CN110484507A - 一种靶向肿瘤Her2的新型嵌合抗原受体T细胞的制备技术 - Google Patents

一种靶向肿瘤Her2的新型嵌合抗原受体T细胞的制备技术 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种靶向肿瘤Her2的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法和应用，通过将CAR‑T细胞设计为双共刺激信号分子，改进了信号肽、穿膜区、铰链区的设计，同时优化了CAR‑T细胞制备过程中病毒表达载体的选择、重组病毒的包装、浓缩、纯化、转导等环节，克服了CAR‑T细胞效能低及不稳定等问题，为增强抗Her2CAR‑T细胞的肿瘤免疫治疗效果打下基础，对实体肿瘤的抗Her2CAR‑T细胞免疫治疗具有实际指导意义。

Description

一种靶向肿瘤Her2的新型嵌合抗原受体T细胞的制备技术
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种靶向肿瘤Her2的新型嵌合抗原受体T细胞的制备技术。
背景技术
Her2/erbB2是一种编码生长因子受体(Her2/erbB2受体)的原癌基因，相关研究显示，在25％～30％的乳腺癌患者中Her2过度表达，这些患者对化疗和内分泌治疗不敏感，而且往往转移、复发较早，因而生存时间短。除乳腺癌外，在卵巢癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、大肠癌、胃癌、膀胱癌、肾细胞癌及其他原发性恶性肿瘤中，Her2也都过度表达。Her2已被证实在肿瘤发生发展中起关键作用，因而是肿瘤生物治疗的重要靶点之一。
嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)由位于胞外的肿瘤相关抗原的单链抗体scFv、跨膜区和位于胞内的T细胞的活化基序所组成。
CAR-T细胞疗法是采取患者外周血中的T细胞，经过基因工程修饰，使T细胞膜上表达CAR，把CAR-T细胞输回患者体内，CAR-T细胞在靶向肿瘤细胞的同时被激活，并能够在体内肿瘤细胞刺激下扩增，从而高效杀死癌细胞。近年来，临床试验采用CAR-T细胞靶向位于肿瘤细胞表面的肿瘤相关抗原，如靶向CD20针对非霍奇金淋巴瘤、靶向GD2针对成神经细胞瘤、靶向CD19针对慢性淋巴细胞性白血病和B细胞急性淋巴细胞性白血病，均已取得显著成果，在相当比例的病人中已取得举世瞩目的抗肿瘤效果。这些临床试验已清楚地表明能被CAR-T细胞靶向的肿瘤的广泛范围。截至目前，CAR-T细胞疗法的临床治疗成功主要局限于血液肿瘤，对实体肿瘤的治疗还有待突破。
CAR-T细胞技术已经发展出第3代，第一代CAR在T细胞内只有一个CD3ζ刺激信号，在此基础上，第二代增加了1个共刺激分子信号，第三代增加了2个共刺激分子信号。目前用于临床治疗研究的主要为第二代(https://clinicaltrials.gov)。CAR-T细胞用于血液系统恶性肿瘤的临床试验，35项为第二代的，主要靶向CD19，第三代的仅2项，分别靶向CD19和CD20。CAR-T细胞用于实体肿瘤的临床试验，15项为第二代的，主要靶向CEA、GD2和Her2，第三代的仅5项，其中4项靶向GD2，1项靶向EGFRⅧ，至今未见靶向Her2的第三代CAR-T细胞临床试验成功报道。
目前第三代CAR-T细胞临床应用较少，主要是因为不能制备效能高且稳定的CAR-T细胞，一方面，人外周血T细胞为原代细胞，培养时间很有限，且必须经刺激活化才能维持生存，但是刺激活化后又会导致其在短期内衰竭，况且还要耐受重组病毒转导过程的伤害，所以对人外周血T细胞刺激活化、持续扩增的条件要求很苛刻；另一方面，人外周血T细胞为悬浮培养细胞，所以重组病毒不容易转导。此外，由于第三代CAR-T细胞的临床应用较少，其有效性是否一定优于第二代CAR-T细胞，以及选择怎样的双共刺激域组合，均不清楚，有待进一步研究。
由于上述原因，本发明人通过大量研究，提供了一种靶向肿瘤Her2的新型嵌合抗原受体T细胞的制备方法，解决了CAR-T细胞效能低及不稳定等一系列问题，并可以促进第三代CAR-T细胞在实体肿瘤临床治疗中的应用。
发明内容
为了克服上述问题，本发明人进行了锐意研究，将CAR-T细胞设计为双共刺激信号分子，改进了信号肽、穿膜区、铰链区的设计，同时优化了CAR-T细胞制备过程中病毒表达载体的选择、重组病毒的包装、浓缩、纯化、转导等环节，克服了CAR-T细胞效能低及不稳定等问题，为增强抗Her2 CAR-T细胞的肿瘤免疫治疗效果打下基础，对实体肿瘤的抗Her2CAR-T细胞免疫治疗具有实际指导意义，从而完成了本发明。
具体来说，本发明的目的在于提供以下方面：
本发明的第一方面，提供了一种靶向肿瘤Her2的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞。
本发明的第二方面，提供了一种上述靶向肿瘤Her2的嵌合抗原受体T细胞的制备方法。
本发明的第三方面，提供了一种上述靶向肿瘤Her2的嵌合抗原受体T细胞在治疗Her2阳性肿瘤方面的应用，如乳腺癌、卵巢癌、大肠癌、胃癌、膀胱癌或肾细胞癌。
本发明所具有的有益效果包括：
(1)本发明中通过在共刺激域增加一个分子信号及改进信号肽、穿膜区、铰链区，使制得的新型靶向肿瘤Her2的嵌合抗原受体T细胞大大增加了对肿瘤细胞的杀伤效能；
(2)本发明中采用慢病毒载体转导T细胞，极大地提高了转导成功率；
(3)本发明中采用PEI方法进行转染，操作简单，成本低廉，且对细胞毒性低，适用于大规模包装病毒；
(4)本发明中提供的重组病毒的纯化方法，依次联用滤膜法、蔗糖垫法和瞬时高速离心进行纯化，尤其是设计了简单可行的瞬时高速离心法对重组病毒进行第3道纯化，使转导的人外周T细胞的存活率从13.25％提高到97.40％，突破了制备CAR-T细胞的瓶颈环节；
(5)本发明中优化了重组病毒转导T细胞的MOI值，使得重组病毒转导人外周血T细胞5天后的活细胞率保持在97.4％的水平，使得重组病毒的表达水平达到理想要求；
(6)本发明中制备的靶向肿瘤Her2的嵌合抗原受体T细胞及其制备方法，克服了CAR-T细胞效能低及不稳定等问题，为增强抗Her2 CAR-T细胞的肿瘤免疫治疗效果打下基础，对实体肿瘤的抗Her2 CAR-T细胞免疫治疗具有实际指导意义。
附图说明
图1示出抗Her2嵌合抗原受体的结构图；
图2示出SignalP-NN预测信号肽切割位点的结果；
图3示出TMHMM预测跨膜区位置的结果；
图4示出SOPMA预测融合蛋白二级结构的结果，其中：h为α-螺旋，e为β-折叠，t为β-转角，c为无规则卷曲；
图5示出SWISS MODEL预测融合蛋白的细胞膜外区三级结构；
图6示出ANTHEPROT 2000预测融合蛋白的抗原性及其他理化性质的结果，其中，曲线1为Parker还原性曲线，曲线2为疏水性曲线，曲线3为Welling还原性曲线，曲线4为亲水性曲线，曲线5为跨膜性曲线，曲线6为可溶性曲线；
图7示出三种重组慢病毒表达载体的图谱，其中，
A为实施例1所用重组慢病毒表达载体的图谱；
B为实施例2所用重组慢病毒表达载体的图谱；
C为实施例3所用重组慢病毒表达载体的图谱；
图8示出三种重组慢病毒载体的菌落PCR鉴定电泳图，其中，
A为实施例1所用重组慢病毒表达载体的菌落PCR鉴定电泳图，M：DNA Marker，1：含有CAR的泳道，2：空载体的泳道；
B为实施例2所用重组慢病毒表达载体的菌落PCR鉴定电泳图，M：DNA Marker，1：空载体的泳道，2：含有CAR的泳道；
