CN112175086A

CN112175086A - 一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体及应用

Info

Publication number: CN112175086A
Application number: CN202011090940.6A
Authority: CN
Inventors: 丁珍; 唐玉新; 陈君; 彭琪; 吴琼; 宋德平; 叶昱; 黄冬艳
Original assignee: Jiangxi Agricultural University
Current assignee: Jiangxi Agricultural University
Priority date: 2020-10-13
Filing date: 2020-10-13
Publication date: 2021-01-05
Anticipated expiration: 2040-10-13
Also published as: CN112175086B

Abstract

本发明涉及生物工程技术领域，具体公开了一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体及制备方法与应用。所述抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体为杂交瘤细胞株5A9分泌的单克隆抗体；所述的杂交瘤细胞株5A9由猪流行性腹泻病毒nsp13重组蛋白免疫原多次免疫小鼠而得到；所述的杂交瘤细胞株5A9于2020年09月01日保藏于中国典型培养物保藏中心，细胞株保藏编号为CCTCC NO:C2020148；所述免疫原，由重组表达载体转化入E.coli BL21感受态中进行诱导表达而得到；所述的重组表达载体包含一对扩增nsp13基因全长的引物，所述nsp13基因的核苷酸序列组成如SEQ ID NO.2所示。本发明所提供的抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体，可制备成猪流行性腹泻病毒nsp13的WesternBlot检测试剂等。

Description

一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体及应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体及制备方法与应用。

背景技术

猪流行性腹泻于1971年首次在英国报道并将其病原体命名为“猪流行性腹泻病毒”，中国在1976第一次报道了此病。猪流行性腹泻是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一种急性、高度接触性猪肠道传染病，以水样腹泻、呕吐和脱水为主要症状，各年龄阶段的猪均易感。哺乳仔猪、断奶仔猪和育肥猪的发病率可达100％，成年母猪发病率约为15％-20％，哺乳仔猪群受害最为严重，病死率平均50％左右。猪流行性腹泻病毒属于冠状病毒，基因组全长约为28kb，为有囊膜、不分节段的单股正链RNA病毒，PEDV病毒全基因组从5’-3’基因结构依次为5’端非编码区(Untranslatedregion， UTR)、16个非结构蛋白(nonstructural protein，nsp)、纤突(Spike，S) 蛋白、开放性阅读框(Open reading frame，ORF)3、小膜(Envelope,E)蛋白、膜(Membrane,M)蛋白、核衣壳(Nucleocapsid,N)蛋白、3’端非编码区(Untranslated region，UTR)。基因组编码两个复制酶多聚蛋白，ORF1a编码多聚蛋白1a(PP1a)，ORF1b编码多聚蛋白1ab(PP1ab)。在病毒自身编码的蛋白水解酶的作用下，复制酶多聚蛋白PP1a和PP1ab裂解产生了16个功能性成熟的nsp，分别是nsp1-nsp16，这些非结构蛋白主要是在病毒的侵染和复制的过程当中表达，在调节病毒基因组RNA的复制和亚基因组RNA的转录方面发挥了重要作用。nsp13是核酸解旋酶，是解旋酶超家族I的成员之一。解旋酶具有解开RNA 和DNA双螺旋的特性，能够水解NTP释放能量。nsp13作为冠状病毒保守蛋白，也是最具有潜力作为靶标设计抗病毒药物，但对PEDV nsp13在病毒感染时结构与功能的研究尚未见到相关报道，因为目前缺乏抗nsp13检测抗体。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：针对现有目前无猪流行性腹泻病毒nsp13功能研究的公开与应用的相关报道等不足，提供一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体及其制备方法与应用。本发明所提供的抗猪流行性腹泻病毒 nsp13单克隆抗体，该抗体可运用于PEDV感染情况下Western Blot检测nsp13。

本发明采用如下技术方案，来实现发明目的。

首先，本发明公开了一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体。所述的一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体为杂交瘤细胞株5A9所分泌；所述的杂交瘤细胞株5A9由猪流行性腹泻病毒重组nsp13蛋白免疫原多次免疫小鼠而得到；所述的杂交瘤细胞株5A9于2020年09月01日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌株保藏编号为CCTCC NO:C2020148。

进一步地，所述的猪流行性腹泻病毒重组nsp13蛋白免疫原，由重组表达载体转化入E.coli BL21感受态中进行诱导表达而得到；所述重组nsp13蛋白免疫原的氨基酸序列组成如SEQ ID NO.1所示。

