CN114957477A

CN114957477A - 猪rig-i样受体特异性单克隆抗体及其制备方法和应用

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Publication number: CN114957477A
Application number: CN202210680936.8A
Authority: CN
Inventors: 朱建中; 邵琦; 李双洁; 曹琦; 张佳佳; 张友文; 孙少华; 张凯莉; 郑王龙; 陈南华
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2022-06-15
Filing date: 2022-06-15
Publication date: 2022-08-30
Anticipated expiration: 2042-06-15
Also published as: CN117285633A; CN114957477B; CN116948033A

Abstract

本发明公开了猪RIG‑I样受体特异性单克隆抗体，该抗体为猪RIG‑I蛋白特异性单克隆抗体、猪MDA5蛋白特异性单克隆抗体和/或猪LGP2蛋白特异性单克隆抗体，所述猪RIG‑I蛋白特异性单克隆抗体由杂交瘤细胞株pRIG‑I mAb产生，所述猪MDA5蛋白特异性单克隆抗体由杂交瘤细胞株pMDA5 mAb产生，所述猪LGP2蛋白特异性单克隆抗体由杂交瘤细胞株pLGP2 mAb A1‑3或杂交瘤细胞株pLGP2 mAb B9‑2产生，所述杂交瘤细胞株pRIG‑I mAb的保藏编号为CCTCC NO:C2022133，所述杂交瘤细胞株pMDA5 mAb的保藏编号为CCTCC NO:C2022134，所述杂交瘤细胞株pLGP2 mAb A1‑3的保藏编号为CCTCC NO:C2022135，所述杂交瘤细胞株pLGP2 mAb B9‑2的保藏编号为CCTCC NO:C2022136。

Description

猪RIG-I样受体特异性单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医学和生物学技术领域，具体涉及猪RIG-I样受体特异性单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

据了解，单克隆抗体技术是现代生命科学研究的重要技术，其在蛋白质的结构与功能研究方面、在人类和动植物的免疫学诊断方面都发挥着无可代替的重要作用。单克隆抗体在疾病预防、临床治疗、疾病诊断及检测中均有众多应用，同时单克隆抗体在生物学研究领域作为研究工具也得到广泛使用。天然免疫是机体防御感染的第一道防线，天然免疫通过一系列模式识别受体(PRR)家族识别来自病原体的各种保守分子从而启动细胞信号和免疫应答。天然免疫RIG-I样受体(RLR)家族是胞浆内的双链RNA(dsRNA)识别受体，在识别和防御病毒尤其是RNA病毒感染中发挥关键作用。RLR家族包括RIG-I、MDA5和LGP2三个成员。

RIG-I是最早发现的RLR原型受体，包括N端的两个半胱天冬酶活化募集结构域(CARDs)；中间的RNA解旋酶结构域，能够和C端结构域一起结合RNA；C端的编码自身活化抑制域(RD)或被称为调节结构域(RD)，负责识别并结合病毒RNA。没有病毒感染时，RIG-I呈静息状态，活性区CARDs与CTD和RNA解旋酶结构域结合，后者阻止CARDs与修饰蛋白接触活化。RIG-I能够识别5'-三磷酸dsRNA(5'-ppp-dsRNA)和短链dsRNA(＜300bp)。RIG-I在抗病毒免疫中发挥重要作用，这些病毒包括大多数单负链RNA病毒，如副粘病毒家族的新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)、正粘病毒科的流感病毒、弹状病毒科的水疱性口炎病毒(Vesicular stomatitis virus，VSV)和狂犬病病毒(Rabies virus，RV)，单正链RNA病毒如日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)，以及一些DNA病毒如腺病毒和痘苗病毒等。

MDA5与RIG-I具有相似的分子结构，包括N端的两个半胱天冬酶活化募集结构域(CARDs)；中间的RNA解旋酶结构域，能够和C端结构域一起结合RNA；C端的编码自身活化抑制域(RD)或被称为调节结构域(RD)，负责识别并结合病毒RNA。没有病毒感染时，MDA5呈静息状态，活性区CARDs与CTD和RNA解旋酶结构域结合，后者阻止CARDs发生活化。MDA5优先识别长的双链RNA(dsRNA)(＞1000bp)。MDA5同样在抗病毒免疫中发挥重要作用，这些病毒主要为小核糖核酸病毒科的病毒如脑心肌炎病毒(EMCV)，还有呼肠孤病毒科病毒如轮状病毒(Rotavirus)等。

LGP2缺少N端的信号活性区域(CARDs)，但其能够与配体dsRNA高亲和力结合，发挥重要的调控功能。在RIG-I和MDA5信号介导的抗病毒免疫中，LGP2发挥的确切调控功能和作用机制尚未明晰，另外LGP2在细胞免疫应答中的作用及机制研究更需要进一步深入。

猪是非常重要的经济动物，但由于缺乏商业化的猪RLR蛋白RIG-I、MDA5和LGP2抗体工具，也没有猪RLR单克隆抗体的文献报道(现有RLR蛋白抗体都是人和鼠RLR的抗体，与猪RLR蛋白的交叉反应性没有测试数据，并不能与猪RLR蛋白进行反应)，猪RLR蛋白功能相关研究非常缺乏。此外，猪还是包括传染病在内的多种人类疾病非常有前途的动物模型，因此研制出能区分猪和人RLR的特异抗体来研究其种属差异显得非常必要。

发明内容

本发明针对所要解决的技术问题，克服现有技术的不足而提供一种猪RIG-I样受体特异性单克隆抗体及其制备方法和应用。

本发明鉴于RLR包括猪RLR在抗病毒中的关键作用，为了弥补猪RLR商业化抗体的空白，使用细胞融合杂交瘤技术制备猪RLR家族所有三种蛋白的特异性单克隆抗体，将获得的猪RLR单克隆抗体成功用于各种免疫学试验，并可以用于猪和人RLR的比较免疫学研究。

本发明提供了猪RIG-I样受体(RLR)特异性单克隆抗体，所述猪RIG-I样受体特异性单克隆抗体为猪RIG-I蛋白特异性单克隆抗体、猪MDA5蛋白特异性单克隆抗体和/或猪LGP2蛋白特异性单克隆抗体，所述猪RIG-I蛋白特性单克隆抗体由杂交瘤细胞株pRIG-ImAb产生，所述猪MDA5蛋白特异性单克隆抗体由杂交瘤细胞株pMDA5 mAb产生，所述猪LGP2蛋白特异性单克隆抗体由杂交瘤细胞株pLGP2 mAb A1-3或杂交瘤细胞株pLGP2 mAb B9-2产生，所述杂交瘤细胞株pRIG-I mAb的保藏编号为CCTCC NO:C2022133，所述杂交瘤细胞株pMDA5 mAb的保藏编号为CCTCC NO:C2022134，所述杂交瘤细胞株pLGP2 mAb A1-3的保藏编号为CCTCC NO:C2022135，所述杂交瘤细胞株pLGP2 mAb B9-2的保藏编号为CCTCC NO:C2022136。

本发明提供了猪RLR家族三种蛋白的特异性单克隆抗体，与人RLR无交叉反应，只与猪RLR发生反应。本发明针对猪RIG-I样受体(RLR)家族成员RIG-I、MDA5和LGP2的特异单克隆抗体为猪RLR研究提供特定有用工具。已经成功地应用于各种免疫学试验，包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质印迹(WB)、免疫荧光(IFA)和免疫组织化学(IHC)实验，可以应用于猪RLR蛋白的检测和RLR蛋白抗病毒功能研究。此外，猪特异性RLR蛋白单克隆抗体还可以用于猪和人RLR的种属特异性比较免疫学研究。

本发明进一步的技术方案如下：

优选地，所述猪RIG-I蛋白特异性单克隆抗体能够识别RIG-I蛋白的C端Δ2CARDs片段(201-943aa)，所述猪MDA5蛋白特异性单克隆抗体能够识别MDA5蛋白的C端Δ2CARDs片段(201-1023aa)，所述猪LGP2蛋白特异性单克隆抗体能够识别LGP2蛋白的N端L1(1-200aa)片段。

优选地，所述猪RIG-I蛋白特异性单克隆抗体、猪MDA5蛋白特异性单克隆抗体、猪LGP2蛋白特异性单克隆抗体均为IgG2b的同型免疫球蛋白。

本发明还提供一种猪RIG-I样受体特异性单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

步骤1、从猪肺泡巨噬细胞中提取总RNA，经反转录扩增得到猪RIG-I、猪MDA5、猪LGP2的编码基因，猪RIG-I、猪MDA5、猪LGP2的编码基因分别经过原核表达、纯化后获得猪pRIG-I蛋白、猪pMDA5蛋白、猪LGP2蛋白；

步骤2、利用猪pRIG-I蛋白、猪pMDA5蛋白、猪LGP2蛋白分别对动物进行免疫，分离出脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，筛选出阳性的杂交瘤细胞株pRIG-I mAb、pMDA5mAb、pLGP2 mAb A1-3、pLGP2 mAb B9-2；

步骤3、在动物腹腔内分别接种杂交瘤细胞株pRIG-I mAb、pMDA5 mAb、pLGP2 mAbA1-3、pLGP2 mAb B9-2，将动物腹水液分离、纯化制备猪RIG-I蛋白、猪MDA5蛋白、猪LGP2蛋白特异性单克隆抗体。

本发明利用细胞融合杂交瘤技术制备猪RLR家族RIG-I、MDA5和LGP2蛋白的单克隆抗体，用来研究猪RLR在免疫信号中的作用和功能。

本发明进一步提供了一种猪RIG-I样受体特异性单克隆抗体在免疫学检测中的应用。

上述猪RIG-I样受体特异性单克隆抗体在免疫学检测中的应用，具体包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、蛋白质印迹(WB)、免疫荧光(IFA)和免疫组织化学(IHC)。

