WO2018062199A1 - 人工組換えロタウイルスの作製方法 - Google Patents

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祐太 金井
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    • C12N2720/12351—Methods of production or purification of viral material

Definitions

  • the present invention relates to a method for producing an artificial recombinant virus belonging to the family Reoviridae, and particularly to a method for producing an artificial recombinant rotavirus.
  • the rotavirus belonging to the Reoviridae family is known as a causative virus for infant diarrhea. Rotavirus is prone to infection and onset among infants aged 6 months to 2 years, and almost 100% will be infected by the age of 5 years. A vaccine against rotavirus has been put into practical use and its preventive effect has been confirmed. However, on the other hand, research on the development of next-generation vaccines that are cheaper and have a higher protective effect is ongoing.
  • RG Reverse genetics
  • RNA-based RG systems capable of producing recombinant viruses by introducing viral RNA into cells have been developed for Orbileovirus genus Bluetongue virus and African horse sickness virus (Non-Patent Document 1, 2).
  • Non-Patent Document 1 RNA-based RG systems capable of producing recombinant viruses by introducing viral RNA into cells have been developed for Orbileovirus genus Bluetongue virus and African horse sickness virus.
  • Non-Patent Document 3 a DNA-based RG system consisting of a complete cDNA has been developed.
  • Non-patent Documents 4 and 5 a partial DNA-based RG system using a helper virus has been reported.
  • the RG system using the helper virus requires a powerful method for selecting the target virus from the helper virus, can introduce mutations only in limited segment genes (VP4 gene, NSP2 gene), and production efficiency Is a problem. Therefore, there is a long-awaited development of a complete RG system that does not require a helper virus and can produce rotaviruses by introducing only cDNA or RNA.
  • the present invention includes the following inventions in order to solve the above problems.
  • a method for producing an artificial recombinant virus belonging to the family Reoviridae (1) introducing a FAST protein expression vector and / or a capping enzyme expression vector into a host cell; (2) introducing a vector containing an expression cassette of each segmental RNA genome of the virus, or a set of single-stranded RNA transcribed from the expression cassette into a host cell; and (3) culturing the host cell.
  • the artificial recombinant virus is characterized in that a mutation is introduced into at least one of the segmented RNA genomes and / or a foreign gene is incorporated into at least one of the segmented RNA genomes
  • the FAST protein is Nelson Bayreovirus p10, avian reovirus p10, Bloom virus p13, reptile reovirus p14, baboon leovirus p15, grass carp reovirus p16 and Atlantic salmon reovirus p22.
  • the segmented RNA genome expression cassette comprises an RNA polymerase promoter, a DNA encoding a viral segmented RNA genome, and a DNA encoding a ribozyme having a self-cleaving action.
  • the manufacturing method in any one.
  • the RNA polymerase promoter is a T7 promoter and the host cell is a recombinant T7 RNA polymerase-expressing cell.
  • the ribozyme is a hepatitis D virus ribozyme.
  • the artificial recombinant rotavirus is an artificial recombinant rotavirus that expresses a foreign gene, and instead of a vector containing an expression cassette of a segmented RNA genome encoding NSP1, an expression cassette of a segmented RNA genome encoding NSP1
  • a vector comprising an expression cassette in which a foreign gene is inserted into the NSP1 gene and from which 100 to 1550 bases of the NSP1 gene are deleted is used.
  • Method. A method for promoting virus replication, comprising culturing a host cell expressing FAST protein after infection with the virus.
  • the FAST protein is Nelson Bayreovirus p10, avian reovirus p10, Bloom virus p13, reptile reovirus p14, baboon leovirus p15, grass carp reovirus p16 and Atlantic salmon reovirus p22.
  • the method according to [12], wherein the method is at least one selected from the group consisting of: [14] An artificial recombinant rotavirus, wherein a mutation that suppresses at least one function selected from NSP1, NSP3, and NSP4 is introduced. [15] An artificial recombinant rotavirus characterized by expressing a foreign gene. [16] An artificial recombinant rotavirus, which is a reassortant.
  • a vaccine containing the artificial recombinant rotavirus according to any one of [14] to [16].
  • a vector containing an expression cassette of 11 segmented RNA genomes of rotavirus or a set of 11 single-stranded RNAs transcribed from the expression cassette is introduced into a host cell that does not express FAST protein and capping enzyme And culturing the artificial recombinant rotavirus.
  • a method for producing an artificial recombinant virus belonging to the family Reoviridae, wherein a vector containing an expression cassette of each segmental RNA genome of the virus, or a set of single-stranded RNA transcribed from the expression cassette was introduced A production method comprising culturing a host cell by overexpressing a gene product involved in virus inclusion body formation in a virus-infected cell.
  • the present invention it is possible to provide a method for producing an artificial recombinant virus belonging to the family Reoviridae whose production efficiency of an artificial recombinant virus is improved as compared with the conventional reverse genetics system. Further, it is possible to provide a method for producing an artificial recombinant rotavirus that does not require a helper virus that has not been realized in the past. Furthermore, a vaccine candidate artificial recombinant rotavirus in which a mutation is introduced into the viral segment genome can be provided.
  • a ZsGreen expression artificial recombinant rotavirus was prepared using the segmented genome expression vector containing the four types of ZsGreen gene inserted NSP1 genes shown in FIG. 14, and the retention rate (ZsGreen expression rate) of the ZsGreen gene after virus passage was confirmed. It is a figure which shows the result.
  • the present invention provides a method for producing an artificial recombinant virus belonging to the family Reoviridae (hereinafter referred to as “the production method of the present invention”).
  • the manufacturing method of this invention should just contain the following processes (1), (2), and (3).
  • (1) Step of introducing a FAST protein expression vector and / or a capping enzyme expression vector into a host cell (2) A vector containing an expression cassette of each segmental RNA genome of a virus, or a single-stranded RNA transcribed from the expression cassette Step of introducing set into host cell (3) Step of culturing host cell
  • the virus belonging to the family Reoviridae is a virus having in its genome a linear double-stranded RNA segmented into 10 to 12, and its virion has an icosahedral structure with a diameter of 60 to 80 nm.
  • Viruses belonging to the family Reoviridae include mammalian orthoreoviruses, Nelson bay reoviruses, avian reoviruses and other orthoreoviruses (Genus Orthoreovirus), African horse sickness viruses, bluetongue viruses and other orbiviruses (Genus Orbivirus) , Rotavirus genus such as rotavirus (Genus Rotavirus), Cortivirus genus such as Colorado tick virus (Genus Coltivirus), Aquareovirus genus such as Aquareovirus A (Genus Aquareovirus), Cytoplasmic polyhedrosis virus, etc.
  • Povirus genus (Genus ⁇ Cypovirus), rice southern black stripe dwarf virus, etc. Genius Fijivirus, rice dwarf virus genus phytoreovirus (Genus Phytoreovirus) and rice rugged stunt virus (Rice ragged stunt virus) Orizavirus genus (Genus Oryzavirus) It is included.
  • the production method of the present invention is preferably applied to artificial recombinant viruses of mammalian orthoreovirus and rotavirus.
  • each segmental RNA genome of the virus is not particularly limited as long as it has a structure capable of expressing a single-stranded plus-strand RNA (viral mRNA) serving as a template for double-stranded RNA that is a viral segmental genome.
  • Preferable expression cassettes include, for example, an expression cassette composed of an RNA polymerase promoter, a DNA encoding a segmented RNA genome (cDNA of a segmented RNA genome), and a DNA encoding a ribozyme having a self-cleaving action in order from the upstream.
  • the RNA polymerase promoter is a T7 promoter
  • a T7 terminator sequence is included in the expression cassette.
  • RNA polymerase promoter is a polymerase I-derived promoter
  • a terminator sequence corresponding to the promoter is included in the expression cassette.
  • a polyadenylation signal sequence is included in the expression cassette.
  • each segmental RNA genome of the virus may be composed only of an RNA polymerase promoter and a DNA encoding the segmented RNA genome (segmented RNA genome cDNA).
  • the cleavage pattern of the linear vector encodes only the viral genome 3 ′ end by cleaving the 3 ′ end of the DNA encoding the segmented RNA genome, for example, with a restriction enzyme, It can be used in a state where the vector-derived sequence has a structure that is not transcribed.
  • the cDNA of the segmented RNA genome can be obtained by RT-PCR using RNA extracted from a virus and the resulting double-stranded RNA as a template.
  • a primer set a specific primer set can be designed based on the base sequence of the target segmented RNA genome.
  • the base sequence of the segmental RNA genome of the virus can be obtained from a known database (GenBank, etc.).
  • the base sequence of the viral segmented RNA genome may be determined by a known method using a commercially available sequencer.
  • RNA polymerase promoter As the RNA polymerase promoter, a T7 promoter, a polymerase I-derived promoter, a polymerase II-derived CAG promoter, a CMV promoter, or the like can be suitably used. T7 promoter is preferred.
  • ribozyme having a self-cleaving action a known ribozyme having a self-cleaving action can be appropriately selected and used.
  • examples of the ribozyme having a self-cleaving action include hammerhead ribozyme, hairpin ribozyme, M1 subunit of ribonuclease P, hepatitis D virus (HDV) ribozyme, Varkud's satellite ribozyme and the like. HDV ribozyme is preferable.
  • a vector for inserting a segmented RNA genome expression cassette a known cloning vector, an expression vector for mammalian cells, various virus vectors (vaccinia virus vector, adenovirus vector, adeno-associated virus vector, retrovirus vector, lentivirus vector, etc.) Etc. can be used suitably.
  • one set of vectors equal to the number of viral segments is one set.
  • a polycistronic vector in which two or more segmented RNA genome expression cassettes are contained in one vector may be used.
  • the number of segmented RNA genome expression cassettes contained in one vector is not limited, and one vector may contain expression cassettes of all segments. From the viewpoint of production efficiency of artificial recombinant virus, a smaller number of vectors is preferable.
  • the single-stranded RNA to be introduced into the host cell is a positive-stranded RNA, and can be obtained by in vitro transcription from an expression cassette of a segmented RNA genome.
  • In vitro transcription can be performed, for example, using a commercially available reagent (for example, in vitro Transcription T7 Kit (Takara Bio)).
  • the RNA to be used is preferably capped after in vitro transcription using a cap analog (for example, Ribo m7G Cap Analog (Promega), etc.).
  • the number of sets of single-stranded RNA is the same as the number of viral segments.
  • FAST fusion-associated small transmembrane
  • FAST proteins of known viruses belonging to the Fusogenic reovirus group of the family Reoviridae Orthoreovirus and viruses newly isolated in the future. It can.
  • Nelson Bayreovirus p10 GenBank Accession: BAJ52806
  • Avian Reovirus p10 GeneBank Accession: AGO32037
  • Bloom Virus p13 GeneBank
  • reptile reovirus Rostile reovirus
  • Renilian reovirus GeneBank ACCESSION: AAP03134
  • baboon leovirus Bact reovirus
  • grass carp reovirus Grass carp reovirus
  • a FAST protein expression vector can be prepared, for example, by inserting a gene encoding the FAST protein into a known expression vector for mammalian cells such as pCAGGS plasmid (see FIG. 10) or a known viral vector. .
  • the base sequence of the gene encoding the FAST protein can be obtained from the base sequence information of the virus genome.
  • nucleotide sequence information of the viral genome those registered in known databases (GenBank, etc.) can be used.
  • the nucleotide sequence of the gene encoding p10 of Nelson Bayreovirus for example, the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 26 can be used.
  • SEQ ID NO: 27 base sequences can be used.
  • single-stranded plus-strand RNA encoding the FAST protein can be used.
  • Single-stranded plus-strand RNA encoding FAST protein can be obtained, for example, by in vitro transcription from a FAST protein expression vector.
  • In vitro transcription can be performed, for example, using a commercially available reagent (for example, in vitro Transcription T7 Kit (Takara Bio)).
  • the RNA to be used is preferably capped after in vitro transcription using a cap analog (for example, Ribo m7G Cap Analog (Promega), etc.).
  • the capping enzyme is not particularly limited as long as it is an enzyme that can catalyze the capping reaction of mRNA in the cytoplasm, and a DNA virus or RNA virus capping enzyme that replicates in the cytoplasm of the host cell can be suitably used.
  • capping enzymes for DNA viruses that replicate in the cytoplasm of host cells include capping enzymes encoded by viruses belonging to the Poxviridae family and capping enzymes encoded by viruses belonging to the Asphaviridae family.
  • Examples of capping enzymes for RNA viruses that replicate in the cytoplasm of host cells include the nsp1 protein of Togaviridae viruses.
  • it is a capping enzyme encoded by a virus belonging to the family Poxviridae or Asfaviridae.
  • a capping enzyme encoded by a virus belonging to the poxviridae family a vaccinia virus capping enzyme can be preferably used.
  • a capping enzyme encoded by a virus belonging to the family Asfaviridae NP868R of African swine fever virus can be preferably used.
  • a gene (D1R) encoding a capping enzyme large subunit (GenBank ACCESSION: YP_232988) and a gene (D12L) encoding a small subunit (GenBank ACCESSION: YP_232999) are used, for example, pCAGGS plasmid (
  • a capping enzyme expression vector can be prepared by inserting each into a known expression vector for mammalian cells such as FIG. 10) or a known viral vector.
  • the base sequence of the gene encoding the large subunit of the vaccinia virus capping enzyme for example, the base sequence of SEQ ID NO: 29 can be used, and as the base sequence of the gene encoding the small subunit, for example, the base sequence of SEQ ID NO: 30 is used.
  • a polycistronic vector in which a FAST protein expression cassette and a capping enzyme subunit expression cassette are contained in one vector may be used.
  • single-stranded plus-strand RNA encoding each subunit of the capping enzyme can be used.
  • Single-stranded plus-strand RNA encoding each subunit of the capping enzyme can be obtained, for example, by in vitro transcription from an expression vector of each subunit of the capping enzyme.
  • In vitro transcription can be performed, for example, using a commercially available reagent (for example, in vitro Transcription T7 Kit (Takara Bio)).
  • the RNA to be used is preferably capped after in vitro transcription using a cap analog (for example, Ribo m7G Cap Analog (Promega), etc.).
  • a cell having high sensitivity to viruses belonging to the family Reoviridae and high gene transfer efficiency can be suitably used.
  • examples of such cells include, but are not limited to, BHK cells, MA104 cells, COS7 cells, CV1 cells, Vero cells, L929 cells, and 293T cells A549 cells.
  • modified cells derived from the above cells can also be suitably used as host cells.
  • recombinant T7 RNA polymerase-expressing cells can be used as host cells.
  • Recombinant T7 RNA polymerase-expressing cells can be prepared by, for example, transfecting a cell that can be used as a host cell with an expression vector for mammalian cells into which a gene encoding T7 RNA polymerase (GenBank ACCESSION: ADJ00046) has been inserted. Can be used to select cells that stably express recombinant T7 RNA polymerase.
  • cells that can be used as host cells are infected with various viral vectors inserted with a gene encoding T7 RNA polymerase (vaccinia virus vector, adenovirus vector, adeno-associated virus vector, retrovirus vector, lentivirus vector, etc.).
  • a gene encoding T7 RNA polymerase vaccinia virus vector, adenovirus vector, adeno-associated virus vector, retrovirus vector, lentivirus vector, etc.
  • cells that transiently or continuously express the recombinant T7 RNA polymerase can also be produced.
  • the base sequence of the gene encoding T7 RNA polymerase for example, the base sequence of positions 894 to 3545 of the base sequence of “T7RNA polymerase vector pGemT7cat” (GenBank ACCESSION: HM049174) can be used.
  • known recombinant T7 RNA polymerase-expressing cells for example, BHK / T7-9: Ito, N et al
  • FAST protein expression vector and / or capping enzyme expression vector in step (1) into host cell vector containing expression cassette of each segmental RNA genome of virus in step (2), or one transcribed from the expression cassette
  • Introduction of the set of the double-stranded RNA into the host cell can be carried out using known transfection means such as electroporation, calcium phosphate method, liposome method, DEAE dextran method and the like.
  • transfection means such as electroporation, calcium phosphate method, liposome method, DEAE dextran method and the like.
  • a commercially available transfection reagent for example, TransIT-LT1 (trade name, Mirus) etc.
  • step (1) and step (2) may be performed separately or simultaneously.
  • a process (2) may be performed after a process (1) and a process (1) may be performed after a process (2).
  • step (1) and step (2) are performed simultaneously. That is, the method of the present invention preferably includes the following steps (I) and (II).
  • a FAST protein expression vector and / or a capping enzyme expression vector, and a vector containing an expression cassette for each segmental RNA genome of a virus or a set of single-stranded RNA transcribed from the expression cassette are simultaneously introduced into a host cell.
  • II culturing host cells
  • the host cell into which the FAST protein expression vector and / or capping enzyme expression vector has been introduced may be a cell that transiently expresses the FAST protein and / or capping enzyme, or may be a cell that continuously expresses.
  • a cell that continuously expresses FAST protein and / or capping enzyme in addition to T7 RNA polymerase can be used.
  • Cells that continuously express FAST protein and / or capping enzyme introduce FAST protein expression vector and / or capping enzyme expression vector, and stably express FAST protein and / or capping enzyme using means such as drug selection. It can be produced by selecting cells.
  • the sustained expression cell may be a cell that always expresses FAST protein and / or capping enzyme, and may be a cell whose expression can be controlled by, for example, a Teton / off system.
  • various viral vectors vaccinia virus vector, adenovirus vector, adeno-associated virus vector, retrovirus
  • a gene encoding a FAST protein and / or a gene encoding a capping enzyme is inserted into a cell that can be used as a host cell.
  • Vectors, lentiviral vectors, etc. can be infected to produce cells that transiently or persistently express FAST protein and / or capping enzyme.
  • the amount of nucleic acid used for transfection is preferably selected in accordance with the size of the culture plate used, the type of host cell, the number of seeded cells, and the like. For example, when T7 RNA polymerase stable expression BHK cells are used as host cells and seeded in a 6-well plate at 8 ⁇ 10 5 cells / well and transfection is performed the next day, the DNA amount of each segmented RNA genome expression vector is 0.5.
  • the DNA amount of the FAST protein expression vector is preferably 0.002 to 0.02 ⁇ g, and the DNA amount of the capping enzyme expression vector is preferably 0.5 to 1.0 ⁇ g.
  • the DNA amount of each segmented RNA genome expression vector is 0.25 each.
  • the DNA amount of the FAST protein expression vector is preferably 0.0001 to 0.01 ⁇ g, and the DNA amount of the capping enzyme expression vector is preferably 0.25 to 0.5 ⁇ g.
  • a medium suitable for the host cells can be appropriately selected and used. If cytopathicity is observed in the host cell, it can be determined that an artificial recombinant virus has been produced.
  • the medium and cells in the plate or well in which cell degeneration is confirmed can be collected, and a cell lysate can be prepared and used as a virus sample.
  • a virus may be isolated from this cell lysate by a plaque method, and after culturing in large quantities, virus particles may be purified to obtain a virus sample. Purification of virus particles can be performed by a known method (for example, cesium chloride density gradient centrifugation).
  • a cell lysate may be prepared as described above regardless of the presence or absence of cell degeneration, and this cell lysate may be added to other cells to pass the virus.
  • virus-sensitive cells are preferable, and cells highly sensitive to the virus to be produced are more preferable.
  • MA104 cells or CV1 cells are preferred. If other cells to which the cell lysate has been added are cultured and cell degeneration is observed, it can be determined that an artificial recombinant virus has been produced.
  • the above-mentioned virus-sensitive cells may be seeded on a host cell culture plate or well and co-cultured.
  • the number of seeded cells of other cells to be added is preferably about 1/5 to 1/20 of the cells subjected to transfection.
  • the cells are cultured in a serum-free medium supplemented with trypsin (for example, about 0.5 ⁇ g / ml) for about 3 to 5 days, and then a cell lysate is prepared and added to virus-sensitive cells for passage.
  • virus-sensitive cells that have been passaged are cultured in the above serum-free medium containing trypsin and cell degeneration is observed, it can be determined that an artificial recombinant virus has been produced.
  • the medium and cells in the plate or well in which cell degeneration is confirmed can be collected, and a cell lysate can be prepared and used as a virus sample.
  • a virus may be isolated from this cell lysate by a plaque method, and after culturing in large quantities, virus particles may be purified to obtain a virus sample. Purification of virus particles can be performed by a known method (for example, cesium chloride density gradient centrifugation).
  • an artificial recombinant virus in which a mutation is introduced into at least one of the segmented RNA genomes an artificial recombinant virus in which a foreign gene is incorporated into at least one of the segmented RNA genomes, or segmented RNA
  • Artificial recombinant viruses can be produced in which mutations are introduced into at least one of the genomes and foreign genes are incorporated into at least one of the segmented RNA genomes.
