CN110551213B - 抗丝状病毒单克隆中和抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了抗丝状病毒单克隆中和抗体及其制备方法和应用，所述单克隆中和抗体的抗原结合片段的重链可变区包括如SEQ ID NO:13或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；所述抗原结合片段的轻链可变区包括如SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。本发明的抗原结合片段从成年中国猕猴体内获得，经人源化后对丝状病毒科的扎依尔型、苏丹型和马尔堡型三种假病毒均具有良好的中和活性，对GP蛋白具有较强的亲和力；所述单克隆中和抗体可潜在地应用于抗丝状病毒治疗药物研究、丝状病毒检测试剂盒研制以及丝状病毒抗原检测的分子生物学试剂等。

Description

抗丝状病毒单克隆中和抗体及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及抗丝状病毒单克隆中和抗体及其制备方法和应用。
背景技术
丝状病毒为单股负链RNA病毒，是感染包括人在内的灵长类动物的具有极高致死率的病原体，对感染后的灵长类会引起严重的出血热，主要分为埃博拉病毒属、马尔堡病毒属和奎瓦病毒属。其中，埃博拉病毒属包括扎依尔型(ZEBOV)、苏丹型(SUDV)、莱斯顿型(RESTV)、塔伊森林型(TAFV)和本迪布焦型(BDBV)5个种，埃博拉病毒的平均致死率约为50％，从感染埃博拉病毒至发病为止的潜伏期为2～21天，感染埃博拉病毒后，初期症状表现为疲劳发热、肌肉痛、头痛以及咽喉痛，继而出现呕吐、腹泻、发疹、肾功能以及肝功能受损、外出血等症状。目前国际上还未有特异性的上市治疗药物，因此对丝状病毒的诊断与治疗的研究显得尤其重要。
GP蛋白是I型跨膜蛋白，由676个氨基酸残基组成，相对分子质量为150000-170000，是埃博拉病毒表面棘突的唯一结构蛋白，通过与受体结合介导病毒进入宿主细胞，在病毒入侵、胞膜融合等方面发挥重要的作用，同时GP蛋白能诱导产生中和抗体，是研制疫苗的重要靶点。国际上已经研制出三种抗体混合的药物ZMapp，但是治疗效果有限且不确切，且该抗体在临床I期缺乏有效性和安全性。
CN105087497A公开了杂交瘤细胞株ZJEB8-01、抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体及其制备和应用，所述杂交瘤细胞株ZJEB8-01可用于分泌抗埃博拉病毒GP蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体与博拉病毒GP蛋白的第412-431位氨基酸序列抗原肽具有高的特异性和灵敏性，可应用于制备埃博拉病毒GP蛋白检测试剂。CN107541522A公开了抗埃博拉病毒GP蛋白的单克隆抗体及其应用，所述抗埃博拉病毒GP蛋白的单克隆抗体由保藏号为CCTCC NO:C2016106的杂交瘤细胞株所分泌的，所述单克隆抗体特异性强、生物结合活性好，与感染含GP基因的重组杆状病毒感染的sf9细胞发生反应，而不与正常的sf9细胞反应，可应用于制备检测埃博拉病毒GP蛋白的试剂盒和免疫分析上。然而，上述单克隆抗体对马尔堡病毒属和奎瓦病毒属不具有生物活性。
因此，提供一种针对丝状病毒家族多个致病株的重组抗体，在丝状病毒的诊断与治疗领域具有重要意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了抗丝状病毒单克隆中和抗体及其制备方法和应用，所述单克隆中和抗体基于猕猴实验技术平台制备得到，解决了丝状病毒抗体在实际诊断和治疗方面的问题，为建立丝状病毒检测、诊断、预防和治疗提供了新的方案。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种抗丝状病毒GP蛋白的抗原结合片段，所述抗原结合片段的重链可变区包括如SEQ ID NO:1或如SEQ ID NO:7所示的重链CDR3；
所述抗原结合片段的轻链可变区包括如SEQ ID NO:4或如SEQ ID NO:10所示的轻链CDR3；
SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列为：TRGGSDNHRYFYY；
SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列为：GECHTIDGQDGCL；
SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列为：ARDHSTYYYGNGFSS；
SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列为：LQAYSVPYS.
