CN111518217A - 一种靶向于cd22分子的嵌合抗原受体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种靶向于CD22分子的嵌合抗原受体，属于细胞免疫治疗技术领域。所述靶向于CD22分子的嵌合抗原受体，包括依次连接的前导肽、靶向于CD22分子的纳米抗体重链可变区、CD8α链铰链区、CD8α链跨膜区、CD28分子胞内段、4‑1BB分子胞内段和CD3ζ链,所述靶向于CD22分子的纳米抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明采用靶向于CD22分子的纳米抗体作为受体的特异性识别结构组分，能够特异性地抑制、杀伤以CD22分子作为标志物的疾病。

Description

一种靶向于CD22分子的嵌合抗原受体
技术领域
本发明涉及一种靶向于CD22分子的嵌合抗原受体，属于细胞免疫治疗技术领域。
背景技术
近些年来，免疫学领域中对于转化医学的研究越来越多，尤其是肿瘤免疫。肿瘤免疫治疗中应用比较广泛的是CAR-T细胞免疫治疗策略。在90年代早期，这种免疫治疗策略在转化医学中就获得了好的效果。CAR-T细胞经历了一代、二代到三代的转变。通过这种技术和设计上的革新，逐步对治疗过程中细胞毒作用的活化、杀伤信号的持久进行优化。靶向于CD22分子的CAR-T细胞应用较为广泛，尤其是治疗B淋巴细胞瘤等血液肿瘤。正常机体内的T细胞被有效刺激并发挥免疫学功能需要多重信号的调控，主要包括T细胞受体(TCR)与MHC-抗原肽复合物的识别作为第一信号、T细胞表面的共刺激分子识别活化作为第二信号，甚至还需要细胞因子参与形成第三信号。这种嵌合抗原受体主要是将T细胞刺激和活化的过程所需的蛋白分子进行人工的串联整合，从而促进T细胞的活化和特异性杀伤。CAR-T细胞的特异性杀伤主要是前端的抗体分子部分的识别和结合。目前使用较为广泛的是基于人或其他种属的单克隆抗体单链可变区(Single chain Fv,ScFv)对靶蛋白的特异性识别。但存在如下缺陷：在ScFv与纳米抗体亲和力相当的基础上，ScFv相对于纳米抗体来讲分子量较大，在分子表达和功能发挥上存在一定的限制。纳米抗体是天然存在的最小的抗体片段。ScFv由其亲本单克隆抗体衍生而来，在活性和稳定性等方面可能存在着一定的不足。
鉴于此，有必要提供一种新的靶向于CD22分子的嵌合抗原受体，以解决现有技术的不足。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种靶向于CD22分子的嵌合抗原受体。本发明的靶向于CD22分子的嵌合抗原受体,采用靶向于CD22分子的纳米抗体作为受体的特异性识别结构组分，能够特异性地抑制、杀伤以CD22分子作为标志物的疾病，如B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病和急性髓性白血病等。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：一种靶向于CD22分子的嵌合抗原受体，包括依次连接的前导肽、靶向于CD22分子的纳米抗体重链可变区、CD8α链铰链区、CD8α链跨膜区、CD28分子胞内段、4-1BB分子胞内段和CD3ζ链,所述靶向于CD22分子的纳米抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的靶向于CD22分子的嵌合抗原受体的原理是：
本发明采用CD22单链抗体作为受体的特异性识别结构组分。该CD22单链抗体来源于羊驼，是羊驼天然存在的一种缺失轻链的抗体分子。该抗体只包含一个重链可变区(Variable domain of heavy chain of heavy chain antibody,VHH)和两个常规的CH2和CH3区，单独克隆并表达出来的重链可变区(VHH)结构与其完整的重链抗体相比，在抗体结构稳定性以及与抗原的结合活性中都是相当的，是目前已知的具有最小蛋白分子量的抗体结构，故称这段重链可变区(VHH)结构为纳米抗体(nanobody，Nb)。相较于现有技术的单克隆抗体单链可变区(Single chain Fv,ScFv)，该CD22单链抗体的重链可变区具有结构更小的优点，在嵌合抗原受体的表达和对T细胞的修饰中均具有优势。
本发明的靶向于CD22分子的嵌合抗原受体的有益效果是：
本发明的靶向于CD22分子的嵌合抗原受体,采用靶向于CD22分子的纳米抗体作为受体的特异性识别结构组分，能够特异性地抑制、杀伤以CD22分子作为标志物的疾病，如B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病和急性髓性白血病等。
在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。
