CN115073559A - 重组的非洲猪瘟病毒ep153r亚单位跨膜蛋白的原核可溶性表达方法和应用 - Google Patents

重组的非洲猪瘟病毒ep153r亚单位跨膜蛋白的原核可溶性表达方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种重组的非洲猪瘟病毒EP153R亚单位跨膜蛋白的原核可溶性表达方法和应用，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述原核可溶性表达方法包括：1)根据大肠杆菌密码子偏嗜性特征，人工优化并合成非洲猪瘟病毒EP153R蛋白编码基因，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，基因序列如SEQ ID NO.1所示；2)将密码子优化后的非洲猪瘟病毒EP153R蛋白的基因如SEQ ID NO.1所示的编码基因序列克隆到原核表达载体中，得到含有非洲猪瘟病毒EP153R亚单位蛋白编码基因的重组质粒；3)EP153R亚单位跨膜蛋白表达与纯化。本发明能够提供一种可大规模工业化生产的非洲猪瘟跨膜蛋白EP153R亚单位蛋白且制备方法简单、成本低能够达到国家现有标准。

Description

重组的非洲猪瘟病毒EP153R亚单位跨膜蛋白的原核可溶性表 达方法和应用
技术领域
本发明属于兽用生物制品技术领域。涉及一种重组的非洲猪瘟病毒EP153R亚单位跨膜蛋白的原核可溶性表达方法和应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起的猪的急性、热性、高度接触性传染病，发病率及死亡率高达100％。猪感染非洲猪瘟病毒后出现皮肤充血，内脏器官出血，高热为特征临床症状，猪是ASFV自然感染的唯一哺乳动物宿主，包括家猪和野猪，尤其是家猪，易感性极高，对畜牧业影响巨大。世界动物卫生组织将其列为A类疫病，我国也将其列为一类动物传染病。
该病最早在1921年于非洲的肯尼亚国家确认发生，对非洲乃至全球多个国家的养猪业造成极大打击。2018年8月份以来，在我国多个省份爆发，给我国养猪业带来了严重的经济损失。虽然，国内外学者对非洲猪瘟做了大量的研究工作，但研究发现：常规制备的非洲猪瘟灭活苗效果不明显，而弱毒苗保护效果也不好，且安全性差，易造成散毒。目前，世界上尚未有有效预防非洲猪瘟的疫苗和治疗该病的药物发现，迫切需要新型疫苗的研发和生产来预防非洲猪瘟。
ASFV病毒是具有囊膜的虫媒DNA病毒。病毒颗粒呈二十面体对称结构，平均直径200nm，表面有含糖脂类的囊膜覆盖。其病毒基因组为双股线性DNA，大小为170-190kb，整个基因组大约有150个ORF，编码150-200中蛋白质。EP153R蛋白由EP153R基因编码的病毒跨膜蛋白。EP153R基因全长474bp，编码含有153～163个氨基酸的凝集素类似膜蛋白，与CD44分子的N端区域有显著的同源性，蛋白中潜在多个N-糖基化、磷酸化、豆蔻酰化作用位点，EP153R蛋白含有中央跨膜区C型动物凝集结构域、细胞附着序列。EP153R基因在病毒感染的早期与晚期均有表达，EP153R蛋白为多功能蛋白，能够调控细胞凋亡，C型动物凝集结构域对MHC-I类抗原表达具有抑制作用，且参与ASFV感染细胞后的血细胞吸附过程。在当前没有可能大规模制备灭活疫苗或弱毒疫苗的情况下，确定一种制备该病毒的免疫原性蛋白的方法，以便研究一种能够预防该疾病的疫苗或具有能够预防该疾病的亚单位蛋白具有重大的意义。
发明内容
为了能够大规模生产EP153R蛋白，本发明提供一种重组的非洲猪瘟病毒EP153R亚单位跨膜蛋白的原核可溶性表达方法和应用。。
为了实现上述目的，本发明提供了一种重组的非洲猪瘟病毒EP153R亚单位跨膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，基因序列如SEQ ID NO.1所示。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种重组的非洲猪瘟病毒EP153R亚单位跨膜蛋白的原核可溶性表达方法，所述原核可溶性表达方法包括如下步骤：
1)根据大肠杆菌密码子偏嗜性特征，人工优化并合成非洲猪瘟病毒EP153R蛋白编码基因，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，基因序列如SEQ ID NO.1所示；
2)将密码子优化后的非洲猪瘟病毒EP153R蛋白的基因如SEQ ID NO.1所示的编码基因序列克隆到原核表达载体pET28a中，得到含有非洲猪瘟病毒EP153R亚单位蛋白编码基因的重组质粒；