优选地，所述抗原结合片段的重链可变区还包括如SEQ ID NO:2或如SEQ ID NO:8所示的重链CDR2，如SEQ ID NO:3或如SEQ ID NO:9所示的重链CDR1；
优选地，所述抗原结合片段的轻链可变区还包括如SEQ ID NO:5或如SEQ ID NO:11所示的轻链CDR2，如SEQ ID NO:6或如SEQ ID NO:12所示的轻链CDR1；
SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列为：IFGSAM；
SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列为：GFTVSSYW；
SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列为：VNSDGTQ；
SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列为：SEHSNYF；
SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列为：ISSDGSKK；
SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列为：GFTFSNFG；
SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列为：ATS；
SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列为：QIISDH.
优选地，所述抗原结合片段的重链可变区包括如SEQ ID NO:13或如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；
所述抗原结合片段的轻链可变区包括如SEQ ID NO:14或如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列为：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTVSSYWMSWVRQAPGKGLEWLSDIFGSAMYYGDSVKGRFTVSRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCTRGGSDNHRYFYYWGQGVLVTVSS；
SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列为：
QSVLTQPPSASASLGASVKLTCTLSSEHSNYFIIWYQQRPGRSPRYIMKVNSDGTQNKGDGIPDRFLGSSSGADRYLTISNLQSDDEAEYYCGECHTIDGQDGCLFGGGTRLTVL；
SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列为：
EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNFGLHWVRQAPGKGLDWVAVISSDGSKKYYVDSVQHRFTISRDDSKNILYLQMNNLKLEDTAVYYCARDHSTYYYGNGFSSWGQGVLVTVSS；
SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列为：
DIVMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQIISDHLSWYQQKPGKAPKLLIYATSNLESGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDLASYYCLQAYSVPYSFGQGTKVEIK.
本发明中，选择成年中国猕猴作为实验动物，以扎依尔型GP蛋白、苏丹型GP蛋白和马尔堡病毒GP蛋白作为抗原进行免疫，得到的单克隆中和抗体与人基因的同源性高。
第二方面，本发明提供了一种单克隆中和抗体，所述单克隆中和抗体包括：
重链可变区，所述重链可变区包括如SEQ ID NO:13或如SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列；以及
轻链可变区，所述轻链可变区包括如SEQ ID NO:14或如SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
本发明中，SEQ ID NO:13所示的抗体重链与SEQ ID NO:14所示的抗体轻链配对产生单克隆中和抗体7D10，SEQ ID NO:15所示的抗体重链与SEQ ID NO:16所示的抗体轻链配对产生单克隆中和抗体7E10。
优选地，所述单克隆中和抗体还包括人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区中的任意一种或至少两种的组合，优选为人源IgG1恒定区。
本发明中，通过同源重组将可变区基因与人源IgG1恒定区序列进行连接构建抗体表达载体，实现了抗体的人源化。
本发明中，单克隆中和抗体7D10和单克隆中和抗体7E10对扎依尔型、苏丹型、马尔堡型三种假病毒均具有良好的中和活性，最大半数结合浓度和最大半数抑制浓度可以达到较高的水平，两种单克隆中和抗体均可以潜在地应用于抗丝状病毒治疗药物研究、丝状病毒检测试剂盒研制以及丝状病毒抗原检测的分子生物学试剂等。
第三方面，本发明提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括编码如第一方面所述的抗原结合片段和/或如第二方面所述的单克隆中和抗体的重链可变区和/或轻链可变区的DNA片段。
优选地，所述单克隆中和抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO:17或如SEQ ID NO:19所示的核酸分子；
优选地，所述单克隆中和抗体的轻链可变区包括如SEQ ID NO:18或如SEQ ID NO:20所示的核酸分子。
