CN115747231B - Ⅰ型猫冠状病毒病毒样颗粒、制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种Ⅰ型猫冠状病毒病毒样颗粒、制备方法及应用，所述Ⅰ型猫冠状病毒病毒样颗粒由能够稳定分泌猫冠状病毒E、M、N和S蛋白的四种重组杆状病毒共感染后组装生成，包含完整的猫冠状病毒E、M、N和S蛋白，大小约70～120nm，形态与天然病毒一致。将本发明得到的Ⅰ型猫冠状病毒病毒样颗粒免疫小鼠后能够均能够产生高滴度的抗体水平，同时刺激机体产生细胞免疫。

Description

Ⅰ型猫冠状病毒病毒样颗粒、制备方法及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及Ⅰ型猫冠状病毒病毒样颗粒、制备方法及应用。

背景技术

猫冠状病毒(Feline coronavirus, FCoV)属于冠状病毒科，α冠状病毒属，编码四种结构蛋白：纤突糖蛋白（S）、膜蛋白（M）、包膜蛋白（E）和核衣壳蛋白（N）。冠状病毒的S蛋白是一种膜糖蛋白，被认为是结合和进入细胞的病毒调节因子，是诱导中和抗体产生的主要抗原。M蛋白是最丰富的包膜蛋白，可驱动其他结构组装入VLP中。E蛋白与M蛋白均可促进病毒粒子组装和释放。N蛋白是病毒核衣壳中唯一已知的蛋白组成部分。FCoV首先会入侵小肠绒毛上皮细胞并在细胞内复制，感染后2-3天FCoV会通过粪便进行散毒，这种感染通常是无症状的，但有时会伴有肠炎表现。感染后2周，可在结肠内发现病毒，而回盲交界处是持续性感染无症状病毒携带猫的主要病毒复制部位。

FCoV根据S蛋白氨基酸序列差异分为2种基因型：I型和II型。基因I型FCoV是主要流行基因型，在世界范围内广泛流行，感染率高达80-95%；基因II型FCoV由犬冠状病毒(Canine coronavirus，CCoV)和基因І型FCoV同源重组而来，在临床中不常见，主要流行与亚洲地区。根据导致的临床症状和病理变化FCoV又可分为猫肠道冠状病毒（Felineenteric coronavirus，FECV）和猫传染性腹膜炎病毒（Feline infectious peritonitisvirus，FIPV）两种生物型。目前普遍认为，FIPV是由FECV在猫体内发生突变而来。FIPV导致的猫传染性腹膜炎（Feline infectious peritonitis，FIP）是一种慢性致死性疾病，主要特征为腹腔积液或者胸腔积液，剖检可见腹腔含有纤维蛋白的淡黄色积液，在肝脏、肾脏和网膜表面存在白色颗粒状的炎性渗出物，覆盖肝脏或脾脏并延伸到实质中，是各年龄阶段的猫死亡的主要原因之一。FECV的感染则仅局限于消化道，会引起猫的体温上升，食欲不振甚至脱水等症状。基因I型和II型FCoV均可在体内突变为FIPV。

在冠状病毒家族中，严重急性呼吸综合征冠状病毒2型(Severe AcuteRespiratory Syndrome Coronavirus 2, SARS-CoV-2)、猪流行性腹泻病毒（PorcineEpizootic Diarrhea Virus，PEDV）和牛冠状病毒(Bovine CoV, BCoV)等的病毒样颗粒(Virus-like particles, VLPs)均已在实验室构建成功。VLPs由于其缺乏病毒遗传物质并且空间构象类似于真实病毒，具有良好的安全性和免疫原性，近年来已成为疫苗研究领域的热点。杆状病毒-昆虫细胞系统蛋白表达产量高，并且显示完整的包括糖基化在内的翻译后修饰，是目前表达生产VLPs应用最为广泛的系统。到目前为止，几种基于VLPs的疫苗已经商品化生产，例如重组乙型肝炎病毒（Hepatitis B Virus，HBV）疫苗、人乳头瘤病毒（HumanPapillomavirus，HPV）疫苗、人戊肝病毒（Hepatitis E Virus，HEV）疫苗和猪圆环病毒2型（Porcine circovirus-2, PCV-2）疫苗等，但FCoV的VLPs仍未见报道。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供Ⅰ型猫冠状病毒病毒样颗粒、制备方法及应用。

