CN109652413A - 构建一株表达副猪嗜血杆菌gapdh基因的猪霍乱减毒沙门菌重组菌株 - Google Patents

Abstract

本发明涉及构建一株表达副猪嗜血杆菌GAPDH基因的猪霍乱减毒沙门菌重组菌株，利用猪霍乱沙门菌C500Δasd缺失株的平衡致死载体系统，将副猪嗜血杆菌的一个重要免疫原性基因GAPDH与宿主菌中pYA3493载体相连，从而构建出HPS‑Sal重组疫苗菌株，该重组菌缺失了猪霍乱沙门氏菌基因组上的asd基因，含有能在该菌株中表达asd基因和副猪嗜血杆菌GAPDH基因的重组质粒pYA‑GAPDH，经检测表达效果良好，说明外膜蛋白GAPDH可作为之后研究副猪嗜血杆菌临床检测、流行病学调查和免疫检测的一个基础蛋白，并且由于载体和受体菌的特殊性为以后构建猪霍乱和副猪嗜血杆菌二联疫苗提供了基础设想。

Description

构建一株表达副猪嗜血杆菌GAPDH基因的猪霍乱减毒沙门菌 重组菌株

技术领域

本发明涉及动物细菌性疾病基因工程疫苗技术领域，具体涉及构建一株表达副猪嗜血杆菌GAPDH基因的猪霍乱减毒沙门菌重组菌株。

背景技术

副猪嗜血杆菌又名格拉泽氏病，是存在于健康猪群上呼吸道的共生细菌，但同时也是引起格拉泽氏病的病原菌。以多发性浆膜炎，脑膜炎，关节炎为主要特征。副猪嗜血杆菌可以影响从2周龄到4月龄的青年猪，主要在断奶后和保育阶段发病，通常见于5～8周龄的猪，发病率一般在10％～15％，严重时死亡率可达50％。近年来随着生产管理问题的出现，副猪嗜血杆菌已经成为引起猪发病率和死亡率的主要病原菌之一，在世界范围内引起巨大的经济损失和对动物造成巨大的伤害。

由于副猪嗜血杆菌的血清型比较复杂和它引起的感染的持续性等特点，导致了现在预防和控制副猪嗜血杆菌在猪群中的感染变的越来越困难。但是通过研究表明，许多细菌的外膜蛋白参与病原菌感染宿主的过程，并且参与调节宿主的免疫反应，因此本发明开展了从副猪嗜血杆菌的外膜蛋白中筛选免疫调节蛋白。由于近年来通过基因工程方法构建沙门氏菌减毒株和利用减毒沙门氏菌作为活载体表达外源抗原研制多联活疫苗等已成为研究热点。因此本发明选用减毒沙门氏菌作为受菌体，猪霍乱沙门菌C500株是将抗原性良好的猪霍乱沙门菌强毒株接种含有醋酸砣的培养基中传500多代后，选育出的1株稳定、免疫原性好、用于预防仔猪副伤寒的弱毒疫苗株。选择减毒猪霍乱沙门菌C500Δasd缺失株作为载体有很多优点：沙门氏菌为胞内寄生菌，能有效呈递抗原，在激发抗沙门氏菌免疫反应的同时诱导产生针对外源抗原的特异性体液和细胞免疫反应；口服、滴鼻等免疫途径操作方便、对动物损伤小；能同时诱导广泛的粘膜免疫与全身免疫；另外，沙门氏菌载体本身具有免疫佐剂作用，其脂多糖作为一种内在佐剂可以刺激宿主细胞释放各种细胞因子。鉴于此，以减毒沙门氏菌作为今后粘膜免疫用基因工程活疫苗表达载体具有无可比拟的优越性。

pYA3493：(即外源基因表达质粒)，含有来源于鼠伤寒沙门菌的asd基因，与C500的asd基因100％同源。Asd基因，是编码天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶的基因；天冬氨酸β-半乳糖脱氢酶是合成DAP(二氨基庚二酸)的必须酶。动物自身不能合成DAP，所以缺失株在无外源DAP的条件下溶菌死亡。由沙门氏菌的asd基因缺失株C500Δasd与含有asd基因的pYA3493质粒构成Asd+平衡表达系统。只有含Asd+质粒的沙门氏菌asd缺失株才能在无DAP存在的条件下存活，并在体内或体外稳定表达外源抗原。另外，由于Asd+平衡表达系统中asd基因代替了抗生素抗性标记，也更加安全。