SEQ ID NO:17所示的核酸分子为：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTCCAGCCTGGAGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCGTTAGCAGCTACTGGATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCGGGAAAGGGGCTGGAGTGGCTTTCAGACATTTTTGGTAGTGCCATGTACTACGGAGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGAGACAATGCCAAGAACTCGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACGGCCGTGTATTATTGTACTAGAGGGGGAAGTGATAACCATCGTTACTTTTACTACTGGGGCCAGGGAGTCCTGGTCACCGTCTCTTCAG；
SEQ ID NO:18所示的核酸分子为：
CAGTCTGTGCTGACCCAGCCCCCGTCTGCATCTGCCTCGTTGGGAGCCTCTGTCAAGCTCACCTGCACCCTGAGCAGTGAGCACAGCAACTACTTTATTATCTGGTATCAACAGAGACCAGGGAGGTCTCCCCGGTATATAATGAAGGTTAACAGTGATGGCACCCAGAACAAGGGGGATGGGATCCCCGATCGCTTCTTGGGCTCCAGCTCTGGGGCTGACCGCTACCTCACCATCTCCAACCTCCAGTCTGATGACGAGGCTGAGTATTACTGTGGAGAGTGCCACACGATTGATGGCCAGGACGGTTGCTTATTCGGAGGAGGGACCCGGCTCACCGTCCTAG；
SEQ ID NO:19所示的核酸分子为：
GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGAGGAGGCTTGGTTCAGCCTGGGGGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAATTTTGGCCTACACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGACTGGGTGGCAGTTATATCGTCTGATGGAAGTAAGAAATACTATGTAGACTCTGTGCAGCACCGATTCACCATCTCCAGAGACGATTCCAAGAATATACTATATCTTCAAATGAACAACCTGAAATTGGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCACTCCACGTATTACTATGGTAATGGTTTTTCCTCCTGGGGCCAGGGAGTCCTGGTCACCGTCTCCTCAG；
SEQ ID NO:20所述的核酸分子为：
GATATTGTGATGACTCAGTCTCCATCTTCCCTGTCTGCATCGGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCAGGGCAAGTCAGATCATTAGCGATCATTTAAGTTGGTATCAGCAGAAACCAGGAAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTACATCCAATTTGGAAAGCGGGGTCCCGTCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGAATTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATCTTGCATCTTATTACTGTCTACAGGCTTATAGTGTCCCGTACAGTTTTGGCCAGGGGACCAAGGTGGAGATCAAAC.
第四方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括如第三方面所述的核酸分子。
优选地，所述表达载体还包括编码人源IgG1恒定区的核酸分子。
优选地，所述表达载体为pCMV。
第五方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞转染有如第三方面所述的核酸分子和/或如第四方面所述的表达载体。
优选地，所述宿主细胞包括293T细胞或CHO细胞。
第六方面，本发明提供了一种制备如第一方面所述的抗原结合片段和/或如第二方面所述的单克隆中和抗体的方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将获取的B细胞进行RT-PCR，获得抗体重链可变区的核酸分子和轻链可变区的核酸分子；
(2)分别将步骤(1)所述的重链可变区的核酸分子和轻链可变区的核酸分子连接入表达载体，转入感受态细胞，培养后挑取单克隆细胞进行筛选；
(3)将筛选后的表达载体转入宿主细胞，培养并收集上清液，分离纯化得到所述单克隆中和抗体。
优选地，步骤(1)所述B细胞来源于猕猴。
本发明中，利用猕猴实验技术平台，制备单克隆中和抗体，克服了小鼠与人基因同源性较低的缺陷，通过对抗体的人源化过程解决了丝状病毒抗体在实际诊断和治疗方面的问题。
优选地，步骤(1)所述B细胞的获取方法包括以下步骤：
(1’)采用扎依尔型GP蛋白、苏丹型GP蛋白和马尔堡病毒GP蛋白的混合物作为抗原，对猕猴进行免疫；
(2’)获取免疫后猕猴的外周血单个核细胞，对B细胞进行抗体标记，利用流式细胞分选术，分选得到所述B细胞。
本发明中，采用丝状病毒扎依尔型、苏丹型(GenBank：KT878488.1)和马尔堡型病毒(GenBank：JX458858.1)的GP蛋白作为抗原，利用免疫学和分子生物学技术，通过多次免疫，从中国猕猴体内分离得到亲和成熟的抗体基因，构建得到稳定的人源化抗GP蛋白的单克隆中和抗体表达载体。
优选地，步骤(1’)所述扎依尔型GP蛋白、苏丹型GP蛋白和马尔堡病毒GP蛋白的摩尔比为(0.5～1):(0.5～1):(0.8～1)，例如可以是0.5:0.5:0.8、0.5:0.5:1、0.5:1:0.8、0.5:1:1、1:0.5:0.8、1:0.5:1、1:1:0.8或1:1:1，优选为1:1:1。
