CN111518174B - 优化的非洲猪瘟CD2v蛋白及其高效表达方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及优化的非洲猪瘟CD2v蛋白及其高效表达方法和应用。本发明优化的非洲猪瘟CD2v蛋白的氨基酸序列截取自CD2v蛋白靠近跨膜域的单个免疫球蛋白样结构域的氨基酸序列，并进行密码子优化，还可以对其进行截短或突变。本发明设计的CD2v蛋白在CHO细胞中表达量高，易于纯化，可用于鉴别诊断，为生产非洲猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。

Description

优化的非洲猪瘟CD2v蛋白及其高效表达方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术及兽用生物制品技术领域，具体涉及经优化的非洲猪瘟CD2v蛋白及能够将优化的非洲猪瘟CD2v蛋白进行高效表达的方法和该优化的CD2v蛋白在非洲猪瘟检测防疫领域的应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)，是由非洲猪瘟病毒(African swinefever virus)ASFV引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，其常表现出全身出血、呼吸障碍和神经症状等临床症状，具有病程时间短、高病死率等特征，在家猪中导致的死亡率接近100％，因此将其列为一类传染病，同时该病也是世界动物卫生组织(OIE)的法定报告动物疫病之一。非洲猪瘟的传播和疫情的出现，对养猪生产已构成严重威胁，带来了巨大的经济损失，高度重视非洲猪瘟的防控对于保障生猪产业的健康发展极其重要。
非洲猪瘟(ASF)的病原是非洲猪瘟病毒(ASFV)，病毒主要的靶细胞是单核细胞和肺泡巨噬细胞。软蜱(钝缘蜱)是该病毒主要的传播媒介和贮藏宿主。ASFV主要以家猪/猪、家猪/软蜱/野猪、家猪/软蜱三种方式循环传播。ASFV是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员。病毒粒子直径约为200nm，呈正二十面体结构，由多层同心圆结构组成，由内到外依次是类核、核壳、内膜、衣壳和外囊膜。ASFV基因组为线性双链DNA 分子，约为170～193kb。基因组的两端通过部分碱基配对形成发夹环，中间区域较为保守，两端靠近发夹环部位有末端重复序列和可变区。不同的毒株因基因组可变区长度不同而导致其基因组大小存在差异。非洲猪瘟病毒基因组共有150多个开放阅读框，共编码100多种多肽，编码151～167种蛋白质，成熟的病毒粒子包含54种结构蛋白，其中，结构蛋白p72和CD2v可分别用于进行基因型和血清型分析。CD2v蛋白位于病毒粒子的外囊膜上，由信号肽序列和一个跨膜区组成，因为它拥有两个免疫球蛋白样的结构域，其氨基酸序列与CD2分子非常相似，可以与猪红细胞表面的CD2受体发生特异性结合，因此ASFV可以吸附在猪的红细胞表面，具有血吸附性。具有血吸附性的非洲猪瘟病毒，在感染时90％的病毒粒子呈红细胞吸附的状态，这种现象可能与非洲猪瘟病毒在猪体内的传播有关。
目前还没有针对非洲猪瘟的疫苗，如何阻断病毒在家猪中的传播，防止病毒在机体内的逃逸，对防御非洲猪瘟具有重大意义。
发明内容
为解决现有技术中存在的问题，在一方面，本发明分析了非洲猪瘟CD2v 蛋白的氨基酸序列，先通过分析蛋白序列的疏水分布，将CD2v全长蛋白的胞外区与跨膜区、胞内区分开，获得CD2v蛋白胞外区片段序列，再对该序列进行糖基化分析与二硫键分析，将胞外区的两个免疫球蛋白结构域分开，获得CD2v蛋白胞外区近跨膜区的一段序列，并在相关研究的基础上，在靠近跨膜域的单免疫球蛋白样结构域蛋白中确定了一段特异性结合至猪源 CD2蛋白的优化的非洲猪瘟CD2v蛋白，所以本发明提供了如下技术方案。
[1].多肽，其来源于非洲猪瘟CD2v蛋白，且特异性地结合至猪源CD2 蛋白，所述多肽包含SEQ ID No.3或SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或由其组成，优选为SEQ ID No.1所示的氨基酸序列；
优选地，
SEQ ID No.3所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列如SEQ ID No.11所示， SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列如SEQ ID No.10所示， SEQ ID No.1所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列如SEQ ID No.9所示。
