CN113943376B - 一种融合基因、其编码蛋白及其在抗非洲猪瘟中的应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供一种融合基因及其编码蛋白和其在抗非洲猪瘟中的应用。所述融合基因包含非洲猪瘟病毒核衣壳外膜蛋白CD2V基因和病毒包膜蛋白P17基因与选自结核分枝杆菌的表面蛋白HBHA基因和轮状病毒的毒力基因NSP4基因中的至少一种。同时本发明还提供了能够表达表达保护性抗原CD2V‑P17‑HBHA‑NSP4的重组植物乳杆菌，该重组菌具有相较于出发菌株更优的生长性能，稳定期后的活菌衰减速度更慢，并且具有良好的免疫效果，攻毒后可促进血清中产生高水平CD8+T细胞，可明显降低血清、口、肛、粪便中病毒粒子拷贝数，有效的减轻实验各脏器的病理损伤，对非洲猪瘟病毒具有良好的阻断作用，可用于防治非洲猪瘟。

Description

一种融合基因、其编码蛋白及其在抗非洲猪瘟中的应用
技术领域
本申请涉及基因工程技术领域，具体涉及一种融合基因、其编码蛋白及其在抗非洲猪瘟中的应用。
背景技术
本发明背景技术中公开的信息旨在增加对本发明总体背景的理解，而该公开不应必然被视为承认或以任何形式暗示该信息已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
非洲猪瘟(African Swine fever，ASFV)是由非洲猪瘟病毒引起猪的一种急性、热性、高度传染性疾病。该病病程短，死亡率高，对养猪业危害极大，世界卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病之一，我国将其列为一类动物疫病。ASFV可感染家猪、野猪和软蜱，是唯一一种节肢动物作为传播媒介的DNA病毒。家猪感染后，多以全身出血、呼吸障碍和神经症状为主要特征，致死率高达100％。
非洲猪瘟的传播方式主要有以下4种：1、直接接触传播，通过与病猪直接接触，或者通过接触感染猪的血液、粪便、尿液以及污染的环境、设备、工具等方式，猪在感染ASFV后，在所有的组织和体液中以及腹泻的粪便中，都可以检测到ASFV，其中，血液中病毒的含量最高，因此在解剖病猪时，环境中也可存在大量的ASFV。2、通过感染猪的肉制品及泔水，也可传播ASFV。3、通过蜱虫的叮咬传播，蜱虫叮咬感染猪后，再次叮咬健康猪后，也可将ASFV传染给健康猪，并且，蜱虫不仅可以起到传播载体的作用，也可作为病毒繁殖基地的储存库，持续带毒数年。4、野猪也可传播ASFV，野猪在感染ASFV后，可能不会发病，但是仍具有传播病毒的能力，
ASF是一种严重出血热为特征的疫病，死亡率高达100％，对全世界的养猪业都是毁灭性的打击。不仅造成了巨大的经济损失，而且还威胁了全世界的食品安全和养猪业的发展。虽然ASFV只有一种血清型，但是病毒的毒力差异比较大，能够引起最急性、急性、亚急性、慢性和亚临床ASF，我们常见的是最急性型和急性型。家猪感染ASF一般发病急、死亡率高，急性病理的病理变化与败血症型的猪瘟相仿，病变主要以皮肤发绀，体腔积液，大部分内脏器官充血，出血，以及内皮细胞的损伤和脾脏、淋巴结的广泛性坏死为主。病理学变化主要集中在血管、淋巴结、脾脏、肾脏和肺脏。亚急性症状与急性症状相似，但病变较轻，慢性的ASF常常伴随着慢性肺炎、关节炎、皮肤点状出血等症状。ASF不感染人，不会对人的生命造成威胁，但是对食品安全会带来严重的影响，很多国家猪都是重要的动物蛋白质来源，在疫情爆发后，ASF不仅会导致猪的死亡，同时还会对猪的生产能力造成下降，严重影响着养猪业的发展。
传染性疾病控制最有效的手段就是预防，接种疫苗被认为是最有效的措施，虽然ASFV被研究近一百年了，但是由于其复杂的结构、编码众多的毒力蛋白、能够在巨噬细胞中复制并且具有多种逃逸机制等特点，到现在也没开发出商品化的疫苗，所以，ASF的防控难度仍然很大。这些年所研究的疫苗有ASFV灭活疫苗、ASFV活疫苗、ASFV DNA疫苗、以及ASFV亚单位疫苗等，但是经临床应用后，虽可以激发机体产生高水平的抗体，但对病毒的再次感染却没有很好的保护作用，同时，活疫苗与弱毒苗存在散毒等缺点。
ASFV是一种较大的胞质内复制的病毒，呈对称二十面体，直径200nm，同心圆状结构，中央为核质体，直径80nm，由病毒基因组、完成基因早期转录所必须的酶以及一些DNA结合蛋白组成。核质体外是一些蛋白组成的核衣壳，主要包括P72，核衣壳外是病毒内层囊膜，该囊膜结合着一些蛋白，如P54等。随着基因工程技术的发展，基因工程疫苗逐渐走向大众的视野，而乳酸菌作为益生菌的代表，越来越被大众所接受。乳酸菌的表达系统已经很成熟，通过基因工程技术改造和人工发酵培养，包被制成的活的微生态制剂。但是，如何提供一种具有良好免疫原性的抗原蛋白，并能够通过乳酸菌表达系统表达出来，具备良好的表达量，且能够切实有效的发挥保护效力，却总会有因为各种因素比如表达的蛋白的定位、表达的蛋白的稳定性、以及转录-翻译-分泌的过程和条件等的影响而使得菌株的性能及目的蛋白的表达难以预期。
发明内容
为了改善现有技术的不足，本发明提供了一种融合基因、其编码蛋白及其在抗非洲猪瘟中的应用。本发明选取非洲猪瘟病毒中具有吸附血细胞功能的核衣壳外膜蛋白CD2V基因序列和病毒包膜蛋白P17基因序列，结合佐剂结核分枝杆菌的表面蛋白HBHA(结合血凝素)基因和轮状病毒的毒力基因NSP4基因，构建了一组融合基因片段CD2V-P17-HBHA-NSP4，该基因能够编码激发机体抗非洲猪瘟感染的融合蛋白，且该蛋白具有良好的免疫原性。同时，为了更好地实现发挥作用，本发明还提供了能够表达该融合基因产生具有良好免疫原性蛋白的重组植物乳杆菌，该菌具有良好的生长性能，可通过口服饲喂方式使猪获得免疫，以该重组菌进行免疫的猪在进行攻毒后，能够产生高水平CD8+T细胞，可明显降低血清、口、肛、粪便中病毒粒子拷贝数，有效的减轻实验各脏器的病理损伤，对非洲猪瘟病毒具有良好的阻断作用，有良好的防治非洲猪瘟潜力。
具体地，本发明提供了下述的技术特征，以下技术特征的一个或多个的结合构成本发明的技术方案。
在本发明的第一方面，本发明提供了一种融合基因，其包含非洲猪瘟病毒核衣壳外膜蛋白CD2V基因和病毒包膜蛋白P17基因与选自结核分枝杆菌表面蛋白HBHA基因和轮状病毒毒力基因NSP4基因中的至少一种。比如，在本发明的一些实施方式中，所述融合基因中包含CD2V-P17-HBHA基因片段，或者包含CD2V-P17-HBHA-NSP4基因片段。
在本发明的一些实施方式中，所述融合基因包含或至少由CD2V基因、P17基因、HBHA基因和NSP4基因组成。
在本发明的一些实施方式中，所述融合基因的序列包含下述1)至3)中任一项中所述的序列：
1)如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4中所示的核苷酸序列；
2)如SEQ ID NO：5中所示的序列；
3)在高严谨条件下可与SEQ ID NO：5所示序列杂交的核苷酸序列；
4)与SEQ ID NO：5中所示核苷酸序列具有至少90％序列同源性的、且具有相同功能的核苷酸序列。
在本发明的第二方面，本发明提供了一种激发机体抗非洲猪瘟感染的融合蛋白，其由上述第一方面中所述的融合基因编码，其氨基酸序列中包含与SEQ ID NO：6中所示的氨基酸序列具有至少90％序列同源性的序列；优选地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQID NO：6中所示。
在本发明的第三方面，本发明提供了含有上述第一方面中所述的融合基因的表达载体。
在本发明的一些实施方式中，所述表达载体以含有pSIP409-pgsA’(ata)的质粒为基础质粒；进一步地，在一些实施方式中，所述表达载体为pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4，其由pSIP409-pgsA’(ata)与融合基因CD2V-P17-HBHA-NSP4片段连接得到。优选地，pSIP409-pgsA’(ata)与CD2V-P17-HBHA-NSP4片段使用T4连接酶连接。其中，pSIP409-pgsA’(ata)为无抗生素标签表达载体。
在本发明的一些实施方式中，所述pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4的核苷酸序列如SEQ ID NO：7中所示。
在本发明的第四方面，本发明提供了含有上述第一方面中所述的融合基因的转基因细胞系。
在本发明的第五方面，本发明提供了含有上述第一方面中所述的融合基因的工程菌。
在本发明的一些实施方式中，所述工程菌的出发菌株为植物乳杆菌，优选为植物乳杆菌NC8(Lactobacillus plantarum NC8)，更优选为丙氨酸消旋酶基因(alr)缺陷型植物乳杆菌，简称为NC8Δalr。
在本发明的较为具体的实施方式中，本发明提供了构建上述工程菌的方法，包括：将目的基因片段CD2V-P17-HBHA或CD2V-P17-HBHA-NSP4与无抗生素标签表达载体pSIP409-pgsA’(ata)连接，比如通过T4连接酶连接，将连接产物电转化后获得质粒pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA或pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4，将该质粒电转化至植物乳杆菌NC8Δalr中，即得重组工程菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA或NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4，经培养，该菌具有良好的生长性能，能够更快速地生长并进入生长稳定期，且其稳定期后的活菌衰减速度小于出发菌株，并且该重组工程菌能够良好的表达保护性抗原CD2V-P17-HBHA或CD2V-P17-HBHA-NSP4，且该抗原具有良好的免疫原性。尤其，CD2V-P17-HBHA-NSP4具有更为优异的免疫原性。
在本发明的一些实施方式中，将本发明的重组工程菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA、NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4饲喂小鼠，能够有效的提高血清中的IgG及粪便中分泌型IgA，有效刺激脾细胞中淋巴细胞分泌IFN-γ，提高小鼠的细胞免疫力，同时也有效的提高PP结中，B淋巴细胞产生的IgA，发挥着体液免疫作用，以及，通过抗原刺激时，肠系膜淋巴细胞可以增殖分化。并且，上述两株重组植物乳杆菌相较于NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17效果均更优，且尤其重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4能够表现出更为优异的效果。
在本发明的一些实施方式中，发明人以构建的重组工程菌在P3实验室中对猪进行了攻毒实验，通过实验结果可以发现，重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4经口服灌胃免疫仔猪后，相较于对照组可对仔猪产生明显的保护作用。攻毒后，与对照组相比，可维持实验组体温处于正常水平。可促进实验组血清中产生高水平的CD8+T细胞。与对照组相比，可明显降低血清、口、肛、粪便中病毒粒子拷贝数。从病理角度，可有效的减轻实验各脏器的病理损伤。对非洲猪瘟病毒具有良好的阻断作用。同时，发明人将NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17、NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA和NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4三株重组植物乳杆菌进行复配(比如1:1:1的比例进行混合复配)，在相同饲喂量的情况下，会对仔猪产生相较于三株菌更为有利的保护作用。
在本发明的第六方面，本发明提供了一种药物组合物或药物制剂或饲料，其包含上述第二方面中所述的激发机体抗非洲猪瘟感染的融合蛋白或上述第五方面中所述的工程菌。
在本发明的一些实施方式中，本发明所述药物组合物或药物制剂中包含本发明所述的至少一种上述第二方面中所述的激发机体抗非洲猪瘟感染的融合基因编码的蛋白或者包含至少一种上述第四方面中所述的激发机体抗非洲猪瘟感染的融合基因的工程菌，以及，在此基础上，所述药物组合物或药物制剂还可以包含至少一种药物载体或药学上可接受的辅料，或者其他治疗有效的试剂。其中，合适的药用辅料可以是本领域已知的种类，比如溶剂、缓冲剂、稀释剂等等，例如可以是作者Paul J Sheskey等人编著的《药用辅料手册》(Handbook of Parmaceutical Excipients)中所记载的。或者，所述饲料中除包含本发明所述的融合蛋白中的至少一种或者包含本发明所述的重组植物乳杆菌中的至少一种的基础上，还可以包含其他动物尤其猪生长所需的可食用物质，比如粮食类包括大豆、豆粕、玉米、谷物等、鱼粉、氨基酸、杂粕、乳清粉、油脂、肉骨粉、饲料添加剂、维生素、微量元素等等。
以及，在本发明的一些优选的实施方式中，所述药物组合物或药物制剂或饲料中可以同时包含上述第二方面所述的激发机体抗非洲猪瘟感染的融合蛋白中的一种或多种的组合，比如CD2V-P17-HBHA蛋白或CD2V-P17-HBHA-NSP4蛋白，或者CD2V-P17-HBHA蛋白和CD2V-P17-HBHA-NSP4蛋白的组合，比如以1:1比例复配，或者在此基础上还可以进一步包含其他有功能或者无功能的成分，比如CD2V-P17蛋白等。以及，所述药物组合物或药物制剂或饲料中可以同时包含上述第五方面所述的工程菌中的一种或多种的组合，比如，可以同时包含NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA或NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4，或者NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA和NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4的组合，比如以1:1比例复配，或者在此基础上进一步包含其他有功能或无功能的成分或菌株，比如NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17。
在本发明的第七方面，本发明提供了一种表达上述第二方面中所述的激发机体抗非洲猪瘟感染的融合蛋白的方法，其包括：构建含有上述第一方面中所述的融合基因的表达载体，再将构建的表达载体导入宿主细胞获得重组菌株，培养该重组菌株，最后从培养物中分离出融合蛋白。比如构建上述第三方面所述的表达载体，并导入为乳杆菌NC8，尤其是丙氨酸消旋酶基因(alr)缺陷型植物乳杆菌NC8Δalr中构建得到上述第五方面中所述的工程菌，然后培养并表达目的蛋白，比如CD2V-P17-HBHA或CD2V-P17-HBHA-NSP4。
在本发明的第八方面，本发明提供了上述第一方面中所述的融合基因或上述第二方面中所述的激发机体抗非洲猪瘟感染的融合蛋白或上述第五方面中所述的工程菌在制备预防和/或治疗非洲猪瘟的疫苗或药物或饲料中的应用。
通过上述一个或多个技术手段，可实现以下有益效果：
本发明选取非洲猪瘟病毒中具有吸附血细胞功能的核衣壳外膜蛋白CD2V基因序列和病毒包膜蛋白P17基因序列，结合佐剂结核分枝杆菌的表面蛋白HBHA(结合血凝素)基因和轮状病毒的毒力基因NSP4基因，构建了一组融合基因，该基因能够编码激发机体抗非洲猪瘟感染的融合蛋白，且该蛋白具有良好的免疫原性。同时为了提高其效果，本发明还提供了能够表达该融合基因产生保护性抗原CD2V-P17-HBHA-NSP4的重组植物乳杆菌，该菌具有良好的生产性能，相较于其出发菌株，在稳定期后活菌的衰减速度更慢，可通过口服该菌获得免疫，具有良好的免疫效果，攻毒后可促进血清中产生高水平CD8+T细胞，可明显降低血清、口、肛、粪便中病毒粒子拷贝数，有效的减轻实验各脏器的病理损伤，对非洲猪瘟病毒具有良好的阻断作用，可用于防治非洲猪瘟。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本申请的实施方案，其中：
图1：重组乳酸菌的构建，A：目的片段PCR结果，其中，M：5000marker，1-3为融合基因CD2V-P17-HBHA-NSP4的验证；B：双酶切结果，其中，M：10000marker，1：连接至无抗载体中的双酶切验证；C：重组乳酸菌的PCR结果，其中，M：5000marker，1：乳酸菌PCR验证未成功，2：成功的PCR验证。
图2：重组乳酸菌的革兰氏染色镜检图。
图3：融合蛋白CD2V-P17-HBHA-NSP4的验证，目的基因导入至乳酸菌中，对乳酸菌表达目的蛋白的验证，M：170KDmarker。1：未加入目的基因的空载体乳酸菌。2：插入目的基因CD2V-P17-HBHA-NSP4，经验证表达的蛋白大小为98KD。
图4：优化融合蛋白CD2V-P17-HBHA-NSP4诱导剂用量，M：170KDmarker，1：加入诱导剂10ng/ml，2：加入诱导剂100ng/ml。
图5：优化融合蛋白CD2V-P17-HBHA-NSP4诱导剂添加时间；M：180KDmarker，1:接菌后3.5h加入诱导剂，2：接菌后4.5h加入诱导剂，3：接菌后5.5h加入诱导剂。
图6：脾脏中CD8+(A)、CD4+(B)T细胞中IFN-γ的表达情况，重组乳酸菌NC8Δalr-pSIP409pgsA'-CD2V-P17-HBHA-NSP4和复合乳酸菌组与其他各组具有差异。
图7：PP结的树突细胞中CD80、CD86表达情况结果，重组乳酸菌NC8Δalr-pSIP409pgsA'-CD2V-P17-HBHA-NSP4和复合乳酸菌组与其他各组具有极显著差异。
图8：PP结中B220和IgA含量的变化结果。
图9：淋巴细胞增值结果，NC8Δalr-pSIP409pgsA'-CD2V-P17-HBHA-NSP4和复合乳酸菌组与其他各组具有差异。
图10：(A)3Day、10Day、20Day、30Day小鼠粪便中分泌型SIgA的检测结果；(B)3Day、10Day、20Day、30Day小鼠血清中IgG的测定结果。
图11：猪实验中各组的体温变化情况。
图12：猪实验中免疫后第14天的流式结果，实验组与对照组CD8具有显著性差异。
图13：猪实验中攻毒后第7天的流式结果，实验组与对照组CD8具有差异极显著。
图14：对攻毒后的每天咽拭子进行病毒粒子定量，在第6天和第7天差异极显著。