进一步，所述前导肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
采用上述进一步的有益效果是：前导肽可以介导CAR蛋白表达后向细胞膜外进行定位分布。
进一步，所述CD8α链铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQID NO.6所示。
采用上述进一步的有益效果是：CD8α链铰链区可以促进CAR结构胞外段的稳定，并促进胞外段CAR结构形成二聚体。
进一步，所述CD8α链跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列如SEQID NO.8所示。
采用上述进一步的有益效果是：CD8α链跨膜区可以促进CAR结构定位在细胞膜上。
进一步，所述CD28分子胞内段的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
采用上述进一步的有益效果是：CD28分子胞内段可以作为共刺激分子，对T细胞进行活化。
进一步，所述4-1BB分子胞内段的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
采用上述进一步的有益效果是：4-1BB分子胞内段可以作为共刺激分子，对T细胞进行活化。
进一步，所述CD3ζ链的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，氨基酸序列如SEQ IDNO.14所示。
采用上述进一步的有益效果是：CD3ζ链可以传导T细胞活化信号至细胞内信号通路。
附图说明
图1为本发明的BA125纳米抗体VHH区与CD22胞外段蛋白的亲和力检测。
图2为本发明的实施例中，流式细胞术检测CAR-T细胞表达嵌合抗原受体的情况。
图3为本发明的实施例中，检测CD22-K562刺激CAR-T细胞活化产生TNFα细胞因子的情况。图中，Effector cell指效应细胞；PMA/iono指佛波酯和离子霉素；TNFα指肿瘤坏死因子α。
图4为本发明的实施例中，检测CD22-K562刺激CAR-T细胞活化产生IFNγ细胞因子的情况。图中，Effector cell指效应细胞；PMA/iono指佛波酯和离子霉素；IFNγ指干扰素γ。
图5为本发明的实施例中，检测CAR-T细胞对CD22-K562靶细胞的杀伤情况。图中，E：T ratio，指效靶比；％Cytotoxicity，指细胞毒效应百分数。
具体实施方式
以下结合具体附图对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
CAR-T Cell Immunotherapy，全称是Chimeric Antigen Receptor T-CellImmunotherapy，嵌合抗原受体T细胞免疫疗法。
CAR，全称是Chimeric Antigen Receptor，嵌合抗原受体。
实施例1：靶向于CD22分子的纳米抗体的制备
步骤1：经真核表达系统在293T细胞中表达CD22蛋白胞外段，并在C末端加入His标签，使用镍柱纯化蛋白，经分子筛纯化蛋白后检测蛋白浓度，分装，于-80℃保存。
步骤2：将纯化后的CD22分子作为抗原免疫羊驼，经过四次抗原的免疫，每次间隔20天，检测羊驼外周血血清的抗体效价。
步骤3：采集羊驼外周血并提取外周血单个核细胞(PBMC)，提取RNA，反转录，PCR扩增重链可变区，连接载体后构建文库。
步骤4：通过噬菌体展示，采用间接ELISA筛选阳性克隆(OD值大于1)，筛选能够结合抗原的抗体克隆序列。
步骤5：测序确认靶向于CD22分子的纳米抗体的重链可变区序列。
实施例2：靶向于CD22分子的纳米抗体的亲和力分析
步骤1：将实施例1得到的靶向于CD22分子的纳米抗体的重链可变区序列克隆至人型支原体(MH)抗体表达载体中，并在C末端加入His标签。载体转染293T细胞以在真核细胞中进行抗体的表达，通过镍柱纯化抗体蛋白，经分子筛纯化蛋白后检测蛋白浓度，于4℃保存。
步骤2：使用Biacore T200设备(购自GE Healthcare)进行抗原抗体结合亲和力(动力学)分析，采用CM5芯片氨基偶联CD22蛋白分子，同时使用不同浓度的抗体蛋白循环结合已偶联的抗原蛋白，分析结合动力学曲线并计算亲和力。
步骤3：通过亲和力验证，筛选出KD值达到10-8M的抗体克隆，命名为BA125纳米抗体。
实施例3：靶向于CD22分子的嵌合抗原受体质粒载体的构建
步骤1：将实施例2得到的BA125纳米抗体序列通过PCR扩增后，与基因合成的嵌合抗原受体其他结构组分序列通过重叠PCR方法进行拼接构建。完整的靶向于CD22分子的嵌合抗原受体，包括依次连接的靶向于CD22分子的纳米抗体重链可变区、CD8α链铰链区、CD8α链跨膜区、CD28分子胞内段、4-1BB分子胞内段和CD3ζ链。