GAPDH，是糖酵解反应中一种非常重要的酶，在组织中表达量很高，又比较稳定，常作为研究其他基因和表达的内参基因，但近年来随着研究的深入，发现GAPDH还参与到DNA修复，启动细胞凋亡，调节蛋白质的表达等多项生理功能。目前有研究认为细菌对宿主的黏附在细菌的治病过程中发挥着重要的作用，而GAPDH是副猪嗜血杆菌的一种膜蛋白，与细菌黏附宿主细胞有关，可能与副猪嗜血杆菌的毒力和致病力密切相关。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于构建一株无抗性标记表达副猪嗜血杆菌外膜蛋白GAPDH基因的猪霍乱减毒沙门氏菌重组株C500Δasd pYA3493-GAPDH，该重组菌缺失了猪霍乱沙门氏菌基因组上的asd基因，含能在该菌株中表达asd基因和副猪嗜血杆菌外膜蛋白GAPDH基因的重组质粒pYA-GAPDH。

为实现上述目的，本发明提供的技术方案为：

本发明提供了一种扩增GAPDH基因的引物对，包括引物1和引物2；

引物1的核苷酸序列如序列表中序列1所示，即上游引物：5’-GTAAAAGATGCTGAAGAATTCATGGCAATTAAAATTG-3’；

引物2的核苷酸序列如序列表中序列2所示，即下游引物：5’-GCAAGTTTAAATAAATTTTTTTAGCCTTTGTAGTTG-3’。

本发明还保护上述引物对在扩增GAPDH基因中的应用。

本发明还提供了一种重组载体，其是将GAPDH基因插入无抗性质粒载体pYA3493的EcoR I和Hind III酶切位点间构建得到。

本发明还提供了上述重组载体的构建方法，包括步骤：提取副猪嗜血杆菌5型SH0165菌株的DNA，然后采用上述的引物对扩增GAPDH基因，将扩增得到的PCR产物进行胶回收和纯化，之后与pMD18-T载体连接，得到连接产物；将连接产物转入感受态细胞DH-5α中，经酶切鉴定，筛选阳性克隆并进行序列测定，得到pMD18-T-GAPDH；用EcoR I和Hind III同时酶切无抗性质粒载体pYA3493和pMD18-T-GAPDH，将酶切产物连接构建得到pYA3493(+)-GAPDH表达载体，即重组载体。

本发明还保护上述重组载体在制备GAPDH蛋白中的应用；本发明还保护上述重组载体在动物细菌性疾病基因工程疫苗技术领域中的应用。

本发明还提供了一种副猪嗜血杆菌外膜蛋白基因GAPDH重组猪霍乱减毒沙门氏菌株，其是将上述重组载体pYA3493(+)-GAPDH转入猪霍乱沙门氏菌asd基因缺失株C500Δasd中构建得到。

本发明还提供了上述副猪嗜血杆菌外膜蛋白基因GAPDH重组猪霍乱减毒沙门氏菌株的构建方法，包括步骤：构建猪霍乱沙门氏菌asd基因缺失株C500Δasd；然后将上述重组载体pYA3493(+)-GAPDH电转入猪霍乱沙门氏菌asd基因缺失株C500Δasd中，之后培养，待平皿表面有菌落长出后进行双酶切、PCR鉴定及测序，结果均证明所得为阳性pYA3493(+)-GAPDH质粒，得到副猪嗜血杆菌外膜蛋白基因GAPDH重组猪霍乱减毒沙门氏菌株C500ΔasdpYA3493-GAPDH，又名HPS-Sal菌株。