本发明的有益效果如下：本发明提供四株猪RLR蛋白单克隆抗体，其中三株特异性单克隆抗体只与猪RLR(RIG-I、MDA5和LGP2)反应，与人RLR无交叉反应，用于特异性检测猪RLR，可用于猪RLR蛋白的检测和RLR蛋白抗病毒功能研究以及猪和人RLR的种属特异性比较免疫学研究。

保藏证明和存活证明说明

(1)保藏菌株：杂交瘤细胞株pRIG-I mAb，保藏编号：CCTCC NO:C2022133，保藏日期：2022-5-12收到，2022-5-18检测完毕，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学；

(2)保藏菌株：杂交瘤细胞株pMDA5 mAb，保藏编号：CCTCC NO:C2022134，保藏日期：2022-5-12，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学；

(3)保藏菌株：杂交瘤细胞株pLGP2 mAb A1-3，保藏编号：CCTCC NO:C2022135，保藏日期：2022-5-12，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学；

(4)保藏菌株：杂交瘤细胞株pLGP2 mAb B9-2，保藏编号：CCTCC NO:C2022136，保藏日期：2022-5-12，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。

附图说明

图1为本发明中重组猪RLR纯化蛋白的SDS-PAGE考马染色鉴定示意图。图2为本发明中Western-blot分析纯化猪RLR蛋白与标签HA抗体的反应性的示意图。图3为本发明中猪RLR三种蛋白4株单抗的亚类鉴定示意图。图4为本发明中Western-blot分析猪RLR单克隆抗体与外源和内源猪RLR蛋白的反应性的示意图。图5为本发明中Western-blot分析猪RLR单克隆抗体识别抗原区域的示意图。图6为本发明中Western-blot分析猪RLR单克隆抗体种属反应特异性的示意图。图7为本发明中猪RLR单抗间接免疫荧光检测猪RLR蛋白在细胞中的表达和定位的示意图。图8为本发明中猪RLR单抗免疫组化检测PRRSV感染猪组织中的RLR蛋白分布与表达的示意图。图中：将呼吸繁殖综合征病毒(PRRSV)感染猪的心，肝，脾，肺，肾，淋巴结组织切片进行免疫组化染色分析，在放大200X显微镜下观察染色结果。局部方框内组织染色放大结果图附于对应图片右侧。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步的详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护权限不限于下述的实施例。

实施例所涉及试剂及材料的来源如下：猪肺泡巨噬细胞(PAM，3D4/21，购自美国菌种保存中心，ATCC Cat#CRL-2843)，中间载体pENTR4-MCS-2HA(扬州大学兽医学院实验室构建保存，构建方法见论文Front Immunol.2020Aug 14；11:1669.doi:10.3389/fimmu.2020.01669)，真核目的表达载体pcDNA-DEST47(购自Addgene)，原核目的表达载体pDSET-527(购自Addgene)，IPTG诱导剂(购自TransGen生物技术公司)，

Ni-TEDPacked Columns镍柱(购自MACHEREY-NAGEL)，BALB/c小鼠(购自扬州大学实验动物中心)，福氏不完全佐剂(购自Roche)，PEG1500(购自Roche)，人IFN-β(购自BBI，C600038)，ISG56兔抗(扬州大学兽医学院实验室制备保存，将人ISG56纯化蛋白免疫新西兰大白兔获得血清多抗，具体制备方法见论文Virulence.2022Dec；13(1):740-756.doi:10.1080/21505594.2022.2065962)，HA鼠抗(购自TransGen)，pCAGGS-2HA(扬州大学兽医学院实验室构建保存，合成2HA标签编码序列至pCAGGS质粒的EcoRV和BglII位点获得，申请人在此承诺自申请日起二十年内可向公众发放该材料)，Triton X-100(购自索来宝)，多聚甲醛(购自索来宝)，驴抗小鼠IgG(H+L)Alexa Fluor488(购自ThermoFisher Scientific)，HRP偶联山羊抗小鼠(购自TransGen)。

除了上述特殊说明的生物材料及试剂外，本发明中所提及的其余材料及试剂为市购，公众能从国内外商业渠道购买到，此处不再一一说明。

本发明中的“％”为体积百分比。

实施例1猪RIG-I、MDA5和LGP2基因序列、单克隆抗体制备工艺

(1)猪RIG-I基因克隆表达、蛋白纯化和单克隆抗体的制备

从猪肺泡巨噬细胞(PAM，3D4/21)中提取总RNA，设计克隆和检测PCR引物(见表1)，反转录PCR(RT-PCR)扩增出猪RIG-I(pRIG-I)的编码基因(pRIG-I编码基因序列的GenBank登录号为MF358966，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；pRIG-I蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示)。将pRIG-I基因与中间载体pENTR4-MCS-2HA连接获得重组中间质粒pENTR4-pRIG-I-2HA。将上述重组中间质粒分别与真核目的表达载体pcDNA-DEST47和原核目的表达载体pDSET-527进行特异位点性重组(LR)，获得重组真核表达质粒pcDNA-pRIG-I-2HA和重组原核表达质粒pDEST527-pRIG-I-2HA。将上述重组原核表达质粒转化到DE3/BL21感受态大肠杆菌(E.coli)进行原核蛋白诱导表达，原核蛋白表达的最佳诱导条件为：IPTG诱导剂浓度1mM、37℃条件下培养12h。对原核诱导表达的大肠杆菌菌体进行超声充分破碎后，于4℃离心30min，将目的蛋白所在的细菌裂解上清通过0.45μM的滤器过滤。过滤后上清使用

Ni-TED Packed Columns镍柱(MACHEREY-NAGEL)过柱吸附，每个样品可反复过柱两到三次。然后用LEW缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl(pH8.0，30mL))洗涤吸附柱2-3次去除杂蛋白。用洗脱缓冲液(50mM NaH₂PO₄，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 8.0)洗脱三次，每次3mL。将洗脱后的纯化蛋白使用最小截留分子量为25kDa的透析袋置在PBS缓冲液(0.24g KH₂PO₄，1.44g NaHPO₄，8g NaCl，0.2g KCl，0.056g吡哆醇，0.04g甜菊糖A苷，加入去离子水800mL，调节pH至8.5)中于4℃进行透析，每1-2h换一次PBS缓冲液。最后获得可溶性纯化pRIG-I蛋白(pRIG-I蛋白的SDS-PAGE考马染色鉴定结果见图1，图中左边为标准分子量蛋白，框内为不同的猪RLR全长蛋白，标准蛋白为牛血清白蛋白(BSA))。纯化的pRIG-I蛋白在Westernblot中可以被标签HA抗体所识别(结果见图2，图中左边为标准分子量蛋白)。

用纯化pRIG-I蛋白皮下免疫6-8周龄BALB/c小鼠，第二次与第一次免疫时间间隔14天，第三和第二次免疫时间间隔7天，三免后5天内小鼠尾静脉采血分离血清，对血清中抗体ELISA效价最高的小鼠进行腹腔注射加强免疫。加强免疫后72小时内取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合(细胞融合的具体操作步骤见后面详细介绍)，获得杂交瘤细胞克隆。其中，有1株ELISA阳性的细胞克隆，进一步Western-blot检测发现有杂交瘤细胞克隆能与真核pRIG-I蛋白能产生特异性反应。由此，获得了1株能够分泌pRIG-I单克隆抗体的杂交瘤细胞株pRIG-I mAb(中国菌种中心细胞收藏号为CCTCC NO:C2022133)。选取8-12周龄的BALB/c小鼠经腹腔注射0.2-0.3mL/只的福氏不完全佐剂。在3天后腹腔注射小鼠杂交瘤细胞株(1-3×10⁶细胞/0.3ml/只)，5天后观察小鼠腹部鼓胀程度来判定小鼠腹水产生情况。若手触小鼠腹部有明显的肿胀感且小鼠腹部呈现紧绷状态即可用16号针头采集腹水。可连续采2-3次，将采集后的腹水于2000rpm，5min离心，去除最上层的脂肪组织与混入腹水内的红细胞，收集上清，纯化得到pRIG-I蛋白特异性单克隆抗体。分装后冻存于-80℃冰箱。

(2)猪MDA5基因克隆表达、蛋白纯化和单克隆抗体的制备

从猪肺泡巨噬细胞(PAM，3D4/21)中提取总RNA，设计克隆和检测PCR引物(见表1)，反转录PCR(RT-PCR)扩增出猪MDA5(pMDA5)的编码基因(pMDA5编码基因序列的GenBank登录号为MF358967，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；pMDA5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示)。将pMDA5基因与中间载体pENTR4-MCS-2HA连接获得重组中间质粒pENTR4-pMDA5-2HA。将上述重组中间质粒分别与真核目的表达载体pcDNA-DEST47和原核目的表达载体pDSET-527进行特异位点性重组(LR)，获得重组真核表达质粒pcDNA-pMDA5-2HA和重组原核表达质粒pDEST527-pMDA5-2HA。将上述重组原核表达质粒转化到DE3/BL21感受态大肠杆菌(E.coli)进行原核蛋白诱导表达，原核蛋白表达的最佳诱导条件为：IPTG诱导剂浓度1mM、37℃条件下培养12h。对原核诱导表达的菌体超声充分破碎后，于4℃离心30min，将目的蛋白所在的上清通过0.45μM的滤器过滤。过滤后上清使用

Ni-TED Packed Columns镍柱(MACHEREY-NAGEL)过柱吸附，每个样品可反复过柱两到三次。然后用LEW缓冲液(50mMNaH₂PO₄，300mM NaCl(pH8.0，30mL))洗涤吸附柱2-3次去除杂蛋白。用洗脱缓冲液(50mMNaH2PO4，300mM NaCl，250mM咪唑，pH 8.0)洗脱三次，每次3mL。将洗脱后的纯化蛋白使用最小截留分子量为25kDa的透析袋置在PBS缓冲液(0.24g KH₂PO₄，1.44g NaHPO₄，8g NaCl，0.2g KCl，0.056g吡哆醇，0.04g甜菊糖A苷，加入去离子水800mL，调节pH至8.5)中于4℃进行透析，每1-2h换一次PBS缓冲液。最后获得可溶性纯化pMDA5蛋白(pMDA5蛋白的SDS-PAGE考马染色鉴定结果见图1)。纯化的猪MDA5蛋白在Western blot中也可以被标签HA抗体所识别(见图2)。