3)EP153R亚单位跨膜蛋白表达与纯化：
将步骤2)中筛选的所述重组质粒转入大肠杆菌菌株中诱导表达，通过培养、筛选得到高度表达的菌株，发酵培养该高度表达的菌株，再进行裂解、离心，将离心收集的上清液加入到镍柱中进行分离纯化，最后加入咪唑洗脱液洗脱目的蛋白，以得到含有EP153R蛋白的咪唑洗脱液，再采用磷酸盐缓冲液置换该含有EP153R蛋白的咪唑洗脱液，以得到非洲猪瘟病毒EP153R亚单位可溶性融合蛋白。
这里，非洲猪瘟病毒EP153R亚单位跨膜蛋白原核表达载体构建如下：
设计PCR引物，对所述合成的EP153R亚单位蛋白编码基因进行PCR扩增，所述引物序列如下：
上游引物为F：AGGCCATGGCGTTCAGCAACAAG，下划线为Nco I酶切位点；
下游引物为R：GCACTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTT，下划线为Xho I酶切位点；
利用Nco I和Xho I分别双酶切PCR产物和pET28a原核表达载体，筛选阳性重组质粒。
在本发明的优选技术方案中，步骤2)中，所述原核表达载体为pET28a。
在本发明的优选技术方案中，步骤3)中，所述大肠杆菌菌株选自C43(DE3)菌株、C41(DE3)菌株中的一种菌株。
在本发明的优选技术方案中，步骤3)中，所述诱导表达采用IPTG作为诱导剂。
在本发明的优选技术方案中，步骤3)中，所述诱导表达时诱导温度为20-25℃，诱导时间为8-12h。
在本发明的优选技术方案中，步骤3)中，所述咪唑洗脱液为bufferA和bufferB的混和液、bufferB；所述咪唑洗脱液的浓度为20mM、50mM、500mM。
在本发明的优选技术方案中，步骤3)中，所述咪唑洗脱液为bufferA：bufferB＝24:1的混合、bufferA：bufferB＝9:1的混合、含500mM咪唑的bufferB。
在本发明的优选技术方案中，步骤3)中，Buffer A为50mM NaH2PO4，500mM NaCl，0.05％Tween 20，pH 7.4；Buffer B为50mM NaH2PO4，500mM NaCl，500mM咪唑，0.05％Tween20，pH 7.4。
在本发明的优选技术方案中，步骤3)中，所述磷酸盐缓冲液为50mM NaH2PO4，500mMNaCl，0.05％Tween 20，pH 7.4。
根据本发明的再一个方面，本发明提供了一种所述非洲猪瘟病毒EP153R亚单位可溶性融合蛋白在制备诊断、预防和治疗非洲猪瘟的疫苗中的应用。
与现有技术相比，本发明公开的表达序列、表达载体以及相应的纯化制备方法克服了现有技术中的缺陷，解决了大肠杆菌中不能直接大量可溶性表达EP153R蛋白且产量低的问题。本发明能够在大肠杆菌中直接可溶性表达EP153R，克服了现有技术中的诸多问题，且制备方法简单、成本低。
附图说明
图1表示EP153R基因序列优化前后比对结果。
图2表示pET28a-OPTI-EP153R质粒图谱。
图3表示pET28a-OPTI-EP153R诱导表达SDS-PAGE检测结果如图3所示，其中M是Marker，1是诱导前上清，2是诱导前沉淀，3是诱导后上清，4是诱导后沉淀，箭头指向为EP153R蛋白。从图中可以看出，目的蛋白为可溶性表达。
图4表示重组EP153R的SDS-PAGE纯化检测结果：1是EP153R蛋白，2是纯化后的蛋白Marker。
图5表示EP153R蛋白纯化后Western-blot检测结果：1是EP153R蛋白，2是纯化后的蛋白Marker。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明做进一步说明，本发明的实施例仅用于说明本发明的技术方案，并非限定本发明。
本发明实施例中所使用的菌株、质粒和试剂均为市售产品。
实施例1 EP153R蛋白表达及制备
1.1非洲猪瘟EP153R蛋白的选择
非洲猪瘟跨膜蛋白EP153R是由EP153R基因编码的一段多肽，已有研究表明，EP153R基因在病毒感染的早期与晚期均有表达，调控细胞凋亡，C型动物凝集结构域对MHC-I类抗原表达具有抑制作用，且参与ASFV感染细胞后的血细胞吸附过程。因此，利用EP153R蛋白作为抗原具有很好的防控非洲猪瘟的感染，尽管EP153R蛋白报道在真核表达系统中存在表达。但是，目前还没有报道在原核表达系统中能可溶性表达全长及纯化得到该蛋白，这也是本发明所要解决的一个重要的技术问题。
1.2非洲猪瘟EP153R蛋白密码子优化