C为实施例3所用重组慢病毒表达载体的菌落PCR鉴定电泳图，M：DNA Marker，1：空载体的泳道，2：含有CAR的泳道；
图9示出三种重组慢病毒载体的经EcoR I和BamH I双酶切鉴定电泳图，其中，M：DNA Marker，1：空载体的泳道，2：含有CAR的泳道，
A～C分别为实施例1～3中重组慢病毒载体经EcoR I和BamH I双酶切鉴定的电泳图；
图10示出三种重组慢病毒质粒转染293T-17细胞48h和72h后的GFP表达情况，其中，
a为实施例1转染48h后的细胞中GFP在可见光视野下的表达情况；
b为实施例1转染48h后的细胞中GFP在荧光视野下的表达情况；
c为实施例1转染72h后的细胞中GFP在可见光视野下的表达情况；
d为实施例1转染72h后的细胞中GFP在荧光视野下的表达情况；
e为实施例4转染48h后的细胞中GFP在可见光视野下的表达情况；
f为实施例4转染48h后的细胞中GFP在荧光视野下的表达情况；
g为实施例4转染72h后的细胞中GFP在可见光视野下的表达情况；
h为实施例4转染72h后的细胞中GFP在荧光视野下的表达情况；
i为实施例5转染48h后的细胞中GFP在可见光视野下的表达情况；
j为实施例5转染48h后的细胞中GFP在荧光视野下的表达情况；
k为实施例5转染72h后的细胞中GFP在可见光视野下的表达情况；
l为实施例5转染72h后的细胞中GFP在荧光视野下的表达情况；
图11示出三种重组慢病毒质粒转染293T-17细胞72h后流式细胞仪检测GFP表达情况，其中，
a为对比例4的细胞中GFP的表达情况；
b为实施例1的细胞中GFP的表达情况；
c为实施例4的细胞中GFP的表达情况；
d为实施例5的细胞中GFP的表达情况；
图12示出细胞在悬浮与贴壁培养状态下转染的滴度结果图，其中，*：P＜0.05，**：P＜0.01，
a为实施例6中细胞的滴度结果；
b为实施例7中细胞的滴度结果；
c为实施例3中细胞的滴度结果；
d为实施例8中细胞的滴度结果；
图13示出包装重组慢病毒的质粒体系的优化结果，其中，
A中的a为实施例3中的滴度结果；
b为实施例9中的滴度结果；
B示出不同质粒总量的滴度结果；
C示出不同质粒比例的滴度结果，其中，*：P＜0.05，**：P＜0.01，***：P＜0.001；
图14示出不同刺激法的PBMC的生长状况，其中，
a为对比例1中PBMC的生长状况图；
b为实施例25中PBMC的生长状况图；
c为实施例1中PBMC的生长状况图；
图15示出不同刺激法的PBMC的生长曲线；
图16示出不同刺激法的流式细胞仪检测情况，其中，
A为实施例25所述方法刺激2天后的检测情况；
B为实施例1所述方法刺激2天后的检测情况；
C为实施例25所述方法刺激4天后的检测情况；
D为实施例1所述方法刺激4天后的检测情况；
图17示出重组慢病毒以不同MOI转导人Jurkat T细胞后的流式细胞仪检测情况，其中，
A为对比例2中检测7-AAD染色阴性的活细胞率；
B为实施例26中检测7-AAD染色阴性的活细胞率；
C为实施例27中检测7-AAD染色阴性的活细胞率；
D为实施例1中检测7-AAD染色阴性的活细胞率；
E为实施例28中检测7-AAD染色阴性的活细胞率；
F为实施例1、26～28及对比例2中的GFP阳性率结果；
图18为不同重组慢病毒载体的CAR表达情况图，其中，
A为三种重组慢病毒分别转导293T-17细胞后，Western blot检测CAR(含外源性CD3ζ)的表达水平；
B为三种重组慢病毒分别转导人外周血T细胞后，Western blot检测CAR(含外源性CD3ζ)的表达水平；
图19示出抗Her2 CAR-T细胞与靶细胞共培养的检测情况，其中，A为对比例3中的细胞与BT474细胞共培养的结果；
B为实施例1中的细胞与BT474细胞共培养的结果；
a为Her阳性的乳腺癌细胞BT474，
b为转导不含CAR慢病毒的人外周血T细胞，
c为转导含CAR慢病毒的人外周血T细胞；
图20为ELISA检测CAR-T细胞被肿瘤细胞激活情况，其中，**：P＜0.01，***：P＜0.001，
A为IL-2含量的检测结果，
B为IFN-γ含量的检测结果；
图21为LDH法检测在不同效靶比下CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用结果，其中，对照组1、2分别与实验组比较，**：P＜0.01，***：P＜0.001。
具体实施方式
下面对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。
在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
嵌合抗原抗体中的单链抗体scFv(single chain Fv domain，单链可变区结构域)具有特异性识别并结合TAA(tumor-associated antigen，肿瘤相关性抗原)的功能。scFv的构成是将单克隆抗体的重链可变区(the variable region of heavy chain，VH)和轻链可变区(the variable region of light chain，VL)用一可弯曲的多肽接头(Linker)将VH和VL连接起来。跨膜区通常是由免疫球蛋白超家族组成，如CD8、CD28和IgG。而胞内信号传导区包括共刺激分子和免疫受体酪氨酸活化基序，其中，共刺激分子通常为CD28，活化基序通常为CD3ζ。
其中，CD3ζ中的ζ链是位于T细胞膜内的主要信号转导分子CD3的一个重要亚基，能传递外部抗原刺激信号，在激活T细胞杀伤肿瘤细胞中必不可少。T细胞活化需要双信号刺激，除基本刺激信号外，还需要共刺激信号(如CD28等)，以引起T细胞增殖、细胞因子分泌和靶向杀伤。
本发明的第一方面，提供了一种靶向肿瘤Her2的嵌合抗原受体T细胞，所述靶向肿瘤Her2的嵌合抗原受体T细胞(以下简称CAR-T细胞)中的嵌合抗原受体包括细胞膜外抗原结合区、铰链区、跨膜区和胞内信号传导区，其中，所述细胞膜外抗原结合区包括抗Her2的单链抗体scFv，以特异性靶向Her2过度表达的肿瘤细胞；所述胞内信号传导区包括基本刺激信号分子和共刺激信号分子，所述共刺激信号分子具有两个，形成双共刺激结构域，以充分激活T细胞的抗肿瘤活性。
本发明人经过研究发现，对于远离细胞膜的抗原表位，无铰链区的CAR-T细胞可以识别和结合抗原；而对于膜近端的抗原表位，一个灵活的铰链区对抗原的识别是必要的。针对不同肿瘤相关抗原需要调整铰链区长度，以更好发挥靶向结合能力。
根据本发明一种优选的实施方式，选用CD3、CD28或CD8的跨膜区来构建CAR，优选选用CD28的跨膜区来构建CAR。
其中，所述CD28的跨膜区在CAR的二聚化和T细胞活化中发挥重要作用。
在进一步优选的实施方式中，所述CAR融合基因的信号肽选自Igκ基因的信号肽，和/或，所述CAR融合基因的铰链区选自CD8基因的铰链区。
根据本发明一种优选的实施方式，所述胞内信号传导区包括双共刺激结构域和位于其下游的活化基序，所述双共刺激结构域由CD28、CD137/4-1BB、CD134/OX40、DAP10或ICOS中的两种构成。
在进一步优选的实施方式中，所述双共刺激结构域由CD28、CD137/4-1BB或CD134/OX40中的两种构成。
其中，CD28可募集PI3K、Grb2等分子来调节关键转录因子的活性；CD134能促进T细胞体外增殖且增加白介素-2的分泌；CD137是肿瘤坏死因子家族受体，能激活下游的JNK、p38、MAPK和NF-κB信号途径。
在更进一步优选的实施方式中，所述双共刺激结构域由CD28和CD137构成。