更进一步地，所述的重组表达载体，包含一对扩增nsp13基因全长的引物；所述nsp13基因全长为1791bp，其核苷酸序列组成如SEQ ID NO.2所示。

更进一步地，所述引物包含上游引物nsp13-F和下游引物nsp13-R；所述 nsp13-F序列为5’-TTTCTCGAGtctgcagggctttgtgttgt-3',酶切位点为Xho I；所述nsp13-R序列为5’-CCGGAATTCttactgcaaatcagac-3，酶切位点为EcoR I。

其次，本发明公开了上述抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体的一种制备方法。

该制备方法包含以下制备步骤：

S1、构建重组表达载体：设计引物，扩增得到nsp13目的基因，将其克隆到 pET-28a原核载体上，得到重组表达载体pET-28a-nsp13；

S2、获得免疫原：将上述S1步骤得到的pET-28a-nsp13重组表达载体，转入E.coliBL21感受态中进行诱导表达，得到猪流行性腹泻病毒重组nsp13包涵体蛋白，再经SKL溶解透析复性得到可溶性重组蛋白nsp13，作为后续单克隆抗体制备的免疫原；

S3、获得单克隆杂交瘤细胞株：将所述S2步骤得到的的免疫原多次免疫小鼠，取免疫的小鼠脾脏细胞，与SP2/0瘤细胞融合，筛选获得分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞株；

S4、得到单克隆抗体：将所述S3步骤得到的单克隆杂交瘤细胞注入小鼠腹腔，小鼠腹部胀大后，采集腹水，即得抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体。

进一步地，S1步骤中所述的引物设计为：根据猪流行性腹泻病毒 CH/JX/01/P30株核苷酸序列信息，设计一对扩增nsp13基因全长的引物；S1步骤中所述的扩增为：对猪流行性腹泻病毒CH/JX/01/P30株，提取病毒基因组RNA，反转录合成cDNA，用引物nsp13-F,nsp13-R扩增全长nsp13基因。

进一步地，S2步骤中所述的诱导表达为：将扩增后的全长nsp13基因克隆到pET-28a原核和pCAGGS-HA真核表达载体上，经酶切与测序鉴定，命名为 pET-28a-nsp13和pCAGGS-HA-nsp13；将pET-28a-nsp13质粒转入E.coli BL21 感受态细胞中，得到重组nsp13包涵体蛋白；S2步骤中所述的SKL为十二烷基肌氨酸钠；所述的SKL溶解透析复性为：对重组nsp13包涵体蛋白，使用SKL溶解该包涵体后，经过透析复性获得可溶性重组蛋白nsp13。

进一步地，S3步骤中所述的用免疫原多次免疫小鼠为：将纯化后的重组蛋白nsp13作为免疫原，四次免疫6周龄雌性BABL/c小鼠；所述的与SP2/0瘤细胞融合为：采用有限稀释法将单克隆杂交瘤细胞经3次亚克隆，选取分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞；所述的杂交瘤细胞为杂交瘤细胞株5A9。

更进一步地，所述的四次免疫为：首次免疫使用完全弗氏佐剂，二、三、四次免疫选用不完全弗氏佐剂。

进一步地，S4步骤中所述的注入小鼠腹腔-采集腹水为：将S3步骤得到的能分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞，按每只小鼠10⁶个细胞，注入8周龄 BABL/c小鼠的腹腔进行免疫，7天后采取小鼠腹水，获得单克隆抗体。

最后，本发明公开了上述抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体的一种应用。

上述抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体，为探讨nsp13的功能奠定了基础，对研究猪流行性腹泻病毒的发病机制提供了帮助；可将该抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体，用于制备猪流行性腹泻病毒nsp13的Western Blot检测试剂。

有益效果：

(1)本发明所公开的一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体及其制备方法与应用，填补了目前在抗猪流行性腹泻病毒nsp13抗体方面的空白。

(2)本发明所提供的抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体，为探讨nsp13的功能奠定了基础，对研究猪流行性腹泻病毒的发病机制提供了帮助；可将该抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体，用于制备猪流行性腹泻病毒nsp13的Western Blot检测试剂。

(3)本发明所公开的一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白单克隆抗体的制备方法，工艺简单、方法方法、条件温和，适合于批量制备抗猪流行性腹泻病毒 nsp13蛋白单克隆抗体。

附图说明

图1是本发明实施例1的PEDV nsp13基因PCR扩增(1A)及构建原核表达载体后PCR(1B)鉴定结果图，其中M为蛋白质分子量标准；

图2是本发明实施例1纯化的nsp13蛋白表达产物SDS-PAGE(2A)和重组 nsp13蛋白纯化的SDS-PAGE(2B)结果图；

图3是本发明实施例3抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白单克隆抗体的腹水(m Ab)和BABL/c小鼠第四次免疫血清以及BABL/c小鼠阴性血清的ELISA效价鉴定结果图；

