CN110759973A - 一种表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药基因工程与免疫学领域，具体涉及一种表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的细胞株及其应用。本发明提供的表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的细胞株，是通过对非洲猪瘟CD2v蛋白核酸序列进行优化合成，构建含ASFV‑CD2v基因的重组慢病毒载体，然后包装慢病毒并感染HEK‑293T细胞，再经筛选获得的。本发明提供的表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的细胞株，具有与亲本细胞相似的生物特性，有利于抗原蛋白的规模生产；表达蛋白在表达细胞内能得到接近病毒蛋白的天然构象与修饰加工，抗原性好，易于大量生产。

Description

一种表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的细胞株及其应用

技术领域

本发明属于生物医药基因工程与免疫学领域，具体涉及一种表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的细胞株及其应用。

背景技术

非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)引起的猪的一种急性、热性、高度接触传染性疾病，其临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，表现高热、皮肤充血、流产、水肿及脏器出血等，致死率可高达100％。该病一开始主要是在非洲流行，近年来逐渐扩散到欧洲及亚洲等国家和地区，我国2018年开始出现首例病猪后，在短短数月内，辽宁、河南、江苏、浙江、安徽、黑龙江、内蒙古、吉林等省份都相继报道，感染猪死亡率接近100％，给我国养猪业造成了巨大损失。我国已将此病规定为一类动物疾病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必报类动物疫病，该病已受到世界各国的高度重视。

ASFV病毒粒子是由核壳蛋白包裹的病毒基因组DNA、病毒内囊膜、病毒衣壳和外囊膜组成的二十面体结构，直径约200nm。囊膜蛋白是构成病毒颗粒的主要结构蛋白，也是重要的表面抗原，与宿主细胞嗜性、致病性与免疫原性密切相关。已知功能的ASFV囊膜蛋白主要有CD2v、p54、p12、p30、p17和p22 等。

由于ASF的高致死性和高传染性，且暂时没有有效的疫苗，为防止疫病的传播，需要实施严格的卫生和生物安全控制措施，而这就依赖于疫病的快速、可靠的早期诊断。目前，ASF的实验室诊断包括动物接种、病毒分离、病毒核酸 DNA检测和特异性抗体检测等方法。然而，动物接种、病毒分离和病毒核酸DNA 等检测方法或需要在生物安全三级以上的实验室，或需要专业的仪器设备和技术人员，或操作繁琐，难以满足基层检疫部门的需要。因此，利用重组ASFV抗原建立快速、安全的诊断和检疫方法是十分必要的。近年来，随着ASFV全基因组测序的完成，国内外学者利用基因工程技术表达了部分ASFV重要的结构蛋白(如P30、P54、P72和CD2v等)，并利用表达的重组蛋白用于ASFV血清学诊断用抗原的研究。

中国专利申请CN110269932A公开了一种非洲猪瘟疫苗及其用途，并具体公开了一种免疫原性组合物，包含第一、第二和第三构建体，该组合物可以用于制备ASFV疫苗或用于治疗或预防ASFV感染的药物，这种疫苗在一定程度上降低了养猪过程中感染非洲猪瘟病毒的风险，解决了我国没有非洲猪瘟疫苗的难题。但是，这种疫苗制备过程极其复杂，对应抗原产量低，最终导致对非洲猪瘟的抑制性不高。

综上可知，现有技术中普遍存在抗原产量低，检测方法复杂，对非洲猪瘟的抑制性差等问题。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的缺点，提供一种表达非洲猪瘟病毒 CD2v蛋白的细胞株及其应用。本发明提供的表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的细胞株，表达稳定，在多次传代后仍保持很好的蛋白表达水平，且相应蛋白抗原表达量高。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种重组非洲猪瘟病毒CD2v蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

MIILIFLIFSNIVLSIDYWVSFNKTIILDSNITNDNNDINGVSWNFFNNSFNT LATCGKAGNFCECSNYSTSIYNITNNCSLTIFPHNDVFDTTYQVVWNQIINYTI KLLTPATPPNITYNCTNFLITCKKNNGTNTNIYLNINDTFVKYTNESILEYNWN NSNINNFTATCIINNTISTSNETTLINCTYLTLSSNYFYTFFKLYHHHHHH(SEQID NO.1)。