[2].多肽，其来源于非洲猪瘟CD2v蛋白，且特异性地结合至猪源CD2 蛋白，所述多肽包含SEQ ID No.7或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列或由其组成，优选为SEQ ID No.5所示的氨基酸序列，优选地，
SEQ ID No.7所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列如SEQ ID No.15所示， SEQ IDNo.6所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列如SEQ ID No.14所示。
SEQ ID No.5所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列如SEQ ID No.13所示。
[3].多肽，其来源于非洲猪瘟CD2v蛋白，且特异性地结合至猪源CD2 蛋白，所述多肽包含SEQ ID No.8所示的氨基酸序列或由其组成，优选为SEQ ID No.4所示的氨基酸序列，优选地
SEQ ID No.8所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列如SEQ ID No.16所示， SEQ IDNo.4所示的氨基酸序列的核苷酸编码序列如SEQ ID No.12所示。
[4].多肽，其包含优化的非洲猪瘟CD2v蛋白，其特异性地结合至猪源 CD2蛋白，且其氨基酸序列如SEQ ID No.17所示，其为在如SEQ ID No.5 所示的氨基酸序列的N端截短了12个氨基酸位点所得，优选地，所述优化的非洲猪瘟CD2v蛋白的核苷酸编码序列如SEQID No.18所示。
[5].多肽，其包含优化的非洲猪瘟CD2v蛋白，其特异性地结合至猪源 CD2蛋白，且其氨基酸序列如SEQ ID No.19所示，其为对如SEQ ID No.17 所示氨基酸序列的第4、第16和第38位氨基酸进行了突变所得，优选地，所述优化的非洲猪瘟CD2v蛋白的核苷酸编码序列如SEQ ID No.20所示。
[6].多肽缀合物，其包含权利要求1-5中任一项所述的多肽，优选，进一步包含纯化标签，如His、Fc、HA、GST、Flag、MBP或FLAG标签。
[7].高效表达优化的非洲猪瘟CD2v蛋白的方法，其包括将项1-5中任一项所述的多肽的核苷酸编码序列引入到CHO细胞中以表达该多肽。
[8].项7所述的方法，其中所述多肽的核苷酸编码序列存在于重组质粒中，优选地所述引入采用电穿孔法。
[9].根据项1-5中任一项所述的多肽或项6所述的多肽缀合物在制备 CD2v抗原制品中的应用。
[10].根据项1-5中任一项所述的多肽或项6所述的多肽缀合物在制备诊断非洲猪瘟的制品中的应用。
[11].根据项1-5中任一项所述的多肽或项6所述的多肽缀合物在制备非洲猪瘟亚单位疫苗中的应用。
较非洲猪瘟CD2v蛋白全长段，优化后的非洲猪瘟CD2v蛋白降低了全序列非受体结合区引起非特异性免疫的风险，且因进行了特定的密码子优化而使之更易在CHO细胞中得到表达，因此产量显著提升。
上述优化的非洲猪瘟CD2v蛋白不仅保留了CD2v结合猪源CD2蛋白的活性位点，并且显著提升了CD2v蛋白的产量。
并且，本发明提供一种高效表达优化的非洲猪瘟CD2v蛋白的方法，其包括将前述任一优化的非洲猪瘟CD2v蛋白的核苷酸编码序列引入到CHO细胞中以表达该优化的非洲猪瘟CD2v蛋白。在一个实施方案中，其中所述优化的非洲猪瘟CD2v蛋白的核苷酸编码序列存在于重组质粒中，在一个实施方案中，所述转入采用电穿孔法。
该高效表达优化后的非洲猪瘟CD2v蛋白的CHO细胞株的构建方法是基于电穿孔法使用上述经优化后CD2v蛋白的重组质粒转染宿主CHO细胞株，并对转染后的宿主CHO细胞进行克隆培养、筛选。
在另一个方面本发明提供上述优化的非洲猪瘟CD2v蛋白在制备诊断非洲猪瘟的制品中的用途以及其在制备非洲猪瘟亚单位疫苗中的用途。验证了本发明优化的非洲猪瘟CD2v蛋白在猪体内产生对应抗体的能力。
本发明优化的非洲猪瘟CD2v蛋白更易在CHO细胞中进行表达，并且能够明显提高CD2v蛋白表达量，得到的CD2v蛋白易于纯化，可用于鉴别诊断，为生产非洲猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。