图15：对攻毒后的每天粪便进行病毒粒子定量，在第3天差异极显著。
图16：对攻毒后的血清进行病毒粒子定量，在第3天、第5天、第7天差异极显著。
图17：对解剖后各组肠段及各器官组织中病毒粒子定量，各组织器官实验组与对照组具有显著性差异，左图：各肠段病毒定量；右图：各脏器病毒定量。
图18：各组脾脏和肾脏的解剖直观图比较情况。
图19：比较各组肠道解剖直观图中的肠系膜淋巴结。
图20：比较各组腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结的病理变化。
图21：比较各组肾脏、脾脏病理变化。
图22：比较各组十二指肠、空肠的病理变化。
图14-17中的虚线为基线，基线为空白组的样本进行定量后的数值所绘制的标准线。
上述图中，*p＜0.1；**p＜0.05；***p＜0.01。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本申请。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本申请所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本申请所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1重组乳酸菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4的构建
1.材料
1.1菌种及质粒
非洲猪瘟保护性抗原CD2V-P17及佐剂HBHA和NSP4委托苏州金维智生物有限公司合成、植物乳杆菌NC8(Lactobacillus plantarum NC8)、PUCVector(pMD18-T SimpleVector)、穿梭表达载体(大肠杆菌/乳酸菌)pSIP409、E.coliχ6212、含有丙氨酸消旋酶基因alr的质粒pSIP409-pgsA’-EGFP(ata)，均由吉林农业大学王春凤教授团队实验室构建或保存，上述材料均可以从吉林农业大学王春凤教授团队实验室获得。
1.2酶及主要试剂
限制性核酸内切酶(Xba I和Hind III)、
Figure BDA0003329922300000061
Max DNA Polymerase、SppIP购于宝生物工程大连有限公司，T4连接酶、快速连接酶、无缝克隆试剂等购于碧云天生物科技有限公司，质粒小提试剂盒和DNA凝胶回收与纯化试剂盒购于美国Omega Bio-Tek公司；10×M buffer、10×T4 buffer、D-丙氨酸和2％Gly，由吉林农业大学实验室配制并保存。
1.3培养基
LB大肠杆菌液体培养基：氯化钠10.0g/L、胰蛋白胨10.0g/L、酵母提取物5.0g/L，121℃灭菌20min。固体培养基需加1.5％的琼脂。
MRS培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、柠檬酸铵2g/L、乙酸钠5g/L、吐温-80 1mL/L，pH值6.0±0.05，121℃灭菌20min。固体培养基需加1.2％的琼脂。
1.4转化试剂
电击缓冲液：MgCl2 0.029g、蔗糖34.21g、dH2O 80mL，以稀盐酸将溶液pH调至7.4，加入蒸馏水定容至100mL，121℃灭菌20min，-20℃储存备用。
清洗缓冲液：Na3PO4 0.19g、MgCl2 0.009g；dH2O 80mL以稀盐酸将pH调至7.4，加入蒸馏水定容至100mL，121℃灭菌20min，-20℃储存备用。
1.5 Western Blot试剂
5×电泳缓冲液(pH 8.3)：甘氨酸94.0g、Tris碱15.1g、10％SDS 50.0mL、dH2O600mL，将pH调至8.3，加入蒸馏水定容至1000mL，分装后备用，5倍稀释使用。
1.5mol/L Tris·Cl(pH 8.8)：Tris碱18.15g，以适量蒸馏水充分溶解，将pH调至8.8，加入蒸馏水定容至100mL，121℃灭菌20min，4℃储存备用。
1.0mol/L Tris·Cl(pH 6.8)：Tris碱6.0g，以适量蒸馏水充分溶解，将pH调至6.8，加入蒸馏水定容至100mL，121℃灭菌20min，4℃储存备用。
1×SDS上样缓冲液：甘油10.0mL、SDS 2.0g、DTT 1.0mL、溴酚蓝0.1g、Tris碱0.6055g，以适量蒸馏水充分溶解，将pH调至6.8，加入蒸馏水定容至100mL，分装备用。
染色液：异丙醇500mL、考马斯亮蓝R-250 2.5g、冰乙酸100mL，加入蒸馏水定容至1000mL后，分装备用。
脱色液：无水乙醇50mL、冰乙酸100mL，加入蒸馏水定容至1000mL，分装备用。
凝胶保存液：冰乙酸7mL，加入蒸馏水定容至100mL，常温储存，分装备用。
封闭液：PBS 20mL、BSA 0.3g，充分溶解后即可使用，现用现配。
1.6琼脂糖凝胶电泳相关试剂
琼脂糖凝胶(0.8％)：1×TAE 100mL、琼脂糖0.8g，微波炉加热直至完全溶解，温度冷却至约70℃加入5μL EB并混匀，倒入凝胶板中，完全凝固后即可使用。
20mg/mL SppIP：SppIP 0.1g、ddH2O 4mL，加入蒸馏水定容至5mL，以滤器(0.22μm)进行过滤除菌，分装后于-20℃储存。
2方法
2.1基因的合成及优化
本发明选取非洲猪瘟病毒SY-18毒株中具有吸附血细胞功能的核衣壳外膜蛋白CD2V基因序列和病毒包膜蛋白P17基因序列，在此基础上结合结核分枝杆菌的表面蛋白HBHA-结合血凝素基因及轮状病毒的毒力基因NSP4，构建获得目的基因CD2V-P17-HBHA-NSP4，连接到克隆载体pUC中，得到pUC-CD2V-P17-HBHA-NSP4。
其中，CD2V的核苷酸序列如SEQ ID NO：1中所示，P17的核苷酸序列如SEQ ID NO：2中所示，HBHA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3中所示，NSP4的核苷酸序列如SEQ ID NO：4中所示。
2.2目的片段的回收及酶切
对含有非洲猪瘟基因的质粒pUC-CD2V-P17-HBHA-NSP4，使用限制性核酸内切酶Xba I和Hind III对质粒进行双酶切，通过琼脂糖凝胶电泳，确定目的条带，然后使用胶回收试剂盒，将目的片段回收，得到了片段CD2V-P17-HBHA-NSP4，同时，也对片段进行PCR验证。
引物序列：F----TCTAGAATGATCATCTTAATCTTCCTGA(SEQ ID NO：9)
R----AAGCTTTTAATGGTGATGGTGATGATGCATACTTGC(SEQ ID NO：10)
反应体系：Prime STAR Max 50μL、ddH2O 44μL、上游引物F 2μL、下游引物R 2μL、模板2μL(10×)。反应条件为：98℃预变性20s，98℃变性10s，50℃退火5s，72℃延伸30s，共30个循环。
酶切体系如下：PCR回收产物40μL、10×M buffer 5μL、HindⅢ2.5μL、XbaI 2.5μL，放入37℃水浴锅中酶切过夜，产物电泳后载体使用胶回收试剂盒回收。
2.3含有pSIP409-pgsA’(ata)载体片段的酶切回收
以含有pSIP409-pgsA’(ata)表达载体的质粒pSIP409-pgsA’-EGFP(ata)为基础质粒，使用HindⅢ、XbaI进行双酶切。酶切体系如下：pSIP409-pgsA’-EGFP(ata)40μL、10×Mbuffer 5μL、HindⅢ2.5μL、XbaI 2.5μL，放入37℃水浴锅中酶切过夜，产物电泳后载体使用胶回收试剂盒回收。
2.4将含有目的片段的CD2V-P17-HBHA-NSP4与pSIP409-pgsA’(ata)载体片段连接
将无抗生素标签表达载体pSIP409-pgsA’(ata)与目的片段CD2V-P17-HBHA-NSP4使用T4进行连接，DNA连接反应体系为：载体1.5μL、HN片段7μL、T4连接酶0.5μL、10×T4buffer 1μL，放入16℃金属浴中连接过夜。
2.5连接产物电转至大肠杆菌6212感受态
将上述连接产物转化至大肠杆菌χ6212电转感受态中，转化后取100μL菌液涂布于LB平板；次日挑取菌落进行提质粒测序验证，得到的阳性质粒命名为pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4。
2.6植物乳杆菌感受态的获得及鉴定
(1)取-80℃冻存的植物乳杆菌NC8Δalr接种于5mL含D-丙氨(0.2mg/mL)的MRS培养液中，30℃厌氧条件下培养过夜；
(2)含D-丙氨酸(0.2mg/mL)的MRS固体培养基上接种适量菌液，30℃厌氧条件下培养至长出状态良好的单个菌落，约36-48h
(3)取5mL含D-丙氨酸(0.2mg/mL)的MRS液体培养基(含2％Gly)接种培养生长良好的单个菌落，30℃厌氧条件下培养直至菌液OD600值为0.6；
(4)取20mL含D-丙氨酸(0.2mg/mL)的MRS液体培养基(含2％Gly)接种培养30μL上述菌液，30℃厌氧条件下继续培养直至菌液OD600值为0.4；
(5)冰浴上述OD600值为0.4的菌液20min，4℃条件下5000r/min离心10min，收集菌体沉淀；
(6)将菌体沉淀以冰冷的2mL清洗缓冲液重悬，4℃条件下5000r/min离心10min，并重复清洗两次，收集菌体沉淀；
(7)将菌体沉淀以冰冷的400μL电击缓冲液重悬，冰浴10min后以每管100μL进行分装备用
2.7植物乳杆菌NC8Δalr的电转化
(1)取5μL重组质粒pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4加入两管冰浴的100μL乳酸菌感受态中，轻缓混匀，移入提前预冷的0.2cm间距的电击杯内，静置冰浴5min后，放入电转化仪(2.5Kv,6ms)中进行电击；
(2)电转化结束后，立即静置冰浴5min，取电击杯内液体加入到800mL 30℃预热的MRS培养液中，30℃厌氧条件下培养3h；
(3)将MRS固体培养基上均匀涂布100μL上述菌液，30℃厌氧条件下培养至长出状态良好的单个菌落，约36-48h。
2.8重组植物乳杆菌质粒的提取及鉴定
向MRS培养液中接种状态良好的乳酸菌单个菌落，30℃厌氧条件下过夜培养，以质粒小量提取试剂盒(革兰氏阳性菌)进行质粒提取。将所提质粒分别进行双酶切和PCR鉴定。对提取的质粒使用HindⅢ和XbaI进行双酶切检测是否含有目的条带。
3实验结果
3.1序列信息
CD2V-P17-HBHA-NSP4核苷酸序列如SEQ ID NO：5中所示，
CD2V-P17-HBHA-NSP4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6中所示。
pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4的核苷酸序列如SEQ ID NO：7中所示。
pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4的氨基酸序列如SEQ ID NO：8中所示。
3.4重组植物乳杆菌酶切鉴定
重组植物乳杆菌提取的质粒能酶切出约8.1kb的载体和2.6kb的目的条带，结果与预期相符，见图1，证明该菌株含保护性抗原CD2V-P17-HBHA-NSP4片段。
3.5重组植物乳杆菌甘油管保存
鉴定阳性的重组植物乳杆菌单菌落命名为重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4。与实施例1相同的方法，发明人同时还构建了根据上述方法发明人还构建了重组乳酸NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA和NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17，在免疫小鼠实验中，本发明将三株菌分别免疫小鼠，然后进行比较。
实施例2重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4蛋白表达情况及免疫源性分析
1材料
菌株：本发明实施例1获得的重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4。
培养基：MRS培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、柠檬酸铵2g/L、乙酸钠5g/L、吐温-80 1mL/L，pH值6.0±0.05，121℃灭菌20min。固体培养基需加1.2％的琼脂。
2方法
2.1形态学分析
取10μL重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4甘油管保存液涂布于MRS琼脂平板，于30℃培养48h。挑取平板上生长的乳杆菌典型单菌落(短杆、中等大小、凸起、微白色边缘整齐)进行革兰氏染色和过氧化氢酶试验。
2.2重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4最佳诱导剂浓度筛选
将鉴定阳性的重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4甘油管保存液0.5mL接种于100mL的MRS培养基中，30℃恒温培养过夜后，2％接种量转接新鲜灭菌的MRS培养基，继续培养3h后(OD600≈0.3)加入不同量的诱导剂SppIP，诱导剂终浓度分别为10和100ng/mL。诱导16h后，收集各组菌体沉淀，并用PBS重悬后调整各组菌悬液的OD600值达到统一，分别取20mL进行超声波破碎等处理。
具体条件为：超声功率300W，超声2s，间歇5s，每个样品超声20min，超声完成后加入终浓度为0.35g/mL的硫酸铵，4℃静置过夜，次日4℃条件下12000g离心10min，弃掉上清，沉淀用300μL PBS重悬，4℃条件下12000g离心10min，取上清与4×蛋白上样缓冲液混匀后，煮沸10min，迅速冰浴5min，12000g离心3min，取上清20μL上样，以蛋白质标准分子量为参考，在12％SDS-PAGE上进行电泳分析。
2.3重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4最佳诱导剂添加时间筛选
将鉴定阳性的重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4甘油管保存液0.5mL接种于100mL MRS培养基中，30℃恒温培养过夜后，2％接种量转接新鲜灭菌的MRS培养基，30℃静置培养，分别在培养3.5h(OD600≈0.489)、4.5h(OD600≈0.545)、5.5h(OD600≈0.630)后加入相同量的诱导剂(终浓度100ng/mL)，同时以不加诱导剂组为对照，诱导6h后取样，并进行离心、超声波破碎等前处理，处理和检测条件同上。
2.4目的蛋白SDS-PAGE电泳及Western blot检测方法
用于染色的PAGE胶用考马斯亮蓝染色液浸泡凝胶，在摇床上染色30-45min，将凝胶浸泡于脱色液中，脱色2-4h，其间换脱色液数次，直至有清晰条带出现为止。用于转印的PAGE胶，按仪器说明安装转印系统，在Biorad 1645050转印仪上进行转印操作，恒流300mA转印60min，取出转印后的膜。转印后的PVDF膜转移至封闭液中于37℃封闭1h；然后利用抗鼠的HIS标签抗体按照1:1000进行稀释作为一抗，于4℃反应过夜；用PBST洗膜3次，每次10min；二抗HRP标记的羊抗鼠IgG按1:5000稀释，于室温摇床震荡1h；用PBST洗膜3次，每次10min；使用超敏ECL化学发光试剂盒(购自碧云天生物技术有限公司)及天能化学发光成像系统进行观察。
3结果
3.1形态学分析
革兰氏染色呈阳性，镜检图(图2)可见为菌体杆状或链杆状，过氧化氢酶试验为阴性，符合植物乳杆菌的形态
3.2重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4最佳诱导剂浓度筛选
酶切鉴定阳性的重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4表达样品经蛋白电泳，可见NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4菌株在98kDa大小附近有条带，而NC8Δalr空载体菌株未见相应条带。结果表明重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4能够表达保护性抗原CD2V-P17-HBHA-NSP4且该蛋白具有免疫原性。最佳诱导剂添加浓度为100ng/mL。结果如图3所示。
3.3重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4最佳诱导剂添加时间筛选
由图4可以看出，重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4在接种后培养3.5-5.5h时添加诱导剂均可成功表达目的蛋白，从表达蛋白条带来看，各时间点目的蛋白表达量差异不显著，以培养4.5h时(对数生长期中期附近)添加诱导剂的蛋白表达量相对较高。
3.4目的蛋白Western blot检测结果
酶切鉴定阳性的重组植物乳杆菌表达样品转膜后与抗鼠的His抗体发生特异性结合(图5)，进一步证明了重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4能够表达CD2V-P17-HBHA-NSP4，且该蛋白具有免疫原性。
实施例3重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4的免疫效果评价
1材料
菌株：本发明实施例1获得的重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4。
培养基：MRS培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、柠檬酸铵2g/L、乙酸钠5g/L、吐温-80 1mL/L，pH值6.0±0.05，121℃灭菌20min。固体培养基需加1.2％的琼脂。
动物：SPF级BALB/c小鼠，20只。
抗体：PE Hamster Anti-Mouse CD3e、APC Hamster Anti-Mouse CD4、FITCHamster Anti-Mouse CD8、PE Hamster Anti-Mouse IFN-г、PE Hamster Anti-Mouse IL-4。
