CN108484758B - 抗埃博拉病毒vp40蛋白单克隆抗体a2g7及其应用 - Google Patents
抗埃博拉病毒vp40蛋白单克隆抗体a2g7及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种抗埃博拉病毒VP40蛋白单克隆抗体A2G7及其应用。该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，能与ZEBOV‑VP40蛋白N端抗原肽特异性结合，发挥抗病毒效应；产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆和传代流程筛选后获得的杂交瘤细胞，能稳定分泌A2G7，抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.1，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。A2G7具备拮抗扎伊尔型埃博拉病毒样颗粒的抗病毒效应，可以其它单抗联合应用。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及抗扎伊尔型埃博拉病毒VP40蛋白单克隆抗体的制备及应用，是利用细胞工程、抗体工程技术，获得分泌抗VP40蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞系，通过同品系的小鼠诱导腹水，制备抗VP40蛋白的单克隆抗体A2G7，鉴定为IgG1、κ型，通过基因测序明确抗体的序列，再通过亲和纯化、电泳、免疫、基因工程等技术实现对该抗体的应用。
背景技术
埃博拉病毒病是由埃博拉病毒感染引起的致死性出血热。1976年，埃博拉病毒首次在苏丹南部和刚果（金）（旧称扎伊尔）发现，后陆续在中非地区小规模爆发，截止2013年，共造成2387人发病，死亡1310例，病死率54.9%。2014年埃博拉病毒再次爆发，以扎伊尔型埃博拉病毒为主要毒株，席卷西非，并跨越大洲，美国、英国、西班牙相继发生埃博拉病例。截止2016年12月31日，共报告28712例病例（含确诊及可疑病例），死亡11372例，死亡率39.6%。尽管自西非疫情以来，针对埃博拉病毒快速诊断、抗病毒药物、疫苗等研究等方面已经取得很大进展，但目前国际上仍没有特异的治疗手段和可供临床推广应用的疫苗。埃博拉病毒病已经成为国际性重大传染病，研究抗埃博拉病毒治疗对人类的安全至关重要。
研究表明，埃博拉病毒GP及VP40蛋白在埃博拉病毒病的致病机制中担任重要作用，GP蛋白与病毒入侵、胞膜融合密切相关，VP40蛋白在促进膜融合，维持病毒颗粒完整性,协助病毒出芽等方面发挥重要作用。因此，GP及VP40蛋白是研究药物、疫苗等的重要靶点。目前，有多种埃博拉病毒GP及VP40单克隆抗体得到鉴定，但多数用于快速诊断，仅有数个GP单克隆抗体在灵长类动物模型上验证了抗病毒效应，譬如，GP单克隆抗体mAb114; 2个GP单克隆抗体的联合抗体MIL77E；3个GP单克隆抗体的联合：MB-003, ZMab 和 ZMappTM。当前，仅ZMappTM 正在开展I/II期临床试验。但是具备抗埃博拉病毒效应的VP40单克隆抗体未见报道。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供了一种抗埃博拉病毒VP40蛋白单克隆抗体A2G7及其应用。
一种抗埃博拉病毒VP40蛋白单克隆抗体A2G7，该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，能与ZEBOV-VP40蛋白N端抗原肽特异性结合，发挥抗病毒效应；
产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆和传代流程筛选后获得的杂交瘤细胞，能稳定分泌A2G7，抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.1，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
一种所述的单克隆抗体A2G7的制备方法，通过以下步骤获得：
（1）小鼠免疫：选择6周龄的BALB/C雄性小鼠，以针对ZEBOV-VP40蛋白N端的特异的抗原肽15肽 ARSNSTIARGGNSNC ，SEQ ID No.3，对小鼠进行免疫，总共免疫3次，第1次免疫予100μg抗原肽加佐剂混匀后予小鼠大腿内侧肌肉注射免疫，第21天时，同等剂量抗原肽及佐剂混合物免疫第2次，第35天时，同等剂量抗原肽及佐剂混合物免疫第3次；第38天处理小鼠，用于融合实验；