第一方面，本发明提供一种Ⅰ型猫冠状病毒结构蛋白基因，包括以下蛋白中的至少一种：包膜蛋白E基因、膜蛋白M基因、核衣壳蛋白N基因和纤突糖蛋白S基因，并进行扩增；

所述包膜蛋白E基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述膜蛋白M基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述核衣壳蛋白N基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述纤突糖蛋白S基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一些实施例中，所述扩增时，包膜蛋白E基因的核苷酸序列的正向引物如SEQ ID NO.5所示；反向引物序列如SEQ ID NO.6所示；

膜蛋白M基因的核苷酸序列的正向引物序列如SEQ ID NO.7所示；反向引物序列如SEQ ID NO.8所示；

核衣壳蛋白N基因的核苷酸序列的正向引物序列如SEQ ID NO.9所示；反向引物序列如SEQ ID NO.10所示；

纤突糖蛋白S基因的核苷酸序列的正向引物序列如SEQ ID NO.11所示；反向引物序列如SEQ ID NO.12所示。

第二方面，本发明提供一种重组质粒，其包括前述Ⅰ型猫冠状病毒结构蛋白基因。

第三方面，本发明提供一种重组杆粒，其包括前述重组质粒。

第四方面，本发明提供一种重组杆状病毒，其包括前述的重组杆粒。

第五方面，本发明提供一种Ⅰ型猫冠状病毒病毒样颗粒，其由前述Ⅰ型猫冠状病毒结构蛋白基因装配而成。

第六方面，本发明提供一种Ⅰ型猫冠状病毒病毒样颗粒的制备方法，包括：

（1）设计并扩增Ⅰ型猫冠状病毒结构蛋白基因；

（2）构建重组质粒；

（3）构建重组杆粒；

（4）将（3）中的重组杆粒转染细胞，得到重组杆状病毒；

（5）将重组杆状病毒共感染细胞，得到Ⅰ型猫冠状病毒病毒样颗粒。

第七方面，本发明提供一种免疫原，其包括前述的Ⅰ型猫冠状病毒结构蛋白基因。

第八方面，本发明提供一种药物组合物，包括：前述的Ⅰ型猫冠状病毒结构蛋白基因。

所述药物组合物还可以包括药学上可接受的佐剂和/或辅料。

辅料是指生产药物组合物和调配处方时所用的赋形剂和附加剂，具有赋形、保护活性成分、提高稳定性、增溶、助溶、缓控释等重要功能，以使药物组合物达到一定的保质期和生物利用度，从而提高药物组合物的安全性和有效性。可与本申请的药物组合物共同施用的辅料包括但不限于糖、蛋白、氨基酸和高分子聚合物。

第九方面，本发明提供了一种前述的Ⅰ型猫冠状病毒结构蛋白基因在制备用于治疗和/或预防Ⅰ型猫冠状病毒感染的疫苗和/或药物中的用途。

本发明具有如下有益效果：

（1）本发明病毒样颗粒包含完整的猫冠状病毒E、M、N和S蛋白，大小约70~120 nm，形态与天然病毒一致；利用该Ⅰ型猫冠状病毒病毒样颗粒制备疫苗，免疫小鼠后能够均能够产生高滴度的抗体水平，同时刺激机体产生细胞免疫，小鼠免疫FCoV VLPs 2免14天后诱导产生的FCoV抗体滴度达到1:12800。

（2）本发明提供的疫苗免疫效果佳，安全性好，质量可控，可用于猫冠状病毒病毒病的预防，可用作候选疫苗，具有良好的开发与应用前景。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：