利用纯化pMDA5蛋白皮下免疫6-8周龄BALB/c小鼠，第二次与第一次免疫时间间隔14天，第三和第二次免疫时间间隔7天，三免后5天内小鼠尾静脉采血分离血清，对血清中抗体ELISA效价最高的小鼠进行腹腔注射加强免疫。加强免疫后72小时内取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合(细胞融合的具体操作步骤见后面详细介绍)，获得杂交瘤细胞克隆。其中有1株ELISA阳性的细胞克隆，进一步Western-blot检测发现有杂交瘤细胞克隆能与真核pMDA5蛋白能产生特异性反应。由此，获得了1株能够分泌pMDA5单克隆抗体的杂交瘤细胞株pMDA5 mAb(中国菌种中心细胞收藏号为CCTCC NO:C2022134)。选取8-12周龄的BALB/c小鼠经腹腔注射0.2-0.3mL/只的福氏不完全佐剂。在3天后腹腔注射小鼠杂交瘤细胞(1-3×10⁶细胞/0.3ml/只)，5天后观察小鼠腹部鼓胀程度来判定小鼠腹水产生情况。若手触小鼠腹部有明显的肿胀感且小鼠腹部呈现紧绷状态即可用16号针头采集腹水。可连续采2-3次，将采集后的腹水2000rpm，5min离心，去除最上层的脂肪组织与混入腹水内的红细胞，收集上清，纯化得到pMDA5蛋白特异性单克隆抗体。分装后冻存于-80℃冰箱。

(3)猪LGP2基因克隆表达、蛋白纯化和单克隆抗体的制备

从猪肺泡巨噬细胞(PAM，3D4/21)中提取总RNA，设计克隆和检测PCR引物(见表1)，反转录PCR(RT-PCR)扩增出猪LGP2(pLGP2)的编码基因(pLGP2编码基因序列的GenBank登录号为MF358968，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；pLGP2蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示)。将pLGP2基因与中间载体pENTR4-MCS-2HA连接获得重组中间质粒pENTR4-pLGP2-2HA。将上述重组中间质粒分别与真核目的表达载体pcDNA-DEST47和原核目的表达载体pDSET-527进行特异位点性重组(LR)，获得重组真核表达质粒pcDNA-pLGP2-2HA和重组原核表达质粒pDEST527-pLGP2-2HA。将上述重组原核表达质粒转化到DE3/BL21感受态大肠杆菌(E.coli)进行原核蛋白诱导表达，原核蛋白表达的最佳诱导条件为：IPTG诱导剂浓度1mM、37℃条件下培养6-9h。利用尿素溶解和浓度梯度透析方法从细菌包涵体中纯化出具有较好免疫原性的猪LGP2蛋白(猪LGP2蛋白SDS-PAGE考马染色鉴定结果见图1)。纯化猪LGP2在Western blot中可以被HA标签抗体所识别(见图2)。

利用纯化pLGP2蛋白皮下免疫6-8周龄BALB/c小鼠，第二次与第一次免疫时间间隔14天，第三次和第二次免疫时间间隔7天，三免后5天内小鼠尾静脉采血分离血清，对血清中抗体ELISA效价最高的小鼠进行腹腔注射加强免疫。加强免疫后72小时内取小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞进行融合(细胞融合的具体操作步骤见后面详细介绍)，获得杂交瘤细胞克隆。其中有7株ELISA阳性的细胞克隆，进一步Western-blot检测发现有2株杂交瘤细胞克隆(A1-3和B9-2)能与真核pLGP2蛋白能产生特异性反应。由此，获得了2株能够分泌pLGP2单克隆抗体的杂交瘤细胞株pLGP2 mAb A1-3和pLGP2 mAb B9-2(中国菌种中心细胞收藏号为CCTCC NO:C2022135和CCTCC NO:C2022136)。选取8-12周龄的BALB/c小鼠经腹腔注射0.2-0.3mL/只的福氏不完全佐剂。在3天后腹腔注射小鼠杂交瘤细胞(1-3×10⁶细胞/0.3ml/只)，5天后观察小鼠腹部鼓胀程度来判定小鼠腹水产生情况。若手触小鼠腹部有明显的肿胀感且小鼠腹部呈现紧绷状态即可用16号针头采集腹水。可连续采2-3次，将采集后的腹水2000rpm，5min离心，去除最上层的脂肪组织与混入腹水内的红细胞，收集上清，纯化得到pLGP2蛋白特异性单克隆抗体。分装后冻存于-80℃冰箱。

细胞融合的具体操作步骤如下：

①将1×108脾细胞与1-2×107骨髓瘤细胞SP2/0在50mL融合管中混合，补加无血清DMEM培养基(购自Hyclone公司)至30mL，充分混匀。

②1000rpm离心5-10min，去除离心上清(此时管底沉淀为下层红色的脾细胞和上层白色的SP2/0细胞，两者压积大致相当)。

③握于手掌旋转轻击融合管底，使细胞团块呈松散均质的状态。

④用1mL移液枪在60s内缓缓滴加37℃预热1mL PEG1500，边加边旋转离心管，使PEG1500和细胞充分混匀。

⑤用移液枪在90s内先慢后快方式加入10-20mL预热至37℃的无血清DMEM培养基，稀释并同时终止PEG1500的作用。37℃静置10min。

⑥1000rpm，离心5-10min弃去上清。

⑦加入40mL HAT培养基(含1×的次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)、胸腺嘧啶(T)和10％胎牛血清(FBS)的DMEM培养液))将沉淀细胞轻轻吹打混匀。

⑧用排枪分装至含腹腔饲养细胞的96孔细胞培养板，每孔100μL；然后将培养板置37℃，5％CO2培养箱内培养。

⑨融合后7-10d(杂交瘤细胞克隆非常明显)，可以用新鲜HAT培养基换出1/2培养基。

⑩观察杂交瘤细胞生长情况，超过孔底面积1/10以上且上清变黄时吸出上清供ELISA抗体检测。

表1猪RLR基因克隆和检测PCR引物序列

注：F/R为克隆PCR引物；f/r为检测PCR引物。大写字母标识处为限制性酶切位点。

实施例2猪RIG-I、MDA5和LGP2单克隆抗体鉴定

(1)猪RLR单抗亚类鉴定

按照赛尔维(CELLWAY-LAB洛阳佰奥通实验材料中心)小鼠单抗Ig类/亚类/亚型鉴定试剂盒使用说明书中的操作方法，检测猪RLR三种蛋白4株腹水单抗的亚类，结果见图3。结果显示，pRIG-I、pMDA5和pLGP2(A1-3和B9-2)4株单抗的亚类均为IgG2b。

(2)猪RLR单抗识别内源性和外源性真核表达蛋白的鉴定

将猪肺泡巨噬细胞系(PAM，3D4/21)和PK15细胞分别铺于24孔细胞培养板(2×10⁵细胞/孔)，用500IU/mL、1000IU/mL的人IFN-β(BBI，C600038)直接刺激8-12h后收集细胞。猪RLR重组真核pcDNA表达质粒(pcDNA-pRIG-I-2HA、pcDNA-pMDA5-2HA和pcDNA-pLGP2-2HA)转染293T细胞24h后收集细胞。上述细胞裂解液分别进行SDS-PAGE，用上述4株猪RLR腹水型单抗(体积比1:1000稀释)，ISG56兔抗和HA鼠抗(体积比1:1000稀释)进行Western-blot分析，检测猪RLR三种蛋白4株单抗对外源性和内源性蛋白反应性。结果如图4所示：HA兔抗可以检测到pRIG-I、pMDA5和pLGP2在转染293T细胞中的表达；pRIG-I单抗与pRIG-I反应，而与pMDA5和pLGP2无交叉反应；pMDA5单抗与pMDA5反应，而与pRIG-I和pLGP2无交叉反应；2株pLGP2单抗都可以与pLGP2反应，而与pRIG-I和pMDA5无交叉反应。上述结果说明RLR单抗只和各自RLR蛋白特异反应，而与其它RLR蛋白无交叉反应。另一方面，人(h)IFN-β刺激PAM细胞和PK15细胞诱导表达多种干扰素(IFN)刺激蛋白(ISG)，包括ISG56、RIG-I、MDA5和LGP2等。ISG56可以被ISG56兔抗所检测，说明hIFN-β能有效刺激诱导下游各种ISG蛋白表达。确实hIFN-β诱导的内源性RIG-I蛋白可以被pRIG-I单抗识别反应；hIFN-β诱导的内源性MDA5蛋白可以被pMDA5单抗识别反应；hIFN-β诱导的内源性LGP2蛋白可以被2株pLGP2单抗(A1-3和B9-2)识别反应(见图4)。总体而言，PAM刺激诱导ISG的效果比PK15细胞好，前者是免疫细胞，高表达各类ISG蛋白包括RLR蛋白RIG-I、MDA5和LGP2，因此结果比较符合预期(见图4)。

(3)猪RLR单抗识别蛋白结构域的鉴定

将猪RIG-I蛋白的N端CARDs结构域(1-200aa)编码DNA序列合成到pENTR4-MCS-2HA质粒的SalI/EcoRV位点，构建pENTR4-pRIG-I-CARDs-2HA。再将合成的pENTR4 pRIG-I-CARDs-2HA与目的表达载体pcDNA-DEST47进行位点特异性LR同源重组，获得pcDNA-pRIG-I-CARDs-2HA真核表达质粒。猪RIG-I蛋白的C端CARDs外区域(Δ2CARDs，201-943aa)用表2中的克隆引物从模板质粒PCR扩增，PCR产物酶切后经T4连接酶克隆到pCAGGS-2HA的EcoRI/EcoRV位点，构建pCAGGS-pRIG-I-Δ2CARDs-2HA表达质粒。

