KR101316102B1 - 로타바이러스 나노입자를 이용한 재조합 복합 항원의 제조방법 - Google Patents

로타바이러스 나노입자를 이용한 재조합 복합 항원의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 이종 바이러스 항원 에피톱이 탑재된 로타바이러스 복합 항원 발현용 컨스트럭트, 상기 로타바이러스 복합 항원을 포함하는 백신 조성물, 로타 바이러스 복합항원을 포함하는 로타바이러스 바이러스 유사입자, 및 로타바이러스 유사입자를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 로타바이러스의 항원과 함께 로타바이러스와 다른 이종 바이러스의 에피톱을 동시에 함유하는 복합항원과 이 복합항원을 포함하는 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 저비용으로 대량생산 할 수 있으며, 로타바이러스 및 이종 바이러스에 대한 신규 복합 백신의 연구 및 개발에 응용될 수 있다.

Description

로타바이러스 나노입자를 이용한 재조합 복합 항원의 제조방법{Method for Preparing Recombinant Antigen Complex Using Rotavirus Nanoparticle}
본 발명은 로타바이러스 나노입자를 이용한 재조합 복합 항원의 제조방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 이종바이러스 항원 및 로타바이러스 항원이 연결된 재조합 로타바이러스 복합 항원 단백질, 이를 포함하는 백신 조성물 및 이를 제조하는 방법과, 상기 로타바이러스 항원 단백질을 포함하는 로타바이러스의 바이러스 유사입자(Virus like particle: VLP), 상기 바이러스 유사입자를 포함하는 백신 조성물, 상기 바이러스 유사입자를 생산하는 방법 등에 관한 것이다.
로타바이러스(Human Rotavirus, HRV)는 영유아에서 설사를 유발하는 주요 바이러스로서 한국을 비롯해 전 세계 5세 이하 소아 95％가 적어도 한 번 이상 감염되며 전 세계적으로 매년 발생하는 약 125,000,000명의 설사환자의 약 40％를 차지하는 것으로 알려져 있으며, 공중보건학적으로 매우 중요한 병인체이다(Patel et al. 2011. Pediatr Infect Dis J 30:S1-S5). 이들 바이러스는 피막이 없고, 직경 75 nm의 정 20 면체 형태로 외부캡시드(outer capsid), 내부캡시드(inner capsid), 코어단백질(core protein)의 3중 층 단백질 캡시드(triple layered protein capsid)로 구성되어 있으며, 11 개의 분절로 구성된 dsRNA 바이러스로 알려져 있다. 각각의 분절은 6 개의 구조단백질(VP1, VP2, VP3, VP4, VP6, VP7)과 6 개의 비구조단백질(NSP 1-6)중 하나를 암호화하고 있다(Estes and Cohen, 1989. Rotavirus gene structure and function. Microbiol Rev 53:410-449). 로타바이러스는 VP6의 항원성에 따라 A군으로부터 G군까지 7개 군으로 분류되며 전 세계적으로 가장 흔한 A군은 다시 면역원성 단백인 VP7에 의한 G형(Glycoprotein type)과 VP4에 의한 P형(Protease-sensitive type)으로 세분될 수 있으며, 현재 23종의 G형과 32종의 P형이 보고되어 있다. 사람에서는 G1-G4, G6, G8-G10과 G12 등 9개 혈청형과 P[3], P[4], P[6], P[8]-P[11]과 P[14] 등 8개 유전자형이 감염을 일으키며 각 혈청형들은 서로 교차방어가 되지 않는 특징이 있다 (Banyai et al. 2009. Arch Virol 154:1823-1829; Matthijnssens et al., 2009. Future Microbiol 4:1303-1316).
미국 질병관리본부(CDC)의 보고에 따르면 로타바이러스 설사증으로 미국에서 소요되는 의료비만도 1년에 1천만 달러에 달하며, 국내의 경우 급성장염으로 입원하는 영 유아 환자의 70％가 이들 바이러스 감염에 기인하는 것으로 알려져 있다. 따라서 세계보건기구(WHO)는 개발도상국에서는 로타바이러스 발생을 감소시키고 선진국에서는 의료비의 절감을 목표로 로타바이러스에 대한 백신개발을 최우선 과제로 삼고 있는 실정이다(Parashar et al. 2003. Emerg Infect Dis 9:565-572).
한편, A형 간염바이러스(Human Hepatitis A virus, HAV)는 최근 미 서부지역, 중동 지역, 일부 아시아 지역에서 감염율이 증가하는 추세에 있으며, 전세계적으로 A형 간염의 확산이 우려되고 있는 실정이다. 우리나라에서도 최근 면역력이 없는 10 대 및 20 대의 젊은 층에서 A형 간염이 급속히 늘기 시작하고 있으며, 가장 빈번한 감염환자 연령은 5-14 세로서 주로 환자의 약 30％가 15세 이하인 것으로 보고되어 있다. 미국에서 1982-1993년에 조사한 결과에 의하면, A형 간염은 47％로서 B형 간염의 37％ 보다 많으며, 혈청학적 검사 결과 미국 전체 인구의 약 33％가 과거에 A형 간염에 이환 되었던 경험이 있는 것으로 알려져 있다(Gust et al. 1992. Vaccine 10:S56-S8). A형 간염바이러스는 Picornavirdae 과에 속하는 27 nm 크기의 RNA 바이러스로서, 평균 28일의 잠복기 후에 고열, 권태감, 식욕부진, 오심, 복통, 암뇨, 황달 등의 임상증상 특징으로 하는 급성 간질환을 유발하며, 로타바이러스와 마찬가지로 피막이 없고, 직경 27 nm의 정 20면체 형태로 7.5 kb의 단일가닥 RNA genome을 가지고 있으며, 한 개의 긴 ORF(P1-3)를 보유하는 것으로 알려져 있다(Totsuka et al. 1999. Intervirology 42:63-68).
A형 간염의 주된 전파경로는 로타바이러스와 같이 분변-경구 통로이며, 오염된 음식물이나 식수에 의하여 전염된다. A형 간염 환자는 약 11 - 22％가 입원치료를 받게 되고, 성인이 입원하는 경우 약 27일 동안 결근하게 되며, 병이 발생하였을 때 환자 1명당 평균 11명의 접촉자에 대한 예방요법이 시행되어야 한다. 미국의 경우, A형 간염 환자 1명당 소요되는 직간접비용은 성인에서는 1,817-2,459 달러, 18세 이하에서는 433-1,492 달러 정도로 추정된 바 있다(WHO. 2000. MMWR Wkly Epidemiol Rec 75:38-44). 국내에서 A형 간염은 서울, 인천, 경기 등 수도권을 중심으로 전국에 급증하고 있으며, 질병관리본부 역학보고에 의하면 2007년도에 A형 간염은 2,233건이 발생하였지만 2008년도 1월부터 6월까지 1,575건이 발생하여 지난해에 비해 과반을 넘어 빠르게 증가하고 있는 실정이다(Korea CDC, 2010).
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 이종 바이러스 항원 에피톱이 탑재된 재조합 로타바이러스 복합 항원을 하나의 발현 벡터 시스템을 이용하여 발현시킬 수 있는 벡터 시스템 및 이를 이용하여 상기 재조합 로타바이러스 복합 항원을 함유하는 로타바이러스의 바이러스 유사 입자를 생산하는 방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, A형 간염바이러스 항원 에피톱 및 로타바이러스 항원을 동시에 발현시킬 수 있는 베큘로바이러스 발현 벡터 시스템을 구축하였고, 이를 숙주세포에 형질전환하여 바이러스 복합 항원을 성공적으로 발현시키고 면역원성을 확인하였다. 또한, 상기 복합 항원과 추가적인 바이러스 구조 단백질을 공동 발현시킴으로써 상기 복합 항원을 갖는 로타바이러스의 바이러스 유사 입자를 성공적으로 생산하고, 이 유사입자의 면역원성도 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 이종 바이러스 항원 및 로타바이러스 항원이 연결된 재조합 로타바이러스 복합 항원 단백질을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 로타바이러스 복합 항원 단백질을 포함하는 백신용 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 로타바이러스 복합 항원 단백질 발현용 컨스트럭트를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 로타바이러스 복합 항원 단백질 발현용 컨스트럭트로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 로타바이러스 복합 항원 단백질의 생산방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 포함하는 백신 조성물을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 발현하기 위한 발현 컨스트럭트를 제공하는 것에 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 생산하는 방법을 제공하는 것에 있다.
