CN110408637A

CN110408637A - 一种草鱼出血病酵母口服疫苗及应用

Info

Publication number: CN110408637A
Application number: CN201910727994.XA
Authority: CN
Inventors: 周勇; 范玉顶; 薛明洋; 刘文枝; 江南; 孟彦; 李逸群; 曾令兵; 聂细荣
Original assignee: Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Current assignee: Yangtze River Fisheries Research Institute CAFS
Priority date: 2019-08-08
Filing date: 2019-08-08
Publication date: 2019-11-05
Anticipated expiration: 2039-08-08
Also published as: CN110408637B

Abstract

本发明属于水产动物疾病免疫领域，具体公开了一种草鱼出血病酵母口服疫苗及应用，所述的口服疫苗是表达有融合蛋白LTB‑VP4酿酒酵母，所述融合蛋白LTB‑VP4的氨基酸序列为SEQ ID NO.9所示。该蛋白的免疫原性好，在草鱼体内的稳定性好，疫苗保护力高，攻毒后草鱼的存活率达到了73.3%，制成口服疫苗后，操作简单，适合大规模推广。

Description

一种草鱼出血病酵母口服疫苗及应用

技术领域

本发明属于水产动物疾病免疫领域，具体涉及一种草鱼出血病酵母口服疫苗及应用。

背景技术

草鱼出血病是我国一种高度传染性、致死性的病毒性鱼病，其病原为草鱼呼肠孤病毒(G rass Carp Reovirus，GCRV)。草鱼呼肠孤病毒呈二十面体对称的球形，其基因组由11条分段的dsRNA片段组成。病毒颗粒由7种衣壳蛋白组成，GCRV分为I、II、III型，其中，GCRV II型S6基因编码的蛋白与水生呼肠孤病毒VP4蛋白(S6基因编码)哺乳动物正呼肠孤病毒(Mammal reovirus，MRV)μ1蛋白(M2基因编码)及禽呼肠孤病毒(Avian reovirus，ARV)μB蛋白(M2基因编码)具有较高的同源性，说明GCRV HZ08株的S6基因编码蛋白可能是该毒株的主要衣壳蛋白。对S6基因编码蛋白的二级结构、亲水性、柔性区、抗原性和表面可能性进行预测显示，其抗原性区域和亲水性区域主要分布在两端，较大的柔性区也分布在两端，在C-末端有一个很显著的抗原区域。

草鱼出血病疫苗的研究起先是从组织浆灭活疫苗开始，经历了细胞培养灭活疫苗、减毒活疫苗、亚单位疫苗以及基因工程疫苗等阶段。20世纪60年代，浙江淡水水产研究所和中国科学院水生生物所成功制备了草鱼出血病组织奖灭活疫苗，并在实践中取得了渔民的信任。珠江水产研究所通过多代培养、减毒研制的弱毒活疫苗，使出血病在一定程度上得到了控制。但草鱼病毒性出血病在我国各草鱼养殖区仍频繁爆发，给草鱼养殖造成巨大损失。随着基因工程技术以及分子生物学技术的研究发展，操作方便、成本经济、免疫效果好的新技术疫苗逐渐受到重视。曾伟伟等利用原核表达了GCRV II型S6基因编码蛋白，证明了由该原核表达蛋白制备的多克隆抗体和单克隆抗体有较好的反应原性。宗乾坤等将原核表达的S6基因编码蛋白与感染了GCRV II型鱼的血清相互作用，证明了GCRV II型S6基因编码蛋白有较好的免疫原性。Jiang Hongye等使用枯草芽孢杆菌孢子作为口服递送系统，制备了枯草芽孢杆菌CotC-VP4重组体孢子(CotC-VP4孢子)，并用其作为口服疫苗的存活率为57％，相对存活率(RPS)为47％。

