CN103421733A - 一种副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌二联基因工程苗 - Google Patents

Abstract

本发明属于动物细菌性疾病基因工程疫苗技术领域，具体涉及一种无抗性标记表达副猪嗜血杆菌表面抗原基因HbpB的重组猪霍乱沙门氏菌减毒疫苗的菌株构建、疫苗制备以及应用。获得一株无抗性标记的表达副猪嗜血杆菌表面抗原PalA的猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA(保藏号为CCTCC NO：M2013053)。该重组菌缺失了猪霍乱沙门氏菌基因组上的asd基因，含有能在该菌株中表达asd基因和副猪嗜血杆菌外膜抗原PalA基因的重组质粒pYA-PalA。还公开了猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA的构建方法与相应弱毒疫苗的制备方法，及在制备猪霍乱沙门氏菌-副猪嗜血杆菌疫苗中的应用。

Description

一种副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌二联基因工程苗

技术领域

本发明属于动物细菌性疾病基因工程疫苗领域，具体涉及一种无抗性标记能够表达副猪嗜血杆菌抗原基因PalA的新型副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌二联基因工程苗的菌株构建、疫苗制备以及疫苗应用。 

背景技术

20世纪下半叶，人类历史上爆发了两场史无前例的革命，即大规模应用抗菌药物和疫苗接种，从而使细菌感染第一次能被有效制止，一些致命性疾病如天花、狂犬病及破伤风等都可以加以防制。抗生素和疫苗如此有效使人产生一种错觉，好像人们可以很快远离病原菌，事实远非如此。经过数百万年的演变微生物学会了迅速适应环境的急剧变化，相对简单的遗传物质和极大的个体基数允许他们通过自发突变和获取外来遗传物质以更有效地应对环境变化。这种机制容易造就耐药菌株的出现，同抗生素一样，疫苗也面临着类似于细菌为适应环境发生变异的困境(Grandi，2004)。 

2006年6月以来，“无名高热综合征”在我国南方和中部几个省市大面积流行，给生猪养殖业造成了巨大的经济损失。有研究表明副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis，HPS)是该病重要的继发感染或混合感染的病原之一，加重高热病的临床症状，增加死亡率。HPS原本是常规饲养猪群上呼吸道中的一种常在菌，特定条件下可侵入机体并引起严重的全身性疾病，临床表现以纤维素性多发性浆膜炎、关节炎和脑膜炎症状为主(

1910)。目前市场上副猪嗜血杆菌病防控主要依赖的还是灭活疫苗和抗菌药物，只是传统疫苗的开发利用已经越来越难通过卫生管理部门提出的安全质控要求，抗生素引发的耐药问题也越来越影响到人类自身健康和公共卫生安全。新型副猪嗜血杆菌疫苗研发迫在眉睫。 

当前新型疫苗的寻找策略是基于基因组和后基因组技术，病原体的基因组学、转录组学和蛋白质组学研究，为从组成某一病原体的浩瀚分子海洋中寻找几个能引发保护性免疫反应的蛋白抗原提供了机遇。华中农业大学针对副猪嗜血杆菌全菌蛋白进行蛋白质组学分析之后鉴定出了多个免疫原性外膜蛋白，其中外膜蛋白PalA已被证明具有发展成为疫苗候选体的良好潜力。后经高通量克隆、表达与纯化，并进行适当的与保护相关的测定，证实了PalA蛋白的良好免疫原性以及其作为亚单位疫苗应用的良好前景(周明光，2009)。 

随着分子生物学技术的飞速发展，人们开始关注使用减毒沙门氏菌作为载体表达各种外源抗原，如今应用基因工程方法构建沙门氏菌减毒株和利用减毒沙门氏菌作为活载体表达外源抗原研制二联或多联疫 苗已成为研究热点。至目前为止人们已经研制出多种不含抗生素抗性标记的沙门氏菌疫苗系统，其中应用最广的是asd质粒-载体平衡致死系统。沙门氏菌asd基因编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶，后者是二氨基庚二酸(diaminopimelic acid，DAP)生物合成途径中的必需酶，而DAP是革兰氏阴性菌细胞壁主要化学成分肽聚糖四肽侧链的一个重要组分，沙门氏菌asd缺失株在无外源DAP条件下不能形成完好的细胞壁，从而导致溶菌死亡。将目的基因插入含asd基因的表达质粒，转化asd^-宿主菌后可形成互补，只有转化成功的含有asd质粒的重组沙门氏菌才能存活，并可在体内或体外稳定表达外源抗原。该技术以asd质粒载体平衡致死系统替代抗生素抗性标记，应用起来也更加安全。 

猪霍乱沙门氏菌(Salmonella Choleraesuis)是导致2-4月龄仔猪副伤寒的主要病原，过去曾是危害我国养猪业的主要疾病之一，现在在我国特别是农村散养户普遍存在，造成一定经济损失。动物宰杀前感染沙门氏菌或其产品受到污染，可使人发生食物中毒，因此该病原在公共卫生上也具有重要意义。目前临床上广泛使用的仔猪副伤寒商品苗是由中国兽药监察所房晓文于上世纪60年代研制，该疫苗菌株猪霍乱沙门氏菌C500具有较好的免疫原性，但仍具有一定的残余毒力，遗传背景不清晰，且存在毒力返强的风险。以现今严格规范的安全审批标准，该疫苗想要获批非常困难。 