优选地，步骤(2’)所述抗体标记采用CD3抗体、CD20抗体、CD27抗体、IgG抗体和抗组氨酸抗体进行。
本发明中，RT-PCR采用Premega公司的逆转录试剂盒(cat：A5000/A5001)进行。
第七方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括如第一方面的所述抗原结合片段、如第二方面所述的单克隆中和抗体、如第三方面所述的核酸分子、如第四方面所述的表达载体或如第五方面所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
第八方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括如第一方面的所述抗原结合片段、如第二方面所述的单克隆中和抗体、如第三方面所述的核酸分子、如第四方面所述的表达载体或如第五方面所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述试剂盒还包括洗涤液。
第九方面，本发明提供了一种如第一方面的所述抗原结合片段、如第二方面所述的单克隆中和抗体、如第三方面所述的核酸分子、如第四方面所述的表达载体、如第五方面所述的宿主细胞、如第七方面所述的药物组合物或如第八方面所述的试剂盒在制备丝状病毒治疗药物和/或检测试剂中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明选择猕猴为实验动物，制备单克隆中和抗体，克服了小鼠与人基因同源性较低的缺陷；
(2)本发明以扎依尔型GP蛋白、苏丹型GP蛋白和马尔堡病毒GP蛋白作为抗原进行免疫，将得到的可变区基因与人源IgG1恒定区序列进行连接构建抗体表达载体，得到的单克隆中和抗体与人基因的同源性高，实现了抗体的人源化；
(3)本发明制备的单克隆中和抗体稳定性好，对扎依尔型、苏丹型、马尔堡型三种假病毒具有良好的中和活性，最大半数结合浓度和最大半数抑制浓度可以达到较高的水平；
(4)本发明的单克隆中和抗体可潜在地应用于抗丝状病毒治疗药物研究、丝状病毒检测试剂盒研制以及丝状病毒抗原检测的分子生物学试剂等。
附图说明
图1为第3次加强免疫后血清ELISA检测重组抗体对GP蛋白的结合力；
图2(A)为分选出的活细胞群，图2(B)为分选出的B细胞群，如图2(C)为分选出的能够分泌IgG的记忆B细胞群，图2(D)为分选出的能够与抗原特异性结合的记忆B细胞；
图3为巢式PCR扩增重组抗体7D10重、轻链可变区基因，其中，泳道1为抗体重链可变区基因，泳道2为抗体轻链可变区基因，泳道3为DNA分子量(DL2000)；
图4(A)为单克隆中和抗体7D10重链人源化质粒图谱，图4(B)为单克隆中和抗体7D10 Lambda链人源化质粒图谱，图4(C)为单克隆中和抗体7E10重链人源化质粒图谱，图4(D)为单克隆中和抗体7E10 Lambda链人源化质粒图谱；
图5(A)为制备的单克隆中和抗体7D10对3种GP蛋白的结合活性检测结果，图5(B)为制备的单克隆中和抗体7E10对3种GP蛋白的结合活性检测结果；
图6(A)为制备的单克隆中和抗体7D10对3种假病毒中和活性的检测结果，图6(B)为制备的单克隆中和抗体7E10对3种假病毒的中和活性检测结果。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1猕猴免疫和外周血单个核细胞的获取
本实施例选择成年中国猕猴，以扎依尔型GP蛋白、苏丹型GP蛋白和马尔堡病毒GP蛋白的混合物作为抗原，对猕猴进行3次免疫：第1天第一次在猕猴前肢肌肉注射各200μg扎依尔型GP蛋白(ZEBOV-GP)、苏丹型GP蛋白(SUDV-GP)、马尔堡病毒GP蛋白(MARV-GP)和铝佐剂的混合物；第14天第二次注射同等剂量的抗原蛋白和铝佐剂的混合物；第28天第三次注射同等剂量的抗原蛋白和铝佐剂的混合物，随后在第35天和第42天分别取猕猴抗凝血。如图1所示，将血清进行梯度稀释进行ELISA实验，检测血清中抗体对抗原的结合活性，说明血清中存在对抗原具有结合能力的抗体。
将猕猴抗凝血进行密度梯度离心，初步得到猕猴外周血单个核细胞(PBMC)，利用红细胞吸水涨破原理，裂解PBMC中的红细胞，通过多次清洗，去除PBMC中的杂质，得到纯化的PBMC，具体步骤如下：
(1)向15mL离心管加入5mL淋巴细胞分离液，并将9mL抗凝血缓慢轻柔加入到淋巴细胞分离液液面上，室温1000×g离心30min；
(2)将离心后的样品的中间白色层加入到新的离心管中，并加入1640培养基至8mL；
(3)向离心管中加入8mL PBS缓冲液清洗去除杂质，300×g离心5min，用吸泵吸取液体，加入1.5mL PBS进行重悬，得到纯化的PBMC；
(4)向1.5mL EP管加入300μL PBMC，加入终浓度为10μg/mL的ZEBOV-GP；向1.5mLEP管加入300μL PBMC，加入终浓度为10μg/ml的SUDV-GP；向1.5mL EP管加入300μL PBMC，加入终浓度为10μg/ml的MARV-GP；将加入GP蛋白的PBMC在37℃下孵育30min，剩余PBMC液氮冻存。
实施例2抗原特异性B细胞的标记与分选
将得到的猕猴PBMC利用抗体标记技术，采用CD3抗体、CD20抗体、CD27抗体、IgG抗体和抗组氨酸抗体进行标记，利用流式细胞分选术，分选单个GP蛋白特异性B细胞，具体步骤如下：
(1)将制备的PBMC离心弃孵育上清，加入1mL PBS缓冲液，400×g离心5min，弃上清；
(2)先加入1μL Aqua，4℃孵育20min，随后加入1mL PBS，400×g离心5min，弃上清；
(3)加入如表1所示的荧光标记抗体，4℃染色30min，染色结束加入1mL PBS，400×g离心5min，最后加入300μL PBS重悬，4℃冰箱孵育，进行上机分选。
表1抗体标记体系
Figure BDA0002237753130000131
如图2(A)所示，首先通过流式细胞仪采集所有细胞的物理数据，分选出淋巴细胞和单个细胞群，通过死细胞荧光标记抗体分选出活细胞群；如图2(B)所示，利用CD3-CD20+分选出B细胞群；如图2(C)所示，通过CD27+IgG+分选出能够分泌IgG的记忆B细胞群；最后，如图2(D)所示，通过抗His标签的抗体分选出能够与抗原特异性结合的记忆B细胞。