（2）小鼠骨髓瘤细胞的培养：培养小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并使其保持良好的生长状态用于杂交瘤细胞融合；
（3）细胞融合：采用聚乙二醇细胞融合法，以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，接种BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，用含20% FCS 的HAT培养基培养一天，将步骤（1）中备好的小鼠人道处死，取出脾脏，获取脾脏淋巴细胞，收集步骤（2）中的小鼠骨髓瘤细胞，将上述两种细胞混合离心，然后以聚乙二醇PEG 6000介导细胞融合，融合后的细胞适当稀释，接种至细胞培养板，适当条件培养；
（4）杂交瘤细胞的筛选：将上述培养物在含HAT选择性培养基中培养，吸取培养上清液以酶联免疫吸附检测法做抗体鉴定，筛选阳性克隆；
（5）杂交瘤细胞的克隆化培养：以有限稀释法稀释阳性克隆的杂交瘤细胞，将稀释到一定密度的细胞接种至96孔细胞培养板，使每孔只有一个杂交瘤细胞生长，形成细胞集落的孔予吸取上清液做酶联免疫吸附检测，筛选和鉴定阳性克隆，直到杂交瘤细胞种植孔的阳性率达到100％，将克隆化后的杂交瘤细胞扩大培养并做抗体理化性状分析和鉴定；
（6）小鼠腹水的诱生：在接种杂交瘤细胞前1周，给BALB/C小鼠腹腔注射降植烷0.5ml/只，然后每只接种生长良好的5×106阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水离心，测定抗体效价，并纯化腹水中的单克隆抗体；
（7）单克隆抗体的纯化：利用Protein G亲和纯化法纯化腹水中的单克隆抗体。
一种所述的单克隆抗体A2G7的应用，用于检测在ZEBOV-VP40蛋白的表达，或者用于中和扎伊尔型埃博拉病毒。
所述的扎伊尔型埃博拉病毒为构建的扎伊尔型埃博拉病毒样颗粒ZEBOV-trVLPs。
所述的单克隆抗体A2G7与抗GP单克隆抗体ZJEB8-01、抗VP40单克隆抗体G7A6、抗VP40单克隆抗体F1B4之中的一个或者多个联合应用。
本发明的有益效果：A2G7具备抗病毒效应，A2G7与抗GP单克隆抗体（ZJEB8-01）、其他抗VP40单克隆抗体(G7A6、F1B4)的联合应用具备更显著的抗病毒效应，将为抗扎伊尔型埃博拉病毒的治疗提供新的参考方案。
附图说明
图1. 单克隆抗体A2G7的免疫球蛋白亚型分析；
图2. 单克隆抗体A2G7的腹水、培养上清液效价检测；
图3. ZEBOV-trVLPs感染体外复制模型构建；
图4. 单克隆抗体A2G7拮抗trVLPs后检测trVLPs RNA水平；
图5. 单克隆抗体A2G7拮抗trVLPs后检测trVLPs GP蛋白表达；
图6. 单克隆抗体联合应用拮抗trVLPs后检测trVLPs RNA水平；
图7. 单克隆抗体联合应用拮抗trVLPs后检测trVLPs GP蛋白表达。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例来进一步阐述本发明。
本发明选定扎伊尔型埃博拉病毒VP40蛋白为靶抗原，利用现代生物信息学和分子生物学技术，设计并合成针对VP40蛋白的特异抗原肽序列，采用融合杂交瘤技术建立稳定分泌抗VP40蛋白特异抗原蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞系，并大量制备、纯化和鉴定这些单克隆抗体。该单克隆抗体的成功获得，不仅为建立新型的埃博拉病毒病诊断方法——基于免疫学技术的诊断奠定基础，而且也为VP40单克隆抗体抗病毒及VP40单克隆抗体与GP单克隆抗体联合抗病毒的研究提供科学依据，为抗埃博拉病毒的治疗提供了新的方案。同时对疾病发病机理、诊断、预后及疗效判定等方面的研究起到重要作用。
本发明用到杂交瘤细胞技术。该技术将免疫小鼠的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以建立分泌均质抗体的杂交瘤细胞系，也称为单克隆抗体技术。该技术涉及到动物免疫、细胞培养、细胞融合、细胞克隆培养和免疫测定等一系列方法。
实施例1. 抗埃博拉VP40蛋白的单克隆抗体A2G7的制备
（1）小鼠的免疫：首次免疫，将交联KLH的埃博拉VP40蛋白的15肽（ARSNSTIARGGNSNC）与QuickAntibody-mouse5W按体积1:1混合均匀，总体积100ul。每BALB/C小鼠0.1ml（埃博拉VP40蛋白抗原肽100ug），大腿内侧肌肉注射。第21天按同样方式加强免疫一针。第35天采微量尾血进行ELISA测定，抗体滴度达到1:32000，随即尾静脉注射加强免疫一次，于3天后进行细胞融合。