优选地，编码所述氨基酸的序列为多聚核苷酸序列。

更加优选地，编码所述氨基酸序列的多聚核苷酸序列信息如SEQ ID NO.2 所示。

ATGATAATACTTATTTTTTTAATATTTTCTAACATAGTTTTAAGTATTGATT ATTGGGTTAGTTTTAATAAAACAATAATTTTAGATAGTAATATTACTAATGATA ATAATGATATAAATGGAGTATCATGGAATTTTTTTAATAATTCTTTTAATACAC TAGCTACATGTGGAAAAGCAGGTAACTTTTGTGAATGTTCTAATTATAGTAC ATCAATATATAATATAACAAATAATTGTAGCTTAACTATTTTTCCTCATAATGA TGTATTTGATACAACATATCAAGTAGTATGGAATCAAATAATTAATTATACAAT AAAATTATTAACACCTGCTACTCCCCCAAATATCACATATAATTGTACTAATT TTTTAATAACATGTAAAAAAAATAATGGAACAAACACTAATATATATTTAAAT ATAAATGATACTTTTGTTAAATATACTAATGAAAGTATACTTGAATATAACTG GAATAATAGTAACATTAACAATTTTACAGCTACATGTATAATTAATAATACAA TTAGTACATCTAATGAAACAACACTTATAAATTGTACTTATTTAACATTGTCA TCTAACTATTTTTATACTTTTTTTAAATTATATCACCACCACCACCATCACTG (SEQ ID NO.2)。

优选地，扩增所述氨基酸序列的多聚核苷酸序列的上游引物信息如SEQ ID NO.3所示；扩增所述氨基酸序列的多聚核苷酸序列的下游引物信息如SEQ ID NO.4所示。

ATCGATTACTGGGTGTCCTT(SEQ ID NO.3)；

TGTTGATGTTGGAGTTGTTC(SEQ ID NO.4)。

本发明还提供了一种能高效稳定分泌表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的重组细胞株，其保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国，武汉，武汉大学，培养物名称为哺乳动物细胞HEK-293T，保藏株号为HEK-293T-CD2v，中文分类名为人胚肾细胞HEK-293T-CD2v，保藏编号为CCTCC NO.C2019275，保藏日期为2019年10月29日，保藏期限为30年。

本发明还提供了一种重组非洲猪瘟病毒CD2v蛋白在非洲猪瘟免疫血清诊断方面的应用，是采用间接ELISA的方法检测非洲猪瘟的。

本发明还提供了一种重组非洲猪瘟病毒CD2v蛋白在免疫粘膜佐剂方面的应用。本发明意外的发现，将本发明的表达CD2v蛋白作为免疫粘膜佐剂，与猪流行性腹泻病毒(PEDV)S1蛋白和206佐剂联合使用制备疫苗可以诱导动物机体产生针对PEDV的高效价IgA抗体，抵抗病毒感染；这一突破性进展将为PEDV S1亚单位疫苗的研发发挥关键作用，预期该疫苗在临床的应用将彻底控制PED 的发生，肌肉注射免疫途径也利于该疫苗在临床的推广。

本发明在对GENBANK上已知的非洲猪瘟CD2v蛋白核酸序列基础上进行优化合成，构建含ASFV-CD2v基因的重组慢病毒载体，然后包装慢病毒并感染HEK-293T细胞，筛选得到能稳定表达CD2v蛋白的重组细胞系，生产纯化得到 CD2v蛋白。利用得到的重组蛋白作为非洲猪瘟检测的抗原，建立非洲猪瘟血清免疫学检测方法；并将其作为一种免疫粘膜佐剂，与我们发明的猪流行性腹泻病毒疫苗(申请号为：201610573424.6，一种稳定表达猪流行性腹泻病毒S1蛋白的重组细胞系、疫苗和应用)联合使用，通过肌肉注射西藏小型猪就能使小猪体内产生高水平IgA抗体。