本发明人经过进一步研究发现，整合了CD137的嵌合抗原受体(CAR)可以促进抗凋亡蛋白Bcl-XL的表达，抵抗激活所诱导的T细胞凋亡，使CAR-T细胞能持续存活和不断分泌细胞因子，增强CAR-T细胞的特异性杀伤效应。
双共刺激结构域由于CD28和CD137的附加效应，能够促使抗凋亡蛋白的表达上调，同时能够促进Akt途径的高活性。其中，所述Akt是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在细胞存活和凋亡中起重要作用，Akt途径可以通过一系列的下游转导调控细胞凋亡、细胞周期，并对端粒酶活性、肿瘤血管的生成以及肿瘤的侵润有一定的促进作用。
本发明制备的靶向肿瘤Her2的嵌合抗原受体T细胞能够同时发挥体液免疫和细胞免疫的双重作用来产生免疫应答从而彻底清除肿瘤细胞，尤其是共刺激域增加了一个CD137共刺激信号分子，使得CAR的应答性显著提升。
本发明的第二方面，提供了一种靶向肿瘤Her2的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，其中，该方法包括以下步骤：
步骤1，构建CAR融合基因，并构建包含该融合基因的重组病毒表达载体；
步骤2，利用上述构建的重组表达载体制得转导T细胞的重组病毒；
步骤3，将上述重组病毒转导至分离的T细胞中，使得融合基因表达于T细胞膜上，制得CAR-T细胞。
根据本发明一种优选的实施方式，所述步骤1包括以下子步骤：
步骤1-1，获取CAR各个区域的目的基因片段，进行连接，获得CAR融合基因；
根据本发明一种优选的实施方式，采用PCR方法扩增出细胞膜外抗原结合区、铰链区、跨膜区和胞内信号传导区的目的基因片段，经电泳鉴定，鉴定正确后回收目的片段。
其中，由于所述目的基因片段均为已知序列，需要根据已知序列设计引物，并从相应的重组质粒上经普通PCR扩增得到。如：signal目的基因从pSecTag2上扩增得到，抗Her2单链抗体(anti-Her2scFv)从重组pPIC9K上扩增得到。
在进一步优选的实施方式中，将上述回收的目的基因片段利用重叠延伸PCR技术进行连接，将连接完成的融合基因进行电泳鉴定，鉴定正确后回收。
其中，所述重叠延伸PCR(SOE-PCR)技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链，从而在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段重叠拼接起来。
在本发明中，每连接一段目的片段，均要对连接产物进行电泳鉴定回收。
步骤1-2，构建含有上述CAR融合基因的重组克隆质粒；
根据本发明一种优选的实施方式，以商业化的pUC118载体为骨架，利用限制性内切酶EcoR I和BamH I消化去除其上的GUS基因，并利用T4连接酶将同样经限制性内切酶EcoR I和BamH I处理过的CAR融合基因进行连接，构建含有CAR融合基因的重组克隆质粒。
在进一步优选的实施方式中，将上述构建的重组克隆质粒进行转化、筛选及培养后提取质粒DNA。
在本发明中，将上述构建的重组克隆质粒转化至大肠杆菌E.coli DH-5α感受态细胞中，挑选转化后的阳性单菌落进行PCR鉴定，然后提取质粒。
在更进一步优选的实施方式中，对上述提取的质粒DNA进行酶切和测序鉴定，以保证融合基因序列正确。
在本发明中，对上述质粒进行酶切鉴定，所述内切酶为EcoR I和BamH I，将证实的单克隆送测序机构测序，将测序结果与已知的融合基因标准序列进行比对，以保证融合基因序列正确。
步骤1-3，预测上述CAR融合蛋白的特性；
根据本发明一种优选的实施方式，采用生物信息学手段预测上述CAR融合蛋白的信号肽切割位点、跨膜区位置、融合蛋白二级结构、融合蛋白的细胞膜外区三级结构、融合蛋白的抗原性及其他理化性质。
在本发明中，根据上述CAR融合基因的核苷酸序列，可以得到该融合基因编码的氨基酸序列。
其中，采用SignalP-NN预测信号肽切割位点，采用TMHMM预测跨膜区位置，采用SOPMA预测融合蛋白二级结构，采用SWISS MODEL预测融合蛋白的细胞膜外区三级结构，采用ANTHEPROT 2000预测融合蛋白的抗原性及其他理化性质。
步骤1-4，将上述CAR融合基因接入病毒载体，构建得到CAR病毒表达载体。
根据本发明一种优选的实施方式，所述CAR融合基因接入的病毒载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体中的一种，优选为慢病毒载体。
其中，慢病毒载体是指在人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)基础上改造而成的，能利用逆转录酶和整合酶将目的RNA转变为DNA并整合到宿主细胞的染色体中，从而使目的基因在宿主细胞中长期而稳定的表达。作为逆转录病毒家族中的特别成员，慢病毒与逆转录病毒相比，对分裂细胞(无核膜)和非分裂细胞(有核膜)均具有转导能力，慢病毒的整合前复合体能通过ATP依赖的核孔复合体进入细胞核，从而能稳定且高效的转导各种哺乳动物细胞系和原代细胞。
本发明人经过研究发现，慢病毒载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达目的序列的效果，在转导神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、肝细胞和一些较难转导的细胞如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等的过程中，慢病毒载体能够大大提高目的基因或目的shRNA的转导效率，且能大大增加目的基因或目的shRNA整合到宿主细胞基因组的几率。
在进一步优选的实施方式中，所述慢病毒载体选自pLVX、pCDH或pLNCX中的一种，
优选地，所述慢病毒载体选自pLVX和/或pCDH。
其中，所述pLVX为第二代慢病毒载体，pCDH为第三代慢病毒载体。
二者的区别主要包括以下方面：
(1)二者的启动子的长度不一致，分别为1333bp和545bp；
(2)5'-LTR的长度不一致，分别为635bp和179bp；
(3)3'-LTR的长度不一致，分别为636bp和233p，且pCDH中添加了131bp的SV40polyA序列和146bp的SV40ORI复制起始位点；
(4)GFP(绿色荧光蛋白)不同，分别为ZsGreen1和copGFP；
(5)翻译元件不同，分别为核糖体结合序列IRES和自我剪切序列T2A。
在本发明中，所述pLVX载体包括pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1和pLVX-CMV-IRES-ZsGreen1，所述pCDH载体为pCDH-EF1α-T2A-copGFP。
在更进一步优选的实施方式中，所述慢病毒载体为pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1。
本发明人经过研究发现，根据CAR在转导细胞中的蛋白表达水平可知，当重组慢病毒用于转导293T-17细胞时，慢病毒载体pLVX-CMV-IRES-ZsGreen1最为适合；当重组慢病毒用于转导人外周血T细胞时，慢病毒载体pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1最为适合。由于本发明中研究的是重组慢病毒转导人外周血T细胞，因此优选选择pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1。