本实验室以2018年在中国报道流行的非洲猪瘟毒株亚型，参考Georgia 2007/1全基因序列(GenBank：FR682468.1)为模板，对编码非洲猪瘟EP153R蛋白的EP153R的核苷酸序列进行密码子优化，得到OPTI-EP153R序列，如SEQ ID NO.1所示，该序列合成工作委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成。如图1所示，优化前后有30％的核苷酸序列不同。
1.3 pET28a-OPTI-EP153R重组质粒构建
1.3.1 PCR扩增目的片段OPTI-EP153R
1.3.1.1 PCR反应
(1)引物设计及合成
上游引物:5’-AGGCCATGGCGTTCAGCAACAAG-3’
下游引物:5’-GCACTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTT-3’
(2)加样体系50μL，如下表所示：
Figure BDA0002976884960000041
Figure BDA0002976884960000051
PCR扩增程序：
Figure BDA0002976884960000052
1.3.1.2 PCR产物进行胶回收
(1)标记好样品收集EP管、吸附柱以及收集管；
(2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值；
(3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5mL离心管中；
(4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μL PC buffer，50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解；
(5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μL平衡液BL，离心12,000rpm/min，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；
(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置2min，10,000rpm/min，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱CB2放入收集管中；
(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PW buffer，静置3min，离心10,000rpm/min，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中；
(8)重复步骤(7)；
(9)空吸附柱离心，12,000rpm/min，2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干；
(10)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL Elutionbuffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm/min，2min；
(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱CB2，盖上离心管盖子，保留离心管中的DNA样品；
(12)将步骤11中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收DNA片段。
1.3.2 PCR产物及载体双酶切反应
(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，在1.5mL EP管中按照下表进行加样、混匀：50μL反应体系
Figure BDA0002976884960000061
(2)将步骤(1)中的1.5mL EP管置于相应酶最适温度恒温水浴锅中，水浴2-3h。
双酶切产物胶回收：取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段，方法同1.2.1中PCR产物胶回收。
1.3.3连接反应
(1)准备洁净的1.5mL EP管若干，做好标记，置于EP管架上待用。
(2)在1.5mL EP管按照下表进行加样、混匀。
Figure BDA0002976884960000062