大肠杆菌不耐热肠毒素(heat-liable enterotoxin，LT)是由肠产毒性大肠杆菌(enterot oxigenet ic E.coli，ETEC)分泌的一种外毒素,具有很强的免疫原性。LT分子是由1个A亚基(28ku)和5个完全相同的B亚基(11.5ku)单体组成的AB5型六聚体蛋白。A亚基具有ADP-核糖基化转移酶活性，是LT的毒素活性部分。B亚基在空间上形成环状五聚体，包含有神经节甘脂(mono sialoganglio side，GM)结合位点，是LT的受体结合部位。无毒的B亚基(LTB)具有良好的免疫原性，是一种很好的免疫佐剂。Weltzin等将重组LTB作为佐剂与尿素酶共同免疫小鼠，发现可产生特异性的血清抗尿素酶IgG1和IgG2a以及唾液中的抗尿素酶IgA，以及对Hp的保护性免疫。Rask等将重组LTB作为佐剂与人丙种球蛋白(HGG)共同免疫后，发现LTB可提高抗原的粘膜免疫原性，还能介导针对它的体液和粘膜B细胞和T细胞的长期记忆反应。Jobling等利用LTB基因与肺炎链球菌表面蛋白A(PSPA)的基因融合表达了具有免疫活性的重组蛋白。J.Rombout等将LTB与犬细小病毒VP2蛋白以及绿色荧光标记蛋白在土豆中表达，将转基因土豆通过干燥粉碎等过程制备成饲料投喂鲤鱼，通过荧光显微镜观察以及ELISA检测法可以检测到表达的融合蛋白在肠道被鱼体吸收，可诱导机体产生免疫应答反应。

酵母表面展示(Yeast surface display)技术是继噬菌体展示技术发明以来的一种展示异源蛋白的真核展示系统，酵母细胞对异源蛋白表达后将其运送至细胞外并利用二硫键将目的蛋白锚定于酵母细胞表面，使其结构更加接近病毒表面的天然糖蛋白。由于抗原糖蛋白展示于酵母细胞表面，利用其进行免疫时更加容易被免疫系统所识别，并且酿酒酵母(Sacchar omyces cerevisiae)细胞是食品/生物安全级的真核微生物，不但能够对外源蛋白进行简单的翻译后加工修饰，而且酵母本身也是很好的免疫佐剂成分，这些优势使该系统成为口服疫苗研发的热门工具。

由于口服疫苗具有特异性强、分子量小和安全性高等优点，但同时存在免疫原性弱的缺点。目前暂未见LTB与GCRV II型S6基因编码蛋白融合表达制备抗草鱼出血病口服疫苗的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种编码融合蛋白LTB-VP4的基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示。

本发明的另一个目的在于提供了一种草鱼出血病口服疫苗，所述的疫苗为表达有融合蛋白LTB-VP4的酵母菌。

本发明的最后一个目的在于提供了融合蛋白LTB-VP4的应用。

为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

申请人针对GCRV II型S6基因，选取合适的片段进行表达以制备高保护率的草鱼出血病疫苗。最终筛选出一段保护率最高的融合蛋白LTB-VP4，该蛋白的稳定性好，在草鱼体内功能发挥稳定，可直接制备成适口性好的酵母疫苗，通过口服的方式进行免疫；编码所述融合蛋白LTB-VP4的核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示。

SEQ ID NO.9所示核苷酸序列编码的融合蛋白也为本发明的保护范围。

本发明的保护内容还包括，表达有融合蛋白LTB-VP4的酵母菌。

融合蛋白LTB-VP4的应用，包括利用融合蛋白LTB-VP4制备成草鱼出血病疫苗，包括以融合蛋白LTB-VP4为有效成分制备成口服或者注射的草鱼出血病疫苗。

以上所述的应用中，优选的，当以酵母展示技术制备的融合蛋白LTB-VP4进行免疫时，采用口服免疫，首次免疫连续口服三天后，间隔10天，进行加强免疫，再次口服三天。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明首次将GCRV II型S6基因截取了四段，同LTB进行融合表达，获得了一段免疫原性好，保护率高的融合蛋白LTB-VP4；