将猪MDA5蛋白的N端CARDs结构域(1-200aa)编码DNA序列合成到pENTR4-MCS-2HA质粒的SalI/EcoRV位点，构建pENTR4-pMDA5-CARDs-2HA。再将合成的pENTR4-pMDA5-CARDs-2HA与目的表达载体pcDNA-DEST47进行位点特异性LR同源重组，获得pcDNA-pMDA5-CARDs-2HA真核表达质粒。猪MDA5蛋白的C端CARDs外区域(Δ2CARDs，201-1023aa)用表2中的克隆引物从模板质粒PCR扩增，PCR产物酶切后经T4连接酶克隆到pCAGGS-2HA的EcoRI/EcoRV位点，构建pCAGGS-pMDA5-Δ2CARDs-2HA表达质粒。

使用prosite网站(https://prosite.expasy.org/)预测猪pLGP2的功能结构域，分别为猪pLGP2蛋白的N端解旋酶ATP结合域(L1，1-200aa)、中间解旋酶CTER域(L2，340-530aa)和C端CTR域(L3，531-685aa)。分别设计L1、L2和L3片段的克隆PCR引物(见表2)，将相应PCR扩增片段克隆到载体pcDNA-2HA的NheI/EcoRV位点，分别构建pcDNA-pLGP2-L1-2HA、pcDNA-pLGP2-L2-2HA和pcDNA-pLGP2-L3-2HA表达质粒。

将序列正确pcDNA-pRIG-I-CARDs-2HA和pCAGGS-pRIG-I-Δ2CARDs-2HA表达质粒分别转染293T细胞。细胞裂解液样品用pRIG-I腹水单抗(体积比1∶1000稀释)进行Western-blot分析，根据Western-blot结果鉴定pRIG-I单克隆抗体所识别蛋白的功能结构区域。结果如图5所示，pRIG-I单抗识别位点位于RIG-I蛋白C端Δ2CARDs片段(201-943aa)。

将序列正确pcDNA-pMDA5-CARDs-2HA和pCAGGS-pMDA5-Δ2CARDs-2HA表达质粒分别转染293T细胞。细胞裂解液样品用pMDA5腹水单抗(体积比1:1000稀释)进行Western-blot分析，根据Western-blot结果鉴定pMDA5单克隆抗体所识别蛋白的功能结构区域。结果如图5所示，pMDA5单抗识别位点位于MDA5蛋白C端Δ2CARDs片段(201-1023aa)。

将序列正确的pLGP2截短体(L1,L2,L3)pcDNA质粒分别转染293T细胞，细胞裂解液样品用2株pLGP2腹水单抗(体积比1∶1000稀释)进行Western-blot分析，根据Western-blot结果鉴定2株pLGP2单克隆抗体所识别蛋白的功能结构区域。结果如图5所示，pLGP2的2株单抗识别位点位于LGP2蛋白N端L1(1-200aa)片段。

表2猪RLR截短体克隆引物序列

注：大写字母标识处为限制性酶切位点。

(4)猪RLR单抗识别种属特异性的鉴定

将猪pcDNA pRIG-I-2HA质粒和人pcDNA hRIG-I-3FLAG质粒各1μg分别转染293T细胞，24h后收集细胞。细胞裂解液用pRIG-I腹水型单抗(体积比1:1000稀释)作为一抗进行Western-blot分析，检测pRIG-I单抗的种属识别/反应特异性。同时将HA和FLAG标签鼠单抗作为对照抗体使用，结果见图6。结果显示，猪RIG-I和人RIG-I蛋白均可以被各自的蛋白标签抗体HA和FLAG所特异识别，获得预期表达。猪RIG-I单抗只与猪RIG-I发生反应，与人RIG-I无交叉反应。因此，获得了1株具有种属特异性的pRIG-I单克隆抗体。

将猪pcDNA-pMDA5-2HA质粒和人pcDNA-hMDA5-3FLAG质粒各1μg分别转染293T细胞，24h后收集细胞。细胞裂解液用pMDA5腹水型单抗(体积比1:1000稀释)作为一抗进行Western-blot分析，检测pMDA5单抗的种属识别/反应特异性。同时将HA和FLAG标签鼠单抗作为对照抗体使用，结果见图6。结果显示，猪MDA5和人MDA5蛋白均可以被各自的蛋白标签抗体HA和FLAG所特异识别，获得预期表达。猪MDA5单抗只与猪MDA5发生反应，与人MDA5无交叉反应。因此，获得了1株具有种属特异性的pMDA5单克隆抗体。

将猪pcDNA pLGP2-2HA质粒和人pcDNA hLGP2-3FLAG质粒各1μg分别转染293T细胞，24h后收集细胞。细胞裂解液用2株pLGP2腹水型单抗(体积比1:1000稀释)作为一抗进行Western-blot分析，检测2株pLGP2单抗的种属识别/反应特异性。同时将HA和FLAG标签鼠单抗作为对照抗体使用，结果见图6。结果显示，猪LGP2和人LGP2蛋白均可以被各自的蛋白标签抗体HA和FLAG所特异识别，获得预期表达。猪LGP2的2株单抗情况有所不同，其中pLGP2(B9-2)单抗只与猪LGP2发生反应，与人LGP2无交叉反应；而pLGP2(A1-3)单抗既能识别猪LGP2，也可以识别人LGP2，与人LGP2存在交叉反应。因此，获得了1株具有种属特异性的pLGP2单克隆抗体(B9-2)。

实施例3猪RLR单抗间接免疫荧光鉴定RLR蛋白细胞内表达和定位

将消化好的PAM细胞按照3×10⁵的量铺进12孔细胞培养板中，在37℃，5％CO₂培养箱中培养长成单层时，直接加入hIFN-β(500IU/mL,BBI)刺激细胞8-12h。用PBS缓冲液洗涤后，将细胞在室温下用5％多聚甲醛固定10分钟，然后在室温下用0.5％Triton X-100进行细胞透膜15分钟。固定和透膜后细胞在室温下用5％BSA PBS溶液(5％牛血清白蛋白(BSA)，Na₂HPO₄ 80mM,NaH₂PO₄.2H₂O 20mM,NaCl 100mM)封闭2小时，分别4℃过夜孵育一抗pRIG-I、pMDA5和pLGP2单抗(A1-3和B9-2)(体积比1:200稀释)，然后室温2小时孵育二抗驴抗小鼠IgG(H+L)Alexa Fluor 488(体积比1:200稀释)。PBST(Na₂HPO₄ 80mM,NaH₂PO₄.2H₂O 20mM,NaCl 100mM，0.05％Tween-20))洗涤3次后，用DAPI(购自Beyotime公司)在室温下对细胞进行负染10分钟，最后在荧光显微镜下检查染色的PAM细胞。结果显示(见图7)：pRIG-I单抗可通过间接免疫荧光(IFA)检测hIFN-β刺激PAM中诱导表达的pRIG-I蛋白，所识别的荧光蛋白在胞浆中呈连续分布，尤其是在核周区域。pMDA5单抗可通过间接免疫荧光(IFA)检测hIFN-β刺激PAM中诱导表达的pMDA5蛋白，所识别的荧光蛋白在胞浆中与RIG-I和LGP2不同，呈不连续分布，尤其是在核周区域。pLGP2单抗(A1-3和B9-2株)均可通过间接免疫荧光(IFA)检测hIFN-β刺激PAM中诱导表达的pLGP2蛋白，2株pLGP2单抗均主要识别胞浆蛋白且具有相似的模式，即识别的荧光蛋白在胞浆中呈连续分布，尤其是在核周区域。

实施例4猪RLR单抗免疫组化检测RLR蛋白在PRRSV感染猪组织中的分布与表达

取感染高致病性猪呼吸繁殖综合征病毒(HP-PRRSV)感染猪的组织，包括心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和淋巴结，用于组织切片。固定、脱水后，将组织包埋在融化石蜡中进行切片。组织切片的厚度为5μm，组织切片用双蒸水铺展，平铺在聚赖氨酸涂层的载玻片上，在37℃下干燥过夜，并在4℃下保存。染色前，石蜡切片依次再水化，用3％过氧化氢(H₂O₂)在黑暗中孵育阻断内源性过氧化物酶从而修复抗原。PBS清洗后，组织切片用5％PBS在37℃下封闭15分钟，然后与一抗pRIG-I、pMDA5和pLGP2单抗(B9-2株)(体积比1:500稀释)分别4℃过夜孵育。第二天切片用PBS清洗，与二抗即HRP偶联山羊抗小鼠(体积比1:200稀释)在室温下孵育30分钟。然后用底物DAB显色5分钟出现特定的棕色反应。用苏木精复染后，组织切片在梯度酒精中脱水并用中性树脂密封。最后对干燥的组织切片进行显微镜检查、图像采集和分析。实验结果表明(见图8)，RIG-I、MDA5和LGP2都主要集中在肺脏和肾脏，其次是淋巴结、肝脏、脾脏。心脏组织中没有阳性染色，可以作为阴性对照。肺脏染色最为显著，强阳性染色细胞呈现黄褐色。

以上所述，仅为本发明中的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉该技术的人在本发明所揭露的技术范围内，可理解想到的变换或替换，都应涵盖在本发明的包含范围之内，因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 猪RIG-I样受体特异性单克隆抗体及其制备方法和应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2844