鉴于此，我们构建了猪霍乱沙门氏菌C500的asd基因缺失突变株，并利用asd质粒-载体平衡致死系统稳定表达副猪嗜血杆菌免疫原性蛋白PalA，从而获得一株副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌二联基因工程疫苗菌株。鉴于猪霍乱沙门氏菌asd质粒载体平衡致死系统具有外源基因表达稳定、无需纯化及无抗性标记等优点，同时基于副猪嗜血杆菌外膜蛋白PalA的良好免疫原性，本发明开发的一种新型的副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌二联疫苗菌株具有良好的应用前景。 

发明内容

本发明的第一个目的在于克服现有技术缺陷获得一种免疫原性和安全性均良好的可表达副猪嗜血杆菌免疫抗原PalA的重组猪霍乱沙门氏菌菌株。 

本发明的第二个目的是利用表达副猪嗜血杆菌PalA抗原的重组猪霍乱沙门氏菌菌株制备副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌二联基因工程疫苗。 

本发明的第三个目的是利用表达副猪嗜血杆菌PalA基因的重组猪霍乱沙门氏菌菌株制备的副猪嗜血杆菌猪霍乱沙门氏菌二联基因工程苗的应用。 

本发明通过以下技术方案实现： 

申请人获得了一株不含抗性标记的表达副猪嗜血杆菌PalA基因的重组的猪霍乱沙门氏菌菌株，命名为猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA，Salmonella choleraesuis asd^-C500/pYA-PalA，于2013年1月24日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCC NO： M2013053。 

本发明主要技术方案如下所述： 

1.构建表达副猪嗜血杆菌PalA抗原基因的重组猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA菌株。 

2.重组猪霍乱沙门氏菌株asd^-C500/pYA-PalA生物学鉴定及其作为疫苗应用的安全性评估。 

3.重组猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA弱毒活疫苗的制备及其应用前景描述。 

更具体的实验技术方案见《具体实施方式》所述。 

本发明的主要优点是： 

1.本发明制备的副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌二联基因工程疫苗利用我国仔猪副伤寒商品疫苗菌株猪霍乱沙门氏菌C500作为亲本菌株，导入的的外源抗原PalA为副猪嗜血杆菌重要免疫原性蛋白，该抗原不仅具有良好的免疫保护性，且在副猪嗜血杆菌的主要血清型中均保守存在。因此，本发明制备的二联基因工程疫苗能同时抵抗仔猪副伤寒和副猪嗜血杆菌病，具有广阔的市场应用前景。 

2.本发明制备的基因工程疫苗可经自然免疫途径进行大规模接种(如饲喂或饮水)，操作方便，且能够诱导机体产生良好的体液免疫、细胞免疫以及粘膜免疫效应。 

3.本发明制备的基因工程菌株无抗性标记，完全符合国家疫苗生物安全性要求。 

附图说明

序列表SEQ IDNO：1是本发明克隆的副猪嗜血杆菌PalA基因片段的核苷酸序列，序列全长为462bp，其中序列的1-462位是编码区(CDS)。 

序列表SEQ ID NO：2是副猪嗜血杆菌PalA抗原的氨基酸序列，编码153个氨基酸。 

图1：是本发明重组猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA的构建流程。 

图2：是本发明中载体质粒pBluescriptSK(+)的物理图谱。 

图3：是本发明中自杀质粒pRE112的质粒图谱。 

图4：是本发明制备的转移质粒pREasd12的物理图谱。 

图5：本发明制备的中间质粒pREasd12的酶切鉴定结果。泳道M为DNA分子Marker，泳道1为pREasd12质粒双酶切产物。 

图6：是本发明猪霍乱沙门氏菌asd^-C500突变株的PCR鉴定图。其中泳道M1为2000bp DNA分子Marker，泳道M2为15000bp DNA分子Marker，泳道1-7为asd^-C500缺失株，泳道8-12为亲本株C500对照，泳道13为pREasd12质粒对照，泳道14为空白对照。 

图7：是本发明表达载体pYA3493的质粒图谱。 

图8：是本发明重组质粒pYA-PalA的双酶切鉴定图谱。泳道M为2000bp plus DNA分子Marker，泳道1 为重组质粒pYA-PalA的酶切产物，箭头所示为插入的PalA基因条带。 

图9：是本发明中猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA菌株的PCR鉴定图谱。其中泳道M为2000plus DNA分子Marker，泳道1为asd^-C500/pYA-PalA的PCR产物，显示条带为PalA基因，泳道2为asd^-C500/pYA-PalA的PCR产物，显示条带为InvA基因。 

图10：是本发明重组菌株asd^-C500/pYA-PalA的SDS-PAGE图谱。泳道M为蛋白分子量Marker，泳道2为重组菌asd^-C500/pYA-PalA，其中箭头所示为外源蛋白PalA条带，为对照菌株asd^-C500/pYA-3493。 

图11：是本发明重组菌株asd^-C500/pYA-PalA的Western-blot分析图谱。泳道M为蛋白分子量Marker， 

泳道1为对照菌株asd^-C500/pYA-3493，泳道2为asd^-C500/pYA-PalA，其中箭头所示为外源蛋白PalA条带。 

图12：是本发明重组猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA与对照菌株asd^-C500/pYA-3493的生长曲线。 