图4是本发明实施例4抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白单克隆抗体Western Blot分析结果图；

图5是本发明实施例4抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白单克隆抗体IFA结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法。所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。

在下列实施例中，如未注明具体实验方法，则通常按照常规条件中所述的方法进行。如《精编分子生物学实验指南》(F.M.奥斯伯,R.E.金斯顿,J.G. 赛德曼等主编，马学军，舒跃龙的译。北京：科学出版社，2004)。

为了研究猪流行性腹泻病毒(PEDV)nsp13的功能，本发明公开并研制了与猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白具有反应性的单克隆抗体。具体通过如下过程获得特异性的单克隆抗体：

(1)、根据猪流行性腹泻病毒CH/JX/01/P30株核苷酸序列信息，设计一对扩增nsp13基因全长的引物。提取病毒基因组RNA，反转录合成cDNA，用引物 nsp13-F,nsp13-R扩增全长nsp13基因，将其克隆到pET-28a与pCAGGS-HA原核和真核表达载体上，经酶切、测序鉴定正确后。将pET-28a-nsp13转入E.coli BL21感受态细胞中，利用IPTG诱导表达重组nsp13蛋白。获得重组nsp13包涵体蛋白，使用SKL溶解该包涵体后经过透析复性获得可溶性重组蛋白nsp13，作为制备后续单克隆抗体的免疫原。

(2)、将纯化后重组nsp13蛋白作为免疫原，免疫6周龄雌性BABL/c小鼠。首次免疫使用完全弗氏佐剂，二、三、四次免疫选用不完全弗氏佐剂，重组nsp13 蛋白与弗氏佐剂1:1比例混合，首次免疫蛋白量加倍。融合前3d，腹腔注射纯抗原加强免疫。取免疫后的小鼠脾脏细胞，与SP2/0瘤细胞按3:1的比例融合，筛选阳性杂交瘤细胞，采用有限稀释法经3次亚克隆选取分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞，按10⁶个细胞/只免疫8周龄BABL/c小鼠，7天后采集小鼠腹水，获得单克隆抗体。

实施例1：重组表达猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白：

根据猪流行性腹泻病毒CH/JX/01/P30株核苷酸序列信息，设计一对扩增 nsp13基因的引物，该引物由擎科生物工程股份有限公司合成。上游引物序列为： nsp13-F:5'-TTTCTCGAGtctgcagggctttgtgttgt-3'，酶切位点为XhoⅠ；下游引物序列为nsp13-R:5'-CCGGAATTCttactgcaaatcagac-3'，酶切位点为EcoRⅠ。扩增得到的nsp13目的基因全长为1791bp，所述nsp13基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。提取病毒基因组RNA，反转录合成cDNA，用引物nsp13-F，nsp13-R 扩增全长nsp13基因，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测鉴定回收，通过PCR扩增出大小约1791bp的nsp13基因，与预期结果相符(图1A)。载体pET-28a DNA 与PCR产物用XhoI、EcoRⅠ酶切后使用T4连接酶连接3h后转化E.coli BL21 感受态细胞中，均匀涂布于含卡那霉素抗性固体琼脂平板上，37℃培养16h挑取单个菌落摇菌，PCR鉴定重组表达质粒是否正确，PCR鉴定结果如图1B所示，扩增出了大小约1791bp的nsp13基因。将PCR鉴定正确的质粒送擎科生物工程股份有限公司进行测序鉴定。测序结果表明载体构建成功。经测序鉴定正确的阳性表达载体质粒命名为pET-28a-nsp13。