根据本发明一种优选的实施方式，分别对慢病毒载体pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1和上述构建的pUC118重组克隆质粒进行双酶切，所述限制性内切酶为EcoR I和BamH I。
在进一步优选的实施方式中，对酶切得到的融合基因片段和慢病毒载体片段进行回收和纯化，再利用连接酶进行连接。
其中，所述连接酶为T4连接酶。
在更进一步优选的实施方式中，将连接产物进行转化、筛选及培养后提取质粒DNA，并对提取的质粒DNA进行酶切鉴定。
在本发明中，将连接产物转化至大肠杆菌E.coli DH-5α感受态细胞中，摇菌培养及涂板后，挑选转化后的阳性单菌落进行PCR鉴定，然后提取质粒，利用EcoR I和BamH I两种内切酶进行酶切，并电泳鉴定。
根据本发明一种优选的实施方式，所述步骤2包括以下子步骤：
步骤2-1，利用步骤1中构建的重组表达载体包装重组病毒；
根据本发明一种优选的实施方式，在进行包装前，培养包装细胞，所述培养为悬浮培养和/或贴壁培养，优选为悬浮培养。
其中，所述包装细胞为HEK-293T-17细胞，是人肾上皮细胞系的衍生细胞株，具有较高的病毒包装能力。
在进一步优选的实施方式中，所述包装细胞在含胎牛血清FBS的DMEM培养基中培养，所述胎牛血清的含量为10％。
其中，所述DMEM培养基是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，广泛应用于疫苗生产和各种初代病毒宿主细胞的细胞培养及单一细胞培养。
在更进一步优选的实施方式中，含有包装细胞的培养基平铺在培养皿中，在37℃、5％的CO2下培养过夜，待用。
根据本发明一种优选的实施方式，将目的质粒、包装质粒和包膜质粒按照一定的比例进行混合，置于DMEM培养液中。
在本发明中，选用的是第二代病毒包装系统，是因为第二代包装出的病毒滴度高，适合本发明中CAR-T细胞的制备要求。所述滴度是稀释度的倒数，病毒滴度即病毒悬液的浓度，就是指pfu的数值。
其中，第二代的包装系统包括包装质粒和包膜质粒，包装质粒主要由pCMV-dR8.91、psPAX2，包膜质粒主要有pMD2.G、pCMV-VSV-G。
在进一步优选的实施方式中，所述目的质粒、包装质粒和包膜质粒的重量比为(3～5)：(1～3)：(0.5～1.5)，优选为(3.5～4.5)：(1.5～2.5)：(0.75～1.25)，更优选为4:2:1，
在6孔板中加入的质粒总量为1.7～3.7ug/孔，优选为2.1～3.3ug/孔，更优选为2.9ug/孔。
在本发明中，采用的第二代三质粒慢病毒包装系统是由转移质粒(目的质粒，即本发明中的重组慢病毒载体)、包装质粒gag/pol和包膜质粒VSV-G组成。其中，所述转移质粒上的目的基因在包装细胞的细胞质中转录为RNA，被包装到病毒颗粒中；控制gag/pol表达的顺式作用序列是在转移质粒上，gag编码病毒的衣壳蛋白，pol编码病毒中的逆转录酶和整合酶，在病毒转导受体细胞后，逆转录酶在细胞质中使目的RNA逆转录为DNA，整合酶在细胞核中使目的DNA整合入受体细胞基因组而稳定表达；VSV-G编码病毒外壳，仅在病毒与受体细胞融合时发挥作用。
由上述可知，所述第二代三质粒慢病毒包装系统中3个质粒的相对重要性等级为：目的质粒＞包装质粒gag/pol＞包膜质粒VSV-G，且如果包膜质粒过量，可能会产生缺核心RNA的空心病毒，因此，本发明中三者的比例设置为(3～5)：(2～4)：(0.5～1.5)。
在更进一步优选的实施方式中，所述包膜质粒与包装质粒的组合为pCMV-dR8.91/pCMV-VSV-G和/或psPAX2/pMD2.G。
优选地，所述包膜质粒与包装质粒的组合为psPAX2/pMD2.G。
根据本发明一种优选的实施方式，所述转染方法选自磷酸钙法、脂质体法或聚醚酰亚胺(PEI)法中的一种，优选为聚醚酰亚胺(PEI)法。
本发明人经过研究发现，磷酸钙法成本低，但操作较为繁琐，需要加入血清来降低磷酸钙对细胞的毒性，受培养基pH的影响非常大，在实验中对溶液配制及实验操作要求很高，而且包装效率较低。脂质体法有商业试剂盒，操作简便，其中Lipofectamine3000优于Lipofectamine 2000，其产病毒时间短，毒性较低，包装病毒滴度较高。但Lipofectamine法成本较高，不适用于大规模包装病毒。PEI法的包装成本低且包装效率比磷酸钙法高，方法简便，对细胞毒性低，适用于大规模包装病毒。
在进一步优选的实施方式中，在DMEM培养液中加入转染试剂聚醚酰亚胺，并混合均匀，所述加入的聚醚酰亚胺与质粒总量的重量比为(2～5)：1，优选为(2.5～4)：1，更优选为3:1。
本发明人经过研究发现，当加入的聚醚酰亚胺与质粒总量的重量比高于5:1时，质粒DNA的量过少，进而导致病毒滴度低，转染效率低；当加入的聚醚酰亚胺与质粒总量的重量比低于2:1时，聚醚酰亚胺-质粒DNA复合物对细胞产生的毒性过大。这主要是因为，聚醚酰亚胺含氮量与质粒DNA的含磷量的比例(即N/P比率)严重影响转染效率，PEI-质粒DNA复合物对细胞有一定的毒性，质粒量过多不仅会造成浪费而且毒性大，质粒量过少则病毒的滴度低。
因此，可以通过调整N/P比率来确定PEI的用量，提高转染效率。
根据本发明一种优选的实施方式，在293T-17细胞为悬浮培养状态下进行转染，在6孔板中的细胞密度为0.8×106个/孔～2.4×106个/孔，优选为1.2×106个/孔～2.0×106个/孔，更优选为1.6×106个/孔。
优选地，所述转染为瞬时转染。
在进一步优选的实施方式中，在转染12～16h后更换培养液。
在更进一步优选的实施方式中，观察转染细胞的绿色荧光蛋白的表达情况，并检测绿色荧光蛋白的表达阳性率。
其中，利用荧光显微镜观察GFP的表达情况，利用流式细胞仪检测GFP的表达阳性率。
根据本发明另一种优选的实施方式，在293T-17细胞为贴壁培养状态下进行转染，转染前24h接种6孔板的细胞密度为4×105个/孔～12×105个/孔，优选为6×105个/孔～10×105个/孔，更优选为8×105个/孔，
相应地，转染时的细胞汇合度为40～100％，优选为50～90％，更优选为70～80％。
本发明人经过研究发现，瞬时转染时采用不同细胞密度常常会导致病毒滴度的明显差异，对不同慢病毒载体其最佳细胞密度也往往不同。
本发明人经过研究发现，当293T-17细胞的汇合度过大时，细胞会在病毒收集前因为接触抑制而大量死亡，不容易包装出病毒；当293T-17细胞的汇合度过小时，细胞量过少，有的质粒接触不到细胞，也不容易包装出病毒。
根据本发明一种优选的实施方式，对包装的重组慢病毒进行滴度测定，所述重组慢病毒的滴度测定方法包括以下步骤：
(1)利用24孔板，在每孔铺293T-17细胞于10％FBS的DMEM培养液中，培养过夜；
其中，每测定1个病毒样品需铺6孔细胞，1孔用做转染前细胞计数，1孔用做未转染对照孔，其余4孔均用做转染孔，但为1个病毒样品的倍比稀释孔。
(2)观察确认转导时细胞汇合度为30～40％，计数其中1孔的细胞数；
(3)转导24h后换液，继续培养48h；
(4)荧光显微镜下选取GFP表达阳性率介于5％-20％的稀释倍数孔做流式检测。
在本发明中，按T＝(P×N)/(D×V)计算滴度，其中，T：titer(TU/ml)，P：GFP阳性细胞％，N：转导时的每孔细胞数，D：所加病毒的稀释倍数，V：每孔加入的稀释的病毒体积(ml)。
步骤2-2，将上述包装后的重组病毒进行浓缩、纯化，得到转导T细胞的重组病毒；
根据本发明一种优选的实施方式，在换液24h和48h后，分别收集病毒原液，并进行初步纯化。