2方法
2.1重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4生长曲线的测定
将重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4甘油管保存液0.5mL接种于100mL MRS培养基中，30℃恒温培养过夜后，按照1％的接种菌量接种于装有500mL MRS培养基的细口玻璃瓶中，30℃恒温静置过夜，发酵时间46h，在此期间，间隔不同时间取样，检测发酵液的OD600值、pH值和活菌数。2个平行，以平均值绘制生长曲线。与此同时，在相同条件下检测空载体菌株植物乳杆菌NC8的生长曲线，并与重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4进行比较，结果见表1。
表1：重组乳酸菌生长数据
Figure BDA0003329922300000101
Figure BDA0003329922300000111
2.2结果分析
重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4接种后2h进入对数生长期，活菌数增长较快。接种后8h逐步进入稳定期，8-28h期间活菌数变化不大，稳定期活菌数最高为6.2×109CFU/mL。28h后逐渐进入衰亡期，活菌数迅速下降。植物乳杆菌NC8稳定期活菌数最高为3.8×109cfu/mL，低于重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4，稳定后期活菌数衰减速度快于重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4。
3免疫动物实验
实验共分为6组，每组十只小鼠，分为：实验组4组(喂重组菌、复合乳酸菌组)、空载体菌组、对照组(PBS)。
其中，实验组4组，分别饲喂NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4、NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA和NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17，复合乳酸菌组(将三株菌按照1：1：1，)
免疫程序：实验组连续免疫三天，空七天，在免疫三天，空七天，在免疫三天，空七天，分别在第十天、二十天、三十天、采血，做流式，每三天采粪。空载体组和对照组同理。
3.1实验步骤：首先对重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4、NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA和NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17分别进行计数，当菌量达到1×109CFU/mL时，对小鼠进行口服免疫，保证每次灌胃无溢出。在第十天，各组取3只小鼠，进行流式检测。流式步骤如下：
(1)分别对小鼠采取眼球采血、处死。
(2)在超净台中，分别取小鼠的脾脏、PP结、肠系膜淋MLN巴结置于冰上。
(3)研磨脾在铜网中加1mL完全培养基，研磨后吸到1.5EP，2000rpm，5min,4℃，弃上清(离心机平的),加500μL红细胞裂解液，冰上裂解3min后加500μL PBS混匀静止2min。离心2000rpm，5min，4℃，弃上清。1mLPBS洗1遍弃上清加1mL完全培养基。
(4)MLN在铜网中加1mL完全培养基，研磨后吸到1.5EP，2000rpm，5min,4℃，弃上清(离心机平的),1mLPBS洗1遍弃上清加1mL完全培养基。
(5)研磨pp结时，在铜网中加1mL完全培养基，研磨后吸到1.5EP，2000rpm，5min,4℃，弃上清(离心机平的),1mLPBS洗1遍弃上清加1mL完全培养基。
(6)细胞计数：在冰上，将脾细胞原液100倍稀释(10μL+990μL PBS)、MLN细胞20倍稀释(50μL+950μL PBS)、PP结细胞20倍稀释(50μL+950μL PBS)，然后通过血细胞计数板进行计数，计算出1x106的细胞需要多少微原液。
(7)抗体的稀释：分别对流式抗体B220+IgA、CD11+CD80+CD86+、CD3 CD4 CD8/IFN-γIL-4进行稀释，避光、置于冰上。
(8)PP表面(生发中心)ISO单标B220+IgA，B220+(APC，110x)、IgA(FITC,40x)，pp胞内：100μL样+B220APC10μL，4℃避光20min，1％BSA的PBS洗一次，离心弃上清，加250μL甲醛固定液，4℃避光20min，加800μL穿膜液混匀(用娃哈哈1:9稀释)，立即离心，弃上清，第二次加1mL穿膜液，室温避光静止5分钟，离心弃上清(不用PBS洗)，剩100μL直接加IgA+FITC,(40倍稀释)，避光4℃孵育20min。孵育后离心弃上清，用1mLPBS洗一遍，弃上清，加入250μLPBS混匀。过膜上机。
(9)CD11c+,(APC，40x)、CD80+,(FITC，60x)、CD86+，(PEcy7，40x),10μL样+各加10μL共30μL(可提前将三种稀释后的抗体混在一起)。4℃避光20min，1mL的PBS洗一遍，弃上清，加入250μLPBS混匀。过膜上机。
(10)MLN，Spleen(24孔板)ISO单标CD3 CD4 CD8/IFN-γ、IL-4，分别取2x106/孔的细胞铺于48孔板中，然后加入离子霉素(1:10)、PMA(1:100)、阻断剂(1:40)，刺激6h，将细胞洗下于1.5mL离心管中，分别加入抗体CD3 CD4 CD8，4℃避光20min，1％BSA的PBS洗一次，离心弃上清，加250μL甲醛固定液，4℃避光20min，加800μL穿膜液混匀(用娃哈哈1:9稀释)，立即离心，弃上清，第二次加1mL穿膜液，室温避光静止5分钟，离心弃上清(不用PBS洗)，剩100μL直接加IgA+FITC,(40倍稀释)，避光4℃孵育20min。孵育后离心弃上清，用1mLPBS洗一遍，弃上清，加入250μLPBS混匀。过膜上机。
3.2粪便中分泌型SIgA的检测
对采集的粪便进行处理，在粪便中加入粪便重量三倍的PMSF蛋白酶抑制剂对粪便进行处理，4℃过夜，3000r离心10min，吸取上清备用。对粪便中的分泌型SIgA检测方法如下：
(1)包被抗原，将纯化好的蛋白用包被缓冲液稀释至3ug/mL，在98孔板中，每孔100μL，密封，4℃过夜。
(2)洗板，向98孔板中每孔加入300μL的PBST，洗板5次，每次3-5min，轻轻震荡，拍干。
(3)封闭，每孔加入300μL的封闭液，封膜，37℃，1h。
(4)洗板，向98孔板中每孔加入300μL的PBST，洗板5次，每次3-5min，轻轻震荡，拍干。
(5)加入一抗，一抗为上面制备的粪便上清液，分别对粪便上清液进行梯度稀释，封膜、37℃，1h。
(6)洗板，向98孔板中每孔加入300μL的PBST，洗板5次，每次3-5min，轻轻震荡，拍干。
(7)加入酶标二抗，二抗使用抗鼠的SIgA抗体(1:100000稀释)，封膜，37℃，1h。
(8)洗板，向98孔板中每孔加入300μL的PBST，洗板5次，每次3-5min，轻轻震荡，拍干。
(9)底物显色，每孔加入100μL的底物显色液，37℃，1h。
(10)终止反应，向每孔中加入50μL的终止液(终止液为2M的浓硫酸)。
(11)酶标仪检测结果，在酶标仪内，检测波长450nm，振板30s，度数。
(12)结果判误：若待测孔OD>0.1且大于阴性对照孔的2.1倍(P/N>2.1)
P：待测样品，在某一稀释倍数测定的OD值，N：为阴性样品，在相应稀释倍数的测定的OD值，判定为阳性。以判定为阳性的样品最高稀释倍数为抗体效价。
3.3血清中IgG的测定
对眼球采到的血，放在37℃，温箱中孵育4h后，5000r进行10min离心，吸取析出的血清备用。对血清中IgG的测定方法如下：
(1)包被抗原，将纯化好的蛋白用包被缓冲液稀释至3ug/mL，在98孔板中，每孔100μL，密封，4℃过夜。
(2)洗板，向98孔板中每孔加入300μL的PBST，洗板5次，每次3-5min，轻轻震荡，拍干。
(3)封闭，每孔加入300μL的封闭液，封膜，37℃，1h。
(4)洗板，向98孔板中每孔加入300μL的PBST，洗板5次，每次3-5min，轻轻震荡，拍干。
(5)加入一抗，一抗为上面制备的血清，分别对血清进行梯度稀释，封膜、37℃，1h。
(6)洗板，向98孔板中每孔加入300μL的PBST，洗板5次，每次3-5min，轻轻震荡，拍干。
(7)加入酶标二抗，二抗使用抗鼠的IgG抗体(1:100000稀释)，封膜，37℃，1h。
(8)洗板，向98孔板中每孔加入300μL的PBST，洗板5次，每次3-5min，轻轻震荡，拍干。
(9)底物显色，每孔加入100μL的底物显色液，37℃，1h。
(10)终止反应，向每孔中加入50μL的终止液(终止液为2M的浓硫酸)。
(11)酶标仪检测结果，在酶标仪内，检测波长450nm，振板30s，度数。
(12)结果判误：若待测孔OD>0.1且大于阴性对照孔的2.1倍(P/N>2.1)
P：待测样品，在某一稀释倍数测定的OD值，N：为阴性样品，在相应稀释倍数的测定的OD值，判定为阳性。以判定为阳性的样品最高稀释倍数为抗体效价。
3.4CCK-8比色法检测T淋巴细胞增殖96孔板
(1)将脾淋巴细胞以5×105个/孔均匀的铺在96孔板中；
(2)设置只有PRMI1640完全培养基的空白对照组(后边也加cck8)、添加淋巴细胞悬液的实验组。(只加细胞，不加刺激物三孔)每组三个重复孔，(96孔板最外围加入PBS保持环境湿度。共87孔，剩余孔加培养基)
(3)每孔加入10μl浓度为10μg/mL的ConA或纯化好的蛋白，混匀后置于37℃，5％CO2培养箱中培养44h。
(4)小心吸取培养基上清，加入90μL新鲜的PRMI1640完全培养基，再加入10μLcck-8溶液继续37℃，5％CO2条件下培养4h。在读取平板之前，可以在摇床上温柔的混匀。然后使用酶标仪测量450nm处的吸光度。
(5)计算刺激指数SI＝[(实验组A值-空白对照组A值)/(PBS对照组A值-空白对照组A值)]。
4实验结果
4.1流式结果
通过流式细胞术，发明人检测了脾脏中CD4和CD8中IFN-γ的表达情况，如图6所示，由结果可知，在脾淋巴细胞CD8+中，实验组重组乳酸菌与对照组相比较IFN-γ的表达情况呈显著性差异，并且复合乳酸菌组表达IFN-γ的量最高，与对照组比较差异显著。在PP结中B220和IgA含量变化情况，如图8所示，由结果可知，实验组重组乳酸菌与对照组相比较，实验组的IgA的表达量高于对照组，其中复合乳酸菌组可以有效的诱导B细胞产生IgA。。在PP结中，CD80和CD86在树突细胞中的表达情况中，实验组与对照组呈极显著差异，复合乳酸菌组可以活化树突细胞，使其向CD80和CD86的方向表达，如图7所示。根据流式结果可知，NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4相较于对照组和空载体菌组以及另外两株重组菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA和NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17实验组，具有显著更优的效果。
4.2粪便中分泌型SIgA的测定
发明人分别检测了第7Day、第21Day、第28Day、第35Day粪便中分泌型的SIgA的表达情况，实验结果如图10A所示：在第7Day中，实验组与对照组相比较呈极显著差异。在第21Day、第28Day中，实验组与对照组相比较呈显著性差异，在第35Day，实验组与对照组相比较，实验组中SIgA的表达量远远超于对照组。并且实验组中的复合乳酸菌组与其他三组实验组比较更加明显，NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4相较于另外两株重组菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA和NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17实验组具有显著更优的效果。
4.3血清中IgG的测定
发明人分别检测了第7Day、第21Day、第28Day、第35Day血清中的IgG的表达情况，实验结果如图10B所示：在第7Day、第21Day、第28Day、第35Day中，实验组与对照组相比较呈极显著性差异，实验组的血清中IgG表达量要远远高于对照组。并且验组中的复合乳酸菌组与其他三组实验组比较更加明显，NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4相较于另外两株重组菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA和NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17实验组具有显著更优的效果。
4.4 CCK-8检测淋巴细胞增殖情况
本发明通过CCK-8检测肠系膜淋巴细胞增殖情况，结果如图9所示，在纯化的蛋白与ConA分别刺激下，纯化蛋白在OD450下的检测结果与ConA的结果相差不大，但与未加刺激剂组相比较，差异显著，本实施例所纯化的蛋白对肠系膜淋巴细胞的增殖有刺激作用，尤其以NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4组和复合乳酸菌组效果最佳。
5结论
动物实验结果表明以本发明实施例中构建的三株重组乳酸菌及其复合乳酸菌进行比较后，复合乳酸菌饲喂小鼠，能够有效的提高血清中的IgG及粪便中分泌型IgA，有效刺激脾细胞中淋巴细胞分泌IFN-γ，提高小鼠的细胞免疫。同时也有效的提高PP结中，B淋巴细胞产生的IgA，发挥着体液免疫作用。通过抗原刺激时，肠系膜淋巴细胞可以增殖分化。
实施例4回归本体动物的攻毒实验
1材料
菌株：重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4。
培养基：MRS培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、柠檬酸铵2g/L、乙酸钠5g/L、吐温-80 1mL/L，pH值6.0±0.05，121℃灭菌20min。固体培养基需加1.2％的琼脂。
动物：SPF级长白猪，9只。
抗体：PE-cy7 Anti-Pig CD3e、PE Anti-Pig CD4、FITC Anti-Pig CD8、Percp-cy5.5 Anti-Pig IFN-г、APC Anti-Pig IL-4(抗体均采购于BD生物科学有限公司)，APCAnti-Pig CD335、PE Anti-Pig CD14、PE Anti-Pig CD163、PE Anti-Pig CD21、FITC Anti-Pig IgA、PE Anti-Pig Gam Dta T cell(均采购于赛默飞生物科技有限公司)。
实验材料：采血管：抗凝剂(用于外周血的检测)、促凝剂(用于血清的分离)、口肛拭子、5mL注射器、FICOL分离液、红细胞裂解液、病理切片、HE染色剂、赖氨酸组化切片、日本羽毛刀片、组化笔、石蜡、包埋盒、多聚甲醛等。
生产材料：教槽饲料、育肥饲料、农夫山泉水、饲养笼子、食槽、水槽、体温计、卫可消毒剂等。
2免疫实验
免疫程序：设置三组，分别为实验组(n＝3)、对照组(n＝3)、空白组(n＝3)。
实验组：将构建成功的重组植物乳酸菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4，经诱导后，乳酸菌的数量达1×1010/mL时，取30mL菌液，分成三份，每只小猪灌服10mL，免疫程序为隔天免疫，共免疫7次。
对照组：每只小猪灌服10mL PBS。空白组：不进行灌服。
每日测温，隔天称体重，在第7Day和第14Day分别采血做流式，隔天采粪，用于粪便中乳酸菌定值及排出量的定量。
3攻毒实验
攻毒地点：中国科学院军事兽医研究所P3实验室。攻毒程序：实验组与对照组中每只小猪通过口服方式攻1×102.5TCID50的病毒。而空白组不攻毒。
每日记录体温、口、肛拭子、收集粪便，隔天采血，用于流式。攻毒后，对出现濒死的猪进行处死，采集淋巴结、脾脏、肾脏等器官和组织，用于病理切片及免疫荧光。
3.1流式方法检测外周血淋巴细胞
Ficoll分离步骤：
1、吸取3mL Ficoll分离液于15mL离心管中。
2、向其上面缓慢加入4mL抗凝血。
3、400*g离心30-40min，18-20℃.
4、离心好后，吸取其中间层，于新的15mL离心管中，加入6mL PBS(2％).
5、60-100*g离心10min，18-20℃.
6、去除上清，在加入6-8mL PBS(2％)，重悬。
7、60-100*g离心10min，18-20℃.
8、去除上清，用10％血清的1640重悬。
9、染抗体前，加入0.5μL CD16/32
外周血淋巴细胞分离，分别检测CD3\CD4\CD8
1、血清封闭：每头500μL抗凝血及血清，各管加入60μL终体积为10％的小鼠血清，室温孵育10min。
2、裂解红细胞：每管加入1.2mL红细胞裂解液(1:3)，室温孵育10min，1000rpm，5min弃上清，加入900μL红细胞裂解液(1:2)，室温孵育10min，1000rpm，5min弃上清，100μLPBS重悬。
3、CD3/CD4/CD8：每管加入CD3-PE-cy7 1.9μL，CD4-PE 1.9μL，CD8-FITC 2μL，轻轻用枪混匀，室温避光孵育30min，1000rpm，5min弃上清，500μL PBS重悬离心两次，最后用200μL PBS重悬，待测。还有3管单标，1管不标，一共25管。加抗体之前预混三种抗体CD3-PE-cy740.75μL，CD4-PE 40.75μL，CD8-FITC 43μL；每个样加5.8μL。
3.2流式检测胞内的细胞因子
1、将分离的细胞取出2.5×106，铺在48孔板中，加入200μL 1640.
2、设置空白组、喂菌组、空载体组(每孔加入刺激剂、离子霉素、阻断剂、蛋白等)。
3、37℃，厌氧培养，6h。
4、将细胞吹下来，吸取至离心管中，染胞外抗体，避光孵育后，用PBS洗一次。
5、细胞加入250μL甲醛固定液，4℃，避光20min，加入800μL穿膜液(1:9)，立即离心，弃上清，第二次加入1mL穿膜液，室温避光静置5min，离心弃上清，剩100μL，加胞内抗体，4℃避光孵育20min，弃上清，用1mL PBS洗一次，离心弃上清，剩300μL，重悬，过膜上机。