本发明通过酵母表面展示技术，将LTB-VP4在酿酒酵母中表达，制备成了可用于口服的草鱼出血病疫苗，蛋白在鱼体内环境中的稳定性好，疫苗保护力高，攻毒后草鱼的存活率达到了73.3％。

附图说明

图1为构建的9种酵母表面展示质粒结构示意图。

具体实施方式

本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。

实施例1：

目的基因的选取：

1)选取GCRV II型S6基因(GenBank：GQ896337.1)的四段序列，分别为核酸40bp-270bp、310bp-546bp、922bp-1053bp、1492bp-1731bp；

2)编码VP4-1蛋白的基因：将步骤1)中的40bp-270bp在5’端加上酶切位点EcoR I(GAATTC)，3’端先加上TG基因，然后再加上酶切位点Not I(GCGGCCGC)，序列为SEQ ID NO.1所示；

3)编码VP4-2蛋白的基因：将步骤1)中的310bp-546bp在5’端加上酶切位点EcoR I(GAATTC)，3’端先加上TG基因，然后再加上酶切位点Not I(GCGGCCGC)，序列为SEQ ID NO.2所示；

4)编码VP4-3蛋白的基因：将步骤1)中的922bp-1053bp在5’端加上酶切位点EcoRI(GAATTC)，3’端先加上TG基因，然后再加上酶切位点Not I(GCGGCCGC)，序列为SEQ IDNO.3所示；

5)编码VP4-4蛋白的基因：将步骤1)中的1492bp-1731bp在5’端加上酶切位点EcoRI(GAATTC)，3’端先加上TG基因，然后再加上酶切位点Not I(GCGGCCGC)，序列为SEQ IDNO.4所示；

6)编码VP4(-)蛋白的基因：将步骤1)中的四段基因依次首尾相连后，在5’端加上酶切位点EcoR I(GAATTC)，3’端先加上TG基因，然后再加上酶切位点Not I(GCGGCCGC)，序列为SEQ ID NO.5所示；

7)编码VP4蛋白的基因：将步骤1)中的四段基因片段两两之间用GGATCC依次连接后，在5’端加上酶切位点EcoR I(GAATTC)，3’端先加上TG基因，然后再加上酶切位点Not I(GCGGCCGC)，序列为SEQ ID NO.6所示；

8)编码LTB蛋白的基因：大肠杆菌不耐热肠毒素B亚基(GenBank：M17874.1)，在5’端加上酶切位点EcoR I(GAATTC)，3’端先加上TG基因，然后再加上酶切位点Not I(GCGGCCGC)，序列为SEQ ID NO.7所示；

9)编码LTB-VP4(-)蛋白的基因：将SEQ ID NO.7 3’端的TGGCGGCCGC删除，将SEQID NO.5的5’端的GAATTC删除后相连，序列为SEQ ID NO.8所示；

10)编码LTB-VP4蛋白的基因：将SEQ ID NO.7的3’端的TGGCGGCCGC删除，将SEQIDNO.6的5’端的GAATTC删除，二者通过GGGACTCGGAGGACTCGG相连，序列为SEQ ID NO.9所示。

将上述9种蛋白编码基因送天一辉远生物科技有限公司进行合成。

实施例2：

草鱼出血病酵母口服疫苗的制备：

1)将实施例1的9种合成产物和pYD1载体分别用EcoR I和Not I进行双酶切后，将合成产物分别连接至pYD1载体上，构建成酵母表面展示质粒，依次命名为：pYD1-GCRV-VP4-1、pYD1-GCRV-VP4-2、pYD1-GCRV-VP4-3、pYD1-GCRV-VP4-4、pYD1-GCRV-VP4(-)、pYD1-GCRV-VP4、pYD1-LTB、pYD1-LTB-GCRV-VP4(-)、pYD1-LTB-GCRV-VP4(图1)。