附图说明
图1是氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19所示的优化的非洲猪瘟CD2v蛋白1、2和3的产物的WB结果图；
图2是氨基酸序列如SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19所示的优化的非洲猪瘟CD2v蛋白1、2和3的产物配以佐剂免疫猪苗，取免疫28天的血清作为一抗，与蛋白产物进行WB检测获得的结果图；
图3是氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示的优化的非洲猪瘟CD2v蛋白1 的ELISA标准曲线；
图4是氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示的优化的非洲猪瘟CD2v蛋白2 的ELISA标准曲线；
图5是氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示的优化的非洲猪瘟CD2v蛋白3 的ELISA标准曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
本发明所应用的方法可以采用基因工程技术领域中常用的方法，而不仅限于本发明实施例的具体记载，本领域的普通技术人员可以其它常规方法来实现本发明。
实施例1：确定优化的CD2v蛋白基因，以及表达优化后CD2v蛋白基因的重组质粒的构建
1.1CD2v蛋白基因序列的确定的优化
以NCBI官网记录的2018年分离的沈阳毒株CD2v序列(KM262845.1) 为基础，对CD2v蛋白序列进行网站分析，先通过分析蛋白序列的疏水分布，将CD2v全长蛋白的胞外区与跨膜区、胞内区分开，获得CD2v蛋白胞外区片段序列，再对该序列进行糖基化分析与二硫键分析，将胞外区的两个免疫球蛋白结构域分开，获得CD2v蛋白胞外区近跨膜区的一段序列，并在相关研究的基础上，在靠近跨膜域的单免疫球蛋白样结构域蛋白中确定了一段特异性结合至猪源CD2蛋白的优化的非洲猪瘟CD2v蛋白1，其氨基酸的序列如SEQ ID NO.5所示，并对其编码核苷酸序列进行CHO细胞株偏爱的密码子优化，密码子优化表为北京鼎持生物技术有限公司所有，优化后的核苷酸编码序列如SEQ ID NO.13所示。
从如序列SEQ ID NO.5所示CD2v蛋白N端截短12个氨基酸位点，截短后的氨基酸序列如SEQ ID NO.17所示，此为优化的CD2v蛋白2，核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
对如序列SEQ ID NO.17所示截短后的优化的CD2v蛋白2的氨基酸序列的第4、第16和第38位点上突变3个氨基酸位点，突变后的氨基酸序列如SEQ ID NO.19所示，此为优化的CD2v蛋白3，其核苷酸编码序列如SEQ ID NO.20所示。
1.2CD2v蛋白重组质粒的构建
将三种本实施例1.1得到的优化的CD2v蛋白1、2和3的核苷酸序列 SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20交由华大基因合成并连接至 PMV通用载体上，得到三种对应的PMV-CD2v质粒，再使用pcDNA3.1载体(购自Addgene)，分别重组构建了三种pcDNA3.1-CD2v质粒。下文详细阐述了对三种PMV-CD2v质粒的处理步骤。
1.2.1酶切PMV-CD2v质粒
(1)标记好需要用到的1.5mL的EP管，在1.5mL的EP管中按照下表进行加样、混匀：双酶切反应体系为10μL，加样如下表1所示：
表1
Figure GDA0003717255930000061
酶HindⅢ、EcoRⅠ购自NEB公司。
(2)将步骤(1)中的装有双酶切反应体系的1.5mL EP管置于37℃恒温水浴锅中，酶切过夜。
1.2.2双酶切胶回收。
取出上述双酶切产物，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段。
(1)柱平衡步骤：向吸附柱CB2中(吸附柱放入收集管)加入500μL 平衡液，12,000rmp离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(2)将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下放入干净的离心管中，称取重量，并记录数值。