3.3对各脏器中非洲猪瘟病毒滴度的定量
3.3.1引物和探针引物和探针针对ASFV B6461，基因的保守序列设计。
上游引物VP72-F1:5'GCTTTCAGGATAGAGATACAGCTCT-3'(SEQ ID NO：11)；
下游引物VP72-R1:5'-CCGTAGTGGAAGGGTATGTAAGAG-3'(SEQ ID NO：12)；
TaqMan探VP72-T1:FAM-CCGTAACTGCTCATGGTATCAATCTTATCG-BHQI(SEQ ID NO：13。
3.3.2扩增体系：
Figure BDA0003329922300000161
3.3.3扩增条件：50℃孵育2min；95℃预变性5min；95℃变性15s.58℃退火延伸1min，45个循环，在每一循环的58℃时收集FAM荧光信号。
3.3.4试验成立条件：阳性对照的Ct值<30且出现特异性扩增曲线，阴性对照无Ct值或阴性对照Ct值240且无特异性扩增曲线，试验结果有效；否则应重新进行试验。
3.3.5荧光PCR结果判定
符合8.5的条件，被检样品Ct值<38且出现特异性扩增曲线，则判为ASFV核酸阳性；当无Ct值或Ct值>40，则判为ASFV核酸阴性；当38<Ct值<40且出现特异性扩增曲线,则判为疑似。对疑似样品，模板量加倍(4pL.DNA模板)进行1次复检，做3个重复；有2个重复Ct值<40且出现特异性扩增曲线即判为ASFV核酸阳性，否则判为ASFV核酸阴性。
3.4病理切片制作步骤
3.4.1样本的处理：将组织完全侵泡在多聚甲醛中4-6Day，待组织完全固定好后，对样品进行处理，切合适大小，置于包埋盒中，准备脱水。
3.4.2脱水：采用酒精梯度脱水(以验证如下脱水时间较合理)，70％2h，80％2h，85％过夜，90％2h，95％Ⅰ1-1.5h，95％Ⅱ1-1.5h，100％Ⅰ1h，100％Ⅱ1h，
3.4.3透明：设二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ，透明时间(肠管较小各1min即可)(肺脏和肝脏可以各2min)，透明到肉眼观察呈煮熟的肉皮样，透明时间切忌不要过长，影响较大。
3.4.4浸蜡与包埋：浸蜡温度为55℃，勿调；蜡Ⅰ、蜡Ⅱ浸蜡时间各为40min，透蜡后将组织放入包埋盒内进行包埋。
3.4.5切片：将包裹好的蜡块置于冰上数分钟，取蜡块安装在切片机上，先切除表面的少量余蜡，然后用冰敷20s，然后开始切片，一般肠段切片设置2.5微米，肝脾等组织设置5.切几片后用毛笔进行拉伸，边切边拉，适当长度后，用镊子夹起，展开在42度的水面，用载玻片挑取。
3.4.6染色：二甲苯1:8-10min，二甲苯2:8-10min。100％酒精3:1min。100％酒精4:1min。95％酒精5:1min。80％酒精6:1min。70％酒精7:1min。水洗，苏木素8:2min。水洗，盐酸-酒精：几秒。水洗，0.5％氨水：1min。水洗，0.5％伊红：2min。80％酒精：2min。95％酒精：2min。100％酒精：2min。100％酒精：2min。
3.4.7烘干和封片：立即将片子放入烘箱中，80度烘干，准备盖片。盖片：在载玻片上加入树脂胶，盖上盖玻片，轻轻挤压，排出气泡。
3.5免疫荧光的制作
3.5.1样本的处理：将组织完全浸泡在多聚甲醛中4-6Day，待组织完全固定好后，对样品进行处理，切合适大小，置于包埋盒中，准备脱水。
3.5.2脱水：采用酒精梯度脱水(以验证如下脱水时间较合理)，70％2h，80％2h，85％过夜，90％2h，95％Ⅰ1-1.5h，95％Ⅱ1-1.5h，100％Ⅰ1h，100％Ⅱ1h。
3.5.3透明：设二甲苯Ⅰ，二甲苯Ⅱ，透明时间(肠管较小各1min即可)(肺脏和肝脏可以各2min)，透明到肉眼观察呈煮熟的肉皮样，透明时间切忌不要过长，影响较大。
3.5.4浸蜡与包埋：浸蜡温度为55℃，勿调；蜡Ⅰ、蜡Ⅱ浸蜡时间各为40min，透蜡后将组织放入包埋盒内进行包埋。
3.5.5切片：将包裹好的蜡块置于冰上数分钟，取蜡块安装在切片机上，先切除表面的少量余蜡，然后用冰敷20s，然后开始切片，一般肠段切片设置2微米，切几片后用毛笔进行拉伸，边切边拉，适当长度后，用镊子夹起，展开在42度的水面，用载玻片挑取。
3.5.6脱蜡：二甲苯5分钟，3次(换新)，无水乙醇5分钟2次，90％乙醇5分钟2次，70％乙醇5分钟1次，蒸馏水5分钟2次(烧杯洗)
3.5.7抗原修复：将切片浸泡在抗原修复液(1X)中，95-100℃加热约20分钟(加热时间可以控制在10-30分钟内，最佳的加热时间需根据不同的样品和目的蛋白自行摸索)。抗原修复液(1X)使用前需预热到95-100℃。加热可以使用普通的水浴锅，也可以使用微波炉加热。如果使用微波炉加热，需注意避免暴沸和过多的水分蒸发。随后大约在20-30分钟内冷却至室温。用免疫染色洗涤液(PBS)洗涤1-2次，每次3-5分钟。
3.5.8用免疫组化笔画圈。(开始避光)5％山羊血清和0.3％triton100(PBS稀释)封闭破膜，室温避光放置60min。(一个样大概15μL)，倾去血清，勿洗，用吸水纸吸干液体，滴加稀释后的一抗4℃避光孵育过夜(潮湿环境)。PBS清洗5min 3次。吸水纸吸干液体，滴加二抗，室温1h。PBS洗，5min，2次。(烧杯洗，不要晃)，DAPI室温避光，PBS洗，5min，3次(烧杯洗)。封片(不要干片)，封完即可观察，没干之前看完。
4结果
4.1外周血淋巴细胞流式结果
在免疫第7Day，本发明分离了外周血淋巴细胞，通过流式可以发现，实验组的CD8高于对照组，呈显著性差异，而CD4/CD8的值中，对照组高于实验组。在免疫第14Day，实验组的CD8略高于对照组，而CD4/CD8的值中，实验组远高于对照组(图12)。在攻毒后第5Day，实验组的CD8远远高于对照组，差异极显著，而CD4/CD8的值中。对照组远远高于实验组，差异极显著(图13)。
4.2对组织中病毒滴度的定量
分别对粪便、口肛拭子、各段肠道、脏器器官、血清等中的病毒滴度定量。
4.2.1粪便中病毒粒子的定量
对于粪便，定量了攻毒后1-7Day的每200mg粪便中的病毒拷贝，实验结果可知，攻毒后第三天，开始从粪便中检测出病毒，对照组粪便中病毒的拷贝数要高于实验组，从第六天开始，实验组粪便病毒拷贝数降至标准拷贝数以下，对照组仍高于标准值。实验结果如图15。
4.2.2血清中病毒拷贝定量
攻毒后第三天，开始从血清中检测出病毒，对照组血清的病毒粒子拷贝数高于实验组，实验组从第五天开始，病毒拷贝数下降，对照组呈持续升高。实验结果如图16。
4.2.3口拭子中病毒的定量
攻毒后第一天和第二天，可以在口腔中检测到病毒粒子，对照组在第六天以后可以检测到的病毒粒子数高于400，明显高于实验组。实验结果如图14。
4.3病理切片结果
对于病理切片的比较，分别对实验组、对照组、空白组三组进行比较，实验结果如下：
4.3.1脾脏的病理切片
与空白组相比，对照组脾脏表现为明显的出血样变化，实验组脾脏组织病理组织学变化明显减轻，结果如图21。
4.3.2肾脏病理切片
与空白组相比，对照组肾脏组织可见条索样出血和梗死变化，实验组可见肾脏组织出血变化明显减轻，肾小球肾炎，结果如图21。
4.3.3腹股沟淋巴结病理切片
与空白组相比，可见对照组腹股沟淋巴结弥漫性出血和局灶性坏死，实验组腹股沟淋巴结病理组织学变化明显减轻，结果如图20。
4.3.4肠系膜淋巴结病理切片
与空白组相比，可见对照组肠系膜淋巴结弥漫性出血，实验组肠系膜淋巴结出血变化均有不同程度的减轻，结果如图20。
4.3.5十二指肠和空肠
本发明观察了十二指肠和空肠的病理切片，与空白组相比，PBS对照组肠壁有明显的变薄、出血，而复合乳酸菌组较为正常，结果如图22。
此外，在小鼠实验中，分别对三株单菌及复合乳酸菌进行比较，三株复合乳酸菌的免疫效果优于其他三株单菌，所以本实施例中，还采用三株重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4、NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA和NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17进行复配后的复合菌株(1:1:1菌株数量复配，复配菌数量达到1×1010/mL时，取10mL复合菌液灌胃小猪)进行了攻毒测试，测试方法同实施例4，结果表明，三株重组植物乳杆菌复配使用时的效果显著优于对照组和空白组，并且尤其需要注意的是，相较于任意一株重组植物乳杆菌，以三株菌的复配菌对小猪进行免疫，会对小猪产生更优的保护作用。
5结论：重组植物乳杆菌NC8Δalr-pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4，经免疫仔猪后，可对实验组仔猪产生明显的保护作用。攻毒后，与对照组相比，可维持实验组体温处于正常水平(图11)。可促进实验组血清中产生高水平的CD8+T细胞。与对照组相比，可明显降低血清、口、肛、粪便中病毒粒子拷贝数。从病理角度，可有效的减轻实验各脏器的病理损伤。对非洲猪瘟病毒具有良好的阻断作用。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，尽管参照前述实施例对本申请进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 吉林农业大学
<120> 一种融合基因、其编码蛋白及其在抗非洲猪瘟中的应用
<130> 202126139
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1083
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgataatac ttattttttt aatattttct aacatagttt taagtattga ttattgggtt 60
agttttaata aaacaataat tttagatagt aatattacta atgataataa tgatataaat 120
ggagtatcat ggaatttttt taataattct tttaatacac tagctacatg tggaaaagca 180
ggtaactttt gtgaatgttc taattatagt acatcaatat ataatataac aaataattgt 240
agcttaacta tttttcctca taatgatgta tttgatacaa catatcaagt agtatggaat 300
caaataatta attatacaat aaaattatta acacctgcta ctcccccaaa tatcacatat 360
aattgtacta attttttaat aacatgtaaa aaaaataatg gaacaaacac taatatatat 420
ttaaatataa atgatacttt tgttaaatat actaatgaaa gtatacttga atataactgg 480
aataatagta acattaacaa ttttacagct acatgtataa ttaataatac aattagtaca 540
tctaatgaaa caacacttat aaattgtact tatttaacat tgtcatctaa ctatttttat 600
acttttttta aattatatta tattccatta agcatcataa ttgggataac aataagtatt 660
cttcttatat ccatcataac ttttttatct ttacgaaaaa gaaaaaaaca tgttgaagaa 720
atagaaagtc caccacctga atctaatgaa gaagaacaat gtcagcatga tgacaccact 780
tccatacatg aaccatctcc cagagaacca ttacttccta agccttacag tcgttatcag 840
tataatacac ctatttacta catgcgtccc tcaacacaac cactcaaccc atttccctta 900
cctaaaccgt gtcctccacc caaaccatgt ccgccaccca aaccatgtcc tccacctaaa 960
ccatgtcctt cagctgaatc ctattctcca cccaaaccac tacctagtat cccgctacta 1020
cccaatatcc cgccattatc tacccaaaat atttcgctta ttcacgtaga tagaattatt 1080
taa 1083
<210> 2
<211> 354
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atggacactg aaacgtctcc actgctttct cataacctgt caacccgcga gggaattaaa 60
caaagcaccc aaggcctttt agcccataca atcgccaaat atcccggaac aactgcgatt 120
ctcctgggca ttttgatttt gctcattatt attcttatca tcgttgccat cgtttactat 180
aaccggacta ttgactgcaa gtcgagcata cctaaacctc ctcctagcta ctatgtacaa 240
caacctgagc ctcaccacca tttcccggta ttctttagaa aaaggaaaaa ctccacctcc 300
ctgcagtccc acattccaag cgacgaacaa ttagctgaac ttgcgcattc ataa 354
<210> 3
<211> 600
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atggctgaaa actcgaacat tgatgacatc aaggctccgt tgcttgccgc gcttggagcg 60
gccgacctgg ccttggccac tgtcaacgag ttgatcacga acctgcgtga gcgtgcggag 120
gagactcgta cggacacccg cagccgggtc gaggagagcc gtgctcgcct gaccaagctg 180
caggaagatc tgcccgagca gctcaccgag ctgcgtgaga agttcaccgc cgaggagctg 240
cgtaaggccg ccgagggcta cctcgaggcc gcgactagcc ggtacaacga gctggtcgag 300
cgcggtgagg ccgctctaga gcggctgcgc agccagcaga gcttcgagga agtgtcggcg 360
cgcgccgaag gctacgtgga ccaggcggtg gagttgaccc aggaggcgtt gggtacggtc 420
gcatcgcaga cccgcgcggt cggtgagcgt gccgccaagc tggtcggcat cgagctgcct 480
aagaaggctg ctccggccaa gaaggccgct ccggccaaga aggccgctcc ggccaagaag 540
gcggcggcca agaaggcgcc cgcgaagaag gcggcggcca agaaggtcac ccagaagtag 600
<210> 4
<211> 528
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
atggataagc ttgccgacct caactacaca ttgagtgtaa tcactttaat gaatgacaca 60
ctacattcta ttattcaaga tccaggaatg gcgtattttc catatatcgc atctgtcctg 120
actgttttgt ttactctaca taaagcatca attccaacga tgaagatagc gttaagaacg 180
tcaaagtgtt cgtacaaagt aattaaatat tgcatggtta cgatcattaa tactcttcta 240
aaattggctg gttataaaga acaggttact actaaggatg aaattgaaca acagatggac 300
agaattgtta aagagatgag gcgtcaattg gagatgattg acaaattgac aactcgtgaa 360
attgagcagg ttgaattact taagcgtata catgataaat tagttgctag accagttgat 420
gctatagaca tgtcaaaaga atttaatcag aaaaatatta gaacgctaga tgaatgggaa 480
agcggaaaaa atccatatga accatcagaa gtgactgcat ctatgtga 528
<210> 5
<211> 2628
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
catatgatca tcttaatctt cctgatcttt agtaatattg ttctcagtat tgattattgg 60
gtcagtttta ataaaaccat tatcctggat agtaatatca ccaatgataa caatgatatt 120
aatggagtga gttggaactt ttttaataat agttttaata ccctggccac ctgtggtaaa 180
gctggtaatt tttgtgaatg tagcaactac agtactagta tttacaatat taccaataac 240
tgcagtctga ccatttttcc acataatgat gtttttgata ccacctatca agttgtttgg 300
aatcaaatta ttaactatac cattaaactg ctgacccctg ccaccccacc aaacattacc 360
tacaattgca ccaatttcct gataacctgt aagaaaaata atgggacaaa caccaatatt 420
tacctgaaca taaatgatac ctttgttaaa tacaccaatg aatctattct ggaatacaat 480