步骤2：将构建好的DNA片段插入至PLVX慢病毒表达载体(本载体经过改造，原载体为PLVX-IRES-ZsGreen1，将CMV启动子替换为PGK启动子，并去除了IRES-ZsGreen1结构)中，并经过测序验证质粒构建的准确性，即得到靶向于CD22分子的嵌合抗原受体慢病毒表达质粒载体。
实施例4：慢病毒的包装与制备
步骤1：慢病毒包装在293T细胞中进行，所需质粒包括PLVX-BA125-28BBz、dR8.74和MD2.G。采用聚乙烯亚胺(Polyethylenimine，PEI)转染试剂进行转染，具体方法详见聚乙烯亚胺转染试剂说明书。该聚乙烯亚胺转染试剂可以市售购买，如可以购自Sigma，货号为408727。
步骤2：传代293T细胞至新的10cm培养皿中，接种密度在70％-80％；
步骤3：传代后12h进行转染，按照质量比PLVX-BA125-28BBz：dR8.74：MD2.G＝6:5:1，按照质量体积比为质粒：聚乙烯亚胺＝1ug:2.5ul，质粒按比例混合于无血清无抗生素的DMEM基础培养基中，聚乙烯亚胺同样按比例进行配制，室温静置5min，将质粒混悬液与聚乙烯亚胺混悬液等体积混合后，室温静置20min，将转染混悬液小心加入至293T细胞培养上清中，每皿加入1mL。
步骤4：转染后12h进行全量换液，更换完全DMEM培养基后继续培养。
步骤5：总转染时间为36h后收集培养上清，2600g离心10min，转移上清至新的离心管并保存。
实施例5：PBMC(外周血单个核细胞)的分离与培养
步骤1：取50ml健康人的外周血样本，使用等体积的PBS稀释样本。
步骤2：准备新的离心管并加入等体积的淋巴细胞分离液，巴斯德管小心吸取稀释后的样本加入至分离液上层。
步骤3：600g室温离心20min，离心机转动采用缓升缓降模式。
步骤4：巴斯德管小心吸取中间层的白膜层细胞至新的离心管中。
步骤5：加入3-5倍体积的PBS稀释白膜层细胞进行洗涤，充分混匀，300g离心10min。
步骤6：弃上清，小体积PBS重悬细胞沉淀，加入40ml PBS再次进行洗涤，充分混匀，300g离心5min。
步骤7：弃上清，使用T细胞无血清培养基(ImmunoCult-XF T cell Exp Medium,STEM CELL)重悬细胞进行培养，并加入终浓度为1000IU/mL的IL2、50ng/mL的CD3激活抗体和50ng/mL的CD28激活抗体，激活培养48h。
步骤8：收集细胞悬液，300g离心3min，弃上清，更换新鲜的培养基，并加入终浓度为1000IU/mL的IL2，继续培养。
实施例6：CAR-T细胞的转导制备
步骤1：取培养7天的T细胞进行转导实验，计数收集1.2×107细胞，使用T细胞完全培养基重悬细胞并接种于24孔板中，每孔500ul细胞悬液，每孔5×105细胞。
步骤2：取包装好的慢病毒悬液12mL，加入终浓度为5ug/mL的聚凝胺(polybrene)，充分混匀，加入至24孔板中，每孔500ul病毒液。
步骤3：细胞置于培养箱正常培养，慢病毒感染12h后将所有细胞重悬离心后全量换液，置换为新鲜的完全培养基，并继续培养。
实施例7：CAR-T细胞CAR结构表达的阳性率检测
步骤1：转导后的T细胞培养4-6天进行CAR表达情况的阳性率检测，使用流式细胞术进行检测。
步骤2：收集1×106细胞并使用PBS洗涤，300g离心3min。
步骤3：弃上清，500ul的PBS重悬细胞，按体积比1:500剂量加入生物素山羊抗羊驼抗体(Biotin-Goat Anti-Alpaca IgG),特异性识别重链可变区(VHH区)抗体(购自美国Jackson Immuno公司)，振荡混匀，室温孵育30min。
步骤4：加入1mL PBS洗涤细胞，振荡混匀，300g离心3min。
步骤5：弃上清，100ul的PBS重悬细胞，加入1Text剂量的anti-CD3-APC-Cy7抗体(购自BD公司,Becton,Dickinson and Company)，同时加入1ug的PE标记的链霉亲和素(PE-Streptavidin)抗体(购自BD公司,Becton,Dickinson and Company)，振荡混匀，室温孵育30min。
步骤6：加入1mL的PBS洗涤细胞，振荡混匀，300g离心3min。
步骤7：弃上清，300ul的PBS重悬细胞，振荡混匀，上机检测。
实施例8：CAR-T细胞活化功能检测
步骤1：使用未转导的T细胞作为对照，检测CAR-T与CD22-K562(K562细胞系稳定表达CD22分子)靶细胞共孵育后细胞因子的释放。
步骤2：收集培养中的CAR T细胞，通过细胞计数得到活化实验所需细胞进行离心收集。
步骤3：同样的，收集CD22-K562细胞，得到所需数量细胞。
步骤4：按照表1的方案进行细胞接种，细胞接种于V型底的96孔板中，
表1细胞接种方案
Figure BDA0002440851320000091
