CN117947096A - 一种羊轮状病毒重组质粒、反向遗传病毒学拯救系统及其构建方法和应用 - Google Patents
一种羊轮状病毒重组质粒、反向遗传病毒学拯救系统及其构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种羊轮状病毒重组质粒、反向遗传学病毒拯救系统及其构建方法和应用，属于分子生物学和生物医学领域。本发明将重组质粒、辅助质粒pCMV‑868CP和Opti‑MEM混合，然后与TransIT‑LT1转染试剂混合转染至BHK‑T7/9细胞中；将MA104N*V工程细胞株与转染的BHK‑T7/9细胞混合共培养，拯救得到羊轮状病毒重组病毒株。本发明通过反向遗传学体系，成功拯救出携带或不携带分子标记的轮状病毒(LLR)，以及重组轮状病毒(rLLR)。本发明拯救得到的重组病毒为外源基因表达奠定了基础，为轮状病毒抗病毒药物、疫苗中和抗体、联合疫苗及基因治疗等的研究和应用提供了工具和思路。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学和生物医学领域，尤其涉及一种羊轮状病毒重组质粒、反向遗传学病毒拯救系统及其构建方法和应用。
背景技术
轮状病毒(Rotavirus，RV)属于呼肠孤病毒科(Reoviridae)，通过粪口途径传播，主要感染小肠上皮细胞，轮状病毒属于双链(ds)RNA病毒，其基因组由11条分节段的dsRNA组成，随着分子生物学技术的进步，许多轮状病毒株11条dsRNA的核苷酸序列被获得，来自不同毒株的序列显示出了共同特征。轮状病毒的11条dsRNA共编码12种蛋白，包括6种结构蛋白(VP1～VP4，VP6和VP7)和6种非结构蛋白(NSP1～NSP6)，它们各自在轮状病毒的感染、复制、表达及组装过程中发挥不同的作用。
当应用于病毒时，“反向遗传学”描述了一种从纯化的DNA或RNA生成病毒的策略。这种方法的优点是操纵用于转染DNA或RNA收获具有感染能力的重组或重配病毒，这一过程通常又被称为病毒拯救(rescue of virus)。几乎所有的基因工程技术均以DNA为操作对象，因此，DNA病毒的反向遗传学技术比较容易。相对而言，RNA病毒的反向遗传学技术则更为复杂，而且不同RNA病毒的反向遗传学技术差异也很大。呼肠孤病毒科病毒由多层衣壳蛋白组成复杂的三维空间结构，其基因组由10～12条分节段的双链RNA组成，病毒基因组的复杂性使得呼肠孤病毒科病毒的感染性克隆构建十分困难。其次，各基因组节段具有特异性分配特点，并且对外来的同源基因节段具有排斥性，这一特性也限制了对呼肠孤病毒科病毒基因组的修饰和操作。因此，呼肠孤病毒科病毒反向遗传操作系统的建立在所有RNA病毒中难度是最大的。
NSP1已被证明对细胞培养中病毒的复制不是必须的。NSP1可以耐受外源基因的插入，并且具有作为外源基因表达载体的潜力。但是，NSP1在感染细胞中的表达水平较低，并且易发生蛋白酶体降解，因而，外源基因的表达量也不高。此外，以改变NSP1 ORF的方式插入外源基因，可能会损害NSP1蛋白作为干扰素拮抗剂的功能，从而影响病毒的生物学特性。NSP3的C末端插入荧光报告基因的第二代报告病毒，NSP3的ORF被编码NSP3和报告基因的融合基因取代。其中，已有六种荧光报告蛋白(UnaG、mKate、mRuby、TagBFP、CFP、YFP)分别被融合到NSP3 ORF的C末端。在这些报告病毒中，报告基因通过T2A连接到NSP3的ORF，T2A可实现对NSP3和报告基因的“终止-再启动”表达，因此，不影响NSP3和报告基因的功能。
2017年，Kanai等人建立了猴SA11株的反向遗传学系统。此后各国实验室大多利用基于SA11株的反向遗传学技术开展的轮状病毒的各方面研究。随之，人类毒株KU、Odelia、CDC-9、HN126，猴株RRV，禽株PO-13和牛株RF的反向遗传学系统也相继被成功建立。2018年，Komoto等人的实验室报道了仅转染表达基因组的11个T7拯救质粒可以更高效拯救病毒，前提是要将表达NSP2和NSP5的质粒提高3～5倍。2020年，美国实验室John T等人建立了“12质粒系统”，除了表达轮状病毒基因组的11个T7拯救质粒外，增加了非洲猪瘟病毒NP868R加帽酶质粒。随后美国另一实验室Liliana等人通过构建融合表达加帽酶和T7 RNA聚合酶的辅助质粒，进一步优化了“12质粒系统”。遗憾的是国内关于轮状病毒反向遗传学的研究严重不足。同时，基于轮状病毒基因组的复杂性和对外来的同源基因节段的排斥性，我国还未见RV反向遗传学平台建立成功的报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种羊轮状病毒重组质粒、反向遗传学病毒拯救系统及其构建方法和应用，搭建以LLRV为骨架，实现轮状病毒遗传特征“定制式修订”或作为表达外源目的蛋白的载体的反向遗传学平台。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种羊轮状病毒重组质粒，所述重组质粒为pT7-VP1/LLRV、pT7-VP2/LLRV、pT7-VP3/LLRV、pT7-VP4/LLRV、pT7-VP6/LLRV、pT7-VP7/LLRV、pT7-NSP1/LLRV、pT7-NSP2/LLRV、pT7-NSP3/LLRV、pT7-NSP4/LLRV和pT7-NSP5/LLRV；
所述pT7-VP1/LLRV的序列如SEQ ID NO:108所示；所述pT7-VP2/LLRV的序列如SEQID NO:109所示；所述pT7-VP3/LLRV的序列如SEQ ID NO:110所示；所述pT7-VP4/LLRV的序列如SEQ ID NO:111所示；所述pT7-VP6/LLRV的序列如SEQ ID NO:112所示；所述pT7-VP7/LLRV的序列如SEQ ID NO:113所示；所述pT7-NSP1/LLRV的序列如SEQ ID NO:114所示；所述pT7-NSP2/LLRV的序列如SEQ ID NO:115所示；所述pT7-NSP3/LLRV的序列如SEQ ID NO:116所示；所述pT7-NSP4/LLRV的序列如SEQ ID NO:117所示；所述pT7-NSP5/LLRV的序列如SEQID NO:117所示；
可将所述重组质粒中的pT7-NSP1/LLRV、pT7-NSP3/LLRV、pT7-NSP4/LLRV和pT7-NSP5/LLRV用突变质粒进行替换；所述突变质粒为pT7-muNSP1/LLRV、pT7-muNSP3/LLRV、pT7-muNSP4/LLRV和pT7-muNSP5/LLRV，该突变用于区分与原轮状病毒的区别；
所述pT7-muNSP1/LLRV的序列是将所述pT7-NSP1/LLRV的NSP1/LLRV序列第1349和1363位分别由C和T突变为T和C；所述pT7-muNSP3/LLRV的序列是将所述pT7-NSP3/LLRV的NSP3/LLRV序列第799和811位分别由T和T突变为C和C；所述pT7-muNSP4/LLRV的序列是将所述pT7-NSP4/LLRV的NSP4/LLRV序列第395和404位分别由A和A突变为G和T；所述pT7-muNSP5/LLRV的序列是将所述pT7-NSP5/LLRV的NSP5/LLRV序列第298和306位分别由T和A突变为C和G。
本发明还提供了一种羊轮状病毒的反向遗传学病毒拯救系统，包括所述的重组质粒、辅助质粒pCMV-868CP、MA104或MA104 N*V工程细胞株和BHK-T7/9细胞。
优选的，所述辅助质粒pCMV-868CP以CMV为启动子，以(G4S)4为连接肽，融合表达非洲猪瘟病毒加帽酶NP868R和T7 RNAP。
优选的，所述MA104 N*V工程细胞株为基因组整合有BVDV的N蛋白和PIV5的V蛋白的细胞株。
本发明还提供了一种所述的羊轮状病毒的反向遗传学病毒拯救系统拯救病毒的方法，包括以下步骤：
将所述的重组质粒、辅助质粒pCMV-868CP和Opti-MEM混合，然后与TransIT-LT1转染试剂混合静置后转染至BHK-T7/9细胞中；培养、清洗后将MA104 N*V工程细胞株与转染的BHK-T7/9细胞混合共培养，拯救得到羊轮状病毒重组病毒株。
优选的，所述重组质粒、辅助质粒pCMV-868CP和Opti-MEM混合比例为10～14μg：1～2μg：200～300μL；
所述TransIT-LT1转染试剂、重组质粒、辅助质粒pCMV-868CP的比例为20～35μL：10～14μg：1～2μg；所述混合静置的时间为20～40min；
所述培养使用DMEM完全培养基，所述清洗使用DMEM不完全培养基，所述培养的时间为42～54h；所述共培养的时间为2～5天。
本发明还提供一种所述的羊轮状病毒重组质粒或所述羊轮状病毒的反向遗传学病毒拯救系统在构建表达外源蛋白的重组病毒或改造轮状病毒遗传特征中的应用。
优选的，将所述表达外源蛋白的基因片段连接到所述的重组质粒上构建得到表达外源蛋白的重组病毒。
本发明还提供一种所述的羊轮状病毒重组质粒或所述羊轮状病毒的反向遗传学病毒拯救系统在制备疫苗、药物和诊断试剂开发中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过沉默突变分别在LLRVNSP1、NSP3、NSP4和NSP5节段中引入EcoRV、MluI和BamHI酶切位点序列，构建得到突变质粒；并构建了表达LLRVVP1～VP4、VP6、VP7、NSP1～NSP5蛋白的11个重组质粒的LLRV感染性克隆系统，成功拯救出携带分子标记的rLLR，为从分子水平上修饰或改造LLRV基因组提供了有效的技术支持，也为深入开展轮状病毒致病机制、载体改造和新型疫苗、药物和诊断试剂开发等研究奠定了技术基础。
本发明成功构建了RV感染性克隆系统的辅助质粒pCMV-868CP，显著提高了BHK-T7/9细胞中T7启动子质粒的表达效率。