实施例3利用RT-PCR从单个B细胞中分离抗体可变区基因
采用Promega公司生产的逆转录试剂盒配置细胞裂解液，分装至96孔板后，将细胞离心，加入反转试剂后反转成cDNA，反转录完成后置于-80℃冻存；
利用猕猴特异性引物通过巢式PCR，以B细胞cDNA为模板，扩增抗体的重、轻链可变区基因，50μL体系中含有5μL cDNA、HotStarTaq Plus酶、dNTPs、和0.5μM特异性引物，按以下条件进行PCR扩增：预变性94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃50s，35个循环；72℃7min；获得的PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，重组抗体7D10重、轻链可变区基因的电泳结果如图3所示。
回收目的片段，送样测序，测序结果与IMGT数据库(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/vquest)进行比对，得到如SEQ ID NO:17～18或如SEQ ID NO:19～20的抗体可变区基因片段。
实施例4构建单克隆中和抗体的表达载体
利用同源重组引物分别在抗体重链可变区基因的两端和轻可变区基因的两端加入同源重组臂，使用双酶将含有人抗体重、轻链IgG1恒定区的表达质粒线性化，产生同源重组臂；将加入同源重组臂的可变区基因片段和线性化的质粒通过同源重组的方式连接起来，构成完整的表达载体，其中，重组抗体重链人源化质粒图谱如图4(A)或图4(C)所示，轻链人源化质粒图谱如图4(B)或图4(D)所示，将重组产物转化进TOP10大肠杆菌感受态中，扩增质粒。
实施例5单克隆中和抗体的表达与纯化
将实施例4得到的重组抗体重、轻链表达质粒按照1:1比例加入到Opti-Mem转染培养基中，充分混合后加入DNA 4倍质量的转染试剂PEI，混合后，室温避光放置30min，随后加入到293T细胞中；
孵育6h后去除转染体系，加入FreeStyleTM293表达培养基，使用AKTA蛋白纯化系统，采用亲和纯化(Protein A)的方法纯化表达的抗体上清，得到单克隆中和抗体7D10或7E10，具体步骤为：
(1)将表达的抗体上清以2500×g室温离心10min，去除沉淀物；
(2)将装有Protein A的亲和纯化柱用10倍体积的结合缓冲液(Binding Buffer)充分流洗；
(3)将表达上清以5mL/min的流速通过纯化柱；
(4)使用20倍纯化柱体积的结合缓冲液(Binding Buffer)充分洗涤纯化柱；
(5)用0.1M pH＝3.0-3.5的柠檬酸缓冲液洗脱纯化柱，直至洗脱峰降至平衡状态，用1M pH＝9.0的Tris-HCl缓冲液调节pH为7.0；
(6)使用浓缩离心柱浓缩纯化后的单克隆中和抗体，用PBS作为抗体保存的缓冲液，最后用BSA蛋白浓度检测方法测定浓缩后的抗体浓度。
实施例6单克隆中和抗体亲和活性检测
采用ELISA方法检测单克隆中和抗体7D10或7E10对扎依尔型GP蛋白(Zaire GP)、苏丹型GP蛋白(Sudan GP)、马尔堡病毒GP蛋白(Marburg GP)三种GP蛋白的亲和活性，主要步骤如下：
(1)将3种GP蛋白用PBS稀释成1ng/μL，以每孔100μL加入到96孔酶标板中，4℃封闭过夜；
(2)弃上清，用0.01M的PBST洗板3次，用PBST配制含5％脱脂奶粉的封闭液，每孔加入100μL室温封闭2h；
(3)倒弃牛奶，用PBST清洗5遍，将纯化浓缩后的抗体进行梯度稀释，浓度从10μg/mL 5倍稀释至0.016μg/mL，100μg/孔，室温放置2h；
(4)弃抗体稀释液，用PBST清洗6遍，用1:5000封闭液稀释山羊抗人IgG-HRP，每孔加入100μL，室温放置2h；
(5)弃二抗稀释液，用PBST清洗6遍，加入TMB，100μL/孔，避光室温放置5min；
(6)每孔加入100μL 1M稀硫酸终止反应，在450nm处测定吸光度，以P/N>2.1为阳性。
结果如图5(A)和图5(B)所示，筛选的重组抗体7D10和7E10对扎依尔型GP蛋白(Zaire GP)、苏丹型GP蛋白(Sudan GP)、马尔堡病毒GP蛋白(Marburg GP)三种GP蛋白均具有结合活性，其中，重组抗体7D10对三种抗原的最大半数结合浓度(EC50)分别达到5.054μg/mL、2.645μg/mL和1.504μg/mL。
实施例7单克隆中和抗体中和活性检测
采用微量中和的方法检测单克隆中和抗体7D10和7E10对扎依尔型、苏丹型和马尔堡型三种丝状病毒的荧光报告假病毒感染的中和活性，主要步骤如下：
(1)第一天下午铺96孔Huh-7细胞，细胞数为5×104/100μL/孔，培养过夜；
(2)第二天培养36h后，稀释抗体和病毒，感染细胞；
(3)用PBS稀释抗体至浓度为100μg/mL，取100μL PBS加到96孔板的第二排至第6排中；取200μL稀释抗体加到96孔板的第一排中，随后取第一排的100μL稀释抗体至第二排中，吹打混匀后取100μL加入下一排孔中，每个稀释度设置三个复孔，依次稀释至最后一排孔后吸掉多余的100μL；
(4)病毒用DMEM培养基稀释，每孔加入100TCID50/20μL的假病毒，放入37℃培养箱中孵育30min，孵育结束后，取出铺有Huh-7细胞的96孔板，吸掉培养基；
(5)每孔加入200μL PBS洗去孔中的培养基，随后吸掉PBS；
(6)按照顺序吸取100μL中和后混合液到铺有Huh-7细胞的96孔板中，放入37℃细胞培养箱中，6h后吸掉液体，加入含10％FBS的DMEM培养基；放入培养箱，48h后检测；
(7)检测时，吸掉培养基，每孔加入50μL的Promega公司的Luciferase(E2620)检测试剂，混匀室温放置30min，随后将96孔板置于Turner BioSystems VeritusTM读值。
结果如图6(A)和图6(B)所示，重组抗体7D10对Zaire型、Sudan型和Marburg型三种假病毒均具有很好的中和效果，对三种假病毒的最大半数抑制浓度(IC50)分别为0.4391μg/mL、0.8923μg/mL和0.4907μg/mL；重组抗体7E10对Zaire型、Sudan型和Marburg型三种假病毒也具有很好的中和效果，对三种假病毒的IC50分别为0.47μg/mL、0.6399μg/mL和5.327μg/mL。