图1为Dual-2E、Dual-2M、Dual-2N和Dual-2S重组质粒酶切鉴定，a：pH启动子双酶切；b：p10启动子双酶切；c：单酶切鉴定；

图2为DH10-2E、DH10-2M、DH10-2N和DH10-2S重组杆粒鉴定，(a) 重组杆粒蓝白斑筛选结果；(b)重组杆粒的PCR鉴定结果；

图3为重组杆状病毒感染导致的Sf9细胞病变；

图4为重组杆状病毒的基因组PCR鉴定；

图5为免疫荧光染色分析重组杆状病毒感染后48 h的 Sf9 细胞中E 、M、N和S 蛋白表达（分辨率200μm），(A)感染重组杆状病毒FastBac-2E后的Sf9细胞，(B)感染重组杆状病毒FastBac-2M后的Sf9细胞，(C)感染重组杆状病毒FastBac-2N后的Sf9细胞，(D)感染重组杆状病毒FastBac-2S后的Sf9细胞，(E) 正常Sf9细胞，FITC 为偶联抗体(绿色)，DAPI用于染色细胞核(蓝色)，Merge表示 FITC 与 DAPI 合并；

图6为Western blotting分析重组杆状病毒感染后 Sf9 细胞分泌的E 、M、N和S蛋白，“-”表示阴性对照（从未感染昆虫细胞收集的培养基），1: MOI= 0.5, 2: MOI= 0.2,3: MOI=0. 05, 4: MOI= 0.005；

图7为Western blotting和电镜鉴定不同蛋白组装的FCoV VLPs（比例尺对应于100 nm），“-”表示阴性对照（从未感染昆虫细胞收集的培养基），(A): Western blotting鉴定FCoV VLPs。(B)电镜鉴定FCoV VLPs；

图8为蔗糖密度梯度离心纯化FCoV VLPs，（A）蔗糖密度梯度离心，红色框中为白色沉淀层，(B) Western blotting分析纯化中及纯化后的FCoV VLPs， 1：纯化前的FCoVVLPs，2：浓缩后的FCoV VLPs，3：纯化后的FCoV VLPs， (C)透射电镜观察纯化后的 FCoVVLPs，比例尺对应于100nm；

图9为ELISA检测小鼠血清中的FCoV N和S蛋白抗体，（A）免疫过程中IgG的变化；（B）初次免疫后28天小鼠血清中的IgG抗体滴度；

图10为细胞内IFN-γ和IL-4染色分析结果。

具体实施方式

以下通过具体的实施案例以及附图说明对本发明作进一步详细的描述，应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定。

除非另有说明，以下实施例中使用的培养基、试剂和溶液均为市售商品，或者可以通过本领域已知方法制备。

实施例1

1.材料

1.1试验仪器

超净工作台(SterilGARD Ⅲ Advance)购自BAKER；超高速离心机购自Beckman；低温冷冻离心机(centrifuge 5427 R)、PCR仪和移液器购自eppendorf；恒温水浴锅购自北京市永光明医疗仪器有限公司；蛋白电泳仪、转模仪和多功能成像系统(ChemiDoc MPImaging System)购自Bio-red；恒温培养振荡箱(ZWY-100H)购自上海智诚有限公司；超纯水仪(MicroPure ST)购自Thermo；荧光倒置显微镜(U-HGLGPS)购自OLYMPUS；恒温培养箱(HPX-9052MBE)购自苏州博讯有限公司；高压蒸汽灭菌锅购自上海申安医疗器械厂；恒温金属浴购自宝予德（中国）有限公司。

1.2细胞与载体

Sf9细胞购自武汉普诺赛有限公司；DH10Bac和pFast Bac-Dual由本实验室保存。

1.3试验试剂

T4连接酶、QuickCut EcoR Ⅰ、QuickCut Xba Ⅰ、QuickCut XhoⅠ和QuickCut Kpn Ⅰ限制性内切酶及BacPAK™杆状病毒快速滴度试剂盒(631406)购自TAKARA；Cellfection^®ⅡReagent购自Thermo；DH5α购自北京天根有限公司；Sf9细胞完全培养基及无血清培养基购自武汉普诺赛有限公司；Quick Taq HS DyeMix购自TOYOBO；胶回收试剂盒、纯化试剂盒、质粒提取试剂盒和去内毒素质粒小提试剂盒均购自OMEGA；氨苄霉素、庆大霉素、卡那霉素、四环素、X-gal、IPTG、LB液体培养基及LB固体培养基均购自北京索莱宝科技有限公司；兔抗猫IgG(HRP+FITC)、兔抗鼠IgG(HRP+FITC)、蛋白酶K、超敏ECL化学发光底物、TMB显色液和BCA蛋白浓度测定试剂盒购自北京博士德有限公司。