tggaacaata gcaatattaa caatttcact gccacctgta ttattaataa taccattagt 540
actagtaatg aaaccaccct gattaattgt acatatctga ccctaagtag taactacttt 600
tatacatttt tcaaactgta ctacatcccc ctgagtatta ttattggtat taccattagt 660
atcctgctga taagtatcat tacctttctg agtctgagaa agagaaagaa gcatgttgaa 720
gaaattgaaa gtccaccacc tgaaagtaat gaagaagaac aatgtcaaca tgatgatacc 780
actagtattc atgaaccaag tccaagagaa cctctgttac ccaagccata cagtagatat 840
caatacaata ccccaattta ctatatgaga ccaagtaccc aaccactgaa tccatttcca 900
ctgcccaaac catgtccccc accaaaacca tgtccaccac caaaaccatg tccaccaccc 960
aaaccttgcc caagtgcaga aagttatagt ccacctaagc cactgccaag tattccactg 1020
ttaccaaata tcccaccact gagtacccaa aatattagtc tgattcatgt tgatagaatt 1080
attggcacga ttgcggcgat ggatactgaa actagtccac tgctgagtca taatctgagt 1140
actagagaag gtattaaaca aagtacccaa ggtctgctgg cccataccat tgccaaatat 1200
cctggtacca ctgccattct gctgggtatt ctaatcctgc tgattattat tttgataatt 1260
gttgccattg tttactataa cagaaccatt gattgtaaaa gtagtattcc aaaaccacca 1320
ccaagttatt atgttcaaca acctgaacca catcatcatt ttcctgtgtt ttttagaaaa 1380
agaaaaaata gtactagtct gcaaagtcat attccaagtg atgaacaact ggcagaactg 1440
gcccatagtg gcacgattgc ggcgatggca gaaaatagta atattgatga tattaaagcc 1500
ccactgctgg cagccctggg tgcagcagat ctggccctgg ccactgttaa tgaactgatt 1560
accaatctga gggaaagagc agaggaaact agaactgata ctagaagtag agttgaagaa 1620
agtagagcaa gactgaccaa actgcaagaa gatctgcctg aacaactgac tgaactgaga 1680
gaaaaattta ctgcagaaga actgagaaaa gcagcagagg gttacttgga ggcagccact 1740
agtagataca atgaactggt tgaaagaggt gaagcagccc tggaaagact gagaagtcaa 1800
caaagttttg aagaagttag tgctagagct gagggttatg ttgatcaagc agttgaactg 1860
acccaagaag ccctgggtac tgttgcaagt caaactagag cagttggtga gagagcagct 1920
aaactggttg gtattgaact gcccaaaaaa gcagcccctg ccaaaaaagc tgcccctgca 1980
aagaaggctg ctcctgccaa aaaagcagca gccaagaaag cacctgctaa aaaagcagca 2040
gccaagaagg ttacacaaaa aggcacgatt gcggcgatgg ataaactggc agatctgaac 2100
tataccctga gtgttattac cctgatgaat gataccctgc atagtattat tcaagatcct 2160
ggtatggcct attttccata tattgcaagt gttctgactg ttctgtttac cctgcataaa 2220
gcaagtattc caaccatgaa aattgccctg agaactagta aatgtagtta taaagttatt 2280
aaatattgta tggttaccat tattaatacc ctgctgaaac tggctggtta taaagaacaa 2340
gttaccacca aagatgagat agaacaacaa atggatagaa ttgttaaaga aatgagaaga 2400
caactggaaa tgattgataa actgaccact agagagattg aacaagttga actgctgaaa 2460
agaattcatg ataaactggt tgcaagacct gttgatgcca ttgatatgag taaagaattt 2520
aatcagaaaa atattagaac cctggatgaa tgggaaagtg gtaaaaatcc ttatgaacca 2580
agtgaagtta ctgcaagtat gcaccaccac caccaccact aaaagctt 2628
<210> 6
<211> 867
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
His Met Ile Ile Leu Ile Phe Leu Ile Phe Ser Asn Ile Val Leu Ser
1 5 10 15
Ile Asp Tyr Trp Val Ser Phe Asn Lys Thr Ile Ile Leu Asp Ser Asn
20 25 30
Ile Thr Asn Asp Asn Asn Asp Ile Asn Gly Val Ser Trp Asn Phe Phe
35 40 45
Asn Asn Ser Phe Asn Thr Leu Ala Thr Cys Gly Lys Ala Gly Asn Phe
50 55 60
Cys Glu Cys Ser Asn Tyr Ser Thr Ser Ile Tyr Asn Ile Thr Asn Asn
65 70 75 80
Cys Ser Leu Thr Ile Phe Pro His Asn Asp Val Phe Asp Thr Thr Tyr
85 90 95
Gln Val Val Trp Asn Gln Ile Ile Asn Tyr Thr Ile Lys Leu Leu Thr
100 105 110
Pro Ala Thr Pro Pro Asn Ile Thr Tyr Asn Cys Thr Asn Phe Leu Ile
115 120 125
Thr Cys Lys Lys Asn Asn Gly Thr Asn Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ile
130 135 140
Asn Asp Thr Phe Val Lys Tyr Thr Asn Glu Ser Ile Leu Glu Tyr Asn
145 150 155 160
Trp Asn Asn Ser Asn Ile Asn Asn Phe Thr Ala Thr Cys Ile Ile Asn
165 170 175
Asn Thr Ile Ser Thr Ser Asn Glu Thr Thr Leu Ile Asn Cys Thr Tyr
180 185 190
Leu Thr Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Tyr Thr Phe Phe Lys Leu Tyr Tyr
195 200 205
Ile Pro Leu Ser Ile Ile Ile Gly Ile Thr Ile Ser Ile Leu Leu Ile
210 215 220
Ser Ile Ile Thr Phe Leu Ser Leu Arg Lys Arg Lys Lys His Val Glu
225 230 235 240
Glu Ile Glu Ser Pro Pro Pro Glu Ser Asn Glu Glu Glu Gln Cys Gln
245 250 255
His Asp Asp Thr Thr Ser Ile His Glu Pro Ser Pro Arg Glu Pro Leu
260 265 270
Leu Pro Lys Pro Tyr Ser Arg Tyr Gln Tyr Asn Thr Pro Ile Tyr Tyr
275 280 285
Met Arg Pro Ser Thr Gln Pro Leu Asn Pro Phe Pro Leu Pro Lys Pro
290 295 300
Cys Pro Pro Pro Lys Pro Cys Pro Pro Pro Lys Pro Cys Pro Pro Pro
305 310 315 320
Lys Pro Cys Pro Ser Ala Glu Ser Tyr Ser Pro Pro Lys Pro Leu Pro
325 330 335
Ser Ile Pro Leu Leu Pro Asn Ile Pro Pro Leu Ser Thr Gln Asn Ile
340 345 350
Ser Leu Ile His Val Asp Arg Ile Ile Gly Thr Ile Ala Ala Met Asp
355 360 365
Thr Glu Thr Ser Pro Leu Leu Ser His Asn Leu Ser Thr Arg Glu Gly
370 375 380
Ile Lys Gln Ser Thr Gln Gly Leu Leu Ala His Thr Ile Ala Lys Tyr
385 390 395 400
Pro Gly Thr Thr Ala Ile Leu Leu Gly Ile Leu Ile Leu Leu Ile Ile
405 410 415
Ile Leu Ile Ile Val Ala Ile Val Tyr Tyr Asn Arg Thr Ile Asp Cys
420 425 430
Lys Ser Ser Ile Pro Lys Pro Pro Pro Ser Tyr Tyr Val Gln Gln Pro
435 440 445
Glu Pro His His His Phe Pro Val Phe Phe Arg Lys Arg Lys Asn Ser
450 455 460
Thr Ser Leu Gln Ser His Ile Pro Ser Asp Glu Gln Leu Ala Glu Leu
465 470 475 480
Ala His Ser Gly Thr Ile Ala Ala Met Ala Glu Asn Ser Asn Ile Asp
485 490 495
Asp Ile Lys Ala Pro Leu Leu Ala Ala Leu Gly Ala Ala Asp Leu Ala
500 505 510
Leu Ala Thr Val Asn Glu Leu Ile Thr Asn Leu Arg Glu Arg Ala Glu
515 520 525
Glu Thr Arg Thr Asp Thr Arg Ser Arg Val Glu Glu Ser Arg Ala Arg
530 535 540
Leu Thr Lys Leu Gln Glu Asp Leu Pro Glu Gln Leu Thr Glu Leu Arg
545 550 555 560
Glu Lys Phe Thr Ala Glu Glu Leu Arg Lys Ala Ala Glu Gly Tyr Leu
565 570 575
Glu Ala Ala Thr Ser Arg Tyr Asn Glu Leu Val Glu Arg Gly Glu Ala
580 585 590
Ala Leu Glu Arg Leu Arg Ser Gln Gln Ser Phe Glu Glu Val Ser Ala
595 600 605
Arg Ala Glu Gly Tyr Val Asp Gln Ala Val Glu Leu Thr Gln Glu Ala
610 615 620
Leu Gly Thr Val Ala Ser Gln Thr Arg Ala Val Gly Glu Arg Ala Ala
625 630 635 640
Lys Leu Val Gly Ile Glu Leu Pro Lys Lys Ala Ala Pro Ala Lys Lys
645 650 655
Ala Ala Pro Ala Lys Lys Ala Ala Pro Ala Lys Lys Ala Ala Ala Lys
660 665 670
Lys Ala Pro Ala Lys Lys Ala Ala Ala Lys Lys Val Thr Gln Lys Gly
675 680 685
Thr Ile Ala Ala Met Asp Lys Leu Ala Asp Leu Asn Tyr Thr Leu Ser
690 695 700
Val Ile Thr Leu Met Asn Asp Thr Leu His Ser Ile Ile Gln Asp Pro
705 710 715 720
Gly Met Ala Tyr Phe Pro Tyr Ile Ala Ser Val Leu Thr Val Leu Phe
725 730 735
Thr Leu His Lys Ala Ser Ile Pro Thr Met Lys Ile Ala Leu Arg Thr
740 745 750
Ser Lys Cys Ser Tyr Lys Val Ile Lys Tyr Cys Met Val Thr Ile Ile
755 760 765
Asn Thr Leu Leu Lys Leu Ala Gly Tyr Lys Glu Gln Val Thr Thr Lys
770 775 780
Asp Glu Ile Glu Gln Gln Met Asp Arg Ile Val Lys Glu Met Arg Arg
785 790 795 800
Gln Leu Glu Met Ile Asp Lys Leu Thr Thr Arg Glu Ile Glu Gln Val
805 810 815
Glu Leu Leu Lys Arg Ile His Asp Lys Leu Val Ala Arg Pro Val Asp
820 825 830
Ala Ile Asp Met Ser Lys Glu Phe Asn Gln Lys Asn Ile Arg Thr Leu
835 840 845
Asp Glu Trp Glu Ser Gly Lys Asn Pro Tyr Glu Pro Ser Glu Val Thr
850 855 860
Ala Ser Met
865
<210> 7
<211> 8768
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ccatgggcaa gaaagaatta agtttccacg agaagttatt aaaattgact aaacaacaaa 60
aaaagaagac taacaagcat gtgtttattg ctattccaat tgttttcgtt ttaatgtttg 120
cttttatgtg ggcaggtaaa gctgagactc caaaagttaa gacttatagt gatgacgttt 180
tgagtgcttc atttgtcggc gacattatga tgggtcgtta cgttgagaaa gtcacggaac 240
aaaagggtgc agatagtatt ttccaatatg ttgaaccgat tttccgtgct agtgattatg 300
ttgctggcaa ttttgaaaat cctgttactt atcagaaaaa ctacaaacaa gctgataaag 360
agattcattt acagactaat aaggaaagtg ttaaagtttt aaaggatatg aattttactg 420
tcttaaatag tgctaataat catgctatgg attatggtgt tcaaggtatg aaagatacgt 480
taggtgagtt tgctaaacag aatttagata ttgttggtgc tggttattca ttaagtgacg 540
ctaagaagaa aattagttac cagaaagtgt ctagaatgat catcttaatc ttcctgatct 600
ttagtaatat tgttctcagt attgattatt gggtcagttt taataaaacc attatcctgg 660
atagtaatat caccaatgat aacaatgata ttaatggagt gagttggaac ttttttaata 720
atagttttaa taccctggcc acctgtggta aagctggtaa tttttgtgaa tgtagcaact 780
acagtactag tatttacaat attaccaata actgcagtct gaccattttt ccacataatg 840
atgtttttga taccacctat caagttgttt ggaatcaaat tattaactat accattaaac 900
tgctgacccc tgccacccca ccaaacatta cctacaattg caccaatttc ctgataacct 960
gtaagaaaaa taatgggaca aacaccaata tttacctgaa cataaatgat acctttgtta 1020
aatacaccaa tgaatctatt ctggaataca attggaacaa tagcaatatt aacaatttca 1080