优选地，将两次收集到的病毒原液分别进行初步纯化。
其中，要达到人体基因治疗的要求，重组慢病毒必须去除产品中的蛋白杂质、DNA杂质、内毒素等来确保产品的质量、有效性及安全性。
在进一步优选的实施方式中，将所述病毒原液进行低速离心以除去细胞碎片，所得上清液经过滤膜过滤以除去杂质，所述滤膜的直径为0.45μm。
本发明人经过研究发现，经过超速或高速离心浓缩得到的重组慢病毒的粗品，含有的杂质较多，需要进行纯化。
微孔滤膜法多用于病毒在浓缩之前的初步纯化，适合于病毒等热敏性物质，具高通量、低分辨率的特点，本发明中采用的0.45μm的滤膜，既能有效地滤除较大杂质颗粒，又不致于堵塞滤孔而损失病毒。
在更进一步优选的实施方式中，所述低速离心的速度为3000rpm，所述离心时间为5min。
优选地，检测初步纯化的病毒原液的滴度和纯度。
在本发明中，将初步纯化的重组病毒存放于4℃，待进行浓缩。
根据本发明一种优选的实施方式，将上述得到的初步纯化的重组病毒进行浓缩和进一步纯化，
将上述初步纯化的病毒原液加入蔗糖垫置于离心管中，进行离心，以在浓缩病毒的同时除去部分杂质。
在本发明中，为了获得较高滴度的重组慢病毒用于制备CAR-T，一般需要将存在于上清液中的病毒颗粒浓缩成更小的体积。
其中，在离心管中将蔗糖溶液加在病毒原液的下层，经离心后，较病毒颗粒小的杂质因为悬于蔗糖层中未沉淀到底部而可以被吸弃。
在进一步优选的实施方式中，所述离心的速度为20000～80000g，离心时间为1～3h，离心温度为4℃。
本发明人经过研究发现，当离心速度大于80000g时，较高的浓缩转速产生的剪切力有可能导致慢病毒颗粒破碎，会导致病毒活力降低；当离心速度小于20000g时，病毒的活力恢复率较低。
优选地，所述离心的速度为20000～50000g，离心时间为1.5～2.5h。
更优选地，所述离心的速度为20000g，离心时间为2h。
本发明人经过研究发现，离心速度在0-10000g范围时，滴度随转速线性增加，10000g～90000g范围浓缩的病毒滴度保持稳定，但10000g浓缩的病毒纯度远远高于90000g所浓缩的，这对于提高靶细胞尤其是原代细胞转导效率尤其重要。
在本发明中，当离心速度为20000g，离心2h时，病毒活力的恢复率高且病毒滴度高。
在更进一步优选的实施方式中，将上述离心后的混合物弃掉上清液，剩余病毒沉淀加入PBS进行重悬。
其中，所述加入的PBS的体积为病毒原液体积的1/100。
根据本发明一种优选的实施方式，采用瞬时高速离心法对上述重悬液进行更进一步的纯化。
在进一步优选的实施方式中，所述瞬时高速离心的速度为10000～20000g，时间为0.5～1.5min，优选地，所述瞬时高速离心的速度为15000g，时间为1min。
本发明人经过研究发现，对浓缩病毒液进行瞬时高速离心，可以进一步有效地除去微孔滤膜尚未除去的，较病毒略大(0.1-0.45μm)的杂质，对提高经转导的人外周T细胞的细胞存活率具有极显著的效果，能将细胞存活率从13％提升至97％。
在更进一步优选的实施方式中，将经上述瞬时高速离心得到的上清液取出，分装储存待用，所述储存温度为-80℃。
本发明人经过研究发现，病毒的转导能力在低于-60℃会保存得很好，本发明中所采用的慢病毒，是有包膜的较大的RNA病毒，属于不稳定型，需要储存在极低温度下。
此外，本发明人还发现，病毒滴度随冻融次数显著降低，多次冻融会影响核酸稳定性，因此分装后冻存，以减少冻融次数。
根据本发明一种优选的实施方式，所述步骤3包括以下子步骤：
步骤3-1，人外周血单个核细胞(PBMC)的分离；
根据本发明一种优选的实施方式，抽取患者外周血，经低速离心后除去血浆，并加入PBS稀释。
其中，所述稀释后的血液与抽取的外周血的体积比为2:1，所述PBS为磷酸盐缓冲液。
在进一步优选的实施方式中，将稀释后的血液加入Ficoll淋巴细胞分离液中，进行低速离心。
在更进一步优选的实施方式中，吸取液面交接处的单个核细胞层至新的离心管中，加入PBS离心洗涤细胞。
优选地，在上述得到的细胞中加入完全培养液进行重悬，所述完全培养液为含10％FBS的RPMI1640培养液。
步骤3-2，人外周血T细胞的激活和扩增；
根据本发明一种优选的实施方式，利用磁珠法和/或抗体包被法对PBMC进行激活，优选利用磁珠法进行激活。
其中，磁珠法首先需要将抗体包被到磁珠外表面，具体操作如下：将抗体CD2-Biotin、CD3-Biotin和CD28-Biotin按照浓度比为1:1:1的比例加入到EP管中混合均匀，保证各个抗体的终浓度为10ug/ml，加入待包被的磁珠和Buffer，于4℃摇床放置2h进行抗体的充分包被。
抗体包被法首先需要将抗体包被到培养板的孔底表面，具体操作如下：用PBS配制1ug/ml anti-CD3抗体，如包被于24孔板，则每孔加入150ul，置于4℃过夜或37℃孵育2h进行抗体的充分包被。
本研究所采用的磁珠法的anti-CD3抗体和anti-CD28抗体都是包被状态的；抗体包被法的anti-CD3抗体是包被状态的，anti-CD28抗体是加在培养液中的；此外，磁珠法相比于抗体包被法，多了anti-CD2抗体。本发明人经过研究发现，磁珠法较抗体包被法对PBMC的激活效果好，因此，本发明中优选磁珠法对PBMC进行激活。
在进一步优选的实施方式中，取上述包被好的磁珠，加入不含血清的PRMI1640培养液，经离心洗涤后，加入培养液进行重悬。
在更进一步优选的实施方式中，将磁珠与上述分离好的PBMC按照一定比例进行混合，然后接种至24孔板中，置于培养箱中培养，以激活T细胞。
优选地，所述磁珠与PBMC的比例为1:1、1:2或2:1。
其中，所述24孔板中含有白细胞介素-2(IL-2)，浓度为500IU/mL；所述培养箱中的培养时间为2天。
根据本发明一种优选的实施方式，检测经磁珠刺激后的PBMC的生长状况、生长曲线和CD3+T淋巴细胞的比例。
步骤3-3，将重组病毒转导至T细胞，并进行CAR表达检测。
根据本发明一种优选的实施方式，将上述制备好的重组慢病毒加入经激活的T细胞培养孔中，同时加入聚凝胺。
其中，所述聚凝胺的终浓度为8μg/ml。
在进一步优选的实施方式中，按照MOI为5～40将重组慢病毒加入T细胞培养孔中，所述MOI优选为10～30，更优选为20。
其中，所述MOI指的是转导时病毒与细胞数量的比值。
本发明人经过研究发现，当MOI大于40时，会造成病毒的浪费；当MOI小于5时，总细胞的转导效率和活细胞的转导效率均较低。
在更进一步优选的实施方式中，将24孔板放入离心机中，在1200～1500g下离心2h，然后将24孔板置于培养箱中培养10～14h后换液。
根据本发明一种优选的实施方式，在第一次转导后24h，按上述步骤将重组慢病毒重复转导人外周T细胞。
在进一步优选的实施方式中，向RPMI1640完全培养液中加入白细胞介素-2，以维持T细胞存活和增殖。
根据本发明一种优选的实施方式，在转导人外周T细胞5～8天后，利用流式细胞仪检测活细胞率和GFP阳性率。
在进一步优选的实施方式中，在转导后利用Western blot检测CAR的表达水平。
本发明提供的靶向肿瘤Her2的嵌合抗原受体T细胞的制备方法，转导操作简单，对细胞毒性低；对浓缩重组病毒采用的瞬时高速离心法进行第3道纯化，使转导的人外周T细胞的存活率从13.25％提高到97.40％；使得重组病毒转导人外周血T细胞5天后的活细胞率保持在97.4％的水平，使得重组病毒的表达水平达到理想要求。
本发明的第三方面，提供了一种上述的CAR-T细胞在治疗Her2阳性肿瘤方面的应用，如乳腺癌、卵巢癌、大肠癌、胃癌、膀胱癌或肾细胞癌。
实施例
实施例中，所用试剂来源如下：