본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 이종 바이러스 항원 및 로타바이러스 항원이 연결된 재조합 로타바이러스 복합 항원 단백질을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 이종 바이러스는 A형 간염바이러스인 것을 특징으로 하는 복합 항원 단백질을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 로타바이러스 항원은 VP7 단백질 부위이고, 상기 A형 간염바이러스 항원은 도메인 2(D2) 또는 도메인 3(D3)인 것을 특징으로 하는 복합 항원 단백질을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 VP7 단백질 부위는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 D2는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 D3는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 복합 항원 단백질을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 로타바이러스 항원과 상기 A형 간염바이러스 항원은 펩티드 링커 Leu-Glu-Pro-Gly 또는 Lys-Asp-Glu-Leu 에 의해 연결된 것을 특징으로 하는 복합 항원 단백질을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 상기 로타바이러스 복합 항원 단백질을 유효성분으로 포함하는 백신용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 상기 로타바이러스 복합 항원 단백질을 발현하기 위한 발현 컨스트럭트로서, (a) 이종 바이러스의 항원 및 로타바이러스의 항원이 연결된 복합 항원을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (b) 상기 복합 항원을 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 로타바이러스 복합 항원 단백질 발현용 컨스트럭트를 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 상기 로타바이러스 복합 항원 단백질 발현용 컨스트럭트로 형질 전환된 숙주세포를 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 로타바이러스 복합 항원 단백질의 생산 방법을 제공한다: (a) 상기 로바이러스 복합 항원 단백질 발현용 컨스트럭트로 형질 전환된 숙주세포로를 배양하는 단계: 및 (b) 상기 단계 (a)에서 배양된 배양물로부터 로타바이러스 복합 항원 단백질을 분리 및 정제하는 단계.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, (a) 로타바이러스의 VP2, VP4, 및 VP6의 폴리펩티드, 및 (b) 상기 로타바이러스 복합 항원 단백질을 포함하는 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 VP2의 폴리펩티드는 서열목록 제 4 서열의 아미노산 서열을 갖고, 상기 VP4의 폴리펩티드는 서열목록 제 5 서열의 아미노산 서열을 갖고, 상기 VP6의 폴리펩티드는 서열목록 제 6 서열의 아미노산 서열을 갖는다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 상기 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 포함하는 백신용 조성물을 제공한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 다음을 포함하는 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 발현하기 위한 발현 컨스트럭트를 제공한다: (ⅰ) 프로모터에 작동적으로 연결된 VP2 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1의 재조합 베큘로바이러스; (ⅱ) 프로모터에 작동적으로 연결된 VP4 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2의 재조합 베큘로바이러스; (ⅲ) 프로모터에 작동적으로 연결된 VP6 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3의 재조합 베큘로바이러스; 및 (ⅳ) 프로모터에 작동적으로 연결된, 상기 로타바이러스 복합 항원 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제4의 재조합 베큘로바이러스.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 로타바이러스 복합 항원 단백질을 포함하는 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 생산하는 방법: (a) 상기 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 발현하기 위한 발현 컨스트럭트로 형질 전환된 숙주세포로를 배양하는 단계: 및 (b) 상기 단계 (a)에서 배양된 배양물로부터 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 분리 및 정제하는 단계.
본 명세서에서 사용되는 용어 "복합 항원"은 둘 이상의 상이한 항원 또는 에피톱을 동시에 포함하는 키메릭(chimeric) 항원을 의미한다.
본 발명의 가장 큰 기술적 특징 중에 하나는 로타바이러스 항원에 이종 바이러스의 항원 에피톱이 연결되어 이종 바이러스 항원 에피톱이 탑재된 로타바이러스 복합 항원을 발현시킬 수 있는 발현 컨스트럭트 시스템을 확립하였다는 점에 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "발현 컨스트럭트"는 발현 목적의 뉴클레오타이드 서열 및 이 서열의 발현을 유도하는 서열 (예컨대, 프로모터)을 포함하는 발현을 위한 최소한의 엘리먼트(element)를 의미한다. 이러한 발현 컨스트럭트는 바람직하게는, 전사조절 서열 - 발현 목적의 뉴클레오타이드 서열 - 폴리아데닐화 서열을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로모터"는 진핵세포에서 목적 유전자의 전사(transcription)을 유도할 수 있는 전사 조절 서열을 의미한다. 상기 진핵세포에서 작동 가능한 프로모터 서열은, 사이토메갈로 바이러스의 즉시 초기형 프로모터, SV40의 프로모터(SV 40 후기형 프로모터 및 SV 40 초기형 프로모터), HSV(herpes simplex virus)의 tk 프로모터, 아데노바이러스 2 주요 후기형 프로모터(Adeno 2 major late promoter PAdml), 아데노바이러스 2 초기형 프로모터(PAdE2), AAV (human parvo virusassociated virus)의 p19 프로모터, 엡스타인 바 바이러스(EBV) 프로모터, 로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, 마우스의 메탈로티오네인(metallothionein) 프로모터 (MT 프로모터), MMTV LTR 프로모터, HIV의 LTR 프로모터, β-액틴 프로모터, EF1 알파 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터, 그리고 인간 헤로글로빈, 인간 근육 크레아틴 또는 인간 메탈로티오네인 유래의 프로모터가 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 "작동적으로 연결된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 핵산 서열 사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 서열의 전사 및/또는 트랜스레이션을 조절하게 된다.
본 발명의 발현 컨스트럭트에는 전사 종결 서열로서, 폴리 아데닐화 서열이 포함될 수 있으며, 예를 들어 소성장 호르몬 터미네이터(Gimmi, E. R., et al., Nucleic Acids Res. 17:6983-6998(1989)), SV40 유래 폴리 아데닐화 서열(Schek, N, et al., Mol. Cell Biol. 12:5386-5393(1992)), HIV-1 polyA(Klasens, B. I. F., et al., Nucleic Acids Res. 26:1870-1876(1998)), β-글로빈 polyA(Gil, A., et al, Cell 49:399-406(1987)), HSV TK polyA(Cole, C. N. and T. P. Stacy, Mol. Cell. Biol. 5:2104-2113(1985)) 또는 폴리오마바이러스 polyA (Batt, D. B and G. G. Carmichael, Mol. Cell. Biol. 15:4783-4790(1995))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 발현 컨스트럭트에는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 제네티신 (G418), 네오마이신 또는 테트라사이클린에 대한 내성 유전자를 포함한다.
본 발명의 재조합 복합항원 발현 컨스트럭트는 다양한 형태로 제작될 수 있으며, 대표적으로 플라스미드(plasmid) 또는 바이러스 벡터(viral vector) 시스템으로 제작될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 발현 컨스트럭트는 바이러스 벡터 시스템이며, 예를 들어, 아데노바이러스(adenovirus), 아데노-관련 바이러스(adenoassociatedvirus), 레트로바이러스(retrovirus), 렌티바이러스(lentivirus), 배시니아 바이러스(vaccinia virus), 헤르페스심플렉스 바이러스(Herpes simplex virus), 베큘로바이러스(baculovirus) 등의 벡터 시스템에 적용될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 가장 바람직한 구현예에 의하면, 상기 발현 컨스트럭트는 베큘로바이러스 전이 벡터로 제작될 수 있다.