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgacagcag agcagcggcg gaatctgcac gctttcgggg actatgtcag gaagactctc 60

gaccccacct tcatcctgag ctacatggcc ccctggttta gggacgatga ggtgcagcat 120

attcaggctg agaaaaacaa caagggcccg acagaggctg catcactttt tctccagttc 180

ctgttggagc tccaggagga aggctggttc cgaggctttt tggatgccct taaccaagca 240

ggttattctg gactttgtga agccattgaa agttgggatt tccaaaaaat tgagaagttg 300

gaggagtaca gatcactctt aaggcgttta caaccagaat ttaaaaccac gatcaatcca 360

aaagatatcc ttcctgaaat agctgaatgt ttaattagtc aggaatgtga agaaattctt 420

cagatttgtt ccagcaaggg gctgatggca ggtgcagaga aaatggttga atgcctcctc 480

agatcagaca aggagaattg gcctaaaact ttgaaacttg ctttggagaa agaagagagc 540

aggttcagtg aactgtggat ggtagacaaa ggtgcagaag atgttaaaat gaaagatctt 600

gaggatgacg aaatgaaaac ttgtgatgta cagattttct acaaggaaga accagaaaac 660

cagaatctta gtcagaattc gtgttcctct tcagaagcac ctcatactta cagcccactg 720

aagccaagaa attaccaact ggagcttgct ttacctgctc agaatggaaa aaacacaata 780

atatgtgctc ctactggttg tggaaaaacc tttgtttctc ttcttatatg tgaacatcat 840

cttaagaaat ttccacaagg acgaaagggg aaggttgtct tttttgctat tcaactccca 900

gtgtatgagc agcagaaatc tgtgttctca aaacattttg aaagacttgg gtacaaagtt 960

gcaggcattt ctggagcaac gtctgacact gtctgtgtgg aacagattgt tgagaacaac 1020

gacatcatca tcttaacgcc acagattctt gtgaactgtc ttaccaatgg gacaattcca 1080

tcactctctg tgtttacttt gatgatattt gatgaatgcc acaacaccag caaacagcat 1140

ccttataatg tcatcatgtt taattatcta gatcggaaac ttggaggatc ttcagactca 1200

ctgccccagg tcattggact gactgcctcg gttggcgttg gggatgcaaa aaacaaggct 1260

gaagccacag aatacatctg caaattgtgt gcttctcttg acacttcggt catagcaaca 1320

gtcagagaca acttggaaga actagaggaa gttgtgtata agccccagaa gtttttcagg 1380

aaagtggaat tacggaccac tgacagattt aagtgcatca tatcgcagct gatgatggag 1440

atagagagtc tggcaaagag catctttgaa gaacttggta ccataactct tggaggctta 1500

tttcaaattc aaaatagtaa tttcggaaca cagaaatatg agcagtggat tgtcaaggtt 1560

cagaaagagt gtgcggtgtt tcagatgcca gacaaagaca aagaaagcag gatttgtaaa 1620

gcactgtttt cgtacatgtc acatttgcgg atatacaacg atgcccttat tatcaatgaa 1680

catgcccgaa tgaaagatgc tttggattac ttgaaagact tcttcagaaa tatccgagca 1740

gcaggctttg atgagattga gcaagatctc actcagagat ttgaagaaaa gctgcaagaa 1800

ctagaaagca tttccataga tcccagcaac gagaacccta aactcagaga cctctgcttc 1860

atcttgcaag aagagtacca cttaaaccca gagaccagaa ccattctctt tgtgaaaacc 1920

agagcccttg tggatgcttt aaagaaatgg attaaagaaa atcctaagct cagctttctg 1980

aaacctagca tattgactgg acgtggcaaa acgaatcaga acatagggat gaccctccca 2040

gcccagaagt gtgtactgga taccttcaga actgacaagg ataacaagat tctgatcacc 2100

acctcggtgg cagatgaagg catcgacatt gctcagtgca atctggtcat cctatatgag 2160

tatgtgggca acgtcatcaa aatgatccaa accagaggca gaggaagagc aagagggagc 2220

aagtgtttcc ttctgactgc taacgctgat ctgatcgaca aagagaaaat gaacatgtac 2280

aaagaagaaa tgatgaatgg ggccatttta atcctgcaga catgggatga agcagtattt 2340

aaagaaaaga ttcaccagat acagattcgt gaaaaaatca tcagggataa tcaaggaaaa 2400

ccagaacctg tgcctgataa gaaaactaaa aaactactct gcaaaaagtg caaagccttt 2460

gcatgttata cagctgatat aagaatggtg gagaaatgcc atttcactgt ggttggagat 2520

gctttcaggg agcgctttgt gagtaaactg caccccaaac caaagagttt tgggaatatt 2580

gaaaagagag caaagatata ttgtgctagg ccagactgca gccatgactg gggaatctat 2640

gtgaggtata aggcatttga gatgccattt ataaaaatcg aaagttttgt ggtggaggat 2700

attgcaactg gagttcagac cgtgcatgcc aagtggaagg actttaattt tgagaagcta 2760

tcatttgatg ctgcagaaat ggccggtgga gctcaggacc tgggtcttca gggaatgggc 2820

aaccttgagc ccatcaccag ctag 2844

<210> 2

<211> 947

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Thr Ala Glu Gln Arg Arg Asn Leu His Ala Phe Gly Asp Tyr Val