慢病毒表达载体pLVX-EF1a-MCS-IRES-ZsGreen1、慢病毒包装载体pSPAX2、pMD2G：购自美国SBI公司；EcoR I限制性内切酶、BamH I限制性内切酶、T4DNA连接酶：购自大连宝生物工程有限公司；HEK293T-17细胞：来自美国组织培养库即ATCC；RPMI1640、DMEM、FBS、PBS：购自美国Gibco公司；CD3ζ抗体：购自美国abcam公司；DMSO、Polybrene、淋巴细胞分离液：购自美国Sigma公司；PEI：购自美国SignaGen公司；重组人IL-2：购自美国Perpro Tech公司；抗人CD3、抗人CD28抗体：购自美国eBioscience公司；抗人IL-2ELISA试剂盒、抗人IFN-γELISA试剂盒：购自杭州联科生物技术股份有限公司；LDH杀伤检测试剂盒：购自东仁化学科技有限公司。
实施例1
(一)
(1-1)本实施例中所应用的信号肽Igκ基因、人源化赫赛汀抗体4D5基因的scFv(anti-Her2scFv)、CD8基因的铰链区(hinge)、CD28基因的跨膜区和胞内区、CD137基因、CD3ζ基因的序列均参考Genebank，根据已知序列分别设计普通PCR引物和SOE-PCR引物进行扩增，扩增得到的目的基因片段经电泳检测确定片段正确，然后对片段进行回收；
利用高保真连接酶对回收的目的基因片段进行SOE-PCR，依次进行连接，每连接一段后进行电泳鉴定，鉴定正确后再次进行下一段目的基因的连接，直至所有目的基因片段连接完成，最终获得CAR融合基因的结构为：EcoR I-Kozak-Igκ-VL-linker-VH-CD8hinge-CD28跨膜区-CD28胞内区-CD137-CD3ζ-BamH I，所得的抗Her2嵌合抗原受体的结构图如图1所示；
对获得的融合基因进行电泳检测鉴定，鉴定正确后回收。
(1-2)将上述得到的CAR融合基因和pUC 118载体同时利用限制性内切酶EcoR I和BamH I进行处理，然后将处理后的片段进行电泳回收后，利用T4连接酶进行连接，构建pUC118重组克隆质粒；
将重组克隆质粒转化至大肠杆菌E.coli DH-5α感受态细胞中，挑选转化后的阳性单菌落进行PCR鉴定，然后提取质粒，对重组克隆质粒进行双酶切及电泳检测，确保CAR融合基因序列正确。
(1-3)针对CAR融合蛋白，采用SignalP-NN预测信号肽切割位点，结果如图2所示，可知，该融合蛋白最可能的信号肽断裂位点在第22个和第23个氨基酸之间；采用TMHMM预测跨膜区位置，结果如图3所示，可知跨膜区位于融合蛋白第323-345aa之间，1-322aa为细胞膜外区，346-549aa为细胞膜内区；采用SOPMA预测融合蛋白二级结构，结果如图4所示，其中，h:α-螺旋(21.68％)，e:β-折叠(24.4％)，t:β-转角(10.02％)，c:无规则卷曲(43.9％)；采用SWISS MODEL预测融合蛋白的细胞膜外区三级结构，结果如图5所示；采用ANTHEPROT2000预测融合蛋白的抗原性及其他理化性质，结果如图6所示。
(1-4)利用限制性内切酶EcoR I和BamH I分别对慢病毒载体pLVX-EF1α-IRES-ZsGreen1和pUC118重组克隆质粒进行双酶切，然后将酶切后的片段进行电泳回收后，利用T4连接酶进行连接，构建重组慢病毒表达载体，命名为pLVX-EF1α-CAR-IRES-ZsGreen1；
将构建的重组慢病毒表达载体进行菌落PCR鉴定，同时经EcoR I和BamH I双酶切鉴定，并进行电泳检测。
(二)
(2-1)在转染前，将293T-17细胞悬浮于2ml含10％FBS的DMEM中，铺在6孔板中，37℃，5％CO2培养过夜；
将重组慢病毒质粒pLVX-EF1α-CAR-IRES-ZsGreen1、pSPAX2和pMD2.G按照重量比为4:2:1置于DMEM培养液中，充分混匀；再将总质粒(pLVX-EF1α-CAR-IRES-ZsGreen1、pSPAX2和pMD2.G)与PEI按重量比为1:3(分别为2.9ug/孔和8.7ug/孔)的比例混合均匀，静置20min；
进行转染时，将293T-17细胞接种于6孔板中，其中，细胞为悬浮状态，细胞密度为16×105个/孔，将转染试剂与慢病毒总质粒的混合物逐滴加入细胞培养液中，在转染12～16h后更换培养液；
在转染293T-17细胞48h和72h后，利用荧光显微镜观察GFP的表达情况，
在转染293T-17细胞72h后，利用流式细胞仪检测GFP的表达阳性率；
24孔板每孔铺7×104个293T-17细胞于500ul 10％FBS/DMEM培养液中，培养过夜。每测定1个病毒样品需铺6孔细胞，1孔用做转导前细胞计数，1孔用做未转导对照孔，其余4孔均用做转导孔，但为1个病毒样品的倍比稀释孔。观察确认转导时细胞汇合度为30-40％，计数细胞数；转导24h后换液，继续培养48h，荧光显微镜下选取GFP表达阳性率介于5％-20％的稀释倍数孔做流式检测，按T＝(P×N)/(D×V)计算滴度。T：titer(TU/ml)，P：GFP阳性细胞％，N：转导时的每孔细胞数，D：所加病毒的稀释倍数，V：每孔加入的稀释的病毒体积(0.2ml)。
(2-2)在换液24h后，将病毒原液于3000rpm离心5min，上清用0.45μm的滤膜过滤；在换液48h后，再次收集病毒原液，并将病毒原液于3000rpm离心5min，上清用0.45μm的滤膜过滤；
将两次收集并过滤后的病毒原液合并，在其下层加入20％的蔗糖垫置于超离管中，于20000g，4℃离心2h，所得沉淀用1/100病毒原液体积的PBS重悬，每隔30min重悬1次，共重悬4次，置于4℃过夜溶解；
进一步地，经15000g瞬时高速离心1min，将上清液取出，分装储存待用，所述储存温度为-80℃。
(三)
(3-1)抽取10ml健康志愿者外周血(EDTA抗凝)，低速离心尽量吸去血浆，用PBS稀释至20ml，在离心管中加入10ml Ficoll淋巴细胞分离液，再加入20ml经PBS稀释后的血液，低速离心，吸取单个核细胞层置入新离心管中，加PBS离心洗涤细胞，用RPMI1640完全培养液1ml重悬细胞。
(3-2)将10ug/100ul CD2-Biotin、10ug/100ul CD3-Biotin、10ug/100ul CD28-Biotin加入到2ml EP管中充分混匀(各抗体终浓度为10ug/ml)，再加入500ul磁珠(1×108)，加入200ul Buffer，于4℃摇床放置2h，进行抗体的充分包被，然后于4℃保存；
取包被好的磁珠10ul(1×106个)，于1.5ml EP管中，加入RPMI1640培养液，离心洗涤2次，加入100ul培养液重悬磁珠，将磁珠与细胞以1:1充分混匀，接种至24孔板中，含IL-2为500IU/ml，置培养箱中培养2天，以激活细胞；
检测经磁珠刺激后的PBMC的生长状况、生长曲线和CD3+T淋巴细胞的比例。
(3-3)取步骤2中制备的浓缩病毒，按照MOI为20加入经激活的细胞培养孔中，细胞密度为2×105个/200ul/孔，并加入终浓度为8ug/ml的polybrene；将24孔板放入平板转子中1200-1500g离心2h，再培养10-14h后换液；
第一次转导后24h，重组慢病毒重复转导人外周血T细胞，条件同第一次转导，向RPMI1640完全培养液中加入终浓度为500IU/ml左右的IL-2以维持T细胞存活和增殖；
在转导人外周T细胞5天后，利用流式细胞仪检测活细胞率和GFP阳性率；
在转导人外周T细胞后，利用Western blot检测CAR的表达水平。
实施例2～3