（2）小鼠骨髓瘤细胞SP2/0的培养：把来自BALB/C小鼠的SP2/0骨髓瘤细胞株以含10% FBS-DMEM培养基培养传代，在含5％CO2饱和湿度的37°C孵箱中培养。融合前一天传代以保证融合时细胞进入对数生长期。
（3）细胞融合：以BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞作为饲养细胞，在融合前一天，接种BALB/C小鼠腹腔巨噬细胞于96孔培养板，含20% FCS 的HAT培养基培养一天，次日取脾脏，采用压力注水法分离脾细胞，离心洗涤细胞1～2次后用培养液重悬。收集小鼠SP2/0骨髓瘤细胞，离心，洗涤2次后用培养液重悬，作为待融合的SP2/0细胞。以1.0×108个免疫小鼠脾淋巴细胞与1.0×107个小鼠骨髓瘤细胞SP2/0混合，在50%PEG6000作用下融合。两种细胞混合后洗涤一次，离心弃上清，轻弹管壁悬开细胞（勿加液体）用37℃预温的50% PEG6000（pH8.0）0.8 ml于60～90秒内逐滴加入细胞沉淀中，其间轻轻振摇离心管，但勿吹打，静置1分钟，然后按先慢后快的原则，于第1分钟内加完1 ml无血清RPMI 1640，于第2分钟内加完2ml无血清RPMI 1640，于第3分钟内加完7 ml无血清RPMI 1640，以后1分钟内逐渐加入37℃预温的无血清RPMI1640培养基30～40 ml。800转/分钟低速离心5～10分钟。然后加入20%FCS HAT培养基，分别接种到加有饲养细胞的96孔培养板，一般每次融合的细胞铺4块板，置37℃ 5%CO2孵箱中培养。
（4）杂交瘤细胞的筛选：每隔4天换1/2培养液（HAT）一次，10天后改用含HT培养液。融合后的杂交瘤细胞在含HT的选择性培养液中大约持续培养两周。在细胞集落长到适当大小时（在10倍物镜下观察，细胞克隆大小以占满一个视野为宜），吸取培养液上清，适当稀释后做ELISA，筛选阳性克隆。
采用ELISA间接法筛选阳性杂交瘤克隆，主要步骤：
1） 0.01M pH9.6碳酸盐缓冲液稀释埃博拉VP40蛋白多肽，浓度1000ng/ml，分别于96孔酶标板加入0.1ml/孔包板，4℃过夜；2）0.01M pH7.4 PBS-Tween 20洗板三次；3）用2%BSA-0.01M pH 7.2的PBS封闭2小时；4）同上洗板；5）加入1:5稀释的杂交瘤培养上清，0.1ml/孔，同时设阳性对照（免疫小鼠的血清）、阴性对照（SP2/0培养上清液）和空白对照，室温反应2小时；6）洗板；7）加1:5000稀释的羊抗小鼠Ig (G+M)-HRP，0.1ml/孔，室温反应1小时；8）洗板；9）加入底物（TMB）室温避光反应5~10分钟；10）2M H2SO4终止反应；450nm测定其OD值，以P/N≥2.1为阳性。
（5）杂交瘤细胞的克隆化：杂交瘤细胞的克隆化培养按有限稀释法进行，选择抗体检测阳性（合成的埃博拉VP40蛋白多肽阳性）的杂交瘤孔细胞作适当增殖后，准确计数细胞。用完全1640培养基稀释成10个/ml的细胞悬液接种到已有饲养细胞的96孔培养板中，每孔0.1ml，7-10天后观察细胞生长情况，并检测上清液中抗体水平，选择5个抗体滴度最高的，呈单个克隆细胞生长的培养孔，作再次克隆化培养。此方法可重复多次，直至单克隆孔抗体检测阳性率为100%。
（6）诱生腹水：在接种杂交瘤细胞前一周，给BALB/C小鼠腹腔注射降植烷每只0.5ml，然后每只接种5.0×106阳性杂交瘤细胞，10天后收集腹水测定抗体效价。
（7）单克隆抗体的纯化：采用亲和纯化法(Protein G交联的Sepharose)纯化腹水中单克隆抗体。1）腹水用冷Binding Buffer（结合缓冲液）稀释3倍后, 于4℃ 10000rpm 离心15分钟去除沉淀物。2）将预装有Sepharose-Protein G 的亲和纯化柱用10倍柱床体积的Binding Buffer充分流洗。3）将稀释的腹水上柱，控制流速8～10滴/分钟。4）将流穿的腹水重复上柱一次。5）用20倍柱床体积的Binding Buffer充分洗涤，直至流穿液A280吸光值小于0.01。6）用Elution Buffer（洗脱缓冲液）洗脱结合的单克隆抗体，控制流速8～10滴/分钟，收集洗脱液于预加有0.1ml的磷酸钾缓冲液（PH7.9，0.5M）的收集管中，每管收集0.5ml含抗体的洗脱液，共收集20管以上。7）于A280nm检测每管洗脱液的吸光度，并收集吸光值大于0.2的洗脱液。8）将收集的洗脱液置于透析卡中，并于0.1M PH7.0 的PBS中透析。每隔6小时换液一次，共透析24小时。9）将透析后的抗体溶液稀释（1:100）后，于280nm测蛋白含量。10）将纯化的抗体分装于小管中，置于低温冰箱备用。