2.试验方法

2.1重组质粒的构建与鉴定

以已报道的中国西南地区FCoV流行毒株SMU-CDF19 (GenBank No. MW316842.1)的模板，送上海生工生物工程有限公司针对Sf9细胞优化后合成其E、M、N和S基因，合成后的基因序列分别见SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4。合成时加入酶切位点，PH启动子采用EcoRⅠ和Hind III两个酶切位点，p10启动子采用XhoⅠ和KpnⅠ两个酶切位点。利用限制性内切酶将目的序列从中间载体进行酶切，双酶切体系为限制性内切酶各1µL、Buffer 2 µL、质粒10 µL，最后加入ddH₂O补足20 µL，37℃酶切20 min，酶切产物用E.Z.N.A. Gel Extraction Kit对其进行产物纯化。分别将纯化后的E、M、N和S基因针对PH启动子的片段连接至pFast Bac-Dual并转化至DH5α。

采用菌落PCR挑取阳性菌落，扩大培养后的菌液用E.Z.N.A. Plasmid Mini KitⅠ提取质粒，按上述方法进行双酶切。酶切后的产物进行胶回收，将酶切后的载体(含有PH启动子端的E、M、N和S基因)在p10启动子端继续分别连接E、M、N和S基因。

两端启动子均连接成功后，按上述方法提取质粒，对Dual-2E、Dual-2M、Dual-2N和Dual-2S重组质粒进行双酶切和测序鉴定。

2.2重组杆粒的获得与鉴定

将鉴定正确的重组质粒Dual-2E、Dual-2M、Dual-2N和Dual-2S分别转化至DH10Bac(方法同上)涂布含有50 µg/mL卡那霉素、7 µg/mL庆大霉素、10 µg/mL四环素、100 µg/mLBluo-gal和40 µg/mL IPTG的平板，48h后，平板上长出蓝色菌落和白色菌落，挑选圆形的白色菌落划线纯化，直至平板上长出的菌落均为白斑。挑取单菌落置于含有三抗的LB液体中，200 rpm/min增菌18 h，使用E.Z.N.A. Endo-Free Plasmid Maxi Kit提取重组杆粒，采用PCR法鉴定重组杆粒，利用表1中的引物分别扩增提取的DH10-2E、DH10-2M、DH10-2N和DH10-2S重组杆粒中的E、M、N和S基因（表1为S基因的引物），将扩增后的PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定后正确即为重组杆状病毒的基因组。

，

2.3重组杆状病毒的拯救

传代Sf9细胞至6孔细胞板，每孔2 mL，约1×10⁶ cells，置于27℃恒温培养箱内培养 10-12 h，Cellfection^®Ⅱ Reagent进行转染。转染过程如下：

1.分别向4个1.5 mL EP管中加入100 µL不含血清和抗生素的Sf9细胞培养基，分别取8 µL转染试剂加入100 µL Sf9细胞培养基中，涡旋混匀后室温静置30 min。

2.分别向4个1.5 mL EP管中加入100 µL不含血清和抗生素的Sf9细胞培养基，分别向管中加入6-8 µg DH10-2E、DH10-2M、DH10-2N和DH10-2S重组杆粒，轻轻混匀。

3.分别将稀释后的Cellfection®Ⅱ Reagent与DH10-2E、DH10-2M、DH10-2N和DH10-2S重组杆粒(约210 µL) 轻轻混匀，室温静置15-30 min。

4.静置期间，弃去6孔板中的细胞培养基，轻轻加入2.5 mL 1.5% FBS的Sf9细胞培养基，室温静置15 min。

5.分别将含有重组杆粒的混合液均匀滴加至6孔板中，27℃培养箱中静置培养4h。静置4 h后取出6孔板，弃去细胞培养基，延壁缓慢加入Sf9细胞完全培养基，培养96 h。

6.细胞出现明显的膨大变圆后分别收获细胞培养液，若未观察到明显病变则按细胞培养液3%连续传代病毒，直至产生病变收获重组杆状病毒，分别命名为FastBac-2E、FastBac-2M、FastBac-2N和FastBac-2S。