본 발명의 발현 컨스트럭트에 사용될 수 있는 이종 바이러스 항원에는 제한이 없으며 상기 이종 바이러스의 종류는 다음과 같다. RNA 바이러스로는 엔테로바이러스(Enterovirus), 라이노바이러스(Rhinovirus), 헤파토바이러스(Hepatovirus), 카르디오바이러스(Cardiovirus), 아프토바이러스(Aphthovirus), 폴리오바이러스(Poliovirus), 팔에코바이러스(Parechovirus), 에르보바이러스(Erbovirus), 코부바이러스(Kobuvirus), 테스초바이러스(Teschovirus), 콕사키바이러스(Coxsackie virus), 뎅기바이러스(dengue virus), C 형 간염바이러스(Hepatitis C virus), 황열바이러스(Yellow fever virus), 노로바이러스(Norovirus), E형 간염바이러스(Hepatitis E virus), 루벨라바이러스(Rubella virus), 코로나바이러스(Corona virus), 아스트로바이러스(Astrovirus), 아테리바이러스(Arterivirus), 임파구성 맥락 수막염 바이러스(Lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV), 인플루엔자바이러스 A형(Influenza A virus), 인플루엔자바이러스 B형(Influenza B virus), 인플루엔자바이러스 C형(Influenza C virus), 홍역바이러스(measles virus), 멈프스바이러스(Mumps virus), 호흡기세포융합바이러스(Respiratory Syncytial Virus, RSV), 한타바이러스(Hantavirus), 광견병바이러스(Rabies virus), 에볼라바이러스(Ebola virus), 마르부르그바이러스(Marburg virus), 보르나병바이러스(Borna disease virus), 렌티바이러스(Lentivirus)가 있으며, DNA 바이러스로는 B형 간염바이러스(Hepatitis B Virus), 아데노바이러스(Adenovirus), 전염성간염바이러스(Infectious canine hepatitis virus), 유두종바이러스(Papillomavirus), 단순헤르페스바이러스(Herpes simplex virus), 수두대상포진바이러스(Varicella-zoster virus), 거대세포바이러스(Cytomegalovirus), 에프스타인-바바이러스(Epstein-Barr virus), 두창바이러스(Smallpox virus), 원숭이폭스바이러스(Monkey pox virus), 우두바이러스(Cow pox virus), 폴리오마바이러스(polyoma virus), JC바이러스(JC virus), 파보바이러스 B19(Parvovirus B19)가 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 로타바이러스 복합 항원의 발현 컨스트럭트에서 상기 이종 바이러스는 A형 간염바이러스이다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 A형 간염바이러스의 항원은 도메인 2 (Domain 2, D2) 또는 도메인 3 (Domain 3, D3)이다. 보다 바람직하게는, 상기 A형 간염바이러스 항원의 도메인 2 (D2)와 도메인 3 (D3)는 각각 서열목록 제2서열과 제3서열의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예 의하면, 상기 로타바이러스 항원은 VP7 단백질 부위이다. 보다 바람직하게는 상기 로타바이러스 항원 VP7 단백질 부위는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 로타바이러스 항원과 상기 A형 간염바이러스 항원은 펩티드 링커(peptide linker)에 의해 연결된다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 펩티드 링커(peptide linker)는 Leu-Glu-Pro-Gly 또는 Lys-Asp-Glu-Leu이다. 상기 Lys-Asp-Glu-Leu은 ER(endoplasmic reticulum)에 재조합 단백질의 잔류(retention)을 촉진함으로써 MHC 클래스 I에 의한 항원제시효과를 향상시킨다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상기 본 발명의 로타바이러스 복합 항원 발현용 컨스트럭트는 도 1에 도시된 DNA 구성요소들을 포함한다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 상기 로타바이러스 복합 항원 발현용 컨스트럭트로 형질 전환된 숙주 세포를 제공한다.
본 발명의 로타바이러스 복합 항원의 발현 컨스트럭트가 형질 전환될 수 있는 숙주세포는 바람직하게는 동물세포이고, 보다 바람직하게는 이스트(yeast), 곤충세포, 포유동물세포이고, 가장 바람직하게는 곤충세포주이다. 곤충세포로는 예를 들어, Sf21 (Spodoptera frugiperda 21; Invitrogen), Sf9 (Spodoptera frugiperda 9;Invitrogen), Tn5 (Trichoplusia ni 5; Invitrogen) 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명에서 상기 발현 컨스트럭트를 동물 세포에 형질전환하는 방법은 당업계에 공지된 다양한 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들어, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법(Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol. Cell Biol., 5:1188-1190(1985)), 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc.Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572(1990)), 초산-리튬 DMSO법(Hill et al., Nucleic Acid Res., 19, 5791(1991)) 등을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 A형 간염바이러스 항원과 로타바이러스 항원이 상호 연결된 재조합 로타바이러스 복합 항원을 제공한다.
본 발명이 또 다른 일 양태에 따르면 상기 재조합 로타바이러스 복합 항원을 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 로타바이러스 항원은 VP7 단백질 부위이고, 상기 A형 간염바이러스 항원 에피톱은 도메인 2 (Domain 2, D2) 또는 도메인 3(Domain 3, D3)이다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 로타바이러스 항원 VP7 단백질 부위는 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 A형 간염바이러스의 항원 에피톱의 D2와 D3는 각각 서열목록 제2서열과 제3서열의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 로타바이러스 항원과 상기 A형 간염바이러스 항원 에피톱은 펩티드 링커에 의해 연결되며, 보다 바람직하게는 상기 펩티드 링커(peptide linker)는 Leu-Glu-Pro-Gly 또는 Lys-Asp-Glu-Leu이다.
본 발명의 재조합 로타바이러스 복합 항원 단백질은 하기 실시예에서 입증되는 바와 같이, 로타바이러스에 대한 항체 유도능 뿐만 아니라 A형 간염 바이러스에 대한 항체 유도능을 보유한다.
본 발명의 백신 조성물은 (a) A형 간염바이러스 항원을 포함한 재조합 로타바이러스 복합 항원 단백질의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 백신 조성물은 A형 간염바이러스 및 로타바이러스 감염에 의해 유발되는 다양한 질환의 예방에 이용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "약제학적 유효량"은 상기한 질환에 대한 예방 효과를 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.
본 발명의 백신 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 비경구 투여가 바람직하고, 예컨대 정맥내 투여, 복강내 투여, 근육내 투여, 피하 투여 또는 국부 투여를 이용하여 투여할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 질병 증상의 정도, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
본 발명의 백신 조성물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 됨으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 A형 간염바이러스 항원을 포함하는 로타바이러스 복합 항원의 생산 방법을 제공한다: (a) (i) A형 간염 바이러스의 항원 및 로타바이러스의 항원이 연결된 복합 항원을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (ⅱ) 상기 복합 항원을 코딩하는 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 로타바이러스 복합 항원 발현용 재조합 베큘로바이러스로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계: 및 (b) 상기 단계 (a)에서 배양된 배양물로부터 재조합 로타바이러스 복합 항원 단백질을 분리 및 정제하는 단계.
본 발명에서 형질전환된 숙주 세포의 배양은 당업계에 공지된 통상적인 동물세포의 배양 방법을 이용할 수 있다.
세포 배양시 사용되는 배지는 형질전환된 숙주세포가 효율적으로 이용할 수 있는 탄소원, 질소원, 무기염 등을 포함한다면 천연 배지 또는 합성 배지를 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 탄소원은 글루코오스, 프럭토오스, 수크로오스와 같은 탄수화물; 녹말, 녹말의 가수분해물; 아세트산 및 프로피온산과 같은 유기산; 메탄올, 에탄올, 프로판과 같은 알코올 등을 포함한다. 질소원은 암모니아; 염화암모늄, 암모늄설페이트, 암모늄아세테이트 및 암모늄포스페이트와 같은 무기산 또는 유기산의 암모늄염; 펩톤, 육추출물(meat extract), 이스트추출물, 옥수수 침지액, 카제인 가수분해물, 대두추출물, 대두가수분해물; 다양한 발효된 세포 및 이들의 분해물 등을 포함한다. 무기염은 포타슘디하이드로젠 포스페이트, 다이포타슘하이드로젠 포스페이트, 마그네슘 포스페이트, 마그네슘 설페이트, 소디엄 클로라이드, 망간 설페이트, 구리 설페이트, 칼슘 카보네이트 등을 포함한다.
본 발명에서 이용될 수 있는 배지는 동물세포의 배양에 통상적으로 이용되는 어떠한 배지도 가능하며, 예를 들어, Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med.147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med., 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물 (Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈 (Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978)) 등이 이용될 수 있다. 배지에 대한 설명은, R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique, Alan R. Liss, Inc., New York에 상세하게 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.
배양은 통상적으로 진탕배양 또는 회전기에 의한 회전에 의한 것과 같은 호기성 조건하에서 행한다. 배양 온도는 바람직하게는 15 내지 40℃에서 행하고, 배양시간은 일반적으로 5 시간 내지 7 일간 행한다. 배지의 pH는 배양 중에서 바람직하게는 3.0 내지 9.0의 범위를 유지한다. 배지의 pH는 무기 또는 유기산, 알칼리 용액, 우레아, 칼슘 카보네이트, 암모니아 등으로 조절할 수 있다. 배양 중에는 필요한 경우 암피실린 및 테트라사이클린과 같은 항생제를 첨가할 수 있다.
상기 배양된 형질전환 세포로부터 발현된 복합 항원 단백질을 분리하는 방법은 당업계에서 통상적으로 이용되는 분리 및 정제 방법을 채용하여 실시할 수 있다. 예컨대, 암모늄 설페이트 또는 PEG 등을 이용한 용해도에 따른 분리 (solubility fractionation), 분자량에 따른 한외여과 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 다양한 방법이 이용될 수 있고, 통상적으로는 상기한 방법의 조합을 이용하여 분리 및 정제하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 로타바이러스의 VP2, VP4, 및 VP6의 폴리펩티드, 및 (b) 이종 바이러스 항원 에피톱 및 로타바이러스 항원 VP7의 융합단백질을 갖는 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 제공한다.