  • Such an artificial recombinant virus can be prepared by introducing a desired mutation into an expression cassette of a segmented RNA genome and / or incorporating a desired foreign gene. Mutation can be introduced into the expression cassette of the segmented RNA genome or foreign genes can be incorporated using known gene recombination techniques.
  • the present inventors have developed an artificial recombinant rotavirus capable of self-propagation in which a deletion mutation has been introduced into NSP1 of rotavirus, an artificial recombinant rotavirus in which a deletion mutation has been introduced into NSP3, and an amino acid in NSP4.
  • a part of the viral protein gene essential for growth can be deleted to produce an artificial recombinant rotavirus that cannot grow independently.
  • an artificial recombinant virus that cannot proliferate independently can be produced.
  • the artificial recombinant virus produced in this way can grow only in cells that express normal viral proteins corresponding to the mutant viral proteins. Therefore, the artificial recombinant virus can be applied to the production of single-infecting virus-like particles, and is considered useful as a vaccine. Furthermore, an artificial recombinant virus as an attenuated vaccine candidate can also be produced by adding mutations to known viral protein genes involved in attenuation or attenuation.
  • the present inventors have succeeded in producing an artificial recombinant rotavirus that expresses luciferase by incorporating a luciferase gene (Nluc gene) into the NSP1 gene of rotavirus. Furthermore, the present inventors have succeeded in producing an artificial recombinant rotavirus that expresses ZsGreen by incorporating a green fluorescent protein gene (ZsGreen gene) into the NSP1 gene of rotavirus. It is thought that the foreign gene can be integrated into any segmental genome of rotavirus.
  • the foreign gene is not limited to a gene having a size of 500 bp or more such as the Nluc gene (SEQ ID NO: 31) or the ZsGreen gene (SEQ ID NO: 33), and a short peptide can be expressed as a fusion protein with a viral protein. .
  • one foreign gene may be incorporated into each of two or more different segmented genomes, or two or more foreign genes may be incorporated into one segmented genome.
  • the foreign gene expression vector it is preferable to use a vector containing a segmented genome expression cassette in which a foreign gene is inserted into the NSP1 gene of rotavirus and a part of the NSP1 gene is deleted.
  • the insertion position of the foreign gene is not particularly limited, but is usually downstream from about 30 bases to about 200 bases of the 5 ′ end (including the untranslated region) of the NSP1 gene and the 3 ′ end (including the untranslated region) of the NSP1 gene. It is preferable to insert a foreign gene in a range upstream from about 30 bases to about 200 bases).
  • the NSP1 gene is in the range of about 80 bases to about 150 bases from the 5 ′ end (including the untranslated region) of the NSP1 gene, and more preferably from about 100 bases to about 130 from the 5 ′ end (including the untranslated region) of the NSP1 gene. Insert a foreign gene in the base range.
  • the deletion site of the NSP1 gene is not particularly limited, but is preferably downstream from the insertion position of the foreign gene. However, it is preferable to leave the 3 'end (including untranslated region) region of the NSP1 gene, and preferably leave at least about 30 bases, about 50 bases, about 100 bases, about 200 bases or more.
  • the number of bases to be deleted is not particularly limited, and may be 1550 bases or less, 1200 bases or less, 1000 bases or less, 800 bases or less, 700 bases or less, 600 bases or less, 500 bases or less, or 400 bases or less. Further, the number of bases to be deleted may be 100 bases or more, 200 bases or more, or 300 bases or more.
  • the artificial recombinant virus having a mutation produced by the production method of the present invention and a virus expressing a foreign gene are useful for functional analysis of viral proteins and are useful for the development of vaccines and vaccine vectors.
  • an artificial recombinant virus having a mutation or a virus expressing a foreign gene can be used as a vaccine.
  • the production efficiency of the artificial recombinant rotavirus is improved by overexpressing the rotavirus NSP2 gene product and / or the rotavirus NSP5 gene product in the host cell.
  • Either the NSP2 gene product or the NSP5 gene product may be overexpressed in the host cell, or both may be overexpressed in the host cell.
  • both the NSP2 gene product and the NSP5 gene product are overexpressed in the host cell.
  • NSP2 expression vector A vector that expresses the NSP2 gene product (hereinafter referred to as “NSP2 expression vector”) and a vector that expresses the NSP5 gene product (hereinafter referred to as “NSP5 expression vector”) are prepared.
  • NSP2 expression vector and NSP5 expression vector include NSP2 gene (GenBank Accession: LC178571, SEQ ID NO: 18) and NSP5 gene (GenBank Accession: LC178574, SEQ ID NO: 21), for example, a known mammal such as pCAGGS plasmid (see FIG. 10). It can be prepared by inserting each into an animal cell expression vector or a known viral vector.
  • the NSP2 gene inserted into the NSP2 expression vector and the NSP5 gene inserted into the NSP5 expression vector may be the NSP2 gene and NSP5 gene of the same strain as the artificial recombinant rotavirus to be prepared. Or it may be the NSP2 gene and NSP5 gene of rotavirus of different animals (human, monkey, horse, bird, dog, pig, cow, mouse, rat, rabbit, etc.).
  • a polycistronic vector in which the NSP2 expression cassette and the NSP5 expression cassette are contained in one vector may be used.
  • single-stranded plus-strand RNA encoding NSP2 can be used.
  • single-stranded plus-strand RNA encoding NSP5 can be used in place of the NSP5 expression vector.
  • These single-stranded plus-strand RNAs can be obtained, for example, by in vitro transcription from an NSP2 expression vector and an NSP5 expression vector. In vitro transcription can be performed, for example, using a commercially available reagent (for example, in vitro Transcription T7 Kit (Takara Bio)).
  • the RNA to be used is preferably capped after in vitro transcription using a cap analog (for example, Ribo m7G Cap Analog (Promega), etc.).
  • Segment RNA genome expressing segment 8 (NSP2 gene) and / or segment 11 (NSP5 gene) expressing segment 8 (NSP2 gene) without using NSP2 expression vector and / or NSP5 expression vector By increasing the amount of expression vector (segment 11 expression vector) introduced into the host cell over the segmented RNA genomic expression vector expressing other segments, the host cell is allowed to overexpress the NSP2 gene product and / or NSP5 gene product. be able to.
  • the DNA amount of the segment 8 expression vector and / or segment 11 expression vector to be introduced into the host cell is not particularly limited as long as it is larger than that of other segmental RNA genome expression vectors. It may be 5 times to about 10 times, and may be about 2 times to about 5 times. See Table 2 of Example 2 for each segmented genome (segment) of rotavirus.
  • the present inventors have confirmed that an artificial recombinant rotavirus can be produced without using host cells that express FAST protein and / or capping enzyme (see Example 10). That is, the present invention relates to a vector containing an expression cassette of 11 segmented RNA genomes of rotavirus in a host cell that does not express FAST protein and capping enzyme, or a set of 11 single-stranded RNAs transcribed from the expression cassette.
  • the present invention provides a method for producing an artificial recombinant rotavirus, which is characterized by introducing and culturing.
  • the first embodiment of the production method is a method using a host cell into which an NSP2 expression vector and / or an NSP5 expression vector has been introduced.
  • a vector containing an expression cassette of 11 segmented RNA genomes of rotavirus, or a set of 11 single-stranded RNAs transcribed from the expression cassette is used as a host cell. It is a method to introduce.
  • the amount of the segment 8 expression vector and / or the segment 11 expression vector introduced into the host cell in the expression cassette of the 11 segment RNA genomes of rotavirus is the segment RNA genome expressing other segments. The amount is preferably increased from that of the expression vector.
  • the DNA amount of the segment 8 expression vector and / or segment 11 expression vector to be introduced into the host cell is not particularly limited as long as it is larger than that of other segmental RNA genome expression vectors. It may be 5 times to about 10 times, and may be about 2 times to about 5 times.
  • Rotaviruses NSP2 and NSP5 are known to form viral inclusions (Viral inclusion body) in virus-infected cells and function as viral replication sites (Hu L, Crawford S, Hyser J, Estes M, and Prasad V (2012): Rotavirus non-structural proteins: Structure, Function, Current, Opinion, Virology 2 (4): 380-388.
  • the virus inclusion body is a structure commonly found in viruses belonging to the family Reoviridae, and is encoded by the M3 gene of the family Reoviridae Orthoreovirus (Mammalian Orthoreovirus, Nelson Bayreovirus, Avian Reovirus, etc.).
  • NS2 encoded by segment 8 of the reoviridae Orbivirus genus form virus inclusion bodies in the same manner.
  • Known to function as a replication site Thimas CP, Booth TF, Roy P (1990): Synthesis of bluetongue virus-encoded phosphoprotein and formation of inclusion bodies by recombinant baculovirus in insect cells: it binds thele-single-stranded RNA species. Journal of General Virology, 71 (Pt 9): 2073-2083.).
  • the present inventors use a host cell into which a ⁇ NS expression vector and a ⁇ NS expression vector are introduced when producing an artificial recombinant virus of a mammalian orthoreovirus, and the production efficiency of the artificial recombinant virus is greatly improved. This was confirmed (see Example 13).
  • the present invention provides virus inclusion body formation in a virus-infected cell into a host cell into which a vector containing an expression cassette for each segmental RNA genome of the virus or a set of single-stranded RNA transcribed from the expression cassette is introduced.
  • Host cells that express FAST protein and / or capping enzyme may be used as host cells, and host cells that do not express FAST protein and capping enzyme may be used.
  • Examples of gene products involved in the formation of virus inclusion bodies in virus-infected cells include ⁇ NS encoded by the M3 gene of Orthoreovirus, ⁇ NS encoded by the S3 or S4 gene of Orthoreovirus, Orbivirus NS2 encoded by the genus segment 8 and the like can be mentioned, and these can be used alone or in combination.
  • the gene expression vector may be introduced into a host cell, and a vector containing an expression cassette of a segmented RNA genome encoding the gene
  • the amount of DNA may be increased from other segmented RNA genome expression vectors and introduced into host cells.
  • the DNA amount of the vector containing the segmented RNA genome expression cassette encoding the gene may be about 1.5 to about 10 times the amount of DNA of other segmented RNA genome expression vectors, and about 2 to about It may be 5 times.
  • the present invention provides an artificial recombinant rotavirus into which a mutation that suppresses at least one function selected from NSP1, NSP3, and NSP4 is introduced.
  • the present inventors have succeeded in producing an artificial recombinant rotavirus lacking 108 amino acids in the C-terminal region of rotavirus NSP1. Since the C-terminal region of NSP1 is known to play an important role in suppressing innate immunity (Barro, M., and Patton, JT (2005).
  • Rotavirus nonstructural protein 1 subverts innate immune response by inducing degradation of IFN regulatory factor 3.
  • This artificial recombinant rotavirus is an attenuated virus that retains replication ability and is considered useful as a vaccine. Furthermore, the present inventors produced an artificial recombinant rotavirus having a deletion mutation in NSP3 and an artificial recombinant rotavirus having an amino acid substitution mutation in NSP3, and the artificial recombinant rotavirus having a mutation in NSP1, NSP3 and NSP4, respectively. It has been confirmed that the virus has reduced growth compared to wild-type artificial recombinant rotavirus.
  • artificial recombinant rotaviruses having mutations in NSP3 and NSP4, respectively are attenuated viruses that retain replication ability and are considered useful as vaccines.
  • a vaccine containing an artificial recombinant rotavirus into which a mutation that suppresses at least one function selected from NSP11, NSP3 and NSP4 is introduced is also included in the present invention.
  • the present invention provides an artificial recombinant rotavirus that expresses a foreign gene.
  • the foreign gene is not particularly limited.
  • the produced artificial recombinant rotavirus can be used as a vaccine by using a foreign gene encoding a vaccine antigen.
  • vaccine antigens include oral or mucosal infections such as norovirus antigen, adenovirus antigen, hepatitis A antigen, sapovirus antigen, hand-foot-and-mouth disease virus antigen, enterovirus antigen, HIV antigen, salmonella antigen, Campylobacter antigen, Vibrio parahaemolyticus antigen Escherichia coli O157 antigen, cholera antigen, typhoid antigen, dysentery antigen and the like. These vaccine antigens may be epitope peptides.
  • a vaccine may be constituted by combining a plurality of artificial recombinant rotaviruses expressing different foreign vaccine antigens.
  • An artificial recombinant rotavirus that can be used as a multivalent vaccine for rotavirus by expressing one or more genes encoding heterologous or heterologous rotavirus antigen proteins (eg, VP4, VP7, etc.) as foreign genes can be provided.
  • the antigenic protein may be an epitope peptide.
  • the reporter gene can be appropriately selected from known reporter genes. For example, luciferase gene, GFP gene, RFP gene and the like can be suitably selected.
  • the present invention provides an artificial recombinant rotavirus that is a reassortant.
  • the rotavirus reassortant means a rotavirus having a new genotype structure in which segmental genome recombination has occurred between heterologous or heterologous rotaviruses.
  • the rear sortant is also called a gene reassortant.
  • Such a reassortant between rotaviruses of different species or strains is useful for the functional analysis of segmented genomes and extremely useful as an artificial recombinant rotavirus as a vaccine candidate.
  • reassortants containing VP4 gene segment genomes or VP7 gene segment genomes of rotaviruses with different serotypes can be used as a bivalent rotavirus vaccine.
  • a multivalent rotavirus vaccine can be comprised by mixing these two or more.
  • the present invention provides a method for promoting virus replication.
  • the viral replication promotion method of the present invention is characterized by infecting a host cell expressing FAST protein with a virus and culturing.
  • the virus to infect is not specifically limited, The virus which belongs to Reoviridae is preferable. Of these, mammalian orthoreovirus and rotavirus are preferred.
  • a host cell that expresses a FAST protein can be prepared by introducing a FAST protein expression vector into a cell that can be used as a host cell.
  • the FAST protein expression vector the FAST protein expression vector described in the production method of the present invention can be used.
  • the host cell and the method for introducing each vector into the host cell can also be performed in the same manner as the production method of the present invention.
  • the host cell that expresses the FAST protein may be a cell that transiently expresses the FAST protein, or may be a cell that continuously expresses the FAST protein.
  • the amount of nucleic acid used for transfection is preferably selected in accordance with the size of the culture plate used, the type of host cell, the number of seeded cells, and the like. For example, when Vero cells are used as host cells, seeded in a 6-well plate at 8 ⁇ 10 5 cells / well and transfection is performed the next day, the DNA amount of the FAST protein expression vector is preferably 0.002 to 0.02 ⁇ g. The amount of DNA used for transfection can be appropriately changed so as to be proportional to the number of seeded cells suitable for the plate to be used.
  • Host virus infection can be performed by adding a virus sample to the host cell culture medium.
  • the amount of virus infection is not particularly limited, but MOI of 0.1 to 0.0001 is preferable.
  • the culture period is not particularly limited, but is preferably 16 to 48 hours.
  • the virus replication promotion method of the present invention can promote virus proliferation (replication) by applying it to viruses with low proliferation (replication) ability. It is also useful when preparing a virus stock having a high virus titer.
  • Example 1 Improvement of mammalian orthoreovirus reverse genetics system
  • MMV mammalian orthoreovirus
  • RG reverse genetics
  • Virus A mammalian orthoreovirus type 1 Lang strain (hereinafter referred to as “MRV T1L strain”) was used.
  • MRV T1L strain can be purchased from ATCC (ATCC VR-230).
  • Table 1 shows the gene names and GenBank ACCESSIONs of the 10 segmental RNA genomes of the MRV T1L strain.
  • RT-PCR product (cDNA of each segmented RNA genome) was cloned into p3E5EGFP (Watanabe et al., (2004) Journal of virology, 78, 999-1005).
  • a T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 22) is adjacent to the 5 ′ side of the cDNA of each segmented RNA genome
  • a hepatitis D virus (HDV) ribozyme sequence (SEQ ID NO: 23) is adjacent to the 3 ′ side
  • a T7 terminator is downstream of the T7 promoter sequence.
  • a plasmid having an expression cassette in which the sequence (SEQ ID NO: 24) was arranged was obtained.
  • the resulting plasmid encodes each segmented RNA genome between the T7 promoter sequence and the HDV ribozyme sequence (between positions 30 and 31 of SEQ ID NO: 25) of the p3E5 plasmid (3076 bp, SEQ ID NO: 25) shown in FIG. It has a structure with cDNA inserted.
  • an expression cassette of M2 was inserted into the plasmid (pT7-L1T1L) into which L1 was cloned to prepare a bicistronic plasmid (pT7-L1-M2T1L).
  • an M2 expression cassette is inserted into the plasmid (pT7-L2 T1L) into which L2 has been cloned to produce a bicistronic plasmid (pT7-L2-M3T1L), and a plasmid (pT7-L3 T1L) into which L3 has been cloned.
  • FAST protein expression vector is a protein coding region DNA (SEQ ID NO: 26) of Nelson Bayreovirus p10 gene (see GenBank ACCESSION: AB908284) or avian reovirus p10 gene (GenBank ACCESSION: AF218358). ) Protein coding region DNA (SEQ ID NO: 27) is inserted into the pCAGGS plasmid (5699 bp, SEQ ID NO: 28, Matsuo et al., 2006, Biochem Biophys Res Commun 340 (1): 200-208) shown in FIG. Produced.
  • Each coding region DNA was synthesized by an artificial gene synthesis service (Eurofins Genomics) based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 27 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 28.
  • Each synthetic DNA was inserted into the BglII cleavage site of pCAGGS plasmid (between positions 1753 and 1754 of SEQ ID NO: 28), and pCAG-p10 (Nelson Bayreovirus p10 expression vector) and pCAG-ARVp10 (avian reovirus p10) Vector).
  • the capping enzyme expression vector is a protein coding region DNA of vaccinia virus D1R gene (GenBank ACCESSION: NC006998, positions 94948 to 96482, SEQ ID NO: 29) and protein coding region DNA of vaccinia virus D12L gene. (GenBank ACCESSION: NC006998, positions 107332 to 108195, SEQ ID NO: 30) was inserted into the pCAGGS plasmid. Each coding region DNA was synthesized by an artificial gene synthesis service (Eurofins Genomics) based on the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 29 and the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 30.
  • an artificial gene synthesis service Eurofins Genomics
  • Each synthetic DNA was inserted into the BglII cleavage site of pCAGGS plasmid (between positions 1753 and 1754 of SEQ ID NO: 28) to obtain pCAG-D1R (vaccinia virus mRNA capping enzyme large subunit expression vector) and pCAG-D12L (vaccinia).
  • pCAG-D1R vaccinia virus mRNA capping enzyme large subunit expression vector
  • pCAG-D12L vaccinia
  • BHK-T7 / P5 cells that stably express T7 RNA polymerase were used.
  • BHK-T7 / P5 cells are selected by transfecting BHK cells (Baby Hamster Kidney Cells) with pCAGGS plasmid inserted with DNA encoding T7 RNA polymerase downstream of the CAG promoter, and culturing them in a medium containing puromycin. Produced.
  • RNA genome expression vector (pT7-L1-M2T1L, pT7-L2-M3T1L, pT7-L3-S3T1L and pT7-S1-S2-S4-M1T1L) 0.4 each, FAST protein expression vector (pCAG-p10 or pCAG-ARVp10) 0.05 ⁇ g, 0.005 ⁇ g or 0.0005 ⁇ g, capping enzyme expression vectors (pCAG-D1R and pCAG-D12L) 0.2 ⁇ g each, BHK-T7 / P5 cells using transfection reagent (TransIT-LT1 (trade name), Mirus) Introduced.
  • TransIT-LT1 (trade name), Mirus) Introduced.
  • transfection reagent 2 ⁇ l was used per ⁇ g of DNA.
  • BHK-T7 / P5 cells were cultured in a DMEM medium containing 5% FBS, 100 units / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin in a 37 ° C., 5% CO 2 environment. Media and cells were harvested 48 hours after transfection. The collected medium and cells were freeze-thawed three times and subjected to plaque assay as a virus sample, and the virus titer was measured.
  • Plaque assay The plaque assay was performed according to the following procedure.
  • the virus titer of the cells co-introduced with the capping enzyme expression vectors increased about 100 times. Furthermore, the virus titer of cells co-introduced with both the FAST protein expression vector and the capping enzyme expression vector increased by about 1200 times. This result shows that the efficiency of artificial recombinant virus production is greatly improved by co-introducing at least one of the FAST protein expression vector and the capping enzyme expression vector and the segmented RNA genome expression vector into the host cell. It was.
  • pCAG-ARVp10 was used as the FAST protein expression vector.
  • present inventors have also described a segmental RNA genome expression vector (see Non-Patent Document 3) of MRVASTT3D strain and an FAST protein expression vector for an artificial recombinant virus of mammalian orthoreovirus type3 Dearing strain (MRV T3D strain).