（8）单克隆抗体的亚型鉴定: 采用Serotec公司的小鼠单克隆抗体免疫球蛋白分型试剂盒分析。将纯化的单抗作适当稀释后进行检测，操作严格按试剂盒说明书进行。试验结果为 A2G7杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体为IgG1、κ型（图1），其余两株G7A6、F1B4杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体亦为IgG1、κ型。
A2G7杂交瘤细胞系经3次克隆化，持续培养六月余，分泌抗体稳定。该细胞株经液氮冻存，复苏后生长良好，抗体分泌未见衰退（图2）。抗体的重链氨基酸序列如SEQ IDNo.1，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
实施例2.抗扎伊尔型埃博拉VP40蛋白的单克隆抗体A2G7抗病毒效应、A2G7与抗GP单克隆抗体（ZJEB8-01）、其他抗VP40单克隆抗体(G7A6、F1B4)联合应用抗病毒效应的研究
本实验通过下述途径实现：
（1）构建扎伊尔型埃博拉病毒样颗粒（ZEBOV-trVLPs）体外复制模型（图3）。ZEBOV-trVLPs能模拟ZEBOV合成迷你型丝状病毒样颗粒，具备入侵、复制等基本功能，但无生物危害性；该trVLPs系统广泛应用于模拟ZEBOV的研究，对于筛选病毒受体、抗病毒药物等研究具有重要意义。
（2）超速离心收集trVLPs颗粒，予A2G7单抗剂量梯度（3, 5, 10, 15μg/ml）分别与trVLPs (MIO=3)在体外轻摇孵育1h后，加入293T细胞培养板（24孔板）；设未加抗体的trVLPs为对照组。孵育48h后，弃上清液，PBS清洗3次，抽提细胞总RNA，予埃博拉检测试剂盒（上海之江，QR-0220-02）做实时定量PCR法检测细胞内trVLPs- RNA水平（图4）。
（3）超速离心收集trVLPs颗粒，予A2G7单抗浓度梯度（3, 5, 10, 15μg/ml）分别与trVLPs (MIO=6)在体外轻摇孵育1h后，加入293T细胞培养板（6孔板）；设未加抗体的trVLPs为对照组。孵育48h后，弃上清液，PBS清洗3次，抽提细胞总蛋白质，予蛋白免疫印迹技术（Western Blot）检测细胞内trVLPs GP蛋白表达（图5）。
（4）超速离心收集trVLPs颗粒，予ZJEB8-01（5μg/ml）+ A2G7（5μg/ml）、G7A6（5μg/ml）+A2G7（5μg/ml）、F1B4（5μg/ml）+ A2G7（5μg/ml）混匀后分别与trVLPs (MIO=3)在体外轻摇孵育1h后，加入293T细胞培养板（24孔板）；设A2G7（10μg/ml）组及未加抗体的trVLPs为对照组。孵育48h后，弃上清液，PBS清洗3次，抽提细胞总RNA，予埃博拉检测试剂盒（上海之江，QR-0220-02）做实时定量PCR法检测细胞内trVLPs- RNA水平（图6）。
（5）超速离心收集trVLPs颗粒，予ZJEB8-01（5μg/ml）+ A2G7（5μg/ml）、G7A6（5μg/ml）+A2G7（5μg/ml）、F1B4（5μg/ml）+ A2G7（5μg/ml）混匀后分别与trVLPs (MIO=6)在体外轻摇孵育1h后，加入293T细胞培养板（6孔板）；设A2G7（10μg/ml）组及未加抗体的trVLPs为对照组。孵育48h后，弃上清液，PBS清洗3次，抽提细胞总蛋白质，予蛋白免疫印迹技术（Western Blot）检测细胞内trVLPs GP蛋白表达（图7）。
图6、7结果表明，A2G7在剂量为10μg/ml时，能显著降低细胞内trVLPs-RNA水平及GP蛋白的表达，在15μg/ml时，能达到更好的效果；抗体联合应用抗病毒的研究中，在抗体总剂量为10μg/ml的情况下，ZJEB8-01（5μg/ml）+ A2G7（5μg/ml）、G7A6（5μg/ml）+A2G7（5μg/ml）、F1B4（5μg/ml）+ A2G7 （5μg/ml）的联合抗病毒效应均明显优于A2G7（10μg/ml）单独抗病毒效应。
实验结果表明，A2G7具备抗病毒效应，A2G7与抗GP单克隆抗体（ZJEB8-01）、其他抗VP40单克隆抗体(G7A6、F1B4)的联合应用具备更显著的抗病毒效应，将为抗扎伊尔型埃博拉病毒的治疗提供新的参考方案。
序列表
<110> 浙江大学