图13：足本发明重组菌asd^-C500/pYA-PalA遗传稳定性PCR分析图谱。泳道M为2000plus的DNA分子Marker，泳道1-10为重组菌asd^-C500/pYA-PalA的原代、第10、20、30、40、50、60、70、80、90代及100代的PCR产物，泳道C为对照asd^-C500/pYA-3493的PCR产物。 

图14：是本发明重组菌株asd^-C500/pYA-PalA免疫小鼠诱导的PalA特异性抗体水平示意图。 

具体实施方式

实施例1猪霍乱沙门氏菌asd基因缺失突变株asd^-C500的构建 

1.主要实验材料 

猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500购自中国兽医药品监察所。pBluescriptSK(+)载体质粒(该质粒图谱见附图2)购自美国Stratagene公司。自杀质粒pRE112(其质粒图谱见附图3)、大肠杆菌χ7213由美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III教授惠赠。 

Taq酶等PCR相关试剂、Xba I和BamH I等核酸内切酶及相关Buffer、T4连接酶及Buffer、DH5α感受态细胞等均为宝生物工程(大连)有限公司产品。细菌基因组DNA提取试剂盒购自天津天根生化科技(北京)有限公司。UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程技术有限公司。DNA分子Marker、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit均为北京全式金生物技术有限公司产品。DAP购自美国Sigma公司。 

2.引物设计 

参照鼠伤寒沙门氏菌LT2株asd基因(GenBank No：AE008863)上下游序列设计2对引物pa1/pa2和pa3/pa4(见表1)，从猪霍乱沙门氏菌弱毒疫苗株C500基因组中分别扩增asd基因上下游片段asd1和asd2，扩增片段大小分别为2112bp和2069bp(其中上游基因asd1在NCBI中的位置是NC-012125.1：3638301..3640412，下游基因asd2在NCBI中的位置是NC-012125.1：3641589..3643657)， 上臂两端分别引入Xba I和BamHI酶切位点，下臂两端分别引入BamHI和Kpn I酶切位点。另设计pa5/pa6引物对(见表1)用于进行猪霍乱沙门氏菌C500亲本株和asd^-C500缺失菌株的鉴定。引物由上海生工生物工程有限公司合成。 

表1：相关PCR引物 

表1说明：引物序列中带有下划线的核苷酸序列为酶切位点。 

3.asd基因上游片段asd1与下游片段asd2的克隆 

将猪霍乱沙门氏菌C500冻干粉在无抗性LB固体平板上划线，37℃培养16h。挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37℃条件下200r/min培养16h。按细菌基因组提取试剂盒(天津天根生化科技(北京)有限公司产品)说明书介绍的方法，提取猪霍乱沙门氏菌C500全基因组作为PCR模板。 

目的基因asd1和asd2的PCR扩增反应均在25μL体系中进行，反应体系如下：模板DNA1μL，10μmol/L的上、下游引物各1μL，2mmol/L dNTPs1μL，2U/μLTaq酶0.5μL，10×Taq Buffer2.5μL，双蒸水16μL。asd1和asd2基因的PCR扩增条件为：95℃变性5min后进入循环，循环参数为94℃1min，57℃1min，72℃2.5min。30个循环后，72℃延伸10min。所扩增的PCR产物经0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析，片段大小与预期大小相当，证实目的基因asd1和asd2的获得。 

4.pREasd12转移质粒的构建 

先以Xba I和BamHI双酶切asd1基因片段和pBluescriptSK(+)载体质粒，回收纯化后将之用T4DNAligase连接，连接产物命名为pSKasd1，16℃水浴过夜。再将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃在固体LB培养基培养12h，挑菌到液体LB培养基，37℃、225r/min振摇培养12h。使用质粒小提试剂盒少量提取并获得中间质粒pSKasd1，再用BamH I和Kpn I双酶切基因asd2与质粒pSKasd1。回收后用T4DNA Ligase连接(连接产物命名为pSKasd12质粒)，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃培养12h，挑菌到液体LB培养基，37℃、225r/min培养12h，利用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit(为北京全式金生物技术有限公司产品)小量提取质粒从而获得pSKasd12质粒。然后用Xba I和Kpn I双酶切转移质粒pSKasd12与自杀质粒pRE112(来源：美国圣路易斯密苏里州，华盛顿大学Dr.RoyCurtissIII教授 惠赠)，回收asd1-asd2片段和质粒pRE112，用T4DNA Ligase连接，16℃水浴12h，电转化(参数：电压2.0KV；电容5μF；脉冲电阻200Ω；时间4ms)大肠杆菌χ7213感受态细胞(制备方法同χ6097感受态制备)(来源美国圣路易斯密苏里州，华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III教授惠赠；Edwards，R.A.，L. H.Keller，and D.M.Schifferli.1998.Improved allelic exchange vectors and their use to analyze987P fimbria gene expression.Gene207：149-157)构建重组菌株χ7213/pREasd12，37℃培养12h挑菌到LB液体培养基，37℃下225r/min培养12h，小量制备质粒从而获得pREasd12转移质粒(其物理图谱见图4)。将pREasd12转移质粒利用Xba I和Kpn I双酶切，酶切产物进行PCR跑胶电泳，跑胶结果可显示出中间质粒pREasd1和插入片段asd2条带大小，证明pREasd12转移质粒构建成功(见图5)。 