  • an experiment was carried out in which at least one of the capping enzyme expression vector was co-introduced into the host cell, and it was confirmed that the production efficiency of the artificial recombinant virus was greatly improved as in the MRVMRT1L strain.
  • Nelson Bayreovirus expresses FAST protein by its own p10 gene.
  • Example 2 Development of rotavirus reverse genetics system
  • SA11 strain was used. The present inventors have determined and registered the base sequence of each of the 11 segmental RNA genomes of this virus strain. Table 2 shows the names and GenBank ACCESSIONs of 11 segmented RNA genomes of the simian rotavirus SA11 strain (hereinafter referred to as “SA11 strain”) used in this experiment.
  • Each segmented RNA genome expression cassette is flanked by a T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 22) on the 5 ′ side of each segmented RNA genome cDNA and a hepatitis D virus (HDV) ribozyme sequence (SEQ ID NO: 23) on the 3 ′ side. , Having a structure in which a T7 terminator sequence (SEQ ID NO: 24) is arranged downstream thereof.
  • the prepared plasmids were pT7-VP1SA11, pT7-VP2SA11, pT7-VP3SA11, pT7-VP4SA11, pT7-VP6SA11, pT7-VP7SA11, pT7-NSP1SA11, pT7-NSP2SA11, pT7-NSP7 -NSP4SA11 and pT7-NSP5SA11.
  • T at position 1053 of the NSP1 gene of pT7-NSP1SA11 was mutated to C
  • T at position 1059 was changed to C
  • a at position 409 of the NSP2 gene of pT7-NSP2SA11 SEQ ID NO: 18
  • T at position 418 is mutated to C
  • a at position 406 of the NSP3 gene of pT7-NSP3SA11 SEQ ID NO: 17
  • a at position 412 is mutated to T
  • the NSP4 gene of pT7-NSP4SA11 (sequence) In No.
  • the NSP1 gene (SEQ ID NO: 15) from positions 1049 to 1054 is the BamHI recognition sequence
  • the NSP2 gene (SEQ ID NO: 18) is from positions 413 to 418
  • the EcoRV recognition sequence
  • the NSP3 gene (SEQ ID NO: 17) is from position 408 to Marker mutation-introduced plasmids in which the 413th position is the EcoRI recognition sequence and the NSP4 gene (SEQ ID NO: 20) is the MluI recognition sequence from the 393th to 398th positions (pT7-NSP1SA11 / BamHI, pT7-NSP2SA11 / EcoRV, pT7-NSP3SA11 / EcoRI PT7-NSP4SA11 / MluI) was prepared (see FIG. 2).
  • FAST protein expression vector For the FAST protein expression vector, pCAG-p10 (Nelson Bayreovirus p10 expression vector) prepared in Example 1 was used.
  • the capping enzyme expression vectors include pCAG-D1R (vaccinia virus mRNA capping enzyme large subunit expression vector) and pCAG-D12L (vaccinia virus mRNA capping enzyme small subunit expression vector) prepared in Example 1. )It was used.
  • Host cells BHK-T7 / P5 cells that stably express the same T7 RNA polymerase as in Example 1 were used as host cells.
  • the wild-type artificial recombinant virus was produced using the 11 types of segmented RNA genome expression vectors produced in (2) above.
  • rsSA11 an artificial recombinant virus having one marker mutation
  • pT7-NSP4SA11 / MluI was used instead of pT7-NSP4SA11.
  • pT7-NSP1SA11 / BamHI is used instead of pT7-NSP1SA11
  • pT7-NSP2SA11 / EcoRV is used instead of pT7-NSP2SA11
  • pT7 PT7-NSP3SA11 / EcoRI was used instead of -NSP3SA11.
  • BHK-T7 / P5 cells were seeded at 8 ⁇ 10 5 cells / well in a 6-well culture plate. Eleven types of segmented RNA genome expression vectors 0.8 ⁇ g each, FAST protein expression vector (pCAG-p10) 0.015 ⁇ g, capping enzyme expression vectors (pCAG-D1R and pCAG-D12L) 0.8 ⁇ g each, transfection reagent (TransIT-LT1 ( The product was introduced into BHK-T7 / P5 cells using trade names) and Mirus). 2 ⁇ L of transfection reagent per 1 ⁇ g of DNA was used.
  • BHK-T7 / P5 cells were cultured in a DMEM medium containing 5% FBS, 100 units / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin in a 37 ° C., 5% CO 2 environment. Media and cells were harvested 48 hours after transfection. The collected medium and cells were freeze-thawed three times to prepare a cell lysate, and passaged to monkey MA104 cells (ATCC CRL-2378.1). Specifically, about 0.5 ml of the cell lysate was added to MA104 cells in a confluent state in a 12-well plate in the presence of trypsin 0.5 ⁇ g / ml. FBS-free DMEM medium was used for culture of MA104 cells.
  • NSP1 amplification product, NSP2 amplification product and NSP3 amplification product of wild-type SA11 and rsSA11-3 were treated with BamHI, EcoRV and EcoRI, respectively, and subjected to 1.2% agarose electrophoresis.
  • NSP46 amplification products of wild type SA11 and rsSA11 were treated with MluI and subjected to 1.2% agarose electrophoresis.
  • the virus obtained by this rotavirus reverse genetics system is an artificial recombinant rotavirus derived from a segmented RNA genome expression vector.
  • Example 3 Production of artificial recombinant rotavirus having deletion mutation
  • pT7-NSP1SA11 As a template, KOD-Plus-Mutagenesis Kit (trade name, Toyobo) and specific primer, position 1192 of NSP1 gene (SEQ ID NO: 15)
  • a plasmid having a mutant NSP1 gene (see FIG. 4) in which 299 bases at ⁇ 1490 position were deleted was prepared.
  • This plasmid (referred to as pT7-NSP1SA11 ⁇ C108) expresses the NSP1 protein lacking the 108 amino acids on the C-terminal side of NSP1.
  • Example 4 Production of luciferase-expressing rotavirus
  • luciferase gene-inserted NSP1 expression plasmid The Nluc gene, which is a luciferase gene derived from Oplophorus gracilirostris, was used as the luciferase gene.
  • the Nluc protein coding region from position 815 to position 1330 (SEQ ID NO: 31) of the pNL1.1 vector is amplified by PCR, and the amplified product is the NSP1 gene of pT7-NSP1SA11 (SEQ ID NO: SEQ ID NO: 15) and inserted between positions 128 and 129 to prepare a luciferase gene inserted NSP1 gene expression plasmid (referred to as pT7-NSP1SA11-Nluc) (see FIG. 6).
  • the cell lysate of MA104 cells was diluted 10-fold and added to confluent CV-1 cells in a 12-well plate to infect the virus. After incubation for 60 minutes, the medium was removed and the cells were overlaid with DMEM medium containing 0.8% agarose gel and 0.5 ⁇ g / ml trypsin. Plaque luminescence was confirmed 4 days after virus infection. That is, the substrate stock solution of Nano-Glo Luciferase Assay System (trade name, Promega) is diluted about 500 times with FBS-free DMEM medium, added to each well, and luminescence is obtained with an in vivo imaging system (IVIS Spectrum, manufactured by Xenogen) Was detected. Subsequently, the cells were fixed with 10% formaldehyde and stained with crystal violet to visualize the plaques.
  • IVIS Spectrum in vivo imaging system
  • Example 5 Production of artificial recombinant rotavirus using either FAST protein expression vector or capping enzyme expression vector] ⁇ Materials and methods>
  • Example 2 Eleven types of segmented RNA genome expression vectors of simian rotavirus SA11 strain prepared in (2),
  • Example 1 ⁇ Materials and methods> FAST protein prepared in (3)
  • Expression vectors pCAG-p10 and the capping enzyme expression vectors pCAG-D1R and pCAG-D12L prepared in (4) were introduced into BHK-T7 / P5 cells (see Example 1) in the combinations shown in Table 3 and artificially assembled. It was confirmed whether or not a replacement rotavirus could be produced.
  • BHK-T7 / P5 cells on the day before transfection, seed BHK-T7 / P5 cells at 4 ⁇ 10 5 cells / well in a 12-well culture plate and use the transfection reagent (TransIT-LT1 (trade name), Mirus). Each vector was introduced into BHK-T7 / P5 cells in the amount of DNA shown in Table 3.
  • MA104 cells (4 ⁇ 10 4 cells / well) were added and cultured for 3 days. The medium and cells were collected and freeze-thawed three times to prepare a cell lysate. About 0.5 ml of this cell lysate was added to MA104 cells in a confluent state in a 12-well plate in the presence of 0.5 ⁇ g / ml of trypsin and cultured for 7 days.
  • Example 6 Enhancement of replication ability of mammalian orthoreovirus (MRV) and rotavirus (RV) by FAST protein
  • Vero cells confluent in 24-well plates were transfected with FAST protein expression vector (pCAG-p10) or empty vector (pCAG empty) at 0, 0.25, 0.5, 1, and 2 ⁇ g, respectively.
  • TransIT-LT1 (trade name, Mirus) was used as a transfection reagent. After 2 hours, the medium was replaced with fresh DMEM containing 5% FBS, and infected with mammalian orthoreovirus (MRV T1L strain) or simian rotavirus (SA11 strain) at an MOI of 0.001.
  • Example 1 After adsorption at 37 ° C. for 1 hour, the cells were washed 6 times with PBS. MRV-infected cells were cultured in 5% FBS-containing DMEM, and RV-infected cells were cultured in FBS-free DMEM. The medium and cells were collected 16 hours after infection, and a cell lysate prepared by repeating freeze-thaw three times was subjected to a plaque assay. The plaque assay was performed in the same manner as in Example 1.
  • FIG. (A) is the MRV result and (B) is the RV result.
  • MRV when pCAG-p10 was transfected at 0.5 ⁇ g or more, the replication ability was enhanced as compared with the empty vector (mock).
  • RV when 1 ⁇ g or more of pCAG-p10 was transfected, the replication ability was enhanced compared to the empty vector (mock). From these results, it was shown that the virus replication ability is improved by using a cell expressing FAST protein as a host cell.
  • Example 7 Production of simian rotavirus and monoria sortan rotavirus of simian rotavirus
  • plasmid having human rotavirus NSP4 gene A plasmid containing cDNA of NSP4 segmented RNA genome (GenBank ACCESSION: AB022772, SEQ ID NO: 32) of KU strain was prepared. RT-PCR was carried out using double-stranded RNA extracted from the virus as a template and specific primers based on the nucleotide sequence of the human NSP4 segment RNA genome. The obtained RT-PCR product (NSP4 segmented RNA genome cDNA) is located between the T7 promoter sequence and the HDV ribozyme sequence of the p3E5 plasmid (3076 bp, SEQ ID NO: 25) shown in FIG.
  • each segmented RNA genome expression cassette is flanked by a T7 promoter sequence (SEQ ID NO: 22) on the 5 ′ side of each segmented RNA genome cDNA and a hepatitis D virus (HDV) ribozyme sequence (SEQ ID NO: 23) on the 3 ′ side. , Having a structure in which a T7 terminator sequence (SEQ ID NO: 24) is arranged downstream thereof.
  • the prepared plasmid is referred to as pT7-NSP4KU.
  • NSP4 monoria sortan rotavirus (SA11 / KUNSP4) is a pT7-NSP4SA11 in the 11 types of segmented RNA genome expression vectors prepared in (2) of Example 2. Instead of pT7-NSP4KU, the same method as in Example 2 was used. Media and cells were collected from the wells of MA104 cells in which cytopathicity was observed, freeze-thawed 3 times to prepare cell lysate, and extracted viral genomic RNA from SA11 / KUNSP4. It was subjected to SDS-PAGE together with viral genomic RNA extracted from the strain.
  • Example 8 Screening test for anti-rotavirus drug using luciferase-expressing rotavirus
  • ribavirin Smee, DF, Sidwell, RW, Clark, SM, Barnett, BB, and Spendlove, RS (1982)
  • Inhibition of rotaviruses by selected antiviral substances mechanisms of viral inhibition and in vivo activity. Antimicrobial agents and chemotherapy 21, 66-73.
  • CV-1 cells were seeded at 1 ⁇ 10 5 cells / well in a 96-well culture plate.
  • CV-1 cells were infected with the wild-type SA11 strain and the luciferase-expressing artificial recombinant rotavirus produced in Example 4 at an MOI of 0.001. After adsorption at 37 ° C for 1 hour, the culture supernatant is removed, and ribavirin (Sigma Aldrich) containing 0, 1, 5, 10, 50, 100, or 200 ⁇ M DMEM (without FBS, 0.5 ⁇ g / ml trypsin) ), And cultured at 37 ° C. for 14 hours.
  • ribavirin Sigma Aldrich
  • Nano-Glo Luciferase Assay System (trade name, Promega) was added to the medium, and luminescence was detected with an in vivo imaging system (IVIS Spectrum, manufactured by Xenogen).
  • Example 9 Improvement of rotavirus reverse genetics system (1)
  • the production efficiency of the artificial recombinant rotavirus was examined using an overexpression system of the NSP2 gene product and the NSP5 gene product.
  • NSP2 expression vector and NSP5 expression vector are protein coding region DNA of NSP2 gene (GenBank ACCESSION: LC178571, SEQ ID NO: 18) of simian rotavirus SA11 strain and protein coding region DNA of NSP5 gene (GenBank ACCESSION: LC178574, SEQ ID NO: 21).
  • GenBank ACCESSION: LC178571, SEQ ID NO: 18 protein coding region DNA of NSP5 gene
  • GenBank ACCESSION: LC178574, SEQ ID NO: 21 was inserted into the pCAGGS plasmid shown in FIG. 10, respectively.
  • Each coding region DNA was synthesized by an artificial gene synthesis service (Eurofins Genomics).
  • BHK-T7 / P5 cells that stably express T7 RNA polymerase were used as host cells.
  • BHK-T7 / P5 cells can be selected by transfecting BHK cells (Baby Hamster Kidney Cells) with pCAGGS plasmid inserted with T7 RNA polymerase-encoding DNA downstream of the CAG promoter and culturing them in antibiotic-containing media. Produced.
  • RNA genome expression vectors T7-VP1SA11, pT7-VP2SA11, pT7-VP3SA11, pT7-VP4SA11, pT7-VP6SA11, pT7-VP7SA11, pT7-NSP1SA11, pT7-NSP2SA11, pT7-NSP3SA11, pT7-NSP4) , FAST protein expression vector (pCAG-FAST p10), capping enzyme expression vector (pCAG-D1R and pCAG-D12L), NSP2 expression vector (pCAG-NSP2) and NSP5 expression vector (pCAG-NSP5), transfection reagent (TransIT -LT1 (trade name) and Mirus) were introduced into BHK-T7 / P5 cells with the DNA amounts shown in Table 4.
  • BHK-T7 / P5 cells were cultured in a DMEM medium containing 5% FBS, 100 units / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin in a 37 ° C., 5% CO 2 environment. Media and cells were harvested 48 hours after transfection. The collected medium and cells were freeze-thawed three times to prepare a cell lysate, and passaged to monkey MA104 cells (ATCC CRL-2378.1). Specifically, about 0.5 ml of the cell lysate was added to MA104 cells in a confluent state in a 12-well plate in the presence of trypsin 0.5 ⁇ g / ml. FBS-free DMEM medium was used for culture of MA104 cells. The cells were cultured for 7 days after the passage, and it was judged that an artificial recombinant rotavirus was produced when cell degeneration was observed during that time.
  • Example 10 Improvement of rotavirus reverse genetics system (2)
  • RNA genomic expression vector, NSP2 expression vector, NSP5 expression vector, transfection reagent and host cell as in Example 9 were used.
  • BHK-T7 / P5 cells were seeded in 12-well culture plates (4 ⁇ 10 5 cells / well). Each vector was introduced into BHK-T7 / P5 cells in the amount of DNA described in Table 6. 2 ⁇ L of transfection reagent per 1 ⁇ g of DNA was used.
  • Culture of BHK-T7 / P5 cells and passage to monkey MA104 cells were performed in the same manner as in Example 9. The cells were cultured for 7 days after the passage, and it was judged that an artificial recombinant rotavirus was produced when cell degeneration was observed during that time.
  • an artificial recombinant rotavirus could be produced.
  • an NSP2 expression vector and an NSP5 expression vector may be introduced separately as in the X group, and NSP2 and NSP5 are encoded as in the Y group. It was shown that the amount of DNA introduced into the segmented RNA genome expression vector may be increased.
  • Group Y demonstrates that an artificial recombinant rotavirus can be produced if only rotavirus eleven segment RNA genome expression vectors are introduced into a host cell and cultured.
  • Example 11 Production of artificial recombinant attenuated virus by introducing mutation into NSP4 protein
  • pT7-NSP4SA11 (see Example 2) as a template, NOD4 gene (SEQ ID NO: SEQ ID NO :) using KOD-Plus-Mutagenesis Kit (trade name, Toyobo) and specific primers In 20), a plasmid having a mutant NSP4 gene in which cytosine (C) at position 55 was replaced with glycine (G) was prepared.
  • This plasmid (referred to as pT7-NSP4SA11-L5S) expresses a mutant NSP4 protein in which the fifth leucine (L) of the NSP4 protein is replaced with serine (S).
  • the present inventors have also identified the wild type rotavirus for the NSP1 deletion mutant rotavirus (rsSA11 / NSP1 ⁇ C108) prepared in Example 3 and the NSP3 deletion mutant rotavirus separately prepared. It is confirmed that the growth has decreased. Therefore, an artificial recombinant rotavirus produced by adding an artificial mutation to NSP1 or NSP3 is also considered to be an excellent vaccine candidate as an attenuated virus having replication ability.
  • Example 12 Production of artificial recombinant rotavirus that stably expresses green fluorescent protein
  • ZsG Green Fluorescent Protein Gene Insertion NSP1 Expression Plasmid ZsGreen (hereinafter referred to as ZsG) gene was used as the green fluorescent protein gene.
  • the ZsG protein coding region (SEQ ID NO: 33) of the pZsGreen vector (Clontech) is amplified by PCR, and the amplified product is inserted between positions 111 and 112 of the NSP1 gene (SEQ ID NO: 15) of pT7-NSP1SA11.
  • An inserted NSP1 gene expression plasmid (referred to as pT7-NSP1SA11-ZsG-Full) was prepared.
  • plasmids lacking positions 134-465, 134-855 or 134-1243 of the NSP1 gene based on the pT7-NSP1SA11-ZsG-Full plasmid were prepared (see FIG. 14).
  • ZsG-expressing rotavirus is a pT7-NSP1SA11-instead of pT7-NSP1SA11 in the 11 types of segmented RNA genome expression vectors prepared in (2) of Example 2. It was produced in the same manner as in Example 2 except that ZsG-Full, pT7-NSP1SA11-ZsG- ⁇ 332, pT7-NSP1SA11-ZsG- ⁇ 722 or pT7-NSP1SA11-ZsG- ⁇ 1110 was used.
  • the viruses prepared using the respective ZsG expression plasmids are referred to as rsSA11 / ZsG-Full, rsSA11 / ZsG- ⁇ 332, rsSA11 / ZsG- ⁇ 722, and rsSA11 / ZsG- ⁇ 1110, respectively.
  • Each of the prepared viruses was infected with MA104 cells, and the presence or absence of green fluorescence (ZsG expression) was confirmed under a fluorescence microscope.
  • each virus P1 stock was infected with confluent MA104 cells in a 24-well plate and cultured in FBS-free DMEM supplemented with trypsin 0.5 ⁇ g / ml for 72 hours to obtain a P2 stock.
  • virus infection experiments were repeated, and virus stocks up to P10 were obtained.
  • MA104 cells confluent in 12-well plates were each infected with P1, P5 and P10 stocks of each virus at MOI 0.01 and cultured in DMEM without 5% FBS. Sixteen hours after infection, the cells were fixed with 10% formalin for 24 hours and subjected to immunostaining for viral antigens.
  • the cells were washed twice with PBS, permeabilized with 0.1% Triton-X-100, and reacted with rabbit anti-rotavirus NSP4 antibody and anti-rabbit IgG antibody-Alexa594 conjugate to detect the viral antigen. Tried. The cells after immunostaining were observed with a fluorescence microscope, and the expression rate of ZsG in virus antigen-positive cells was measured.
  • Example 13 Improvement of mammalian orthoreovirus reverse genetics system
  • ⁇ Materials and methods Preparation of ⁇ NS expression vector and ⁇ NS expression vector
  • the ⁇ NS expression vector and ⁇ NS expression vector are protein coding regions of the ⁇ NS gene (M3 gene in Table 1, GenBank ACCESSION: AF174382, SEQ ID NO: 6) of the mammalian orthoreovirus T1L strain.