综上所述，本发明选择猕猴为实验动物，以扎依尔型GP蛋白、苏丹型GP蛋白和马尔堡病毒GP蛋白作为抗原进行免疫，将得到的可变区基因与人源IgG1恒定区序列进行连接构建抗体表达载体，得到的重组抗体与人基因的同源性高，实现了抗体的人源化；所述重组抗体稳定性好，对扎依尔型GP蛋白(Zaire GP)、苏丹型GP蛋白(Sudan GP)、马尔堡病毒GP蛋白(Marburg GP)具有结合活性；对扎依尔型、苏丹型、马尔堡型三种假病毒具有良好的中和活性，最大半数结合浓度和最大半数抑制浓度可以达到较高的水平；本发明的重组抗体的制备方法简便、重复性好。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院广州生物医药与健康研究院
<120> 抗丝状病毒单克隆中和抗体及其制备方法和应用
<130> 20190929
<160> 20
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 1
Thr Arg Gly Gly Ser Asp Asn His Arg Tyr Phe Tyr Tyr
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 2
Ile Phe Gly Ser Ala Met
1 5
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 3
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<212> PRT
<213> 人工合成
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<212> PRT
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<400> 5
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 6
Ser Glu His Ser Asn Tyr Phe
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 7
Ala Arg Asp His Ser Thr Tyr Tyr Tyr Gly Asn Gly Phe Ser Ser
1 5 10 15
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<213> 人工合成
<400> 8
Ile Ser Ser Asp Gly Ser Lys Lys
1 5
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 9
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<211> 9
<212> PRT
<213> 人工合成
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Leu Gln Ala Tyr Ser Val Pro Tyr Ser
1 5
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<212> PRT
<213> 人工合成
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Ala Thr Ser
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<212> PRT
<213> 人工合成
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Gln Ile Ile Ser Asp His
1 5
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 13
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Ser Asp Ile Phe Gly Ser Ala Met Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys Gly
50 55 60
Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln
65 70 75 80
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg
85 90 95
Gly Gly Ser Asp Asn His Arg Tyr Phe Tyr Tyr Trp Gly Gln Gly Val
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 14
<211> 115
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 14
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Ala Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Thr Cys Thr Leu Ser Ser Glu His Ser Asn Tyr Phe
20 25 30
Ile Ile Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Arg Ser Pro Arg Tyr Ile Met
35 40 45
Lys Val Asn Ser Asp Gly Thr Gln Asn Lys Gly Asp Gly Ile Pro Asp
50 55 60
Arg Phe Leu Gly Ser Ser Ser Gly Ala Asp Arg Tyr Leu Thr Ile Ser
65 70 75 80
Asn Leu Gln Ser Asp Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Gly Glu Cys His