본 발명의 로타바이러스 유사입자에 사용될 수 있는 이종 바이러스는 제한이 없으며 이종 바이러스의 종류는 다음과 같다. RNA 바이러스로는 엔테로바이러스(Enterovirus), 라이노바이러스(Rhinovirus), 헤파토바이러스(Hepatovirus), 카르디오바이러스(Cardiovirus), 아프토바이러스(Aphthovirus), 폴리오바이러스(Poliovirus), 팔에코바이러스(Parechovirus), 에르보바이러스(Erbovirus), 코부바이러스(Kobuvirus), 테스초바이러스(Teschovirus), 콕사키바이러스(Coxsackie virus), 뎅기바이러스(dengue virus), C 형 간염바이러스(Hepatitis C virus), 황열바이러스(Yellow fever virus), 노로바이러스(Norovirus), E형 간염바이러스(Hepatitis E virus), 루벨라바이러스(Rubella virus), 코로나바이러스(Corona virus), 아스트로바이러스(Astrovirus), 아테리바이러스(Arterivirus), 임파구성 맥락 수막염 바이러스(Lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV), 인플루엔자바이러스 A형(Influenza A virus), 인플루엔자바이러스 B형(Influenza B virus), 인플루엔자바이러스 C형(Influenza C virus), 홍역바이러스(measles virus), 멈프스바이러스(Mumps virus), 호흡기세포융합바이러스(Respiratory Syncytial Virus, RSV), 한타바이러스(Hantavirus), 광견병바이러스(Rabies virus), 에볼라바이러스(Ebola virus), 마르부르그바이러스(Marburg virus), 보르나병바이러스(Borna disease virus), 렌티바이러스(Lentivirus)가 있으며, DNA 바이러스로는 B형 간염바이러스(Hepatitis B Virus), 아데노바이러스(Adenovirus), 전염성간염바이러스(Infectious canine hepatitis virus), 유두종바이러스(Papillomavirus), 단순헤르페스바이러스(Herpes simplex virus), 수두대상포진바이러스(Varicella-zoster virus), 거대세포바이러스(Cytomegalovirus), 에프스타인-바바이러스(Epstein-Barr virus), 두창바이러스(Smallpox virus), 원숭이폭스바이러스(Monkey pox virus), 우두바이러스(Cow pox virus), 폴리오마바이러스(polyoma virus), JC바이러스(JC virus), 파보바이러스 B19(Parvovirus B19)가 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 이종바이러스는 A형 간염바이러스이다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 융합단백질은 A형 간염바이러스 항원 D2 및 로타바이러스 항원 VP7의 융합단백질 D2-VP7이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 VP2 폴리펩티드는 서열목록 제4서열을 포함하고, 상기 VP4 폴리펩티드는 서열목록 제5서열의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VP6 폴리펩티드는 서열목록 제6서열의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 D2 폴리펩티드는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VP7 폴리펩티드은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 융합단백질 D2-VP7은 D2 폴리펩티드와 VP7 폴리펩티드가 펩티드 링커 Leu-Glu-Pro-Gly 또는 Lys-Asp-Glu-Leu에 의해 연결된다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 로타바이러스의 VP2, VP4, 및 VP6의 폴리펩티드, 및 (b) A형 간염바이러스 항원 에피톱 D2 및 로타바이러스 항원 VP7의 융합단백질인 D2-VP7을 포함하는 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 유효성분으로 포함하는 백신 조성물을 제공한다.
본 발명에서 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 포함하는 "백신 조성물"에 관한 설명은 상기 로타바이러스 복합항원을 포함하는 백신 조성물에서 설명된 바와 동일하므로 중복하여 기재하지 않는다.
본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 A형 간염바이러스 항원을 포함하는 로타바이러스의 바이러스 유사입자의 생산방법을 제공한다: (a) (ⅰ) 프로모터에 작동적으로 연결된 VP2 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1의 재조합 베큘로바이러스; (ⅱ) 프로모터에 작동적으로 연결된 VP4 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2의 재조합 베큘로바이러스; (ⅲ) 프로모터에 작동적으로 연결된 VP6 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3의 재조합 베큘로바이러스; 및 (ⅳ) 프로모터에 작동적으로 연결된 융합 단백질 D2-VP7 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제4의 재조합 베큘로바이러스로 형질전환된 숙주세포를 배양하는 단계; (b) 상기 숙주세포의 배양물로부터 로타바이러스의 바이러스 유사 입자를 분리 및 정제하는 단계.
본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 VP2 폴리펩티드는 서열목록 제4서열의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VP4 폴리펩티드는 서열목록 제5서열의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VP6 폴리펩티드는 서열목록 제6서열의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 D2 폴리펩티드는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 VP7 폴리펩티드은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 융합단백질 D2-VP7은 D2와 VP7가 펩티드 링커 Leu-Glu-Pro-Gly 또는 Lys-Asp-Glu-Leu에 의해 연결된다.
본 발명에서 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 생산하는 방법은 상기 로타바이러스 복합항원 단백질을 생산하는 방법에서 설명된 바와 동일하므로 중복하여 기재하지 않는다.
본 발명은 이종 바이러스 항원 에피톱이 탑재된 로타바이러스 복합 항원 발현용 컨스트럭트, 상기 로타바이러스 복합 항원을 포함하는 백신 조성물, 로타 바이러스 복합항원을 포함하는 로타바이러스의 바이러스 유사입자, 및 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 포함하는 백신 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 의하면 로타바이러스의 항원과 함께 로타바이러스와 다른 이종 바이러스의 에피톱을 동시에 함유하는 복합항원과 이 복합항원을 포함하는 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 저비용으로 대량생산 할 수 있으며, 로타바이러스 및 이종 바이러스에 대한 신규 복합 백신의 연구 및 개발에 응용될 수 있다.
도 1은 본 발명자들이 구축한 A형 간염바이러스 항원 및 로타바이러스 항원을 포함하는 재조합 복합항원을 동시에 발현하는 베큘로바이러스 발현 벡터 시스템의 구체적인 구성을 보여준다.
도 2a 및 도 2b는 본 발명의 재조합 베큘로바이러스로 감염된 곤충세포주 Sf9에서 재조합 복합항원 단백질이 정상적으로 발현되는 결과를 보여준다.
도 2a는 SDS-PAGE에 의한 총 단백질 분석 결과이다. 레인(lane) 1은 비감염(unifected)이고, 레인 2는 D2/VP7 복합항원, 레인 3은 D3/VP7 복합항원을 각각 발현하는 결과이다.
도 2b는 항-V5 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석 결과를 보여준다. 레인 N은 비감염(unifected)이고, 레인 1은 D2/VP7 복합항원, 레인 2는 D3/VP7 복합항원을 각각 발현하는 결과이다.
도 3은 곤충세포주 Sf9에서 본 발명의 재조합 복합항원 단백질 D2/VP7의 발현 양상을 보여준다. 레인 1은 비감염 sf9 세포(uninfected sf9 cell)이고, 레인 1-10은 각각 바이러스 감염 후 1 내지 10일 후의 결과이다.
도 4a 및 도 4b는 본 발명의 재조합 복합항원 단백질이 A형 간염바이러스 및 로타바이러스 특이적 항체에 의해 인지되어 면역원성을 갖는다는 것을 보여주는 웨스턴 블롯 결과이다.
도 4a는 로타바이러스 Wa주에 특이적인 항체를 포함하는 항-로타바이러스 토끼 혈청을 사용하여 측정한 결과이다. 레인 1은 비감염 sf9 세포이고; 레인 2는 D2/VP7 복합항원, 레인 3은 D3/VP7 복합항원을 측정한 결과이다.
도 4b는 A형 간염바이러스 특이적 항체를 포함하는 A형 간염바이러스 감염 환자 혈청을 사용하여 측정한 결과이다. 레인 1은 비감염 sf9 세포이고, 레인 2는 D2/VP7 복합항원을 측정한 결과이다.
도 5a 및 도 5b는 재조합 복합항원 단백질 D2/VP7의 면역원성을 ELISA에 의해 측정한 결과를 보여준다. 재조합 복합항원 단백질 D2/VP7를 토끼에 주사하여 면역화시킨 후 면역혈청을 분리하여 이를 항체가 측정에 사용하였다.