  • the DNA and ⁇ NS gene (S3 gene in Table 1, GenBank ACCESSION: M14325, SEQ ID NO: 9) protein coding region DNAs were respectively inserted into the pCAGPM plasmid shown in FIG. Each coding region DNA was synthesized by an artificial gene synthesis service (Eurofins Genomics).
  • Each synthetic DNA is inserted into the BglII cleavage site of pCAGPM plasmid (between positions 1753 and 1754 of SEQ ID NO: 28), pCAG- ⁇ NST1L (mammalian orthoreovirus ⁇ NS expression vector) and pCAG- ⁇ NST1L (mammalian orthoreovirus) (sigma NS expression vector) was obtained.
  • transfection reagent 2 ⁇ g per 1 ⁇ g of DNA was used.
  • BHK-T7 / P5 cells were cultured in a DMEM medium containing 5% FBS, 100 units / ml penicillin and 100 ⁇ g / ml streptomycin in a 37 ° C., 5% CO 2 environment. Media and cells were harvested 48 hours after transfection. The collected medium and cells were freeze-thawed three times and used as a virus sample in a plaque assay (see Example 1) to measure virus titer.
  • ⁇ Result> Viral titers of cells into which only four segmental RNA genome expression vectors (pT7-L1-M2T1L, pT7-L2-M3T1L, pT7-L3-S3T1L and pT7-S1-S2-S4-M1T1L) of MRV T1L strain have been introduced
  • the virus titer of the cells co-introduced with the ⁇ NS expression vector and the ⁇ NS expression vector increased about 8.2 times.
  • the virus titer of the cells co-introduced with only the ⁇ NS expression vector increased about 6.4 times. From this result, it was shown that the co-introduction of ⁇ NS expression vector, ⁇ NS expression vector and ⁇ NS expression vector, and segmented RNA genome expression vector into host cells greatly improves the efficiency of artificial recombinant virus production. .

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Abstract

（１）ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターおよび／またはキャッピング酵素発現ベクターを宿主細胞に導入する工程、（２）ウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された一本鎖ＲＮＡのセットを宿主細胞に導入する工程、および（３）宿主細胞を培養する工程を含むレオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法を提供する。本発明は、従来法よりウイルス作製効率が向上したレオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法であり、ヘルパーウイルスを使用せずに人工組換えロタウイルスを作製することができる。

Description

人工組換えロタウイルスの作製方法
　本発明は、レオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法に関するものであり、特に人工組換えロタウイルスの作製方法に関するものである。
　レオウイルス科に属するロタウイルスは、乳幼児の下痢症の原因ウイルスとして知られている。ロタウイルスが感染、発症しやすいのは生後６か月から２歳の乳幼児であり、５歳までにほぼ１００％が感染する。ロタウイルスに対するワクチンは実用化されており、その予防効果も確認されている。しかし一方で、より安価で防御効果の高い次世代ワクチンの開発研究が進められている。
　人工的にウイルスを作製できるリバースジェネティクス（ＲＧ）系は多くのＲＮＡウイルスで確立されており、ウイルス学的基礎研究、およびウイルスベクターやワクチンベクター開発等の応用研究の発展に大いに貢献している。しかし、１０～１２本の分節二本鎖ＲＮＡゲノムを有するレオウイルス科におけるＲＧ系は、その分節ゲノムの複雑さから、他のＲＮＡウイルスと比較して開発が遅れている。
　レオウイルス科において、オルビレオウイルス属ブルータングウイルス、アフリカ馬疫ウイルスでは、ウイルスＲＮＡを細胞に導入することで組換えウイルスを作製できるＲＮＡベースのＲＧ系が開発されている（非特許文献１，２）。オルソレオウイルス属哺乳類オルソレオウイルスでは、完全なｃＤＮＡからなるＤＮＡベースのＲＧ系が開発されている（非特許文献３）。ロタウイルス属ロタウイルスでは、ヘルパーウイルスを用いた部分的なＤＮＡベースのＲＧ系が報告されている（非特許文献４，５）。しかし、ヘルパーウイルスを用いるＲＧ系は、ヘルパーウイルスから目的のウイルスを選別する強力な方法が必要であること、限られた分節遺伝子（ＶＰ４遺伝子、ＮＳＰ２遺伝子）にしか変異を導入できないこと、作製効率が低いことが問題である。そこで、ヘルパーウイルスを必要としない、ｃＤＮＡまたはＲＮＡのみの導入によりロタウイルスを作製できる完全なＲＧ系の開発が待ち望まれている。
Boyce, M., Celma, C.C., and Roy, P., Development of reverse genetics systems for bluetongue virus: recovery of infectious virus from synthetic RNA transcripts, J Virol 82:8339-8348, 2008. Kaname Y, Celma CC, Kanai Y, Roy P., Recovery of African horse sickness virus from synthetic RNA, J Gen Virol 94:2259-2265, 2013. Kobayashi, T, Antar, AAR, Boehme, KW, Danthi, P, Eby, EA, Guglielmi, KM, Holm, GH, Johnson, EM, Maginnis, MS, Naik, S, Skelton, WB, Wetzel, JD, Wilson, GJ, Chappell, JD, and Dermody, TS, A plasmid-based reverse genetics system for animal double-stranded RNA viruses. Cell Host Microbe 1:147-157, 2007. Komoto, S, Sasaki, J, and Taniguchi, K, Reverse genetics system for introduction of site-specific mutations into the double-stranded RNA genome of infectious rotavirus. Proc Natl Acad Sci USA 103:4646- 4651, 2006. Trask SD, Taraporewala ZE, Boehme TS, Dermody TS, Patton JT, Dual selection mechanisms drive efficient single-gene reverse genetics for rotavirus.　Proc Natl Acad Sci USA 107:18652-18657 2010.
　レオウイルス科に属するウイルスのリバースジェネティクス系を改良し、従来法よりウイルス作製効率が向上したレオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法を提供することを課題とする。また、ヘルパーウイルスを必要としない人工組換えロタウイルスの作製方法を提供することを課題とする。さらに、ウイルス分節ゲノムに変異を導入したワクチン候補の人工組換えロタウイルスを提供することを課題とする。
　本発明は、上記の課題を解決するために以下の各発明を包含する。
［１］レオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法であって、
（１）ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターおよび／またはキャッピング酵素発現ベクターを宿主細胞に導入する工程、
（２）ウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された一本鎖ＲＮＡのセットを宿主細胞に導入する工程、および
（３）宿主細胞を培養する工程
を含むことを特徴とする作製方法。
［２］人工組換えウイルスが、分節ＲＮＡゲノムの少なくとも１つに変異が導入されていること、および／または、分節ＲＮＡゲノムの少なくとも１つに外来遺伝子が組み込まれていることを特徴とする前記［１］に記載の作製方法。
［３］ＦＡＳＴタンパク質が、ネルソンベイレオウイルスのｐ１０、トリレオウイルスのｐ１０、ブルームウイルスのｐ１３、爬虫類レオウイルスのｐ１４、ヒヒレオウイルスのｐ１５、ソウギョレオウイルスのｐ１６およびタイセイヨウサケレオウイルスのｐ２２から選択される少なくとも１種である前記［１］または［２］に記載の作製方法。
［４］キャッピング酵素が、宿主細胞の細胞質内で複製するＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスのキャッピング酵素である前記［１］～［３］のいずれかに記載の作製方法。
［４－１］キャッピング酵素が、ポックスウイルス科に属するウイルスのキャッピング酵素である前記［１］～［３］のいずれかに記載の作製方法。
［５］分節ＲＮＡゲノムの発現カセットが、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ウイルス分節ＲＮＡゲノムをコードするＤＮＡおよび自己切断作用を有するリボザイムをコードするＤＮＡを含むことを特徴とする前記［１］～［４］のいずれかに記載の作製方法。
［６］ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＴ７プロモーターであり、宿主細胞が組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現細胞であることを特徴とする前記［５］に記載の作製方法。
［７］リボザイムが、Ｄ型肝炎ウイルスリボザイムである前記［５］または［６］に記載の作製方法。
［８］宿主細胞とウイルス高感受性細胞を共培養することを特徴とする前記［１］～［７］のいずれかに記載の作製方法。
［９］レオウイルス科に属する人工組換えウイルスが、人工組換えロタウイルスである前記［１］～［８］のいずれかに記載の作製方法。
［１０］宿主細胞にロタウイルスＮＳＰ２遺伝子産物および／またはロタウイルスＮＳＰ５遺伝子産物を過剰発現させることを特徴とする前記［９］に記載の作製方法。
［１１］人工組換えロタウイルスが、外来遺伝子を発現する人工組換えロタウイルスであり、ＮＳＰ１をコードする分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクターに代えて、ＮＳＰ１をコードする分節ＲＮＡゲノムの発現カセットのＮＳＰ１遺伝子内に外来遺伝子が挿入され、かつ、ＮＳＰ１遺伝子の１００～１５５０塩基が欠失している発現カセットを含むベクターを用いることを特徴とする前記［９］または［１０］に記載の作製方法。
［１２］ＦＡＳＴタンパク質を発現する宿主細胞にウイルスを感染させて培養することを特徴とするウイルス複製促進方法。
［１３］ＦＡＳＴタンパク質が、ネルソンベイレオウイルスのｐ１０、トリレオウイルスのｐ１０、ブルームウイルスのｐ１３、爬虫類レオウイルスのｐ１４、ヒヒレオウイルスのｐ１５、ソウギョレオウイルスのｐ１６およびタイセイヨウサケレオウイルスのｐ２２から選択される少なくとも１種である前記［１２］に記載の方法。
［１４］ＮＳＰ１、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４から選択される少なくとも１つの機能を抑制する変異が導入されていることを特徴とする人工組換えロタウイルス。
［１５］外来遺伝子を発現することを特徴とする人工組換えロタウイルス。
［１６］リアソータントであることを特徴とする人工組換えロタウイルス。
［１７］前記［１４］～［１６］のいずれかに記載の人工組換えロタウイルスを含有するワクチン。
［１８］ＦＡＳＴタンパク質およびキャッピング酵素を発現しない宿主細胞に、ロタウイルスの１１個の分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された１１個の一本鎖ＲＮＡのセットを導入し、培養することを特徴とする人工組換えロタウイルスの作製方法。
［１９］宿主細胞にロタウイルスＮＳＰ２遺伝子産物および／またはロタウイルスＮＳＰ５遺伝子産物を過剰発現させて培養することを特徴とする前記［１８］に記載の作製方法。
［２０］レオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法であって、ウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された一本鎖ＲＮＡのセットが導入された宿主細胞に、ウイルス感染細胞内のウイルス封入体形成に関与する遺伝子産物を過剰発現させて培養することを特徴とする作製方法。
　本発明により、従来のリバースジェネティクス系より人工組換えウイルスの作製効率が向上したレオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法を提供することができる。また、従来実現していなかったヘルパーウイルスを必要としない人工組換えロタウイルスの作製方法を提供することができる。さらに、ウイルス分節ゲノムに変異を導入したワクチン候補の人工組換えロタウイルスを提供することができる。
哺乳類オルソレオウイルスのリバースジェネティクス系において、ＦＡＳＴタンパク質および／またはキャッピング酵素を宿主細胞で共発現させることによる人工組換えウイルス作製効率の向上を検討した結果を示す図である。 人工組換えロタウイルスの作製に用いたマーカー変異導入プラスミドの変異導入部位を示す図である。 ロタウイルスのリバースジェネティクス系で作製されたウイルスが、マーカー変異を有することを確認した結果を示す図である。 野生型ＮＳＰ１遺伝子および欠失変異を有するＮＳＰ１遺伝子の構造を示す図である。 野生型人工組換えウイルスとＮＳＰ１遺伝子に欠失変異を有する人工組換えウイルスの各分節ゲノムＲＮＡをＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した結果を示す図である。 野生型ＮＳＰ１遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子を挿入したＮＳＰ１遺伝子の構造を示す図である。 ルシフェラーゼ発現人工組換えロタウイルスのプラークアッセイの結果（左）と、プラークの発光を確認した結果（右）を示す図である。 哺乳類オルソレオウイルス（ＭＲＶ）またはロタウイルス（ＲＶ）の複製能が、ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターを導入した宿主細胞を用いることにより増強されることを確認した結果を示す図である。 ｐ３Ｅ５プラスミドの構造を示す図である。 ｐＣＡＧＧＳプラスミドの構造を示す図である。 ヒトロタウイルスのＮＳＰ４分節ＲＮＡゲノムを有する人工組換えサルロタウイルスの各分節ゲノムＲＮＡ、野生型ヒトロタウイルスの各分節ゲノムＲＮＡ、および野生型サルロタウイルスの各分節ゲノムＲＮＡをＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した結果を示す図である。 ルシフェラーゼ発現人工組換えロタウイルスを用いて、抗ロタウイルス薬リバビリンによるウイルス増殖抑制効果を発光強度で評価した結果を示す図である。 ＮＰＳ４変異を有する人工組換えロタウイルスと野生型人工組換えロタウイルスの複製能を比較した結果を示す図である。 ＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子を挿入したＮＳＰ１遺伝子の構造を示す図であり、１段目は塩基の欠失がないＮＳＰ１遺伝子、２～４段目は一部の塩基を欠失させたＮＳＰ１遺伝子を用いている。 図１４に示した４種類のＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子挿入ＮＳＰ１遺伝子を含む分節ゲノム発現ベクターを用いてＺｓＧｒｅｅｎ発現人工組換えロタウイルスを作製し、ウイルス継代後のＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子の保持率（ＺｓＧｒｅｅｎ発現率）を確認した結果を示す図である。
〔人工組換えウイルスの作製方法〕
　本発明は、レオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法（以下、「本発明の作製方法」と記す）を提供する。本発明の作製方法は、以下の工程（１）、（２）および（３）を含むものであればよい。
（１）ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターおよび／またはキャッピング酵素発現ベクターを宿主細胞に導入する工程
（２）ウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された一本鎖ＲＮＡのセットを宿主細胞に導入する工程
（３）宿主細胞を培養する工程
　レオウイルス科に属するウイルスは、１０～１２本に分節した直鎖二本鎖ＲＮＡをゲノムに持つウイルスであり、そのビリオンは直径６０～８０ｎｍの正二十面体構造を示す。レオウイルス科に属するウイルスには、哺乳類オルソレオウイルス、ネルソンベイレオウイルス、トリレオウイルス等のオルソレオウイルス属（Genus Orthoreovirus）、アフリカ馬疫ウイルス、ブルータングウイルス等のオルビウイルス属（Genus Orbivirus）、ロタウイルス等のロタウイルス属（Genus Rotavirus）、コロラドダニ熱ウイルス等のコルチウイルス属（Genus Coltivirus）、アクアレオウイルスＡ等のアクアレオウイルス属（Genus Aquareovirus）、細胞質多角体病ウイルス等のサイポウイルス属（Genus Cypovirus）、イネ南方黒すじ萎縮病ウイルス等のフィジウイルス属（Genus Fijivirus）、イネ萎縮病ウイルス等のフィトレオウイルス属（Genus Phytoreovirus）およびイネラギッドスタントウイルス（Rice ragged stunt virus）等のオリザウイルス属（Genus Oryzavirus）が含まれる。なかでも、本発明の作製方法は、哺乳類オルソレオウイルスおよびロタウイルスの人工組換えウイルスに適用することが好ましい。
　ウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットは、ウイルス分節ゲノムである二本鎖ＲＮＡの鋳型となる一本鎖プラス鎖ＲＮＡ（ウイルスｍＲＮＡ）を発現可能な構造を有するものであれば特に限定されない。好ましい発現カセットとしては、例えば上流から順にＲＮＡポリメラーゼプロモーター、分節ＲＮＡゲノムをコードするＤＮＡ（分節ＲＮＡゲノムのｃＤＮＡ）および自己切断作用を有するリボザイムをコードするＤＮＡから構成される発現カセットが挙げられる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＴ７プロモーターの場合は、Ｔ７ターミネーター配列が発現カセットに含まれる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがポリメラーゼＩ由来プロモーターの場合は、そのプロモーターに対応するターミネーター配列が発現カセットに含まれる。ポリメラーゼＩＩ由来のプロモーターの場合は、ポリアデニレーションシグナル配列が発現カセットに含まれる。
　ウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットは、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターと分節ＲＮＡゲノムをコードするＤＮＡ（分節ＲＮＡゲノムのｃＤＮＡ）のみから構成されていてもよい。このような発現カセットを含むベクターにおいて、分節ＲＮＡゲノムをコードするＤＮＡの３’末端を、例えば制限酵素で切断することにより、直鎖状ベクターの切断パターンがウイルスゲノム３’末端のみをコードし、ベクター由来の配列が転写されない構造を有する状態で使用することができる。
　分節ＲＮＡゲノムのｃＤＮＡは、ウイルスからＲＮＡを抽出し、得られた二本鎖ＲＮＡを鋳型とするＲＴ－ＰＣＲにより取得することができる。プライマーセットは、目的の分節ＲＮＡゲノムの塩基配列に基づいて特異的なプライマーセットを設計することができる。ウイルスの分節ＲＮＡゲノムの塩基配列は、公知のデータベース（GenBank等）から取得することができる。また、市販のシークエンサーを用いて公知の方法により、ウイルスの分節ＲＮＡゲノムの塩基配列を決定してもよい。