本发明还保护上述副猪嗜血杆菌外膜蛋白基因GAPDH重组猪霍乱减毒沙门氏菌株在制备GAPDH蛋白中的应用；本发明还保护上述副猪嗜血杆菌外膜蛋白基因GAPDH重组猪霍乱减毒沙门氏菌株在动物细菌性疾病基因工程疫苗技术领域中的应用。

本发明利用猪霍乱沙门菌C500Δasd缺失株的平衡致死载体系统，将副猪嗜血杆菌的一个重要免疫原性基因GAPDH与宿主菌中pYA3493载体相连，从而构建出HPS-Sal重组疫苗菌株，该重组菌缺失了猪霍乱沙门氏菌基因组上的asd基因，含有能在该菌株中表达asd基因和副猪嗜血杆菌GAPDH基因的重组质粒pYA-GAPDH，两者合在一起构成了平衡致死系统，且既有猪霍乱沙门菌的抗原基因又有副猪嗜血杆菌的抗原基因。本发明构建的重组副猪嗜血杆菌猪霍乱减毒沙门菌菌株，经检测表达效果良好，说明外膜蛋白GAPDH可作为之后研究副猪嗜血杆菌临床检测、流行病学调查和免疫检测的一个基础蛋白，并且由于载体和受体菌的特殊性为以后构建猪霍乱和副猪嗜血杆菌二联疫苗提供了基础设想。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1为本发明实施例2中重组表达质粒的鉴定结果图；

图2为本发明实施例5中蛋白浓度测定图；

图3为本发明实施例5中His标签重组蛋白纯化效果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

实施例1(设计引物对)

本实施例提供一种扩增HPS标准5型SH0165菌株的GAPDH基因的引物对，其是按照副猪嗜血杆菌基因序列，利用Oligo6.0软件分析，设计一对GAPDH引物，引物两端分别加限制性酶切位点EcoR I，Hind III和方框内及保护性碱基。经计算机BLAST软件分析，具有较好的特异性；包括引物1和引物2；引物1的核苷酸序列如序列表中序列1所示，即上游引物(GAPDH-up)：5’-GTAAAAGATGCTGAAGAATTCATGGCAATTAAAATTG-3’；

引物2的核苷酸序列如序列表中序列2所示，即下游引物(GAPDH-down)：5’-GCAAGTTTAAATAAATTTTTTTAGCCTTTGTAGTTG-3’。

本发明采用的GAPDH基因特异性引物是根据基因序列自行设计，并由广州天一辉远生工生物工程技术服务有限公司合成。

实施例2(构建重组载体)

本实施例构建一种重组载体，步骤具体包括如下。

提取副猪嗜血杆菌5型血清菌株SH0165(由华南农业大学禽病教研室保藏)的DNA，然后采用实施例1的引物对扩增GAPDH基因，其中，PCR的扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸90s，进行34个循环，最后72℃延伸10min；将扩增得到的PCR产物采用产物纯化试剂盒回收目的片段。

将扩增的产物在琼脂糖凝胶上电泳后，紫外灯下切割目的条带，用凝胶回收试剂盒回收和纯化，具体步骤参照说明书进行。

将所得片段与pMD-18T载体连接，将连接产物加入到新制备的感受态细胞DH5α(购自TaKara-宝生物工程有限公司)中，轻旋混匀；冰浴30min，42℃热休克90s，立即冰浴2min；然后加入到1ml，37℃预热的液体LB培养基中，120r/min振摇2h，5000r/min离心2min，弃去800ul上清，余下的200ul培养液涂布于固体平板含(100ul/mlKan+)，37℃培养12h。