(3)按照步骤(2)中表格完成加样后，将每个10μl反应体系置于16℃低温冷却液循环机中，水浴10-16h；
(4)取出步骤(3)中EP管，将其置于65℃水浴锅中，水浴15min；
(5)取出步骤(4)中的EP管，置于4℃保存。
1.3.4转化反应
(1)将10μL连接反应液快速加入100μL感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min；
(2)取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min；
(3)取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加入600μL液体LB培养基，然后将样品管置于37℃恒温摇床，220rpm/min，培养1h；
(4)涂板：取出步骤(3)中样品管，室温离心8,000rpm/min，2min，去掉600μL上清液体，剩余上清液重悬管底部的菌体，将重悬的菌液放入相应的转化平板中心，用涂菌棒将转化平板中心的菌液均匀铺开。
(5)将转化步骤(4)平板正置于生化恒温培养箱中，37℃培养1h后，将转化平板倒置进行培养15h；
(6)观察转化结果。
1.3.5质粒抽提与双酶切鉴定
1.3.5.1质粒抽提
(1)用10μL移液枪头从转化平板中挑取单克隆至5mL含氨苄抗性的LB液体培养基中，37℃，220rpm/min摇菌过夜；
(2)将菌液移至1.5mL EP管中，室温离心，12,000rpm/min，2min，弃上清；
(3)向步骤(2)的EP管中加入250μL质粒提取试剂P1 buffer，彻底悬浮菌体；
(4)向步骤(3)溶液中加入250μL P2 buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2-4min；
(5)向步骤(4)溶液中加入350μL P3 buffer，立即温和颠倒离心管5-10次混匀；室温静置2-4min；
(6)将步骤(5)溶液，室温离心，14,000rpm/min，10min；
(7)将步骤(6)中上清溶液移至吸附柱中心，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；
(8)向吸附柱中心加入500μL Buffer DW1，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体；
(9)向吸附柱中心加入500μL wash solution，室温离心，12,000rpm/min，30s，倒掉收集管中液体，重复一次；
(10)空吸附柱，室温离心，12,000rpm，2min。
(11)将吸附柱放入一个干净的1.5mL离心管中，向吸附膜中心加入30μL Elutionbuffer，室温静置5min，室温离心，12,000rpm，2min。保存管中DNA溶液。
1.3.5.2双酶切鉴定
(1)标记好需要用到的1.5mL EP管，按照下表进行加样：20μL反应体系
Figure BDA0002976884960000081
(2)将步骤(1)中的EP管20μL反应体系置于37℃恒温水浴锅中，水浴2h。
(3)将步骤(2)中的双酶切体系样品进行琼脂糖凝胶电泳，检查插入片段大小是否正确；
(4)选择插入片段正确的克隆送测序公司测序。将测序结果正确的质粒保存备用。
1.4非洲猪瘟EP153R蛋白表达
1.4.1转化大肠杆菌C43(DE3)
吸取1μL质粒(1.3.5.1中提取的质粒)加入100μL E.coli C43(DE3)感受态细胞中，冰浴30min；42℃热激90s；冰浴2min；在超净台内加入500μL无抗性的LB培养液；37℃220rpm摇1h；吸取100μL菌液涂卡那抗性LB平板，37℃过夜培养，挑取单克隆(E.coli C43(DE3)pET28a-ASFV-EP153R)并加入甘油于-80℃保存备用。
1.4.2小量诱导表达
(1)甘油管保藏管菌株活化：取E.coli C43(DE3)pET28a-ASFV-EP153R菌株甘油保藏管解冻，用接种环挑取甘油管中菌悬液于卡那霉素抗性平板(50μg/mL)上划线，37℃培养过夜。
(2)挑菌活化：于培养好的平板上挑取单克隆至3mL卡那抗性LB培养基中，37℃220r/min摇床培养5～6h，至OD600达到0.5～0.8；
(3)发酵接种：将活化好的菌悬液取150μL接种至15mL卡那抗性LB培养基中，37℃，220r/min培养；
(4)降温诱导：当OD 600达到0.6-0.8时，取出5mL菌液，12,000rpm离心5min，将菌体置于-20℃保存，即为“诱导前”。剩余菌液置于冰水浴10min，加入2μL 1M IPTG，终浓度0.2mM IPTG。将摇床温度降至20℃，诱导10h；