本发明成功构建了可以稳定表达BVDV-N和PIV5-V的MA104 N*V工程细胞株，该细胞株可以起到IFN-Ⅰ应答拮抗的目的，有利于轮状病毒的感染，提高了感染性克隆系统的拯救效率。
本发明成功拯救了能够在P5代以内稳定表达NLuc的报告病毒rLLR/NSP3-NLuc，且NLuc萤光素酶的表达量和病毒滴度呈线性相关关系，为轮状病毒抗病毒药物筛选和疫苗中和抗体的研究奠定了基础。
本发明在LLRVNSP3载体中以P2A为连接肽，构建重组病毒rLLR/NSP3-CoV2/RBD，成功拯救了能够在P5代以内稳定表达SARS-CoV2 RBD蛋白的重组病毒rLLR/NSP3-CoV2/RBD，为进一步探索开发轮状病毒和新冠病毒联合疫苗提供了思路。
本发明成功拯救了重组病毒rLLR/NSP1-EGFP，其能够稳定表达EGFP蛋白，与轮状病毒疫苗株(LLRV)具有相似的生长曲线。
本发明以我国广泛使用的轮状病毒疫苗株(兰州生物制品研究所生产的罗特威疫苗)为骨架，构建和改造轮状病毒，其安全性和有效性得以充分保障。
附图说明
图1是LLRV基因组感染性克隆质粒构建示意图(注：11个LLRV基因组片段的全长cDNA位于含有pT7启动子的质粒内，上游与T7启动子连接，下游与HDV核酶连接，确保LLRV(+)RNA全长具有真实的5'和3'末端)；
图2是pCMV-868CP辅助质粒构建的示意图；
图3是pT7-LIET-GFP质粒转染BHK-T7/9细胞12h后GFP的表达结果(A.单独转染pT7-LIET-GFP质粒；B.共同转染pT7-LIET-GFP和pCMV-868CP质粒(10×))；
图4是plvx-BVDV-N-PIV5-V质粒构建的示意图；
图5是嘌呤霉素筛选的结果(注：A.正常MA104细胞；B.完全抗嘌呤霉素的MA104 N*V细胞)；
图6是MA104 N*V细胞中STAT1和IRF3的表达鉴定结果图；
图7是MA104细胞的形态图(10×)；
图8是rLLR的dsRNA-PAGE硝酸银染色鉴定结果；
图9是rLLRNSP1，NSP3，NSP4和NSP5基因RT-PCR扩增和酶切鉴定结果；
图10是wtLLR与rLLR稀释10-5后的间接免疫荧光图(10×)；
图11是rLLR与wtLLR按照MOI 0.01PFU/cell接种MA104细胞的生长动力学特性(注：A.滴度；B.基因组拷贝数)；
图12是pT7-NSP3-P2A-Nluc/LLR和pT7-NSP3-P2A-RBD/LLR质粒的示意图；
图13是rLLR/NSP3-NLuc和rLLR/NSP3-CoV2/RBD病毒拯救后MA104细胞的形态(10×)；
图14是重组病毒rLLR/NSP3-NLuc的遗传稳定性鉴定(注：A.dsRNA-PAGE的硝酸银染色；B.NSP3基因RT-PCR扩增；C.荧光素酶活性的测定)；
图15是重组病毒rLLR/NSP3-CoV2/RBD的遗传稳定性鉴定(注：A.dsRNA-PAGE的硝酸银染色；B.NSP3基因RT-PCR扩增；C.CoV2/RBD蛋白的westernblot；D.间接免疫荧光(60×))；
图16是rLLR/NSP3-NLuc、rLLR/NSP3-CoV2/RBD和rLLR/NSP1-EGFP与亲本株rLLR稀释10-4后的间接免疫荧光(10×)；
图17是rLLR/NSP3-NLuc、rLLR/NSP3-CoV2/RBD和rLLR/NSP1-EGFP与亲本株rLLR按照MOI 0.01PFU/cell接种MA104细胞的生长动力学特性(注：A.滴度；B.基因组拷贝数)；
图18是NSP1片段插入EGFP的pT7-NSP1-EGFP/LLR示意图；
图19是rLLR/NSP1-EGFP感染MA104的细胞病变及荧光观察结果(10×)；
图20是P10代rLLR/NSP1-EGFP的IFA鉴定图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
LLRV是我国兰州生物制品研究所研制的婴幼儿用于预防轮状病毒感染所致急性胃肠炎的轮状病毒减毒疫苗。该疫苗株来源于羊轮状病毒在细胞上连续传代后获得的减毒株。
细胞培养：MA104细胞在添加10％胎牛血清和1％青链霉素溶液的DMEM培养基中传代培养；HEK-293T细胞在添加10％胎牛血清和1％青链霉素溶液的DMEM培养基中传代培养；BHK-T7/9细胞在添加10％胎牛血清，10％胰蛋白示磷酸盐肉汤(Tryptose PhosphateBroth，TPB)，1％非必需氨基酸溶液(Non-Essential Amino Acids，NEAA)和1％L-谷氨酰胺(L-glutamine，L-Gln)的DMEM培养基中传代培养，并每隔一代加入600μg/mL潮霉素B传代培养。
实施例1轮状病毒传代培养
1.病毒激活：胰蛋白酶水解轮状病毒刺突蛋白VP4后形成VP5*和VP8*，有利于病毒吸附和入胞，并增强病毒的感染力。因此，将在-80℃冰箱保存的病毒液(LLRV)融化后，加入终浓度为10μg/mL的胰蛋白酶，37℃激活1h。
2.病毒吸附：将已长成致密单层的MA104细胞用PBS缓冲液轻洗3次，而后将激活的病毒液接种到单层MA104细胞上，5％CO2培养箱中吸附2h，期间每15min混匀一次。
3.维持培养：吸附2h后，吸弃培养瓶中的吸附液，用PBS缓冲液清洗2次，并加入胰蛋白酶终浓度为2μg/mL的DMEM维持液培养7～9d，逐日观察，待细胞病变达80％以上时收获病毒，反复冻融3次，分装成小管于-80℃冰箱保存备用。
实施例2轮状病毒全基因组扩增
对于LLRV的全基因组扩增，首先，采用5'/3'RACE对每条基因组的5'/3'末端进行确认。其次，再根据5'/3'RACE结果，设计LLRV特异性引物进行基因组全长扩增，对于片段较长的VP1(3302bp)、VP2(2687bp)和VP3(2592bp)片段，分别采用4对、4对和3对引物进行RT-PCR扩增，其余8个片段均采用1对引物进行RT-PCR扩增。
1.病毒RNA的提取
将LLRV病毒液置于冰上完全溶解，4℃，3000rpm，离心10min去除细胞碎片，参照病毒RNA提取试剂盒说明书提取LLRV的基因组，置于-20℃保存。
2.解链
将步骤1中提取的LLRV dsRNA置于PCR仪中，98℃5min，解链后ssRNA不稳定，需立即置于冰上。
3.ssRNA3'末端加Poly(A)尾，反应体系如下：
表1ssRNA3'末端加Poly(A)尾的反应体系成分
| 组分 | 用量(μL) | 终浓度 |
| 10×Poly(A)Polymerase | 6 | 1× |
| E.coli Poly(A)Polymerase(5U/μL) | 6 | 0.05-0.5U/μL |
| ATP(10mM) | 3 | 0.5mM |
| ssRNA | 60 | 500ng/μL |
置于PCR仪中，37℃反应30min。
4.磁性分离法从总RNA中分离poly(A)+RNA
参照VAHTS mRNA Capture Beads说明书对poly(A)+RNA进行筛选，具体步骤如下：
向RNase-free离心管中加入200μL加A尾的mRNA，加入500μL Buffer VL，涡旋混匀15～30sec，将混合液瞬时离心收集至管底。
将FastPure RNA Columns置于Collection Tubes 2mL中，转移上述混合液至FastPure RNA Columns中，12,000rpm离1min，弃滤液。
向FastPure RNA Columns中加入600μL Buffer RW，12,000rpm离心30sec；弃滤液。
重复步骤3。
空柱12,000rpm离心2min。
小心将FastPureRNA Columns转移至新的1.5mL RNase-free Collection Tubes中，向膜中央悬空加入30μL的RNase-free ddH2O，室温放置1min，12,000rpm离心1min。
弃去FastPure RNA Columns，将poly(A)+RNA置于-20℃保存备用。
5.5'/3'RACE
参考兰州生物制品研究所上传至GenBank的LLRV基因组序列(登录号：JQ013502～JQ013504，JQ013506，JQ031150，HM800948，JQ031145～JQ031148，JQ031151)，使用诺唯赞生物5'/3'RACE GSP引物在线设计软件Primer design(appbi.vazyme.com:8085)，对每个基因片段的5'/3'末端随机设计1～2条特异性引物，分别命名为LLRV-片段名称-51(52)/31(32)，引物序列见表2，交由擎科生物合成。
表2LLRV 5'/3'末端序列扩增引物
(1)预变性反应体系如下:RNA100 ng，5'GSP Primer(5'RACE)和3'CDS Primer(3'RACE)2μL，dNTP Mix2μL，RNase-free ddH2O补足至13μL。
置于PCR仪中，70℃反应3min，立即置于冰上。
(2)反转录反应体系如下表3：
表3反转录反应体系成分
置于PCR仪中，42℃反应90min，70℃反应15min，立即置于冰上。
(3)PCR扩增反应体系如下：5'RACE-Ready cDNA2.5μL，5'GSP(10μM)1μL，10×Universal Primer Mix5μL，2×PCR Mix25μL，ddH2O16.5μL，Total 50μL。
PCR扩增反应条件如下：预变性(98℃，1min)，变性(98℃，10s)，退火(68℃，15s)，延伸(72℃，3min)，循环次数25次，总延伸(72℃，5min)。
(4)巢式PCR(Nested PCR)扩增
取5μL步骤(3)中的扩增产物为模板，使用试剂盒中自带的Nested Primer进行巢式PCR扩增，反应体系如下：步骤(3)中的扩增产物5μL，5'/3'GSP(10μM)1μL，NestedPrimer1μL，2×PCR Mix25μL，ddH2O18μL，Total50μL.