同时，本发明利用慢病毒载体构建能表达非洲猪瘟CD2v蛋白的重组细胞系，并利用该细胞系表达重组蛋白CD2v，研究其在免疫血清诊断方面的应用和其作为免疫粘膜佐剂在猪流行性腹泻病毒疫苗中的作用。为我国非洲猪瘟的免疫血清学诊断试剂的制备和预防控制奠定了基础，并找到一种通过肌肉注射猪流行性腹泻病毒疫苗就可产生高水平IgA抗体的免疫粘膜佐剂，为PEDV亚单位疫苗的研发发挥关键作用。

与现有技术相比，本发明提供的表达非洲猪瘟CD2v蛋白的重组细胞株的技术优势为：

(1)本发明所选用的蛋白表达系统为哺乳动物细胞HEK-293T，得到的重组细胞系HEK-293T-CD2v具有与亲本细胞相似的生物特性，有利于抗原蛋白的规模生产；表达蛋白在表达细胞内能得到接近病毒蛋白的天然构象与修饰加工，抗原性好；重组细胞可以用生物反应器高密度发酵培养，易于大量生产；

(2)本发明采用慢病毒载体携带目的基因构建重组质粒后转染HEK-293T 细胞，产生的高滴度病毒颗粒再感染HEK-293T细胞从而构建得到的重组细胞系，表达稳定，在多次传代后仍保持很好的蛋白表达水平；

(3)本发明首次利用慢病毒表达系统表达CD2v蛋白，序列中还含有组氨酸标签序列，有利于后期纯化，且成本较低；

(4)本发明提供的重组细胞株，生产蛋白过程中，不需要用非洲猪瘟病毒，生物安全性好，生产的蛋白免疫原性好、灵敏度高、特异性强、准确度高，且抗原表达量极高，为非洲猪瘟的准确诊断奠定了基础。

附图说明

图1为慢病毒重组载体pLV-CMV-CD2v的酶切电泳图；

图2为慢病毒重组载体pLV-CMV-CD2v的PCR电泳图；

图3为转染后不同克隆细胞表达E2蛋白检测结果；

图4为筛选克隆细胞系后不同代次细胞E2蛋白表达检测结果；

图5为重组细胞系不同代次细胞E2基因RT-PCR结果；

图6为蛋白纯化检测图；

图7为免疫前后猪血清、粪便和唾液中IgA水平检测；

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。

所述慢病毒包装辅助质粒gag/pol、Rev1.66和VSVG均购自Invitrogen公司。

实施例1稳定表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的重组细胞系的构建及检测

1、编码非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的基因序列设计及制备

1.1编码非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的基因序列设计

根据非洲猪瘟病毒CD2v蛋白(ASFV CD2v)的核酸序列(GenBank: KM609392.1)，及在哺乳动物细胞表达上的密码子偏好优化序列，加入his标签核苷酸序列，并在设计该基因时，在起始密码子前加有Kozak序列和酶切位点与保护性碱基，在CD2v蛋白基因编码末端加有终止子和酶切位点与保护性碱基；得到的CD2v蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.1为SEQ ID NO.1翻译后的氨基酸序列。

1.2编码非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的基因序列制备

非洲猪瘟病毒CD2v蛋白基因以及该基因特异性扩增引物(F-1和R-1)均由通用生物系统(安徽)有限公司合成。

编码非洲猪瘟病毒CD2v蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，基因特异性引物F-1和R-1的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示。

2、慢病毒重组载体的构建及检测

将慢病毒表达质粒pLV-CMV-EGFP用NheI和MluⅠ酶切处理回收大片段，然后与经NheI和MluⅠ酶切回收的ASFV-CD2v基因在T4DNA连接酶作用下连接，转化stab3感受态细胞后涂布含氨苄的LB平板，过夜培养后挑取单菌落扩增培养并提取质粒，用菌落PCR及酶切对其进行鉴定，鉴定的阳性质粒即为本实施例所需慢病毒重组载体，将其命名为pLV-CMV-CD2v。