将pYD1-LTB-GCRV-VP4用EcoR I和Not I进行双酶切检测。同时用检测引物JC-F：5’-AGTAACGTTTGTCAGTAATTGC-3’；JC-R：5’-GTCGATTTTGTTACATCTACAC-3’进行PCR检测。结果显示，在凝胶成像系统中可清晰的见到与预测大小相同的条带，表明pYD1-LTB-GCRV-VP4重组质粒构建成功；其余质粒也利用相同方法及对应的引物进行检测，均显示重组质粒构建成功。

2)EBY100感受态的制备

将EBY100菌种在YPDA平板(或含亮氨酸和色氨酸的最小D-葡萄糖平板)上划线，30℃培养箱培养至出现单菌落(1-3d)。挑单菌落至5mL YPDA液体培养基中(50mL离心管)，30℃、160-180r/min摇床培养8-12h(过夜培养)。取500ul过夜培养物接种至50mL PYDA液体培养基中(250mL三角瓶)，30℃、160-180r/min摇床培养至OD₆₀₀为0.15-0.3。将培养好的菌液离心(50mL离心管)，4℃、1000g/min离心10min，弃上清。沉淀用少量YPDA液体重悬后加入至含100mL YPDA液体培养基的三角瓶中30℃160-180r/min摇床培养3-5h，至OD₆₀₀为0.4-0.5。4℃、1000g/min离心10min，弃上清，沉淀用30mL预冷的ddH₂O重悬。4℃、1000g/min离心10min，弃上清，沉淀用1.5mL1.1×TE/LiAc充分混悬，分装至2个1.5mL EP管中。高速离心(8000g/min)15s，弃上清，沉淀用600ul 1.1×TE/LiAc充分混悬，即为EBY100感受态

3)酵母表面展示载体电转化酿酒酵母及转化子筛选

在EBY100感受态细胞中分别加入5μgpYD1空质粒及鉴定正确的pYD1-LTB、pYD1-GCRV-VP4-1、pYD1-GCRV-VP4-2、pYD1-GCRV-VP4-3、pYD1-GCRV-VP4-4、pYD1-GCRV-VP4(-)、pYD1-GCRV-VP4、pYD1-LTB-GCRV-VP4(-)、pYD1-LTB-GCRV-VP4质粒，电击后立即加入1mL预冷的1mol/L山梨醇，并转移到1.5mL灭菌管中30℃培养1h后涂布于YNB选择培养基(含亮氨酸，不含色氨酸)上，30℃静置培养2d。筛选出阳性转化子，并分别命名为EBY100/pYD1、EBY100/pYD1-GCRV-VP4-1、EBY100/pYD1-GCRV-VP4-2、EBY100/pYD1-GCRV-VP4-3、EBY100/pYD1-GCRV-VP4-4、EBY100/pYD1-LTB、EBY100/pYD1-GCRV-VP4(-)、EBY100/pYD1-GCRV-VP4、EBY100/pYD1-LTB-GCRV-VP4(-)、EBY100/pYD1-LTB-GCRV-VP4。

利用检测引物JC-F/JC-R对EBY100/pYD1-LTB-GCRV-VP4阳性转化子进行PCR鉴定，由凝胶电泳后可以看出该重组质粒已经成功转入酵母感受态EBY100细胞中，其余转化子也用相同方法(对应的检测引物)进行鉴定。

4)酵母表面展示蛋白的诱导表达

挑取筛选成功的阳性转化子于含有2％葡萄糖YNB-CAA培养基中，30℃振荡培养待其OD600值在2.0～5.0时，4000r/min离心8min收集菌体。并在离心后的菌体中加入含有2％半乳糖的YNB-CAA培养基重悬酵母细胞，并使其重悬后的OD600值在0.5～1.0。重悬后的酵母细胞于20℃摇床中振荡培养，诱导蛋白的表达，并分别在诱导后的0～60h内取样，4000r/min离心8min收集菌体，弃上清，沉淀用2mL PBS重悬后，用高压破碎仪进行破碎，并利用HisTrap FF柱对表达后培养基上清进行纯化。根据Bradford法测定酵母表面展示蛋白的浓度，表达后上清中目的蛋白含量最高分别为EBY100/pYD1-GCRV-VP4-1蛋白12ug/mL、EBY100/pYD1-GCRV-VP4-2蛋白13ug/mL、EBY100/pYD1-GCRV-VP4-3蛋白10ug/mL、EBY100/pYD1-GCRV-VP4-4蛋白13ug/mL、EBY100/pYD1-LTB蛋白17ug/mL、EBY100/pYD1-GCRV-VP4(-)蛋白9ug/mL、EBY100/pYD1-GCRV-VP4蛋白10ug/mL、EBY100/pYD1-LTB-GCRV-VP4(-)蛋白9ug/mL、EBY100/pYD1-LTB-GCRV-VP4蛋白8ug/mL。