1 5 10 15

Arg Lys Thr Leu Asp Pro Thr Phe Ile Leu Ser Tyr Met Ala Pro Trp

20 25 30

Phe Arg Asp Asp Glu Val Gln His Ile Gln Ala Glu Lys Asn Asn Lys

35 40 45

Gly Pro Thr Glu Ala Ala Ser Leu Phe Leu Gln Phe Leu Leu Glu Leu

50 55 60

Gln Glu Glu Gly Trp Phe Arg Gly Phe Leu Asp Ala Leu Asn Gln Ala

65 70 75 80

Gly Tyr Ser Gly Leu Cys Glu Ala Ile Glu Ser Trp Asp Phe Gln Lys

85 90 95

Ile Glu Lys Leu Glu Glu Tyr Arg Ser Leu Leu Arg Arg Leu Gln Pro

100 105 110

Glu Phe Lys Thr Thr Ile Asn Pro Lys Asp Ile Leu Pro Glu Ile Ala

115 120 125

Glu Cys Leu Ile Ser Gln Glu Cys Glu Glu Ile Leu Gln Ile Cys Ser

130 135 140

Ser Lys Gly Leu Met Ala Gly Ala Glu Lys Met Val Glu Cys Leu Leu

145 150 155 160

Arg Ser Asp Lys Glu Asn Trp Pro Lys Thr Leu Lys Leu Ala Leu Glu

165 170 175

Lys Glu Glu Ser Arg Phe Ser Glu Leu Trp Met Val Asp Lys Gly Ala

180 185 190

Glu Asp Val Lys Met Lys Asp Leu Glu Asp Asp Glu Met Lys Thr Cys

195 200 205

Asp Val Gln Ile Phe Tyr Lys Glu Glu Pro Glu Asn Gln Asn Leu Ser

210 215 220

Gln Asn Ser Cys Ser Ser Ser Glu Ala Pro His Thr Tyr Ser Pro Leu

225 230 235 240

Lys Pro Arg Asn Tyr Gln Leu Glu Leu Ala Leu Pro Ala Gln Asn Gly

245 250 255

Lys Asn Thr Ile Ile Cys Ala Pro Thr Gly Cys Gly Lys Thr Phe Val

260 265 270

Ser Leu Leu Ile Cys Glu His His Leu Lys Lys Phe Pro Gln Gly Arg

275 280 285

Lys Gly Lys Val Val Phe Phe Ala Ile Gln Leu Pro Val Tyr Glu Gln

290 295 300

Gln Lys Ser Val Phe Ser Lys His Phe Glu Arg Leu Gly Tyr Lys Val

305 310 315 320

Ala Gly Ile Ser Gly Ala Thr Ser Asp Thr Val Cys Val Glu Gln Ile

325 330 335

Val Glu Asn Asn Asp Ile Ile Ile Leu Thr Pro Gln Ile Leu Val Asn

340 345 350

Cys Leu Thr Asn Gly Thr Ile Pro Ser Leu Ser Val Phe Thr Leu Met

355 360 365

Ile Phe Asp Glu Cys His Asn Thr Ser Lys Gln His Pro Tyr Asn Val

370 375 380

Ile Met Phe Asn Tyr Leu Asp Arg Lys Leu Gly Gly Ser Ser Asp Ser

385 390 395 400

Leu Pro Gln Val Ile Gly Leu Thr Ala Ser Val Gly Val Gly Asp Ala

405 410 415

Lys Asn Lys Ala Glu Ala Thr Glu Tyr Ile Cys Lys Leu Cys Ala Ser

420 425 430

Leu Asp Thr Ser Val Ile Ala Thr Val Arg Asp Asn Leu Glu Glu Leu

435 440 445

Glu Glu Val Val Tyr Lys Pro Gln Lys Phe Phe Arg Lys Val Glu Leu

450 455 460

Arg Thr Thr Asp Arg Phe Lys Cys Ile Ile Ser Gln Leu Met Met Glu

465 470 475 480

Ile Glu Ser Leu Ala Lys Ser Ile Phe Glu Glu Leu Gly Thr Ile Thr

485 490 495

Leu Gly Gly Leu Phe Gln Ile Gln Asn Ser Asn Phe Gly Thr Gln Lys

500 505 510

Tyr Glu Gln Trp Ile Val Lys Val Gln Lys Glu Cys Ala Val Phe Gln

515 520 525

Met Pro Asp Lys Asp Lys Glu Ser Arg Ile Cys Lys Ala Leu Phe Ser

530 535 540

Tyr Met Ser His Leu Arg Ile Tyr Asn Asp Ala Leu Ile Ile Asn Glu

545 550 555 560

His Ala Arg Met Lys Asp Ala Leu Asp Tyr Leu Lys Asp Phe Phe Arg

565 570 575

Asn Ile Arg Ala Ala Gly Phe Asp Glu Ile Glu Gln Asp Leu Thr Gln

580 585 590

Arg Phe Glu Glu Lys Leu Gln Glu Leu Glu Ser Ile Ser Ile Asp Pro

595 600 605

Ser Asn Glu Asn Pro Lys Leu Arg Asp Leu Cys Phe Ile Leu Gln Glu

610 615 620

Glu Tyr His Leu Asn Pro Glu Thr Arg Thr Ile Leu Phe Val Lys Thr

625 630 635 640

Arg Ala Leu Val Asp Ala Leu Lys Lys Trp Ile Lys Glu Asn Pro Lys

645 650 655

Leu Ser Phe Leu Lys Pro Ser Ile Leu Thr Gly Arg Gly Lys Thr Asn

660 665 670

Gln Asn Ile Gly Met Thr Leu Pro Ala Gln Lys Cys Val Leu Asp Thr

675 680 685

Phe Arg Thr Asp Lys Asp Asn Lys Ile Leu Ile Thr Thr Ser Val Ala

690 695 700

Asp Glu Gly Ile Asp Ile Ala Gln Cys Asn Leu Val Ile Leu Tyr Glu

705 710 715 720

Tyr Val Gly Asn Val Ile Lys Met Ile Gln Thr Arg Gly Arg Gly Arg

725 730 735

Ala Arg Gly Ser Lys Cys Phe Leu Leu Thr Ala Asn Ala Asp Leu Ile

740 745 750

Asp Lys Glu Lys Met Asn Met Tyr Lys Glu Glu Met Met Asn Gly Ala

755 760 765

Ile Leu Ile Leu Gln Thr Trp Asp Glu Ala Val Phe Lys Glu Lys Ile

770 775 780

His Gln Ile Gln Ile Arg Glu Lys Ile Ile Arg Asp Asn Gln Gly Lys

785 790 795 800

Pro Glu Pro Val Pro Asp Lys Lys Thr Lys Lys Leu Leu Cys Lys Lys

805 810 815

Cys Lys Ala Phe Ala Cys Tyr Thr Ala Asp Ile Arg Met Val Glu Lys

820 825 830

Cys His Phe Thr Val Val Gly Asp Ala Phe Arg Glu Arg Phe Val Ser

835 840 845

Lys Leu His Pro Lys Pro Lys Ser Phe Gly Asn Ile Glu Lys Arg Ala

850 855 860

Lys Ile Tyr Cys Ala Arg Pro Asp Cys Ser His Asp Trp Gly Ile Tyr

865 870 875 880

Val Arg Tyr Lys Ala Phe Glu Met Pro Phe Ile Lys Ile Glu Ser Phe

885 890 895

Val Val Glu Asp Ile Ala Thr Gly Val Gln Thr Val His Ala Lys Trp

900 905 910

Lys Asp Phe Asn Phe Glu Lys Leu Ser Phe Asp Ala Ala Glu Met Ala

915 920 925

Gly Gly Ala Gln Asp Leu Gly Leu Gln Gly Met Gly Asn Leu Glu Pro

930 935 940

Ile Thr Ser

945

<210> 3

<211> 3084

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtcgtcgg atgggtattc cgcggaccag aatttctgct atctcatctc gtgtttcagg 60

gccagagtga aaaggtacat tcaggtggag ccggtattgg actacttgac ctttctgcct 120

gcagaggtga aggagcagat tcagagggcg gtcgccacca ctgggaacat aaacgcagct 180

gaactgcttc tgaacacttt ggagaagggg gtctggcccc ccggctggac taggatgttt 240

gtgcaggctc tccgggaaac aggcaactcc ttagcggccc gctacgtgaa ccccgatctc 300

accgacttgc cctctccatc ctttgagagc tctcatgatg agtgtctcca actgctgaac 360

cttcttcagc ctacagtggt ggacaagctt ctggttaccg atgtcttgga taaatgtgtg 420

gaggagcaac tgttgacagg tgaagacaga aatcgggttt ctgctgcaga aaatgatgga 480

aatgaatcag gagtaaggga gctcctgaaa aggattgtgc agaaagaaaa ctggttttct 540

acatttctga cagttctgag acaaacagga aatgatgcac ttgcccgcga attaacaggc 600

accgattgct gtgaaagcaa tgcagaatct gacgatttat taggagaaaa tggtcctgaa 660

gttcaagagc ctctcctttt agccacagat cagccaagtc tggacgtctc ggacatagag 720

aaaagttcac tggaatcatc ttttgcagat tcttctgtag tttcagaatc agacacaagt 780

ttggcagaag gaagtgtcag ctgcttagat gaaagtcttg gacataacag caacatgggc 840

agtgattcag gcaccatggg aagtgattca gatgaagaga ctgtggctca aagagcatcc 900

cctgagccag agctgcatct caggccttac caactggaag tggcccagcc agctctggag 960

ggaaagaata tcattatatg cctccctacc gggagtggga aaaccagagt ggccgtgtac 1020

attgccaagg atcacttgga caagaagaaa gaagcttctg aacctggaaa agttatagtc 1080

cttgtcaata aggtaccatt agttgaacag ctcttccgca aagagttcga accatttttg 1140

aagaaatggt atcgtgttac tagattaagt ggtgataccc aattgaaaat aacatttcca 1200

gaagttgtca agtcttgtga tgttattatc agtacagctc aaatccttga aaactccctt 1260

ttaaactcag aagaaggaga agaccctggt gtacagctgt cagacttttc tctcatcatc 1320

attgacgaat gccatcacac caacaaagaa gcagtctata ataacatcat gaggcgttat 1380

ttgaaacaga aattgaaaaa caataaactc aagaaagaag agaaaccagt gattccctta 1440

cctcagatat tgggactaac agcctcacca ggtgttgggg gagccaaaaa gcaagccaaa 1500

gctgaagaac atattttaaa aatatgtgcc aatcttgatg catttaccat taaaactgtg 1560

aaaaaaaata ttaatcaact taaagaccaa ataaaggagc catgcaaaaa gtttgtaatc 1620

gcagatgaca ccagagaaga tctgtttaaa gatagacttc tagaaataat gacaaacatt 1680

caaacttttt gccaaattag tcctatgtcg gattttggaa ctcaacccta tgaacaatgg 1740

ctcattcaaa tggaaaaaaa agctgcaaga gacggaaatc gcaaagatcg tgtttgtgca 1800

gaacatttga aaaagtacaa tgaggctcta caaattaatg atacaatccg aaggattgat 1860

gcctataatc accttaaaac tttctacaat gatgagaaag aaaagaagtt tgaagtcctg 1920

gaagatgaca gtgatgacaa tggagatgat agtgataacg atgaagatga gaatgatgaa 1980

aagaaacctt caaaactgga tgaatcagat atatttctca tgactttatt tttgagaaac 2040

aagaaaatat tgaagaagct ggctgaaaac ccagaatatg aaaatgaaaa gctgaccaaa 2100

ttaagaaaca ccataatgga acattttaca aggactgagg aatcagcacg aggaataatt 2160

ttcacaaaaa cacgacagag tgcatatgcc ctttcccagt ggattactga caataaaaaa 2220

tttgcagaag taggagtcaa agcccaccat ctgattggag ctggacacag cagtgagttc 2280

aagcccatga cacagaatga acaaagagaa gtcattagta aatttcgcac gggaaaaata 2340

aatctgctta tcgctaccac ggtggcagaa gaaggtctgg atattaaaga gtgtaatatc 2400

gttattcgat atggtctcgt cactaatgaa atagccatgg tccaggcccg tggtcgagcc 2460

agagctgatg agagcaccta cgtcctggtt gcccaaagtg gctctggagt tattgaacgt 2520

gagaccgtta atgatttccg agagaaaatg atgtataaag ctatagaccg tgttcaaaat 2580

atgaaaccag aagagtatgc tcataagatt ttggaattac agatgcaaag tataatggaa 2640

aagaaaatga aaatcaagag aagtattgca aagcaatgca aggacaaccc atcattaata 2700

agttttctat gcaaaaactg cagtgtgcta gcctgctctg gagaagatat ccacataatt 2760

gagaagatgc accatgtcaa catgacacca gagttcaaga acctgtatat tgtgagagga 2820

aacaaggcac tgcagacgaa gtttgctgac tatcaaacaa atggcgagat aatctgcaaa 2880

aaatgtggcc aagcttgggg aacgatgatg gtgcacaaag gcttagattt gccttgtctc 2940

aaaataaaga attatgtagt ggctttcaaa aataatttat ttaagaaaca atacaaaaag 3000

tgggtagaat tacccatcac atttcccgat cttaactatt cagaatattg tttgtctagt 3060

gatgaggacc ccatcaccag ctag 3084

<210> 4

<211> 1027

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ser Ser Asp Gly Tyr Ser Ala Asp Gln Asn Phe Cys Tyr Leu Ile