上述含氨苄的LB平板，其培养基配方为100毫升量：胰化蛋白胨1g、酵母提取物0.5g、氯化钠1g、琼脂1.5g，加蒸馏水溶解，高压灭菌20分钟，待液体冷却到55度加入氨苄，摇匀后立刻倒板；所述氨苄浓度为100mg/mL，加入量为每100mL培养基加入100μL氨苄。

本实施例提取的重组质粒经KpnⅠ酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳分析，发现有两条带，酶切产物电泳带型与预期结果一致，同时PCR检测结果也与预期一致；酶切结果如图1所示，图中，1-4为pLV-CMV-CD2v重组质粒1-4号克隆质粒的酶切结果，M为Marker(DL2000)；质粒PCR鉴定结果如图2所示，图中，M为DL2000 Marker，2为阴性对照，3-5为分别为1，3，4号克隆质粒的PCR 结果。

3、慢病毒包装及滴度检测

3.1细胞铺板

细胞铺板采用本领域技术人员的常规操作，具体步骤如下所示：

倒掉HEK-293T细胞培养瓶中的培养上清，用1-3mL PBS洗涤一遍，吸净；加入1mL0.25％的胰酶，室温作用1-2min；待细胞都变圆，加入2-3mL DMEM 完全培养基把细胞吹打下来，收集到离心管中，1000rpm离心5min，弃上清；

用DMEM完全培养基将细胞沉淀充分重悬，使细胞形成单细胞悬液；

向100mm细胞培养皿加入10mL DMEM完全培养基，用细胞计数板细胞计数，每个皿约加入6×10⁶细胞，37℃、5％CO₂培养箱内培养过夜。

DMEM完全培养基的配方为:含10％FBS，100U/mL的青霉素，0.1mg/mL 链霉素的DMEM完全培养基(Corning cellgro,USA,Lot number 10-013-CVR-500mL)。

细胞状态对于病毒包装至关重要，细胞生长良好的状态有利于病毒包装，因此需要保证良好的细胞状态和较少的传代次数。

3.2慢病毒包装及感染

所述慢病毒包装就是将之前制备的慢病毒重组载体pLV-CMV-CD2v与慢病毒包装辅助质粒共转染人胚胎肾细胞HEK-293T，转染方法采用PEI(聚乙烯亚胺)方法，具体步骤如下所示。

3.2.1转染体系

所述PEI转染法为本领域技术人员的常规操作，其转染体系分为A液和B 液，具体如下所示：

A液：

PEI储存液 24μL；

1×HBS 补至1mL；

B液

上述PEI储存液的配方是：称取1.25mg PEI粉末溶解于50mL 1×HBS(pH7.4) 中，0.2μm滤膜过滤，储存于4℃备用。

上述1×HBS的配方为：将8.76g NaCl溶解于900mL超纯水，加入20mL 1M 的HEPES，调pH值到7.4，定容至1L，0.2μm滤膜过滤后储存于4℃备用。

3.2.2转染

细胞铺板后第二天，待细胞融合度达到70％-90％时，将转染体系的A液加入到B液，充分混匀，室温静置20min后，轻轻滴加到100mm皿的细胞培养上清中，轻晃培养皿混匀，放37℃，5％CO₂孵箱中培养48h后收集上清液，然后再向细胞培养皿中加入10mLDMEM完全培养基，继续培养48h后收集上清液，合并两次上清液，然后3000rpm离心5min后去除细胞碎片，则得到所需病毒液。

将该病毒液取100uL用于检测病毒滴度，其余的分装后放于-80度冰箱保存或用于后续的细胞感染。

3.3病毒滴度检测

病毒滴度检测采用RT-QPCR测定病毒滴度，其操作方法采用本领域技术人员的常规操作和所用试剂盒说明步骤即可，检测结果显示病毒滴度为1.2×10⁸ copies/mL，说明病毒包装成功，能感染细胞并将基因插入到细胞基因组中。

3.4细胞感染

将上述得到的病毒液感染HEK293-T细胞，具体步骤如下所示：

(1)将生长状态良好的HEK293-T细胞消化计数后用DMEM完全培养基稀释至1×10⁵/mL，加入24孔板，500μL/孔，准备2个复孔，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时；