5)酵母表面展示蛋白的Western Blotting分析

将诱导表达后的酿酒酵母离心，收集菌体，提取诱导表达后酿酒酵母的蛋白，并将提取后的蛋白上清液进行12％SDS-PAGE凝胶电泳。电泳后转移至硝酸纤维素膜上，加入PBS(含有1％BSA)室温封闭1h，PBS洗涤3遍后，加入鼠抗His标签单克隆抗体作为一抗、go atanti-rabbit IgG antibody H&L(HRP)作为二抗，对酵母表面展示蛋白进行Western Blotting检测，并以含有pYD1空质粒的酵母细胞诱导产物作为对照。

提取诱导后EBY100/pYD1、EBY100/pYD1-GCRV-VP4-1、EBY100/pYD1-GCRV-VP4-2、EBY100/pYD1-GCRV-VP4-3、EBY100/pYD1-GCRV-VP4-4、EBY100/pYD1-LTB、EBY100/pYD1-GCRV-VP4(-)、EBY100/pYD1-GCRV-VP4、EBY100/pYD1-LTB-GCRV-VP4(-)、EBY100/pYD1-LTB-GCRV-VP4蛋白进行Western Blotting分析，并以含有pYD1空质粒的酵母细胞诱导产物作为对照。经2％半乳糖诱导后，含有EBY100/pYD1、EBY100/pYD1-GCRV-VP4-1、EBY100/pYD1-GCRV-VP4-2、EBY100/pYD1-GCRV-VP4-3、EBY100/pYD1-GCRV-VP4-4、EBY100/pYD1-LTB、EBY100/pYD1-GCRV-VP4(-)、EBY100/pYD1-GCRV-VP4、EBY100/pYD1-LTB-GCRV-VP4(-)、EBY100/pYD1-LTB-GCRV-VP4重组质粒的酵母细胞提取物都出现了与预期大小一致的特异性反应条带，而含有pYD1空质粒的酵母细胞诱导产物并未出现条带。Western Blotting结果表明9种转化了不同重组质粒的酵母细胞都能成功表达目的蛋白。

6)酵母表面展示蛋白的免疫荧光检测

利用含有2％半乳糖的YNB-CAA培养基重悬酵母细胞进行诱导表达，将不同时间段诱导后的酵母细胞离心收集菌体，加入PBS洗涤3遍；以鼠抗His标签单克隆抗体抗体作为一抗，与细胞孵育1h并经PBS洗涤后，加入Goat Anti-Rabbit IgG antibody H&L(Cy3)作为二抗与酵母细胞孵育1h，PBS洗涤后取酵母细胞滴于载玻片上，并经盖玻片压实后利用倒置荧光显微镜进行免疫荧光检测。荧光显微镜观察结果显示，转化了重组质粒的酵母细胞表面呈现出特异性红色荧光，而未转化重组质粒的酵母细胞表面并未见红色荧光。上述结果表明，转化了重组质粒的9种酵母细胞成功表达并且表面展示了目的蛋白

7)草鱼出血病酵母口服疫苗的制备

将诱导表达后的酿酒酵母，2000r/min离心10min，弃上清，沉淀进行冷冻干燥,冻干粉后，产品中的有效菌浓度均大于6×10¹²CFU/g。将冷冻干燥产物按质量比1:100与草鱼饲料混合，制备成草鱼出血病酵母口服疫苗，同时制备酿酒酵母EBY100/pYD1口服饲料作为对照。