2.4 重组杆状病毒的鉴定

2.4.1 基因组PCR鉴定

分别取第3代FastBac-2E、FastBac-2M、FastBac-2N和FastBac-2S重组杆状病毒培养液10 µL，加入10 µL Proteinase K，涡旋混匀后58℃水浴1 h，取出煮沸5 min，即得到重组杆状病毒的基因组DNA。分别以四种重组杆状病毒的基因组DNA为模板，利用表1中的引物对其进行PCR鉴定。

2.4.2 间接免疫荧光鉴定

传代Sf9细胞至6孔细胞板，每孔2 mL，约1×10⁶ cells，置于27℃恒温培养箱内培养 10-12 h，按细胞培养液3%分别接入第3代FastBac-2E、FastBac-2M、FastBac-2N和FastBac-2S重组杆状病毒27℃恒温培养48 h。

（1）从培养箱中取出已经膨大变圆的细胞，弃去原培养液，加入预冷的80%丙酮，4℃固定30 min。

（2）弃去丙酮液，用PBST洗涤3次，每次5 min。

（3）洗涤后每孔分别加入5%脱脂奶37℃封闭1 h。重复步骤2洗涤3次。

（4）分别加入5% BSA稀释的抗E、M、N和S蛋白的一抗，37℃孵育1 h。重复步骤2洗涤3次。

（5）避光加入PBST稀释的FITC标记的二抗，37℃孵育45 min，用PBST洗涤5次，每次5 min。

（6）吸干6孔板中的液体，均匀滴加少量DAPI染液，在避光条件下用荧光倒置显微镜观察目的蛋白的表达情况。

2.5重组杆状病毒滴度的测定

利用Bac PAK杆状病毒滴度快速测定试剂盒测定FastBac-2E、FastBac-2M、FastBac-2N和FastBac-2S重组杆状病毒的滴度，测定步骤如下：

1.传代sf9细胞至96孔板，每孔6.5×10⁴个细胞。

2.将96孔板放入密封的塑料袋中，孵育27℃ 1 h；

3.取900 μL含添加物的完全培养基和100 μL病毒培养上清，连续稀释为10^-4、10^-5和10^-6，然后轻轻混匀；

4.将96孔板中的培养基用排枪轻轻吸出，在含有细胞的96孔板中加入25 μL连续稀释的病毒，做3个复孔，另外加25 μL培养基做阴性对照；

5.将上述96孔板放入密封的塑料袋中，室温孵育1 h；

6.将病毒稀释液小心吸出，然后加入50 μL甲基纤维素，放入密封的塑料袋中，培养27℃ 43~47 h；

7.向含有甲基纤维素的孔中加入每孔150 μL预冷的丙酮，室温10 min，将板中的液体甩出，用200μl PBST（含 0.05% Tween 20）洗板三次，每次 5 min；

8.加入已经稀释过的正常羊血清50 μL，室温封闭5 min，将液体甩出；

9.加入按比例稀释的gp64鼠单克隆抗体50μL，37℃孵育 25 min，甩出板中的液体，用200 μL（含 0.05% Tween 20）PBST洗板两次，每次5 min；

10.加入稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗50 μL，孵育37℃ 25 min，甩出板中的液体，洗板三次采用PBST（含 0.05% Tween 20）200 μL，每次 5 min；

11.加入底物50 μL室温显色3 h，蓝色斑点出现之后，在倒置荧光显微镜下观察感染灶，计算出杆状病毒的滴度。

2.6 猫冠状病毒病毒样颗粒的装配与纯化

2.6.1 杆状病毒蛋白表达量的优化

传代Sf9细胞至T25细胞瓶，每瓶5 mL，约1×10⁶ cells/mL，置于27℃恒温培养箱内培养10-12 h。根据2.2.5测定的杆状病毒滴度接入不同感染复数(MOI=0.005, MOI=0.05, MOI=0.2, MOI=0.5)的FastBac-2E、FastBac-2M、FastBac-2N和FastBac-2S重组杆状病毒，共计16个T25细胞瓶，27℃恒温培养96 h。取出病变的细胞冻融3次，100 W超声破碎15s，冰上静置15 min后再次破碎15 s。3000 rpm/min 4℃低温离心10 min，取上清，WesternBlot 分析不同MOI蛋白表达量的差异。