도 5a는 로타바이러스 Wa 항원에 대해 상기 제조한 토끼 면역혈청의 항체가를 측정한 결과이다. 그래프에서,
Figure 112011032021644-pat00001
는 음성대조군으로서 음성 토끼혈청의 항체가이고,
Figure 112011032021644-pat00002
은 양성대조군으로서 로타바이러스 Wa주에 대한 토끼면역혈청의 항체가이고,
Figure 112011032021644-pat00003
은 재조합 복합항원 단백질 D2/VP7의 토끼 면역혈청의 항체가이다. 흡광도(OD value)는 왼쪽에 표시하였고, 희석배수는 아래쪽에 표시하였다.
도 5b는 A형 간염바이러스 HM175 항원에 대해 상기 제조한 토끼 면역혈청의 항체가를 측정한 결과이다. 그래프에서,
Figure 112011032021644-pat00004
은 음성 대조군으로서 음성 토끼혈청의 항체가이고,
Figure 112011032021644-pat00005
은 양성대조군으로서 A형 간염바이러스 HM175 항원에 대한 토끼면역혈청의 항체가이며,
Figure 112011032021644-pat00006
은 재조합 복합항원 단백질 D2/VP7의 토끼 면역혈청의 항체가이다. 흡광도(OD value)는 왼쪽에 표시하였고, 희석배수는 아래쪽에 표시하였다.
도 6a 및 도 6b는 재조합 복합항원 단백질 D2/VP7을 토끼에 접종하여 얻은 면역혈청과 바이러스와의 반응도를 공초점 현미경으로 측정한 결과를 보여준다.
도 6a의 패널 A는 로타바이러스 Wa주를 감염시킨 MA104 세포와 면역화시키지 않은 정상 토끼 혈청의 반응도를 측정한 결과이고, 패널 B는 로타바이러스 Wa주를 감염시킨 MA104 세포와 재조합 복합항원 단백질 D2/VP7에 대한 토끼 면역혈청의 반응도를 측정한 결과이다.
도 6b의 패널 A는 A형 간염바이러스 HM175를 감염시킨 FRhK-4 세포와 면역화시키지 않은 정상 토끼 혈청의 반응도를 측정한 결과이고, 패널 B는 A형 간염바이러스 HM175주를 감염시킨 FRhK-4 세포와 재조합 복합항원 단백질 D2/VP7에 대한 토끼 면역혈청의 반응도를 측정한 결과이다.
도 7a 및 도 7b는 재조합 복합항원 단백질 D2/VP7을 토끼에 접종하여 얻은 혈청이 로타바이러스 및 A형 간염바이러스에 대한 중화항체를 형성함을 보여주는 결과이다.
도 7a의 패널 A는 로타바이러스 Wa주를 감염시킨 MA104 세포이고(양성대조군), 패널 B는 로타바이러스 Wa주를 감염시킨 MA104 세포에 정상 토끼 혈청을 가한 결과이고(음성대조군), 패널 C는 로타바이러스 Wa주를 감염시킨 MA104 세포에 재조합 복합항원 단백질 D2/VP7에 대한 토끼 항혈청(320배 희석)을 가한 결과이다.
도 7b의 패널 A는 A형 간염바이러스 HM175주를 감염시킨 FRhK-4 세포이고(양성대조군), 패널 B는 A형 간염바이러스 HM175주를 감염시킨 FRhK-4 세포에 정상 토끼 혈청을 가한 결과이고(음성대조군), 패널 C는 A형 간염바이러스 HM175주를 감염시킨 FRhK-4 세포에 재조합 복합항원 단백질 D2/VP7에 대한 토끼 항혈청(160배 희석)을 가한 결과이다.
도 8은 A형 간염바이러스 항원을 함유한 로타바이러스의 바이러스 유사입자(VLP)를 관찰한 결과이다. 패널 A는 로타바이러스 VP2 단백질, VP6 단백질, VP4 단백질, 및 A형 간염바이러스 항원 D2와 로타바이러스 VP7가 연결된 재조합 복합항원 단백질로 구성된 로타바이러스의 바이러스 유사입자(VLP)를 관찰한 것이고, 패널 B는 VP2 단백질과 VP6 단백질로 구성된 로타바이러스의 코어 유사입자(CLP: core like particle)이다.
도 9는 본 발명의 로타바이러스의 바이러스 유사입자(VLP)가 토끼에서 생산된 로타바이러스 VP2, VP4, VP6 단백질에 대한 특이 항체에 의해 인지되어 면역원성을 갖는다는 것을 보여주는 웨스턴 블롯 결과이다.
도 10a 및 도 10b는 로타바이러스의 바이러스 유사입자(VLP)의 면역원성을 ELISA에 의해 측정한 결과이다. 재조합 복합항원 단백질 D2/VP7을 포함하는 로타바이러스의 VLP를 마우스에 주사하여 면역화시킨 후 얻은 면역혈청을 분리하여 이를 항체가 측정에 사용하였다.
도 10a는 로타바이러스 Wa 항원에 대해, 상기 제조한 로타바이러스 VLP의 마우스 면역혈청의 항체가를 측정한 결과이다.
Figure 112011032021644-pat00007
는 음성대조군으로서 음성 마우스혈청의 항체가이고,
Figure 112011032021644-pat00008
은 양성대조군으로서 로타바이러스 Wa주에 대한 마우스 면역혈청의 항체가이고,
Figure 112011032021644-pat00009
은 로타바이러스 VLP의 마우스 면역혈청의 항체가이다. 흡광도(OD value)는 왼쪽에 표시하였고, 희석배수는 아래쪽에 표시하였다.
도 10b는 A형 간염바이러스 HM175 항원에 대해, 상기 제조한 로타바이러스 VLP의 마우스 면역혈청의 항체가를 측정한 결과이다.
Figure 112011032021644-pat00010
은 음성대조군으로서 음성 마우스 혈청의 항체가이고,
Figure 112011032021644-pat00011
은 양성대조군으로서 A형 간염바이러스 HM175 항원에 대한 마우스 면역혈청의 항체가이며,
Figure 112011032021644-pat00012
은 로타바이러스 VLP의 마우스 면역혈청의 항체가이다. 흡광도(OD value)는 왼쪽에 표시하였고, 희석배수는 아래쪽에 표시하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 방법
1. 실험재료
곤충세포주인 Sf9 (Spodoptera frugiperda) 세포주를 한국세포주은행 (KCLB; Korean Cell Line Bank, Korea)으로부터 확보하였고 베큘로바이러스 생성을 위해 사용하였다. Sf9 세포는 250 mL 스피너플라스크(spinner flask)를 이용하여 90 rpm, 27℃ 조건 하에서 10％ FBS (fetal bovine serum)이 함유된 TNM-FH 배지에서 성장 및 유지하였고, 트립판블루 색소배척실험(trypan blue exclusion)을 토대로 혈구계수기(hemocytometer)를 이용하여 세포수 및 세포 생존율을 측정하였다. 혈청형 G1P[8] Wa 로타바이러스주와 HM175 A형 간염 바이러스주 지놈으로부터 항원 에피톱 유전자를 확보하였고, 재조합 베큘로바이러스 제조를 위하여 Bac-N-Blue 베큘로바이러스 발현벡터시스템(Invitrogen)를 이용하였다.
2. 시약 및 실험동물
제한효소 XhoI 및 T4 DNA ligase는 New England Biolabs으로부터 구입하였다. 베큘로바이러스 전이 벡터(transfer vector) pBlueBac4.5/V5-His와 베큘로바이러스 발현시스템 Bac-N-Blue™ 은 Invitrogen으로부터 구입하였다. 플라스미드 미니프랩 키트(plasmid miniprep kit)는 Bioneer로부터 구매하여 사용하였다. A형 간염바이러스 인체 감염환자로부터의 항혈청 및 Wa 로타바이러스주에 대한 토끼혈청을 면역원성 분석을 위하여 사용하였다. 6-8 주령의 SPF 뉴질랜드 White female 토끼를 동물실험을 위해 사용하였으며, 실험 전 2주 동안 순응시켰다.