85 90 95
Thr Ile Asp Gly Gln Asp Gly Cys Leu Phe Gly Gly Gly Thr Arg Leu
100 105 110
Thr Val Leu
115
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<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 15
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Phe
20 25 30
Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Ser Asp Gly Ser Lys Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
50 55 60
Gln His Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ile Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Leu Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp His Ser Thr Tyr Tyr Tyr Gly Asn Gly Phe Ser Ser Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 16
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工合成
<400> 16
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile Ser Asp His
20 25 30
Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Ser Tyr Tyr Cys Leu Gln Ala Tyr Ser Val Pro Tyr
85 90 95
Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 17
<211> 355
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 17
gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtccagc ctggagggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccgttagc agctactgga tgagctgggt ccgccaggct 120
ccgggaaagg ggctggagtg gctttcagac atttttggta gtgccatgta ctacggagac 180
tctgtgaagg gccgattcac cgtctccaga gacaatgcca agaactcgct gtatctgcaa 240
atgaacagcc tgagagccga ggacacggcc gtgtattatt gtactagagg gggaagtgat 300
aaccatcgtt acttttacta ctggggccag ggagtcctgg tcaccgtctc ttcag 355
<210> 18
<211> 346
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 18
cagtctgtgc tgacccagcc cccgtctgca tctgcctcgt tgggagcctc tgtcaagctc 60
acctgcaccc tgagcagtga gcacagcaac tactttatta tctggtatca acagagacca 120
gggaggtctc cccggtatat aatgaaggtt aacagtgatg gcacccagaa caagggggat 180
gggatccccg atcgcttctt gggctccagc tctggggctg accgctacct caccatctcc 240
aacctccagt ctgatgacga ggctgagtat tactgtggag agtgccacac gattgatggc 300
caggacggtt gcttattcgg aggagggacc cggctcaccg tcctag 346
<210> 19
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<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 19
gaggtgcagc tggtggagtc tggaggaggc ttggttcagc ctggggggtc cctgagactc 60
tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt aattttggcc tacactgggt ccgccaggct 120
ccagggaagg ggctggactg ggtggcagtt atatcgtctg atggaagtaa gaaatactat 180
gtagactctg tgcagcaccg attcaccatc tccagagacg attccaagaa tatactatat 240
cttcaaatga acaacctgaa attggaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatcac 300
tccacgtatt actatggtaa tggtttttcc tcctggggcc agggagtcct ggtcaccgtc 360
tcctcag 367
<210> 20
<211> 322
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 20
gatattgtga tgactcagtc tccatcttcc ctgtctgcat cggtaggaga cagagtcacc 60