PCR扩增反应条件同步骤(3)。
(5)琼脂糖凝胶电泳及扩增产物胶回收
按照5μL PCR产物+1μL 6×Loading buffer的比例混匀后，将50μL PCR产物和2μLDNA Marker一起点样于1.5％的琼脂糖凝胶中进行电泳，120V电压电泳30min，在凝胶成像仪中照胶、观察结果，对阳性产物切胶并进行凝胶回收纯化。
(6)连接反应
将上述纯化产物，按照[0.05×片段碱基对数]ng的最适使用量，连接pCE2-TA/Blunt-Zero载体，配置体系如下：5×TA/Blunt-Zero Cloning Mix1μL，胶回收产物1～4μL，ddH2O补足至5μL
轻弹管底混匀，低速瞬时离心收集所有液体于0.2mL离心管底，置于PCR仪25℃，5min。
(7)细胞转化
①从-80℃冰箱取出的Trelief TM 5α感受态细胞，放置冰上解冻；
②向Trelief TM 5α感受态细胞中加入5μL步骤2.2.5的连接产物，放入冰里，静置5min；
③42℃金属浴45s后迅速放入冰浴中，静置2min；
④加入500μL未加抗生素的LB液体培养基，混匀得到复苏液，取部分转化产物涂于kan+LB培养基平板上，用L型细胞涂抹棒均匀涂布，液体晾干后，将培养皿倒置放37℃温箱过夜。
(8)挑取克隆、质粒小提和测序
次日分别挑选长势良好的克隆菌落至1mL kan+液体LB培养基中，于37℃恒温摇床，180rpm震荡培养7h，参照质粒小提试剂盒说明书对菌液进行质粒小提，送擎科生物测序。
6.RT-PCR扩增
根据5'/3'末端RACE扩增的结果，使用Snapgene软件设计LLRV基因组全长扩增引物，引物序列见表4，由擎科生物合成，利用步骤1提取的LLRVRNA进行RT-PCR扩增。
表4LLRV全基因组RT-PCR扩增引物
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(1)解链变性反应体系如下：Forward Primer(10μM)0.5μL，Reverse Primer(10μM)0.5μL，ddH2O 2μL，RNA模板4μL，Total 7μL。
置于PCR仪中，98℃5min，迅速放置于冰上备用。
(2)一步法RT-PCR反应体系如下：5×Buffer 6μL，10μM dNTPS1μL，Enzyme Mix1μL，变性产物7μL，ddH2O15μL，Total 30μL。
(3)RT-PCR反应程序：
表5RT-PCR反应程序
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参照实施例2中5.5'/3'RACE的操作，对RT-PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳、胶回收、连接、转化、挑菌、摇菌和质粒小提，送擎科生物测序。对测序正确的阳性克隆质粒pCE2 TA/Blunt-VP4/LLRV、pCE2 TA/Blunt-VP6/LLRV、pCE2 TA/Blunt-VP7/LLRV、pCE2 TA/Blunt-NSP1/LLRV、pCE2 TA/Blunt-NSP2/LLRV、pCE2 TA/Blunt-NSP3/LLRV、pCE2 TA/Blunt-NSP4/LLRV和pCE2 TA/Blunt-NSP5/LLRV，-20℃保存。
(7)序列结果分析
利用Snapgene软件将每个片段5'/3'RACE测序结果和RT-PCR扩增测序结果进行拼接，共得到11条完整、5'/3'末端准确的LLRV基因组测序结果。
实验结果：以LLR dsRNA基因组为模板，将11个片段5'/3'RACE和RT-PCR扩增克隆测序的结果进行拼接，经SnapGene软件比对分析发现，本研究获得的LLR的全基因组序列与兰州生物制品研究所上传至GenBank(登录号：JQ013502～JQ013504，JQ013506，JQ031150，HM800948，JQ031145～JQ031148，JQ031151)的LLR全基因组序列共有20个核苷酸位点不同，分别位于片段VP2，VP3，NSP3和NSP5的5'末端和片段VP1，VP4，VP7和NSP1的3'末端，ORF区序列没有差异，具体不同位点的序列信息见表6。本研究获得的LLR的全基因组序列已上传至GenBank，登录号为：OQ603388-OQ603398。
表6LLRV毒株5'/3'末端不同核苷酸位点序列
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实施例3LLRV 11个感染性克隆质粒的构建
为了保证LLRV的感染性克隆质粒在转录时能产生精确的5'和3'末端，在LLRV每条基因组的5'末端连接T7启动子，3'末端连接HDV核酶，质粒构建示意图见图1。
1.引物设计
首先，以pT7-VP1/LLR质粒为载体片段PCR扩增的模版，设计载体扩增引物ZT-pT7-LLR-F/R。其次，对于插入片段较长的VP1(3302bp)、VP2(2687bp)和VP3(2592bp)，由金唯智科技有限公司合成目的基因质粒pUC-VP1/LLRV、pUC-VP2/LLRV、pUC-VP3/LLRV为模版。其余8个片段，均以实施例2中6.RT-PCR扩增制备的pCE2 TA/Blunt-VP4/LLRV、pCE2 TA/Blunt-VP6/LLRV、pCE2 TA/Blunt-VP7/LLRV、pCE2 TA/Blunt-NSP1/LLRV、pCE2 TA/Blunt-NSP2/LLRV、pCE2 TA/Blunt-NSP3/LLRV、pCE2 TA/Blunt-NSP4/LLRV和pCE2 TA/Blunt-NSP5/LLRV质粒为模板，设计插入片段的PCR扩增引物，分别命名为CR-LLRV-片段名称-F/R，引物序列见表7(小写序列为5'端添加的重组序列)，交由擎科生物合成。
表711个LLRV感染性克隆质粒构建的PCR扩增引物
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2.PCR反应体系如下：2×Phanta Max Master Mixs 25μL，F(10μM)1μL，R(10μM)1μL，质粒DNA 1μL，ddH2O 22μL，Total 50μL。
扩增条件：95℃3min；95℃15s，55℃15s，72℃1min/kb；共35个循环；72℃5min。参照实施例2中5.5'/3'RACE中的步骤(5)操作进行琼脂糖凝胶和胶回收纯化。
3.同源重组
将线性化载体和插入片段分别按照0.03pmol和0.06pmol的最佳比例，于冰上配置反应体系：线性化载体0.03pmol，插入片段0.06pmol，5×CE Buffer4μL，ExnaseⅡ2μL，ddH2O补足至20μL。
使用移液器轻轻吸打混匀，为防止片段断裂，切勿震荡混匀，置于PCR仪中，37℃反应30min，立即置于冰上冷却。
4.转化、摇菌和菌液PCR扩增
利用TreliefTM 5α感受态细胞对同源重组产物进行转化，每个转化产物随机挑取5个菌落进行摇菌，并用载体通用引物T7-F和T7ter-R进行菌液PCR快速扩增，反应体系如下：2×Rapid TaqMaster Mix10μL，T7-F(10μM)1μL，T7ter-R(10μM)1μL，菌液1μL，ddH2O 7μL。
95℃3min，(95℃15sec，55℃30sec，72℃15sec/kb)×35，72℃5min；将琼脂糖凝胶电泳中位置正确的阳性菌液，用50％甘油与菌液按照1:1的比例保菌，剩余菌液质粒小提后送擎科生物测序。
5.质粒大提
对于测序鉴定正确的阳性质粒，用步骤4中对应编号的保存菌液按照1：1000的比例接种300mL Amp+的LB液体培养基，230rpm过夜震荡培养。次日，用QIAGEN去内毒素质粒提取试剂盒进行质粒大提，具体操作步骤如下：
①实验准备：将RNaseA和lyseBlue加到BufferP1中颠倒混匀并储存于2～8℃；在4℃预冷Buffer P3；制备含70％乙醇的去内毒素无菌水。
②将300mL过夜培养的菌液倒入广口离心瓶中配平，4℃，6000rpm离心30min，将菌体沉淀至瓶底，弃上清，倒置于吸水纸上。
③吸8mL BufferP1加入离心瓶中,用10mL移液管将菌体沉淀吹打混匀,并移入50mL离心管中，再加2mL Buffer P1吹洗瓶身,移入50mL离心管中，此时菌体应变得粘稠。
④向离心管中加入10mL Buffer P2，温和上下翻转混匀，此时菌体应为蓝色，室温静置5min。
⑤向离心管中加入10mL预冷的BufferP3，温和上下翻转混匀，此时菌体应为白色絮状，室温静置10min使菌体充分裂解，4℃，8000rpm离心10min。将上清倒入过滤装置中，用活塞将上清打入新的50mL离心管中。
⑥去内毒素：向50mL离心管中加入2.5mL Buffer ER，上下颠倒混匀，冰上静置30min。
⑦柱平衡：加l0 mL Buffer QBT于QIAGEN-tip吸附柱中，平衡柱子。
⑧DNA吸附：将步骤7中的液体倒入平衡后的QIAGEN-tip吸附柱中，静流。
⑨洗涤：将30mL，Buffer QC加入QIAGEN-tip吸附柱中，洗2次。
⑩洗脱：将QIAGEN-tip吸附柱移入新的50mL离心管中，加15mL Buffer QN，静流洗脱质粒DNA。
DNA沉淀：加10.5mL异丙醇到洗脱下来的液体中，颠倒混匀，4℃，9000rpm离心45min。
DNA溶解：在生物安全柜中风干质粒DNA，加入400μL Buffer TE，室温静置2h溶解质粒。