实施例2～3中所用方法与实施例1相似，区别仅在于步骤(一)的(1-4)中所用慢病毒载体分别为pCDH-EF1α-T2A-copGFP和pLVX-CMV-IRES-ZsGreen1，构建的重组慢病毒表达载体分别命名为pCDH-EF1α-CAR-T2A-copGFP和pLVX-CMV-CAR-IRES-ZsGreen1，结构分别如图7中B和C所示。
实施例4～5
实施例4～5所用方法与实施例1相似，区别仅在于步骤(二)的(2-1)中采用的重组慢病毒质粒分别为pCDH-EF1α-CAR-T2A-copGFP和pLVX-CMV-CAR-IRES-ZsGreen1。
实施例6
实施例6所用方法与实施例3相似，区别仅在于步骤(二)的(2-1)中进行转染时细胞为贴壁状态，转染前24h接种细胞密度为8×105个/孔，转染时细胞密度为2×106个/孔。
实施例7～8
实施例7～8所用方法与实施例3相似，区别仅在于步骤(二)的(2-1)中进行转染时细胞为悬浮状态，细胞密度分别为0.8×106个/孔和2.4×106个/孔。
实施例9
本实施例所用方法与实施例3相似，区别仅在于步骤(二)的(2-1)中所用的包装质粒和包膜质粒为pCMV-dR8.91/pVSV-G。
实施例10～14
实施例10～14所用方法与实施例3相似，区别仅在于步骤(二)的(2-1)中质粒的总量分别为1.7ug/孔、2.1ug/孔、2.5ug/孔、3.3ug/孔和3.7ug/孔。
实施例15～19
实施例15～19所用方法与实施例3相似，区别仅在于步骤(二)的(2-1)中目的质粒：包装质粒：包膜质粒的重量比分别为4:3:1、3:3:1、3:2:1、2:1:1和1:1:1。
实施例20～22
实施例20～22所用方法与实施例3相似，区别仅在于步骤(二)的(2-2)中在病毒原液的下层加入蔗糖后，分别于10000g、50000g和82700g下离心。
实施例23
实施例23所用方法与实施例3相似，区别仅在于步骤(二)的(2-2)中在病毒原液的下层未加入蔗糖进行离心，不进行瞬时高速离心。
实施例24
实施例24所用方法与实施例3相似，区别仅在于步骤(二)的(2-2)中不进行瞬时高速离心。
实施例25
实施例25所用方法与实施例1相似，区别仅在于步骤(三)的(3-2)中采用抗体包被法进行激活T细胞。
实施例26～29
实施例26～29所用方法与实施例1相似，区别仅在于步骤(三)的(3-3)中将浓缩重组病毒分别以MOI为5、10、20和40转导Jurkat T细胞。
对比例
对比例1
本对比例所用方法与实施例1相似，区别仅在于步骤(三)的(3-2)中人外周血T细胞中未加任何刺激。
对比例2
本对比例所用方法与实施例26～29相似，区别仅在于步骤(三)的(3-3)中将浓缩重组病毒以MOI为0转导Jurkat T细胞。
对比例3
本对比例为步骤(三)中从人外周血分离活化的T细胞，不含CAR。
对比例4
本对比例所用样品为未经转染的293T-17细胞。
实验例
实验例1
对实施例1～3中步骤(一)中制备的重组慢病毒表达载体进行菌落PCR电泳检测，结果如图8所示；对实施例1～3中步骤(一)中制备的重组慢病毒表达载体进行双酶切鉴定，电泳检测结果如图9所示。
由图8和图9可知，实施例1～3均成功构建了重组慢病毒表达载体。
实验例2
在实施例1、4和5中的重组慢病毒质粒转染293T-17细胞48h和72h后，利用荧光显微镜观察GFP的表达情况，结果如图10所示，由图可知，在可见光与荧光视野下，实施例4和5中的具荧光细胞的比例较实施例1中的明显高。
在实施例1、4和5中的重组慢病毒质粒转染293T-17细胞72h后，利用流式细胞仪检测实施例1、4、5和对比例4的细胞中GFP的表达阳性率，结果如图11所示，由图可知，实施例4和5中GFP表达阳性细胞率分别为95.8％、95.9％，较实施例1的81.4％明显高。
实验例3
对实施例1、4和5中的重组慢病毒原液经流式细胞仪测定后计算滴度，其中，按T＝(P×N)/(D×V)计算滴度，T：titer(TU/ml)，P：GFP阳性细胞％，N：转导时的每孔细胞数，D：所加病毒的稀释倍数，V：每孔加入的稀释的病毒体积。
结果显示，滴度的大小顺序为：实施例1＜实施例4＜实施例5。由此可知，重组慢病毒在包装环节即当重组慢病毒用于转导293T-17细胞时采用pLVX-CMV-CAR-IRES-ZsGreen1载体最适合。
实验例4
比较分析实施例3、6～8中细胞在悬浮与贴壁培养状态下转染的滴度，结果如图12所示，结果显示，实施例3中的滴度显著高于实施例6中的滴度，实施例7中的滴度最低。由此可知，包装重组慢病毒的培养体系中，以转染时细胞为悬浮状态，细胞密度为1.6×106个/孔的最佳。
实验例5
比较分析实施例3和9的滴度，结果如图13A所示，可知实施例3中的包装体系的滴度显著高于实施例9中的滴度。
比较分析实施例3与实施例10～14的滴度，结果如图13B所示，可知实施例3所述质粒总量的滴度最高。
比较分析实施例3与实施例15～19的滴度，结果如图13C所示，以实施例3中所述的4:2:1最佳。
实验例6
比较分析实施例3和实施例20～22不同离心速度下浓缩后的病毒滴度，结果显示，实施例20的滴度最低，实施例3的滴度最高，实施例21和22的离心速度远大于实施例3的离心速度，但其滴度却均小于实施例3的滴度。
比较分析实施例3和实施例20～22不同离心速度下浓缩后的病毒活力恢复率，结果显示，实施例20的病毒活力恢复率最低，实施例3的病毒活力恢复率最高，实施例21和22的离心速度远大于实施例3的离心速度，但其病毒活力恢复率却均小于实施例3的滴度。
实验例7
比较分析实施例3、23和24所述方法对重组慢病毒的纯化效果及对病毒活力恢复率的影响，结果如表1所示。
表1 实施例3、23和24所述方法对重组慢病毒的纯化效果及其对病毒活力恢复率的影响
其中，病毒原液滴度为(0.317±0.009)×107TU/ml；实施例24与实施例23比较，实施例3与实施例24比较，*：P＜0.05，***：P＜0.001。
由表1可知，实施例24与实施例23比较，蛋白纯度显著提高(P＜0.05)，病毒滴度、病毒活力恢复率、DNA纯度、内毒素含量、转导人外周T细胞5天后的细胞存活率无显著性变化；实施例3与实施例24比较，蛋白纯度显著提高(P＜0.05)，DNA纯度、转导人外周T细胞5天后的细胞存活率极显著提高(P＜0.001)，内毒素含量无显著性变化，尽管病毒滴度、病毒活力恢复率极显著降低(P＜0.001)。由上述可知，瞬时离心法对提高经转导的人外周T细胞的细胞存活率(％)具有极显著的效果，细胞存活率从13.25％提高到97.40％，使制备CAR-T细胞的瓶颈环节的技术突破。
实验例8
比较分析实施例1、25和对比例1所述方法刺激的PMBC的生长状况，结果如图14所示，生长曲线如图15所示，
由图14和图15可知，实施例1中所用的磁珠法能够较大程度的激活T细胞。
经流式细胞仪检测PBMC经实施例1和实施例25所述方法刺激2天和4天后的CD3+T淋巴细胞的比例，结果如图16所示，可知，实施例1中所用的磁珠法刺激的PBMC的CD3+T淋巴细胞的比例显著高于实施例25中的。
实验例9
利用流式细胞仪检测实施例26～29和对比例2中所述方法转导5天后7-AAD染色阴性的活细胞率和GFP阳性率(转导效率)，结果如图17所示，MOI值为0、5、10、20、40时的总活细胞率分别为99.23％、99.3％、98.7％、99.0％、98.9％，总GFP阳性率分别为1.05％、26.9％、49.32％、67.13％、71.64％，活细胞的GFP阳性率分别为0.63％、26.6％、48.2％、66.4％、70.8％。