(3)向步骤(2)中的1.5mL离心管中加入等体积溶液PC buffer，50℃水浴放置10min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。
(4)将步骤(3)所得溶液加入吸附柱CB2中，静置2min，12,000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
(5)向吸附柱中CB2中加入600μL漂洗液PW buffer，静置3min， 12,000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
(6)重复步骤(5)。
(7)将吸附柱CB2放入收集管中，12,000rpm，离心2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干。
(8)将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μLddH2O，静置10min，12,000rpm，离心2min，收集DNA溶液。
(9)将步骤(8)中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶，回收分别针对SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3的三个 DNA片段。
1.2.3连接反应
将1.2.2中回收得到的三个DNA片段分别插入pcDNA3.1载体。
(1)标记需要用到的200μL离心管。
(2)在标记完的离心200μL管中按照下表2的20μL反应体系进行加样：
表2
Figure GDA0003717255930000071
(3)完成加样后，用移液器轻轻吹打几次混匀各组分。
(4)将200μL离心管置于PCR仪中16℃连接3h，得到连接反应产物，其含有分别为连接有SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20三个 DNA的pcDNA3.1载体，分别称为pcDNA3.1-CD2v质粒-1、pcDNA3.1-CD2v 质粒-2、pcDNA3.1-CD2v质粒-3。
(5)步骤(4)的连接反应产物可直接进行转化实验，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。
1.2.4转化反应
(1)将10μL1.2.3得到的连接反应产物分别快速加入含有100μL感受态细胞DH5α(购自康体生命)的样品管中，并吹打混匀，冰浴30min。
(2)步骤(1)完成后，取出样品管，置于42℃水浴45s，然后立即冰浴90s，进行转化。
(3)步骤(2)完成后，取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入200μL LB液体培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm，培养 45min。
(4)制备转化平板，依据pcDNA3.1-CD2v质粒-1、-2、-3的抗性制备转化用LB氨苄抗性平板。
(5)涂板：吸取已转化的感受态细胞加到LB氨苄抗性平板中，均匀涂开。
(6)将步骤(5)平板倒置于生化恒温培养箱中，37℃培养15h。
(7)观察记录转化结果。
1.2.5质粒抽提与酶切鉴定
1.2.5.1质粒抽提
小提质粒试剂盒购自天根生化科技有限公司。具体操作如下：
(1)用10μL移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5ml含氨苄抗性的 LB液体培养基中，37℃，220rpm摇菌过夜。
(2)柱平衡步骤：向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μL 的平衡液BL，12,000rpm，离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
(3)取5mL过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机， 12,000rpm，离心1min，尽量吸取上清。
(4)向步骤(3)中的离心管中每管加入250μL质粒提取试剂P1 buffer，彻底悬浮菌体。
(5)向步骤(4)溶液中加入250μL P2 buffer，立即温和颠倒离心管6-8 次混匀。室温静置2-4min。