(5)菌体收集：发酵结束后，测量OD 600，收集与“诱导前”等量菌体，12,000r/min离心5min，收集菌体置于-20℃保存，即为“诱导后”。
诱导表达SDS-PAGE检测结果如图3所示，其中M是Marker，1是诱导前上清，2是诱导前沉淀，3是诱导后上清，4是诱导后沉淀，箭头指向为EP153R蛋白。从图中可以看出，目的蛋白为可溶性表达。
1.4.3大量诱导表达
(1)甘油管保藏管菌株活化：取菌株甘油保藏管解冻，用接种环挑取甘油管中菌悬液于卡那霉素抗性平板上划线，37℃培养过夜。
(2)挑菌活化：于培养好的平板上挑取单克隆至3mL卡那霉素抗性LB培养基中，37℃220r/min摇床培养5～6h，至OD600达到0.5～0.8；
(3)种子液培养：将活化好的菌悬液取150μL接种至150mL卡那霉素抗性LB培养基中，37℃220r/min培养9～10h；
(4)发酵培养基配制：按照发酵培养基配方配制发酵培养基组分1于3L发酵罐中，安装组联发酵罐，发酵培养基组分2及补料培养基配制于蓝口瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min。
(5)发酵参数设置：Agit 400r/min；Tempreture 37℃；pH 7.00；DO 40；Air100％；Gasflow 2.0；
(6)发酵接种：于接种口将450mL发酵培养基组分2，1mL发酵培养基组分3，200μL消泡剂，3mL卡那抗生素(50mg/mL)补加到发酵罐中；将培养好的150mL种子液接种至3L发酵培养基中进行发酵罐放大培养，培养5～6h至OD 600值到12～14；
(7)降温诱导：设置温度参数，将发酵罐温度降至20℃，取样，加入0.9mL IPTG(1M)至IPTG终浓度为0.3mM，20℃诱导培养8h；
(8)发酵补料：待发酵培养至OD600达到17～19时，按5％的速度连续补加补料培养基(先将补料培养基组分1和2混匀)。
(9)菌体收集：发酵结束后，收集发酵液在8000r/min离心10min，收集菌体置于-20℃保存。
其中，上述过程中所用培养基如下：
发酵培养基组分1:酵母粉10g/L，胰蛋白胨20g/L，KH2PO4 1.14g/L，K2HPO4 0.9g/L，(NH4)2SO4 3.0g/L，MgSO4·7H2O 0.3g/L，NaCl 5g/L，pH 7.0；(按3L的量称取培养基各组分，加dd H2O定容至2.4L)；
发酵培养基组分2：甘油30g/L；(按3L的量称取培养基各组分，加dd H2O定容至450mL)；
发酵培养基组分3：VB1 2mg/L；(配制6mg/mL的VB1 0.22μm过滤除菌)；
补料培养基组分1：酵母粉16.67g/L；胰蛋白胨33.33g/L；(按450mL的量称取培养基各组分，加dd H2O定容至300mL)；
补料培养基组分2：甘油100g/L；(按450mL的量称取培养基各组分，加dd H2O定容至150mL)。
1.5非洲猪瘟EP153R蛋白纯化
1.5.1菌体重悬及破碎
称取一定量的菌体，裂解液重悬后均质仪破碎，离心收集上清。上样前破菌的菌体上清和沉淀分别取样80μL用于SDS-PAGE分析。
1.5.2镍柱纯化
(1)柱平衡：用超纯水平衡2～3CV(column volume柱体积)，排出乙醇保存液；然后用BufferA平衡2～3CV。
(2)上样：将上清用蠕动泵进行上样，根据镍柱体积设定合适的流速，流穿并收集流穿液。混合后取80μL流穿液用于SDS-PAGE分析。
(3)Wash：用30倍柱体积(CV)wash buffer冲洗内毒素。
(4)冲洗：用10倍柱体积(CV)BufferA冲洗，减少Triton X-114的残留。
(5)洗脱：
20mM咪唑洗脱液(bufferA：bufferB＝24:1混合)洗杂：20mM咪唑洗脱液10倍柱体积洗脱杂蛋白，混合后取80μL用于SDS-PAGE分析；
50mM咪唑洗脱液(bufferA：bufferB＝9:1混合)洗杂：50mM咪唑洗脱液2倍柱体积进一步洗脱杂蛋白，混合后取80μL用于SDS-PAGE分析；
Buffer B洗脱目的蛋白：含500mM咪唑的bufferB洗脱目的蛋白并收集，混合后分别取80μL用于SDS-PAGE分析。
1.5.3透析换液
将含有EP153R蛋白的咪唑洗脱液Buffer B倒入透析袋内，用BufferA(磷酸盐溶液)透析至少1,000倍，取80μl留样检测。
1.5.4除菌过滤