使用NanoDrop测定质粒浓度，用Buffer TE将提取质粒的浓度调整至1μg/μL，此时，260/280吸光度比≈1.8，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳验证应主要为超螺旋结构，将验证正确的质粒分装为20μL每管，-20℃保存备用。
实验结果：得到的11个感染性克隆质粒的序列如表8所示。
表8.11个感染性克隆质粒的序列
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实施例4LLRV感染性克隆质粒定点突变
1.引物设计
使用SnapGene软件分析LLRVNSP1，NSP3，NSP4和NSP5片段的同义、单点突变、单一性酶切位点，根据突变位点所在的位置，分别在每个片段上设计1对定点突变PCR扩增，引物序列见表9(小写序列为同义突变位点；下划线为突变后单一性酶切位点)，交由擎科生物合成。
表9LLRV感染性克隆质粒定点突变引物
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2.目的质粒扩增
以实施例3构建的目的质粒pT7-NSP1/LLRV，pT7-NSP3/LLRV，pT7-NSP4/LLRV和pT7-NSP5/LLRV为定点突变PCR扩增的模板，为了防止假阳性克隆过多，在能够正常扩增的前提下，应尽量减少质粒模板的投入量，PCR反应体系如下：2×Max Buffer25μL，dNTP Mix(10mM each)1μL，F(10μM)1μL，R(10μM)1μL，PhantaMax Super-Fidelity DNAPolymerase1μL，质粒DNA 1～3ng，ddH2O补足至50μL。
扩增条件：95℃30s；95℃15s，60℃15s，72℃30～60s/kb；共30个循环；72℃5min；利用琼脂糖凝胶电泳鉴定，对阳性产物切胶回收。
3.扩增产物DpnⅠ消化
由于扩增产物中包含原始质粒，为防止其在转化后形成假阳性转化子，必须在进行重组环化之前进行DpnⅠ消化，去除甲基化模板质粒，反应体系为DpnⅠ1μL，扩增产物50μL。
轻轻吸打混匀后，短暂离心后收集至0.2mL PCR管底，置于PCR仪中，37℃反应2h。
4.重组反应
用NanoDrop测定DpnⅠ消化产物的浓度，以0.03pmol为最佳模板投入量进行重组反应，反应体系如下：DpnⅠ消化产物0.03pmol，5×CE MultiS Buffer 4μL，ExnaseⅡMultiS 2μL，ddH2O补足至20μL。
置于PCR仪中，37℃反应30min，立即置于冰上冷却。利用Trelief TM 5α感受态细胞对重组产物进行转化、摇菌、质粒小提、测序鉴定和质粒大提，具体操作步骤参考实施例3。
实验结果：得到4个突变质粒pT7-muNSP1/LLRV、pT7-muNSP3/LLRV、pT7-muNSP4/LLRV和pT7-muNSP5/LLRV，pT7-muNSP1/LLRV序列是将实施例3中的pT7-NSP1/LLRV的NSP1/LLRV序列第1349和1363位分别由C和T突变为T和C，pT7-muNSP3/LLRV序列是将实施例3中的pT7-NSP3/LLRV的NSP3/LLRV序列第799和811位分别由T和T突变为C和C，pT7-muNSP4/LLRV序列是将实施例3中的pT7-NSP4/LLRV的NSP4/LLRV序列第395和404位分别由A和A突变为G和T，pT7-muNSP5/LLRV序列是将实施例3中的pT7-NSP5/LLRV的NSP5/LLRV序列第298和306位分别由T和A突变为C和G。
1.T7 RNA聚合酶基因的扩增
根据NCBI GenBank中T7 RNAP基因序列(GenBank登录号：FJ881694)，设计T7 RNAP的编码区扩增引物，扩增片段大小为2652bp，引物序列见表10，交由擎科生物合成。
表10T7 RNAP基因编码区PCR扩增引物
取一支E.coli BL21(DE3)感受态在冰上融化，加入500μL无抗性LB液体培养基，在37℃摇床上以180rpm培养8h，3000rpm离心1min弃上清，加入10μL ddH2O将菌体重新悬起，置于PCR仪中，98℃变性5min，立即置于冰上。以E.coli BL21(DE3)基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系如下：2×Phanta Max Master Mixs 12.5μL，T7 RNAP-F(10μM)1μL，T7RNAP-R(10μM)1μL，E.coli BL21(DE3)基因组1μL，ddH2O 9.5μL，Total25μL。
扩增条件：95℃3min；95℃15s，55℃15s，72℃2min 30s；共35个循环；72℃5min；利用琼脂糖凝胶电泳鉴定，对阳性产物切胶回收，送擎科生物测序。
2.质粒无缝克隆
pCMV-868CP质粒是以CMV为启动子，以(G4S)4为连接肽，融合表达非洲猪瘟病毒加帽酶NP868R和T7 RNAP的质粒(见图2)。首先，以pCMV/NP868R质粒为载体片段PCR扩增的模板设计引物，命名为pCMV/NP868R-F/R。其次，以T7 RNAP胶回收产物为插入片段PCR扩增的模板，通过2轮PCR扩增在5'端添加(G4S)4连接肽序列设计引物，命名为T7 RNAP-F1(2)/R，引物序列见表11(小写序列为5'端添加的重组序列)，交由擎科生物合成。通过PCR扩增→琼脂糖凝胶电泳→胶回收→同源重组→小提质粒鉴定→质粒大提步骤完成，具体操作步骤见实施例3LLRV 11个感染性克隆质粒的构建。
表11pCMV-868CP质粒构建的PCR扩增引物
构建得到融合表达非洲猪瘟病毒加帽酶NP868R和T7 RNAP的pCMV-868CP质粒后，转染12h后，在荧光显微镜下观察单独转染pT7-LIET-GFP质粒和与pCMV-868CP质粒共转染时，BHK-T7/9细胞中GFP荧光的表达量。
实验结果：由图3所示，从图3可以看出，pCMV-868CP辅助质粒的加入显著增加了BHK-T7/9细胞中pT7-LIET-GFP质粒的表达量。
实施例6MA104 N*V工程细胞株的构建
1.plvx-BVDV-N-PIV5-V质粒的构建
pUC-BVDV-N-PIV5-V质粒由苏州金唯智生物科技有限公司合成，将plvx-IRES-Puro载体与pUC-BVDV-N-PIV5-V质粒同时用限制性内切酶XhoⅠ和EcoRⅠ进行双酶切，37℃金属浴1h，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离，并对相关片段进行凝胶回收，采用T4 DNA快速连接酶在25℃金属浴连接1h，将连接产物转化到Trelief TM 5α感受态细胞，接种至Amp+LB平板培养基中过夜培养。从平板培养基中挑取单个菌落，180rpm摇床过夜，提取质粒。双酶切验证正确的质粒由北京擎科生物科技有限公司进行测序，plvx-BVDV-N-PIV5-V质粒构建示意图如图4。
2.慢病毒的包装
取293T细胞，消化后调整细胞密度为1×106/mL，接种到35mm平皿中；约18-24h后，待细胞汇合度达到90％以上进行转染，将PMD2.G:psPAX2:plvx-BVDV-N-PIV5-V三种包装质粒按照摩尔比2:1:1的比例，参照LipofectamineTM3000转染试剂的操作说明书进行转染，转染后放置37℃，5％CO2培养箱中；36h和60h后收集上清，3000rpm，离心10min去除细胞碎片；用Amicon Ultra-0.5mL 10K超滤离心管浓缩病毒，保存于-80℃。
3.慢病毒感染MA104细胞
取MA104细胞，消化后调整细胞密度为4×105/mL，每孔2mL，均匀铺入6孔板中，37℃，5％CO2培养；18～24h，待细胞汇合度至40％～50％进行感染，吸弃6孔板中的培养基，更换新的培养基，加入100μL浓缩的慢病毒液，并加入终浓度为10μg/mL的聚凝胺(polybrene)，37℃，5％CO2培养12h；将感染慢病毒的MA104细胞(实验组)和正常MA104细胞(对照组)同时消化后铺入新的6孔板中，待其完全长满后，用含10μg/μL嘌呤霉素的无血清培养基进行换液，37℃孵育48h；期间，观察细胞生长状况，当对照组全部死亡后，收集实验组，接种至T25细胞培养瓶中增殖，并将其命名为MA104N*V细胞。
实验结果：如图5所示，由图5可知，得到了完全抗嘌呤霉素的MA104 N*V细胞。
4.qRT-PCR检测BVDV-N和PIV5-V基因
(1)提取细胞总RNA
以正常MA104细胞为对照，分别取第5代和第10代MA104 N*V细胞的总RNA，具体操作如下：弃掉各孔中的细胞培养液，用PBS洗细胞2次，加入500μL Buffer GTC(在使用之前，每1mL Buffer GTC需加入20μLβ-疏基乙醇，涡旋混匀)，充分裂解细胞，参照OMEGA bio-tekHP Total RNA Kit试剂盒说明书提取细胞总RNA，储存于-80℃备用。
(2)qRT-PCR检测BVDV-N和PIV5-V基因的RNA转录
利用Primer 5.0软件设计BVDV-N，PIV5-V和β-actin内参基因的qRT-PCR扩增引物，送往北京擎科生物有限公司合成，引物序列见表12。
表12BVDV-Npr，PIV5-Vpr和β-actin内参基因的qRT-PCR扩增引物