　ＲＮＡポリメラーゼプロモーターとしては、Ｔ７プロモーター、ポリメラーゼＩ由来プロモーター、ポリメラーゼＩＩ由来のＣＡＧプロモーター、ＣＭＶプロモーターなどを好適に用いることができる。好ましくはＴ７プロモーターである。
　自己切断作用を有するリボザイムは、公知の自己切断作用を有するリボザイムを適宜選択して用いることができる。自己切断作用を有するリボザイムとしては、ハンマーヘッド型リボザイム、ヘアピン型リボザイム、リボヌクレアーゼＰのＭ１サブユニット、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）リボザイム、Ｖａｒｋｕｄ ｓａｔｅｌｌｉｔｅリボザイムなどが挙げられる。好ましくはＨＤＶリボザイムである。
　分節ＲＮＡゲノム発現カセットを挿入するベクターとしては、公知のクローニングベクター、哺乳動物細胞用発現ベクター、各種ウイルスベクター（ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等）などを好適に用いることができる。
　１つのベクターに、１つの分節ＲＮＡゲノム発現カセットが含まれている場合、ウイルスの分節数と同数のベクターが１セットになる。２つ以上の分節ＲＮＡゲノム発現カセットが１つのベクターに含まれているポリシストロニックベクターを使用してもよい。１つのベクターに含まれる分節ＲＮＡゲノム発現カセットの数は限定されず、１つのベクターに全分節の発現カセットが含まれてもよい。人工組換えウイルスの作製効率の観点から、ベクター数は少ない方が好ましい。
　宿主細胞に導入するための一本鎖ＲＮＡはプラス鎖ＲＮＡであり、分節ＲＮＡゲノムの発現カセットからインビトロ転写することにより取得することができる。インビトロ転写は、例えば市販の試薬（例えば、in vitro Transcription T7 Kit（タカラバイオ）等）を用いて行うことができる。使用するＲＮＡはインビトロ転写後、キャップアナログ（例えば、Ribo m7G Cap Analog（プロメガ）等）を用いてキャッピングすることが望ましい。一本鎖ＲＮＡのセットは、ウイルスの分節数と同数である。
　ＦＡＳＴ（fusion-associated small transmembrane）タンパク質としては、レオウイルス科オルソレオウイルス属の膜融合性（Fusogenic）レオウイルスグループに属する既知のウイルスおよび今後新規に分離されるウイルスのＦＡＳＴタンパク質を使用することができる。具体的には、例えばネルソンベイレオウイルス（Nelson Bay reovirus）のｐ１０（GenBank ACCESSION: BAJ52806）、トリレオウイルス（Avian reovirus）のｐ１０（GenBank ACCESSION: AGO32037）、ブルームウイルス（Broome reovirus）のｐ１３（GenBank ACCESSION: YP_003717780）、爬虫類レオウイルス（Reptilian reovirus）のｐ１４（GenBank ACCESSION: AAP03134）、ヒヒレオウイルス（Baboon reovirus）のｐ１５（GenBank ACCESSION: YP_004769555）、ソウギョレオウイルス（Grass carp reovirus）のｐ１６（GenBank ACCESSION: ABV01045）、タイセイヨウサケレオウイルス（Atlantic salmon reovirus）のｐ２２（GenBank ACCESSION: ACN38055）などが挙げられる。好ましくはネルソンベイレオウイルスのｐ１０またはトリレオウイルスのｐ１０である。
　ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターは、例えばｐＣＡＧＧＳプラスミド（図１０参照）のような公知の哺乳動物細胞用発現ベクターや公知のウイルスベクターに、上記ＦＡＳＴタンパク質をコードする遺伝子を挿入することにより、作製することができる。ＦＡＳＴタンパク質をコードする遺伝子の塩基配列は、ウイルスゲノムの塩基配列情報から取得することができる。ウイルスゲノムの塩基配列情報は公知のデータベース（GenBank等）に登録されているものを使用することができる。ネルソンベイレオウイルスのｐ１０をコードする遺伝子の塩基配列として、例えば配列番号２６の塩基配列を使用することができ、トリレオウイルス（Avian reovirus）のｐ１０をコードする遺伝子の塩基配列として、例えば配列番号２７の塩基配列を使用することができる。
　ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターに代えて、ＦＡＳＴタンパク質をコードする一本鎖プラス鎖ＲＮＡを用いることができる。ＦＡＳＴタンパク質をコードする一本鎖プラス鎖ＲＮＡは、例えばＦＡＳＴタンパク質発現ベクターからインビトロ転写することにより取得することができる。インビトロ転写は、例えば市販の試薬（例えば、in vitro Transcription T7 Kit（タカラバイオ）等）を用いて行うことができる。使用するＲＮＡはインビトロ転写後、キャップアナログ（例えば、Ribo m7G Cap Analog（プロメガ）等）を用いてキャッピングすることが望ましい。
　キャッピング酵素としては、細胞質でｍＲＮＡのキャッピング反応を触媒できる酵素であれば特に限定されず、宿主細胞の細胞質内で複製するＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスのキャッピング酵素を好適に用いることができる。宿主細胞の細胞質内で複製するＤＮＡウイルスのキャッピング酵素としては、例えば、ポックスウイルス科に属するウイルスがコードするキャッピング酵素、アスファウイルス科に属するウイルスがコードするキャッピング酵素などが挙げられる。宿主細胞の細胞質内で複製するＲＮＡウイルスのキャッピング酵素としては、トガウイルス科のウイルスのｎｓｐ１タンパク質などが挙げられる。好ましくは、ポックスウイルス科またはアスファウイルス科に属するウイルスがコードするキャッピング酵素である。ポックスウイルス科のウイルスがコードするキャッピング酵素としては、ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を好適に用いることができる。アスファウイルス科に属するウイルスがコードするキャッピング酵素としてはアフリカ豚コレラウイルスのＮＰ８６８Ｒを好適に用いることができる。ワクシニアウイルスのキャッピング酵素を用いる場合、キャッピング酵素ラージサブユニット（GenBank ACCESSION: YP_232988）をコードする遺伝子（Ｄ１Ｒ）およびスモールサブユニット（GenBank ACCESSION: YP_232999）をコードする遺伝子（Ｄ１２Ｌ）を、例えばｐＣＡＧＧＳプラスミド（図１０参照）のような公知の哺乳動物細胞用発現ベクターや公知のウイルスベクターにそれぞれ挿入することにより、キャッピング酵素発現ベクターを作製することができる。ワクシニアウイルスキャッピング酵素のラージサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列として、例えば配列番号２９の塩基配列を使用することができ、スモールサブユニットをコードする遺伝子の塩基配列として例えば配列番号３０の塩基配列を使用することができる。ＦＡＳＴタンパク質発現カセットとキャッピング酵素サブユニット発現カセットが１つのベクターに含まれているポリシストロニックベクターを使用してもよい。
　キャッピング酵素発現ベクターに代えて、キャッピング酵素の各サブユニットをコードする一本鎖プラス鎖ＲＮＡを用いることができる。キャッピング酵素の各サブユニットをコードする一本鎖プラス鎖ＲＮＡは、例えばキャッピング酵素の各サブユニットの発現ベクターからインビトロ転写することにより取得することができる。インビトロ転写は、例えば市販の試薬（例えば、in vitro Transcription T7 Kit（タカラバイオ）等）を用いて行うことができる。使用するＲＮＡはインビトロ転写後、キャップアナログ（例えば、Ribo m7G Cap Analog（プロメガ）等）を用いてキャッピングすることが望ましい。
　宿主細胞には、レオウイルス科に属するウイルスに対する感受性が高く、かつ遺伝子導入効率が高い細胞を好適に用いることができる。このような細胞として、ＢＨＫ細胞、ＭＡ１０４細胞、ＣＯＳ７細胞、ＣＶ１細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｌ９２９細胞、２９３Ｔ細胞Ａ５４９細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。また、上記各細胞由来の改変細胞（新たにクローニングされた細胞や外来遺伝子を導入した細胞など）も宿主細胞として好適に用いることができる。
　分節ＲＮＡゲノム発現カセットのプロモーターにＴ７プロモーターを用いる場合、宿主細胞として組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現細胞を使用することができる。組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現細胞は、例えば宿主細胞として使用可能な細胞に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（GenBank ACCESSION: ADJ00046）をコードする遺伝子が挿入された哺乳動物細胞用発現ベクターをトランスフェクションし、薬剤選択等の手段を用いて組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼを安定発現する細胞を選択することにより、作製することができる。また、例えば宿主細胞として使用可能な細胞に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子が挿入された各種ウイルスベクター（ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等）を感染させて、組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼを一過性、もしくは持続的に発現する細胞を作製することもできる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子の塩基配列としては、例えば「T7RNA polymerase vector pGemT7cat」の塩基配列（GenBank ACCESSION: HM049174）の８９４位～３５４５位の塩基配列を使用することができる。また、公知の組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現細胞（例えばBHK/T7-9: Ito, N et al., (2003) Microbiology and immunology 47, 613-617）を使用することができる。
　工程（１）におけるＦＡＳＴタンパク質発現ベクターおよび／またはキャッピング酵素発現ベクターの宿主細胞への導入、工程（２）におけるウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された一本鎖ＲＮＡのセットの宿主細胞への導入は、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法等の公知のトランスフェクション手段を用いて行うことができる。また、市販のトランスフェクション試薬（例えば、TransIT-LT1（商品名、Mirus）等）を用いて行うことができる。
　本発明の作製方法において、工程（１）と工程（２）を別々に行ってもよく、同時に行ってもよい。工程（１）と工程（２）を別々に行う場合は、工程（１）の後に工程（２）を行ってもよく、工程（２）の後に工程（１）を行ってもよい。好ましくは工程（１）と工程（２）を同時に行うことである。つまり、本発明の方法は、以下の工程（Ｉ）および（ＩＩ）を含むことが好ましい。
（Ｉ）ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターおよび／またはキャッピング酵素発現ベクター、ならびに、ウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクターまたは該発現カセットから転写された一本鎖ＲＮＡのセットを、同時に宿主細胞に導入する工程
（ＩＩ）宿主細胞を培養する工程
　ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターおよび／またはキャッピング酵素発現ベクターが導入された宿主細胞は、ＦＡＳＴタンパク質および／またはキャッピング酵素を一過性に発現する細胞でもよく、持続的に発現する細胞でもよい。宿主細胞として、上記の組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現細胞を使用する場合は、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに加えて、ＦＡＳＴタンパク質および／またはキャッピング酵素を持続的に発現する細胞を用いることができる。ＦＡＳＴタンパク質および／またはキャッピング酵素を持続的に発現する細胞は、ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターおよび／またはキャッピング酵素発現ベクターを導入し、薬剤選択等の手段を用いてＦＡＳＴタンパク質および／またはキャッピング酵素を安定発現する細胞を選択することにより、作製することができる。また、持続発現細胞は、ＦＡＳＴタンパク質および／またはキャッピング酵素を常時発現している細胞でもよく、例えばＴｅｔ ｏｎ／ｏｆｆシステム等により、発現を制御できる細胞でもよい。また、例えば宿主細胞として使用可能な細胞に、ＦＡＳＴタンパク質をコードする遺伝子および／またはキャッピング酵素をコードする遺伝子が挿入された各種ウイルスベクター（ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター等）を感染させて、ＦＡＳＴタンパク質および／またはキャッピング酵素を一過性、もしくは持続的に発現する細胞を作製することもできる。
　トランスフェクションに用いる核酸量は、使用する培養プレートの大きさ、宿主細胞の種類、播種細胞数等に応じて適切な量を選択することが好ましい。例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ安定発現ＢＨＫ細胞を宿主細胞とし、６ウェルプレートに８×１０５個／ウェルで播種し、翌日にトランスフェクションを行う場合、各分節ＲＮＡゲノム発現ベクターのＤＮＡ量はそれぞれ０．５～１．０μｇが好ましく、ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターのＤＮＡ量は０．００２～０．０２μｇが好ましく、キャッピング酵素発現ベクターのＤＮＡ量は０．５～１．０μｇが好ましい。例えば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ安定発現ＢＨＫ細胞を宿主細胞とし、１２ウェルプレートに４×１０５個／ウェルで播種し、翌日にトランスフェクションを行う場合、各分節ＲＮＡゲノム発現ベクターのＤＮＡ量はそれぞれ０．２５～０．５μｇが好ましく、ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターのＤＮＡ量は０．０００１～０．０１μｇが好ましく、キャッピング酵素発現ベクターのＤＮＡ量は０．２５～０．５μｇが好ましい。
　宿主細胞の培養には、宿主細胞に適した培地を適宜選択して用いることができる。宿主細胞に細胞変性が観察されれば、人工組換えウイルスが作製されたと判断することができる。細胞変性が確認されたプレートまたはウェルの培地と細胞を回収し、細胞溶解液を調製して、これをウイルス試料とすることができる。また、この細胞溶解液からプラーク法によりウイルスを単離し、多量培養後、ウイルス粒子を精製してウイルス試料としてもよい。ウイルス粒子の精製は、公知の方法（例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離等）により行うことができる。
　宿主細胞に数日培養した後、細胞変性の有無に関わらず上記のように細胞溶解液を調製し、この細胞溶解液を他の細胞に添加してウイルスを継代してもよい。他の細胞としては、ウイルス高感受性細胞が好ましく、作製しようとするウイルスに対する高感受性細胞がより好ましい。例えば人工組換えロタウイルスを作製する場合は、ＭＡ１０４細胞またはＣＶ１細胞が好ましい。細胞溶解液を添加した他の細胞を培養し、細胞変性が観察されれば、人工組換えウイルスが作製されたと判断することができる。
　あるいは、宿主細胞に各ベクター等をトランスフェクションした数日後に、宿主細胞の培養プレートまたはウェルに上記のウイルス高感受性細胞を播種し、共培養を行ってもよい。共培養を行う場合、添加する他の細胞の播種細胞数はトランスフェクションに供した細胞の１／５～１／２０程度が好ましい。細胞添加後、トリプシン（例えば、約0.5μg/ml）を添加した無血清培地で約３～５日程度培養した後、細胞溶解液を調製してウイルス高感受性細胞に添加し継代する。継代したウイルス高感受性細胞を上記のトリプシン添加無血清培地で培養し、細胞変性が観察されれば、人工組換えウイルスが作製されたと判断することができる。細胞変性が確認されたプレートまたはウェルの培地と細胞を回収し、細胞溶解液を調製して、これをウイルス試料とすることができる。また、この細胞溶解液からプラーク法によりウイルスを単離し、多量培養後、ウイルス粒子を精製してウイルス試料としてもよい。ウイルス粒子の精製は、公知の方法（例えば、塩化セシウム密度勾配遠心分離等）により行うことができる。
　本発明の作製方法において、分節ＲＮＡゲノムの少なくとも１つに変異が導入されている人工組換えウイルス、分節ＲＮＡゲノムの少なくとも１つに外来遺伝子が組み込まれている人工組換えウイルス、または、分節ＲＮＡゲノムの少なくとも１つに変異が導入されかつ分節ＲＮＡゲノムの少なくとも１つに外来遺伝子が組み込まれている人工組換えウイルスを作製することができる。このような人工組換えウイルスは、分節ＲＮＡゲノムの発現カセットに所望の変異を導入すること、および／または、所望の外来遺伝子を組み込むことにより作製することができる。分節ＲＮＡゲノムの発現カセットへの変異導入や外来遺伝子の組み込みは、公知の遺伝子組換え技術を用いて行うことができる。
　本発明者らは、ロタウイルスのＮＳＰ１に欠失変異を導入した自立増殖が可能な人工組換えロタウイルス、ＮＳＰ３に欠失変異を導入した自立増殖が可能な人工組換えロタウイルスおよびＮＳＰ４にアミノ酸置換変異を導入した自立増殖が可能な人工組換えロタウイルスの作製に成功している。また、増殖に必須のウイルスタンパク質遺伝子を一部欠失させ、自立増殖できない人工組換えロタウイルスを作製することができる。すなわち、増殖に必須のウイルスタンパク質遺伝子を一部欠失させ、変異タンパク質を発現するように改変した宿主細胞を用いることにより、自立増殖できない人工組換えウイルスを作製することができる。このようにして作製された人工組換えウイルスは、変異ウイルスタンパク質に対応する正常ウイルスタンパク質を発現する細胞でのみ増殖することができる。したがって、当該人工組換えウイルスは、１回感染型のウイルス様粒子の作製に応用でき、ワクチンとして有用であると考えられる。さらに、既知の強毒化、弱毒化に関与するウイルスタンパク質遺伝子に変異を加えて、弱毒化ワクチン候補の人工組換えウイルスを作製することもできる。
　また、本発明者らは、ロタウイルスのＮＳＰ１遺伝子にルシフェラーゼ遺伝子（Ｎｌｕｃ遺伝子）を組み込んで、ルシフェラーゼを発現する人工組換えロタウイルスの作製に成功している。さらに、本発明者らは、ロタウイルスのＮＳＰ１遺伝子に緑色蛍光タンパク質遺伝子（ＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子）を組み込んで、ＺｓＧｒｅｅｎを発現する人工組換えロタウイルスの作製に成功している。外来遺伝子は、ロタウイルスのいずれの分節ゲノムにも組み込むことが可能であると考えられる。外来遺伝子は、Ｎｌｕｃ遺伝子（配列番号３１）やＺｓＧｒｅｅｎ遺伝子（配列番号３３）のような５００ｂｐ以上のサイズの遺伝子に限定されず、短いペプチドをウイルスタンパク質との融合タンパク質として発現させることも可能である。２以上の外来遺伝子を有する場合、外来遺伝子は異なる２以上の分節ゲノムにそれぞれ１つの外来遺伝子が組み込まれていてもよく、１つの分節ゲノムに２以上の外来遺伝子が組み込まれていてもよい。分節ゲノムの変異と外来遺伝子の組み合わせも特に限定はなく、適宜選択して組み合わせることができる。
　外来遺伝子発現ベクターとして、外来遺伝子をロタウイルスのＮＳＰ１遺伝子に挿入すると共に、ＮＳＰ１遺伝子の一部を欠失させた分節ゲノム発現カセットを含むベクターを用いることが好ましい。外来遺伝子の挿入位置は特に限定されないが、通常ＮＳＰ１遺伝子の５’末端（非翻訳領域を含む）の約３０塩基～約２００塩基より下流、かつ、ＮＳＰ１遺伝子の３’末端（非翻訳領域を含む）の約３０塩基～約２００塩基より上流の範囲に外来遺伝子の挿入することが好ましい。より好ましくはＮＳＰ１遺伝子の５’末端（非翻訳領域を含む）から約８０塩基～約１５０塩基の範囲、さらに好ましくはＮＳＰ１遺伝子の５’末端（非翻訳領域を含む）から約１００塩基～約１３０塩基の範囲に外来遺伝子を挿入する。ＮＳＰ１遺伝子の欠失部位は特に限定されないが、外来遺伝子挿入位置より下流であることが好ましい。ただし、ＮＳＰ１遺伝子の３’末端（非翻訳領域を含む）領域を残すことが好ましく、少なくとも約３０塩基以上、約５０塩基以上、約１００塩基以上、約２００塩基以上を残すことが好ましい。欠失させる塩基数は特に限定されず、１５５０塩基以下、１２００塩基以下、１０００塩基以下、８００塩基以下、７００塩基以下、６００塩基以下、５００塩基以下、４００塩基以下であってもよい。また、欠失させる塩基数は、１００塩基以上、２００塩基以上、３００塩基以上であってもよい。このような外来遺伝子発現ベクターを用いることにより、外来遺伝子を長期間安定に保持し、外来遺伝子産物を長期間安定に発現する人工組換えロタウイルスを作製することができる。
　本発明の作製方法により作製された変異を有する人工組換えウイルスや外来遺伝子を発現するウイルスは、ウイルスタンパク質の機能解析に有用であると共に、ワクチンやワクチンベクターの開発に有用である。また、変異を有する人工組換えウイルスや外来遺伝子を発現するウイルスをワクチンとして使用できると考えられる。
　本発明の作製方法により人工組換えロタウイルスを作製する場合、宿主細胞にロタウイルスＮＳＰ２遺伝子産物および／またはロタウイルスＮＳＰ５遺伝子産物を過剰発現させることにより、人工組換えロタウイルスの作製効率を向上させることができる。ＮＳＰ２遺伝子産物およびＮＳＰ５遺伝子産物のどちらか一方を宿主細胞に過剰発現させてもよく、両方を宿主細胞に過剰発現させてもよい。ＮＳＰ２遺伝子産物とＮＳＰ５遺伝子産物の両方を宿主細胞に過剰発現させることが好ましい。