5.asd基因缺失株的构建 

以χ7213/pREasd12为供体菌，仔猪副伤寒商品化疫苗菌株猪霍乱沙门氏菌C500为受体菌进行接合转移。先将供体菌和受体菌分别在LB培养基中培养过夜，用无菌PBS缓冲液(成分：NaCl8.0g，KCl0.2g，Na₂HPO₄12H₂O2.9g，KH₂PO₄0.2g，加蒸馏水至1000mL，pH7.4)洗两遍，调整菌浓度OD₅₉₅至0.8，各取100μL菌液混合。将无菌硝酸纤维滤膜(NC膜)贴于含DAP的固体LB平板上，再将混合菌液滴于NC膜上，37℃培养12h，同时做供体和受体对照。用无菌PBS洗下滤膜上菌液，重复两次，涂布含30μg/mL氯霉素的固体LB平板，37℃培养12h，将Cm抗性菌落同时转接含Cm和5％蔗糖的LB平板，挑取阳性克隆并提取全菌基因组，用引物pa5/pa6扩增鉴定。阳性接合子在无抗性无NaCl的LB液体培养基中培养12h，连续10倍稀释，涂布含5％蔗糖的无NaCl的固体LB平板，挑取单菌落复制在含Cm和5％蔗糖的固体平板，筛选Cm敏感菌落。提取基因组，再次用引物pa5/pa6扩增鉴定，鉴定结果见图6所示。缺失asd基因的C500突变株无法自主合成DAP，所以不能在无外源DAP的培养基上生长。因而，申请人所构建的asd基因缺失株asd^-C500是正确的。将该asd基因缺失株命名猪霍乱沙门氏菌ΔasdC500^-，Salmonella choleraesuisΔasdC500^-菌株(也常写作猪霍乱沙门氏菌asd^-C500)。该菌株于2012年9月13日送交湖北省武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2012346。 

实施例2：副猪嗜血杆菌外膜蛋白基因PalA的克隆 

1.主要实验材料 

NAD(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)、DAB显色诊断试剂盒均为Sigma公司产品，新生牛血清是杭州四季青生物制品有限公司产品。TSB、TSA为Difco^TM产品。其余主要实验材料参考实施例1。 

2.目的基因分析及引物设计 

本发明涉及生物材料副猪嗜血杆菌SH0165菌株(该菌株由华中农业大学农业微生物国家重点实验室蔡旭旺采集鉴定，详见：蔡旭旺，副猪嗜血杆菌的分离鉴定及诊断方法与灭活疫苗的研究，2006年6月， 华中农业大学博士论文，中围国家图书馆，中国国家数字图书馆 http://res4.nlc.gov.cn/home/search.trs？method＝showDetail&channelid＝3&id＝003448570。申请人承诺公开发放此生物材料)。本发明所涉副猪嗜血杆菌抗原蛋白PalA的全称是“18K peptidoglycan-associated outer membrane lipoprotein PalA”，目的基因PalA在GENBank中的序列登录号及其在副猪嗜血杆菌全基因组中所处位置为PalA＞gi|219870279；84702..85163[Haemophilus parasuis SH0165](其中显示有下划线的为PalA基因在Genebank中的登录号，分号显示的是PalA基因在副猪嗜血杆菌SH0165菌株全基因组中的位置，中括号内显示加粗斜体字的为本发明涉及的副猪嗜血杆菌菌株号)。 

利用SignalP软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)对抗原蛋白PalA进行氨基酸序列分析，结果表明PalA共编码153个氨基酸，最可能的信号肽切割位置在第27至28个氨基酸之间。鉴于本发明所使用载体质粒PYA3493(该质粒图谱见附图7)多克隆位点上游包含信号肽，因此我们对其余序列进行引物设计。应用Primer5.0软件设计用于扩增PalA基因的引物(见表2)。另设计引物对pi1/pi2(见表2)，用以扩增沙门氏菌属特异性基因InvA(Gene ID：1254419)。上述引物对均中上海生工生物技术有限公司合成。 

表2：PalA和InvA基因的扩增引物 

表2说明：引物中带下划线的核苷酸序列即为酶切位点。 

3.副猪嗜血杆菌基因组模板的制备 

将副猪嗜血杆菌SH0165菌株冻干粉接种于含10％灭活新生牛血清及0.1％NAD的TSA固体培养基上，挑取单个菌落接种于含10％灭活新生牛血清及0.1％NAD的TSB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。收集菌体，按照细菌基因组提取试剂盒(天津天根生化科技(北京)有限公司产品)说明书提供的操作方法提取副猪嗜血杆菌基因组DNA。 

4.目的基因PalA的PCR扩增及产物回收 

本发明中目的基因PalA的PCR反应体系为50μL，具体如下所示：HPS全基因组模板4μL，上下游引物各2μL，10mM dNTPs4μL，5U/μL Taq酶0.5μL，10×Taq Buffer5μL，添加ddH₂O调整反应总体积至50μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min，1个循环；94℃变性30sec，54℃退火30sec，72℃延伸1min，30个循环；最后72℃延伸10min。将PCR产物经0.8％琼脂糖胶电泳并进行鉴定回收。跑胶结果 见图5，扩增的PalA核苷酸序列见SEQ ID NO：1所示。然后采用上海生工生物工程技术有限公司的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒回收目的片段，具体操作按照试剂盒说明书的步骤进行。 