ctgccacctg tattattaat aataccatta gtactagtaa tgaaaccacc ctgattaatt 1140
gtacatatct gaccctaagt agtaactact tttatacatt tttcaaactg tactacatcc 1200
ccctgagtat tattattggt attaccatta gtatcctgct gataagtatc attacctttc 1260
tgagtctgag aaagagaaag aagcatgttg aagaaattga aagtccacca cctgaaagta 1320
atgaagaaga acaatgtcaa catgatgata ccactagtat tcatgaacca agtccaagag 1380
aacctctgtt acccaagcca tacagtagat atcaatacaa taccccaatt tactatatga 1440
gaccaagtac ccaaccactg aatccatttc cactgcccaa accatgtccc ccaccaaaac 1500
catgtccacc accaaaacca tgtccaccac ccaaaccttg cccaagtgca gaaagttata 1560
gtccacctaa gccactgcca agtattccac tgttaccaaa tatcccacca ctgagtaccc 1620
aaaatattag tctgattcat gttgatagaa ttattggcac gattgcggcg atggatactg 1680
aaactagtcc actgctgagt cataatctga gtactagaga aggtattaaa caaagtaccc 1740
aaggtctgct ggcccatacc attgccaaat atcctggtac cactgccatt ctgctgggta 1800
ttctaatcct gctgattatt attttgataa ttgttgccat tgtttactat aacagaacca 1860
ttgattgtaa aagtagtatt ccaaaaccac caccaagtta ttatgttcaa caacctgaac 1920
cacatcatca ttttcctgtg ttttttagaa aaagaaaaaa tagtactagt ctgcaaagtc 1980
atattccaag tgatgaacaa ctggcagaac tggcccatag tggcacgatt gcggcgatgg 2040
cagaaaatag taatattgat gatattaaag ccccactgct ggcagccctg ggtgcagcag 2100
atctggccct ggccactgtt aatgaactga ttaccaatct gagggaaaga gcagaggaaa 2160
ctagaactga tactagaagt agagttgaag aaagtagagc aagactgacc aaactgcaag 2220
aagatctgcc tgaacaactg actgaactga gagaaaaatt tactgcagaa gaactgagaa 2280
aagcagcaga gggttacttg gaggcagcca ctagtagata caatgaactg gttgaaagag 2340
gtgaagcagc cctggaaaga ctgagaagtc aacaaagttt tgaagaagtt agtgctagag 2400
ctgagggtta tgttgatcaa gcagttgaac tgacccaaga agccctgggt actgttgcaa 2460
gtcaaactag agcagttggt gagagagcag ctaaactggt tggtattgaa ctgcccaaaa 2520
aagcagcccc tgccaaaaaa gctgcccctg caaagaaggc tgctcctgcc aaaaaagcag 2580
cagccaagaa agcacctgct aaaaaagcag cagccaagaa ggttacacaa aaaggcacga 2640
ttgcggcgat ggataaactg gcagatctga actataccct gagtgttatt accctgatga 2700
atgataccct gcatagtatt attcaagatc ctggtatggc ctattttcca tatattgcaa 2760
gtgttctgac tgttctgttt accctgcata aagcaagtat tccaaccatg aaaattgccc 2820
tgagaactag taaatgtagt tataaagtta ttaaatattg tatggttacc attattaata 2880
ccctgctgaa actggctggt tataaagaac aagttaccac caaagatgag atagaacaac 2940
aaatggatag aattgttaaa gaaatgagaa gacaactgga aatgattgat aaactgacca 3000
ctagagagat tgaacaagtt gaactgctga aaagaattca tgataaactg gttgcaagac 3060
ctgttgatgc cattgatatg agtaaagaat ttaatcagaa aaatattaga accctggatg 3120
aatgggaaag tggtaaaaat ccttatgaac caagtgaagt tactgcaagt atgtaaaagc 3180
ttcaaattac agcacgtgtt gctttgattg atagccaaaa agcagcagtt gataaagcaa 3240
ttactgatat tgctgaaaaa ttgtaattta taaataaaaa tcacctttta gaggtggttt 3300
ttttatttat aaattattcg tttgatttcg ctttcgatag aacaatcaaa gcgagaataa 3360
ggaagataaa tcccataagg gcgggagcag aatgtccgag actaattcat gaccaaaatc 3420
ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagaccccg tagaaaagat caaaggatct 3480
tcttgagatc ctttttttct gcgcgtaatc tgctgcttgc aaacaaaaaa accaccgcta 3540
ccagcggtgg tttgtttgcc ggatcaagag ctaccaactc tttttccgaa ggtaactggc 3600
ttcagcagag cgcagatacc aaatactgtc cttctagtgt agccgtagtt aggccaccac 3660
ttcaagaact ctgtagcacc gcctacatac ctcgctctgc taatcctgtt accagtggct 3720
gctgccagtg gcgataagtc gtgtcttacc gggttggact caagacgata gttaccggat 3780
aaggcgcagc ggtcgggctg aacggggggt tcgtgcacac agcccagctt ggagcgaacg 3840
acctacaccg aactgagata cctacagcgt gagctatgag aaagcgccac gcttcccgaa 3900
gggagaaagg cggacaggta tccggtaagc ggcagggtcg gaacaggagg cgcacgaggg 3960
agcttccagg gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac 4020
ttgagcgtcg atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatcgaaa aacgccagca 4080
acgcggcctt tttacggttc ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg 4140
cgttatcccc tgattctgtg gataaccgta ttaccgcctt tgagtgagct gataccgctc 4200
gccgcagccg aacgaccgag cgcagcgagt cagtgagcga gaaggattat tcggctggtt 4260
gagacgttaa aatgataaag gttgtattaa tcttatatta cggttataat gtactcaact 4320
taataaatga acgcaaaaaa aagaaccctc aacttagcag agttaggatt cacgacttat 4380
cagcacaacc tgataagatt ttcgatagca agtactacca atacaagcta tctaacttgg 4440
tactattata acatgtaggc taagtttttc aaccattgat acttaaagta aacggttgtt 4500
atcgggaatc ttaacagaaa cctgatagca accgtttttt tgttattcaa tggttagcaa 4560
ccatcaaagc aactaaaggc tggaaacctg ttcttagcta gtaaaacctc ccgtgagtgt 4620
cgttcgtgac cccgcttgca gttaacaaca taggtatgct aaaccttgtc gagatcaacg 4680
cgactaaaga cgtggctgga agactaggaa atgatacgga caggctaact attaacgcag 4740
attattcggg ttgctgctaa aaccaactct aataatagtt agtgcaaggg ctggttgagc 4800
ttaaattgtc tgataaagag ttctctcttt atactgcaaa agaagcgcag ttattcacga 4860
ttaggataac tgtttgagag agcctaaggg cttgaccctt gatggtttaa gcaccgctat 4920
gcgtgcggga tccccttaga agcaaactta agagtgtgtt gatagtgcat tatcttaaaa 4980
ttttgtataa taggaattga agttaaatta gatgctaaaa ataggaattg aagttaaatt 5040
agatgctaaa aatttgtaat taagaaggag ggattcgtca tgttggtatt ccaaatgcgt 5100
aatgtagata aaacatctac tgttttgaaa cagactaaaa acagtgatta cgcagataaa 5160
taaatacgtt agattaattc ctaccagtga ctaatcttat gactttttaa acagataact 5220
aaaattacaa acaaatcgtt taacttcagg agagattaca tgaacaaaaa tataaatatc 5280
tcaaactttt taacgagtga aaaagtactc aaccaaataa taaaacaatt gaatttaaaa 5340
gaaaccgata ccgtttacga aattggaaca ggtaaagggc atttaacgac gaaactggct 5400
aaaataagta aacaggtaac gtctattgaa ttagacagtc atctattcaa cttatcgtca 5460
gaaaaattaa aactgaatac tcgtgtcact ttaattcacc aagatattct acagtttcaa 5520
ttccctaaca aacagaggta taaaattgtt gggaatattc cttacaattt aagcacacaa 5580
attattaaaa aagtggtttt tgaaagccgt gcgtctgaca tctatctgac tgttgaagaa 5640
ggattctaca agcgtacctt ggatattcac cgaacactag ggttgctctt gcacactcaa 5700
gtctcgattc agcaattgct taagctgcca gcggaatgct ttcatcctaa accaaaagta 5760
aacagtgtct taataaaact tacccgccat accacagatg ttccagataa atattggaag 5820
ctatataagt actttgtttc aaaatgggtc aatcgagaat atcgtcaact gtttactaaa 5880
aatcagtttc gtcaagcaat gaaacacgcc aaagtaaaca atttaagtac cattacttat 5940
gagcaagtat tgtctatttt taatagttat ctattattta acgggaggaa ataattctat 6000
gagtcgcttt tttaaatttg gaaagttaca cgttactaaa gggaatggag accggggtcg 6060
acccttcaat agagttctta acgttaatcc gaaaaaaact aacgttaata ttaaaaaata 6120
agatccgctt gtgaattatg tataatttga ttagactaaa gaataggaga aagtatgatg 6180
atatttaaaa aactttctcg ttaagatagg ttgttggtga gcatgttata tacggatgta 6240
tcggtttcct taatgcaaaa ttttgttgct atcttattaa tttttctatt atatagatat 6300
attcaaagaa agataacatt taaacggatc atattagata ttttaatagc gattattttt 6360
tcaatattat atctgtttat ttcagatgcg tcattacttg taatggtatt aatgcgatta 6420
gggtggcatt ttcatcaaca aaaagaaaat aagataaaaa cgactgatac agctaattta 6480
attctaatta tcgtgatcca gttattgtta gttgcggttg ggactattat tagtcagttt 6540
accatatcga ttatcaaaag tgatttcagc caaaatatat tgaacaatag tgcaacagat 6600
ataactttat taggtatttt ctttgctgtt ttatttgacg gcttgttctt tatattattg 6660
aagaataagc ggactgaatt acaacattta aatcaagaaa tcattgaatt ttcgttagaa 6720
aaacaatatt ttatatttat atttatttta tttatagtaa tagaaattat tttagcagtt 6780
gggaatcttc aaggagtaac agccacgata ttattaacca ttatcattat tttttgtgtc 6840
cttatcggga tgactttttg gcaagtgatg ctttttttga aggcttattc gattcgccaa 6900
gaagccaatg accaattggt ccggaatcaa caacttcaag attatctagt caatatcgaa 6960
cagcagtaca ccgaattacg gcgatttaag catgattatc aaaacatctt attatcgttg 7020
gagagttttg ccgaaaaggg cgatcagcaa cagtttaagg cgtattacca agaattatta 7080
gcacaacggc caattcaaag tgaaatccaa ggggcagtca ttgcacaact cgactacttg 7140
aaaaatgatc ctattcgagg attagtcatt caaaagtttt tggcagccaa acaggctggt 7200
gttactttaa aattcgaaat gaccgaacca atcgaattag caaccgctaa tctattaacg 7260
gttattcgga ttatcggtat tttattagac aatgcgattg aacaagccgt tcaagaaacc 7320
gatcaattgg tgagttgtgc tttcttacaa tctgatggtt taatcgaaat tacgattgaa 7380
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ggcgctggtc gggggactgg tttagctaat gtgcaggatt tgattgccaa acaaaccaat 7500
ttattcttag aaacacagat tgaaaataga aagttacgac agacattgat gattacggag 7560
gaaacttaat ttgtatcccg tttatttatt agaggatgat ttacagcaac aagcgattta 7620
tcagcaaatt atcgcgaata cgattatgat taacgaattt gcaatgactt taacatgcgc 7680
tgccagtgat actgagacat tgttggcggc aattaaggat cagcaacgag gtttattctt 7740
tttggatatg gaaattgagg ataaccgcca agccggttta gaagtggcaa ctaagattcg 7800
gcagatgatg ccgtttgcgc aaattgtctt cattacaacc cacgaggaac tgacattatt 7860