原核表达、纯化重组猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白程序如下：

将鉴定为阳性的pET-28a-nsp13 E.coli BL21细菌接种LB液体培养基，接种比例1:100，经37□C振荡摇菌至菌液OD值达到0.8后，加入IPTG至终浓度为0.6mM，37℃继续诱导6h。离心收集菌液并用PBS清洗2遍后，加入溶菌酶与破菌缓冲液重悬后，超声至菌液澄清，离心弃上清后将沉淀洗涤2-3次。沉淀中加入SKL剧烈搅动后置于4℃过夜缓慢溶解。将溶解完的蛋白进行离心后取上清加入20％PGE4000 210ul至终浓度为0.2％，50mM(0.03g/mL)的氧化型谷胱甘肽420ul至终浓度为1mM，100mM(0.03g/mL)的还原型谷胱甘肽420ul 至终浓度为2mM，混合均匀，4℃复性过夜，复性完离心后上清于透析液中透析三天获得蛋白。SDS-PAGE结果显示，原核表达纯化的重组蛋白约71kDa，与预期蛋白大小相符(图2B)。图2中，图2A为pET-28a原核表达载体表达猪流行性腹泻病毒重组nsp13蛋白的SDS-PAGE电泳结果图。其中泳道1为含有 pET-28a-nsp13重组表达载体的菌液经IPTG诱导表达的结果；泳道2为含有 pET-28a-nsp13重组表达载体的菌液未加IPTG诱导的结果；泳道3为含有 pET-28a表达载体的菌液经IPTG诱导表达的结果。图2B为表达的重组nsp13包涵体蛋白经过溶解复性得到的nsp13重组蛋白的SDS-PAGE电泳结果图。nsp13 蛋白的氨基酸序列组成如SEQ ID NO.1所示。

实施例2：抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白单克隆抗体的制备：

如实施例1中纯化制备的重组猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白作为免疫原，免疫小鼠，用于制备单克隆抗体。选择6周龄BABL/c雌性小鼠，免疫重组nsp13 蛋白。首次免疫以重组nsp13蛋白作为免疫原，与弗氏完全佐剂1:1比例混合后，按200μg/只(200μl/只)的抗原量皮下注射。两周后，以100μg/只的剂量再经皮下注射，用弗氏不完全佐剂处理同一抗原，每隔两周重复免疫一次，一共免疫三次。每次免疫前，眼眶采血，ELISA鉴定抗体效价。融合前3-4d，腹腔注射纯抗原加强免疫。取小鼠脾脏与SP2/0细胞融合，进行单克隆抗体制备。融合两周后，间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞，具体方法如下:

(1)、包被：重组nsp13蛋白包被ELISA酶标板，包被量为7.5μg/mL,4℃包被过夜。

(2)、洗涤：用含有0.05％tween-20的PBST洗涤3次，300μL/孔，每次3分钟。

(3)、封闭：5％脱脂奶粉37℃孵育2小时，300μL/孔。

(4)、洗涤:用含有0.05％Tween-20的PBST洗涤3次，300μL/孔，每次3分钟。

(5)、加细胞培养上清液：细胞培养上清分别加入包被重组nsp13蛋白的酶标板中，每孔培养上清液100μL，37℃培养箱作用1小时。

(6)、洗涤：用含有0.05％Tween-20的PBST洗涤3次，300μL/孔。每次3分钟。

(7)、加入二抗：按1:2500倍稀释HRP羊抗鼠IgG后，每孔100μL加入酶标板中，37℃孵育1小时。

(8)、洗涤：用含有0.05％Tween-20的PBST洗涤5次，300μL/孔, 每次3分钟。

(9)、显色：每孔加入100μL TMB显色液，避光室温孵育15分钟。

(10)、终止：每孔加入100μL 2M H₂S0₄。

(11)、OD值检测：酶标仪测定OD450值。

经过猪流行性腹泻病毒重组nsp13蛋白ELISA筛选后，选取重组nsp13蛋白反应阳性的克隆，扩大培养后进行3次亚克隆，每次亚克隆后均进行ELISA筛选鉴定阳性克隆。3次亚克隆后，获得3株稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株。最后优选其中一株杂交瘤细胞株5A9于2020年09月01保藏于中国经典培养物保藏中心，细胞株保藏编号为CCTCC NO:C2020148。其分类命名为杂交瘤细胞株5A9。筛选的阳性杂交瘤细胞经扩大培养，用于单克隆抗体腹水制备。

单克隆抗体腹水制备，具体步骤如下:选取8周龄BABL/c雌性小鼠，腹腔注射石蜡油，200μL/只。免疫石蜡油一周后，阳性杂交瘤细胞计数，生理盐水重悬，10⁶/只接种小鼠腹腔。一周后观察小鼠腹部变化，若出现腹部胀大，即进行腹水采集，采集腹水4,000rpm离心l0min，上清分装-80℃保存。

实施例3：抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白单克隆抗体腹水和BABL/c小鼠第四次免疫血清以及BABL/c小鼠阴性血清的ELISA效价鉴定：

如实施例2中制备的腹水以及融合前采集的阳性血清和阴性血清，分别作为一抗，间接ELISA方法检测其效价，具体方法如下：

(3)、封闭：5％脱脂奶粉37℃孵育2小时，300μL/孔。

(4)、洗涤：用含有0.05％Tween-20的PBST洗涤3次，300μL/孔。每次3分钟。

(5)、加入一抗：腹水、阳性血清和阴性血清分别按照倍比稀释方法以1： 100，1：200，1：400，1：800，1：1600，1：3200，1：6400，1：12800，1： 25600，1：51200，1：102400，1：204800的比例稀释后，分别加入包被好的ELISA 中，每孔100μL，37℃培养箱作用1小时。