在生物安全柜中，过0.22μm低蛋白结合针头滤器，或大量蛋白溶液过灭菌的0.22μm滤膜的Nalgene的滤器，过滤好的蛋白溶液样品存放于-80℃冰箱。
其中上述所用纯化溶液如下：
(1)裂解液：50mM NaH2PO4，500mM NaCl，0.2％Triton X-114，0.05％Tween 20，pH8.0；
(2)wash buffer：50mM NaH2PO4，500mM NaCl，0.4％Triton X-114，0.05％Tween20，pH 7.4；
(3)Buffer A：50mM NaH2PO4，500mM NaCl，0.05％Tween 20，pH 7.4；
(4)Buffer B：50mM NaH2PO4，500mM NaCl，500mM咪唑，0.05％Tween 20，pH 7.4。
1.6非洲猪瘟EP153R蛋白的鉴定
1.6.1 SDS-PAGE检测
将步骤1.5纯化后的蛋白进行SDS-PAGE检测，所用样品中EP153R蛋白浓度为1μg/孔，结果如图4所示：从图中可以计算出，纯化后的EP153R蛋白SDS-PAGE纯度为70％，分子量约为19.3kD。
1.6.2 WESTERN-BLOT检测
将步骤1.5纯化后的蛋白进行WESTERN-BLOT检测，转膜时间为1h，所用抗体为AntiHis-Tag Mouse，稀释比为1:2000，孵育时间为1h，结果如图5所示：从图中结果可以看出，纯化后的EP153R蛋白能与抗体发生有效结合。
1.7非洲猪瘟EP153R蛋白稳定性验证
将实施例1纯化后的蛋白用PBS稀释到0.9mg/ml，分成20份，每份0.5mL；十份置于4℃冰箱中，每周取样一份，连续取样10次；十份置于-20℃冰箱中，每周取样一份，连续取样10次；每次取样后用BCA检测蛋白浓度，结果如下表所示：
Figure BDA0002976884960000121
从蛋白浓度的变化来看，两组实验过程中蛋白基本保持稳定。
1.8重组EP153R蛋白免疫原性实验
1.8.1疫苗制备
1.8.1.1按油佐剂：水相(v:v)＝54:46的比例配比。
1.8.1.2抗原准备：将纯化后的重组非洲猪瘟EP153R蛋白经过0.22μm滤膜更除菌过滤，检测浓度及纯度，备用。
1.8.1.3水相配制：根据疫苗中EP153R蛋白的含量，用1XPBS将EP153R蛋白稀释至适当浓度，搅拌10min，使之充分混匀。
1.8.1.4油相准备：按照1.8.1.1的水油比例，量取适量ISA 201VG佐剂。
1.8.1.5乳化：乳化要求油相温度为33±1℃，开启搅拌器，搅拌转速为350rpm/min，在搅拌条件下将水相匀速加入至油相，并持续搅拌10min，使水相和油相充分混合，乳化成双向油乳剂疫苗。
1.8.1.6稳定：乳化结束后，关闭搅拌器，将乳化好的疫苗放入20℃稳定1h。
1.8.1.7分装、贮存：根据免疫需求进行分装，检验合格后于2-8℃进行保存备用。
1.8.2免疫原性实验
1.8.2.1小鼠免疫实验
取16-18g左右健康雌性BALB/c小鼠10只，随机分成2组，每组5只，用1.8.1中制备疫苗进行免一实验。分别于面前，二免后14天进行采血，分离血清进行ELISA检测抗体。
1.8.2.2 ELISA检测实验
(1)包被：用包被液(50mM碳酸盐缓冲液，pH 9.5)将纯化的EP153R蛋白稀释至0.2μg/ml，于96孔板加入100μl/孔，封口膜封好后4℃冰箱放置过夜；
(2)洗涤：从冰箱取出酶标板后，用PBST洗板5次；
(3)封闭：每孔加入200μl封闭液(5％脱脂奶)，封口膜封好后37℃孵育2h；
(4)血清稀释：将用EP153R蛋白免疫后的小鼠的免前血清、二免14天血清用封闭液稀释10000倍(稀释方式为分步稀释：①495μl稀释液中加入5μl血清；②取①中血清5μl加入495μl稀释液，混匀即可)；
(5)洗涤：同(2)；
(6)加样：加入稀释血清，同时用封闭液做阴性对照，37℃孵育1h；
(7)洗涤：同(2)；
(8)加二抗：每孔加入稀释(稀释比为1:5000)的HRP标记的兔抗鼠IgG二抗100μl，37℃孵育0.5h；
(9)洗涤：同(2)；
(10)显色：避光条件下每孔加入100μl的TMB显色液，37℃孵育10min；
(11)终止：每孔加入50μl终止液(2M H2SO4)，终止反应；
(12)检测：于450nm波长测定样品OD值，分析数据；
(13)结果如下表所示：包被的EP153R蛋白的能与EP153R蛋白免疫后血清特异性结合，OD450均值为2.202；包被EP153R蛋白与小鼠免前血清均没有特异性结合，OD450均值为0.365。这说明，EP153R蛋白可以作为Elisa试剂盒的抗原，且免疫后的血清能与EP153R蛋白特异性结合，为后期开发一种检测非洲猪瘟感染和免疫的诊断试剂盒及作为亚单位疫苗候选抗原奠定基础。