3. 로타바이러스와 A형 간염바이러스의 복합 항원을 발현하는 재조합 베큘로바이러스의 발현 시스템의 구축
로타바이러스(HRV)의 캡시드(capsid) 구성 성분인 VP7 유전자는 Wa (G1P[8]) 로타바이러스주 RNA로부터 RT-PCR에 의해 합성한 cDNA에 기초하여 합성하였다. A형 간염바이러스(HAV)의 도메인 2 (D2, amino acid from 767 to 842) 및 도메인 3 (D3, amino acid from 1403 to 1456) 유전자는 HM175 A형 간염바이러스주 RNA로부터 RT-PCR에 의해 합성한 cDNA에 기초하여 합성하였다. 프라이머(primer)에 인위적으로 도입시킨 XhoI 제한효소 부위를 이용하여 A형 간염바이러스와 로타바이러스 에피톱을 동시에 함유하는 2 종류의 재조합 복합 항원을 인코딩하는 DNA 단편을 얻었다: (1) HAV D2 및 HRV VP7 (D2/VP7), (2) HAV D3 및 HRV VP7 (D3/VP7). 이들 재조합 유전자를 PCR에 의해 증폭한 후, 베큘로바이러스 전이 벡터 pBlueBac4.5 (Invitrogen)안으로 클로닝하여 재조합 베큘로바이러스 전이벡터를 만들었다. 제조한 재조합 전이벡터는 염기서열 분석을 하여 정확한 클로닝 여부를 확인하였다. 제조한 재조합 베큘로바이러스 전이벡터는 Bac-N-Blue™ linearized 베큘로바이러스 DNA와 혈청이 없는 배지를 사용하여 준비한 Cellfectinㄾ II 시약과 혼합하였고, 상온에서 15분 반응시킨 후, 여기에 곤충세포 Sf9 세포주 (2 X 106 cells/5㎖, 60 mm-plates)를 첨가하였다. 혼합액은 10％ FBS가 함유된 TNM-FH 배지로 치환하였고, 이후 표준 플라크 분석(standard plaque assay)에 의하여 재조합 베큘로바이러스를 확인하였다.
4. SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯에 의한 발현 단백질 확인
재조합 복합항원 단백질 발현샘플은 10％ SDS-PAGE 상에서 분리하였으며, Coomassie Brilliant Blue R-250(Bio-Rad) 염색법을 이용하여 확인하였다. 발현된 단백질의 존재를 확인하기 위하여, 모든 단백질성분은 Immuno-BlotTM PVDF membrane (Bio-Rad)에 옮긴 후, 이 멤브레인(memebrane)을 5％ 탈지유를 이용하여 블로킹(blocking)하였다. 1차 항체로 토끼에서 제조한 로타바이러스 Wa 항혈청과 A형 간염 환자 혈청을 TBS-T (Tris-buffered saline; 20 mM Tris-HCl, 500 mM NaCl, 0.1％ Tween20, pH 7.9) 용액 내에서 준비하였고, 준비된 1차 항체를 사용하여 1시간 반응시키고, peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (1:2000 dilution in TBS-T, Invitrogen)를 2차 항체로 사용하여 반응시켰다. 발현 단백질은 ECL(electrochemiluminescence) 기법을 이용하여 X-레이 필름(Kodak)에 노출한 후 확인하였다.
5. 토끼의 면역접종
50㎍의 재조합 복합항원 단백질 D2/VP7을 2 마리의 뉴질랜드 화이트(New Zealand white) 토끼에 완전 프로인드 면역반응항진제(complete Freund's adjuvant)와 함께 근육 주사한 후(Day 0), 28 일에 다시 불완전 프로인드 면역반응항진제(incomplete Freund's adjuvant)와 함께 부스팅(boosting)하였다. 40일 후 귀 정맥으로부터 혈액을 채취하고, 혈청을 분리한 후, 항체형성 여부를 ELISA 기법을 이용하여 확인하였다.
6. ELISA에 의한 특이 항체검출
분리 정제한 로타바이러스 Wa 항원과 A형 간염바이러스 HM175 항원(Abcam, UK)을 웰(well) 당 0.1 μg 농도로 코팅 용액(0.1M Na2CO3, 0.1M NaHCO3, pH 9.4)내에 준비한 후, 96-웰 면역플레이트(immunoplate)에 4℃에서 하룻밤 코팅하였다. 코팅된 플레이트를 PBS-T (1 X PBS with 0.05％ Tween20) 200 ㎕로 3회 세척한 후, 5％ (w/v) 탈지유를 사용하여 블로킹 하였다. 토끼로부터 수집한 면역혈청을 단계별로 희석한 후, 37 ℃에서 1시간 반응시켰다. 세척 후, peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (diluted in PBS-T, 5％ 탈지유 함유)를 웰 당 100 ㎕ 씩 첨가한 후, 37℃ 에서 1시간 반응시켰다. 기질용액으로서 OPD (ortho-phenylenediamine)을 첨가한 후 5분 동안 반응시켰고, 1M H2SO4 50 ㎕를 각 웰에 첨가하여 반응을 중지시켰다. 이후, ELISA reader (NanoQuant)를 이용하여 492 nm에서 흡광도를 측정함으로써, 항체농도를 정량하였다.
7. 바이러스-항체 반응에 의한 항체 특이성 확인
7-1. 로타바이러스에 대한 항체 특이성
96-웰 유리 플레이트(Nunc)에 배양된 세포주(MA104)에 10배 희석한 Wa 로타바이러스 용액 100㎕를 첨가하고, 바이러스 배지(1mg/ml 트립신이 0.5％ 첨가된 Eagle's 배지) 100㎕ 첨가하여 세포병변효과(cytopathic effect)가 출현하는 시점까지 반응시켰다. 배양한 배지를 제거하고, 80％ 아세톤을 넣어 10분 동안 반응시켜 세포를 고정시킨 후 PBS(pH 7.2)로 3회 세척을 하고, 1차 항체로서 토끼로부터 얻은 재조합 복합항원 단백질 D2/VP7 면역혈청을 PBS로 50배 희석하여 100㎕ 넣고 37℃ 1시간 반응시켰다. PBS로 3회 세척을 하고, 2차 항체로서 50배 희석한 FITC-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (Invitrogen) 50 ㎕를 넣고 37℃에서 1시간 반응시킨 후 다시 PBS로 3회 세척을 하고, 80％ 글리세롤(Glycerol, Sigma)을 첨가하여 반응을 종결시켰다. 이후, 공초점 현미경(Confocal Microscope, Carl Zeiss)하에서 관찰하여 토끼로부터 얻은 항체가 로타바이러스에 대하여 특이성을 나타내는지 확인하였다.
7-2. A형 간염바이러스에 대한 항체 특이성
96-웰 유리 플레이트(Nunc)에 배양된 세포주(FRhk-4)에 10 배 희석한 HM175 A형 간염바이러스 용액 100㎕를 넣고 바이러스 배지(2％ 소혈청이 첨가된 Eagle's 배지) 100㎕ 첨가하여, 세포병변효과(cytopathic effect)가 출현하는 시점까지 반응시켰다. 배양한 배지를 제거하고, 80％ 아세톤을 첨가하여 10분 동안 반응시켜 세포를 고정시켰다. PBS (pH 7.2)로 3회 세척을 하고, 1차 항체로서 토끼로부터 얻은 재조합 복합항원 단백질 D2/VP7 면역혈청을 PBS로 50배 희석하여 100㎕ 넣고 37℃에서 1시간 반응시켰다. PBS로 3회 세척을 하고, 2차 항체로서 50배 희석한 FITC-conjugated Goat Anti-Rabbit IgG (Invitrogen) 50 ㎕를 첨가하여 37℃에서 1시간 반응시킨 후 다시 PBS로 3회 세척을 하고, 80％ 글리세롤(Glycerol, Sigma)을 넣어 반응을 종결시켰다. 이후, 공초점 현미경(Confocal Microscope, Carl Zeiss)하에서 관찰하여, 토끼로부터 얻은 항체가 A형 간염바이러스에 대하여 특이성을 나타내는지 확인하였다.
8. 중화 항체 형성
토끼로부터 얻은 재조합 복합항원 단백질 D2/VP7 면역혈청을 56℃에서 30분 동안 반응시켜 보체를 불활성화시킨 후, TCID50로 Wa 로타바이러스와 HM175 A형 간염바이러스 용액의 역가를 측정하였다. 96-웰 플레이트에 100 doses TCID50 / 25㎕ (HAV는 1:10, rotavirus는 1:640로 Eagle's 배지로 희석)를 함유한 각 바이러스 용액 50 ㎕를 섞은 후, 토끼로부터 수집한 혈청을 10배 희석한 후 단계별로 2배씩 희석하여, 각 웰당 50 ㎕를 넣고, 고르게 섞은 후 37℃에서 1 시간 반응시켰다. 세포가 배양된 플레이트에 각 바이러스-면역혈청 혼합액을 50㎕씩 넣고, 유지배지(HAV는 Eagle's 배지와 2％의 소혈청, rotavirus는 Eagle's 배지와 트립신 1mg/㎖)를 50㎕ 가한 다음 5일 동안 배양하였다. 이후, 도립 현미경(Leica)을 이용하여 세포변성 정도를 확인하여 ACTG Laboratory Technologist Committee 매뉴얼 (Revised Version 1.0, 2004. 5. 25)에 따라 면역혈청의 중화항체 형성 유무와 항체가를 측정하였다.
xk = dose of the highest dilution.
r = sum of the number of "-" responses.
d = spacing between dilutions.
n = wells per dilution.