挑取转化板上的单一菌落，无菌接至3mlLB/Kan+(Kan+终浓度为50ug/ml液体培养基中，震荡培养12h后，采用试剂盒提取小量质粒。

取克隆重组质粒进行PCR和EcoR I，Hind III双酶切鉴定。PCR反应体系及条件同上。混匀后37℃水浴3h，取出后全部上样，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

将pYA3493载体提取质粒，用EcoR I，Hind III进行双酶切后，用DNA纯化回收试剂盒回收。同时将质粒pMD18-T-GAPDH用EcoR I和Hind III进行双酶切，使用DNA纯化/回收试剂盒回收GAPDH基因片段。将目的片段与载体pYA3493连接，构建得到pYA3493(+)-GAPDH表达载体，即重组载体。重组载体的鉴定结果如图1所示，其中1为DNA Marker，2为PCR鉴定，3为双酶切鉴定。

实施例3(构建一株副猪嗜血杆菌外膜蛋白基因GAPDH重组猪霍乱减毒沙门氏菌株)

本实施例构建一株副猪嗜血杆菌外膜蛋白基因GAPDH重组猪霍乱减毒沙门氏菌株，步骤具体包括如下。

构建猪霍乱沙门氏菌asd基因缺失株C500Δasd；然后将实施例2的重组载体pYA3493(+)-GAPDH电转入猪霍乱沙门氏菌asd基因缺失株C500Δasd中，具体为取10ul已除盐重组质粒pYA3493-GAPDH加入到100ul感受态细胞C500Δasd中，轻轻混匀并立即转移到预冷的0.2cm电转杯中，吸干电转杯外面水迹，然后放入电转仪样品槽中按照以下条件进行电转化电压2.0KV电容5uF；脉冲电阻200Ω。时间，4ms。电击后，马上取出电转杯，迅速加入至1.5mlLB培养基中，37℃，200r/h震荡培养1h，取出菌液涂布于固体培养基表面，将平板正放于37℃培养箱中，待培养液完全被吸收后，倒置培养16-18h，待平皿表面有菌落长出后进行双酶切、PCR鉴定及测序，结果均证明所得为阳性pYA3493(+)-GAPDH质粒，得到副猪嗜血杆菌外膜蛋白基因GAPDH重组猪霍乱减毒沙门氏菌株C500Δasd pYA3493-GAPDH，又名HPS-Sal菌株。

实施例4(重组菌株C500Δasd pYA3493-GAPDH的表达特性)

将实施例3中阳性克隆的培养液用IPTG诱导表达GAPDH重组蛋白；将经诱导表达的菌体离心，将沉淀以倍浓缩比例重悬于中，超声破碎裂解菌体，离心取上清结合一柱，用咪哩洗脱法纯化重组蛋白，取样经四亚群大肠埃希氏菌免疫血清和对照菌免疫血清鉴定及免疫原性、普遍性和特异性验证。并确定蛋白浓度。

将实施例3得到的重组菌C500Δasd pYA3493-GAPDH接种于无抗性液体LB培养基中，37℃振摇培养16-18h后，离心收集菌体。加入适量PBS重悬菌体沉淀，洗涤1次后加入等体积2×SDS上样buffer，煮沸10min后冰浴裂解菌体，以备进行SDS-PAGE。同时处理C500Δasd pYA3493菌体作为阴性对照。

(1)SDS-PAGE凝胶的配制、电泳、染色以及脱色

SDS-PAGE的配制及电泳：按照表1准备好分离胶所需相关试剂，将各成分依次加入20ml烧杯中，迅速混匀，然后立刻添加到制胶板中，胶液上层缓慢铺上少量ddH₂O。约30min后，待下层分离胶完全凝好后彻底弃掉上层水，同时准备5％浓缩胶的配制，具体胶液组成见表1，添加各成分后迅速混合，加入制胶板的分离胶上面，灌满后插入加样梳。待浓缩胶完全凝固后取下子，将凝胶板固定于电泳装置上，并向胶槽中加入足量Tris-甘氨酸电泳缓冲液。向加样孔中分别加入各样品电泳时先设置电压为80V，电流保持在20mA-40mA范围内，电泳约30min后，至所有样品进入分离胶层后调整电压至120V，直至嗅酚蓝泳出胶底面时终止电泳。