(2)准备培养基，在DMEM完全培养基中加入polybrene(聚凝胺)，制备含polybrene的培养基(培养基中Polybrene的终浓度为6-8μg/mL)；

(3)将上述3.2.2制备的病毒液10μL加入到上述含polybrene的培养基中，使终体积为300μL并轻吹混匀，制备得到含病毒培养基；

(4)将步骤1培养24小时后的HEK 293-T细胞的旧培养基倒掉，每个孔内加入300μL含病毒培养基，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养；

(5)培养24小时后，将孔里的培养基倒掉，换上500μL DMEM完全培养基，放入37℃，5％CO₂培养箱中培养；

4、基因稳定表达细胞系的建立

4.1细胞筛选

培养到第3-5天后，将长满培养孔的细胞用胰酶消化后，用有限稀释法传代于96孔板中继续培养，15天后在倒置显微镜下观察每孔细胞的克隆数目；

挑选含有1个细胞集落(即1个细胞团块)的孔相继在24孔板、6孔板、细胞培养瓶中扩大培养，同时收集各个克隆细胞上清用非洲猪瘟阳性血清做抗体， Western Blot检测CD2v蛋白的表达水平及免疫原性。

4.2克隆细胞表达目的蛋白的Western Blot鉴定

克隆细胞在24孔板中培养3d后，收集上清液，加入1:5的蛋白电泳上样缓冲液，离心后吸取上清进行SDS-PAGE电泳；蛋白电泳结束后，进行转膜，恒压15V，20min。转膜完成后将PVDF膜放入含5％脱脂奶粉PBST中室温振荡孵育2h进行封闭。用含有非洲猪瘟阳性血清的PBST作为一抗，4℃孵育过夜。一抗孵育结束后，用PBST漂洗4次，每次10min。然后放入含有相应二抗的PBST中室温振荡孵育2h，用PBST漂洗4次，每次10min。最后，使用HRP-ECL 发光法进行曝光：将A、B发光液等比例混合，滴加至膜上，使用凝胶成像系统分析。结果表明我们筛选得到的5个克隆都能表达目的蛋白CD2v且与非洲猪瘟阳性血清都能特异性反应，我们选取表达量最高、细胞状态最好的细胞克隆继续扩大培养后保存命名为293T-CD2v，并进行稳定性检测。

检测结果如图3所示，图中，1-7分别为不同克隆细胞培养上清Western Blot 结果，由此可知，继续扩大培养后的细胞克隆仍然具有极高的稳定性。

5、本发明重组细胞系的稳定性检测

5.1克隆细胞不同代次细胞表达蛋白的Western Blot鉴定

将上述筛选得到的细胞系293T-CD2v正常传代并收集不同代次细胞上清与非洲猪瘟阳性血清进行Western Blot鉴定，结果表明不同代次的细胞均能稳定表达目的蛋白CD2v且有较好的免疫原性。具体结果如图4所示，图中，1-5分别为1、5、10、15、20代细胞培养上清Western Blot结果；6为阴性对照。

5.2克隆细胞不同代次细胞的RT-PCR鉴定

用RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，取10μL进行反转录，加入Oligo dT1μL，RNase抑制剂1μL，M-MLV 5×Buffer 5μL，M-MLV转录酶1μL， dNTP(10m M)2.5μL，补加双蒸水至25μL，混合，42℃加热60min，95℃5min终止反应。然后利用ASFV-CD2v基因特异性引物，PCR扩增目的基因。

利用RT-PCR对筛选出的重组细胞系进行目的基因的扩增后，结果标明，筛选出的重组细胞系的不同代次的细胞均能扩增出与理论大小一致的目的条带，标明目的基因已稳定融合于细胞基因组中，且遗传稳定。具体结果如图5所示，图中，1为阳性对照，2为阴性对照，M为Marker DL2000(条带从上至下，分别为 2000，1000，750，500，250bp)，3-7分别为1、5、10、15、20代细胞基因RT-PCR 结果。