　ＮＳＰ２遺伝子産物を発現するベクター（以下、「ＮＳＰ２発現ベクター」と記す）およびＮＳＰ５遺伝子産物を発現するベクター（以下、「ＮＳＰ５発現ベクター」と記す）を作製し、これらの一方または両方を宿主細胞に導入することにより、宿主細胞にＮＳＰ２遺伝子産物および／またはＮＳＰ５遺伝子産物を過剰発現させることができる。ＮＳＰ２発現ベクターおよびＮＳＰ５発現ベクターは、ＮＳＰ２遺伝子（GenBank ACCESSION: LC178571、配列番号１８）およびＮＳＰ５遺伝子（GenBank ACCESSION: LC178574、配列番号２１）を、例えばｐＣＡＧＧＳプラスミド（図１０参照）のような公知の哺乳動物細胞用発現ベクターや公知のウイルスベクターにそれぞれ挿入することにより作製することができる。
　ＮＳＰ２発現ベクターに挿入するＮＳＰ２遺伝子およびＮＳＰ５発現ベクターに挿入するＮＳＰ５遺伝子は、作製しようとする人工組換えロタウイルスと同一株のＮＳＰ２遺伝子およびＮＳＰ５遺伝子であってもよく、異なる遺伝子型、異なる血清群または異なる動物（ヒト、サル、ウマ、トリ、イヌ、ブタ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ等）のロタウイルスのＮＳＰ２遺伝子およびＮＳＰ５遺伝子であってもよい。ＮＳＰ２発現カセット、ＮＳＰ５発現カセットが１つのベクターに含まれているポリシストロニックベクターを使用してもよい。
　ＮＳＰ２発現ベクターに代えて、ＮＳＰ２をコードする一本鎖プラス鎖ＲＮＡを用いることができる。同様に、ＮＳＰ５発現ベクターに代えて、ＮＳＰ５をコードする一本鎖プラス鎖ＲＮＡを用いることができる。これらの一本鎖プラス鎖ＲＮＡは、例えばＮＳＰ２発現ベクターおよびＮＳＰ５発現ベクターからインビトロ転写することにより、それぞれ取得することができる。インビトロ転写は、例えば市販の試薬（例えば、in vitro Transcription T7 Kit（タカラバイオ）等）を用いて行うことができる。使用するＲＮＡはインビトロ転写後、キャップアナログ（例えば、Ribo m7G Cap Analog（プロメガ）等）を用いてキャッピングすることが望ましい。
　ＮＳＰ２発現ベクターおよび／またはＮＳＰ５発現ベクターを使用せずに、セグメント８（ＮＳＰ２遺伝子）を発現する分節ＲＮＡゲノム発現ベクター（セグメント８発現ベクター）および／またはセグメント１１（ＮＳＰ５遺伝子）を発現する分節ＲＮＡゲノム発現ベクター（セグメント１１発現ベクター）の宿主細胞への導入量を、他のセグメントを発現する分節ＲＮＡゲノム発現ベクターより増量することにより、宿主細胞にＮＳＰ２遺伝子産物および／またはＮＳＰ５遺伝子産物を過剰発現させることができる。宿主細胞に導入するセグメント８発現ベクターおよび／またはセグメント１１発現ベクターのＤＮＡ量は、他の分節ＲＮＡゲノム発現ベクターより多ければ特に限定されず、他の分節ＲＮＡゲノム発現ベクターのＤＮＡ量の約１．５倍～約１０倍であってもよく、約２倍～約５倍であってもよい。ロタウイルスの各分節ゲノム（セグメント）については、実施例２の表２を参照のこと。
　さらに本発明者らは、ＦＡＳＴタンパク質および／またはキャッピング酵素を発現する宿主細胞を使用しなくても、人工組換えロタウイルスを作製できることを確認した（実施例１０参照）。すなわち本発明は、ＦＡＳＴタンパク質およびキャッピング酵素を発現しない宿主細胞に、ロタウイルスの１１個の分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された１１個の一本鎖ＲＮＡのセットを導入し、培養することを特徴とする人工組換えロタウイルスの作製方法を提供する。
　当該作製方法の第一の実施形態は、ＮＳＰ２発現ベクターおよび／またはＮＳＰ５発現ベクターを導入した宿主細胞を用いる方法である。当該作製方法の第二の実施形態は、宿主細胞に、ロタウイルスの１１個の分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された１１個の一本鎖ＲＮＡのセットのみを導入する方法である。第２の実施形態において、ロタウイルスの１１個の分節ＲＮＡゲノムの発現カセット中、セグメント８発現ベクターおよび／またはセグメント１１発現ベクターの宿主細胞への導入量を、他のセグメントを発現する分節ＲＮＡゲノム発現ベクターより増量することが好ましい。宿主細胞に導入するセグメント８発現ベクターおよび／またはセグメント１１発現ベクターのＤＮＡ量は、他の分節ＲＮＡゲノム発現ベクターより多ければ特に限定されず、他の分節ＲＮＡゲノム発現ベクターのＤＮＡ量の約１．５倍～約１０倍であってもよく、約２倍～約５倍であってもよい。
　ロタウイルスのＮＳＰ２とＮＳＰ５はウイルス感染細胞内にウイルス封入体（Viral inclusion body）を形成し、ウイルス複製の場として機能することが知られている（Hu L, Crawford S, Hyser J, Estes M, and Prasad V (2012): Rotavirus non-structural proteins: Structure and Function Current Opinion in Virology　2(4): 380-388.）。ウイルス封入体は、レオウイルス科に属するウイルスに共通して見られる構造であり、レオウイルス科オルソレオウイルス属（哺乳類オルソレオウイルス、ネルソンベイレオウイルス、トリレオウイルス等）のＭ３遺伝子にコードされるμＮＳおよびＳ３遺伝子またはＳ４遺伝子にコードされるσＮＳ、レオウイルス科オルビウイルス属（アフリカ馬疫ウイルス、ブルータングウイルス等）のセグメント８にコードされるＮＳ２が同様にウイルス封入体を形成し、ウイルス複製の場として機能することが知られている（Thomas CP, Booth TF, Roy P (1990): Synthesis of bluetongue virus-encoded phosphoprotein and formation of inclusion bodies by recombinant baculovirus in insect cells: it binds the single-stranded RNA species. Journal of General Virology, 71 (Pt 9): 2073-2083.）。そこで、本発明らは、哺乳類オルソレオウイルスの人工組換えウイルス作製の際に、μＮＳ発現ベクターおよびσＮＳ発現ベクターを導入した宿主細胞を用いたところ、人工組換えウイルスの作製効率が大幅に向上することを確認した（実施例１３参照）。
　したがって、本発明は、ウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された一本鎖ＲＮＡのセットが導入された宿主細胞に、ウイルス感染細胞内のウイルス封入体形成に関与する遺伝子産物を過剰発現させて培養することを特徴とするレオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法を提供する。宿主細胞には、ＦＡＳＴタンパク質および／またはキャッピング酵素を発現する宿主細胞を用いてもよく、ＦＡＳＴタンパク質およびキャッピング酵素を発現しない宿主細胞を用いてもよい。ウイルス感染細胞内のウイルス封入体形成に関与する遺伝子産物としては、オルソレオウイルス属ウイルスのＭ３遺伝子にコードされるμＮＳ、オルソレオウイルス属ウイルスのＳ３遺伝子またはＳ４遺伝子にコードされるσＮＳ、オルビウイルス属のセグメント８にコードされるＮＳ２などが挙げられ、これらを単独または組み合わせて用いることができる。
　ウイルス感染細胞内のウイルス封入体形成に関与する遺伝子産物を過剰発現させるために、該遺伝子発現ベクターを宿主細胞に導入してもよく、該遺伝子をコードする分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクターのＤＮＡ量を、他の分節ＲＮＡゲノム発現ベクターより増量して宿主細胞に導入してもよい。該遺伝子をコードする分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクターのＤＮＡ量は、他の分節ＲＮＡゲノム発現ベクターのＤＮＡ量の約１．５倍～約１０倍であってもよく、約２倍～約５倍であってもよい。
〔人工組換えロタウイルスおよびワクチン〕
　本発明は、ＮＳＰ１、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４から選択される少なくとも１つの機能を抑制する変異が導入されている人工組換えロタウイルスを提供する。本発明者らは、ロタウイルスのＮＳＰ１のＣ末端領域の１０８アミノ酸を欠失した人工組換えロタウイルスの作製に成功している。ＮＳＰ１のＣ末端領域は自然免疫の抑制に重要な働きをすることが知られているので（Barro, M., and Patton, J.T. (2005). Rotavirus nonstructural protein 1 subverts innate immune response by inducing degradation of IFN regulatory factor 3. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 102, 4114-4119.）この人工組換えロタウイルスは複製能を保持した弱毒ウイルスであり、ワクチンとして有用であると考えられる。さらに本発明者らは、ＮＳＰ３に欠失変異を有する人工組換えロタウイルスおよびＮＳＰ３にアミノ酸置換変異を有する人工組換えロタウイルスを作製し、ＮＳＰ１、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４にそれぞれ変異を有する人工組換えロタウイルスが、野生型人工組換えロタウイルスと比較して増殖が低下していることを確認している。したがって、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４にそれぞれ変異を有する人工組換えロタウイルスも複製能を保持した弱毒ウイルスであり、ワクチンとして有用であると考えられる。このようなＮＳＰ１１、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４から選択される少なくとも１つの機能を抑制する変異が導入されている人工組換えロタウイルスを含有するワクチンも本発明に含まれる。
　本発明は、外来遺伝子を発現する人工組換えロタウイルスを提供する。外来遺伝子は特に限定されないが、例えば、ワクチン抗原をコードする外来遺伝子を用いることにより、作製された人工組換えロタウイルスをワクチンとして使用することができる。ワクチン抗原としては、例えば経口または粘膜感染症であるノロウイルス抗原、アデノウイルス抗原、Ａ型肝炎抗原、サポウイルス抗原、手足口病ウイルス抗原、エンテロウイルス抗原、ＨＩＶ抗原、サルモネラ抗原、カンピロバクター抗原、腸炎ビブリオ抗原、大腸菌Ｏ１５７抗原、コレラ抗原、腸チフス抗原、赤痢抗原等が挙げられる。これらのワクチン抗原は、エピトープペプチドであってもよい。異なる外来ワクチン抗原を発現する人工組換えロタウイルスを複数組み合わせて、ワクチンを構成してもよい。
　外来遺伝子として、異種または異株のロタウイルスの抗原タンパク質（例えばＶＰ４、ＶＰ７等）をコードする遺伝子を１つ以上発現させることにより、ロタウイルスの多価ワクチンとして使用可能な人工組換えロタウイルスを提供することができる。抗原タンパク質は、エピトープペプチドであってもよい。
　レポーター遺伝子を発現する人工組換えロタウイルスは、ウイルス量を容易に可視化できるので、抗ロタウイルス薬のスクリーニングに利用することができる。レポーター遺伝子は公知のレポーター遺伝子から適宜選択することができる。例えば、ルシフェラーゼ遺伝子、ＧＦＰ遺伝子、ＲＦＰ遺伝子などを好適に選択することができる。
　本発明は、リアソータントである人工組換えロタウイルスを提供する。ロタウイルスのリアソータントとは、異種または異株のロタウイルス間で分節ゲノムの組換えが生じた新しい遺伝子型構成を持つロタウイルスを意味する。リアソータントは遺伝子再集合体とも称される。本発明の作製方法を用いれば、全てのロタウイルス種間で人工組換えリアソータントロタウイルスのデザイン、作製が可能である。異なるウイルス株同士の遺伝子分節の交換は自然感染においても認められ、ロタウイルスのような分節ゲノムをもつウイルスにとって重要な進化の方法であると考えられている。このような種または株が異なるロタウイルス間のリアソータントは、分節ゲノムの機能解析に有用であると共に、ワクチン候補の人工組換えロタウイルスとして極めて有用である。例えば、血清型が異なるロタウイルスのＶＰ４遺伝子分節ゲノムまたはＶＰ７遺伝子分節ゲノムを含むリアソータントは、二価のロタウイルスワクチンとして使用できる。また、これらを複数混合することにより、多価ロタウイルスワクチンを構成することができる。
〔ウイルス複製促進方法〕
　本発明は、ウイルス複製促進方法を提供する。本発明のウイルス複製促進方法は、ＦＡＳＴタンパク質を発現する宿主細胞にウイルスを感染させて培養することを特徴とする。感染させるウイルスは特に限定されないが、レオウイルス科に属するウイルスが好ましい。なかでも、哺乳類オルソレオウイルスおよびロタウイルスが好ましい。ＦＡＳＴタンパク質を発現する宿主細胞は、宿主細胞として使用可能な細胞に、ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターを導入することにより作製することができる。ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターは、上記本発明の作製方法において説明したＦＡＳＴタンパク質発現ベクターを使用することができる。宿主細胞および宿主細胞への各ベクターの導入方法も、上記本発明の作製方法と同じ方法で行うことができる。ＦＡＳＴタンパク質を発現する宿主細胞は、ＦＡＳＴタンパク質を一過性に発現する細胞でもよく、ＦＡＳＴタンパク質を持続的に発現する細胞でもよい。
　トランスフェクションに用いる核酸量は、使用する培養プレートの大きさ、宿主細胞の種類、播種細胞数等に応じて適切な量を選択することが好ましい。例えば、Ｖｅｒｏ細胞を宿主細胞とし、６ウェルプレートに８×１０５個／ウェルで播種し、翌日にトランスフェクションを行う場合、ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターのＤＮＡ量は０．００２～０．０２μｇが好ましい。トランスフェクションに用いるＤＮＡ量は、用いるプレートに適した播種細胞数に比例するように適宜変更することができる。
　宿主細胞へのウイルスの感染は、宿主細胞の培地にウイルス試料を添加することで行うことができる。ウイルス感染量は特に限定されないが、ＭＯＩ０．１～０．０００１が好ましい。培養期間は特に限定されないが、１６～４８時間がより好ましい。
　本発明のウイルス複製促進方法は、増殖（複製）能が低いウイルスに適用することでウイルスの増殖（複製）を促進することができる。また、高いウイルス力価を有するウイルスストックを作製する際に有用である。
　以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
〔実施例１：哺乳類オルソレオウイルスリバースジェネティクス系の改良〕
　哺乳類オルソレオウイルス（MRV）はレオウイルス科のモデルウイルスとして解析が進んでおり、プラスミドのみを用いたリバースジェネティクス（RG）系がレオウイルス科で最初に開発された（非特許文献３）。レオウイルス科のRG系の改良を目的に膜融合性（Fusogenic）レオウイルスグループがコードするFASTタンパク質ならびにワクシニアウイルスがコードするキャッピング酵素を用いて人工組換えウイルス作製効率の増強能について検討した。
＜材料および方法＞
（１）ウイルス
　哺乳類オルソレオウイルスtype1 Lang株（以下、「MRV T1L株」と記す）を使用した。MRV T1L株はATCCから購入することができる（ATCC VR-230）。MRV T1L株の10個の各分節RNAゲノムの遺伝子名およびGenBank ACCESSIONを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（２）MRV T1L株の各分節RNAゲノム発現カセットを含むプラスミド（分節RNAゲノム発現ベクター）の作製
　MRV T1L株の10個の分節RNAゲノム（L1～3、M1～3、S1～4）のcDNAを含むプラスミドは、参考文献１（Kobayashi et al. Virology. 2010 Mar 15;398(2):194-200）に記載の方法に従って作製した。すなわち、ウイルスから抽出した二本鎖RNAを鋳型とし、各分節RNAゲノムの塩基配列に基づく特異的プライマーを用いてRT-PCRを行った。得られたRT-PCR産物（各分節RNAゲノムのcDNA）をp3E5EGFP（Watanabe et al., (2004) Journal of virology, 78, 999-1005）にクローニングした。これにより、各分節RNAゲノムのcDNAの5'側にT7プロモーター配列（配列番号22）、3'側にＤ型肝炎ウイルス（HDV）リボザイム配列（配列番号23）が隣接し、その下流にT7ターミネーター配列（配列番号24）が配置された発現カセットを有するプラスミドを得た。得られたプラスミドは、図９に示すp3E5プラスミド（3076bp、配列番号25）のT7プロモーター配列とHDVリボザイム配列の間（配列番号25の30位と31位の間）に各分節RNAゲノムをコードするcDNAが挿入された構造を有する。
　次に、L1をクローニングしたプラスミド（pT7-L1T1L）にM2の発現カセットを挿入して、バイシストロニックなプラスミド（pT7-L1-M2T1L）を作製した。同様に、L2をクローニングしたプラスミド（pT7-L2 T1L）にM2の発現カセットを挿入して、バイシストロニックなプラスミド（pT7-L2-M3T1L）を作製し、L3をクローニングしたプラスミド（pT7-L3 T1L）にS3の発現カセットを挿入して、バイシストロニックなプラスミド（pT7-L3-S3T1L）を作製した。さらに、S2をクローニングしたプラスミド（pT7-S2T1L）にS3、S4およびM1の発現カセットをそれぞれ挿入して、テトラシストロニックなプラスミド（pT7-S1-S2-S4-M1T1L）を作製した。
（３）FASTタンパク質発現ベクターの作製
　FASTタンパク質発現ベクターは、ネルソンベイレオウイルスp10遺伝子（GenBank ACCESSION: AB908284 参照）のタンパク質コード領域DNA（配列番号26）またはトリレオウイルスp10遺伝子（GenBank ACCESSION: AF218358 参照）のタンパク質コード領域DNA（配列番号27）を、図１０に示すpCAGGSプラスミド（5699bp、配列番号28、Matsuo et al., 2006, Biochem Biophys Res Commun 340(1): 200-208）に挿入して作製した。各コード領域DNAは、配列番号27の塩基配列および配列番号28の塩基配列に基づいて、人工遺伝子合成サービス（Eurofins Genomics）にて合成した。各合成DNAをそれぞれpCAGGSプラスミドのBglII切断部位（配列番号28の1753位と1754位の間）に挿入して、pCAG-p10（ネルソンベイレオウイルスp10発現ベクター）およびpCAG-ARVp10（トリレオウイルスp10ベクター）を得た。
（４）キャッピング酵素発現ベクターの作製
　キャッピング酵素発現ベクターは、ワクシニアウイルスD1R遺伝子のタンパク質コード領域DNA（GenBank ACCESSION: NC006998の93948位～96482位、配列番号29）およびワクシニアウイルスD12L遺伝子のタンパク質コード領域DNA（GenBank ACCESSION: NC006998の107332位～108195位、配列番号30）を、上記pCAGGSプラスミドに挿入して作製した。各コード領域DNAは、配列番号29の塩基配列および配列番号30の塩基配列に基づいて、人工遺伝子合成サービス（Eurofins Genomics）にて合成した。各合成DNAをそれぞれpCAGGSプラスミドのBglII切断部位（配列番号28の1753位と1754位の間）に挿入して、pCAG-D1R（ワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素ラージサブユニット発現ベクター）およびpCAG-D12L（ワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素スモールサブユニット発現ベクター）を得た。
（５）宿主細胞
　T7RNAポリメラーゼを安定発現するBHK-T7/P5細胞を使用した。BHK-T7/P5細胞は、CAGプロモーターの下流にT7RNAポリメラーゼをコードするDNAを挿入したpCAGGSプラスミドをBHK細胞（Baby Hamster Kidney Cells）にトランスフェクションし、ピューロマイシン含有培地で培養して選択することにより作製した。
（６）人工組換えウイルスの作製
　トランスフェクションの前日に、BHK-T7/P5細胞を2×105個/ウェルで24ウェル培養プレートに播種した。分節RNAゲノム発現ベクター（pT7-L1-M2T1L、pT7-L2-M3T1L、pT7-L3-S3T1LおよびpT7-S1-S2-S4-M1T1L）各0.4、FASTタンパク質発現ベクター（pCAG-p10またはpCAG-ARVp10）0.05μg、0.005μgまたは0.0005μg、キャッピング酵素発現ベクター（pCAG-D1RおよびpCAG-D12L）各0.2μgを、トランスフェクション試薬（TransIT-LT1（商品名）、Mirus）を用いてBHK-T7/P5細胞に導入した。DNA 1μgあたり2μlのトランスフェクション試薬を使用した。BHK-T7/P5細胞の培養には、5% FBS、100units/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含有するDMEM培地を用い、37℃5%CO2環境下で培養した。トランスフェクションの48時間後に培地および細胞を回収した。回収した培地および細胞を３回凍結融解したものをウイルス試料としてプラークアッセイに供し、ウイルスタイターを測定した。
（７）プラークアッセイ
　プラークアッセイは以下の手順で行った。
(a) マウスL929細胞を、1.2×106個/ウェル/2ml MEM培地で6ウェル培養プレートに播種し、一夜培養。
(b) 上記ウイルス試料110μlをゼラチン含有生理食塩水1mlに添加して攪拌し、10倍希釈液を調製。この手順を繰り返して、段階希釈ウイルス試料を調製。
(c) 培地を除去し、各希釈段階のウイルス試料100μl/ウェルを添加（1試料につき2ウェル）。時々攪拌しながら、室温で60分間インキュベーション。