(6)向步骤(5)溶液中加入350μL P3 buffer，立即温和颠倒离心管6-8 次，充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。12,000rpm，离心10min。
(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱CP3中心，12,000rpm，室温离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱CP3放入收集管中。
(8)向吸附柱中心加入600μL漂洗液PW，12,000rpm，室温离心1min，倒掉收集管中液体，将吸附柱CP3放入收集管中。
(9)重复操作步骤(8)。
(10)将吸附柱CP3放入收集管中，12,000rpm，室温离心2min。
(11)将吸附柱CP3放入干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中心加入50μL ddH2O，室温静置10min，12,000rpm，离心2min，4℃保存管中质粒溶液，得到纯化的pcDNA3.1-CD2v质粒-1、pcDNA3.1-CD2v质粒-2、 pcDNA3.1-CD2v质粒-3。
1.2.5.2对本实施例1.2.5.1中得到的三种质粒分别进行酶切鉴定
通用型DNA纯化回收试剂盒购自天根生化科技有限公司。具体操作如下：
(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，在1.5mL EP管中按照下表3进行加样、混匀：反应体系为20μL：
表3
加样成分名称 加样量
质粒 5μg
酶HindⅢ(20,000units/ml) 0.5μL
酶EcoRⅠ(20,000units/ml) 0.5μL
10×buffer cutsmart 2μL
ddH2O 补至20μL
(2)将步骤(1)中的1.5mL EP管置于37℃恒温水浴锅中，酶切过夜。
(3)电泳验证。取出上述双酶切产物，进行琼脂糖凝胶电泳验证，并由生工生物工程有限公司测序并返回测序结果，鉴定得出pcDNA3.1-CD2v 质粒-1、pcDNA3.1-CD2v质粒-2、pcDNA3.1-CD2v质粒-3的酶切产物分别对应核苷酸序列SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.18、SEQ ID NO.20。
实施例2：将pcDNA3.1-CD2v质粒-1、pcDNA3.1-CD2v质粒-2、 pcDNA3.1-CD2v质粒-3转入CHO细胞，与用于识别转染后CD2v蛋白表达与否的筛选抗性标记。
2.1pcDNA3.1-CD2v质粒大提
将实施例1最终鉴定得到的pcDNA3.1-CD2v质粒-1、pcDNA3.1-CD2v 蛋白质粒-2、pcDNA3.1-CD2v质粒-3进行质粒大提。质粒大提试剂盒购自天根生化科技有限公司。
2.3基于电穿孔法进行质粒转染
A、培养基准备：将FBS(购自美国Gibco公司)用3500的透析袋透析，然后配置含10％dFBS的CSC-03培养基1L，配置完毕后至于培养箱中进行预热，培养箱的温度设置为37℃。
B、宿主细胞准备：接种初始细胞浓度为0.5×106cells/ml的CHO细胞株 (由北京鼎持生物技术有限公司从ATCC引进，引进时间：2018年5月1日， ATCC编号：CCL61。本细胞经在北京鼎持生物技术有限公司扩增培养后建立了细胞库，细胞库的编号为：BJDC-201800010)于125ml三角摇瓶中，悬浮培养3天；用Countstar自动细胞计数仪记录宿主细胞CHO活细胞密度以及细胞活率，按照1.0×107cells总量取细胞，离心去上清，离心条件为800r/m，离心5min；再使用5mL CD-Pro培养基清洗两次去除上清液的细胞，第二次清洗后使用600μL CD-Pro培养基将细胞进行重悬，待用；
C、分别量取200μg pcDNA3.1-CD2v质粒-1、pcDNA3.1-CD2v质粒-2、pcDNA3.1-CD2v质粒-3(溶于电转培养基CD-Pro(购自壹生科(深圳)有限公司)中)加入到使用CD-Pro培养基重悬的CHO细胞液中，室温下孵育5分钟；
D、设定电穿孔仪的电转程序为320V，900uF，∞，4mm；
E、将已溶有质粒的CD-Pro培养基重悬细胞液转入到电转杯中，静置 2min开始电转，记录电转的时长和电压；
F、电转完成后将电转杯中的细胞液加入到已配置好的含10％dFBS的 CSC-03培养基中，吹吸混匀。
G、吹吸混匀的电转细胞液，按照100μL/well的体积比将细胞液铺到96 孔板中，将96孔板置于37℃，含5％CO2的培养箱中培养。
