CN112661841B

CN112661841B - 一种中和新冠病毒新表位的全人单克隆抗体17-2及其应用

Info

Publication number: CN112661841B
Application number: CN202011406812.8A
Authority: CN
Inventors: 庾蕾; 温莺芬; 郭文靖
Original assignee: GUANGZHOU EIGHTH PEOPLE'S HOSPITAL
Current assignee: GUANGZHOU EIGHTH PEOPLE'S HOSPITAL
Priority date: 2020-12-04
Filing date: 2020-12-04
Publication date: 2022-10-14
Anticipated expiration: 2040-12-04
Also published as: CN112661841A

Abstract

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种中和新冠病毒新表位的全人单克隆抗体17‑2及其应用。本发明通过B细胞培养及单克隆抗体技术，成功筛选出针对S2的中和抗体17‑2。本发明提供的抗体17‑2，可与S蛋白及S2结合，其EC50分别为0.034μg/ml和0.038μg/mL，可有效中和SARS‑CoV‑2病毒。与其它表位的S1‑RBD和S1‑NTD抗体联合应用于SARS‑CoV‑2感染的预防和治疗。

Description

一种中和新冠病毒新表位的全人单克隆抗体17-2及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种中和新冠病毒新表位的全人单克隆抗体17-2及其应用。

背景技术

单克隆抗体 (monoclonal antibodies, mAbs) 无疑是最具潜力的一类用于诊断及治疗的生物制剂, 已应用于肿瘤、自身免疫性疾病及感染性疾病的治疗。人单抗的快速分离、高通量测序技术及结构生物学的发展等使得抗体成为快速应对新发传染性疾病的重要手段。

SARS-CoV-2借助病毒表面的刺突蛋白即S蛋白介导病毒与细胞膜的融合，进而入侵宿主细胞。S蛋白包括S1和S2两个亚单位，S1分为N-端（NTD）和受体结合（RBD）区域。病毒感染时，首先是S1-RBD与细胞膜上的受体结合激发S2构象变化，导致病毒与细胞膜融合而进入靶细胞。S1-RBD被认为是诱导宿主中和抗体产生的主要蛋白。因此，面对新型冠状病毒肺炎疫情，大多研究者采用表达RBD重组蛋白分选出RBD特异B细胞策略获得中和抗体。目前已陆续报道了这类RBD抗体，有些具有很强的中和病毒的能力（1.Science. 2020 Aug21;369(6506):956-963. 2. Nature. 2020 Aug;584(7821):450-456.）。但采取这种策略会丢失一些不针对S1-RBD的抗体，甚至会错过机体产生的具有重要抗病毒作用的抗体。比如针对S2的抗体,可能通过阻碍病毒与宿主细胞膜的融合而发挥作用。因此研究人员改变策略，采用S蛋白筛选抗体。国内外已有研究团队从感染康复者获得针对S1-NTD中和抗体（1.Nature. 2020 Aug;584(7821):450-456. 2. Science. 2020 Aug 7;369(6504):650-655.）。但目前为止未见有获得S2中和抗体的报道。

采用针对单一表位单抗作为抗病毒治疗容易出现病毒逃逸现象，即所谓的耐药性。因此常常联用针对不同表位的2-3个抗体作为抗病毒治疗策略。例如在对埃博拉病毒感染治疗时采用3种单抗混合的ZMapp鸡尾酒疗法（N Engl J Med. 2016 Oct 13;375(15):1448-1456. ）。

发明内容

针对现有技术普遍存在的缺陷，本发明提供了一种中和新冠病毒新表位的全人单克隆抗体17-2及其应用。本发明提供的抗体17-2，可与S蛋白及S2结合，其EC50分别为0.034µg/ml和0.038µg/mL，可有效中和SARS-CoV-2病毒。与其它表位的S1-RBD和S1-NTD抗体联合应用于SARS-CoV-2感染的预防和治疗。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种单克隆抗体17-2，所述单克隆抗体17-2的重链可变区氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述单克隆抗体17-2的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

QLQLQESGPGLVKASETLSLTCTVSSGSVSSDSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTMSVDTSKNQFSLKLDSVTAADTAAYYCARGPLGLYYYYMDVWGKGTTVTVSS（SEQ ID NO.1）；

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSINNYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFALTISGLQPEDFATYYCQESNSSPFTFGPGTKVDIK（SEQ ID NO.2）；

优选地，编码所述重链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码所述轻链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

CAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGGCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTGTCTAGTGGCTCCGTCAGCAGTGATAGCTACTACTGGAGTTGGATCCGGCAGCCCCCAGGGAAGGGACTGGAGTGGATTGGATATATCTACTACAGTGGGAGCACCAACTACAACCCCTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATGTCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGGACTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCCGCCTATTACTGTGCGAGAGGCCCACTAGGTCTGTACTACTACTACATGGACGTCTGGGGCAAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCA（SEQ IDNO.3）；

GACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCCCTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGCCGGGCAAGTCAGAGCATTAACAACTATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCGCTCTCACCATCAGCGGTCTGCAACCTGAAGATTTTGCAACTTACTACTGTCAAGAGAGTAACAGTAGCCCATTCACTTTCGGCCCTGGGACCAAAGTGGATATCAAA（SEQ ID NO.4）；

本发明还提供了一种所述单克隆抗体17-2的方法，包含如下过程：

S1、记忆B细胞的识别和分选：从感染者外周血单个核细胞中分离分选出记忆B细胞，经荧光标记抗体染色，分选出记忆B细胞；

S2、记忆B细胞培养及培养上清抗体的筛选：向96孔细胞培养板中加入细胞生长因子，然后加入步骤S1分选出的记忆B细胞，培养7-10天，用捕获ELISA筛选B细胞培养上清中针对SARS-CoV-2 S蛋白抗体的B细胞；

S3、抗体的克隆：提取步骤S2最终筛选出的B细胞的RNA，逆转录成cDNA，用巢式PCR扩增抗体的重链和轻链可变区基因，并经酶切克隆至含有人IgG1恒定区的抗体表达载体上，经IMGT/V-Quest分析重链和轻链可变区基因序列；

S4、抗体的特异性分析：将构建的序列确定的表达载体共转染至293T细胞，5-6天后收获含抗体的培养上清，经proteinA亲和柱纯化，捕获不同病毒膜蛋白抗原ELISA测定抗体的结合活性。

优选地，步骤S1中的荧光标记包括IgD-FITC、CD19-ECD、CD27-PC7、CD38-APCA750、IgM-PB和CD45-KO，记忆B细胞的荧光标记为IgD^-IgM^-CD27⁺CD38^low。

优选地，步骤S2中所述细胞生长因子包括CpG、IL21、IL2、放射照射过的健康人PBMC。

优选地，步骤S3进行巢式PCR扩增时，采用Phusion 超保真DNA聚合酶。

本发明还提供了一种所述单克隆抗体17-2与其它表位的S1-RBD和S1-NTD抗体混合在制备治疗SARS-CoV-2感染的药物中的应用。

优选地，所述药物还包括注射用生理盐水及药学上常用的辅料。

与现有技术相比，本发明提供的单克隆抗体17-2具有如下优势：

（1）本发明提供的获得单克隆抗体17-2策略，是联合B细胞培养结合抗体克隆技术，可分离在体内存在而在体外很难效仿的构象依赖功能性抗体；

（2）本发明提供的获得单克隆抗体17-2策略，在分离过程中不需要用抗原标记记忆B细胞，因而不受标记抗原的限制，可同时筛选与不同蛋白结合的抗体；

（3）本发明提供的单克隆抗体17-2，抗体的重链和轻链配对是自然产生抗体原有的，亲和力高，更适合于实际应用。

附图说明

图1为单克隆抗体17-2重链和轻链表达载体构建结果图；

图2为单克隆抗体17-2抗体与病毒S蛋白的结合反应结果图；

图3为单克隆抗体17-2抗体假病毒中和实验结果图；

图4为B细胞培养和抗体克隆策略示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步解释，但是应当注意的是，以下实施例仅用以解释本发明，而不能用来限制本发明，所有与本发明相同或相近的技术方案均在本发明的保护范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料为市售商品。

所述流式细胞仪为贝克曼库尔特MoFlo Astrios EQ超高速流式细胞分选系统，可购自上海泽权仪器设备有限公司；所述cDNA合成试剂盒为SuperScript III First StrandSynthesis System，可购自美国invitrogen公司，编号为#18080051；所述荧光标记抗体IgD-FITC、CD19-ECD、CD27-PC7、CD38-APC A750、IgM-PB和CD45-KO均可购自国药集团化学试剂有限公司；所述细胞生长因子CpG、IL21、IL2、放射照射过的健康人PBMC均可购自广州豪晋生物科技有限公司。

实施例1 记忆B细胞的识别和分选

所述记忆B细胞的识别和分选的具体过程如下：

1.1外周血单个核细胞分离：取新冠病毒感染康复者恢复期外周静脉EDTA抗凝血，利用密度梯度离心方法分离外周血单个核细胞，分装5×10⁶/管，置于液氮中冻存；

1.2荧光标记抗体染色：外周血单个核细胞放置于37℃中水浴溶化，使用PBS缓冲液洗涤3次，接着加入抗体进行染色，室温避光孵育15min，使用PBS缓冲液洗涤后，加入400µL PBS缓冲液悬浮细胞上流式仪，所述流式仪为贝克曼库尔特MoFlo Astrios EQ超高速流式细胞分选系统，荧光标记的抗体染色：设9个分析管，如表1，1-7管加入相应的单个荧光标记的抗体，第9管加入7种混合的荧光标记的抗体，第8管为只有细胞的空白管，样品管同第9管一样染色；