实施例3：

草鱼出血病酵母口服疫苗在抗GCRV中的应用：

1)疫苗口服免疫实验

将330尾大小为(12±2)cm的草鱼随机分为11组，每组30尾，分别为EBY100/pYD1实验组、EBY100/pYD1-LTB实验组、EBY100/pYD1-GCRV-VP4-1实验组、EBY100/pYD1-GCRV-VP4-2实验组、EBY100/pYD1-GCRV-VP4-3实验组、EBY100/pYD1-GCRV-VP4-4实验组、EBY100/pYD1-GCRV-VP4(-)实验组、EBY100/pYD1-GCRV-VP4实验组、EBY100/pYD1-LTB-GCRV-VP4(-)实验组、EBY100/pYD1-LTB-GCRV-VP4实验组以及未混合疫苗的饲料为空白对照组。

表1为免疫实验设计，具体分组与给药方案见表1。在加强免疫完成后的第21天，腹腔注射100μl浓度为200copies/μl的GCRV病毒进行攻毒。攻毒后，连续30天观察并统计鱼体死亡情况。

表1免疫实验设计

2)实验结果

GCRV攻毒后，免疫组与对照组草鱼在30d内均发生了不同程度的发病死亡，发病时间集中在攻毒后的第8～18d，随后情况趋于稳定。总体来说，口服EBY100/pYD1-LTB-GCRV-VP4组保护效率都高于其他组的保护效率。口服草鱼出血病酵母口服疫苗的最佳方法和剂量为：30尾鱼每天投喂含有100mg草鱼出血病酵母口服疫苗的饲料10g，连续投喂3天，然后在第一次免疫后第13天，继续投喂草鱼出血病酵母口服疫苗3天，保护率为73.33％。

表2保护率结果

试剂配制：

YPDA(1 L)：10g yeast extract，20g peptone加水至900mL，高温灭菌后加入100mL 20％葡萄糖溶液(过滤除菌)和15mL 0.2％腺嘌呤溶液(过滤除菌)，固体则加入15g琼脂灭菌后冷却至60℃加入100mL 20％葡萄糖溶液和15mL 0.2％腺嘌呤溶液。

MDP(1 L)：6.7g YNB加水至900mL，高温灭菌后加入100mL 20％葡萄糖溶液(过滤除菌)，固体则加入15g琼脂灭菌后冷却至60℃加入100mL 20％葡萄糖溶液。

YNB-CCA(1 L)：6.7g YNB和5g络蛋白水解物加水至900mL，高温灭菌(必须高温灭菌)。

20％葡萄糖(1 L)：200g葡糖糖加水至1 L，溶解完全后过滤除菌。

20％半乳糖(1 L)：200g半乳糖加水至1 L，溶解完全后过滤除菌。

序列表

<110> 中国水产科学研究院长江水产研究所

<120> 一种草鱼出血病酵母口服疫苗及应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 247

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gaattcaatg gcgacggtaa tagcttcggt gccgaaagcg acatgcgatc gacagctgcg 60

ccagaaatca tgttatcacc cggaaaactt aacccgaatg gactcgcatg gatgaaagtc 120

gcaggatcag gtatgggacc aggctcactg caaattgtac acgcaacaga cgggtcaccg 180

tattgttaca tccctccgga cgccatgtct agtatggaaa aatcagcagg tgccgtttgg 240

cggccgc 247

<210> 2

<211> 253

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gaattctgct ctacagtgaa cgtgtccgac tttactgatg agttcagtgc ctacgttggc 60

gtcagtgaac ccgcggccct taagaagtac gtcgagaaag gagtcttcat gtcaacatca 120

caagcgaaaa atttctttgg gacactcggg cagaggatgg cgaggataaa gggttggtct 180

gaagatatac ggacggcggc tgctatgata ccagtagaca cacctcatgg ctcggtcacg 240

tgctggcggc cgc 253

<210> 3

<211> 148

<212> DNA

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<400> 3

gaattccccg ggactactgc catagagaag acattcgacg tcgggacaac atccaagacg 60

acgtattacc tgagcatggg taactccggt ggtggagatt tgatgattga tctgaagcga 120

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<400> 4

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gacagtgcgc atgcaccatc ctccggcacc gtccttggcc cgcttgcaat tgaaaacaag 180