2.4进行细胞株筛选
将电转染后24小时的96孔板中的CHO细胞液添加MSX(蛋氨酸亚氨基代砜)进行处理，加入量为30～50μm；培养20天左右，将细胞株转移到24孔板中进行培养，培养基为含有5％dFBS的单克隆培养基CSC-03(购自壹生科(深圳)有限公司)；培养3天后扩出一副板24well板，37℃，5％CO2条件下静置7天后，取其上清液进行检测，使用WB检测方式筛选阳性细胞株，即转染成功的细胞株，将筛选的细胞株转移至6孔板中进行培养，培养基为无dFBS的单克隆培养基；培养3天后转移至摇瓶培养，培养基为无dFBS 的CHO-K1+15umMSX培养基，培养三天，其中CHO-K1培养基购自壹生科(深圳)有限公司；此培养过程同时完成了细胞株的筛选和细胞株对无血清培养基的适应培养过程，此过程如表4所示。
表4无血清适应过程
Figure GDA0003717255930000111
对筛选出的细胞株进行扩增，第4天开始加NF604培养基(购自深圳壹生科)，细胞活率60％左右时，12,000rmp，离心15min，收集细胞上清液，取1ml上清液进行检测，使用WB检测方式筛选产量高的阳性细胞株，即转染成功的细胞株(抗体为HRP-Conjugated 6His，Proteintech)，上清液采用镍柱纯化His标签的方式，再进一步筛选得到最佳的已插入优化的CD2v蛋白的CHO细胞株。
三种优化的CD2v蛋白的产量分别为15mg/L、43mg/L、110mg/L(相应地基于细胞计算的产量分别为2.5×10-9mg/cell、7.2×10-9mg/cell、18.3×10-9 mg/cell)，如图1所示，使用SEQ ID NO.19构建的CD2v蛋白的产量要高于 SEQ ID NO.17构建的CD2v蛋白的产量，更高于SEQ ID NO.5构建的CD2v 蛋白的产量。
实施例3：蛋白纯化
优化的CD2v蛋白的层析纯化
(1)将实施例2得到的三种含有优化的CD2v蛋白的细胞上清液，用GE的NiSepharose excel介质进行亲和层析。具体步骤为，将实施例2得到的三种细胞上清液分别5000rpm离心5min，作为上样液。
(2)用5倍柱体积的蒸馏水清洗介质。
(3)用5倍柱体积的平衡缓冲液(50mM Tris，500mM NaCl，pH8.0) 清洗介质。
(4)上样，柱子每毫升可挂4mg蛋白。
(5)用20倍柱体积的洗涤缓冲液(50mM Tris，500mM NaCl，50mM) 清洗介质。
(6)用5倍柱体积的洗脱缓冲液(50mM Tris，500mM NaCl，500mM) 将蛋白洗脱。
得到三种CD2v蛋白，抗原CD2v蛋白1、抗原CD2v蛋白2、抗原CD2v 蛋白3，其氨基酸序分别为SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19，可做为非洲猪瘟的抗原制品。
实施例4：非洲猪瘟CD2v蛋白疫苗制备
(1)将实施例3得到的优化的CD2v蛋白抗原分别与硫柳汞混合，得到优化的CD2v蛋白抗原的终浓度为0.025mg/ml，硫柳汞的的含量为0.01％，再取102mL分别加入18mL ISA15A VG佐剂(购自SEPPIC)。
(2)室温搅拌20min，取出10mL 3500r离心10min，分层液体＜0.5mL(实测约0.1mL)，制成免疫抗原(即疫苗)。
(3)20mL分装(5头份)疫苗瓶，共计29头份。
该批次疫苗注射健康猪体(购自易县东白涧瑞金养猪场)后，采28天血清，进行抗体(一抗为200倍稀释血清，二抗为羊抗猪IgG-HRP，Solarbio)WB检测，检测结果如图2所示。从图2中可以得出，本实施例中三种抗原CD2v 蛋白所得到的疫苗均能与上述200倍稀释血清特异性结合，说明本实施例中三种抗原CD2v蛋白能够产生效价较高的疫苗。
实施例5：CD2v蛋白制备诊断非洲猪瘟制品
(1)按照下表5中稀释浓度分别稀释实施例3得到的氨基酸序列分别为SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.19的三种抗原CD2v蛋白1、抗原CD2v蛋白2、抗原CD2v蛋白3，按照100μL/well加入酶标板中，共设8个浓度梯度，做两列副孔，4℃孵育过夜；
表5
酶标板序号 c(nm) c(ng/mL)
A1-A9 0 0
B1-B9 0.60625 31.25
C1-C9 1.2125 62.5
D1-D9 2.425 125
E1-E9 4.85 250
F1-F9 9.7 500
G1-G9 19.4 1000