2.6.2 猫冠状病毒病毒样颗粒的装配

传代Sf9细胞至T75细胞瓶，约1×10⁶ cells/mL，每瓶20 mL，置于27℃恒温培养箱内培养10-12 h。根据2.6.1鉴定的最优表达MOI接入FastBac-2E、FastBac-2M、FastBac-2N和FastBac-2S重组杆状病毒，分别组装M和S蛋白，E、M和S蛋白，M、N和S蛋白，E、M、N和S蛋白四种不同组合的FCoV VLP。27℃培养120h，冻融细胞3次，吸出细胞培养液4500 rpm/min 4℃低温离心30 min，取上清，用裂解液重悬沉淀，4℃静置15 min后破碎细胞碎片，方法同2.6.1，分别取4种不同蛋白组装的VLP的上清液进行透射电镜观察。

2.6.3 猫冠状病毒病毒样颗粒的纯化

按照2.6.2方法组装包含E、M、N和S四种蛋白的FCoV VLP100 mL，纯化步骤如下：

1.共感染细胞120 h后，取出细胞冻融3次，4000 rpm/min室温离心20 min取上清，0.45 µm滤器过滤。

2.将沉淀的细胞碎片使用10 mL步骤1中的细胞上清重悬，置于冰上，每5 min超声15 s，直至液体变澄清，最后在4℃下以4000 rpm/min离心20 min，取上清。

3.将澄清的含VLP的培养基(包括步骤1和2溶液)加到20%蔗糖垫上，然后在Beckman SW 32 Ti转子中以4℃和30000 rpm/min超速离心2 h，将沉淀重悬于3 mL含有5%蔗糖的TNE缓冲液中，即为浓缩后的FCoV VLP。

4.按浓度从小到大的顺序添加20%、30%和60%的蔗糖溶液，最后将样本加在蔗糖溶液的上面，4℃，30000 rpm/min，进行蔗糖不连续密度梯度离心1 h。

5.小心吸取30%和60%蔗糖溶液之间的白色分离层，用PBS补充至35 mL，4℃，30000rpm/min，再次离心1 h，将沉淀重悬于2 mL PBS缓冲液中，即为纯化后的FCoV VLP。

6.采用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度后，分装保存于-80℃冰箱备用。

2.7 猫冠状病毒病毒样颗粒的鉴定

2.7.1 电镜观察

将2.6.2组装的含有不同蛋白的四种FCoV VLP细胞培养液的上清，分别滴加在铜网上，室温孵育5 min，用滤纸轻轻吸去铜网上多余的液体，晾干后，滴加1%磷钨酸，室温染色3 min。室温晾干后进行透射电镜观察。

2.7.2 Western Blot鉴定

取纯化的FCoV VLPs溶液50 μL，加入 5×上样缓冲液，放于沸水中煮8 min后进行SDS-PAGE电泳，电泳结束时，首先铺上用转膜液浸湿的滤纸，将聚丙烯酰胺凝胶平放至滤纸上，最后在盖上经无水甲醇浸泡90s后的PVDF膜，排尽气泡，200毫安电流，转模2 h。转膜结束后，放入5%脱脂奶中封闭2 h。封闭后洗去脱脂奶放入封闭液稀释的一抗中，4℃孵育过夜。TBST洗膜3次，10 min/次，然后加入封闭液稀释好的辣根过氧化物酶（Horse RadishPeroxidase, HRP）标记的二抗，室温孵育60 min。TBST洗膜3次，10 min/次。在PVDF膜上滴加ECL化学发光液，放入蛋白凝胶成像仪中进行曝光显色。

2.2.8 猫冠状病毒病毒样颗粒免疫小鼠

2.8.1 试验动物与免疫原

6-8周龄的BALB/c雌性小鼠购买自成都达硕公司。由FCoV的S、N、M和E蛋白在Sf9细胞中表达并装配形成的FCoV VLPs， MF59水包油纳米佐剂购买自艾伟拓（上海）医药科技有限公司

2.8.2 小鼠免疫

将购买的6-8周龄试验用BALB/c小鼠随机分成3组（肌肉注射VLPs组、滴鼻VLPs组和对照组），每组5只。分别采用滴鼻和肌肉注射两种方式，每只小鼠免疫50 µg纯化后的FCoV VLPs，Mock组每次每只免疫MF59佐剂200 µL，免疫间隔为2周。