从上述检测结果可以看出，本实施例确实获得能够稳定表达非洲猪瘟病毒 CD2v蛋白的重组细胞系，将其命名为239T-CD2v。

实施例2重组非洲猪瘟病毒CD2v蛋白纯化

1、重组CD2v蛋白纯化

细胞培养上清经0.45μm滤膜过滤，HisTrapTM HP柱与BioLogic LP蛋白纯化仪正确连接后，用3倍柱体积的上样缓冲液(20mM pH7.4磷酸盐缓冲液，0.5M NaCl)，1mL/min平衡柱子，将预处理的样品以1mL/min的速度上样，结束后用上样缓冲液进行流洗，1mL/min，5倍柱床体积，随后用20mM pH7.4磷酸盐缓冲液(含100-500mM咪唑)梯度洗脱重组蛋白，同时用BioLogic LP进行监测，当观察到基线上升，即出现洗脱峰时开始收集。收集洗脱液至洗脱峰回到基线后，继续用上样缓冲液平衡3-5倍柱体积，流速调至1mL/min。再用5倍柱体积的20％乙醇平衡。

2、蛋白纯化分析

收集蛋白纯化各步留样进行SDS-PAGE分析，方法同实施例1中方法。试验结果如图6所示，图中，M为蛋白Marker,1为上样前，2为流穿，3为洗涤， 4-7分别为50mM、100mM、200mM、500mM咪唑洗脱样品；由此可知，纯化后的蛋白主要在100mM咪唑的洗脱液中，且纯度较高。

实施例3间接ELISA检测方法的建立

1、抗原包被浓度与血清稀释倍数的确定

将纯化并测定浓度的重组CD2v蛋白用0.05mol/L碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释到1mg/mL，作为包被抗原，将纯化抗原做1：100、1：200、1：400、1:800、 1：1600倍比稀释后包被96孔酶标板，每孔加入50μL经倍比稀释的纯化重组抗原，每个稀释度重复两孔，37℃包被过夜，用含0.5mL/L Tween-20的0.1mol/L PBS(pH 7.4)(PBST)洗涤6次；以50g/L脱脂奶粉封闭2h，用PBST洗6次；将非洲猪瘟阳性和阴性血清分别用50g/L脱脂奶粉按1：50、1：100、1：200进行倍比稀释，加入封闭后的酶标板，每孔50μL，37℃反应2h，用PBST洗6次；将辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG(IgG-HRP)以1：20000稀释，每孔加入50μL， 37℃反应1h，用PBST洗6次；加入50μL显色液，避光显色15min，最后加入 50μL终止液(2mol/L H₂S0₄)终止反应，检测OD值，计算阳性血清孔的平均OD 值(P)和阴性做清孔的平均OD值(N)之比(P/N)，取阳性值≥1，阴性值≤0.1且 P/N比值最大的条件。

从表1可以看出抗原稀释度在1：100，抗体稀释在1：200时，P/N值最大，所以选择抗原作1：100，抗体作1：200为最佳稀释度，此时抗原的包被浓度为500ng/孔。

表1方阵测定P/N结果

2、临界值的确定

随机挑取100份非洲猪瘟阳性血清和100份非洲猪瘟阴性血清，以优化的抗原包被量和血清工作浓度进ELISA检测，确定ELISA结果判定的临界值。临界值＝阴性血清平均OD值+3×标准差(SD)。

对100份ASFV阴性血清进行间接ELISA检测，按照已经确立的ELISA程序进行测定，读出OD₄₉₀值，进行样本OD值平均值(X)、标准方差(SD)计算。计算出100份血清的OD₄₉₀值的平均值为0.09，标准方差SD为0.03，因此ELISA 阴阳性临界值等于为0.18。为了便于判断结果，我们确定样本OD₄₉₀≥0.18，裁定为阳性；OD₄₉₀<0.18判为阴性。

3、特异性阻断试验

将阳性与阴性血清分别用封闭液以1：25、1：50、1：100、1：200进行稀释，然后加入等体积、适度稀释的非洲猪瘟病毒抗原，反应1h后按上述程序检测。结果表明，阳性血清能被病毒抗原所阻断。