实施例3：重组猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA菌株构建 

1.主要实验材料 

大肠杆菌χ6097(ara^Δ(lac-pro)rpslΔasdA4Δ[zhf-2.∵Tn10]thiΦ80d/lacZΔM15)由美国华盛顿大学Dr.Roy Curtiss III惠赠。CaCl₂、甘油等试剂是上海国药集团化学试剂有限公司产品。其余主要实验试剂见实施例1。 

2.χ6097感受态的制备(CaCl₂法) 

采用CaCl₂法制备大肠杆菌χ6097感受态细胞，具体步骤如下：从-80℃冰箱取出大肠杆菌χ6097冻干粉(该大肠杆菌χ6097，Escherichia coliχ6097于2012年9月13日送交中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏号为CCTCC NO：M2012344)，解冻后划线接种于LB平板上，37℃恒温倒置培养16-18h；挑取单菌落接种至5mL含50μg/mL DAP的LB培养液中，37℃、230r/min恒温培养过夜；按体积比1∶100比例将培养物接种至适量LB培养液(含50μg/mL DAP)中，于37℃、230r/min振荡培养3-4h；取出100～200μL培养物检测OD600，当OD600介于0.3-0.4之间时，将培养物冰浴30min，后于4℃，5000-6000r/min条件下离心10min，收集菌体，弃上清；加入约菌液体积1/2-1/5的冰CaCl₂溶液(含100mmol/L，10％(V/V)甘油，下同)，轻轻吹打充分重悬菌体沉淀，冰浴15min；重复上述步骤2次；再次于4℃，5000r/min离心10min收集菌体，弃上清；加入约1/50-1/25原培养物体积的CaCl₂溶液，轻轻吹打重悬菌体；分装至无菌EP管，每管100μL，-80℃贮存备用。 

3.表达质粒pYA-PalA的构建 

将实施例2中所获PalA基因与质粒pYA3493使用限制性内切酶EcoR I和Sal I进行双酶切，回收酶切产物，并将两者于16℃过夜连接。次日将连接产物转化步骤1制备的χ6097感受态细胞，37℃条件下下在无抗性LB固体培养基上培养。观察可在平皿上生长的单菌落，随机挑取若干，分别放入LB液体培养基中，37℃培养12小时。少量提取质粒，酶切鉴定后筛选阳性重组质粒，命名为pYA-PalA重组质粒。重组质粒pYA-PalA双酶切鉴定图谱见图8所示。 

4.猪霍乱沙门氏菌asd^-C500感受态细胞制备 

从-80℃冰箱中取出猪霍乱沙门氏菌asd^-C500冻干粉，以无菌铂丝直接蘸取并于含50μg/mL DAP的LB平板表面划线接种，37℃倒置培养16-18h；挑取单菌落接种至4mL含50μg/mL DAP的LB培养液中，37℃180r/min培养过夜；按体积比1∶100将培养物转接至50mL LB培养液(含50μg/mL DAP)中，37℃、230r/min振荡培养2-3h；取出100-200μL培养物检测OD₆₀₀，当OD₆₀₀介于0.8左右时，冰浴菌液使之冷却到0℃；然后在4℃条件下5000r/min离心10min收集菌体，弃上清；用2-5mL10％灭菌甘油洗涤菌体沉淀，重复3次，再用10％灭菌甘油重悬菌体细胞，100μL每管分装，做好标记，置-80℃冰箱冻存备用。 

5.重组质粒的电转化 

取2-3μL不含重组质粒pYA-PalA加入到步骤3制备的感受态细胞asd^-C500中，轻轻混匀并立即转移到预冷的0.2cm电转杯中，吸干电转杯外面水迹，然后放入电转仪(BioRad GenePulser)样品槽中；按照以下条件进行电转化：电压2.0KV；电容5μF；脉冲电阻200Ω；时间，4ms。电击后，马上取出电转杯，迅速加入预热至37℃的LB培养基(含50μg/mL DAP)，并将菌液转移到无菌EP管中；37℃120r/min震荡培养60min，取100-150μL菌液涂布于LB固体培养基表面，将平板正放于37℃培养箱中，待培养液完全被吸收后，倒置培养16-18h，待平皿表面有菌落长出后进行鉴定。 

另外，取2-3μL不含盐的pYA3493质粒加入到步骤3制备的感受态细胞asd^-C500中，轻轻混匀并立即转移到预冷的0.2cm电转杯中，吸干电转杯外面水迹，然后按照上述方法进行电转化，所得重组菌株命名为猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA3493；Salmonella choleraesuis asd^-C500/pYA3493(该菌株已于2013年1月24日保藏在中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO：M2013051)。目的重组菌株猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA3493可以合成DAP，恢复了在不含外源DAP的培养基上生长的能力。 