染料法qRT-PCR反应体系如下：2×One Step SYBR Green Mix10μL，One StepSYBR Green Enzyme Mix1μL，Gene Specific Primer Forward(10μM)0.4μL，GeneSpecific Primer Reverse(10μM)0.4μL，模板RNA1μL，ddH2O7.2μL。
按照HiScript IIOne Step qRT-PCR SYBR Green Kit说明书进行扩增，反应条件：50℃15min，1循环；95℃30s，1循环；95℃10s，60℃30s，40循环。
实验结果：如表13所示。
表13MA104和MA104 N*V细胞中BVDV-N，PIV5-V和β-actin内参基因的qRT-PCR检测结果
由表13可知，以正常MA104细胞为对照，从P5代和P10代MA104 N*V细胞中提取总RNA，分别用BVDV-N，PIV5-V和β-actin内参基因引物进行qRT-PCR扩增，在β-actin内参基因扩增CT值一致的前提下，P5和P10代MA104 N*V细胞中均可以检测到BVDV-N和PIV5-V基因，但正常MA104细胞检测不到。上述结果说明BVDV-N和PIV5-V基因通过慢病毒感染成功引入MA104细胞，并稳定结合在MA104细胞的基因组上。
(3)Westernblot检测STAT1和IRF3蛋白的表达
提前一天将对数生长期的正常MA104细胞和MA104 N*V细胞接种于六孔板中，37℃，5％CO2培养过夜。待细胞密度达90％以上，将6孔板放置于-20℃冰箱冻融，1000rpm，离心10min，吸弃上清。用4℃预冷PBS洗2次后，在每管中加入100μLRIPA细胞裂解液，吹打混匀，放于冰上裂解1～2min，13,000g离心10min，取上清。
制样：将20μL蛋白上清与5μL 5×SDS蛋白上样缓冲液充分混匀后，置于100℃沸水中，煮样5～10min。8000rpm离心5min，各取10μL进行SDS-PAGE电泳，剩余蛋白样品存放于-20℃冰箱保存。
转膜：用10％的分离胶进行SDS-PAGE电泳。电泳结束后，仔细切下蛋白胶，去除多余的部分，将裁剪合适的PVDF膜先在甲醇溶液中激活1～2min，然后放入平衡液中。采用湿转法将凝胶上的蛋白转移到PVDF膜上。
封闭：转膜完毕后用新鲜配置的5％脱脂牛奶室温封闭2h。
孵育一抗：用0.1％TBST洗膜3次，每次10min。洗膜后按照1:1000的稀释度孵育STAT1，IRF3和GAPDH蛋白的兔抗单克隆抗体，置于摇床上，4℃过夜。
孵育二抗：次日，将PVDF膜取出，放入0.1％TBST洗液中洗涤3次，每次10min。加入1:5000稀释的HRP标记的山羊抗兔二抗，室温震荡结合1h，用0.1％TBST以同样方法洗涤，去除未结合的多余抗体。
显影：配置Western Lightning Plus-ECL显影液，均匀加在PVDF膜上，利用Tanon4800凝胶成像系统曝光成像，观察条带。
实验结果：如图6所示。以正常MA104细胞为对照，裂解P10代MA104 N*V细胞，分别用抗STAT1，IRF3和内参基因GAPDH的抗体检测MA104 N*V细胞中BVDV-N和PIV5-V蛋白的抑制情况。由图6可知，在内参基因GAPDH蛋白表达量一致的条件下，MA104 N*V细胞中仅有微量的STAT1和IRF3蛋白表达，正常MA104细胞中却可以看到大量的STAT1和IRF3蛋白表达，说明通过慢病毒感染成功整合在MA104细胞基因组的BVDV-N和PIV5-V基因稳定表达了相应的蛋白，并分别抑制了MA104细胞中的Ⅰ型干扰素相关蛋白STAT1和IRF3的表达，有利于轮状病毒的感染。
实施例7突变rLLR毒株的拯救
1.质粒转染
(1)转染前一天，将7～8×105BHK-T7/9细胞铺入六孔板中，培养18～24h，此时此时细胞的汇合度达80％～90％。
(2)利用11个重组质粒拯救携带分子标签的rLLRV，将以下各质粒按照所需质量添加到250μLOpti-MEM中，11个重组质粒：实施例3得到的pT7-VP1/LLRV(0.8μg)、pT7-VP2/LLRV(0.8μg)、pT7-VP3/LLRV(0.8μg)、pT7-VP4/LLRV(0.8μg)、pT7-VP6/LLRV(0.8μg)、pT7-VP7/LLRV(0.8μg)和pT7-NSP2/LLRV(2.4μg)；实施例4得到的pT7-muNSP1/LLRV(0.8μg)、pT7-muNSP3/LLRV(0.8μg)、pT7-muNSP4/LLRV(0.8μg)和pT7-muNSP5/LLRV(2.4μg)，辅助质粒pCMV-868CP(1.6μg)。按照2μL/μg的比例添加TransIT-LT1转染试剂，将质粒与转染试剂复合物在室温下混合静置30min后，均匀逐滴添加到BHK-T7/9细胞中。
(3)24h后，用3mL DMEM清洗个孔2次，并添加1.5mL DMEM不完全培养基(无血清，含10％TPB，1％NEAA和1％L-Gln)至各孔中。48h后，将1×105MA104 N*V细胞添加到转染的BHK-T7/9细胞中，并调整各孔的胰酶浓度为0.5μg/mL。
(4)BHK-T7/9和MA104 N*V细胞共培养3d后，将转染的6孔板在室温和-80℃反复冻融3次，细胞在-80℃冷冻至少4h，并储存于-80℃，准备接毒备用。
2.转管接毒
将消化好的MA104 N*V细胞铺入转管，待其长成致密单层准备接毒备用，取600μL冻融3次的病毒液，加入终浓度为5μg/mL的胰蛋白酶，37℃温箱激活l h。弃去6孔板中MA104N*V细胞培养基，用PBS液清洗3次，接种激活的病毒液，37℃，5％CO2培养箱中吸附2h，期间每15min混匀一次。2h后，吸弃转管中的吸附液，用PBS液清洗2次，并加入胰蛋白酶终浓度为2μg/mL的DMEM维持液(胰蛋白酶水解VP4后形成VP5*和VP8*，有利于病毒进入细胞，并增强病毒的感染力)在37℃，5％CO2培养箱的转管架中慢速旋转培养7～9d，或者观察到CPE。
实验结果：如图7所示。由图7可知，分别利用11+1rLLR，转染7天后收获P0代病毒液，将P0代病毒液在室温和-80℃反复冻融3次，在MA104细胞上传代，在第一次传代的第4～7天，2株拯救病毒均出现典型的CPE，细胞界限变模糊、细胞融合聚集，出现明显的拉长，拉丝，皱缩，变圆，甚至脱落。
实施例8拯救病毒的鉴定及病原学特性分析
1.dsRNA-PAGE和硝酸银染色
参照实施例2的方法，分别提取wtLLR和rLLR的基因组，使用NanoDrop测定RNA浓度，并调整至10ng/μL左右。严格按照表14中的比例在50mL离心管中配制分离胶和积层胶。
表14聚丙烯凝胶电泳配方(单位:mL)
| 组分 | 积层胶(3.5％) | 分离胶(10％) |
| 30％丙烯酰胺 | 0.58 | 1.67 |
| 去离子水 | 3.4 | 2.3 |
| 5×TBE | 1 | 1 |
| 10％APs | 0.035 | 0.035 |
| TEMED | 0.0035 | 0.0034 |
待胶凝固后加入1×TBE电泳缓冲液。将18μL病毒RNA与3μL 6×Loading buffer混匀上样，80v恒压电泳6h。电泳结束后，关闭电源，取出胶体，小心将浓缩胶丢弃，利用核酸快速银染试剂盒进行染色，具体步骤如下：漂洗：将凝胶放入100mL超纯水，水平摇床上清洗2次，每次2min。银染：弃水，加入100mL即用型染色液(超纯水79mL，核酸银染染色增敏液(10×)10mL，核酸银染染色加速液(10×)10mL，核酸银染银溶液(100×)1mL)，水平摇床上结合5min。
弃原有溶液，加入100mL超纯水，水平摇床上清洗15s(注意：水洗涤的时间不能超过20s，否则会导致过多的银离子被洗去，导致检测灵敏度下降)。
显色：弃水，加入100mL银染显色液(超纯水89.8mL，核酸银染基本显色液(10×)10mL，核酸银染显色加速液(500×)0.2mL)，摇床上水平摇动3～10min，直到出现比较理想的预期核酸条带。注意：核酸银染显色加速液有刺激性气味，需要在通风厨内操作；银染显色液配制后需在20min内使用完毕。
终止：弃银染显色液，加入100mL超纯水，水平摇床上常温摇动3～5min。
成像：利用Tanon 4800凝胶成像系统白光成像，观察条带。
实验结果：如图8所示。为了鉴定rLLR的正确性，以wtLLR(野生型兰州羔羊轮状病毒)为对照，提取rLLR基因组，dsRNA-PAGE和硝酸银染色的结果显示rLLR的基因组带型与wtLLR一致。
2.RT-PCR和酶切鉴定
以wtLLR为对照，将上一步提取的rLLR基因组解链，使用LLRVNSP1，NSP3，NSP4和NSP5全长片段扩增引物进行RT-PCR，经琼脂糖凝胶电泳回收之后分别用EcoRⅤ(NSP1和NSP3)，MluI(NSP4)和BamHI(NSP5)进行酶切，酶切反应体系如下：CutSmart缓冲液(10×)2μL，限制性核酸内切酶1μL，PCR纯化产物1ng，ddH2O补足至20μL。
将体系混匀，置于37℃PCR仪中，反应1h后，经过琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切后的条带。
实验结果：如图9所示。结果显示NSP1片段经EcoRV酶切后得到了1363bp和218bp的2条带；NSP3片段经EcoRV酶切后得到了811bp和251bp的2条带；NSP4片段经MluI酶切后得到了395bp和356bp的2条带；NSP5片段经BamHI酶切后得到了372bp和298bp的2条带，片段大小均符合预期长度，且测序结果与目的基因序列完全一致，说明各节段基因组中均成功引入分子标签。