Figure BDA0002976884960000131
Figure BDA0002976884960000141
本发明通过上面的实施例进行举例说明，但是，应当理解，本发明并不限于这里所描述的特殊实例和实施方案。在这里包含这些特殊实例和实施方案的目的在于帮助本领域中的技术人员实践本发明。任何本领域中的技术人员很容易在不脱离本发明精神和范围的情况下进行进一步的改进和完善，因此本发明只受到本发明权利要求的内容和范围的限制，其意图涵盖所有包括在由附录权利要求所限定的本发明精神和范围内的备选方案和等同方案。
Figure BDA0002976884960000151
Figure BDA0002976884960000161
序列表
<110> 浙江海隆生物科技有限公司
<120>重组的非洲猪瘟病毒EP153R亚单位跨膜蛋白的原核可溶性表达方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 4
<211> 477
<212> DNA
<213> 密码子优化后的EP153R蛋白核苷酸序列(DNA)
<400> 4
atggcgttca gcaacaagaa gtacatcggt ctgatcaaca agaaagaggg cctgaagaaa 60
aagatcgacg attacagcat tctgatcatt ggtatcctga ttggcaccaa catcctgagc 120
ctgatcatca acatcatcgg tgaaatcaac aagccgattt gctaccagaa cgacgataaa 180
attttctatt gcccgaagga ctgggtgggt tacaacaacg tttgctacta ttttggcaac 240
gaggagaaga actacaacaa cgcgagcaac tattgcaagc aactgaacag caccctgacc 300
aacaacaaca ccatcctggt gaacctgacc aaaaccctga acctgaccaa gacctataac 360
cacgagagca actactgggt gaactatagc ctgatcaaga acgaaagcgt tctgctgcgt 420
gatagcggct actataaaaa gcagaaacac gttagcctgc tgtacatttg cagcaag 477
<210> 4
<211> 474
<212> DNA
<213> 密码子优化前的EP153R蛋白核苷酸序列(DNA)
<400> 4
atgttttcta acaaaaagta catcggtctt atcaataaga aggagggttt gaaaaaaaaa 60
atagatgatt atagtatatt aataattgga atattaattg gaactaacat cttaagcctt 120
attataaata taataggaga gattaataaa ccaatatgtt accaaaatga tgataagata 180
ttttattgcc ctaaagattg ggttggatat aataatgttt gttattattt tggcaatgaa 240
gaaaaaaatt ataataatgc aagtaattat tgtaagcaat taaatagtac gcttactaat 300
aataatacta ttttagtaaa tcttactaaa acattaaatc ttactaaaac atataatcac 360
gaatctaatt attgggttaa ttattcttta attaaaaatg agtcagtact attacgtgat 420
agtggatatt acaaaaaaca aaaacatgta agtttattat atatttgtag taaa 474
<210> 4
<211> 159
<212> PRT
<213> EP153R蛋白的氨基酸序列(PRT)
<400> 4
Met Ala Phe Ser Asn Lys Lys Tyr Ile Gly Leu Ile Asn Lys Lys Glu
1 5 10 15
Gly Leu Lys Lys Lys Ile Asp Asp Tyr Ser Ile Leu Ile Ile Gly Ile
20 25 30
Leu Ile Gly Thr Asn Ile Leu Ser Leu Ile Ile Asn Ile Ile Gly Glu