(d) 保温した2×199培地/ager（2%アガロースと2×199培地の等量混合物）3ml/ウェルを添加し、37℃2日間インキュベート。
(e) (d)の2日後に2×199培地/agerを2ml/ウェルで重層し、37℃4日間インキュベート。
(f) (e)の2日後にニュートラルレッド含有2×199培地/agerを2ml/ウェルで重層し、37℃一夜インキュベート。
(g) プラークカウント。
＜結果＞
　結果を図１に示した。MRV T1L株の４種の分節RNAゲノム発現ベクター（pT7-L1-M2T1L、pT7-L2-M3T1L、pT7-L3-S3T1LおよびpT7-S1-S2-S4-M1T1L）のみを導入した細胞のウイルスタイターと比較して、FASTタンパク質発現ベクター（pCAG-p10、0.005μg）を共導入した細胞のウイルスタイターは約600倍に増加した。また、キャッピング酵素発現ベクター（pCAG-D1RおよびpCAG-D12L）を共導入した細胞のウイルスタイターは約100倍に増加した。さらに、FASTタンパク質発現ベクターとキャッピング酵素発現ベクターの両方を共導入した細胞のウイルスタイターは約1200倍に増加した。この結果から、FASTタンパク質発現ベクターおよびキャッピング酵素発現ベクターの少なくとも一方と、分節RNAゲノム発現ベクターとを宿主細胞に共導入することにより、人工組換えウイルスの作製効率が大幅に向上することが示された。ただし、宿主細胞に導入するFASTタンパク質発現ベクターのDNA量が0.05μgの場合はウイルスタイターが検出されず、0.0005μgの場合にはウイルスタイターの大幅な増加は認められなかった。したがって、宿主細胞にFASTタンパク質を共発現させる場合は、適切な発現量になるように、導入するFASTタンパク質発現ベクターのDNA量を調整する必要があることが示された。
　図を示していないが、FASTタンパク質発現ベクターとしてpCAG-ARVp10を用いた場合も、図１と同様の結果が得られた。さらに、本発明者らは、哺乳類オルソレオウイルスtype3 Dearing株（MRV T3D株）の人工組換えウイルスについても、MRV T3D株の分節RNAゲノム発現ベクター（非特許文献３参照）と、FASTタンパク質発現ベクターおよびキャッピング酵素発現ベクターの少なくとも一方とを宿主細胞に共導入する実験を行い、MRV T1L株と同様に、人工組換えウイルスの作製効率が大幅に向上することを確認した。
　また、本発明者らは、ネルソンベイレオウイルスの人工組換えウイルス作製において、ネルソンベイレオウイルスの分節RNAゲノム発現ベクター以外にキャッピング酵素発現ベクターを宿主細胞に導入すれば、人工組換えネルソンベイレオウイルスの作製効率が大幅に向上することを確認した。なお、ネルソンベイレオウイルスは自身のp10遺伝子によりFASTタンパク質を発現している。
〔実施例２：ロタウイルスリバースジェネティクス系の開発〕
＜材料および方法＞
（１）ウイルス
　サルロタウイルスSA11株を使用した。本発明者らは、このウイルス株の11個の各分節RNAゲノムの塩基配列を決定し、登録している。本実験に使用したサルロタウイルスSA11株（以下、「SA11株」と記す）の11個の各分節RNAゲノムの名前およびGenBank ACCESSIONを表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
（２）SA11株の各分節RNAゲノム発現カセットを含むプラスミド（分節RNAゲノム発現ベクター）の作製
　SA11株の11個の分節RNAゲノムのcDNAを含むプラスミドを作製した。ウイルスから抽出した二本鎖RNAを鋳型とし、各分節RNAゲノムの塩基配列に基づく特異的プライマーを用いてRT-PCRを行った。得られたRT-PCR産物（各分節RNAゲノムのcDNA）を図９に示すp3E5プラスミド（3076bp、配列番号25）のT7プロモーター配列とHDVリボザイム配列の間（配列番号25の30位と31位の間）に挿入し、各分節RNAゲノムの発現カセットを含むプラスミドを得た。各分節RNAゲノムの発現カセットは、各分節RNAゲノムのcDNAの5'側にT7プロモーター配列（配列番号22）、3'側にＤ型肝炎ウイルス（HDV）リボザイム配列（配列番号23）が隣接し、その下流にT7ターミネーター配列（配列番号24）が配置された構造を有する。作製したプラスミド（分節RNAゲノム発現ベクター）を、それぞれpT7-VP1SA11、pT7-VP2SA11、pT7-VP3SA11、pT7-VP4SA11、pT7-VP6SA11、pT7-VP7SA11、pT7-NSP1SA11、pT7-NSP2SA11、pT7-NSP3SA11、pT7-NSP4SA11およびpT7-NSP5SA11と称する。
（３）マーカー変異導入プラスミドの作製
　KOD-Plus-Mutagenesis Kit（商品名、東洋紡）を用いて、pT7-NSP1SA11、pT7-NSP2SA11、pT7-NSP3SA11およびpT7-NSP4SA11にマーカー変異を導入した。具体的には、pT7-NSP1SA11のNSP1遺伝子（配列番号15）の1053位のTをC、1059位のTをCに変異させ、pT7-NSP2SA11のNSP2遺伝子（配列番号18）の409位のAをT、418位のTをCに変異させ、pT7-NSP3SA11のNSP3遺伝子（配列番号17）の406位のAをG、412位のAをTに変異させ、pT7-NSP4SA11のNSP4遺伝子（配列番号20）の389位のGをA、395位のAをGに変異させた。その結果、NSP1遺伝子（配列番号15）の1049位～1054位がBamHI認識配列、NSP2遺伝子（配列番号18）の413位～418位がEcoRV認識配列、NSP3遺伝子（配列番号17）の408位～413位がEcoRI認識配列、NSP4遺伝子（配列番号20）の393位～398位がMluI認識配列になったマーカー変異導入プラスミド（それぞれpT7-NSP1SA11 /BamHI、pT7-NSP2SA11 /EcoRV、pT7-NSP3SA11 /EcoRI、pT7-NSP4SA11 /MluIと称する）を作製した（図２参照）。
（４）FASTタンパク質発現ベクター
　FASTタンパク質発現ベクターには、実施例１で作製したpCAG-p10（ネルソンベイレオウイルスp10発現ベクター）を使用した。
（５）キャッピング酵素発現ベクター
　キャッピング酵素発現ベクターには、実施例１で作製したpCAG-D1R（ワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素ラージサブユニット発現ベクター）およびpCAG-D12L（ワクシニアウイルスmRNAキャッピング酵素スモールサブユニット発現ベクター）を使用した。
（６）宿主細胞
　宿主細胞には、実施例１と同じT7RNAポリメラーゼを安定発現するBHK-T7/P5細胞を使用した。
（７）人工組換えウイルスの作製
　野生型人工組換えウイルスの作製には、上記（２）で作製した11種類の分節RNAゲノム発現ベクターを用いた。１個のマーカー変異を有する人工組換えウイルス（rsSA11）の作製には、pT7-NSP4SA11に代えてpT7-NSP4SA11/MluIを用いた。３個のマーカー変異を有する人工組換えウイルス（rsSA11-3）の作製には、pT7-NSP1SA11に代えてpT7-NSP1SA11/BamHIを用い、pT7-NSP2SA11に代えてpT7-NSP2SA11/EcoRVを用い、pT7-NSP3SA11に代えてpT7-NSP3SA11/EcoRIを用いた。
　トランスフェクションの前日に、BHK-T7/P5細胞を8×105個/ウェルで6ウェル培養プレートに播種した。11種類の分節RNAゲノム発現ベクター各0.8μg、FASTタンパク質発現ベクター（pCAG-p10）0.015μg、キャッピング酵素発現ベクター（pCAG-D1RおよびpCAG-D12L）各0.8μgを、トランスフェクション試薬（TransIT-LT1（商品名）、Mirus）を用いてBHK-T7/P5細胞に導入した。DNA 1μgあたり2μLのトランスフェクション試薬を使用した。BHK-T7/P5細胞の培養には、5% FBS、100units/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含有するDMEM培地を用い、37℃5%CO2環境下で培養した。トランスフェクションの48時間後に培地および細胞を回収した。回収した培地および細胞を３回凍結融解して細胞溶解液を調製し、サルMA104細胞（ATCC CRL-2378.1）に継代した。具体的には、前記細胞溶解液約0.5mlをトリプシン0.5μg/ml 存在下で、12ウェルプレートでコンフルエントな状態のMA104細胞に添加した。MA104細胞の培養にはFBS不含DMEM培地を使用した。継代後7日間培養し、その間に細胞変性が認められた場合に人工組換えウイルスが作製されたと判断した。本実施例では、野生型SA11、rsSA11およびrsSA11-3のいずれの発現ベクターを導入した細胞にも細胞変性が認められたので、人工組換えロタウイルスの作製に成功したと判断した。
（８）マーカー変異の確認
　細胞変性が観察されたウェルの培地と細胞を回収し、３回凍結融解して細胞溶解液を調製した。野生型SA11、rsSA11およびrsSA11-3の細胞溶解液から、Trizol試薬（Thermo Scientific）を用いて、それぞれウイルスゲノムRNAを抽出した。抽出したRNAを鋳型とし、各分節RNAゲノムの塩基配列に基づく特異的プライマーを用いてRT-PCRを行った。逆転写酵素には、SuperScript III 逆転写酵素（Thermo Scientific）を用いた。野生型SA11およびrsSA11-3のNSP1の増幅産物、NSP2の増幅産物およびNSP3の増幅産物をそれぞれBamHI、EcoRVおよびEcoRIで処理し、1.2％アガロース電気泳動に供した。野生型SA11およびrsSA11のNSP46の増幅産物をMluIで処理し、1.2％アガロース電気泳動に供した。
＜結果＞
　結果を図３に示した。（Ａ）が野生型SA11およびrsSA11-3のNSP1の増幅産物をBamHIで処理した結果、（Ｂ）が野生型SA11およびrsSA11-3のNSP2の増幅産物をEcoRVで処理した結果、（Ｃ）が野生型SA11およびrsSA11-3のNSP3の増幅産物をEcoRIで処理した結果、（Ｄ）が野生型SA11およびrsSA11のNSP46の増幅産物をMluIで処理した結果の電気泳動像である。rsSA11-3およびrsSA11のゲノムRNAにはマーカー変異が導入されており、いずれも対応する制限酵素で切断されることが確認できた。したがって、本ロタウイルスリバースジェネティクス系によって得られたウイルスは、分節RNAゲノム発現ベクター由来の人工組換えロタウイルスであることが明らかになった。
〔実施例３：欠失変異を有する人工組換えロタウイルスの作製〕
　宿主自然免疫反応の抑制因子であるNSP1の部分的欠失変異を有する人工組換えロタウイルスの作製を試みた。
＜材料および方法＞
（１）欠失変異NSP1遺伝子を有するプラスミドの作製
　pT7-NSP1SA11を鋳型として、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（商品名、東洋紡）および特異的プライマーを用いて、NSP1遺伝子（配列番号15）の1192位～1490位の299塩基が欠失した変異NSP1遺伝子（図４参照）を有するプラスミドを作製した。このプラスミド（pT7-NSP1SA11ΔC108と称する）は、NSP1のC末端側108アミノ酸を欠失したNSP1タンパク質を発現する。
（２）人工組換えウイルスの作製および変異の確認
　欠失変異ロタウイルス（rsSA11/NSP1ΔC108）は、実施例２の（２）で作製した11種類の分節RNAゲノム発現ベクターにおいて、pT7-NSP1SA11に代えてpT7-NSP1SA11ΔC108を用いた以外は、実施例２と同じ方法で作製した。同時に野生型人工組換えウイルスを実施例２と同じ方法で作製した。細胞変性が観察されたMA104細胞のウェルから培地と細胞を回収し、３回凍結融解して細胞溶解液を調製し、rsSA11/NSP1ΔC108および野生型SA11の細胞溶解液からそれぞれウイルスゲノムRNAを抽出し、SDS-PAGEに供した。
＜結果＞
　結果を図５に示した。図５から明らかなように、rsSA11/NSP1ΔC108の各ゲノムRNAのバンドは、NSP1以外すべて野生型人工組換えウイルスと同じ位置に確認された。一方NSP1ΔC108のバンドの位置は、野生型のバンドの位置と異なり、NSP1ΔC108のゲノムRNAが野生型より短いことが確認された。NSP1のC末端領域は自然免疫の抑制に重要な領域であることから、本実施例で作製された変異ロタウイルスは、複製能を保持した弱毒ウイルスとして優れたワクチン候補であると考えられる。
〔実施例４：ルシフェラーゼ発現ロタウイルスの作製〕
　ロタウイルスをワクチンベクターとして利用する目的で外来遺伝子発現ロタウイルスの作製を試みた。
＜材料および方法＞
（１）ルシフェラーゼ遺伝子挿入NSP1発現プラスミドの作製
　ルシフェラーゼ遺伝子として、トゲオキヒオドシエビ（Oplophorus gracilirostris）由来のルシフェラーゼ遺伝子であるNluc遺伝子を用いた。pNL1.1ベクター（プロメガ、GenBank ACCESSION: KM359774、3817 bp）のNlucタンパク質コード領域である815位～1330位（配列番号31）をPCRで増幅し、増幅産物をpT7-NSP1SA11のNSP1遺伝子（配列番号15）の128位と129位の間に挿入して、ルシフェラーゼ遺伝子挿入NSP1遺伝子発現プラスミド（pT7-NSP1SA11-Nlucと称する）を作製した（図６参照）。
（２）人工組換えウイルスの作製およびルシフェラーゼ発現の確認
　ルシフェラーゼ発現ロタウイルスは、実施例２の（２）で作製した11種類の分節RNAゲノム発現ベクターにおいて、pT7-NSP1SA11に代えてpT7-NSP1SA11-Nlucを用いた以外は、実施例２と同じ方法で作製した。MA104細胞に継代7日後に培地および細胞を回収し、３回凍結融解して細胞溶解液を調製して、プラークアッセイに供した。プラークアッセイには、CV-1細胞（ATCC CCL-70）を使用した。CV-1細胞の培養には、FBS不含DMEM培地を使用した。MA104細胞の細胞溶解液を10倍段階希釈し、12ウェルプレートでコンフルエントな状態のCV-1細胞に添加してウイルスを感染させた。60分間インキュベーションした後、培地を除去し、0.8％アガロースゲルおよび0.5μg/mlのトリプシンを含有するDMEM培地を細胞に重層した。ウイルス感染から4日後にプラークの発光を確認した。すなわち、Nano-Glo Luciferase Assay System（商品名、プロメガ）の基質原液をFBS不含DMEM培地で約500倍に希釈して各ウェルに添加し、インビボイメージングシステム（IVIS Spectrum、Xenogen社製）で発光を検出した。続いて、10%ホルムアルデヒドで細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色してプラークを可視化した。
＜結果＞
　結果を図７に示した。左が細胞をクリスタルバイオレットで染色してプラークを観察した画像であり、右は同一ウェルの発光を観察した画像である。プラークの位置と同じ位置が発光していることから、ルシフェラーゼ遺伝子を発現する人工組換えロタウイルスが作製できたことが示された。この結果はロタウイルスのゲノムに外来遺伝子を挿入できることが実証するものであり、人工組換えロタウイルスはワクチンベクターとして応用可能であると考えられる。なお、自立増殖可能な外来遺伝子発現ウイルスの作製における外来遺伝子挿入部位として、NSP1遺伝子の他に、NSP3遺伝子（Montero H, Arias CF, Lopez S. Rotavirus Nonstructural Protein NSP3 Is Not Required for Viral Protein Synthesis. Journal of Virology. 2006;80(18):9031-9038. doi:10.1128/JVI.00437-06.）も使用可能と考えられる。
〔実施例５：FASTタンパク質発現ベクターおよびキャッピング酵素発現ベクターのいずれか一方による人工組換えロタウイルスの作製〕
＜材料および方法＞　実施例２＜材料および方法＞（２）で作製したサルロタウイルスSA11株の11種類の分節RNAゲノム発現ベクター、実施例１＜材料および方法＞（３）で作製したFASTタンパク質発現ベクターpCAG-p10、（４）で作製したキャッピング酵素発現ベクターpCAG-D1RおよびpCAG-D12Lを表３に記載の組み合わせで、BHK-T7/P5細胞（実施例１参照）に導入し、人工組換えロタウイルスが作製できるか否かを確認した。具体的には、トランスフェクションの前日に、BHK-T7/P5細胞を4×105個/ウェルで12ウェル培養プレートに播種し、トランスフェクション試薬（TransIT-LT1（商品名）、Mirus）を用いて各ベクターを表３に記載のDNA量でBHK-T7/P5細胞に導入した。2日後に、MA104細胞（4×104個/ウェル）を加え３日間培養した。培地および細胞を回収し、３回凍結融解して細胞溶解液を調製した。この細胞溶解液約0.5mlをトリプシン0.5μg/ml 存在下で、12ウェルプレートでコンフルエントな状態のMA104細胞に添加し、7日間培養した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
＜結果＞
　キャッピング酵素発現ベクターのみを共発現させたＡ群、FASTタンパク質発現ベクターのみを共発現させたＢ群、キャッピング酵素発現ベクターとFASTタンパク質発現ベクターの両方を共発現させたＣ群のいずれの群においても、細胞変性を観察することができた。すなわち、キャッピング酵素発現ベクターおよびFASTタンパク質発現ベクターのいずれか一方のみの共発現で、人工組換えロタウイルスを作製できることが示された。
〔実施例６：FASTタンパク質による哺乳類オルソレオウイルス（MRV）、ロタウイルス（RV）複製能の増強〕
＜材料および方法＞
　24ウェルプレートでコンフルエントな状態のVero細胞に、FASTタンパク質発現ベクター（pCAG-p10）または空ベクター（pCAG empty）を、それぞれ0、0.25、0.5、1、2μgでトランスフェクションした。トランスフェクション試薬には、TransIT-LT1（商品名、Mirus）を用いた。2時間後、培地を新鮮な5%FBS含有DMEMに交換し、MOI 0.001で、哺乳類オルソレオウイルス（MRV T1L株）またはサルロタウイルス（SA11株）を感染させた。37℃で1時間吸着させた後、PBSで細胞を6回洗浄し、MRV感染細胞は5%FBS含有DMEMで、RV感染細胞はFBS不含DMEMで培養した。感染16時間後に培地および細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して調製した細胞溶解液をプラークアッセイに供した。プラークアッセイは、実施例１と同じ方法で行った。
＜結果＞
　結果を図８に示した。（Ａ）はMRVの結果、（Ｂ）はRVの結果である。MRVでは、pCAG-p10を0.5μg以上トランスフェクションした場合、空ベクター（mock）と比べて複製能が増強した。RVでは、pCAG-p10を1μg以上トランスフェクションした場合、空ベクター（mock）と比べて複製能が増強した。これらの結果から、FASTタンパク質を発現する細胞を宿主細胞とすることにより、ウイルスの複製能が向上することが示された。
〔実施例７：サルロタウイルスおよびヒトロタウイルスのモノリアソータントロタウイルスの作製〕
　サルロタウイルスを基盤として、NSP4遺伝子分節のみヒトロタウイルスのNSP4遺伝子をもつ人工組換えロタウイルス（SA11/KUNSP4）の作製を試みた。
＜材料および方法＞
（１）ヒトロタウイルス
　ヒトロタウイルスKU株（Urasawa, S., Urasawa, T., Taniguchi, K., and Chiba, S. (1984). Serotype determination of human rotavirus isolates and antibody prevalence in pediatric population in Hokkaido, Japan. Archives of virology 81, 1-12.）を使用した。
（２）ヒトロタウイルスNSP4遺伝子を有するプラスミドの作製
　KU株のNSP4分節RNAゲノム（GenBank ACCESSION: AB022772、配列番号32）のcDNAを含むプラスミドを作製した。ウイルスから抽出した二本鎖RNAを鋳型とし、ヒトNSP4分節RNAゲノムの塩基配列に基づく特異的プライマーを用いてRT-PCRを行った。得られたRT-PCR産物（NSP4分節RNAゲノムのcDNA）を図９に示すp3E5プラスミド（3076bp、配列番号25）のT7プロモーター配列とHDVリボザイム配列の間（配列番号25の30位と31位の間）に挿入し、NSP4分節RNAゲノムの発現カセットを含むプラスミドを得た。各分節RNAゲノムの発現カセットは、各分節RNAゲノムのcDNAの5'側にT7プロモーター配列（配列番号22）、3'側にＤ型肝炎ウイルス（HDV）リボザイム配列（配列番号23）が隣接し、その下流にT7ターミネーター配列（配列番号24）が配置された構造を有する。作製したプラスミドを、pT7-NSP4KUと称する。
（３）人工組換えウイルスの作製および変異の確認
　NSP4モノリアソータントロタウイルス（SA11/KUNSP4）は、実施例２の（２）で作製した11種類の分節RNAゲノム発現ベクターにおいて、pT7-NSP4SA11に代えてpT7-NSP4KUを用いた以外は、実施例２と同じ方法で作製した。細胞変性が観察されたMA104細胞のウェルから培地と細胞を回収し、３回凍結融解して細胞溶解液を調製し、SA11/KUNSP4からウイルスゲノムRNAを抽出し、野生型SA11株および野生型KU株より抽出したウイルスゲノムRNAとともにSDS-PAGEに供した。
＜結果＞
　結果を図１１に示した。図１１から明らかなように、SA11/KUNSP4の各ゲノムRNAのバンドは、NSP4（図中g10KU）以外すべて野生型SA11株と同じ位置に確認された。一方SA11/KUNSP4のNSP4分節の位置は、野生型KU株のNSP4のバンドと同じ位置に確認された。この結果から、本発明の作製方法を用いれば、様々な動物種由来のロタウイルスの分説ゲノムRNAを自由に組み換えたリアソータントロタウイルスを作製できると考えられた。
〔実施例８：ルシフェラーゼ発現ロタウイルスを利用した抗ロタウイルス薬のスクリーニング試験〕