aacgttagaa cgaaaaatag cgcctttaga ttacattctc aaggaccaaa caatggctga 7920
aatcaaaagg caattgattg atgatctatt gttagctgag aagcaaaacg aggcggcagc 7980
gtatcaccga gaaaatttat ttagttataa aataggtcct cgctttttct cattaccatt 8040
aaaggaagtt gtttatttat atactgaaaa agaaaatccg ggtcatatta atttgttagc 8100
cgttaccaga aaggttactt ttccaggaaa tttaaatgcg ctggaagccc aatatccaat 8160
gctctttcgg tgtgataaaa gttacttagt taacctatct aatattgcca attatgacag 8220
taaaacacgg agtttaaaat ttgtagatgg cagtgaggca aaagtctcgt tccggaaatc 8280
acgggaacta gtggccaaat taaaacaaat gatgtagcgc ctgcaggcac gccaaatgat 8340
cccagtaaaa agccacccgc atggcgggtg gctttttatt agccctagaa gggcttccca 8400
cacgcatttc agcgccttag tgccttagtt tgtgaatcat aggtggtata gtcccgaaat 8460
acccgtctaa ggaattgtca gataggccta atgactggct tttataatat gagataatgc 8520
cgactgtact ttttacagtc ggttttctaa tgtcactaac ctgccccgtt agttgaagaa 8580
ggtttttata ttacagctcc agatctaccg gtttaatttg aaaattgata ttagcgttta 8640
acagttaaat taatacgtta ataatttttt tgtctttaaa tagggatttg aagcataatg 8700
gtgttatagc gtacttagct ggccagcata tatgtattct ataaaatact attacaagga 8760
gattttag 8768
<210> 8
<211> 2763
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Pro Trp Ala Arg Lys Asn Val Ser Thr Arg Ser Tyr Asn Leu Asn Asn
1 5 10 15
Lys Lys Arg Arg Leu Thr Ser Met Cys Leu Leu Leu Phe Gln Leu Phe
20 25 30
Ser Phe Cys Leu Leu Leu Cys Gly Gln Val Lys Leu Arg Leu Gln Lys
35 40 45
Leu Arg Leu Ile Val Met Thr Phe Val Leu His Leu Ser Ala Thr Leu
50 55 60
Trp Val Val Thr Leu Arg Lys Ser Arg Asn Lys Arg Val Gln Ile Val
65 70 75 80
Phe Ser Asn Met Leu Asn Arg Phe Ser Val Leu Val Ile Met Leu Leu
85 90 95
Ala Ile Leu Lys Ile Leu Leu Leu Ile Arg Lys Thr Thr Asn Lys Leu
100 105 110
Ile Lys Arg Phe Ile Tyr Arg Leu Ile Arg Lys Val Leu Lys Phe Arg
115 120 125
Ile Ile Leu Leu Ser Ile Val Leu Ile Ile Met Leu Trp Ile Met Val
130 135 140
Phe Lys Val Lys Ile Arg Val Ser Leu Leu Asn Arg Ile Ile Leu Leu
145 150 155 160
Val Leu Val Ile His Val Thr Leu Arg Arg Lys Leu Val Thr Arg Lys
165 170 175
Cys Leu Glu Ser Ser Ser Ser Ser Leu Val Ile Leu Phe Ser Val Leu
180 185 190
Ile Ile Gly Ser Val Leu Ile Lys Pro Leu Ser Trp Ile Val Ile Ser
195 200 205
Pro Met Ile Thr Met Ile Leu Met Glu Val Gly Thr Phe Leu Ile Ile
210 215 220
Val Leu Ile Pro Trp Pro Pro Val Val Lys Leu Val Ile Phe Val Asn
225 230 235 240
Val Ala Thr Thr Val Leu Val Phe Thr Ile Leu Pro Ile Thr Ala Val
245 250 255
Pro Phe Phe His Ile Met Met Phe Leu Ile Pro Pro Ile Lys Leu Phe
260 265 270
Gly Ile Lys Leu Leu Thr Ile Pro Leu Asn Cys Pro Leu Pro Pro His
275 280 285
Gln Thr Leu Pro Thr Ile Ala Pro Ile Ser Pro Val Arg Lys Ile Met
290 295 300
Gly Gln Thr Pro Ile Phe Thr Thr Met Ile Pro Leu Leu Asn Thr Pro
305 310 315 320
Met Asn Leu Phe Trp Asn Thr Ile Gly Thr Ile Ala Ile Leu Thr Ile
325 330 335
Ser Leu Pro Pro Val Leu Leu Ile Ile Pro Leu Val Leu Val Met Lys
340 345 350
Pro Pro Leu Ile Val His Ile Pro Val Val Thr Thr Phe Ile His Phe
355 360 365
Ser Asn Cys Thr Thr Ser Pro Val Leu Leu Leu Val Leu Pro Leu Val
370 375 380
Ser Cys Val Ser Leu Pro Phe Val Glu Arg Glu Arg Ser Met Leu Lys
385 390 395 400
Lys Leu Lys Val His His Leu Lys Val Met Lys Lys Asn Asn Val Asn
405 410 415
Met Met Ile Pro Leu Val Phe Met Asn Gln Val Gln Glu Asn Leu Cys
420 425 430
Tyr Pro Ser His Thr Val Asp Ile Asn Thr Ile Pro Gln Phe Thr Ile
435 440 445
Asp Gln Val Pro Asn His Ile His Phe His Cys Pro Asn His Val Pro
450 455 460
His Gln Asn His Val His His Gln Asn His Val His His Pro Asn Leu
465 470 475 480
Ala Gln Val Gln Lys Val Ile Val His Leu Ser His Cys Gln Val Phe
485 490 495
His Cys Tyr Gln Ile Ser His His Val Pro Lys Ile Leu Val Phe Met
500 505 510
Leu Ile Glu Leu Leu Ala Arg Leu Arg Arg Trp Ile Leu Lys Leu Val
515 520 525
His Cys Val Ile Ile Val Leu Glu Lys Val Leu Asn Lys Val Pro Lys
530 535 540
Val Cys Trp Pro Ile Pro Leu Pro Asn Ile Leu Val Pro Leu Pro Phe
545 550 555 560
Cys Trp Val Phe Ser Cys Leu Leu Phe Leu Leu Pro Leu Phe Thr Ile
565 570 575
Thr Glu Pro Leu Ile Val Lys Val Val Phe Gln Asn His His Gln Val
580 585 590
Ile Met Phe Asn Asn Leu Asn His Ile Ile Ile Phe Leu Cys Phe Leu
595 600 605
Glu Lys Glu Lys Ile Val Leu Val Cys Lys Val Ile Phe Gln Val Met
610 615 620
Asn Asn Trp Gln Asn Trp Pro Ile Val Ala Arg Leu Arg Arg Trp Gln
625 630 635 640
Lys Ile Val Ile Leu Met Ile Leu Lys Pro His Cys Trp Gln Pro Trp
645 650 655
Val Gln Gln Ile Trp Pro Trp Pro Leu Leu Met Asn Leu Pro Ile Gly
660 665 670
Lys Glu Gln Arg Lys Leu Glu Leu Ile Leu Glu Val Glu Leu Lys Lys
675 680 685
Val Glu Gln Asp Pro Asn Cys Lys Lys Ile Cys Leu Asn Asn Leu Asn
690 695 700
Glu Lys Asn Leu Leu Gln Lys Asn Glu Lys Gln Gln Arg Val Thr Trp
705 710 715 720
Arg Gln Pro Leu Val Asp Thr Met Asn Trp Leu Lys Glu Val Lys Gln
725 730 735
Pro Trp Lys Asp Glu Val Asn Lys Val Leu Lys Lys Leu Val Leu Glu
740 745 750
Leu Arg Val Met Leu Ile Lys Gln Leu Asn Pro Lys Lys Pro Trp Val
755 760 765
Leu Leu Gln Val Lys Leu Glu Gln Leu Val Arg Glu Gln Leu Asn Trp
770 775 780
Leu Val Leu Asn Cys Pro Lys Lys Gln Pro Leu Pro Lys Lys Leu Pro
785 790 795 800
Leu Gln Arg Arg Leu Leu Leu Pro Lys Lys Gln Gln Pro Arg Lys His
805 810 815
Leu Leu Lys Lys Gln Gln Pro Arg Arg Leu His Lys Lys Ala Arg Leu
820 825 830
Arg Arg Trp Ile Asn Trp Gln Ile Thr Ile Pro Val Leu Leu Pro Met
835 840 845
Ile Pro Cys Ile Val Leu Phe Lys Ile Leu Val Trp Pro Ile Phe His
850 855 860
Ile Leu Gln Val Phe Leu Phe Cys Leu Pro Cys Ile Lys Gln Val Phe
865 870 875 880
Gln Pro Lys Leu Pro Glu Leu Val Asn Val Val Ile Lys Leu Leu Asn
885 890 895
Ile Val Trp Leu Pro Leu Leu Ile Pro Cys Asn Trp Leu Val Ile Lys
900 905 910
Asn Lys Leu Pro Pro Lys Met Arg Asn Asn Lys Trp Ile Glu Leu Leu
915 920 925
Lys Lys Glu Asp Asn Trp Lys Leu Ile Asn Pro Leu Glu Arg Leu Asn
930 935 940
Lys Leu Asn Cys Lys Glu Phe Met Ile Asn Trp Leu Gln Asp Leu Leu
945 950 955 960
Met Pro Leu Ile Val Lys Asn Leu Ile Arg Lys Ile Leu Glu Pro Trp
965 970 975
Met Asn Gly Lys Val Val Lys Ile Leu Met Asn Gln Val Lys Leu Leu
980 985 990
Gln Val Cys Lys Ser Phe Lys Leu Gln His Val Leu Leu Leu Ile Ala
995 1000 1005
Lys Lys Gln Gln Leu Ile Lys Gln Leu Leu Ile Leu Leu Lys Asn
1010 1015 1020
Cys Asn Leu Ile Lys Ile Thr Phe Arg Trp Phe Phe Tyr Leu Ile
1025 1030 1035
Ile Arg Leu Ile Ser Leu Ser Ile Glu Gln Ser Lys Arg Glu Gly
1040 1045 1050
Arg Ile Pro Gly Arg Glu Gln Asn Val Arg Asp Phe Met Thr Lys
1055 1060 1065
Ile Pro Arg Glu Phe Ser Phe His Ala Ser Asp Pro Val Glu Lys
1070 1075 1080
Ile Lys Gly Ser Ser Asp Pro Phe Phe Leu Arg Val Ile Cys Cys
1085 1090 1095
Leu Gln Thr Lys Lys Pro Pro Leu Pro Ala Val Val Cys Leu Pro
1100 1105 1110
Asp Gln Glu Leu Pro Thr Leu Phe Pro Lys Val Thr Gly Phe Ser
1115 1120 1125
Arg Ala Gln Ile Pro Asn Thr Val Leu Leu Val Pro Leu Gly His
1130 1135 1140
His Phe Lys Asn Ser Val Ala Pro Pro Thr Tyr Leu Ala Leu Leu
1145 1150 1155
Ile Leu Leu Pro Val Ala Ala Ala Ser Gly Asp Lys Ser Cys Leu
1160 1165 1170
Thr Gly Leu Asp Ser Arg Arg Leu Pro Asp Lys Ala Gln Arg Ser
1175 1180 1185
Gly Thr Gly Gly Ser Cys Thr Gln Pro Ser Leu Glu Arg Thr Thr
1190 1195 1200
Tyr Thr Glu Leu Arg Tyr Leu Gln Arg Glu Leu Glu Ser Ala Thr
1205 1210 1215
Leu Pro Glu Gly Arg Lys Ala Asp Arg Tyr Pro Val Ser Gly Arg
1220 1225 1230
Val Gly Thr Gly Gly Ala Arg Gly Ser Phe Gln Gly Glu Thr Pro
1235 1240 1245
Gly Ile Phe Ile Val Leu Ser Gly Phe Ala Thr Ser Asp Leu Ser
1250 1255 1260
Val Asp Phe Cys Asp Ala Arg Gln Gly Gly Gly Ala Tyr Arg Lys
1265 1270 1275
Thr Pro Ala Thr Arg Pro Phe Tyr Gly Ser Trp Pro Phe Ala Gly
1280 1285 1290
Leu Leu Leu Thr Cys Ser Phe Leu Arg Tyr Pro Leu Ile Leu Trp
1295 1300 1305
Ile Thr Val Leu Pro Pro Leu Ser Glu Leu Ile Pro Leu Ala Ala
1310 1315 1320
Ala Glu Arg Pro Ser Ala Ala Ser Gln Ala Arg Arg Ile Ile Arg
1325 1330 1335
Leu Val Glu Thr Leu Lys Arg Leu Tyr Ser Tyr Ile Thr Val Ile
1340 1345 1350
Met Tyr Ser Thr Met Asn Ala Lys Lys Arg Thr Leu Asn Leu Ala
1355 1360 1365
Glu Leu Gly Phe Thr Thr Tyr Gln His Asn Leu Ile Arg Phe Ser
1370 1375 1380
Ile Ala Ser Thr Thr Asn Thr Ser Tyr Leu Thr Trp Tyr Tyr Tyr
1385 1390 1395
Asn Met Ala Lys Phe Phe Asn His Tyr Leu Lys Thr Val Val Ile
1400 1405 1410
Gly Asn Leu Asn Arg Asn Leu Ile Ala Thr Val Phe Leu Leu Phe
1415 1420 1425
Asn Gly Gln Pro Ser Lys Gln Leu Lys Ala Gly Asn Leu Phe Leu