注：表中，E指effector cells，效应细胞；T指target cells，靶细胞；Effectorcell only指只有效应细胞。PMA/iono指佛波酯和离子霉素。每组同时实验两个副孔。
步骤5：细胞置于培养箱中正常培养孵育24h。
步骤6：小心吸取细胞上清至新的EP管中，使用ELISA方法检测细胞培养上清中的TNF-α和IFN-γ的表达水平，ELISA检测使用博士德生物产品试剂盒，具体操作按照说明书进行。
实施例9：CAR-T细胞体外杀伤活性检测
步骤1：使用未转导的T细胞作为对照，检测CAR-T与CD22-K562(K562细胞系稳定表达CD22分子)靶细胞共孵育后对靶细胞的细胞毒作用。
步骤2：采用
Figure BDA0002440851320000092
EuTDA Cytotoxicity Reagents试剂盒(购自美国PerkinElmer公司)进行实验，按照试剂盒操作说明预标记CD22-K562靶细胞，并使用T细胞培养基接种于V底的96孔板中，每孔5000个细胞，同时设置自发释放孔和最大释放孔；
步骤3：将收集好的效应细胞按照比例接种至孔板中，按照E：T为1:1、5:1、10:1、30:1、60:1的梯度进行接种，每孔培养基体积为200ul。
步骤4：将细胞置于37℃培养箱正常培养2h后，使用Lysis buffer裂解最大释放孔中的靶细胞。
步骤5：继续孵育2h后，即共孵育4h后，按照说明书操作规范，将V型孔板置于平板离心机上进行离心，500g离心5min。
步骤6：每孔小心吸取20ul上清至荧光测定专用96孔板(白板)中，每孔加入200ulEu-Solution，摇床振荡避光室温孵育15min。
步骤7：采用时间分辨荧光(time-resolved fluorescence)检测每孔的荧光信号。
步骤8：按下列公式，计算细胞杀伤百分数。
Figure BDA0002440851320000101
结论：
本发明采用自主筛选的纳米抗体替换传统的scFv作为主要策略，设计建立的嵌合抗原受体具有独特性。我们成功筛选到了能够靶向于CD22蛋白的纳米抗体克隆，并验证了纳米抗体BA125克隆的重链可变区可以很好的与CD22结合，具有较好的亲和力(图1)。实验设置了纳米抗体的5种不同浓度梯度，分别为2nM、4nM、8nM、16nM和32nM，经过曲线拟合报告出纳米抗体BA125克隆蛋白与CD22蛋白的亲和力KD(M)值为9.47E-09M。
我们成功构建了靶向于CD22分子的纳米抗体重链可变区来源的嵌合抗原受体结构慢病毒表达载体，即BA125-28BBz。我们成功制备了用于嵌合抗原受体转导的慢病毒以及CAR-T细胞。通过实验验证制备的CAR-T细胞能够很好的表达所设计的嵌合抗原受体结构(图2)。
通过细胞活化功能实验验证了我们制备的CAR-T细胞受到特异性靶细胞刺激后能够进行有效的活化，分泌相应的细胞因子(图3和图4)。
通过细胞毒实验验证了我们制备的CAR-T细胞能够特异性的对靶细胞进行杀伤(图5)。CAR-T细胞功能检测过程中加入了geneBank中已提交的anti-CD22 scFv构建的嵌合抗原受体结构作为对比。通过以上实验能够证实我们设计的嵌合抗原受体结构以及CAR-T细胞在体外能够很好的发挥对靶细胞的杀伤作用。我们设计的纳米抗体来源的嵌合抗原受体具有一定的有效性和独特性。因此本发明所述的嵌合抗原受体BA125-CD8α-CD28-41BB-CD3ζ可在肿瘤(比如B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、多毛细胞白血病和急性髓性白血病)治疗中得到一定的应用。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 北京荣瑷医学生物科技有限责任公司
<120> 一种靶向于CD22分子的嵌合抗原受体
<160> 14
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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ttcgtgccgg tcttcctgcc agcgaagccc accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca 60
ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg 120
gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg gacttcgcct gtgat 165
<210> 6
<211> 55
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
1 5 10 15