3.间接免疫荧光法测定rLLR的滴度
铺板：提前一天将对数生长期的MA104细胞制成0.5～1×105个/mL的细胞悬液，100μL/孔加入96孔板中，置于5％CO2培养箱中37℃培养2d；
激活、稀释和吸附：将200μL wtLLR和rLLR加入终浓度为5μg/mL的胰蛋白酶，37℃温箱激活l h。用终浓度为0.5μg/mL的胰蛋白酶进行10倍梯度稀释至合适浓度，每孔50μL稀释病毒液，每个稀释度做3个重复，置于5％CO2培养箱中37℃吸附2h；
加维持液：弃掉96孔板中的吸附液，每孔加入100μL胰蛋白酶终浓度为0.5μg/mL的DMEM维持液，置于5％CO2培养箱中37℃培养18～20h；
固定细胞：弃96孔板中的维持液，用PBS清洗1次，200μL/孔。向96孔板中加入4℃预冷的4％组织固定液，150μL/孔，放置于4℃冰箱中静置10～15min，弃4％组织固定液，放置于通风口处晾干；
封闭：用5％牛血清白蛋白(Bovin serum alburmin，BSA)37℃封闭1h，200μL/孔，用PBST清洗3次；
孵育一抗：用1％BSA将VP6抗体按照1:1500稀释度进行稀释，50μL/孔，于37℃孵育2h，用PBST清洗3次；
孵育二抗：用PBS将FITC标记的山羊抗兔的二抗按照1:150的稀释度进行稀释，50μL/孔，于37℃培养箱孵育1h，避光保存；
镜检：用PBST清洗细胞3次，加PBS溶液，150μL/孔，置于荧光显微镜上选取合适的激发光统计具有细胞形态且亮度一致的荧光数；
计算病毒滴度：同一个稀释度的两孔荧光数均在10～100的判定孔为最佳判定孔。
按下列公式进行计算：
病毒滴度(lgPFU/mL)＝lg(最佳判定孔的荧光数平均值×稀释倍数/接毒量)
实验结果：如图10所示。由图10可知，加入荧光二抗后，在显微镜下观察wtLLR与rLLR的荧光灶形成单位，结果显示稀释倍数为10-5孔平均分别有36个和25个荧光灶。
如图11中的A所示，带入公式计算，wtLLR与rLLR的滴度分别为7.08×107PFU/mL和4.89×107PFU/mL。
4.qRT-RCR法绘制rLLR的一步生长曲线
将wtLLR、rLLR按照MOI 0.01PFU/cell分别接种MA104细胞，收取感染后24h、48h、72h、96h的病毒液(每个时间点做3个重复，取平均值)。参照实施例2的方法提取基因组和解链，使用基于LLRVNSP1基因的实时荧光定量RT-PCR检测方法，引物序列见表15，按照HiScript II One Step qRT-PCR Probe Kit说明书进行扩增，反应条件：50℃5min，1循环；95℃20s，1循环；95℃3s，60℃30s(荧光收集)，40循环。计算3株病毒在不同时间点的GCEs，并绘制复制动力曲线。
表15LLRV Real-Time PCR鉴定引物
实验结果：如图11中的B所示。wtLLR与rLLR在不同时间点的GCEs计算结果显示，感染后48h，wtLLR与rLLR(MOI 0.01PFU/cell)的复制均进入了平台期，且拯救病毒rLLR显示出了与亲本株wtLLR极为相似的复制动力曲线。
由以上实施例可知，本发明通过沉默突变分别在LLRVNSP1、NSP3、NSP4和NSP5节段中引入EcoRV、MluI和BamHI酶切位点序列，rLLRV在MA104细胞上盲传至P5代，基因组测序和酶切鉴定的结果显示rLLR存在分子标签。同时，对rLLR与wtLLR基因组带型鉴定、滴度测定和一步生长曲线绘制的结果说明，该拯救病毒与野生病毒具有基本一致的生长动力学特性，也表明这些标签的引入并没有影响到rLLR的感染与复制。本研究首次成功拯救出携带分子标记的rLLR，标志着LLRV感染性克隆系统的成功构建，不仅为深入开展以LLRV为骨架的轮状病毒重配病毒和重组病毒的研究搭建了反向遗传学平台，也将为推动和加速我国RV反向遗传学的研究进程提供帮助。
实施例9重组病毒rLLR/NSP3-NLuc和rLLR/NSP3-CoV2/RBD的构建和拯救
1.pT7-NSP3-P2A-Nluc/LLR重组质粒的构建
分别以pCRISPaint-NanoLuc质粒为插入片段PCR扩增的模板，以pT7-NSP3/LLR质粒为载体PCR扩增的模板，使用SnapGene软件设计同源重组引物，引物序列见表16(小写序列为5'端添加的重组序列)，交由北京擎科生物有限公司合成。
pT7-NSP3-P2A-RBD/LLR重组质粒的构建
以pUC-CoV2-Spike质粒为模板，同过2轮PCR扩增，分别将tPA和Foldon序列加在SARS-CoV2/RBD序列的5'和3'端，构建pUC-tPA+CoV2/RBD+Foldon质粒。分别以pCRISPaint-NanoLuc和pUC-tPA+CoV2/RBD+Foldon质粒为插入片段PCR扩增的模板，以pT7-NSP3/LLR质粒为载体PCR扩增的模板，使用SnapGene软件设计同源重组引物，引物序列见表17(小写序列为5'端添加的重组序列)，交由北京擎科生物有限公司合成。pT7-NSP3-P2A-Nluc/LLR和pT7-NSP3-P2A-RBD/LLR质粒的示意图见图12。
表16pT7-NSP3-P2A-Nluc/LLR和pT7-NSP3-P2A-RBD/LLR质粒构建的PCR扩增引物
2.重组病毒的拯救
将实施例7拯救系统中的突变质粒pT7-muNSP1/LLRV、pT7-muNSP3/LLRV、pT7-muNSP4/LLRV和pT7-muNSP5/LLRV用实施例3中的质粒pT7-NSP1/LLRV、pT7-NSP3/LLRV、pT7-NSP4/LLRV和pT7-NSP5/LLRV进行替换；然后分别用编码NSP3基因的重组质粒pT7-NSP3-P2A-Nluc/LLR和pT7-NSP3-P2A-RBD/LLR替换拯救系统中的pT7-NSP3/LLRV质粒，进行转染→换液→添加MA104N*V细胞和胰酶共培养→收获P0代病毒液→P1代转管接毒，具体操作步骤请参考实施例7rLLR野毒株的拯救。在MA104 N*V细胞耐受的前提下，可适当提高共培养和接毒时胰蛋白酶的浓度。如果P1代观察不到CPE，对病毒液盲传3代培养。
实验结果：如13所示。由图13可知，rLLR/NSP3-NLuc和rLLR/NSP3-CoV2/RBD重组病毒均出现典型的CPE，细胞界限变模糊、细胞融合聚集，出现明显的拉长，拉丝，皱缩，变圆，甚至脱落。阴性对照组细胞形态正常或由于添加2μg/mL胰酶而出现轻微皱缩。
3.重组病毒的鉴定
(1)dsRNA-PAGE和硝酸银染色
以实施例8提取的rLLR dsRNA为对照，对成功拯救的重组病毒rLLR/NSP3-NLuc和rLLR/NSP3-CoV2/RBD，参照病毒RNA提取试剂盒说明书提取基因组，并进行dsRNA-PAGE和硝酸银染色，具体操作步骤请参考实施例8。
实验结果：如图14中的A所示，由图14中的A可知，dsRNA-PAGE和硝酸银染色的结果显示P1～P5代rLLR/NSP3-NLuc的NSP3基因迁移速度明显比亲本株rLLR慢，出现在NSP1条带稍高的位置。
如图15中的A所示，由图15中的A可知dsRNA-PAGE和硝酸银染色的结果显示P1～P5代rLLR/NSP3-CoV2/RBD的NSP3基因迁移速度比亲本株rLLR明显减慢，出现在VP4条带稍低的位置。
(2)RT-PCR检测NLuc和RBD基因的插入
以本实施例2提取的病毒核酸为模板，用NSP3基因全长引物进行RT-PCR扩增。引物序列及PCR反应体系请参考实施例2LLR全基因组的扩增。
实验结果：如图14中的B所示，由图14中的B可知，RT-PCR扩增NSP3/LLR基因的结果显示rLLR在1074bp左右出现目的条带，P1～P5代rLLR/NSP3-NLuc均在1653bp左右出现目的条带，片段大小均符合预期长度，且测序结果与目的基因序列完全一致。
如图15中的B所示，由图15中的B可知，RT-PCR扩增NSP3/LLR基因的结果显示rLLR在1074bp左右出现目的条带，P1～P5代rLLR/NSP3-CoV2/RBD在1956bp左右出现目的条带，片段大小均符合预期长度，且测序结果与目的基因序列完全一致。
(3)重组病毒的噬斑纯化
对鉴定正确的重组病毒液rLLR/NSP3-NLuc和rLLR/NSP3-CoV2/RBD进行激活和吸附，将激活好的病毒液10倍等比稀释，稀释度为10-3～10-7，吸附2h后，6孔板每孔铺入2mL第一层琼脂覆盖物，配制如下：2×MEM培养液中加入等体积1％琼脂，并分别加入终浓度为1μg/mL的胰蛋白酶、100μg/mL的葡聚糖和2mmol/L的L-Gln，边加边振荡，使吸附液和覆盖物混合均匀。待完全凝固后，置于37℃，5％CO2培养箱倒置培养。3d后，铺第二层琼脂覆盖物，除了等体积的2×MEM和1％琼脂外，还额外加入终浓度为120μg/mL的中性红，待完全凝固后置于37℃，5％CO2培养箱倒置培养，观察蚀斑的出现，待病毒蚀斑形成后，将六孔板置于倒置荧光显微镜下，用记号笔标记有细胞病变的部位，用枪头吸取噬斑形成部位至含有1mLDMEM培养基的离心管中。将离心管中的病毒液反复冻融3次，再次进行噬斑纯化，重复以上操作3次，即获得纯化后的重配病毒，并对纯化后的重配病毒连续传代至P5代。
(4)rLLR/NSP3-NLuc重组病毒的荧光素酶活性分析