(7)、加入二抗：按1:2500倍稀释HRP羊抗鼠IgG后，每孔100μL加入酶标板，37℃孵育1小时。

(8)、洗涤：用含有0.05％Tween-20的PBST洗涤5次，300μL/孔。每次3分钟。

(9)、显色：每孔加入100μL TMB显色液，避光室温孵育15分钟。

(10)、终止：每孔加入100μL 2M H₂S0₄。

(11)、OD值检测：酶标仪测定OD450值。

结果如图3所示，腹水、阳性血清、阴性血清分别以1：100，1：200，1： 400，1：800，1：1600，1：3200，1：6400，1：12800，1：25600，1：51200， 1：102400，1：204800的比例稀释后，OD450结果显示阳性血清与腹水的效价均大于1：204800。

实施例4：抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白单克隆抗体的Western Blot检测应用以及间接免疫荧光法特异性鉴定：

如实施例2中制备的腹水，作为一抗，分别用Western Blot和间接免疫荧光法(IFA)检测腹水的特异反应性。

Western Blot具体步骤如下：6孔细胞培养板中铺满HEK 293T细胞， pCAGGS-HA-nsp13与pCAGGS-HA空载体分别转染至HEK 293T细胞，转染28h后的HEK 293T细胞；以及感染1MOI PEDV的VERO 81细胞进行收取。在细胞中加入细胞裂解与蛋白上样液后煮沸10分钟。等量总蛋白上样进行SDS-PAGE电泳，电泳完毕后，采用伯乐转膜仪，电压15V，湿转印16h，将蛋白转印至PVDF膜上。转印完毕后进行后续实验具体操作如下:

(1)、封闭：用5％脱脂奶粉37℃封闭PVDF膜2小时。

(2)、洗涤：用含有0.05％Tween-20的TBST洗涤PVDF膜3次，每次10 分钟。

(3)、加入一抗：实施例2中制备的腹水，用PBS缓冲溶液按照1:1000的比例稀释一抗，室温孵育4小时。

(4)、洗涤：用含有0.05％Tween-20的TBST洗涤PVDF膜3次，每次10 分钟。

(5)、加入二抗：HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体，用PBS按1:2500倍稀释后加入，室温孵育1小时。

(6)、洗涤：用含有0.05％Tween-20的TBST洗涤PVDF膜3次，每次10 分钟。

(7)、显影:采用ECL发光试剂盒进行曝光显影。

IFA的具体步骤如下：

(1)、细胞准备：6孔细胞培养板中铺满HEK 293T细胞，pCAGGS-HA-nsp13 与pCAGGS-HA空载体分别转染至HEK 293T细胞，转染28h后，用冰甲醛于常温固定30min。；

(2)、洗涤：用PBS洗涤3次，每次5分钟。

(3)、透化：用置于-20℃冰甲醇于常温孵育15分钟。

(4)、洗涤：用PBS洗涤3次，每次5分钟。

(5)、封闭：含有10％BSA的PBS缓冲溶液37℃孵育1小时；

(6)、洗涤：用PBS洗涤3次，每次5分钟。

(7)、加入一抗：实施例2中制备的腹水，用PBS缓冲溶液按照1:300的比例稀释一抗，37℃孵育1小时。

(8)、洗涤：用PBS洗涤3次，每次5分钟。

(9)、加入二抗：FITC羊抗鼠IgG，用PBS按1:300倍稀释后加入六孔板，避光37℃孵育1小时。

(10)、洗涤：用PBS洗涤3次，每次5分钟.

(11)、荧光显微镜观察。

Western Blot如图4所示，图4中，4A中表示例2中产生的抗猪流行性腹泻病毒nsp13单克隆抗体对感染PEDV的Vero 81细胞进行Western Blot结果， 1表示抗猪流行性腹泻病毒nsp13单克隆抗体对vero 81细胞进行Western Blot 结果，2表示抗猪流行性腹泻病毒nsp13单克隆抗体对感染了PEDV的vero 81 细胞进行Western Blot结果。4B中表示例2中产生的抗猪流行性腹泻病毒nsp13 单克隆抗体对收取的重组pCAGGS-HA-nsp13真核表达蛋白进行Western Blot结果，1表示抗猪流行性腹泻病毒nsp13单克隆抗体对转染了pCAGGS-HA真核表达质粒的HEK 293T细胞进行Western Blot结果，2表示抗猪流行性腹泻病毒nsp13单克隆抗体对转染了pCAGGS-HA-nsp13真核表达质粒的HEK 293T细胞进行 Western Blot结果。