2.8.3 ELISA抗体检测

分别在免疫前和免疫后每周采集小鼠血液，分离血清后-20℃保存。将FCoV S和N蛋白稀释至1 µg/mL后分别加入酶标板，放置4℃包被过夜。次日，取出酶标板弃去液体，用PBST洗涤3min后加入100 µL 5%BSA放置37 ℃封闭1 h。用PBST洗涤3min后加入倍比稀释的待测小鼠血清，37 ℃孵育2 h。孵育结束后弃去酶标板中的液体，PBST洗涤3次，每次3min。加入羊抗鼠酶标二抗孵育1 h，洗涤同上。加入100 µL TMB显色液15 min后加入终止液终止显色，最后在酶标仪中读取450 nm处的吸光值。

2.8.4 胞内因子染色分析

将2免后14天的小鼠眼球采血后，进行脱臼处死，取脾脏用研磨法分离脾淋巴细胞。采用红细胞裂解液去除红细胞后，用PBS将脾淋巴细胞的细胞密度调整至1×10⁶cells/mL。取流式管，分别取100 μL单细胞悬液，按照eBioscience™ Foxp3/转录因子染色缓冲液套件说明书进行固定破膜处理。固定破膜后，分别加入IFN-γ和IL-4抗体各1 μg，混匀后4℃避光染色30 min。染色完成后加入400 μL PBS重悬细胞，用流式细胞仪检测，采用Everest软件对数据进行分析。

3 结果

3.1 重组质粒的构建与鉴定

将E、M和N基因连接至pFast Bac Dual载体后，获得质粒经测序鉴定（图1），FCoV E基因长度为249 bp、M基因长度为789 bp和N基因基因长度为112134 bp。经酶切和测序鉴定正确后命名为Dual-2E、Dual-2M和Dual-2N重组质粒。另外Dual-2S重组质粒由上海生工生物有限公司合成并连接。

3.2 重组杆粒的获得与鉴定

将2.3.1鉴定成功的重组质粒分别转化至DH10 Bac感受态细胞中，经蓝白斑筛选后菌落PCR鉴定获得DH10-2E、DH10-2M、DH10-2N和DH10-2S重组杆粒（图2）。

3.3 重组杆状病毒的鉴定

3.3.1重组杆状病毒感染细胞

传代Sf9细胞至6孔细胞培养板中，使用Cellfection^®Ⅱ Reagent分别将DH10-2E、DH10-2M、DH10-2N和DH10-2S重组杆粒转染至Sf9细胞中，转染后连续传代至第3代观察到明显的细胞病变，细胞病变表现为细胞变圆膨大（图3），48 h后逐渐脱落，96 h脱落细胞明显增多，达80%。

3.3.2 杆状病毒滴度测定结果

基因组PCR、间接免疫荧光和免疫印迹鉴定结果表明，成功获得分别能够稳定表达FCoV E、M、N和S蛋白的重组杆状病毒。根据2.2.5中的方法测定杆状病毒的滴度分别为E：1.08×10⁷ IFU/mL、M：8.8×10⁶ IFU/mL、N：9.2×10⁶ IFU/mL和S：1×10⁷ IFU/mL。

3.3.3 基因组PCR鉴定重组杆状病毒

采用基因组PCR的方法对转染后的重组杆状病毒进行鉴定，琼脂糖凝胶电泳结果显示重组杆状病毒FastBac-2E、FastBac-2M、FastBac-2N和FastBac-2S分别在249 bp(E)、789 bp (M)、11234 bp (N)和1032 bp (S)处出现了目的条带（图4）。

3.3.4 间接免疫荧光鉴定

根据2.2.4.2描述的方法鉴定重组杆状病毒中FCoV蛋白的表达，与对照细胞相比，重组杆状病毒FastBac-2E、FastBac-2M、FastBac-2N和FastBac-2S均产生了明显的荧光（图5），这表明四种重组杆状病毒分别表达了FCoV的E、M、N和S蛋白。