取对数生长期的MA104细胞接种于96孔板中，每孔50μL。次日，待细胞密度达80％～90％，以rLLR为对照，分别将rLLR和rLLR/NSP3-NLuc以10倍梯度稀释接毒，每个稀释度做5个重复，之后将96孔板置于37℃5％CO2细胞培养箱中培养。48h后，96孔板在室温和-80℃反复冻融2次，按照NLuc萤光素酶检测试剂盒(Promega)说明书配制Nano-Glo萤光素酶检测试剂，每孔50μL分装，并加入50μL病毒液轻轻吹打混匀，放到荧光素酶检测仪器中，设置好程序，读取样品中NLuc萤光素酶信号，记录到计算机中。
实验结果：如图14中的C所示，由图14中的C可知，NLuc萤光素酶活性检测结果显示，除P1代荧光素酶信号稍低外，其余各代次无明显差异。在10倍梯度稀释下，NLuc萤光素酶的表达量和稀释度呈线性相关关系，NLuc荧光素酶的表达量没有随着时间的推移而损失，即使在10-7稀释度下，仍然能检测到荧光素酶信号。
(5)Western blot检测外源蛋白的表达
对于rLLR/NSP3-CoV2/RBD重组病毒中RBD蛋白表达的鉴定，感染24h，首先，收集2mL上清并将其浓缩为100μL，具体操作步骤如下：将细胞上清、预冷甲醇、预冷氯仿按4:4:1的比例加入到1.5mL EP管中，涡旋混匀，4℃5000g离心10min，吸去上层液体，留中间蛋白层和下层；加入5倍氯仿体积的甲醇，4℃5000g离心10min洗去氯仿，弃上清；向蛋白沉淀中加入2mL无水乙醇，涡旋混匀，4℃5000g离心10min，吸净上清，晾干5min；加入100μL含终浓度为1mM PMSF的RIPA细胞裂解液，吹打混匀，放于冰上裂解1～2min，13,000g离心5min，取上清。其次，收集沉淀，用3mL PBS缓冲液漂洗各孔2次，在每孔中加入100μL RIPA细胞裂解液，吹打混匀，放于冰上裂解1～2min，13,000g离心5min，取上清。在收集的上清和沉淀样本中，加入5×Loading buffer，煮沸5～10min，立即-20℃冰置5min，-20℃保存。将样品稍微离心后，以SARS-CoV-2Spike Protein RBD(His-Tag)为阳性对照，各取20μL，分别以VP6和GAPDH作为内参基因对照进行westernblot检测，具体操作步骤请参考实施例8MA104 N*V细胞的蛋白表达鉴定。
实验结果：如图15中的C所示，Westernblot检测的结果显示，在RBD(His-Tag)阳性对照和P1～P5代rLLR/NSP3-CoV2/RBD沉淀中均可检测到RBD蛋白条带，大小约为35kDa，而Mock组、rLLR对照组和P3代上清中均无条带；rLLR、P1～P5代rLLR/NSP3-CoV2/RBD沉淀和P3代上清中均可检测到VP6蛋白条带，大小约为45kDa，而Mock组无条带。Westernblot检测以GAPDH(36kDa)作为内参，在蛋白量一致的情况下，可以观察到，P1～P5代rLLR/NSP3-CoV2/RBD感染细胞沉淀中的RBD蛋白表达水平无明显差异。
(6)间接免疫荧光鉴定RBD蛋白的表达
对于rLLR/NSP3-CoV2/RBD重组病毒中RBD蛋白表达的间接免疫荧光鉴定，按照MOI0.01PFU/cell感染MA104细胞24h后，按照如下步骤操作：
固定：用PBS清洗1次，加入4℃预冷的4％组织固定液，放置于4℃冰箱中静置10～15min，弃4％组织固定液，放置于通风口处晾干；
细胞破膜：爬片稍甩干后用组化笔在盖玻片中间细胞分布均匀的位置画圈(防止抗体流走)，加50～100μL破膜工作液，室温孵育20min，PBS洗3次，每次5min；
血清封闭:在圈内滴加用3％BSA均匀覆盖组织，室温封闭30min；
加一抗：轻轻甩掉封闭液，在细胞孔板里滴加按1:1000和1:500比例配好的VP6和RBD一抗，细胞培养板平放于湿盒内4℃孵育过夜；
加二抗：细胞孔板置于脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。加对应二抗，室温孵育50min；
DAPI复染细胞核：爬片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。切片稍甩干后在圈内滴加DAPI染液，避光室温孵育10min；
封片：爬片置于PBS中在脱色摇床上晃动洗涤3次，每次5min。玻片稍甩干后用抗荧光淬灭封片剂封片。
采集图像：DAPI激发波长330～380nm，发射波长420nm；488激发波长465～495nm，发射波长515-555nm；CY3激发波长510～560nm，发射波长590nm。
结果判读：DAPI通道细胞核为蓝色，488通道阳性为绿色，CY3通道阳性为红色。
实验结果：如图15中的D所示，FITC标记的绿色荧光为病毒VP6蛋白所在的位置，CY3标记的红色荧光为SARS-CoV2 RBD蛋白所在的位置，蓝色荧光为DAPI染色的MA104细胞核的具体位置。间接免疫荧光的结果显示，接毒24h后，在感染rLLR/NSP3-CoV2/RBD重组病毒的MA104细胞中，可观察到病毒围绕细胞核弥散分布于细胞质中，SARS-CoV2 RBD蛋白主要定位于细胞膜上。rLLR仅在细胞质中有VP6蛋白表达，没有感染病毒的Mock对照细胞中，未检测到绿色或红色荧光信号。
4.重组病毒的生长动力学特性研究
以rLLR为对照，分别将rLLR、rLLR/NSP3-NLuc进行10倍梯度稀释至合适浓度，每孔50μL稀释病毒液(每个稀释度做3个重复，取平均值)，在96孔板中感染MA104细胞，用间接免疫荧光法测定重配病毒的滴度，具体操作步骤请参考实施例8。
rLLR为对照，将rLLR、rLLR/NSP3-NLuc按照MOI 0.01PFU/cell分别接种MA104细胞，收取感染后24h、48h、72h、96h的病毒液(每个时间点做3个重复，取平均值)，使用基于NSP3基因的LLR qRT-PCR检测方法，计算重配病毒在不同时间点的GCEs，并绘制复制动力曲线，具体操作步骤请参考实施例8。
实验结果：如图16所示，加入荧光二抗后，在显微镜下观察rLLR/NSP3-NLuc和rLLR/NSP3-CoV2/RBD的荧光灶形成单位，结果显示稀释倍数为10-4孔平均分别有19个和13个荧光灶。
如图17中的A所示，带入公式计算，rLLR/NSP3-NLuc和rLLR/NSP3-CoV2/RBD的滴度分别为3.79×106PFU/mL和2.60×106PFU/mL，均低于亲本株rLLR(7.08×107PFU/mL)。
如图17中的B所示，rLLR/NSP3-NLuc和rLLR/NSP3-CoV2/RBD与亲本株rLLR(MOI0.01PFU/cell)在不同时间点的GCEs计算结果显示：在感染后48h，3株病毒的复制均进入了平台期，但rLLR/NSP3-NLuc和rLLR/NSP3-CoV2/RBD重组病毒在感染后48h、72h和96h的基因组拷贝数略低于亲本株rLLR。
实施例10重组病毒rLLR/NSP1-EGFP的构建和拯救
1.质粒pT7-NSP1-EGFP/LLR的构建
根据文献(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1450225/)报道构建在截短的NSP1片段中插入EGFP基因的质粒pT7-NSP1-EGFP/LLR：将NSP1片段5’端开始的第223～1388位核苷酸替换为P2A连接的增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因(720bp)，并在P2A前面插入GSG序列，以提高P2A的功能，使用SnapGene软件进行序列的设计，示意图如图18所示，设计完成的序列交由苏州金唯智生物科技公司合成cDNA序列。合成的cDNA序列替换到原pT7-NSP1/LLR表达质粒的RsrII和NcoI位点来构建pT7/NSP1-EGFP-LLR质粒。构建质粒的核苷酸序列经直接测序验证。
2.质粒的鉴定与提取
方法同实施例9。
3.病毒拯救
方法同实施例9。
实验结果：如图19所示。
4.重组病毒的生长动力学特性研究
方法同实施例9。
实验结果：如图16所示，加入荧光二抗后，在显微镜下观察NSP1-EGFP-LLR的荧光灶形成单位，结果显示稀释倍数为10-4孔平均有18个荧光灶。
如图17中的A所示，带入公式计算，NSP1-EGFP-LLR的滴度为8.91×105PFU/mL，低于亲本株rLLR(7.08×107PFU/mL)。
如图17中的B所示，NSP1-EGFP-LLR与亲本株rLLR(MOI 0.01PFU/cell)在不同时间点的GCEs计算结果显示：在感染后48h，病毒的复制均进入了平台期，但NSP1-EGFP-LLR重组病毒在感染后48h、72h和96h的基因组拷贝数略低于亲本株rLLR。
5.稳定性
为确定rLLR/NSP1-EGFP是否可以在传代中稳定的表达，将rLLR/NSP1-EGFP的P10代接种MA104细胞培养12h后，VP6蛋白进行间接免疫荧光作为对照，置于倒置荧光显微镜下，接种rLLR/NSP1-EGFP的细胞孔可观察到绿色荧光(图20)，结果表明，将NSP1片段ORF区截短并插入720bp的EGFP基因后可获得稳定表达EGFP基因的重组病毒rLLR/NSP1-EGFP，并在连续传代10次后依旧保持稳定表达。
6.TCID50测定
方法同实施例9。
实验结果：如表17所示。
表17病毒LLR/NSP1-EGFP的TCID50测定
由表18可知，最高稀释度的对数(L)为-1，稀释度对数之间的差(d)为1，出现CPE孔的比率总和(S)为4.25，按照Karber法计算：㏒TCID50＝L-d(S-0.5)＝-4.875，即TCID50＝10-4.75/0.1ml，将该病毒稀释104.75接种0.1ml可使50％的细胞发生病变。