IFA结果如图5所示，图5中1为抗猪流行性腹泻病毒nsp13单克隆抗体对转染了pCAGGS-HA-nsp13真核表达质粒的HEK 293T细胞进行间接免疫荧光染色的结果，图中显示细胞包浆及包膜呈闪亮绿色荧光反应；2中为抗猪流行性腹泻病毒nsp13单克隆抗体对转染了pCAGGS-HA真核表达质粒的HEK 293T细胞进行间接免疫荧光染色的结果，图中显示细胞未见有亮绿色荧光反应。

由于以上实验结果可知，本发明的抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白单克隆抗体的特异性很好，可用于对该蛋白进行进一步的功能研究。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都涵盖在本发明范围内。

序列表

<110> 江西农业大学

<120> 一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体及应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 597

<212> PRT

<213> 重组nsp13蛋白免疫原(nsp13)

<400> 1

Ser Ala Gly Leu Cys Val Val Cys Gly Ser Gln Thr Val Leu Arg Cys

1 5 10 15

Gly Asp Cys Leu Arg Arg Pro Met Leu Cys Thr Lys Cys Ala Tyr Asp

20 25 30

His Val Ile Gly Thr Thr His Lys Phe Ile Leu Ala Ile Thr Pro Tyr

35 40 45

Val Cys Cys Ala Ser Asp Cys Gly Val Asn Asp Val Thr Lys Leu Tyr

50 55 60

Leu Gly Gly Leu Ser Tyr Trp Cys His Glu His Lys Pro Leu Leu Ala

65 70 75 80

Phe Pro Leu Cys Ser Ala Gly Asn Val Phe Gly Leu Tyr Lys Asn Ser

85 90 95

Ala Thr Gly Ser Pro Asp Val Glu Asp Phe Asn Arg Ile Ala Thr Ser

100 105 110

Asp Trp Thr Asp Val Ser Asp Tyr Arg Leu Ala Asn Asp Val Lys Asp

115 120 125

Ser Leu Arg Leu Phe Ala Ala Glu Thr Ile Lys Ala Lys Glu Glu Ser

130 135 140

Val Lys Ser Ser Tyr Ala Cys Ala Thr Leu His Glu Val Val Gly Pro

145 150 155 160

Lys Glu Leu Leu Leu Lys Trp Glu Val Gly Arg Pro Lys Pro Pro Leu

165 170 175

Asn Arg Asn Ser Val Phe Thr Cys Tyr His Ile Thr Lys Asn Thr Lys

180 185 190

Phe Gln Ile Gly Glu Phe Val Phe Glu Lys Ala Glu Tyr Asp Asn Asp

195 200 205

Ala Val Thr Tyr Lys Thr Thr Ala Thr Thr Lys Leu Val Pro Gly Met

210 215 220

Val Phe Val Leu Thr Ser His Asn Val Gln Pro Leu Arg Ala Pro Thr

225 230 235 240

Ile Ala Asn Gln Glu Arg Tyr Ser Thr Ile His Lys Leu His Pro Ala

245 250 255

Phe Asn Ile Pro Glu Ala Tyr Ser Ser Leu Val Pro Tyr Tyr Gln Leu

260 265 270

Ile Gly Lys Gln Lys Ile Thr Thr Ile Gln Gly Pro Pro Gly Ser Gly

275 280 285

Lys Ser His Cys Val Ile Gly Leu Gly Leu Tyr Tyr Pro Gly Ala Arg

290 295 300

Ile Val Phe Thr Ala Cys Ser His Ala Ala Val Asp Ser Leu Cys Val

305 310 315 320

Lys Ala Ser Thr Ala Tyr Ser Asn Asp Lys Cys Ser Arg Ile Ile Pro

325 330 335

Gln Arg Ala Arg Val Glu Cys Tyr Asp Gly Phe Lys Ser Asn Asn Thr

340 345 350

Ser Ala Gln Tyr Leu Phe Ser Thr Val Asn Ala Leu Pro Glu Cys Asn

355 360 365

Ala Asp Ile Val Val Val Asp Glu Val Ser Met Cys Thr Asn Tyr Asp

370 375 380

Leu Ser Val Ile Asn Gln Arg Ile Ser Tyr Arg His Val Val Tyr Val

385 390 395 400

Gly Asp Pro Gln Gln Leu Pro Ala Pro Arg Val Met Ile Ser Arg Gly

405 410 415

Thr Leu Glu Pro Lys Asp Tyr Asn Val Val Thr Gln Arg Met Cys Ala

420 425 430

Leu Lys Pro Asp Val Phe Leu His Lys Cys Tyr Arg Cys Pro Ala Glu

435 440 445

Ile Val Arg Thr Val Ser Glu Met Val Tyr Glu Asn Gln Phe Ile Pro

450 455 460

Val His Pro Asp Ser Lys Gln Cys Phe Lys Ile Phe Cys Lys Gly Asn