4、交叉反应试验

用建立的CD2v-ELISA方法同时检测非洲猪瘟阳性血清、阴性血清，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性血清、猪伪狂犬病毒(PRV)阳性血清、口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清、猪传染性胸膜膝炎阳性血清、副猪嗜血杆菌阳性血清进行检测和比较；结果表明非洲猪瘟阴性血清，猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) 阳性血清、猪伪狂犬病毒(PRV)阳性血清、口蹄疫病毒(FMDV)阳性血清、猪传染性胸膜膝炎阳性血清、副猪嗜血杆菌阳性血清，结果均为阴性，表明没有出现交叉反应。

实施例4CD2v蛋白作为免疫粘膜佐剂在猪流行性腹泻病毒疫苗中的应用

本实施例的猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗是由我司申请专利(一种稳定表达猪流行性腹泻病毒变异株重组S1蛋白的重组细胞系及其应用,专利申请号： 201610573424.6)中的重组细胞系293T-S1生产的S1蛋白和CD2v蛋白、206佐剂组成，具体实验步骤如下所示。

1、疫苗的制备

将重组细胞系293T-S1正常传代后长至融合度达到90％以上时，换无血清培养基继续培养4d；收集培养上清经2000rpm离心10min，吸取上清液；

将上述培养上清液与CD2v蛋白、206佐剂按重量比1:1:1混合并充分乳化制备成疫苗A，将上述培养上清液与206佐剂按重量比1:1混合并充分乳化制备成疫苗B。

2、试验分组和免疫操作

10头PEDV抗体阴性小猪，随机分成2组，每组5头。每头经肌肉注射接种2ml疫苗，在第7天和第21天各加强免疫一次。其中实验组肌肉注射2mL疫苗A、对照组肌肉注射等剂量的疫苗B。各组的猪在免疫前均需要采集血液和唾液、粪便并测定PEDV抗体阴性；各组的猪在免疫后的7、14、21和28天采血液和唾液、粪便测定抗体；

将重组的S1蛋白用ELISA包被液稀释成10μg/mL，100μL/孔4℃冰箱包被过夜；倒尽板孔中液体，每空加300μL洗涤液，静置1min，反复洗涤三次，最后将反应板在吸水纸上吸干；加封闭液300μL，37℃放置2h；倒尽板孔中液体，加洗涤液静置1min，反复洗涤三次，最后一次在吸水纸上将洗涤液吸干；加入稀释的血清，同时加入阴性和阳性对照，阴性对照为阴性猪血清，阳性对照则为猪PEDV高免血清，每孔100μL，37℃1h；倒尽板孔中液体，加洗涤液静置1min，反复洗涤三次，最后一次在吸水纸上将洗涤液吸干；二抗为羊抗猪HRP-IgA抗体，每孔100μL，37℃30min；加底物：加TMB100μL/孔，避光放置15min；加终止液：50μL/孔；读取结果：酶标仪读取OD₄₅₀值；结果判定：样品孔/阴性孔≥2.2为阳性。

具体结果见图7，其中，A为免疫前后猪血清中IgA水平，B为免疫前后猪粪便和唾液中IgA水平结果表明，对照组肌肉注射没有添加粘膜佐剂CD2v只加了206佐剂和CD2v蛋白的疫苗B后不产生IgA抗体，而加了粘膜佐剂CD2v 和206佐剂制备的PEDV S1亚单位疫苗后经肌肉注射途径，二次免疫后7天开始就能刺激猪产生高水平的IgA，在粪便、唾液及血清中PEDV S1IgA均可维持较高水平超过1个月。这一突破性进展将为PEDV S1亚单位疫苗的研发发挥关键作用，预期该疫苗在临床的应用将彻底控制PED的发生，肌肉注射免疫途径也利用该疫苗在临床的推广。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

序列表

<110> 广州伯尼兹生物科技有限公司

<120> 一种表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的细胞株及其应用

<130> 2019.10.8

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 212

<212> PRT

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ile Ile Leu Ile Phe Leu Ile Phe Ser Asn Ile Val Leu Ser Ile