1430 1435 1440
Ala Ser Lys Thr Ser Arg Glu Cys Arg Ser Pro Arg Leu Gln Leu
1445 1450 1455
Thr Thr Val Cys Thr Leu Ser Arg Ser Thr Arg Leu Lys Thr Trp
1460 1465 1470
Leu Glu Asp Glu Met Ile Arg Thr Gly Leu Leu Thr Gln Ile Ile
1475 1480 1485
Arg Val Ala Ala Lys Thr Asn Ser Asn Asn Ser Cys Lys Gly Trp
1490 1495 1500
Leu Ser Leu Asn Cys Leu Ile Lys Ser Ser Leu Phe Ile Leu Gln
1505 1510 1515
Lys Lys Arg Ser Tyr Ser Arg Leu Gly Leu Phe Glu Arg Ala Gly
1520 1525 1530
Leu Asp Pro Trp Phe Lys His Arg Tyr Ala Cys Gly Ile Pro Leu
1535 1540 1545
Glu Ala Asn Leu Arg Val Cys Cys Ile Ile Leu Lys Phe Cys Ile
1550 1555 1560
Ile Gly Ile Glu Val Lys Leu Asp Ala Lys Asn Arg Asn Ser Ile
1565 1570 1575
Arg Cys Lys Phe Val Ile Lys Lys Glu Gly Phe Val Met Leu Val
1580 1585 1590
Phe Gln Met Arg Asn Val Asp Lys Thr Ser Thr Val Leu Lys Gln
1595 1600 1605
Thr Lys Asn Ser Asp Tyr Ala Asp Lys Ile Arg Ile Asn Ser Tyr
1610 1615 1620
Gln Leu Ile Leu Leu Phe Lys Gln Ile Thr Lys Ile Thr Asn Lys
1625 1630 1635
Ser Phe Asn Phe Arg Arg Asp Tyr Met Asn Lys Asn Ile Asn Ile
1640 1645 1650
Ser Asn Phe Leu Thr Ser Glu Lys Val Leu Asn Gln Ile Ile Lys
1655 1660 1665
Gln Leu Asn Leu Lys Glu Thr Asp Thr Val Tyr Glu Ile Gly Thr
1670 1675 1680
Gly Lys Gly His Leu Thr Thr Lys Leu Ala Lys Ile Ser Lys Gln
1685 1690 1695
Val Thr Ser Ile Glu Leu Asp Ser His Leu Phe Asn Leu Ser Ser
1700 1705 1710
Glu Lys Leu Lys Leu Asn Thr Arg Val Thr Leu Ile His Gln Asp
1715 1720 1725
Ile Leu Gln Phe Gln Phe Pro Asn Lys Gln Arg Tyr Lys Ile Val
1730 1735 1740
Gly Asn Ile Pro Tyr Asn Leu Ser Thr Gln Ile Ile Lys Lys Val
1745 1750 1755
Val Phe Glu Ser Arg Ala Ser Asp Ile Tyr Leu Thr Val Glu Glu
1760 1765 1770
Gly Phe Tyr Lys Arg Thr Leu Asp Ile His Arg Thr Leu Gly Leu
1775 1780 1785
Leu Leu His Thr Gln Val Ser Ile Gln Gln Leu Leu Lys Leu Pro
1790 1795 1800
Ala Glu Cys Phe His Pro Lys Pro Lys Val Asn Ser Val Leu Ile
1805 1810 1815
Lys Leu Thr Arg His Thr Thr Asp Val Pro Asp Lys Tyr Trp Lys
1820 1825 1830
Leu Tyr Lys Tyr Phe Val Ser Lys Trp Val Asn Arg Glu Tyr Arg
1835 1840 1845
Gln Leu Phe Thr Lys Asn Gln Phe Arg Gln Ala Met Lys His Ala
1850 1855 1860
Lys Val Asn Asn Leu Ser Thr Ile Thr Tyr Glu Gln Val Leu Ser
1865 1870 1875
Ile Phe Asn Ser Tyr Leu Leu Phe Asn Gly Arg Lys Phe Tyr Glu
1880 1885 1890
Ser Leu Phe Ile Trp Lys Val Thr Arg Tyr Arg Glu Trp Arg Pro
1895 1900 1905
Gly Ser Thr Leu Gln Ser Ser Arg Ser Glu Lys Asn Arg Tyr Lys
1910 1915 1920
Ile Arg Ser Ala Cys Glu Leu Cys Ile Ile Leu Asp Arg Ile Gly
1925 1930 1935
Glu Ser Met Met Ile Phe Lys Lys Leu Ser Arg Asp Arg Leu Leu
1940 1945 1950
Val Ser Met Leu Tyr Thr Asp Val Ser Val Ser Leu Met Gln Asn
1955 1960 1965
Phe Val Ala Ile Leu Leu Ile Phe Leu Leu Tyr Arg Tyr Ile Gln
1970 1975 1980
Arg Lys Ile Thr Phe Lys Arg Ile Ile Leu Asp Ile Leu Ile Ala
1985 1990 1995
Ile Ile Phe Ser Ile Leu Tyr Leu Phe Ile Ser Asp Ala Ser Leu
2000 2005 2010
Leu Val Met Val Leu Met Arg Leu Gly Trp His Phe His Gln Gln
2015 2020 2025
Lys Glu Asn Lys Ile Lys Thr Thr Asp Thr Ala Asn Leu Ile Leu
2030 2035 2040
Ile Ile Val Ile Gln Leu Leu Leu Val Ala Val Gly Thr Ile Ile
2045 2050 2055
Ser Gln Phe Thr Ile Ser Ile Ile Lys Ser Asp Phe Ser Gln Asn
2060 2065 2070
Ile Leu Asn Asn Ser Ala Thr Asp Ile Thr Leu Leu Gly Ile Phe
2075 2080 2085
Phe Ala Val Leu Phe Asp Gly Leu Phe Phe Ile Leu Leu Lys Asn
2090 2095 2100
Lys Arg Thr Glu Leu Gln His Leu Asn Gln Glu Ile Ile Glu Phe
2105 2110 2115
Ser Leu Glu Lys Gln Tyr Phe Ile Phe Ile Phe Ile Leu Phe Ile
2120 2125 2130
Val Ile Glu Ile Ile Leu Ala Val Gly Asn Leu Gln Gly Val Thr
2135 2140 2145
Ala Thr Ile Leu Leu Thr Ile Ile Ile Ile Phe Cys Val Leu Ile
2150 2155 2160
Gly Met Thr Phe Trp Gln Val Met Leu Phe Leu Lys Ala Tyr Ser
2165 2170 2175
Ile Arg Gln Glu Ala Asn Asp Gln Leu Val Arg Asn Gln Gln Leu
2180 2185 2190
Gln Asp Tyr Leu Val Asn Ile Glu Gln Gln Tyr Thr Glu Leu Arg
2195 2200 2205
Arg Phe Lys His Asp Tyr Gln Asn Ile Leu Leu Ser Leu Glu Ser
2210 2215 2220
Phe Ala Glu Lys Gly Asp Gln Gln Gln Phe Lys Ala Tyr Tyr Gln
2225 2230 2235
Glu Leu Leu Ala Gln Arg Pro Ile Gln Ser Glu Ile Gln Gly Ala
2240 2245 2250
Val Ile Ala Gln Leu Asp Tyr Leu Lys Asn Asp Pro Ile Arg Gly
2255 2260 2265
Leu Val Ile Gln Lys Phe Leu Ala Ala Lys Gln Ala Gly Val Thr
2270 2275 2280
Leu Lys Phe Glu Met Thr Glu Pro Ile Glu Leu Ala Thr Ala Asn
2285 2290 2295
Leu Leu Thr Val Ile Arg Ile Ile Gly Ile Leu Leu Asp Asn Ala
2300 2305 2310
Ile Glu Gln Ala Val Gln Glu Thr Asp Gln Leu Val Ser Cys Ala
2315 2320 2325
Phe Leu Gln Ser Asp Gly Leu Ile Glu Ile Thr Ile Glu Asn Thr
2330 2335 2340
Ala Ser Gln Val Lys Asn Leu Gln Ala Phe Ser Glu Leu Gly Tyr
2345 2350 2355
Ser Thr Lys Gly Ala Gly Arg Gly Thr Gly Leu Ala Asn Val Gln
2360 2365 2370
Asp Leu Ile Ala Lys Gln Thr Asn Leu Phe Leu Glu Thr Gln Ile
2375 2380 2385
Glu Asn Arg Lys Leu Arg Gln Thr Leu Met Ile Thr Glu Glu Thr
2390 2395 2400
Phe Val Ser Arg Leu Phe Ile Arg Gly Phe Thr Ala Thr Ser Asp
2405 2410 2415
Leu Ser Ala Asn Tyr Arg Glu Tyr Asp Tyr Asp Arg Ile Cys Asn
2420 2425 2430
Asp Phe Asn Met Arg Cys Gln Tyr Asp Ile Val Gly Gly Asn Gly
2435 2440 2445
Ser Ala Thr Arg Phe Ile Leu Phe Gly Tyr Gly Asn Gly Pro Pro
2450 2455 2460
Ser Arg Phe Arg Ser Gly Asn Asp Ser Ala Asp Asp Ala Val Cys
2465 2470 2475
Ala Asn Cys Leu His Tyr Asn Pro Arg Gly Thr Asp Ile Ile Asn
2480 2485 2490
Val Arg Thr Lys Asn Ser Ala Phe Arg Leu His Ser Gln Gly Pro
2495 2500 2505
Asn Asn Gly Asn Gln Lys Ala Ile Asp Ser Ile Val Ser Glu Ala
2510 2515 2520
Lys Arg Gly Gly Ser Val Ser Pro Arg Lys Phe Ile Leu Asn Arg
2525 2530 2535
Ser Ser Leu Phe Leu Ile Thr Ile Lys Gly Ser Cys Leu Phe Ile
2540 2545 2550
Tyr Lys Arg Lys Ser Gly Ser Tyr Phe Val Ser Arg Tyr Gln Lys
2555 2560 2565
Gly Tyr Phe Ser Arg Lys Phe Lys Cys Ala Gly Ser Pro Ile Ser
2570 2575 2580
Asn Ala Leu Ser Val Lys Leu Leu Ser Pro Ile Tyr Cys Gln Leu
2585 2590 2595
Gln Asn Thr Glu Phe Lys Ile Cys Arg Trp Gln Gly Lys Ser Leu
2600 2605 2610
Val Pro Glu Ile Thr Gly Thr Ser Gly Gln Ile Lys Thr Asn Asp
2615 2620 2625
Val Ala Pro Ala Gly Thr Pro Asn Asp Pro Ser Lys Lys Pro Pro
2630 2635 2640
Ala Trp Arg Val Ala Phe Tyr Pro Lys Gly Phe Pro His Ala Phe
2645 2650 2655
Gln Arg Leu Ser Ala Leu Val Cys Glu Ser Val Val Ser Arg Asn
2660 2665 2670
Thr Arg Leu Arg Asn Cys Gln Ile Gly Leu Met Thr Gly Phe Tyr
2675 2680 2685
Asn Met Arg Cys Arg Leu Tyr Phe Leu Gln Ser Val Phe Cys His
2690 2695 2700
Pro Ala Pro Leu Val Glu Glu Gly Phe Tyr Ile Thr Ala Pro Asp
2705 2710 2715
Leu Pro Val Phe Glu Asn Tyr Arg Leu Thr Val Lys Leu Ile Arg
2720 2725 2730
Phe Phe Cys Leu Ile Gly Ile Ser Ile Met Val Leu Arg Thr Leu
2735 2740 2745
Ala Ser Ile Tyr Val Phe Tyr Lys Ile Leu Leu Gln Gly Asp Phe
2750 2755 2760
<210> 9
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tctagaatga tcatcttaat cttcctga 28
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
aagcttttaa tggtgatggt gatgatgcat acttgc 36
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gctttcagga tagagataca gctct 25
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
ccgtagtgga agggtatgta agag 24
<210> 13
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ccgtaactgc tcatggtatc aatcttatcg 30

Claims (10)

1.一种激发机体抗非洲猪瘟感染的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包含CD2V、P17、HBHA；
所述CD2V由序列为SEQ ID NO：1的基因编码；
所述P17由序列为SEQ ID NO：2的基因编码；
所述HBHA由序列为SEQ ID NO：3的基因编码。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包含NSP4；所述NSP4由序列为SEQ ID NO：4的基因编码。
3.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白由序列为SEQ ID NO：5的基因编码。
4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体为pSIP409-pgsA’(ata)-CD2V-P17-HBHA-NSP4；其核苷酸序列如SEQ ID NO：7中所示。
5.一种包含如权利要求4所述表达载体的工程菌。
6.如权利要求5所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌以植物乳杆菌为出发菌株，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌NC8。
7.如权利要求6所述的工程菌，其特征在于，所述植物乳杆菌为丙氨酸消旋酶基因缺陷型植物乳杆菌NC8Δalr。
8.如权利要求5所述的工程菌，其特征在于，所述工程菌表达产生激发机体抗非洲猪瘟感染的融合蛋白CD2V-P17-HBHA-NSP4，CD2V-P17-HBHA-NSP4通过pgsA’蛋白表达在菌株表面。
9.一种药物组合物或药物制剂或饲料，其包含权利要求1至3任一项中所述的激发机体抗非洲猪瘟感染的融合蛋白或权利要求5至8中任一项所述的工程菌。
10.一种表达权利要求1中所述的激发机体抗非洲猪瘟感染的融合蛋白的方法，其包括：构建含有权利要求4所述的表达载体，再将构建的表达载体导入宿主细胞获得重组菌株，培养该重组菌株，最后从培养物中分离出融合蛋白。
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