H1-H9 38.8 2000
(2)按照200μL/well加入1％BSA，37℃封闭2h；
(3)感染野生非洲猪瘟病毒的猪苗血清(购自易县东白涧瑞金养猪场) 用PBS 1:200稀释后，按照100μL/well加入对应酶标板孔，37℃孵育2h；
(4)按照100μL/well加入1:2000稀释的羊抗猪-HRP抗体(购自 Solarbio)；
(5)TMB显色；
(6)在450nm波长下测得样品吸光度；
检测结果如图3、图4、图5所示，x代表抗原浓度，y代表吸光度，可见随着抗原CD2v蛋白质量的增加，样品吸光度也随之增加，两者呈线性关系，其中针对抗原CD2v蛋白1：y＝9.161x-0.198(R2＝0.937)、针对抗原 CD2v蛋白2：y＝6.5924x+0.5219(R2＝0.9916)、针对抗原CD2v蛋白3：y＝ 9.8873x+1.4012(R2＝0.9979)。说明所生产的CD2v蛋白可以作为抗原制备诊断非洲猪瘟制品。
实施例6：优化的非洲猪瘟CD2v蛋白
按照下表6设计优化的非洲猪瘟CD2v蛋白
表6
Figure GDA0003717255930000141
Figure GDA0003717255930000151
Figure GDA0003717255930000161
Figure GDA0003717255930000171
按照实施例1-3的方法制备各个优化的非洲猪瘟CD2v蛋白，并用实施例4的方法测定各个优化的非洲猪瘟CD2v蛋白作为抗原与抗体的结合能力，其ELISA结果如表7所示：
表7
ELISA(OD450) 阳性猪血清 阴性猪血清
SEQ No.1 0.666 0.054
SEQ No.2 0.612 0.07
SEQ No.3 0.353 0.071
SEQ No.4 0.387 0.074
SEQ No.5 0.474 0.07
SEQ No.6 0.484 0.069
SEQ No.7 0.481 0.069
SEQ No.8 0.465 0.089
上述内容仅为本发明创造的较佳实施例而已，不能以此限定本发明创造的实施范围，即凡是依本发明创造权利要求及发明创造说明内容所做出的简单的等效变化与修饰，皆仍属于本发明创造涵盖的范围。
Figure IDA0002487597170000011
Figure IDA0002487597170000021
Figure IDA0002487597170000031
Figure IDA0002487597170000041
Figure IDA0002487597170000051

Claims (13)

1.多肽，其来源于非洲猪瘟CD2v蛋白，且特异性地结合至猪源CD2蛋白，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示。
2.权利要求1所述的多肽，其核苷酸序列如SEQ ID No.13所示。
3.多肽，其包含非洲猪瘟CD2v蛋白，其特异性地结合至猪源CD2蛋白，且其氨基酸序列如SEQ ID No.17所示。
4.权利要求3所述的多肽，其中所述非洲猪瘟CD2v蛋白的核苷酸编码序列如SEQ IDNo.18所示。
5.多肽，其包含非洲猪瘟CD2v蛋白，其特异性地结合至猪源CD2蛋白，且其氨基酸序列如SEQ ID No.19所示。
6.权利要求5所述的多肽，其中所述非洲猪瘟CD2v蛋白的核苷酸编码序列如SEQ IDNo.20所示。
7.多肽缀合物，其由权利要求1-6中任一项所述的多肽，和纯化标签组成。
8.权利要求7所述的多肽缀合物，其中所述纯化标签选自His、Fc、HA、GST、Flag、MBP或FLAG标签。
9.表达非洲猪瘟CD2v蛋白的方法，其包括将权利要求1-6中任一项所述的多肽或权利要求7-8任一项所述的多肽缀合物的核苷酸编码序列引入到CHO细胞中以表达该多肽或所述多肽缀合物。
10.权利要求9所述的方法，其中权利要求1-6中任一项所述多肽或权利要求7-8任一项所述的多肽缀合物的核苷酸编码序列存在于重组质粒中。
11.权利要求9所述的方法，其中所述引入采用电穿孔法。
12.根据权利要求1-6中任一项所述的多肽或权利要求7-8任一项所述的多肽缀合物在制备CD2v抗原制品中的应用。
13.SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19所示的多肽或权利要求7-8任一项所述的多肽缀合物在制备诊断非洲猪瘟的制品中的应用。
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