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gcaggatcag gtatgggacc aggctcactg caaattgtac acgcaacaga cgggtcaccg 180

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tctacagtga acgtgtccga ctttactgat gagttcagtg cctacgttgg cgtcagtgaa 300

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cggacggcgg ctgctatgat accagtagac acacctcatg gctcggtcac gtgccccggg 480

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agtgaacccg cggcccttaa gaagtacgtc gagaaaggag tcttcatgtc aacatcacaa 360

gcgaaaaatt tctttgggac actcgggcag aggatggcga ggataaaggg ttggtctgaa 420

gatatacgga cggcggctgc tatgatacca gtagacacac ctcatggctc ggtcacgtgc 480

ggatcccccg ggactactgc catagagaag acattcgacg tcgggacaac atccaagacg 540

acgtattacc tgagcatggg taactccggt ggtggagatt tgatgattga tctgaagcga 600

ctcccagcat gcggacttgg atccggtaac gcctcaccag aggaaatgcg ttccgcatta 660

ccagcagatg tgctgacagc tttcaaagcc aagcttacaa cagtggcttc tgtagtcggc 720

cgtgccttaa accccaacga cagtgcgcat gcaccatcct ccggcaccgt ccttggcccg 780

cttgcaattg aaaacaaggc ccaatcgaaa cctaaacccg tatcagatct gtggatagct 840

gctcggcgtg gtgtgaatct attctggcgg ccgc 874

<210> 7

<211> 388

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gaattcatga ataaagtaaa attttatgtt ttatttacgg cgttactatc ctctctatgt 60

gcacacggag ctcctcagtc tattacagaa ctatgttcgg aatatcacaa cacacaaata 120

tatacgataa atgacaagat actatcatat acggaatcga tggcaggcaa aagagaaatg 180

gttatcatta catttaagag cggcgcaaca tttcaggtcg aagtcccggg cagtcaacat 240

atagactccc aaaaaaaagc cattgaaagg atgaaggaca cattaagaat cacatatctg 300

accgagacca aaattgataa attatgtgta tggaataata aaacccccaa ttcaattgcg 360

gcaatcagta tggaaaactg gcggccgc 388

<210> 8

<211> 1228

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gaattcatga ataaagtaaa attttatgtt ttatttacgg cgttactatc ctctctatgt 60