6.重组猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA菌株的获得 

挑取能在LB平皿表面生长的菌落，分别以pi1/pi2、pp1/pp2作为引物进行PCR鉴定。跑胶结果显示所选菌株能够扩增出沙门氏菌特异条带(580bp)和外源基因PalA条带(381bp)，重组菌株asd^-C500/pYA-PalA构建成功(见图9)。将重组质粒pYA-PalA电转至asd^-C500感受态细胞后所构建的重组菌株恢复了在不含DAP的培养基上生长的能力，这说明重组质粒pYA-PalA在asd^-C500宿主菌株内能够表达asd基因并与后者的asd缺失表型形成互补。 

至此，申请人获得了一株不含抗性标记的可以表达副猪嗜血杆菌PalA基因的重组猪霍乱沙门氏菌株，命名为猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA，Salmonella choleraesuis asd^-C500/pYA-PalA，该菌株已于2013年1月24日保藏在中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏编号为CCTCC NO：M2013053。 

实施例4：重组猪霍乱乱沙门氏菌株asa^-C500/pYA-PalA的生物学特性 

1.主要实验试剂 

氯化钠、乙醇、乙酸等是上海国药集团化学试剂有限公司产品；Tris碱、十二烷基磺酸钠(SDS)、内烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺(TEMED)等购自上海生工生物工程技术有限公司；甘氨酸、考马斯亮蓝R-250、考马斯亮蓝G-250购自AMRESCO公司；牛血清白蛋白(BSA)、Tween-20、辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG、DAB显色诊断试剂盒等均为Sigma公司产品。 

2.重组猪霍乱乱沙门氏菌株asa^-C500/pYA-PalA的表达特性 

将重组菌asd^-C500/pYA-PalA接种于无抗性液体LB培养基中，37℃振摇培养15～16h后，离心收集菌体。以适量PBS(pH7.4)重悬菌体沉淀，洗涤1次后加入一定体积2×SDS上样Buffer，沸水浴10min后冰浴裂解菌体，以备进行SDS-PAGE凝胶电泳。同时处理asd^-C500/pYA3493菌体作为阴性对照。 

SDS-PAGE凝胶的配制、电泳、染色以及脱色参照《分子克隆实验指南》第三版(萨姆布鲁克，黄培堂译，科学出版社，2002年版)说明的方法进行。具体步骤如下： 

SDS-PAGE的配制及电泳： 

表3SDS-PAGE胶配置 

按照表3准备好分离胶所需试剂，将各成分加入20mL烧杯中，迅速混匀，然后立刻添加到制胶板中，胶液上层缓慢铺上少量ddH₂O。约30min后，待下层分离胶完全凝好后彻底弃掉上层水，同时准备5％浓缩胶的配制，具体胶液组成见表3，添加各成分后迅速混合，加入制胶板的分离胶上面，灌满后插入加样梳。待浓缩胶完全凝固后取下梳子，将凝胶板固定于电泳装置上，并向胶槽中加入足量Tris-甘氨酸电泳缓冲液。向加样孔中分别加入各样品；电泳时先设置电压为80V，电流保持在20mA-40mA范围内，电泳约30min后，至所有样品进入分离胶层后调整电压至120V，直至溴酚蓝泳出胶底面时终止电泳。 

SDS-PAGE的染色与脱色： 

待电泳完成以后卸下凝胶，用考马斯亮蓝R250染色液(含50％甲醇，45％纯化水，5％冰乙酸，0.25％的考马斯亮蓝R250)染色过夜，然后再用脱色液(含50％甲醇，45％纯化水，5％冰乙酸)进行脱色，观察结果。重组猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA菌株能够大量表达外源蛋白PalA，具体SDS-PAGE分析结果见图10所示。 

Western-blot分析 

重组猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA的Western-blot分析首先是按照上述方法进行SDS-PAGE凝胶电泳，其后操作步骤如下： 

1)转膜：裁取6张Whatman3M滤纸和1张NC膜，滤纸和NC膜的尺寸大小要完全等于或略小于凝胶；将NC膜在ddH₂O中浸泡5min，滤纸浸泡于转移缓冲液中。然后按如下步骤操作：平放石墨电极 的阳极底座，依次放3层滤纸、NC膜、SDS-PAGE凝胶和3层滤纸，彻底排除各层间气泡；将转移电泳槽的上盖扣到石墨电极-转移膜胶复合体上；连接电源，根据凝胶板面积按照0.65mA/cm²-1.0mA/cm²的参数设置电流，电泳转移1h。 

2)封闭：转膜完全后取出NC膜，置于含2％BSA的封闭液中，室温封闭2h； 

3)洗涤：弃封闭液，用TBST洗NC膜3遍，每次5min； 

4)一抗孵肓：将经上述处理的NC膜放入1∶100倍稀释的小鼠抗HPS SH0165感染血清(源自感染致死剂量HPS SH0165菌后存活的小鼠血清)中，37℃孵肓2h； 

5)洗涤：取出NC膜，用TBST洗膜3-5次，每次5min； 

6)二抗孵育：将NC膜转入1∶5000倍稀释的羊抗鼠IgG抗体(HRP标记)中，37℃孵育2h； 

7)洗涤：取出NC膜，用TBST洗膜5次，每次5min； 

8)显色：将NC膜置于新配置的DAB显色液中，避光显色，待目的带颜色深度达到要求后，迅速用TBST洗涤液冲洗以终止反应。观察结果。 

重组猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA菌株的Western-blot分析结果见图11，结果显示asd^-C500/pYA-PalA能够表达外源蛋白PalA，且该蛋白显示出良好的免疫反应原性。 