Spearman-Karber formula : M = xk + d [0.5 - (1/n) (r)]
9. 로타바이러스의 바이러스 유사 입자(virus like particle) 합성 실험
9-1. 세포 감염
10％ FBS와 0.1％ Pluronic F-68을 함유한 TNM-FH 배지 250 ㎖에서 약 3 X 106 cells/㎖ 정도로 배양한 Sf9 세포를 원심 농축하고, VP2, VP4, VP6 및 D2-VP7를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 총 4종의 재조합 베큘로바이러스를 5 pfu/cell의 MOI를 가지고 혼합하여 동시에 감염시켰다. 3-4 시간 정도 원심 튜브에서 바이러스를 흡착시킨 후, 세포 감염액을 원심분리하고, 상등액 배지를 신선한 배지로 바꿔주었다. 이때 배지는 10％ FBS와 0.1％ Pluronic F-68을 함유한 220 ml Grace's insect 배지를 사용하였다. 이후 27 ℃에서 5-7 일간 배양하였다.
9-2. 로타바이러스의 바이러스 유사 입자의 순수 분리 및 정제
감염된 세포 배양액을 12,000 rpm에서 30분 동안 초고속 원심분리하여 세포 배양 상등액을 얻었다. VLP(virus like particle)를 함유하고 있는 배양 상등액에 35％ 수크로오스 쿠션(sucrose in TNC buffer, 10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 140 mM NaCl, 10 mM CaCl2) 1.5 ml을 첨가하고, SW28 로터(Beckman Coulter)를 이용하여 25,000 rpm에서 90분 동안 원심 분리함으로써 VLP 침전물을 얻었다. 수득한 VLP 침전물은 4 ㎖의 TNC 완충액에 부유시켰고, 0.42 g CsCl/ml을 첨가하고 SW50.1 로터(Beckman Coulter)를 이용하여 35,000 rpm 에서 18시간 동안 원심분리하였다. 원심분리한 후 확인된 2개의 밴드, 즉 하위 밴드(VLP)와 상위밴드(CLP)를 일회용 주사기를 이용하여 회수하였고, 각 6 ㎖의 TNC 완충액에 부유시킨다음, SW41 로터(Beckman Coulter)를 이용하여 35,000 rpm에서 120 분간 원심분리하였다. VLP 펠릿(pellet)을 TNC 완충액에 부유한 후, 전자현미경 분석을 통하여 VLP의 존재를 확인하였다.
9-3. 면역접종
정제한 하위 밴드(VLP)와 상위밴드(CLP) 각 50 ㎍을 각 2 마리의 마우스 (Balb/c) 에 완전 프로인드 면역반응항진제(complete Freund's adjuvant)와 함께 마우스 등가죽 피하 2-3 부위에 나누어 주사한 후, 14, 35, 56 일 후에 다시 불완전 프로인드 면역반응항진제(incomplete Freund's adjuvant)와 함께 부스팅(boosting)하였다. 60일 후 정맥으로부터 혈액을 채취하고, 혈청을 분리한 후, 항체형성 여부를 ELISA 기법을 이용하여 확인하였다.
실험결과
1. 로타바이러스와 A형 간염바이러스의 재조합 복합 항원 단백질의 동시발현을 위한 베큘로 바이러스 벡터 시스템의 구축
도 1은 본 발명에서 제작한 A형 간염바이러스(HAV)와 로타바이러스(HRV) 재조합 복합항원 단백질 동시발현 시스템의 모식도이다. 도 1에 나타난 바와 같이, D2/VP7와 D3/VP7로 명명된 총 2종의 로타바이러스와 A형 간염바이러스 에피톱을 동시에 함유하는 재조합 복합 항원 단백질의 발현 시스템을 구축하였다. 재조합 항원 단백질은 Overlap extension PCR을 이용하여 각각 1,215 bp와 1,149 bp에 해당하는 증폭산물을 확보하였고, 이들을 각각 베큘로바이러스 전이 벡터(transfer vector)인 pBlueBac4.5(Invitrogen)에 삽입하였다. 제조한 2종의 재조합 베큘로바이러스 전이 벡터에 대해 DNA 염기서열 분석을 실시하여, 클로닝한 염기서열이 인-프레임 융합(in-frame fusion)되었음을 확인하였다.
2. Sf9 곤충세포주에서 재조합 복합 항원 단백질의 동시발현
구축된 2종류의 재조합 베큘로바이러스 발현벡터를 곤충세포주 Sf9 (Spodoptera frugiperda 9)에 도입하여 발현여부를 총 세포단백질 분석을 통하여 확인하였다. 그 결과 예상된 크기의 2 종의 재조합 복합항원 단백질 산물이 각각의 곤충세포주에서 발현됨을 확인하였다(도 2a 참조). 특히, 이들 단백질의 존재를 확인하기 위하여 V5-항체를 이용하여 확인한 바, 해당 산물의 크기에 해당하는 특이적인 단백질 산물을 확인할 수 있었다(도 2b 참조). 이 결과들은 본 발명에서 구축된 로타바이러스의 항원과 A형 간염바이러스 항원을 동시에 함유하는 재조합 복합 항원 단백질 발현시스템에 의하여 재조합 복합 항원 단백질이 안정적으로 발현되었음을 지시한다. 곤충세포주 Sf9에서 재조합 복합 항원 단백질의 경시적 발현 양상을 조사하기 위하여, D2/VP7을 발현하는 재조합 베큘로바이러스를 세포당 5 pfu로 초기 감염시켜 10일 동안 관찰하였던 바, 감염 후 2 일째 최고 발현량을 보여주었으며, 이후 점진적으로 감소하여 10일째 최소량을 보여주었다(도 3 참조). 이는 재조합 베큘로바이러스 감염 후, 10 일을 주기로 정상적인 세포용해가 유도되었음을 지시한다.
3. 재조합 복합항원 단백질의 면역원성
발현된 2 종의 로타바이러스 및 A형 간염바이러스의 항원 함유 재조합 복합 항원 단백질이 면역원성을 가지는지를 조사하였다. 먼저, 인체 감염환자의 A형 간염바이러스 항혈청(HAV anti-serum from Human Patient) 및 토끼에서 생산된 로타바이러스 특이 항체(Rabbit IgG against HRV Wa strain)를 사용하여 2종의 재조합 복합 항원 단백질에 대해 웨스턴 블롯을 실시하였다. 도 4a에서 나타나는 바와 같이, 발현된 2종의 재조합 복합 항원 단백질 모두 로타바이러스 특이 항체에 양성반응을 보였다. 한편, 3명의 인체 감염환자로부터의 얻은 A형 간염바이러스 항혈청을 사용하여 웨스턴 블롯한 경우 D2/VP7에서만 양성반응을 확인할 수 있었다(표 1 참조). 도 4b에 나타난 결과와 같이 재조합 복합 항원 D2/VP7가 3인의 인체감염환자로부터 얻은 A형 간염바이러스 항혈청에 의해 인지됨을 확인하였다.
항체(antibodies) 재조합 복합 항원 단백질
D2/VP7 D3/VP7
Rabbit IgG against HRV Wa strain (+) (+)
HAV anti-serum from human patient 1 (+) (-)
HAV anti-serum from human patient 2 (+) (-)
HAV anti-serum from human patient 3 (+) (-)
상기 결과는 구축된 2종의 재조합 복합 항원 단백질 중 D2/VP7가 로타바이러스와 A형 간염바이러스에 대하여 모두 면역원성을 보유하고 있음을 지시한다.
D2/VP7 재조합 복합 항원 단백질의 면역원성을 다시 확인하기 위하여, 해당 항원을 토끼에 면역 접종하여 항원특이적인 항체가 형성되는지 조사하였다. 도 5a 및 도 5b의 결과에서 알 수 있듯이, D2/VP7 재조합 복합 항원 단백질은 로타바이러스 Wa주 및 A형 간염바이러스 항원에 대한 특이적 항체 형성을 유도하였다.