表1 SDS-PAGE胶配置

待电泳完成以后卸下凝胶，用0.25％的考马斯亮蓝R250染色液(含50％甲醇，45％纯化水，5％冰乙酸)染色过夜，然后再用脱色液(含50％甲醇，45％纯化水，5％冰乙酸)进行脱色，观察结果。

(2)Western blot分析：

重组猪霍乱沙门氏菌C500Δasd pYA3493-GAPDH的Western blot分析首先是按照上述方法进行SDS-PAGE凝胶电泳，其后操作步骤如下：

1)转膜：裁取6张Whatman3M滤纸和1张NC膜，滤纸和NC膜的尺寸大小要完全等于或略小于凝胶；将NC膜在ddH₂O中浸泡5min，滤纸浸泡于转移缓冲液中。然后按如下步骤操作：平放石墨电极的阳极底座，依次放3层滤纸、NC膜、SDS-PAGE凝胶和3层滤纸，彻底排除各层间气泡。将转移电泳槽的上盖扣到石墨电极-转移膜胶复合体上；连接电源，根据凝胶板面积按照0.65mA/cm²-1.0mA/cm²厅的参数设置电流，电泳转移1h。

2)封闭：转膜完全后取出NC膜，置于含2％BSA的封闭液中，室温封闭2h；

3)洗涤：弃封闭液，用TBST(pH7.5，含1M Tris-HCL 10ml，NaCl 8.8g，0.05％吐温-20)洗NC膜3遍，每次5min。

4)一抗孵育：将NC膜转入用封闭液1：5000倍稀释的羊抗兔IgG抗体(HPR标记)中，37℃孵育2h。

5)洗涤：取出NC膜，用TBST洗膜3-5次，每次5min。

6)二抗孵育：将NC膜转入用封闭液1：5000倍稀释的羊抗兔IGA抗体(HPR标记)中，37℃孵育2h。

7)洗涤：取出NC膜，用TBST洗膜3-5次，每次5min。

8)显色：将膜置于新配置的DAB显色液中，避光显色，待目的带颜色深度达到要求后，迅速用洗涤液冲洗以终止反应。观察结果。

(3)重组菌株C500Δasd pYA3493-GAPDH生长特性

将重组猪霍乱沙门菌株C500Δasd pYA3493-GAPDH与对照组重组猪霍乱沙门菌株C500Δasd pYA3493划线接种于无抗性LB平板上，挑取单克隆分别接种于LB液体培养基中，37℃振荡培养10h后，调整菌液OD₅₆₂值，取50ul接种于5ml LB液体培养基中，37℃振荡培养，每隔1h测定菌液OD₅₆₂值。结果表明重组菌株C500Δasd pYA3493-GAPDH与对照菌株C500Δasd pYA3493生长趋势比较接近。

实施例5(重组菌株C500Δasd pYA3493-GAPDH的诱导表达以及纯化)

将实施例3中序列正确的菌落，挑取单个菌落接种于液体LB培养基中，37℃振荡过夜。37℃振荡培养至A600值0.5-1.0，加IPTG至终浓度为1mM，继续在37℃振荡培养，并在培养的不同时刻(2、3、4、5、6h)各从培养物中取出1ml菌液转移到离心管中，10000r/min，离心5min，收集菌体沉淀，加入90ul 2×上样缓冲液和10ul 1mol/l DTT悬浮混匀，煮沸5min，10000r/min，离心5min后立即使用，或-20℃储存，用前100℃加热5min。