gcacacggag ctcctcagtc tattacagaa ctatgttcgg aatatcacaa cacacaaata 120

tatacgataa atgacaagat actatcatat acggaatcga tggcaggcaa aagagaaatg 180

gttatcatta catttaagag cggcgcaaca tttcaggtcg aagtcccggg cagtcaacat 240

atagactccc aaaaaaaagc cattgaaagg atgaaggaca cattaagaat cacatatctg 300

accgagacca aaattgataa attatgtgta tggaataata aaacccccaa ttcaattgcg 360

gcaatcagta tggaaaacaa tggcgacggt aatagcttcg gtgccgaaag cgacatgcga 420

tcgacagctg cgccagaaat catgttatca cccggaaaac ttaacccgaa tggactcgca 480

tggatgaaag tcgcaggatc aggtatggga ccaggctcac tgcaaattgt acacgcaaca 540

gacgggtcac cgtattgtta catccctccg gacgccatgt ctagtatgga aaaatcagca 600

ggtgccgttt gctctacagt gaacgtgtcc gactttactg atgagttcag tgcctacgtt 660

ggcgtcagtg aacccgcggc ccttaagaag tacgtcgaga aaggagtctt catgtcaaca 720

tcacaagcga aaaatttctt tgggacactc gggcagagga tggcgaggat aaagggttgg 780

tctgaagata tacggacggc ggctgctatg ataccagtag acacacctca tggctcggtc 840

acgtgccccg ggactactgc catagagaag acattcgacg tcgggacaac atccaagacg 900

acgtattacc tgagcatggg taactccggt ggtggagatt tgatgattga tctgaagcga 960

ctcccagcat gcggacttgg taacgcctca ccagaggaaa tgcgttccgc attaccagca 1020

gatgtgctga cagctttcaa agccaagctt acaacagtgg cttctgtagt cggccgtgcc 1080

ttaaacccca acgacagtgc gcatgcacca tcctccggca ccgtccttgg cccgcttgca 1140

attgaaaaca aggcccaatc gaaacctaaa cccgtatcag atctgtggat agctgctcgg 1200

cgtggtgtga atctattctg gcggccgc 1228

<210> 9

<211> 1264

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gaattcatga ataaagtaaa attttatgtt ttatttacgg cgttactatc ctctctatgt 60

gcacacggag ctcctcagtc tattacagaa ctatgttcgg aatatcacaa cacacaaata 120

tatacgataa atgacaagat actatcatat acggaatcga tggcaggcaa aagagaaatg 180

gttatcatta catttaagag cggcgcaaca tttcaggtcg aagtcccggg cagtcaacat 240

atagactccc aaaaaaaagc cattgaaagg atgaaggaca cattaagaat cacatatctg 300

accgagacca aaattgataa attatgtgta tggaataata aaacccccaa ttcaattgcg 360

gcaatcagta tggaaaacgg gactcggagg actcggaatg gcgacggtaa tagcttcggt 420

gccgaaagcg acatgcgatc gacagctgcg ccagaaatca tgttatcacc cggaaaactt 480

aacccgaatg gactcgcatg gatgaaagtc gcaggatcag gtatgggacc aggctcactg 540

caaattgtac acgcaacaga cgggtcaccg tattgttaca tccctccgga cgccatgtct 600

agtatggaaa aatcagcagg tgccgttgga tcctgctcta cagtgaacgt gtccgacttt 660

actgatgagt tcagtgccta cgttggcgtc agtgaacccg cggcccttaa gaagtacgtc 720

gagaaaggag tcttcatgtc aacatcacaa gcgaaaaatt tctttgggac actcgggcag 780

aggatggcga ggataaaggg ttggtctgaa gatatacgga cggcggctgc tatgatacca 840

gtagacacac ctcatggctc ggtcacgtgc ggatcccccg ggactactgc catagagaag 900

acattcgacg tcgggacaac atccaagacg acgtattacc tgagcatggg taactccggt 960

ggtggagatt tgatgattga tctgaagcga ctcccagcat gcggacttgg atccggtaac 1020

gcctcaccag aggaaatgcg ttccgcatta ccagcagatg tgctgacagc tttcaaagcc 1080

aagcttacaa cagtggcttc tgtagtcggc cgtgccttaa accccaacga cagtgcgcat 1140

gcaccatcct ccggcaccgt ccttggcccg cttgcaattg aaaacaaggc ccaatcgaaa 1200

cctaaacccg tatcagatct gtggatagct gctcggcgtg gtgtgaatct attctggcgg 1260

ccgc 1264

<210> 10

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

agtaacgttt gtcagtaatt gc 22

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gtcgattttg ttacatctac ac 22

Claims

1.一种编码融合蛋白的基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示。

2.SEQ ID NO.9所述序列编码的融合蛋白。

3.表达权利要求2所述融合蛋白的酵母菌。

4.权利要求1所述基因或权利要求2所述的融合蛋白在制备草鱼出血病疫苗中的应用。

5.权利要求3所述的酵母菌在制备成草鱼出血病口服疫苗中的应用。

6.根据权利要求3所述的酵母菌，所述的酵母菌为酿酒酵母。

7.根据权利要求5所述的应用，当以酵母展示技术制备的融合蛋白LTB-VP4对草鱼进行免疫时，采用口服免疫，首次免疫连续口服三天后，间隔10天，进行加强免疫，再次口服三天。