　実施例４で作製したルシフェラーゼ発現人工組換えロタウイルスを用いて、既知の抗ロタウイルス薬として知られるリバビリン（Smee, D.F., Sidwell, R.W., Clark, S.M., Barnett, B.B., and Spendlove, R.S. (1982). Inhibition of rotaviruses by selected antiviral substances: mechanisms of viral inhibition and in vivo activity. Antimicrobial agents and chemotherapy 21, 66-73.）によるロタウイルス増殖抑制効果の可視化を試みた。
＜材料および方法＞
　感染実験前日に、CV-1細胞を1×105個/ウェルで96ウェル培養プレートに播種した。野生型SA11株および実施例４で作製したルシフェラーゼ発現人工組換えロタウイルスをMOI 0.001でCV-1細胞に感染させた。37℃で1時間吸着させた後、培養上清を除去し、リバビリン（Sigma Aldrich）を0、1、5、10、50、100または200μMを含むDMEM（FBS不含、0.5μg/mlトリプシン含）を加え、37℃で14時間培養した。培養終了後、Nano-Glo Luciferase Assay System（商品名、プロメガ）の基質原液を培地に添加し、インビボイメージングシステム（IVIS Spectrum、Xenogen社製）で発光を検出した。
＜結果＞
　結果を図１２に示した。図１２から明らかなように、リバビリンを添加したウェルでは、リバビリン濃度に依存して発光強度が減少し、リバビリン濃度50μM以上のウェルでは、発光が観察されなかった。この結果は、ルシフェラーゼ発現人工組換えロタウイルスを用いることにより、ウイルス増殖量を簡便に可視化できることを示すものである。したがって、ルシフェラーゼ発現人工組換えロタウイルスは、未知の抗ロタウイルス薬のスクリーニングに有用であると考えられる。
〔実施例９：ロタウイルスリバースジェネティクス系の改良（１）〕
　実施例２において人工組換えロタウイルスの作製に成功したロタウイルスRG系の改良を目的に、NSP2遺伝子産物およびNSP5遺伝子産物の過剰発現系を用いて人工組換えロタウイルスの作製効率を検討した。
＜材料および方法＞
　分節RNAゲノム発現ベクター、FASTタンパク質発現ベクター、キャッピング酵素発現ベクターは、実施例２と同じものを使用した。
　NSP2発現ベクターおよびNSP5発現ベクターは、サルロタウイルスSA11株のNSP2遺伝子（GenBank ACCESSION:LC178571、配列番号18）のタンパク質コード領域DNAおよびNSP5遺伝子（GenBank ACCESSION:LC178574、配列番号21）のタンパク質コード領域DNAを、それぞれ図１０に示すpCAGGSプラスミドに挿入して作製した。各コード領域DNAは、人工遺伝子合成サービス（Eurofins Genomics）にて合成した。各合成DNAをそれぞれpCAGGSプラスミドのEcoRI切断部位に挿入して、pCAG-NSP2、pCAG-NSP5を得た。
　宿主細胞には、T7RNAポリメラーゼを安定発現するBHK-T7/P5細胞を使用した。BHK-T7/P5細胞は、CAGプロモーターの下流にT7RNAポリメラーゼをコードするDNAを挿入したpCAGGSプラスミドをBHK細胞（Baby Hamster Kidney Cells）にトランスフェクションし、抗生物質含有培地で培養して選択することにより作製した。
　トランスフェクションの前日に、BHK-T7/P5細胞を24ウェル培養プレートに播種した（2×105個/ウェル）。分節RNAゲノム発現ベクター（T7-VP1SA11、pT7-VP2SA11、pT7-VP3SA11、pT7-VP4SA11、pT7-VP6SA11、pT7-VP7SA11、pT7-NSP1SA11、pT7-NSP2SA11、pT7-NSP3SA11、pT7-NSP4SA11およびpT7-NSP5SA11）、FASTタンパク質発現ベクター（pCAG-FAST p10）、キャッピング酵素発現ベクター（pCAG-D1RおよびpCAG-D12L）、NSP2発現ベクター（pCAG-NSP2）およびNSP5発現ベクター（pCAG-NSP5）を、トランスフェクション試薬（TransIT-LT1（商品名）、Mirus）を用いて、表４に記載のDNA量でBHK-T7/P5細胞に導入した。DNA 1μgあたり2μLのトランスフェクション試薬を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　BHK-T7/P5細胞の培養には、5% FBS、100 units/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含有するDMEM培地を用い、37℃5%CO2環境下で培養した。トランスフェクションの48時間後に培地および細胞を回収した。回収した培地および細胞を３回凍結融解して細胞溶解液を調製し、サルMA104細胞（ATCC CRL-2378.1）に継代した。具体的には、前記細胞溶解液約0.5mlをトリプシン0.5μg/ml 存在下で、12ウェルプレートでコンフルエントな状態のMA104細胞に添加した。MA104細胞の培養にはFBS不含DMEM培地を使用した。継代後7日間培養し、その間に細胞変性が認められた場合に人工組換えロタウイルスが作製されたと判断した。
＜結果＞
　結果を表５に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 　ロタウイルスの11個の分節ゲノム発現プラスミドに加えて、キャッピング酵素発現ベクターとFASTタンパク質発現ベクターを共発現させたＡ群、キャッピング酵素発現ベクター、FASTタンパク質発現ベクター、NSP2発現ベクターを共発現させたＢ群、キャッピング酵素発現ベクター、FASTタンパク質発現ベクター、NSP5発現ベクターを共発現させたＣ群、キャッピング酵素発現ベクター、FASTタンパク質発現ベクター、NSP2発現ベクター、NSP5発現ベクターを共発現させたＤ群のすべての群で細胞変性が観察され、人工組換えロタウイルスを作製できることが示された。作製効率は、Ａ群と比較してＢ群が３倍、Ｃ群が等倍、Ｄ群が８倍の上昇が認められた。この結果から、NSP2遺伝子産物および／またはNSP5遺伝子産物の過剰発現は作製効率を向上させることが明らかとなった。
〔実施例１０：ロタウイルスリバースジェネティクス系の改良（２）〕
　FASTタンパク質発現ベクター、キャッピング酵素発現ベクターを使用せずにロタウイルスの作製を試みた。
＜材料および方法＞
　分節RNAゲノム発現ベクター、NSP2発現ベクター、NSP5発現ベクター、トランスフェクション試薬および宿主細胞は実施例９と同じものを使用した。トランスフェクションの前日に、BHK-T7/P5細胞を12ウェル培養プレートに播種した（4×105個/ウェル）。各ベクターを表６に記載のDNA量でBHK-T7/P5細胞に導入した。DNA 1μgあたり2μLのトランスフェクション試薬を使用した。BHK-T7/P5細胞の培養およびサルMA104細胞への継代は、実施例９と同様に行った。継代後7日間培養し、その間に細胞変性が認められた場合に人工組換えロタウイルスが作製されたと判断した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
＜結果＞
　キャッピング酵素発現ベクターとFASTタンパク質発現ベクターを宿主細胞に導入しなくても、NSP2遺伝子産物およびNSP5遺伝子産物を過剰発現させた場合、人工組換えロタウイルスを作製することができた。NSP2遺伝子産物およびNSP5遺伝子産物を宿主細胞に過剰発現させる手段としては、Ｘ群のようにNSP2発現ベクターおよびNSP5発現ベクターを別途に導入してもよく、Ｙ群のようにNSP2およびNSP5をコードする分節RNAゲノム発現ベクターの導入DNA量を増加させてもよいことが示された。特にＹ群は、ロタウイルスの11個の分節RNAゲノム発現ベクターのみを宿主細胞に導入して培養すれば、人工組換えロタウイルスが作製できることを実証したものである。
〔実施例１１：NSP4タンパクへの変異導入による人工組換え弱毒化ウイルスの作製〕
　NSP4に人工的なアミノ酸変異を導入することによる人工組換え弱毒化ロタウイルスの作製を試みた。
　＜材料および方法＞
（１）アミノ酸変異NSP4遺伝子を有するプラスミドの作製
　pT7-NSP4SA11（実施例２参照）を鋳型として、KOD-Plus-Mutagenesis Kit（商品名、東洋紡）および特異的プライマーを用いて、NSP4遺伝子（配列番号20）の55位のシトシン（C）をグリシン（G）に置換した変異NSP4遺伝子を有するプラスミドを作製した。このプラスミド（pT7-NSP4SA11-L5Sと称する）は、NSP4タンパクの5番目のロイシン（L）がセリン（S）に置換した変異型NSP4タンパク質を発現する。
（２）NSP4変異を有する人工組換えウイルスの作製
　NPS4変異を有する人工組換えロタウイルス（rsSA11/NSP4-L5S）は、実施例２の（２）で作製した11種類の分節RNAゲノム発現ベクターにおいて、pT7-NSP1SA11に代えてpT7-NSP4SA11-L5Sを用いた以外は、実施例２と同じ方法で作製した。同時に野生型人工組換えロタウイルス（野生型SA11）を実施例２と同じ方法で作製した。
（３）NSP4変異を有する人工組換えロタウイルスの複製能の確認
　12ウェルプレートでコンフルエントな状態のMA104細胞に、rsSA11/NSP4-L5Sもしくは野生型SA11をMOI 0.01で感染させた。37℃で1時間吸着させた後、PBSで細胞を1回洗浄し、トリプシン0.5μg/ml を加えたFBS不含DMEMで培養した。感染48時間後に培地および細胞を回収し、凍結融解を３回繰り返して調製した細胞溶解液をプラークアッセイに供した。プラークアッセイは、実施例１と同じ方法で行った。
＜結果＞
　結果を図１３に示した。rsSA11/NSP4-L5Sの増殖は野生型SA11に比べ8.7倍低下していた（21500000 vs 2450000）。NSP4に人工的な変異を加えることによる弱毒化ロタウイルスの作製はこれまで報告されておらず、本実施例で作製されたNSP4変異ロタウイルスは、複製能を保持した弱毒ウイルスとして優れたワクチン候補であると考えられる。
　また、図を示していないが、本発明者らは、実施例３で作製したNSP1欠失変異ロタウイルス（rsSA11/NSP1ΔC108）および別途作製したNSP3欠失変異ロタウイルスについても、野生型ロタウイルスに比べ増殖が低下していることを確認している。したがって、NSP1またはNSP3に人工的な変異を加えて作製した人工組換えロタウイルスも、複製能を保持した弱毒ウイルスとして優れたワクチン候補であると考えられる。
〔実施例１２：安定的に緑色蛍光タンパク質を発現する人工組換えロタウイルスの作製〕
　緑色蛍光タンパク質であるZsGreenを発現する組換えロタウイルスの作製を試みた
＜材料および方法＞
（１）緑色蛍光タンパク質遺伝子挿入NSP1発現プラスミドの作製
　緑色蛍光タンパク質遺伝子として、ZsGreen（以下ZsGと称する）遺伝子を用いた。pZsGreenベクター（クロンテック）のZsGタンパク質コード領域（配列番号33）をPCRで増幅し、増幅産物をpT7-NSP1SA11のNSP1遺伝子（配列番号15）の111位と112位の間に挿入して、ZsG遺伝子挿入NSP1遺伝子発現プラスミド（pT7-NSP1SA11-ZsG-Fullと称する）を作製した。さらにその変異体として、 pT7-NSP1SA11-ZsG-Fullプラスミドを元に、NSP1遺伝子の134-465位、134-855位または134-1243位をそれぞれ欠失したプラスミド（それぞれpT7-NSP1SA11-ZsG-Δ332、pT7-NSP1SA11-ZsG-Δ722、pT7-NSP1SA11-ZsG-Δ1110と称する）を作製した（図１４参照）。
（２）人工組換えウイルスの作製およびZsG発現の確認
　ZsG発現ロタウイルスは、実施例２の（２）で作製した11種類の分節RNAゲノム発現ベクターにおいて、pT7-NSP1SA11に代えてpT7-NSP1SA11-ZsG-Full、pT7-NSP1SA11-ZsG-Δ332、pT7-NSP1SA11-ZsG-Δ722またはpT7-NSP1SA11-ZsG-Δ1110を用いた以外は、実施例２と同じ方法で作製した。それぞれのZsG発現プラスミドを用いて作製したウイルスを、それぞれrsSA11/ZsG-Full、rsSA11/ZsG-Δ332、rsSA11/ZsG-Δ722およびrsSA11/ZsG-Δ1110と称する。作製したウイルスをそれぞれMA104細胞に感染させ、蛍光顕微鏡下で緑色蛍光（ZsG発現）の有無を確認した。
（３）ZsG発現ロタウイルスにおけるウイルス継代後のZsG遺伝子の保持率の確認
　24ウェルプレートでコンフルエントな状態のMA104細胞に、rsSA11/ZsG-Full、rsSA11/ZsG-Δ332、rsSA11/ZsG-Δ722またはrsSA11/ZsG-Δ1110をMOI 0.0001で感染させ、トリプシン0.5μg/ml を加えたFBS不含DMEMで培養した。感染後72時間の培養上清から得られたウイルス株をP1ストックとした。それぞれのウイルスのP1ストックの1μLを、24ウェルプレートでコンフルエントな状態のMA104細胞に感染させ、トリプシン0.5μg/ml を加えたFBS不含DMEMで72時間培養し、P2ストックを得た。同様にウイルス感染実験を繰返し、P10までのウイルスストックを得た。12ウェルプレートでコンフルエントな状態のMA104細胞に各ウイルスのP1、P5およびP10ストックをMOI 0.01でそれぞれ感染させ、5%FBS不含DMEMで培養した。感染16時間後に、細胞を10％ホルマリンで24時間固定し、ウイルス抗原を対象とした免疫染色に供した。固定後の細胞はPBSで2回洗浄し、0.1%Triton-X-100で細胞膜を透過させ、ウサギ抗ロタウイルスNSP4抗体および、抗ウサギIgG抗体-Alexa594コンジュゲートを反応させ、ウイルス抗原の検出を試みた。免疫染色後の細胞は、蛍光顕微鏡による観察を行い、ウイルス抗原陽性細胞におけるZsG発現率を測定した。
＜結果＞
　結果を図１５に示した。rsSA11/ZsG-FullにおけるZsGの発現率は、P1が100%、P5が57.1%、P10が8.6%であり、継代を繰り返すごとにZsGの発現が低下することが明らかとなった。一方、rsSA11/ZsG-Δ332、rsSA11/ZsG-Δ722、rsSA11/ZsG-Δ1110はいずれも、P1、P5、P10とも99-100%のZsG発現率を示し、NSP1遺伝子を332-1110塩基欠失させることでZsG遺伝子が安定的に保持されることが明らかになった。
〔実施例１３：哺乳類オルソレオウイルスリバースジェネティクス系の改良〕
　ロタウイルスのNSP2およびNSP5と同じ機能を有する哺乳類オルソレオウイルのμNSおよびσNSを共発現させることにより、人工組換え哺乳類オルソレオウイルスの作製効率が向上するか検討した。
＜材料および方法＞
（１）μNS発現ベクターおよびσNS発現ベクターの作製
　μNS発現ベクターおよびσNS発現ベクターは、哺乳類オルソレオウイルスT1L株のμNS遺伝子（表１のM3遺伝子、GenBank ACCESSION:AF174382、配列番号6）のタンパク質コード領域DNAおよびσNS遺伝子（表１のS3遺伝子、GenBank ACCESSION:M14325、配列番号9）のタンパク質コード領域DNAを、それぞれ図１０に示すpCAGPMプラスミドに挿入して作製した。各コード領域DNAは、人工遺伝子合成サービス（Eurofins Genomics）にて合成した。各合成DNAをそれぞれpCAGPMプラスミドのBglII切断部位（配列番号28の1753位と1754位の間）に挿入して、pCAG-μNST1L（哺乳類オルソレオウイルスμNS発現ベクター）およびpCAG-σNST1L（哺乳類オルソレオウイルスσNS発現ベクター）を得た。
（２）人工組換えウイルスの作製
　トランスフェクションの前日に、BHK-T7/P5細胞を2×105個/ウェルで24ウェル培養プレートに播種した。実施例１で作製した分節RNAゲノム発現ベクター（pT7-L1-M2T1L、pT7-L2-M3T1L、pT7-L3-S3T1LおよびpT7-S1-S2-S4-M1T1L）各0.4μg、μNS発現ベクター（pCAG-μNST1L）および／またはσNS発現ベクター（pCAG-σNST1L）各0.4μgを、トランスフェクション試薬（TransIT-LT1（商品名）、Mirus）を用いてBHK-T7/P5細胞に導入した。DNA 1μgあたり2μgのトランスフェクション試薬を使用した。BHK-T7/P5細胞の培養には、5% FBS、100units/mlペニシリンおよび100μg/mlストレプトマイシンを含有するDMEM培地を用い、37℃5%CO2環境下で培養した。トランスフェクションの48時間後に培地および細胞を回収した。回収した培地および細胞を３回凍結融解したものをウイルス試料としてプラークアッセイ（実施例１参照）に供し、ウイルスタイターを測定した。
＜結果＞
　MRV T1L株の４種の分節RNAゲノム発現ベクター（pT7-L1-M2T1L、pT7-L2-M3T1L、pT7-L3-S3T1LおよびpT7-S1-S2-S4-M1T1L）のみを導入した細胞のウイルスタイターと比較して、μNS発現ベクターおよびσNS発現ベクターを共導入した細胞のウイルスタイターは約8.2倍に増加した。また、μNS発現ベクターのみを共導入した細胞のウイルスタイターは約6.4倍に増加した。この結果から、μNS発現ベクターもしくはμNS発現ベクターおよびσNS発現ベクターと、分節RNAゲノム発現ベクターとを宿主細胞に共導入することにより、人工組換えウイルスの作製効率が大幅に向上することが示された。
　なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。また、本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

Claims (20)

  1. 　レオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法であって、
    （１）ＦＡＳＴタンパク質発現ベクターおよび／またはキャッピング酵素発現ベクターを宿主細胞に導入する工程、
    （２）ウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された一本鎖ＲＮＡのセットを宿主細胞に導入する工程、および
    （３）宿主細胞を培養する工程
    を含むことを特徴とする作製方法。
  2. 　人工組換えウイルスが、分節ＲＮＡゲノムの少なくとも１つに変異が導入されていること、および／または、分節ＲＮＡゲノムの少なくとも１つに外来遺伝子が組み込まれていることを特徴とする請求項１に記載の作製方法。
  3. 　ＦＡＳＴタンパク質が、ネルソンベイレオウイルスのｐ１０、トリレオウイルスのｐ１０、ブルームウイルスのｐ１３、爬虫類レオウイルスのｐ１４、ヒヒレオウイルスのｐ１５、ソウギョレオウイルスのｐ１６およびタイセイヨウサケレオウイルスのｐ２２から選択される少なくとも１種である請求項１または２に記載の作製方法。
  4. 　キャッピング酵素が、宿主細胞の細胞質内で複製するＤＮＡウイルスまたはＲＮＡウイルスのキャッピング酵素である請求項１～３のいずれかに記載の作製方法。
  5. 　分節ＲＮＡゲノムの発現カセットが、ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、ウイルス分節ＲＮＡゲノムをコードするＤＮＡおよび自己切断作用を有するリボザイムをコードするＤＮＡを含むことを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載の作製方法。
  6. 　ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがＴ７プロモーターであり、宿主細胞が組換えＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現細胞であることを特徴とする請求項５に記載の作製方法。
  7. 　リボザイムが、Ｄ型肝炎ウイルスリボザイムである請求項５または６に記載の作製方法。
  8. 　宿主細胞とウイルス高感受性細胞を共培養することを特徴とする請求項１～７のいずれかに記載の作製方法。
  9. 　レオウイルス科に属する人工組換えウイルスが、人工組換えロタウイルスである請求項１～８のいずれかに記載の作製方法。
  10. 　宿主細胞にロタウイルスＮＳＰ２遺伝子産物および／またはロタウイルスＮＳＰ５遺伝子産物を過剰発現させることを特徴とする請求項９に記載の作製方法。
  11. 　人工組換えロタウイルスが、外来遺伝子を発現する人工組換えロタウイルスであり、ＮＳＰ１をコードする分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクターに代えて、ＮＳＰ１をコードする分節ＲＮＡゲノムの発現カセットのＮＳＰ１遺伝子内に外来遺伝子が挿入され、かつ、ＮＳＰ１遺伝子の１００～１５５０塩基が欠失している発現カセットを含むベクターを用いることを特徴とする請求項９または１０に記載の作製方法。
  12. 　ＦＡＳＴタンパク質を発現する宿主細胞にウイルスを感染させて培養することを特徴とするウイルス複製促進方法。
  13. 　ＦＡＳＴタンパク質が、ネルソンベイレオウイルスのｐ１０、トリレオウイルスのｐ１０、ブルームウイルスのｐ１３、爬虫類レオウイルスのｐ１４、ヒヒレオウイルスのｐ１５、ソウギョレオウイルスのｐ１６およびタイセイヨウサケレオウイルスのｐ２２から選択される少なくとも１種である請求項１２に記載の方法。
  14. 　ＮＳＰ１、ＮＳＰ３およびＮＳＰ４から選択される少なくとも１つの機能を抑制する変異が導入されていることを特徴とする人工組換えロタウイルス。
  15. 　外来遺伝子を発現することを特徴とする人工組換えロタウイルス。
  16. 　リアソータントであることを特徴とする人工組換えロタウイルス。
  17. 　請求項１４～１６のいずれかに記載の人工組換えロタウイルスを含有するワクチン。
  18. 　ＦＡＳＴタンパク質およびキャッピング酵素を発現しない宿主細胞に、ロタウイルスの１１個の分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された１１個の一本鎖ＲＮＡのセットを導入し、培養することを特徴とする人工組換えロタウイルスの作製方法。
  19. 　宿主細胞にロタウイルスＮＳＰ２遺伝子産物および／またはロタウイルスＮＳＰ５遺伝子産物を過剰発現させて培養することを特徴とする請求項１８に記載の作製方法。
  20. 　レオウイルス科に属する人工組換えウイルスの作製方法であって、ウイルスの各分節ＲＮＡゲノムの発現カセットを含むベクター、または該発現カセットから転写された一本鎖ＲＮＡのセットが導入された宿主細胞に、ウイルス感染細胞内のウイルス封入体形成に関与する遺伝子産物を過剰発現させて培養することを特徴とする作製方法。
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