<120> 抗埃博拉病毒VP40蛋白单克隆抗体A2G7及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 139
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 1
Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Val Thr Asp
1 5 10 15
Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Phe Val Lys
20 25 30
Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr Ser Tyr Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu
50 55 60
Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Arg Asp Gly Val Thr Asn Tyr Ser
65 70 75 80
Ala Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser
85 90 95
Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Thr Tyr Tyr Ser Asp Trp Asp Tyr Ala Met Asp Ser
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 2
<211> 132
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<400> 2
Met Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg
1 5 10 15
Glu Thr Asn Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser
20 25 30
Val Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser
35 40 45
Leu Leu Tyr Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asn Trp Phe Leu Gln Arg
50 55 60
Pro Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp
65 70 75 80
Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe
85 90 95
Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr
100 105 110
Cys Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Leu Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys
115 120 125
Leu Glu Leu Lys
130
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Ala Arg Ser Asn Ser Thr Ile Ala Arg Gly Gly Asn Ser Asn Cys
1 5 10 15
Claims (1)
1.一种抗埃博拉病毒VP40蛋白单克隆抗体A2G7，其特征在于，该单克隆抗体亚型为IgG1、κ型，能与ZEBOV-VP40蛋白N端抗原肽特异性结合，发挥抗病毒效应；
产生该单克隆抗体的杂交瘤细胞是由免疫的BALB/C小鼠脾淋巴细胞和小鼠骨髓瘤细胞SP2/0经融合、筛选、克隆和传代流程筛选后获得的杂交瘤细胞，能稳定分泌A2G7，抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID No.1，轻链氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
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| GR01 | Patent grant | ||
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