其中，MOI值10的较5的、MOI值20的较10的均极显著增加(P＜0.01)，而MOI值40的较20的未显著增加，所以最佳MOI值为20，再多则浪费病毒。
实验例10
利用Western blot分别检测实施例1～3中三种慢病毒载体分别转导293T-17细胞和人外周血T细胞后的CAR(含外源性CD3ζ)的表达水平，分别以tublin和内源性CD3ζ为内参，结果如图18所示，可知，从CAR在293T-17细胞中的蛋白表达水平看，实施例3中所述载体pLVX-CMV-CAR-IRES-ZsGreen1最佳，从CAR在人外周血T细胞中的蛋白表达水平看，实施例1中所述载体最佳，当重组慢病毒用于转导人外周血T细胞(即用于制备CAR-T细胞)时应该采用载体pLVX-EF1α-CAR-IRES-ZsGreen1。
实验例11
以对比例3中的不含CAR的人外周血T细胞与BT474细胞共培养为对照组，实施例1中的含CAR的人外周血T细胞与BT474细胞共培养为实验组，利用倒置相差显微镜观察CAR-T细胞与Her2阳性乳腺癌细胞BT474的结合能力，结果如图19所示，可以明显看出，实施例1中的含CAR的人外周血T细胞与Her2阳性乳腺癌细胞BT474紧密结合，结合能力显著高于对比例3中的不含CAR的人外周血T细胞。
实验例12
以实施例1中含CAR的人外周血T细胞与Her2阴性乳腺癌细胞MCF7细胞共培养为对照组1，以对比例3中不含CAR的人外周血T细胞与Her2阳性乳腺癌细胞BT474细胞共培养为对照组2，以实施例1中含CAR的人外周血T细胞与Her2阳性乳腺癌细胞BT474细胞共培养为实验组，共培养48h后分别采用联科生物的Human IL-2 ELISA kit、Human IFN-γELISAkit，检测上清液中IL-2、IFN-γ含量，结果如图20所示，结果显示对照组1和对照组2中的上清液中IL-2和IFN-γ含量均较低，实验组中含CAR的人外周血T细胞与Her2阳性乳腺癌细胞BT474细胞共培养中的上清液中IL-2和IFN-γ含量均极显著增加。由此说明，实施例1中的含CAR的人外周血T细胞被靶细胞显著活化。
实验例13
以实施例1中含CAR的人外周血T细胞与Her2阴性乳腺癌细胞MDA231细胞共培养为对照组1，以对比例3中不含CAR的人外周血T细胞与Her2阳性乳腺癌细胞BT474细胞共培养为对照组2，以实施例1中含CAR的人外周血T细胞与Her2阳性乳腺癌细胞BT474细胞共培养为实验组，采用东仁化学科技有限公司的Cytotoxicity LDH Assay Kit，LDH法检测在不同效靶比(效应T细胞与肿瘤靶细胞的比值)下CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，结果如图21所示。
从图中可以看出，随着效靶比的增大，对照组1、2和实验组中CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用逐渐增强，实验组的杀伤作用较对照组均有显著增加，当效靶比为16:1时，杀伤作用最大。
以上结合了优选的实施方式对本发明进行了说明，不过这些实施方式仅是范例性的，仅起到说明性的作用。在此基础上，可以对本发明进行多种替换和改进，这些均落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种靶向肿瘤Her2的嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞，其特征在于，所述靶向肿瘤Her2的嵌合抗原受体T细胞中的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞膜外抗原结合区、铰链区、跨膜区和胞内信号传导区，其中，所述细胞膜外抗原结合区包括抗Her2的单链抗体scFv，以特异性靶向Her2过度表达的肿瘤细胞；
所述胞内信号传导区包括基本刺激信号分子和共刺激信号分子，所述共刺激信号分子具有两个，形成双共刺激结构域，以充分激活T细胞的抗肿瘤活性。
2.根据权利要求1所述的靶向肿瘤Her2的嵌合抗原受体T细胞，其特征在于，所述双刺激信号分子选自CD28、CD137/4-1BB、CD134/OX40、DAP 10或ICOS中的两种。
3.一种如权利要求1或2中所述的靶向肿瘤Her2的嵌合抗原受体T细胞制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤1，构建CAR融合基因，并构建包含该融合基因的重组病毒表达载体；
步骤2，利用上述构建的重组病毒表达载体制备转导T细胞的重组病毒；
步骤3，将上述重组病毒转导至分离的T细胞中，使得融合基因表达于T细胞膜上，制得靶向肿瘤Her2的嵌合抗原受体T细胞。
4.根据权利3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1包括以下子步骤：
步骤1-1，获取CAR各个区域的目的基因片段，然后进行连接，制备得到CAR融合基因；
步骤1-2，构建含有上述CAR融合基因的重组克隆质粒；
步骤1-3，预测上述CAR融合基因编码的融合蛋白的特性；
步骤1-4，将上述CAR融合基因接入病毒载体，构建得到CAR病毒表达载体；
优选地，步骤1-4中，所述病毒载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺病毒载体中的一种，更优选地，步骤1-4中，所述病毒载体为慢病毒载体。
5.根据权利3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2包括以下子步骤：
步骤2-1，利用步骤1中构建的重组病毒表达载体包装重组病毒；
步骤2-2，将上述包装后的重组病毒进行浓缩、纯化，得到转导T细胞的重组病毒；
优选地，步骤2-1中，利用包装质粒和包膜质粒对重组病毒质粒进行包装，所述重组病毒质粒、包装质粒和包膜质粒的重量比为(3～5)：(1～3)：(0.5～1.5)，优选为(3.5～4.5)：(1.5～2.5)：(0.75～1.25)，更优选为4:2:1。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤2-2中，利用滤膜对所述重组病毒进行初步纯化，
利用蔗糖垫高速离心对重组病毒进行进一步纯化，所述离心的速度为20000～80000g，离心时间为1～3h，离心温度为4℃。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤2-2中，在对重组病毒进行蔗糖垫高速离心纯化之后，再进行瞬时高速离心，以更进一步纯化，所述离心的速度为10000～20000g，时间为0.5～1.5min。
8.根据权利3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3包括以下子步骤：
步骤3-1，对人外周血单个核细胞进行分离；
步骤3-2，激活和扩增人外周血T淋巴细胞；
步骤3-3，将制备的重组病毒转导入激活的人外周血T淋巴细胞。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，步骤3-3中，所述重组病毒转导入人Jurkat T淋巴细胞的MOI为5～40，优选为10～30。
10.一种权利要求1或2所述的靶向肿瘤Her2的嵌合抗原受体T细胞在治疗Her2阳性肿瘤方面的应用，如乳腺癌、卵巢癌、大肠癌、胃癌、膀胱癌或肾细胞癌。
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