SDS-PAGE凝胶电泳：组装好电泳设备，拔出样品梳，每孔加入10ul的样品，样品在浓缩胶中采用8v/cm的电压进行电泳，在分离胶中采用15v/cm的电压进行电泳。待嗅酚蓝至分离胶底部约1cm时，停止电泳。取出凝胶用考马斯亮蓝R-250染色液在摇床上染色30min左右，然后脱色至背景清晰，用清水冲洗、照相。SDS-PAGE表明，在IPTG的诱导下，转化有重组质粒的大肠杆菌C500Δasd可高效表达融合蛋白时间梯度结果如图2所示。

用His标签蛋白纯化试剂盒(碧云天)纯化蛋白，具体步骤参照说明书进行。His标签重组蛋白纯化效果图如图3所示。其中，M：marker；CL：细菌裂解液(cell lysate)；FT：上样穿流液(flow through)；W1-W3：洗涤液1-3(wash1-3)；E1-E4：洗脱液1-4(elution 1-4)。

需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对步骤、数字表达式和数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个以上，除非另有明确具体的限定。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的保护范围当中。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 构建一株表达副猪嗜血杆菌GAPDH基因的猪霍乱减毒沙门菌重组菌株

<130> 2

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

gtaaaagatg ctgaagaatt catggcaatt aaaattg 37

<210> 2

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gcaagtttaa ataaattttt ttagcctttg tagttg 36

Claims (10)

1.一种扩增GAPDH基因的引物对，其特征在于：

所述引物对包括引物1和引物2；

所述引物1的核苷酸序列如序列表中序列1所示；

所述引物2的核苷酸序列如序列表中序列2所示。

2.权利要求1所述的引物对在扩增GAPDH基因中的应用。

3.一种重组载体，其特征在于：

所述重组载体是将GAPDH基因插入无抗性质粒载体pYA3493的EcoR I和Hind III酶切位点间构建得到。

4.一种权利要求3所述的重组载体的构建方法，其特征在于，包括步骤：

提取副猪嗜血杆菌5型SH0165菌株的DNA，然后采用权利要求1所述的引物对扩增GAPDH基因，将扩增得到的PCR产物进行胶回收和纯化，之后与pMD18-T载体连接，得到连接产物；将所述连接产物转入感受态细胞DH-5α中，经酶切鉴定，筛选阳性克隆并进行序列测定，得到pMD18-T-GAPDH；

用EcoR I和Hind III同时酶切无抗性质粒载体pYA3493和pMD18-T-GAPDH，将酶切产物连接构建得到pYA3493(+)-GAPDH表达载体。

5.权利要求4所述的重组载体在制备GAPDH蛋白中的应用。

6.权利要求4所述的重组载体在动物细菌性疾病基因工程疫苗技术领域中的应用。

7.一种副猪嗜血杆菌外膜蛋白基因GAPDH重组猪霍乱减毒沙门氏菌株，其特征在于：

所述菌株是将权利要求3所述的重组载体转入猪霍乱沙门氏菌asd基因缺失株C500Δasd中构建得到。

8.一种权利要求7所述的副猪嗜血杆菌外膜蛋白基因GAPDH重组猪霍乱减毒沙门氏菌株的构建方法，其特征在于，包括步骤：

构建猪霍乱沙门氏菌asd基因缺失株C500Δasd；然后将权利要求3所述的重组载体电转入所述猪霍乱沙门氏菌asd基因缺失株C500Δasd中，之后培养，待平皿表面有菌落长出后进行双酶切、PCR鉴定及测序，结果均证明所得为阳性pYA3493(+)-GAPDH质粒，得到所述副猪嗜血杆菌外膜蛋白基因GAPDH重组猪霍乱减毒沙门氏菌株C500Δasd pYA3493-GAPDH。

9.权利要求8所述的副猪嗜血杆菌外膜蛋白基因GAPDH重组猪霍乱减毒沙门氏菌株在制备GAPDH蛋白中的应用。

10.权利要求8所述的副猪嗜血杆菌外膜蛋白基因GAPDH重组猪霍乱减毒沙门氏菌株在动物细菌性疾病基因工程疫苗技术领域中的应用。