atcacttgca gggcaagtca gatcattagc gatcatttaa gttggtatca gcagaaacca 120
ggaaaagccc ctaagctcct gatctatgct acatccaatt tggaaagcgg ggtcccgtca 180
aggttcagcg gcagtggatc tgggacagaa ttcactctca ccatcagcag cctgcagcct 240
gaagatcttg catcttatta ctgtctacag gcttatagtg tcccgtacag ttttggccag 300
gggaccaagg tggagatcaa ac 322

Claims (18)

1.一种抗丝状病毒GP蛋白的抗原结合片段，其特征在于，
所述抗原结合片段的重链可变区包括如SEQ ID NO: 13所示的氨基酸序列；
所述抗原结合片段的轻链可变区包括如SEQ ID NO: 14所示的氨基酸序列；或者
所述抗原结合片段的重链可变区包括如SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列；
所述抗原结合片段的轻链可变区包括如SEQ ID NO: 16所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗原结合片段，其特征在于，
所述抗原结合片段的重链可变区包括如SEQ ID NO: 1所示的重链CDR3；
所述抗原结合片段的轻链可变区包括如SEQ ID NO: 4所示的轻链CDR3；
所述抗原结合片段的重链可变区还包括如SEQ ID NO: 2所示的重链CDR2，如SEQ IDNO: 3所示的重链CDR1；
所述抗原结合片段的轻链可变区还包括如SEQ ID NO: 5所示的轻链CDR2，如SEQ IDNO: 6所示的轻链CDR1。
3.根据权利要求1所述的抗原结合片段，其特征在于，
所述抗原结合片段的重链可变区包括如SEQ ID NO: 7所示的重链CDR3；
所述抗原结合片段的轻链可变区包括如SEQ ID NO: 10所示的轻链CDR3；
所述抗原结合片段的重链可变区还包括如SEQ ID NO: 8所示的重链CDR2，如SEQ IDNO: 9所示的重链CDR1；
所述抗原结合片段的轻链可变区还包括如SEQ ID NO: 11所示的轻链CDR2，如SEQ IDNO: 12所示的轻链CDR1。
4.一种单克隆中和抗体，其特征在于，所述单克隆中和抗体包括权利要求1-3任一项所述的抗原结合片段。
5.根据权利要求4所述的单克隆中和抗体，其特征在于，所述单克隆中和抗体还包括人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区中的任意一种或至少两种的组合。
6.根据权利要求4所述的单克隆中和抗体，其特征在于，所述单克隆中和抗体包括人源IgG1恒定区。
7.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码如权利要求1-3任一项所述的抗原结合片段和/或如权利要求4-6任一项所述的单克隆中和抗体的重链可变区和轻链可变区的DNA片段。
8.根据权利要求7所述的核酸分子，其特征在于，编码所述单克隆中和抗体的重链可变区的DNA片段的序列如SEQ ID NO: 17所示，编码所述单克隆中和抗体的轻链可变区的DNA片段的序列如SEQ ID NO: 18所示；或者
编码所述单克隆中和抗体的重链可变区的DNA片段的序列如SEQ ID NO: 19所示，编码所述单克隆中和抗体的轻链可变区的DNA片段的序列如SEQ ID NO: 20所示。
9.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求7或8所述的核酸分子。
10.根据权利要求9所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体还包括编码人源IgG1恒定区的核酸分子。
11.根据权利要求10所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为pCMV。
12.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞转染有如权利要求7或8所述的核酸分子和/或如权利要求9-11任一项所述的表达载体。
13.根据权利要求12所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括293T细胞或CHO细胞。
14.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1-3任一项所述的抗原结合片段、如权利要求4-6任一项所述的单克隆中和抗体、如权利要求7或8所述的核酸分子、如权利要求9-11任一项所述的表达载体或如权利要求12或13所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合。
15.根据权利要求14所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。
16.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1-3任一项所述的抗原结合片段、如权利要求4-6任一项所述的单克隆中和抗体、如权利要求7或8所述的核酸分子、如权利要求9-11任一项所述的表达载体或如权利要求12或13所述的宿主细胞中的任意一种或至少两种的组合。
17.根据权利要求16所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括洗涤液。
18.一种如权利要求1-3任一项所述的抗原结合片段、如权利要求4-6任一项所述的单克隆中和抗体、如权利要求7或8所述的核酸分子、如权利要求9-11任一项所述的表达载体、如权利要求12或13所述的宿主细胞、如权利要求14或15所述的药物组合物或如权利要求16或17所述的试剂盒在制备丝状病毒治疗药物和/或检测试剂中的应用。
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