또한, D2/VP7 재조합 복합항원에 특이적인 항체가 로타바이러스와 A형 간염바이러스에 특이적으로 반응하는지를 확인하기 위하여, 각 바이러스로 감염시킨 배양된 세포와 D2/VP7 재조합 복합항원의 접종에 의해 유도된 면역혈청을 반응시켰다. 도 6a 및 도 6b에 나타나는 결과와 같이, D2/VP7 재조합 복합항원 접종에 의해 얻은 토끼 면역혈청이 각 바이러스에 특이적으로 반응함을 확인하였다. 이러한 결과는 D2/VP7 재조합 복합항원이 A형 간염바이러스와 로타바이러스에 특이적인 항체의 생성을 유도한다는 것을 증명하는 것이다.
4. 재조합 복합항원 단백질의 중화 항체 형성능
D2/VP7 재조합 복합항원에 특이적인 항체가 로타바이러스와 A형 간염바이러스에 대해 중화력을 가지는지 확인하기 위하여, 각 바이러스를 세포에 감염시켜 배양한 후, 이를 D2/VP7 재조합 복합항원에 대한 항혈청과 반응시켰다. 그 결과, 양성대조군과 비교하여 세포병변효과(Cytopathic effect)의 출현이 로타바이러스의 경우 희석배수 320배, A형 간염바이러스의 경우 희석배수 160배까지 감소하여, 항혈청이 각 바이러스를 억제하는 중화력이 있음을 확인할 수 있었다(도 7a 및 도 7b 참조). 아래 표 2는 토끼에 접종하여 얻은 재조합 복합항원 단백질 D2/VP7의 항혈청의 TCID50를 측정한 결과를 보여준다.
바이러스 종류 사람 로타바이러스 A형 간염 바이러스
역가(titer) TCID50 10-5.35/ml 10-1.95/ml
5. 로타바이러스의 바이러스 유사입자의 전자현미경 사진
상기 실시예에 기재한 방법에 의해 합성한 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 전자현미경으로 관찰하였다. 그 결과, D2/VP7 재조합 복합항원을 함유하는 로타바이러스의 바이러스 유사입자가 정상적으로 형성되어 있음을 확인할 수 있었다(도 8 참조).
6. 로타바이러스의 바이러스 유사입자의 면역원성
제조한 로타바이러스의 바이러스 유사입자에 대한 면역원성 여부를 조사하기 위하여, 10％ SDS-PAGE 상에서 분리하고, 토끼에서 생산된 로타바이러스 특이 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 실시한 결과, 해당 산물의 크기에 해당하는 특이적인 단백질 산물을 확인하였다(도 9 참조). 로타바이러스의 바이러스 유사입자의 면역원성을 재확인하기 위하여, 상기 제조한 바이러스 유사입자를 마우스에 면역 접종하여 항원특이적인 항체형성 유무를 조사하였다. 그 결과, 음성대조군과 비교하여 바이러스 특이적인 항체가 유도됨을 확인하였다(도 10 참조).
7. 실험 결론 및 기대효과
본 발명에서는 A형 간염바이러스 에피톱(D2, D3, D4)과 로타바이러스 에피톱(VP2 및 VP7)을 조합한 총 2종의 재조합 복합항원 단백질 D2-VP7 및 D3-VP7를 발현할 수 있는 베큘로바이러스 발현 벡터 시스템을 구축하였고, 이들 복합항원 단백질을 곤충세포인 Sf9 세포주에서 발현하였다. 이들 발현된 재조합 복합항원 단백질에 대한 면역원성을 토끼 및 인체 감염환자 혈청을 이용한 웨스턴 블롯 분석법을 통해 확인하였다. 또한, 면역원성이 확인된 후보 재조합 복합항원 단백질을 토끼에 직접 투여하여 혈청을 얻고, 이 혈청에 대해 ELISA 분석을 행하여 바이러스 특이 항체가 형성되었음을 증명함으로써 면역원성 재확인하였다. 또한, 토끼면역접종으로 형성된 항혈청이 A형 간염바이러스와 로타바이러스의 활성을 모두 억제하는 중화항체능력을 가지고 있음을 확인하였다. 또한, 제작한 로타바이러스-A형 간염바이러스의 재조합 복합항원을 함유하는 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 마우스에 면역 접종한 결과 A형 간염바이러스와 로타바이러스에 모두에 대해 특이적인 항체가 형성되었다. 본 발명의 복합항원단백질 발현시스템은 A형 간염바이러스 및 로타바이러스 유래 항원단백질의 동시 및 대량 발현, 키메라 바이러스 유사 입자 합성, A형 간염바이러스 및 로타바이러스에 대한 복합 면역백신 개발과 다양한 바이러스 항원을 함유하는 복합 바이러스 유사입자 백신 개발에 적용할 수 있다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (15)

  1. 이종 바이러스 항원 및 로타바이러스 항원이 펩티드 결합에 의해 연결된 재조합 로타바이러스 복합 항원 단백질로서, 상기 로타바이러스 항원은 서열목록 제1서열의 아미노산 서열을 포함하는 VP7 단백질 부위이고, 상기 이종 바이러스 항원은 A형 간염바이러스 항원으로서 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 포함하는 A형 간염바이러스 도메인 2(D2) 부위 또는 서열목록 제3서열의 아미노산 서열을 포함하는 A형 간염바이러스 도메인 3(D3) 부위인 것을 특징으로 하는 복합 항원 단백질.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 로타바이러스 항원과 상기 A형 간염바이러스 항원은 펩티드 링커 Leu-Glu-Pro-Gly 또는 Lys-Asp-Glu-Leu 에 의해 연결된 것을 특징으로 하는 복합 항원 단백질.
  6. 제 1 항 또는 제 5 항 기재의 로타바이러스 복합 항원 단백질을 유효성분으로 포함하는 백신용 조성물.
  7. 제 1 항 또는 제 5 항 기재의 로타바이러스 복합 항원 단백질을 발현하기 위한 발현 컨스트럭트로서, (a) 제 1 항 또는 제 5 항 기재의 로타바이러스 복합 항원 단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열; 및 (b) 상기 로타바이러스 복합 항원단백질을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함하는 로타바이러스 복합 항원 단백질 발현용 컨스트럭트.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 발현용 컨스트럭트는 베큘로바이러스 전이 벡터인 것을 특징으로 하는 로타바이러스 복합 항원 단백질 발현용 컨스트럭트.
  9. 상기 제 7 항 기재의 로타바이러스 복합 항원 단백질 발현용 컨스트럭트로 형질 전환된 숙주세포.
  10. 다음의 단계를 포함하는 로타바이러스 복합 항원 단백질의 생산 방법: (a) 상기 제 7 항 기재의 로타바이러스 복합 항원 단백질 발현용 컨스트럭트로 형질 전환된 숙주세포를 배양하는 단계: 및 (b) 상기 단계 (a)에서 배양된 배양물로부터 로타바이러스 복합 항원 단백질을 분리 및 정제하는 단계.
  11. (a) 로타바이러스의 VP2, VP4, 및 VP6의 폴리펩티드, 및 (b) 상기 제 1 항 또는 제 5 항 기재의 로타바이러스 복합 항원 단백질을 포함하는 로타바이러스의 바이러스 유사입자.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 VP2의 폴리펩티드는 서열목록 제 4 서열의 아미노산 서열을 갖고, 상기 VP4의 폴리펩티드는 서열목록 제 5 서열의 아미노산 서열을 갖고, 상기 VP6의 폴리펩티드는 서열목록 제 6 서열의 아미노산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 로타바이러스의 바이러스 유사입자.
  13. 상기 제 11 항 기재의 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 포함하는 백신용 조성물.
  14. 다음을 포함하는 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 발현하기 위한 발현 컨스트럭트:
    (ⅰ) 프로모터에 작동적으로 연결된 VP2 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제1의 재조합 베큘로바이러스;
    (ⅱ) 프로모터에 작동적으로 연결된 VP4 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제2의 재조합 베큘로바이러스;
    (ⅲ) 프로모터에 작동적으로 연결된 VP6 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제3의 재조합 베큘로바이러스; 및
    (ⅳ) 프로모터에 작동적으로 연결된, 상기 제 1 항 또는 제 5 항 기재의 로타바이러스 복합 항원 단백질 코딩 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 제4의 재조합 베큘로바이러스.
  15. 다음의 단계를 포함하는 로타바이러스 복합 항원 단백질을 포함하는 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 생산하는 방법: (a) 상기 제 14 항 기재의 발현 컨스트럭트로 형질 전환된 숙주세포를 배양하는 단계: 및 (b) 상기 단계 (a)에서 배양된 배양물로부터 로타바이러스의 바이러스 유사입자를 분리 및 정제하는 단계.

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