1 5 10 15

Ser Cys Phe Arg Ala Arg Val Lys Arg Tyr Ile Gln Val Glu Pro Val

20 25 30

Leu Asp Tyr Leu Thr Phe Leu Pro Ala Glu Val Lys Glu Gln Ile Gln

35 40 45

Arg Ala Val Ala Thr Thr Gly Asn Ile Asn Ala Ala Glu Leu Leu Leu

50 55 60

Asn Thr Leu Glu Lys Gly Val Trp Pro Pro Gly Trp Thr Arg Met Phe

65 70 75 80

Val Gln Ala Leu Arg Glu Thr Gly Asn Ser Leu Ala Ala Arg Tyr Val

85 90 95

Asn Pro Asp Leu Thr Asp Leu Pro Ser Pro Ser Phe Glu Ser Ser His

100 105 110

Asp Glu Cys Leu Gln Leu Leu Asn Leu Leu Gln Pro Thr Val Val Asp

115 120 125

Lys Leu Leu Val Thr Asp Val Leu Asp Lys Cys Val Glu Glu Gln Leu

130 135 140

Leu Thr Gly Glu Asp Arg Asn Arg Val Ser Ala Ala Glu Asn Asp Gly

145 150 155 160

Asn Glu Ser Gly Val Arg Glu Leu Leu Lys Arg Ile Val Gln Lys Glu

165 170 175

Asn Trp Phe Ser Thr Phe Leu Thr Val Leu Arg Gln Thr Gly Asn Asp

180 185 190

Ala Leu Ala Arg Glu Leu Thr Gly Thr Asp Cys Cys Glu Ser Asn Ala

195 200 205

Glu Ser Asp Asp Leu Leu Gly Glu Asn Gly Pro Glu Val Gln Glu Pro

210 215 220

Leu Leu Leu Ala Thr Asp Gln Pro Ser Leu Asp Val Ser Asp Ile Glu

225 230 235 240

Lys Ser Ser Leu Glu Ser Ser Phe Ala Asp Ser Ser Val Val Ser Glu

245 250 255

Ser Asp Thr Ser Leu Ala Glu Gly Ser Val Ser Cys Leu Asp Glu Ser

260 265 270

Leu Gly His Asn Ser Asn Met Gly Ser Asp Ser Gly Thr Met Gly Ser

275 280 285

Asp Ser Asp Glu Glu Thr Val Ala Gln Arg Ala Ser Pro Glu Pro Glu

290 295 300

Leu His Leu Arg Pro Tyr Gln Leu Glu Val Ala Gln Pro Ala Leu Glu

305 310 315 320

Gly Lys Asn Ile Ile Ile Cys Leu Pro Thr Gly Ser Gly Lys Thr Arg

325 330 335

Val Ala Val Tyr Ile Ala Lys Asp His Leu Asp Lys Lys Lys Glu Ala

340 345 350

Ser Glu Pro Gly Lys Val Ile Val Leu Val Asn Lys Val Pro Leu Val

355 360 365

Glu Gln Leu Phe Arg Lys Glu Phe Glu Pro Phe Leu Lys Lys Trp Tyr

370 375 380

Arg Val Thr Arg Leu Ser Gly Asp Thr Gln Leu Lys Ile Thr Phe Pro

385 390 395 400

Glu Val Val Lys Ser Cys Asp Val Ile Ile Ser Thr Ala Gln Ile Leu

405 410 415

Glu Asn Ser Leu Leu Asn Ser Glu Glu Gly Glu Asp Pro Gly Val Gln

420 425 430

Leu Ser Asp Phe Ser Leu Ile Ile Ile Asp Glu Cys His His Thr Asn

435 440 445

Lys Glu Ala Val Tyr Asn Asn Ile Met Arg Arg Tyr Leu Lys Gln Lys

450 455 460

Leu Lys Asn Asn Lys Leu Lys Lys Glu Glu Lys Pro Val Ile Pro Leu

465 470 475 480

Pro Gln Ile Leu Gly Leu Thr Ala Ser Pro Gly Val Gly Gly Ala Lys

485 490 495

Lys Gln Ala Lys Ala Glu Glu His Ile Leu Lys Ile Cys Ala Asn Leu

500 505 510

Asp Ala Phe Thr Ile Lys Thr Val Lys Lys Asn Ile Asn Gln Leu Lys

515 520 525

Asp Gln Ile Lys Glu Pro Cys Lys Lys Phe Val Ile Ala Asp Asp Thr

530 535 540

Arg Glu Asp Leu Phe Lys Asp Arg Leu Leu Glu Ile Met Thr Asn Ile

545 550 555 560

Gln Thr Phe Cys Gln Ile Ser Pro Met Ser Asp Phe Gly Thr Gln Pro

565 570 575

Tyr Glu Gln Trp Leu Ile Gln Met Glu Lys Lys Ala Ala Arg Asp Gly

580 585 590

Asn Arg Lys Asp Arg Val Cys Ala Glu His Leu Lys Lys Tyr Asn Glu

595 600 605

Ala Leu Gln Ile Asn Asp Thr Ile Arg Arg Ile Asp Ala Tyr Asn His

610 615 620

Leu Lys Thr Phe Tyr Asn Asp Glu Lys Glu Lys Lys Phe Glu Val Leu

625 630 635 640

Glu Asp Asp Ser Asp Asp Asn Gly Asp Asp Ser Asp Asn Asp Glu Asp

645 650 655

Glu Asn Asp Glu Lys Lys Pro Ser Lys Leu Asp Glu Ser Asp Ile Phe

660 665 670

Leu Met Thr Leu Phe Leu Arg Asn Lys Lys Ile Leu Lys Lys Leu Ala

675 680 685

Glu Asn Pro Glu Tyr Glu Asn Glu Lys Leu Thr Lys Leu Arg Asn Thr

690 695 700

Ile Met Glu His Phe Thr Arg Thr Glu Glu Ser Ala Arg Gly Ile Ile

705 710 715 720

Phe Thr Lys Thr Arg Gln Ser Ala Tyr Ala Leu Ser Gln Trp Ile Thr

725 730 735

Asp Asn Lys Lys Phe Ala Glu Val Gly Val Lys Ala His His Leu Ile

740 745 750

Gly Ala Gly His Ser Ser Glu Phe Lys Pro Met Thr Gln Asn Glu Gln

755 760 765

Arg Glu Val Ile Ser Lys Phe Arg Thr Gly Lys Ile Asn Leu Leu Ile

770 775 780

Ala Thr Thr Val Ala Glu Glu Gly Leu Asp Ile Lys Glu Cys Asn Ile

785 790 795 800

Val Ile Arg Tyr Gly Leu Val Thr Asn Glu Ile Ala Met Val Gln Ala

805 810 815

Arg Gly Arg Ala Arg Ala Asp Glu Ser Thr Tyr Val Leu Val Ala Gln

820 825 830

Ser Gly Ser Gly Val Ile Glu Arg Glu Thr Val Asn Asp Phe Arg Glu

835 840 845

Lys Met Met Tyr Lys Ala Ile Asp Arg Val Gln Asn Met Lys Pro Glu

850 855 860

Glu Tyr Ala His Lys Ile Leu Glu Leu Gln Met Gln Ser Ile Met Glu

865 870 875 880

Lys Lys Met Lys Ile Lys Arg Ser Ile Ala Lys Gln Cys Lys Asp Asn

885 890 895

Pro Ser Leu Ile Ser Phe Leu Cys Lys Asn Cys Ser Val Leu Ala Cys

900 905 910

Ser Gly Glu Asp Ile His Ile Ile Glu Lys Met His His Val Asn Met

915 920 925

Thr Pro Glu Phe Lys Asn Leu Tyr Ile Val Arg Gly Asn Lys Ala Leu

930 935 940

Gln Thr Lys Phe Ala Asp Tyr Gln Thr Asn Gly Glu Ile Ile Cys Lys

945 950 955 960

Lys Cys Gly Gln Ala Trp Gly Thr Met Met Val His Lys Gly Leu Asp

965 970 975

Leu Pro Cys Leu Lys Ile Lys Asn Tyr Val Val Ala Phe Lys Asn Asn

980 985 990

Leu Phe Lys Lys Gln Tyr Lys Lys Trp Val Glu Leu Pro Ile Thr Phe

995 1000 1005

Pro Asp Leu Asn Tyr Ser Glu Tyr Cys Leu Ser Ser Asp Glu Asp Pro

1010 1015 1020

Ile Thr Ser

1025

<210> 5

<211> 2058

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atggagctgc gaccctacca gtgggaggtg atcatgcccg ctctggaggg caggaatatc 60

atcatatggc tgcccacggg cgctggcaag accagggcgg ctgcttatgt ggccaagagg 120

catctggaga ctgtggatgg agccaaggtg gttgtgctgg tcaacagggt gcacctggtg 180

acccagcatt gtgaggagtt cagccgcatg ctggacagac gctgggccat taccaccctg 240

agcggggaca tggggccacg agccggcttt ggccacctgg cccggagcca tgatctgctc 300

atctgcacag ctgagctgct acagatggcg ctgaccagcg aggaggagga ggagcacgtg 360

gagctcaacg tcttctctct gctggtggtg gatgagtgtc accacacaca caaagacacc 420

gtctacaaca tcatcctgag ccagtacctg aagcataaat tccagaggag gaagccgctg 480

ccgcaggtgc tcgggctcac agcctcccca ggcacaggca gggcctcgac gctcgatggc 540

gccattgacc acatcctgca gctctgtgcc aacctggata cgtggcgcat catgtcaccc 600

cagaactccc gctcccagct gcaggagcac agccggcagc cctgcaaaca gtacgacctc 660

tgccaccagc gtgcccagga cccgtttggg gccaagctga agaagctcat ggacaaaatc 720

caccgccatc tggagatgcc ggagttgaga cgggactttg ggactcagac atacgagcag 780

caagtggtgg agctgagcca agctgcggct gaggcggggc tccaggagcg gagggtgtat 840

gcgcttcacc tgcgtcgcta caatgatgcg ctgctcatcc acgacacagt ccgcgcggtg 900

gacgccctgg ccacgctgcg ggatttctac accagggagc gcgccaccaa gacccagatc 960

ctacaggctg agcgctggct gctggcgctg tttgatgatc acaagaatga gctggcccgc 1020

ctggcagctg atggcccaga gaacccgaaa ctggaggtgc tgaaagaaat cctgcagaag 1080

cagttcaagg gtccccagag cccccggggc atcatcttca cccgaacccg ccagagcgct 1140

cactccctcc tgctgtggct ccagcagcag ccgagcctgc agactgtgga catcagggcc 1200

cagctgttga ttggggctgg gaacagcagc cagagcaccc cgatgaccca gatgacccag 1260

agggaccagc aagaagtgat ccagaagttc cggactggtg ccttgaacct cctggtggcc 1320

acgagtgtgg cagaggaggg gctggacatc ccccagtgca acgtggtggt gcgctatggg 1380

ctcctgacca atgagatctc catggtccag gcaaggggcc gggcccgggc cagtcaaagc 1440

gtatactcgt ttgtggcagc ccaaggcagc cgggagctgc ggcgggagca gactaatgag 1500

gcgctggaga gtctgatgga acaggcggtg gctgctgtgc aggcgatgga ccaggccgag 1560

taccaggcca agatccagga gctgcagcgg gcagccttgg ttaagcgggc agcccgggca 1620

gcccagcaga agagtcggca gcagaagttc ctggcagagc aagtgcagct cctgtgcatc 1680

aactgcatgg tggccatggg ctacgggagt gacctgcgga aggtggagag tgcccaccat 1740

gtcaacgtga accccaactt caagatctac tacaacgtct cccaggagcc tgtggtcatt 1800

gacagagtct tcaaggactg gaggcccggg ggtgtcattc gctgcaggaa ctgtggggag 1860

agctggggca tgcagataat ctacaagtcc gtgaagctgc cagtgctcaa agtccgcagt 1920

gtgcttctgg agacgcccaa cgggcggatc caggtcaaga aatggtcctg cgtgcccttc 1980

ccggtgcctg acttcgatta cacgcagtat tgcaccgaga gcctgaccga cctctccctg 2040

gacgatatca ccagctag 2058

<210> 6

<211> 685

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Glu Leu Arg Pro Tyr Gln Trp Glu Val Ile Met Pro Ala Leu Glu