3.重组猪霍乱乱沙门氏菌株asa^-C500/pYA-PalA的生长特性 

将重组菌株asd^-C500/pYA-PalA与对照菌株asd^-C500/pYA-3493划线接种于无抗性LB平板上，挑取单克隆分别接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养10h后，调整菌液OD₅₉₅值，取50μL接种于5mL的LB液体培养基中，37℃振荡培养，每隔1h测定菌液OD₅₉₅值。结果如图12所示，表明重组菌株asd ^-C500/pYA-PalA与对照菌株asd^-C500/pYA3493生长趋势非常相似，虽然在对数前期和对数后期二者的生长速度略有差异，至稳定期时两者的细菌数量再次趋于一致。 

4.重组猪霍乱乱沙门氏菌株株asd^-C500/pYA-PalA的遗传稳定性 

将重组猪霍乱乱沙门氏菌株asd^-C500/pYA-PalA在LB液体培养基中连续传代，分别取原代、第10、20、30、40、50、60、70、80、90、100代菌液作为模板进行PCR扩增鉴定。结果表明：重组菌asd^-C500/pYA-PalA的不同代次均能扩增出外源基因palA条带(381bp，见图13)。对传代100次后挑取的重组菌测序结果与初代外源片段序列依旧一致，表明重组质粒pYA-PalA能在猪霍乱沙门氏菌asd^-C500中稳定遗传。 

5.重组猪霍乱沙门氏菌asa^-C500/pYA-PalA的致病力评估 

重组菌株asd^-C500/pYA-PalA的致病力及安全性评估是通过感染SPF级昆明小鼠感染试验证明的。将梯度剂量的重组菌asd^-C500/pYA-PalA腹腔注射4周龄SPF级雌性昆明系小鼠，同时设置asd^-C500/pYA3493菌株对照，连续观察21天并记录小鼠的存活情况。按照Reed-Muench法计算小鼠的半数致死剂量(LD₅₀)，评价重组菌株与对照菌株相比的毒力变化。小鼠腹腔感染重组菌asd^-C500/pYA-PalA与对照菌株asd^-C500/pYA3493的安全性评估实验结果见表4，重组菌asd^-C500/pYA-PalA的LD₅₀明显大于对 照菌株asd^-C500/pYA3493，表明本发明构建的重组猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA的应用安全性更加良好。 

表4重组猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA菌株对小鼠半数致死剂量LD₅₀的测定 

实施例5：重组猪霍乱乱沙门氏菌株asd^-C500/pYA-PalA疫苗的制备 

将重组猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA菌株在无抗性LB固体培养基上培养，挑取单菌落接种至LB液体培养基，37℃培养8-10h，收集菌液并调整活菌数目达1×10¹⁰CFU/mL，将菌液与15％灭菌脱脂乳(灭菌脱脂乳配制方法是将每100mL去离子水中加脱脂奶粉15g，充分混匀后，105℃灭菌30min，待其冷却至室温后置4℃保存备用)以1∶1体积比进行充分混合，按每瓶2.0mL的规格分装于灭菌冻干瓶中，置冷冻干燥机中冻干。冻干36-40h后压盖，置-20℃保存备用，以作为能够同时抵抗副猪嗜血杆菌病和仔猪副伤寒的二联基因工程弱毒活疫苗。 

实施例6：重组猪霍乱乱沙门氏菌疫苗asd^-C500/pYA-PalA对小鼠的免疫效力试验 

1试验分组及免疫 

随机选取4周龄SPF级雌性昆明小鼠48只，平均分为4组，每组12只。依次设置为asd^-C500/pYA-PalA口服免疫组，asd^-C500/pYA-PalA腹腔注射组、asd^-C500/pYA-3493口服免疫组、asd^-C500/pYA-3493腹腔注射组。口服组小鼠免疫前禁食24h，禁水4h，并先以100μL10％NaHCO₃中和胃酸，30min后用12号灌胃针口服疫苗100μL，灌胃1h后恢复饮水和饲料。腹腔注射后每只小鼠免疫剂量为0.2mL/只。初次免疫两周后进行加强免疫1次，具体操作同一免。 

2血清特异性抗体的检测 

各组小鼠在首免后第28天采血收集免疫血清，每组6只，用于检测各组小鼠的PalA特异性抗体水平(具体操作方法参考文献5)。免疫小鼠血清中特异性PalA抗体的ELISA检测结果见图14，结果表明相比阴性对照组，重组菌asd^-C500/pYA-PalA免疫组小鼠产生了高水平的针对目的蛋白PalA的特异性抗体，而且相对于口服组而言腹腔注射组小鼠产生特异性抗体的能力更强。 

3免疫小鼠攻毒保护性试验 

加强免疫后第14天对小鼠进行攻毒试验。将每组免疫小鼠分两批进行，每批6只。其中一批采用副猪嗜血杆菌SH0165菌株进行攻毒，攻毒途径是腹腔注射，攻毒剂量为40亿CFU/0.2ml/只；另一批采用猪霍乱沙门氏菌强毒株C78-1(菌株来源：中国兽医药品监察所)进行攻毒试验，攻毒方式是灌胃，攻毒剂量为500万CFU/0.1m L/只。灌胃前禁食24h，禁水4h，先以100μL10％NaHCO₃中和胃酸，30min后用12号灌胃针口服疫苗100μL，攻毒2h后恢复饮水和饲料。攻毒后连续观察14天，记录各组小鼠的临床特征及死亡情况。 