35 40 45
Ile Asn Lys Pro Ile Cys Tyr Gln Asn Asp Asp Lys Ile Phe Tyr Cys
50 55 60
Pro Lys Asp Trp Val Gly Tyr Asn Asn Val Cys Tyr Tyr Phe Gly Asn
65 70 75 80
Glu Glu Lys Asn Tyr Asn Asn Ala Ser Asn Tyr Cys Lys Gln Leu Asn
85 90 95
Ser Thr Leu Thr Asn Asn Asn Thr Ile Leu Val Asn Leu Thr Lys Thr
100 105 110
Leu Asn Leu Thr Lys Thr Tyr Asn His Glu Ser Asn Tyr Trp Val Asn
115 120 125
Tyr Ser Leu Ile Lys Asn Glu Ser Val Leu Leu Arg Asp Ser Gly Tyr
130 135 140
Tyr Lys Lys Gln Lys His Val Ser Leu Leu Tyr Ile Cys Ser Lys
145 150 155

Claims (10)

1.一种重组的非洲猪瘟病毒EP153R亚单位跨膜蛋白，其特征在于，所述重组的非洲猪瘟病毒EP153R亚单位跨膜蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，基因序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种重组的非洲猪瘟病毒EP153R亚单位跨膜蛋白的原核可溶性表达方法，其特征在于，所述原核可溶性表达方法包括如下步骤：
1)根据大肠杆菌密码子偏嗜性特征，人工优化并合成非洲猪瘟病毒EP153R蛋白编码基因，所述氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，基因序列如SEQ ID NO.1所示；
2)将密码子优化后的非洲猪瘟病毒EP153R蛋白的基因如SEQ ID NO.1所示的编码基因序列克隆到原核表达载体pET28a中，得到含有非洲猪瘟病毒EP153R亚单位蛋白编码基因的重组质粒；
3)EP153R亚单位跨膜蛋白表达与纯化：
将步骤2)中筛选的所述重组质粒转入大肠杆菌菌株中诱导表达，通过培养、筛选得到高度表达的菌株，发酵培养该高度表达的菌株，再进行裂解、离心，将离心收集的上清液加入到镍柱中进行分离纯化，最后加入咪唑洗脱液洗脱目的蛋白，以得到含有EP153R蛋白的咪唑洗脱液，再采用磷酸盐缓冲液置换该含有EP153R蛋白的咪唑洗脱液，以得到非洲猪瘟病毒EP153R亚单位可溶性融合蛋白。
3.如权利要求1所述的原核可溶性表达方法，其特征在于，步骤2)中，所述原核表达载体为pET28a。
4.根据权利要求1所述的原核可溶性表达方法，其特征在于，步骤3)中，所述大肠杆菌菌株选自C43(DE3)菌株、C41(DE3)菌株中的一种菌株。
5.如权利要求1所述的原核可溶性表达方法，其特征在于，步骤3)中，所述诱导表达采用IPTG作为诱导剂，所述诱导表达时诱导温度为20-25℃，诱导时间为8-12h。
6.权利要求1所述的原核可溶性表达方法，其特征在于，步骤3)中，所述咪唑洗脱液为bufferA和bufferB的混和液、bufferB；所述咪唑洗脱液的浓度为20mM、50mM、500mM。
7.权利要求6所述的原核可溶性表达方法，其特征在于，步骤3)中，所述咪唑洗脱液为bufferA：bufferB＝24:1的混合、bufferA：bufferB＝9:1的混合、含500mM咪唑的bufferB。
8.权利要求6或7所述的原核可溶性表达方法，其特征在于，步骤3)中，Buffer A为50mMNaH2PO4，500mM NaCl，0.05％Tween 20，pH 7.4；Buffer B为50mM NaH2PO4，500mM NaCl，500mM咪唑，0.05％Tween 20，pH 7.4。
9.权利要求1所述的原核可溶性表达方法，其特征在于，步骤3)中，所述磷酸盐缓冲液为50mM NaH2PO4，500mM NaCl，0.05％Tween 20，pH 7.4。
10.一种如权利要求1～9任一所述的非洲猪瘟病毒EP153R亚单位可溶性融合蛋白在制备诊断、预防和治疗非洲猪瘟的疫苗中的应用。
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