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
20 25 30
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
35 40 45
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
50 55
<210> 7
<211> 84
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gcaaccacag gaac 84
<210> 8
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn
20 25
<210> 9
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 10
<211> 41
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
1 5 10 15
Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro
20 25 30
Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
35 40
<210> 11
<211> 141
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgtttctctg ttgttaaacg gggcagaaag aagctcctgt atatattcaa acaaccattt 60
atgagaccag tacaaactac tcaagaggaa gatggctgta gctgccgatt tccagaagaa 120
gaagaaggag gatgtgaact g 141
<210> 12
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe
1 5 10 15
Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly
20 25 30
Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40 45
<210> 13
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 14
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110

Claims (7)

1.一种靶向于CD22分子的嵌合抗原受体，其特征在于，包括依次连接的前导肽、靶向于CD22分子的纳米抗体重链可变区、CD8α链铰链区、CD8α链跨膜区、CD28分子胞内段、4-1BB分子胞内段和CD3ζ链,所述靶向于CD22分子的纳米抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的靶向于CD22分子的嵌合抗原受体，其特征在于，所述前导肽的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
3.根据权利要求1所述的靶向于CD22分子的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD8α链铰链区的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
4.根据权利要求1所述的靶向于CD22分子的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD8α链跨膜区的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
5.根据权利要求1所述的靶向于CD22分子的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD28分子胞内段的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示。
6.根据权利要求1所述的靶向于CD22分子的嵌合抗原受体，其特征在于，所述4-1BB分子胞内段的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
7.根据权利要求1-6任一项所述的靶向于CD22分子的嵌合抗原受体，其特征在于，所述CD3ζ链的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
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