由以上实施例可知，本发明通过轮状病毒反向遗传系统成功拯救出含有Nluc、RBD和EGFP的报告基因的LLRV轮状病毒；含有Nluc、RBD和EGFP的报告基因的LLRV轮状病毒传代过程中稳定表达报告基因；含有Nluc、RBD和EGFP的报告基因的LLRV轮状病毒与轮状病毒疫苗株(LLRV)具有相似的生长曲线，含有报告基因(Nluc、RBD和EGFP)的轮状病毒可广泛用于抗病毒药物筛选、疫苗评价、感染机制、胞内和体内示踪等研究。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种羊轮状病毒重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pT7-VP1/LLRV、pT7-VP2/LLRV、pT7-VP3/LLRV、pT7-VP4/LLRV、pT7-VP6/LLRV、pT7-VP7/LLRV、pT7-NSP1/LLRV、pT7-NSP2/LLRV、pT7-NSP3/LLRV、pT7-NSP4/LLRV和pT7-NSP5/LLRV；
所述pT7-VP1/LLRV的序列如SEQ ID NO:108所示；所述pT7-VP2/LLRV的序列如SEQ IDNO:109所示；所述pT7-VP3/LLRV的序列如SEQ ID NO:110所示；所述pT7-VP4/LLRV的序列如SEQ ID NO:111所示；所述pT7-VP6/LLRV的序列如SEQ ID NO:112所示；所述pT7-VP7/LLRV的序列如SEQ ID NO:113所示；所述pT7-NSP1/LLRV的序列如SEQ ID NO:114所示；所述pT7-NSP2/LLRV的序列如SEQ ID NO:115所示；所述pT7-NSP3/LLRV的序列如SEQ ID NO:116所示；所述pT7-NSP4/LLRV的序列如SEQ ID NO:117所示；所述pT7-NSP5/LLRV的序列如SEQ IDNO:117所示；
可将所述重组质粒中的pT7-NSP1/LLRV、pT7-NSP3/LLRV、pT7-NSP4/LLRV和pT7-NSP5/LLRV用突变质粒进行替换；所述突变质粒为pT7-muNSP1/LLRV、pT7-muNSP3/LLRV、pT7-muNSP4/LLRV和pT7-muNSP5/LLRV，该突变用于区分与原轮状病毒的区别；
所述pT7-muNSP1/LLRV的序列是将所述pT7-NSP1/LLRV的NSP1/LLRV序列第1349和1363位分别由C和T突变为T和C；所述pT7-muNSP3/LLRV的序列是将所述pT7-NSP3/LLRV的NSP3/LLRV序列第799和811位分别由T和T突变为C和C；所述pT7-muNSP4/LLRV的序列是将所述pT7-NSP4/LLRV的NSP4/LLRV序列第395和404位分别由A和A突变为G和T；所述pT7-muNSP5/LLRV的序列是将所述pT7-NSP5/LLRV的NSP5/LLRV序列第298和306位分别由T和A突变为C和G。
2.一种羊轮状病毒的反向遗传学病毒拯救系统，其特征在于，包括权利要求1所述的重组质粒、辅助质粒pCMV-868CP、MA104或MA104 N*V工程细胞株和BHK-T7/9细胞。
3.根据权利要求2所述的羊轮状病毒的反向遗传学病毒拯救系统，其特征在于，所述辅助质粒pCMV-868CP以CMV为启动子，以(G4S)4为连接肽，融合表达非洲猪瘟病毒加帽酶NP868R和T7 RNAP。
4.根据权利要求2所述的羊轮状病毒的反向遗传学病毒拯救系统，其特征在于，所述MA104 N*V工程细胞株为基因组整合有BVDV的N蛋白和PIV5的V蛋白的MA104工程细胞株。
5.权利要求2～4任意一项所述的羊轮状病毒的反向遗传学病毒拯救系统拯救病毒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将权利要求2所述的重组质粒、辅助质粒pCMV-868CP和Opti-MEM混合，然后与TransIT-LT1转染试剂混合静置后转染至BHK-T7/9细胞中；培养、清洗后将MA104细胞株或MA104 N*V工程细胞株与转染的BHK-T7/9细胞混合共培养，拯救得到羊轮状病毒重组病毒株。
6.根据权利要求5所述的羊轮状病毒的反向遗传学病毒拯救系统拯救病毒的方法，其特征在于，所述重组质粒、辅助质粒pCMV-868CP和Opti-MEM混合比例为10～14μg：1～2μg：200～300μL；
所述TransIT-LT1转染试剂、重组质粒、辅助质粒pCMV-868CP的比例为20～35μL：10～14μg：1～2μg；所述混合静置的时间为20～40min；
所述培养使用DMEM完全培养基，所述清洗使用DMEM不完全培养基，所述培养的时间为42～54h；所述共培养的时间为2～5天。
7.权利要求1所述的羊轮状病毒重组质粒或权利要求2所述羊轮状病毒的反向遗传学病毒拯救系统在构建表达外源蛋白的重组病毒或改造轮状病毒遗传特征中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，将所述表达外源蛋白的基因片段连接到权利要求1所述的重组质粒上构建得到表达外源蛋白的重组病毒。
9.权利要求1所述的羊轮状病毒重组质粒或权利要求2所述羊轮状病毒的反向遗传学病毒拯救系统在制备疫苗、药物和诊断试剂开发中的应用。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014032082A1 (en) * | 2012-08-27 | 2014-03-06 | Murdoch Childrens Research Institute | Modified human rotaviruses and uses therefor |
| US20190282689A1 (en) * | 2016-09-27 | 2019-09-19 | Osaka University | Method for producing artificial recombinant rotavirus |
| WO2022221159A1 (en) * | 2021-04-15 | 2022-10-20 | Merck Sharp & Dohme Llc | Rotavirus vectors for heterologous gene delivery |
| CN115942955A (zh) * | 2020-04-20 | 2023-04-07 | 印第安纳大学理事会 | 重组轮状病毒表达系统和重组轮状病毒 |
| CN116694578A (zh) * | 2023-04-29 | 2023-09-05 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 稳定表达t7聚合酶细胞系、轮状病毒反向遗传系统及其构建方法和应用 |
-
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Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014032082A1 (en) * | 2012-08-27 | 2014-03-06 | Murdoch Childrens Research Institute | Modified human rotaviruses and uses therefor |
| US20190282689A1 (en) * | 2016-09-27 | 2019-09-19 | Osaka University | Method for producing artificial recombinant rotavirus |
| CN115942955A (zh) * | 2020-04-20 | 2023-04-07 | 印第安纳大学理事会 | 重组轮状病毒表达系统和重组轮状病毒 |
| WO2022221159A1 (en) * | 2021-04-15 | 2022-10-20 | Merck Sharp & Dohme Llc | Rotavirus vectors for heterologous gene delivery |
| CN116694578A (zh) * | 2023-04-29 | 2023-09-05 | 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心） | 稳定表达t7聚合酶细胞系、轮状病毒反向遗传系统及其构建方法和应用 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| DING S等: "Perspectives for the optimization and utility of the rotavirus reverse genetics system", 《VIRUS RES》, vol. 303, 28 July 2021 (2021-07-28), pages 1 - 4, XP086725144, DOI: 10.1016/j.virusres.2021.198500 * |
| 刘夏飞等: "基于质粒的轮状病毒反向遗传学研究进展", 《病毒学报》, vol. 39, no. 02, 17 March 2023 (2023-03-17), pages 549 - 560 * |
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