表1 记忆B细胞分选时，各管中的荧光标记抗体组合

1.3记忆B细胞的分选：样品管上机分析，依据7-AAD及CD45圈出活的CD45阳性的白细胞。依据CD19圈出B细胞。在IgM和IgD双阴的B细胞群体里定义IgD^-IgM^-CD27⁺CD38^low群体为记忆B细胞，将记忆B细胞分选至含细胞培养液的96孔细胞培养板中，25-50细胞/每孔。

实施例2 记忆B细胞培养及培养上清抗体的筛选

向含记忆B细胞的96孔细胞培养板中加入CpG、IL21、IL2、放射照射过的健康人PBMC及含有EBV的B95.8细胞培养上清培养10天。用捕获ELISA筛选B细胞培养上清中针对SARS-CoV-2 S蛋白抗体的存在。

实施例3抗体的克隆

3.1 cDNA合成：对于筛选出上清中有针对SARS-CoV-2 S蛋白抗体存在的B细胞，先提RNA再逆转录成cDNA。cDNA合成为试剂盒(SuperScript III First Strand SynthesisSystem, invitrogen, #18080051)。

3.2 巢式PCR扩增抗体的重链和轻链可变区基因：PCR引物序列及具体PCR扩增过程详见参考文献（J Immunol Methods. 2008 Jan 1;329(1-2):112-24.），反应使用Phusion超保真DNA聚合酶（Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer,NEB, #M0532s)。

3.3抗体的重链及轻链可变区PCR产物经酶切（VH，AgeI/SalI, VK, AgeI/Xhol,VL,AgeI/BsiWI）克隆到含有人IgG1恒定区的抗体表达载体上，见图1。将测得的重链和轻链可变区基因序列经IMGT/V-Quest分析。

实施例4 抗体的特异性分析

4.1 抗体的生产：将构建的序列确定的抗体的重链和轻链载体共转染293T细胞，6天后收获含抗体的培养上清；

4.2 抗体的纯化：将含抗体的培养上清进行proteinA亲和柱纯化，并测定蛋白含量；

4.3 抗体与S蛋白的结合反应及中和实验：

17-2抗体与S及S2蛋白结合，EC50分别为0.034µg/mL和0.038µg/mL。不与S1蛋白结合，见图2。假病毒中和实验体系显示该抗体可有效中和SARS-CoV-2，IC50为0.5874µg/mL，见图3。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州市第八人民医院

<120> 一种中和新冠病毒新表位的全人单克隆抗体17-2及其应用

<130> 2020.12.4

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 122

<212> PRT

<213> 17-2重链可变区氨基酸序列(17-2 Heavy chain variable region aminoacid sequence)

<400> 1

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Ala Ser Glu

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Ser Gly Ser Val Ser Ser Asp

20 25 30

Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Val Thr Met Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe

65 70 75 80

Ser Leu Lys Leu Asp Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Tyr

85 90 95

Cys Ala Arg Gly Pro Leu Gly Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Met Asp Val Trp

100 105 110

Gly Lys Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 17-2轻链可变区氨基酸序列(17-2 light chain variable region aminoacid sequence)

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ala Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Glu Ser Asn Ser Ser Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 366

<212> DNA

<213> 编码17-2重链可变区的核苷酸序列(Nucleotide sequence encoding the17-2 heavy chain variable region)

<400> 3

cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagg cttcggagac cctgtccctc 60

acctgcactg tgtctagtgg ctccgtcagc agtgatagct actactggag ttggatccgg 120

cagcccccag ggaagggact ggagtggatt ggatatatct actacagtgg gagcaccaac 180

tacaacccct ccctcaagag tcgagtcacc atgtcagtag acacgtccaa gaaccagttc 240

tccctgaagc tggactctgt gaccgctgcg gacacggccg cctattactg tgcgagaggc 300

ccactaggtc tgtactacta ctacatggac gtctggggca aagggaccac ggtcaccgtc 360

tcctca 366

<210> 4

<211> 321

<212> DNA

<213> 编码17-2轻链可变区的核苷酸序列(Nucleotide sequence encoding 17-2 light chain variable region)

<400> 4

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga cagagtcacc 60

atcacttgcc gggcaagtca gagcattaac aactatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcgctctca ccatcagcgg tctgcaacct 240

gaagattttg caacttacta ctgtcaagag agtaacagta gcccattcac tttcggccct 300

gggaccaaag tggatatcaa a 321

Claims

1.一种单克隆抗体17-2，其特征在于，所述单克隆抗体17-2的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述单克隆抗体17-2的轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的单克隆抗体17-2，其特征在于，编码所述重链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码所述轻链可变区氨基酸序列的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。

3.一种如权利要求1所述单克隆抗体17-2在制备治疗SARS-CoV-2感染的药物中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述药物还包括注射用生理盐水及药学上常用的辅料。