465 470 475 480

Val Gln Val Asp Asn Gly Ser Ser Ile Asn Arg Arg Gln Leu Asp Val

485 490 495

Val Arg Met Phe Leu Ala Lys Asn Pro Arg Trp Ser Lys Ala Val Phe

500 505 510

Ile Ser Pro Tyr Asn Ser Gln Asn Tyr Val Ala Ser Arg Met Leu Gly

515 520 525

Leu Gln Ile Gln Thr Val Asp Ser Ser Gln Gly Ser Glu Tyr Asp Tyr

530 535 540

Val Ile Tyr Thr Gln Thr Ser Asp Thr Ala His Ala Cys Asn Val Asn

545 550 555 560

Arg Phe Asn Val Ala Ile Thr Arg Ala Lys Lys Gly Ile Leu Cys Ile

565 570 575

Met Cys Asp Arg Ser Leu Phe Asp Val Leu Lys Phe Phe Glu Leu Lys

580 585 590

Leu Ser Asp Leu Gln

595

<210> 2

<211> 1791

<212> DNA

<213> nsp13

<400> 2

tctgcagggc tttgtgttgt ttgtggctct caaactgttt tacgttgtgg tgattgtcta 60

cggcgtccta tgctttgtac taagtgtgct tatgatcatg tcattggaac aactcacaag 120

ttcattttgg ctatcactcc atatgtgtgt tgtgcttcag attgtggtgt caatgatgta 180

actaagctct acttaggtgg tcttagttat tggtgtcatg aacacaagcc acttcttgca 240

ttcccgttgt gttctgctgg taatgttttt ggtttgtaca aaaattctgc taccggctca 300

cccgacgttg aggactttaa tcgcattgct acatccgatt ggactgatgt ttctgactac 360

aggttggcaa atgatgtcaa ggactcattg cgtctatttg cagcggaaac tatcaaggcc 420

aaggaggaga gcgttaagtc atcctacgct tgtgcaacat tacatgaggt tgtaggacct 480

aaagagttgt tgctcaaatg ggaagtcggc agacccaaac cacctcttaa tagaaattcg 540

gttttcactt gttatcatat aacgaagaac accaaatttc aaatcggtga gtttgtgttt 600

gagaaggcag aatatgataa tgatgctgta acatataaaa ctaccgccac aacaaaactt 660

gttcctggca tggtttttgt gcttacctca cataatgttc agccattgcg cgcaccgacc 720

attgctaatc aagaacgtta ttccactata cataagttgc atcctgcttt taacatacct 780

gaagcttatt ctagcttagt gccctattac caactgattg gtaagcagaa gattacaact 840

atccagggac ctcccggtag tggtaaatct cactgtgtta tagggctagg tttgtactat 900

ccaggtgcac gtatagtgtt tacagcttgt tctcatgcag cggtcgattc actttgtgtg 960

aaagcctcca ctgcttatag caatgacaaa tgttcacgca tcataccaca gcgtgctcgt 1020

gttgagtgtt atgacggttt caagtctaat aatactagtg ctcagtacct tttctccact 1080

gtcaatgctt tgccagagtg caatgcggac attgttgtgg tggatgaggt ctctatgtgc 1140

actaattatg acttgtctgt cataaatcag cgcatcagct ataggcatgt agtctatgtt 1200

ggtgaccctc aacagctgcc tgcaccacgt gttatgattt cacgtggtac tttggaacca 1260

aaggactaca acgttgtcac tcaacgcatg tgtgccctta agcctgatgt tttcttgcac 1320

aagtgttatc gctgtcctgc tgagatagtg cgtactgtgt ctgagatggt ctatgaaaac 1380

caattcattc ctgtgcaccc agatagcaag cagtgtttta aaatcttttg caagggtaat 1440

gttcaggttg ataatggttc aagcattaat cgcaggcaat tggatgttgt gcgtatgttt 1500

ttggctaaaa atcctaggtg gtcaaaggct gtttttattt ctccttataa cagccagaat 1560

tatgttgcca gccgtatgct aggtttacaa attcagacag ttgactcatc ccagggtagt 1620

gagtatgact atgtcattta cacacaaact tcagatactg cccatgcctg taatgttaac 1680

aggtttaatg ttgccatcac aagggctaag aaaggcatat tatgtataat gtgcgatagg 1740

tccctttttg atgtgcttaa attctttgag cttaaattgt ctgatttgca g 1791

<210> 3

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttctcgagt ctgcagggct ttgtgttgt 29