1 5 10 15

Gly Arg Asn Ile Ile Ile Trp Leu Pro Thr Gly Ala Gly Lys Thr Arg

20 25 30

Ala Ala Ala Tyr Val Ala Lys Arg His Leu Glu Thr Val Asp Gly Ala

35 40 45

Lys Val Val Val Leu Val Asn Arg Val His Leu Val Thr Gln His Cys

50 55 60

Glu Glu Phe Ser Arg Met Leu Asp Arg Arg Trp Ala Ile Thr Thr Leu

65 70 75 80

Ser Gly Asp Met Gly Pro Arg Ala Gly Phe Gly His Leu Ala Arg Ser

85 90 95

His Asp Leu Leu Ile Cys Thr Ala Glu Leu Leu Gln Met Ala Leu Thr

100 105 110

Ser Glu Glu Glu Glu Glu His Val Glu Leu Asn Val Phe Ser Leu Leu

115 120 125

Val Val Asp Glu Cys His His Thr His Lys Asp Thr Val Tyr Asn Ile

130 135 140

Ile Leu Ser Gln Tyr Leu Lys His Lys Phe Gln Arg Arg Lys Pro Leu

145 150 155 160

Pro Gln Val Leu Gly Leu Thr Ala Ser Pro Gly Thr Gly Arg Ala Ser

165 170 175

Thr Leu Asp Gly Ala Ile Asp His Ile Leu Gln Leu Cys Ala Asn Leu

180 185 190

Asp Thr Trp Arg Ile Met Ser Pro Gln Asn Ser Arg Ser Gln Leu Gln

195 200 205

Glu His Ser Arg Gln Pro Cys Lys Gln Tyr Asp Leu Cys His Gln Arg

210 215 220

Ala Gln Asp Pro Phe Gly Ala Lys Leu Lys Lys Leu Met Asp Lys Ile

225 230 235 240

His Arg His Leu Glu Met Pro Glu Leu Arg Arg Asp Phe Gly Thr Gln

245 250 255

Thr Tyr Glu Gln Gln Val Val Glu Leu Ser Gln Ala Ala Ala Glu Ala

260 265 270

Gly Leu Gln Glu Arg Arg Val Tyr Ala Leu His Leu Arg Arg Tyr Asn

275 280 285

Asp Ala Leu Leu Ile His Asp Thr Val Arg Ala Val Asp Ala Leu Ala

290 295 300

Thr Leu Arg Asp Phe Tyr Thr Arg Glu Arg Ala Thr Lys Thr Gln Ile

305 310 315 320

Leu Gln Ala Glu Arg Trp Leu Leu Ala Leu Phe Asp Asp His Lys Asn

325 330 335

Glu Leu Ala Arg Leu Ala Ala Asp Gly Pro Glu Asn Pro Lys Leu Glu

340 345 350

Val Leu Lys Glu Ile Leu Gln Lys Gln Phe Lys Gly Pro Gln Ser Pro

355 360 365

Arg Gly Ile Ile Phe Thr Arg Thr Arg Gln Ser Ala His Ser Leu Leu

370 375 380

Leu Trp Leu Gln Gln Gln Pro Ser Leu Gln Thr Val Asp Ile Arg Ala

385 390 395 400

Gln Leu Leu Ile Gly Ala Gly Asn Ser Ser Gln Ser Thr Pro Met Thr

405 410 415

Gln Met Thr Gln Arg Asp Gln Gln Glu Val Ile Gln Lys Phe Arg Thr

420 425 430

Gly Ala Leu Asn Leu Leu Val Ala Thr Ser Val Ala Glu Glu Gly Leu

435 440 445

Asp Ile Pro Gln Cys Asn Val Val Val Arg Tyr Gly Leu Leu Thr Asn

450 455 460

Glu Ile Ser Met Val Gln Ala Arg Gly Arg Ala Arg Ala Ser Gln Ser

465 470 475 480

Val Tyr Ser Phe Val Ala Ala Gln Gly Ser Arg Glu Leu Arg Arg Glu

485 490 495

Gln Thr Asn Glu Ala Leu Glu Ser Leu Met Glu Gln Ala Val Ala Ala

500 505 510

Val Gln Ala Met Asp Gln Ala Glu Tyr Gln Ala Lys Ile Gln Glu Leu

515 520 525

Gln Arg Ala Ala Leu Val Lys Arg Ala Ala Arg Ala Ala Gln Gln Lys

530 535 540

Ser Arg Gln Gln Lys Phe Leu Ala Glu Gln Val Gln Leu Leu Cys Ile

545 550 555 560

Asn Cys Met Val Ala Met Gly Tyr Gly Ser Asp Leu Arg Lys Val Glu

565 570 575

Ser Ala His His Val Asn Val Asn Pro Asn Phe Lys Ile Tyr Tyr Asn

580 585 590

Val Ser Gln Glu Pro Val Val Ile Asp Arg Val Phe Lys Asp Trp Arg

595 600 605

Pro Gly Gly Val Ile Arg Cys Arg Asn Cys Gly Glu Ser Trp Gly Met

610 615 620

Gln Ile Ile Tyr Lys Ser Val Lys Leu Pro Val Leu Lys Val Arg Ser

625 630 635 640

Val Leu Leu Glu Thr Pro Asn Gly Arg Ile Gln Val Lys Lys Trp Ser

645 650 655

Cys Val Pro Phe Pro Val Pro Asp Phe Asp Tyr Thr Gln Tyr Cys Thr

660 665 670

Glu Ser Leu Thr Asp Leu Ser Leu Asp Asp Ile Thr Ser

675 680 685

Claims

1.猪RIG-I样受体特异性单克隆抗体，其特征在于：所述猪RIG-I样受体特异性单克隆抗体为猪RIG-I蛋白特异性单克隆抗体、猪MDA5蛋白特异性单克隆抗体和/或猪LGP2蛋白特异性单克隆抗体，所述猪RIG-I蛋白特性单克隆抗体由杂交瘤细胞株pRIG-I mAb产生，所述猪MDA5蛋白特异性单克隆抗体由杂交瘤细胞株pMDA5 mAb产生，所述猪LGP2蛋白特异性单克隆抗体由杂交瘤细胞株pLGP2 mAb A1-3或杂交瘤细胞株pLGP2 mAb B9-2产生；所述杂交瘤细胞株pRIG-I mAb的保藏编号为CCTCC NO:C2022133，所述杂交瘤细胞株pMDA5 mAb的保藏编号为CCTCC NO:C2022134，所述杂交瘤细胞株pLGP2 mAb A1-3的保藏编号为CCTCC NO:C2022135，所述杂交瘤细胞株pLGP2 mAb B9-2的保藏编号为CCTCC NO:C2022136。

2.根据权利要求1所述一种猪RIG-I样受体特异性单克隆抗体，其特征在于：所述猪RIG-I蛋白特性单克隆抗体能够识别RIG-I蛋白的C端Δ2CARDs片段（201-943 aa），所述猪MDA5蛋白特异性单克隆抗体能够识别MDA5蛋白的C端Δ2CARDs片段（201-1023 aa），所述猪LGP2蛋白特异性单克隆抗体能够识别LGP2蛋白的N端L1（1-200 aa）片段。

3.根据权利要求1所述一种猪RIG-I样受体特异性单克隆抗体，其特征在于：所述猪RIG-I蛋白特性单克隆抗体、猪MDA5蛋白特异性单克隆抗体、猪LGP2蛋白特异性单克隆抗体均为IgG2b的同型免疫球蛋白。

4.如权利要求1至3任一项所述一种猪RIG-I样受体特异性单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤2、利用猪pRIG-I蛋白、猪pMDA5蛋白、猪LGP2蛋白分别对动物进行免疫，分离出脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合，筛选出阳性的杂交瘤细胞株pRIG-I mAb、pMDA5 mAb、pLGP2 mAb A1-3、pLGP2 mAb B9-2；

步骤3、在动物腹腔内分别接种杂交瘤细胞株pRIG-I mAb、pMDA5 mAb、pLGP2 mAb A1-3、pLGP2 mAb B9-2，将动物腹水液分离、纯化制备猪RIG-I蛋白、猪MDA5蛋白、猪LGP2蛋白特异性单克隆抗体。

5.如权利要求1至3任一项所述一种猪RIG-I样受体特异性单克隆抗体在免疫学检测中的应用。

6.根据权利要求5所述一种猪RIG-I样受体特异性单克隆抗体在免疫学检测中的应用，其特征在于：包括酶联免疫吸附试验、蛋白质印迹、免疫荧光和免疫组织化学。