1 5 10 15

Asp Tyr Trp Val Ser Phe Asn Lys Thr Ile Ile Leu Asp Ser Asn Ile

20 25 30

Thr Asn Asp Asn Asn Asp Ile Asn Gly Val Ser Trp Asn Phe Phe Asn

35 40 45

Asn Ser Phe Asn Thr Leu Ala Thr Cys Gly Lys Ala Gly Asn Phe Cys

50 55 60

Glu Cys Ser Asn Tyr Ser Thr Ser Ile Tyr Asn Ile Thr Asn Asn Cys

65 70 75 80

Ser Leu Thr Ile Phe Pro His Asn Asp Val Phe Asp Thr Thr Tyr Gln

85 90 95

Val Val Trp Asn Gln Ile Ile Asn Tyr Thr Ile Lys Leu Leu Thr Pro

100 105 110

Ala Thr Pro Pro Asn Ile Thr Tyr Asn Cys Thr Asn Phe Leu Ile Thr

115 120 125

Cys Lys Lys Asn Asn Gly Thr Asn Thr Asn Ile Tyr Leu Asn Ile Asn

130 135 140

Asp Thr Phe Val Lys Tyr Thr Asn Glu Ser Ile Leu Glu Tyr Asn Trp

145 150 155 160

Asn Asn Ser Asn Ile Asn Asn Phe Thr Ala Thr Cys Ile Ile Asn Asn

165 170 175

Thr Ile Ser Thr Ser Asn Glu Thr Thr Leu Ile Asn Cys Thr Tyr Leu

180 185 190

Thr Leu Ser Ser Asn Tyr Phe Tyr Thr Phe Phe Lys Leu Tyr His His

195 200 205

His His His His

210

<210> 2

<211> 639

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 2

atgataatac ttattttttt aatattttct aacatagttt taagtattga ttattgggtt 60

agttttaata aaacaataat tttagatagt aatattacta atgataataa tgatataaat 120

ggagtatcat ggaatttttt taataattct tttaatacac tagctacatg tggaaaagca 180

ggtaactttt gtgaatgttc taattatagt acatcaatat ataatataac aaataattgt 240

agcttaacta tttttcctca taatgatgta tttgatacaa catatcaagt agtatggaat 300

caaataatta attatacaat aaaattatta acacctgcta ctcccccaaa tatcacatat 360

aattgtacta attttttaat aacatgtaaa aaaaataatg gaacaaacac taatatatat 420

ttaaatataa atgatacttt tgttaaatat actaatgaaa gtatacttga atataactgg 480

aataatagta acattaacaa ttttacagct acatgtataa ttaataatac aattagtaca 540

tctaatgaaa caacacttat aaattgtact tatttaacat tgtcatctaa ctatttttat 600

acttttttta aattatatca ccaccaccac catcactga 659

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 3

atcgattact gggtgtcctt 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成(Artificial Sequence)

<400> 4

tgttgatgtt ggagttgttc 20

Claims (7)

1.一种重组非洲猪瘟病毒CD2v蛋白，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.如权利要求1所述的重组非洲猪瘟病毒CD2v蛋白，其特征在于，编码所述氨基酸的序列为多聚核苷酸序列。

3.如权利要求2所述的重组非洲猪瘟病毒CD2v蛋白，其特征在于，编码所述氨基酸序列的多聚核苷酸序列信息如SEQ ID NO.2所示。

4.如权利要求3所述的重组非洲猪瘟病毒CD2v蛋白，其特征在于，扩增所述氨基酸序列的多聚核苷酸序列的上游引物信息如SEQ ID NO.3所示；扩增所述氨基酸序列的多聚核苷酸序列的下游引物信息如SEQ ID NO.4所示。

5.一种能高效稳定分泌表达非洲猪瘟病毒CD2v蛋白的重组细胞株，其特征在于，其保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏株号为HEK-293T-CD2v。

6.一种重组非洲猪瘟病毒CD2v蛋白在非洲猪瘟免疫血清诊断方面的应用。

7.一种重组非洲猪瘟病毒CD2v蛋白在免疫粘膜佐剂方面的应用。

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