具体攻毒保护结果见表5与表6。针对免疫小鼠的HPS SH0165攻毒结果来看，无论是采用口服免疫还是皮下注射方式，重组菌株asd^-C500/pYA-PalA均能提供明显的保护力，其中asd^-C500/pYA-PalA口服组免疫小鼠甚至可以对致死剂量的副猪嗜血刚杆菌强毒株提供100％保护力。对照猪霍乱沙门氏菌强毒株攻毒试验结果，可以看出重组猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA菌株与对照菌株asd^-C500/pYA-3493均具有一定的保护力，而且重组菌株的保护效力更强，其中asd^-C500/pYA-PalA腹腔注射组免疫保护效力达83.3％。由此证明，本发明构建的重组猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA菌株能够同时抵抗猪霍乱沙门氏菌和副猪嗜血杆菌感染，具有作为副猪嗜血杆菌-猪霍乱沙门氏菌二联基因工程疫苗的良好应用前景。 

表5免疫小鼠的HPS SH0165攻毒保护结果 

表6免疫小鼠的猪霍乱沙门氏菌C78-1攻毒保护结果 

参考文献 

1.Kielstein P， Rapp-Gabrielson VJ.Designation of15serovars of Haemophilus parasuis on the basis of immunodiffusion using heat-stable antigen extracts.J Clin Microbiol，1992；30(4)：862-865 

2.Nielsen R.Pathogenicity and immunity studies of Haemophilus parasuis serotypes.Acta Vet Scand，1993，34(2)：193-198 

3.Cai X，Chen H，Blackall PJ，et al.，Serological characterization of Haemophilus parasuis isolates from  China.Vet Microbiol，2005，111(3-4)：231-236 

4.Kang，H，et al.，Immune responses to recombinant pneumococcal PspA antigen delivered by live attenuated Salmonella enterica serovar Typhimurium vaccine.Infect.Immun.，2002，70：1739-1749 

5.赵建平等，猪链球菌-副猪嗜血杆菌二联亚单位疫苗在小鼠的免疫效力分析，畜牧兽医学报，2012，43(10)：1639-1644 

6.徐引弟.猪霍乱沙门氏菌C500株crp-、asd-缺失株平衡致死系统的构建及应用.[博士学位论文].武汉：华中农业大学，2006. 

http://www.cnki.net/kcms/detail/detail.aspx？recid＝&FileName＝2006190171.nh&DbName＝CDFD2007&Db Code＝CDFD&uid＝WEEvREcwSlJHSldTTGJhYlNPdlJaQmc3NUdpb2pvZmUyd1lneFlQNXAvc2JVWGJLdWVBcE5BZ3Q2N2N6OVhXWA。 

Claims (7)

1.一株表达副猪嗜血杆菌表面抗原PalA基因的重组的猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA，Salmonella choleraesuis asd^-C500/pYA-PalA，保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2013053。

2.如权利要求1所述的猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA，其特征包括：

1)所述的菌株基因组缺失了猪霍乱沙门氏菌生长必需的asd基因；

2)所述的菌株内含表达副猪嗜血杆菌表面抗原PalA基因的重组质粒pYA-PalA，该质粒能够复制表达asd基因。

3.一种无抗性标记的重组质粒pYA-PalA，其特征在于，所述的质粒含有副猪嗜血杆菌表面抗原PalA基因，且能在宿主菌内表达，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

4.一种无抗性标记的重组质粒pYA-PalA，其蛋白质的序列如SEQ ID NO：2所示。

5.一种表达副猪嗜血杆菌表面抗原基因PalA的重组的猪霍乱沙门氏菌的制备方法，其包括如下步骤：

1)构建猪霍乱沙门氏菌C500菌株asd基因缺失株asd^-C500；

2)设计引物对，通过PCR扩增方法得到副猪嗜血杆菌表面抗原PalA基因片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

3)将步骤2)中扩增的基因片段PalA插入原核表达载体pYA3493的EcoR I和Sal I位点之间，得到表达质粒pYA-PalA；

4)将步骤3)获得的表达质粒pYA-PalA电转化至宿主菌株猪霍乱沙门氏菌asd^-C500中，筛选得到表达副猪嗜血杆菌表面抗原PalA基因的重组的猪霍乱沙门氏菌asd^-C500/pYA-PalA，Salmonella choleraesuis)asd^-C500/pYA-PalA，其保藏号为CCTCC NO：M2013053；

其中：

步骤2)所述的引物对的DNA序列如下所示：

上游引物：gaa gaattc agtgctaatgcaagtgctaatgcagg，

下游引物：agtgtcgac_ttagtactctaacactgcacgacggttt。

6.权利要求1或2所述的重组的猪霍乱沙门氏菌在制备猪霍乱沙门氏菌-副猪嗜血杆菌二联基因工程疫苗中的应用。

7.权利要求3或4所述的重组质粒pYA-PalA在制备猪霍乱沙门氏菌-副猪嗜血杆菌二联基因工程疫苗中的应用。

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