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ccggaattct tactgcaaat cagac 25

Claims

1.一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述的单克隆抗体为杂交瘤细胞株5A9所分泌；所述的杂交瘤细胞株5A9由猪流行性腹泻病毒重组nsp13蛋白免疫原多次免疫小鼠而得到；所述的杂交瘤细胞株5A9于2020年09月01日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌株保藏编号为CCTCC NO:C2020148。

2.根据权利要求1所述的一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述的猪流行性腹泻病毒重组nsp13蛋白免疫原，由重组表达载体转化入E.coli BL21感受态中进行诱导表达而得到；所述重组nsp13蛋白免疫原的氨基酸序列组成如SEQ IDNO.1所示。

3.根据权利要求2所述的一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述的重组表达载体，包含一对扩增nsp13基因全长的引物；所述nsp13基因全长为1791bp，其核苷酸序列组成如SEQ ID NO.2所示。

4.根据权利要求3所述的一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体，其特征在于：所述引物包含上游引物nsp13-F和下游引物nsp13-R；所述nsp13-F序列为5’-TTTCTCGAGtctgcagggctttgtgttgt-3',酶切位点为Xho I；所述nsp13-R序列为5’-CCGGAATTCttactgcaaatcagac-3'，酶切位点为EcoR I。

5.根据权利要求1-4任一所述的一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体的制备，其特征在于，包含以下制备步骤：

S1、构建重组表达载体：设计引物，扩增得到nsp13目的基因，将其克隆到pET-28a原核载体上，得到重组表达载体pET-28a-nsp13；

S2、获得免疫原：将上述S1步骤得到的pET-28a-nsp13重组表达载体，转入E.coli BL21感受态中进行诱导表达，得到猪流行性腹泻病毒重组nsp13包涵体蛋白，再经SKL溶解透析复性得到可溶性重组蛋白nsp13，作为后续单克隆抗体的免疫原；

6.根据权利要求5所述的一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体的制备，其特征在于，S1步骤中所述的引物设计为：根据猪流行性腹泻病毒CH/JX/01/P30株核苷酸序列信息，设计一对扩增nsp13基因全长的引物；S1步骤中所述的扩增为：对猪流行性腹泻病毒CH/JX/01/P30株，提取病毒基因组RNA，反转录合成cDNA，用引物nsp13-F,nsp13-R扩增全长nsp13基因。

7.根据权利要求5所述的一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体的制备，其特征在于，S2步骤中所述的诱导表达为：将扩增后的全长nsp13基因克隆到pET-28a原核和pCAGGS-HA真核表达载体上，经酶切与测序鉴定，命名为pET-28a-nsp13和pCAGGS-HA-nsp13；将pET-28a-nsp13质粒转入E.coli BL21感受态细胞中，得到重组nsp13包涵体蛋白；S2步骤中所述的SKL溶解透析复性为：对重组nsp13包涵体蛋白，使用SKL溶解该包涵体后，经过透析复性获得可溶性重组蛋白nsp13。

8.根据权利要求5所述的一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体的制备，其特征在于，S3步骤中所述的用免疫原多次免疫小鼠为：将纯化后的重组蛋白nsp13作为免疫原，四次免疫6周龄雌性BABL/c小鼠；所述的与SP2/0瘤细胞融合为：采用有限稀释法将单克隆杂交瘤细胞经3次亚克隆，选取分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞；所述的杂交瘤细胞为杂交瘤细胞株5A9。

9.根据权利要求5所述的一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，S4步骤中所述的注入小鼠腹腔-采集腹水为：将S3步骤得到的能分泌特异性抗体的单克隆杂交瘤细胞，按每只小鼠10⁶个细胞，注入8周龄BABL/c小鼠的腹腔进行免疫，7天后采取小鼠腹水，获得单克隆抗体。

10.根据权利要求1-4任一所述的一种抗猪流行性腹泻病毒nsp13蛋白的单克隆抗体在制备猪流行性腹泻病毒nsp13的Western Blot检测试剂中的应用。