3.3.5 免疫印迹鉴定

收取不同MOI感染的四种杆状病毒的Sf9细胞上清液，通过Western Blotting实验鉴定上清液中的蛋白表达，结果显示FastBac-2M、FastBac-2N和FastBac-2S分别在MOI为0.5、0.05和0.05时蛋白表达量最高。而FastBac-2E由于表达的FCoV E蛋白分子量太小，约8-12 KDa，并且表达量低，仅在MOI为0.05和0.005处出现非常弱的条带（图6）。

3.4 猫冠状病毒VLP的鉴定

3.4.1 电镜鉴定

分别取2.2.6.2中组装的MS、MNS、EMS和EMNS 4种不同蛋白组合的VLP，在电镜下观察，结果显示：四种不同的蛋白组合均能够观察到FCoV VLP，但在没有E蛋白参与组装的情况下，S蛋白也无法组装进入VLP。此外N蛋白参与组装的VLP大小统一、形态更稳定（图7）。综上所述，同时包含E、M、N和S四种结构蛋白的FCoV VLP的形态与大小最接近天然病毒。

3.4.2 Western Blot分析

以临床收集的FCoV阳性猫血清为一抗，分别对MS、MNS、EMS和EMNS 4种FCoV VLP进行Western Blotting鉴定分析，结果显示在相应位置14 KDa (E)、25 KDa (M)、43 KDa (N)和250 KDa (S)均出现了条带（图7），表明四种VLP由相应的FCoV蛋白组成。

3.5 猫冠状病毒VLP的纯化

根据2.2.6.3中描述的方法，从100 mL组装后的Sf9细胞中纯化蛋白（图8）。纯化完成后，经BCA试剂盒测定浓度，从100 mL组装后的Sf9细胞上清中约纯化得到3 mg FCoVVLPs。

3.6 免疫小鼠血清抗体检测结果

收集免疫后小鼠血清通过ELISA检测FCoV S和N蛋白抗体水平。结果显示（图9A），免疫的FCoV VLPs的特异性抗体均逐渐升高，而Mock组和滴鼻免疫组无明显升高，滴鼻免疫组的特异性抗体只在2免后14天检测到有轻微升高。将小鼠血清进行倍比稀释后检测FCoVS和N蛋白抗体效价，结果显示（图9B）：滴鼻组产生的抗体滴度高于Mock组，但明显低于肌肉注射组，滴鼻组与佐剂组的抗体滴度无统计学差异。小鼠免疫FCoV VLPs2免14天后诱导产生的FCoV抗体滴度达到1:12800。

3.7 免疫小鼠胞内因子染色分析结果

为了进一步检测FCoV VLPs在小鼠体内刺激T淋巴细胞所产生的免疫应答效果，我们对2免后14天的小鼠进行脾淋巴细胞的分离，并检测T细胞分泌的IFN-γ和IL-4两种细胞因子。结果显示（图10），肌肉注射免疫和滴鼻免疫组均诱导机体T细胞产生了较高水平的IFN-γ和IL-4，与Mock组相比具有显著差异。肌肉注射免疫组诱导产生的IFN-γ水平高于滴鼻免疫组，而滴鼻免疫组诱导产生的IL-4水平略高于肌肉注射免疫组。

综上所述，本发明成功构建了能够分别分泌表达FCoV S、N、M和E蛋白的重组杆状病毒FastBac-2E、FastBac-2M、FastBac-2N和FastBac-2S。将这四种杆状病毒共同感染昆虫细胞后可自组装形成FCoV VLPs，透射电镜观察自组装的FCoV VLPs多呈球形，表面分布棘突，近似于与天然病毒。将收获的FCoV VLPs与佐剂混合后制备成疫苗免疫小鼠后，诱导产生了高水平的血清抗体，IL-4和IFN-γ细胞因子水平也显著上升。VLPs疫苗能够刺激机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫应答，安全性高，具有广阔的应用前景。

本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的技术方案及其核心思想；本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本申请实施例的技术方案的范围。

Claims (2)

1.一种Ⅰ型猫冠状病毒病毒样颗粒，其特征在于，其由序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列编码的蛋白装配而成。

2.权利要求1所述的Ⅰ型猫冠状病毒病毒样颗粒在制备用于治疗和/或预防Ⅰ型猫冠状病毒感染的疫苗和/或药物中的用途。