CN113735981B - Cd19-car-t细胞及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及CD19‑CAR‑T细胞及其制备方法。一方面，本发明涉及一种编码的嵌合抗原受体，包括作为第一信号的抗原结合结构域、跨膜结构域、作为第二信号的细胞内传导结构域、表达IL‑7和CCL‑17细胞因子的第三信号域、以及分泌中和PD‑1、GM‑CSG的anti‑PD‑1、anti‑GM‑CSF scFv的第四信号域。另一方面，本发明涉及一种CAR‑T细胞，其能够分泌表达IL‑7、CCL17因子和/或PD‑1、GM‑CSF抗体。另一方面，本发明涉及制备CAR‑T细胞的方法，以及它们治疗肿瘤的用途。

Description

CD19-CAR-T细胞及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分泌IL-7和CCL-17因子，以及分泌中和PD-1和GM-CSF的anti-PD-1与anti-GM-CSFscFv的CD19-CAR-T细胞，本发明还涉及此CD19-CAR-T细胞的制备方法及其用途，尤其是在制备用于治疗肿瘤的治疗剂中的用途。
技术背景
美国食品药品监督管理局(FDA)2017年8月批准了第一个基因治疗产品Kymriah，此产品能够很好的治疗一些患有急性淋巴细胞白血病(ALL)的儿童和年轻人患者。Kymriah是一种基因改良的自体T细胞免疫疗法，即嵌合抗原受体T(CAR-T)免疫疗法。CAR-T免疫疗法是一种以嵌合型抗原受体为基础的细胞免疫治疗方案，通过体外基因转导技术，将编码嵌合抗原受体CAR-T基因序列导入T细胞中，生成可以结合靶抗原的肿瘤特异性T细胞。最常见的CARs包括了一段抗原识别区，比如单克隆抗体(mAb)的单链可变区段(scFv)，和激活T细胞胞内信号域的TCRζ链。
靶向CD19的CAR-T细胞已经在临床前和临床中表现出惊人的效果，现有研究表明IL-7能延长免疫细胞的存活能力，也能刺激成熟T细胞增殖等，所以IL-7因子可以增强免疫细胞在体内存活时间及抗肿瘤效果；CCL-17也被称作胸腺和活化调节趋化因子，能够提高内源性免疫细胞向肿瘤细胞的聚集能力，进一步增强免疫细胞的抗肿瘤效果。但该疗法却受到其相关毒副作用的限制，如细胞因子释放综合症和神经毒性等。细胞因子综合症主要指免疫细胞与肿瘤细胞作用的过程中，大量释放细胞因子以至于引起进一步的连锁反映，如过度炎症引起的高热寒战、呼吸困难、凝血障碍等，神经毒性引起的头疼、意识模糊、认知改变、语言障碍等症状，最终危及生命。近期，有研究表明单核细胞和巨噬细胞促进CAR-T细胞治疗后的CRS和神经毒性进展，中和巨细胞集落刺激因子(GM-CSF)能够减缓CAR-T细胞治疗后的CRS及神经毒性，且不会抑制CAR-T的功能(Sterner RM,Sakemura R,Cox MJ.GM-CSFinhibition reduces cytokine release syndrome and neuroinflammation butenhances CAR-T cell function in xenografts.Blood.2019Feb 14；133(7):697-709.doi:10.1182/blood-2018-10-881722.Epub2018 Nov 21.)。利用RNA干扰技术高效率敲低CAR-T细胞内GM-CSF表达或分泌表达中和GM-CSF的anti-GM-CSF scFv，预防或减缓细胞因子释放综合症和神经毒性的发生发展，提高CAR-T疗法的安全性。
在CAR-T细胞治疗肿瘤方面还有肿瘤微环境和免疫应答方面具有十分重要的作用，为了消除肿瘤细胞，需要激活自身免疫系统，免疫细胞的激活与扩增成为消除肿瘤的关键因素，而免疫细胞如T细胞会被肿瘤微环境中免疫检查点分子所抑制，如程序性死亡受体(PD-1)，PD-1在机体中可以下调免疫系统对人体细胞的反映，以及通过抑制T细胞炎症活动来调节免疫系统并促进自身耐受，预防自身免疫性疾病产生，但也可以结合传导抑制性信号，如结合PDL-1配体诱导导致细胞死亡(AICD)产生，限制了体内免疫细胞或CAR-T细胞在体内的持续存在。所以通过PD-1抗体来封闭PD-1免疫检查点，进而修复CAR-T细胞的功能。
因此，本领域仍然期待有改进的肿瘤治疗的方法，例如需要有优良性能的分泌IL-7和CCL-17因子，以及分泌中和PD-1和GM-CSF的anti-PD-1与anti-GM-CSFscFv的CD19-CAR-T细胞。
发明内容
本发明的目的在于改进肿瘤治疗的方法，例如提供一种具有优良性能的分泌IL-7和CCL-17因子，以及分泌中和PD-1和GM-CSF的anti-PD-1与anti-GM-CSFscFv的CD19-CAR-T细胞。
本发明制得的CAR-T细胞亦可称为CD19-CAR-T细胞。
针对目前CAR-T技术实际需求，本发明提供了共表达IL-7和CCL17的CD19 CAR表达质粒的构建，不仅能将IL-7分泌到T细胞外，而且使CCL-17最大程度招募外周血免疫细胞，进一步提高CAR-T的肿瘤细胞杀伤能力。为了增强杀伤效果及降低CRS及神经毒性副作用，同时构建分泌中和PD-1、GM-CSF的anti-PD-1、anti-GM-CSFscFv的质粒。
为达到此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种嵌合抗原受体，包括：
a)作为第一信号的抗原结合结构域、
b)跨膜结构域、
c)作为第二信号的细胞内传导结构域、以及
d)表达IL-7和CCL-17细胞因子的第三信号域。
根据本发明第一方面的编码的嵌合抗原受体，其包含序列2所示的氨基酸序列。
第二方面，本发明还提供一种重组质粒，其具有如序列1所示的核苷酸序列。
第三方面，本发明还提供一种CAR-T细胞，其能够分泌表达IL-7、CCL17因子和/或PD-1、GM-CSF抗体。
根据本发明第三方面的CAR-T细胞，其转染了表达前述嵌合抗原受体的序列。
第四方面，本发明进一步提供了制备CAR-T细胞的方法，其包括以下步骤：
(1)质粒合成：
使用载体pLVX-EF1a-IRES-PGK-puro合成CAR-19-1质粒，该质粒是由CD19单链可变区、CD8a铰链区、CD8a跨膜区、4-1BB信号、CD3ζ的包浆信号、IL-7、CCL17序列构成，并且具有序列1所述核苷酸序列；
使用载体pLVX-EF1a-IRES-PGK-puro合成CAR-19-2质粒，该质粒是由CD19单链可变区、CD8a铰链区、CD8a跨膜区、4-1BB信号、CD3ζ的包浆信号序列构成，并且具有序列3所述核苷酸序列；
使用载体pLVX-mCherry-C1合成CAR-19-3质粒，该质粒是由anti-PD-1scFv单链可变区、anti-GM-CSF scFv单链可变区序列构成，并且具有序列5所述核苷酸序列；
(2)病毒包装：
使用Invitrogen Lipofectamine 3000转染试剂即Lip3000进行病毒包装，293T培养基为添加10％FBS的DMEM-H培养基，慢病毒包装培养基为添加1％GlutaMAX、1mM丙酮酸钠、5％FBS的Opti-MEMI培养基；
将293T细胞以7x106个细胞/孔的密度接种于含12mL的慢病毒包装培养基的10cm培养皿中，置于37℃、5％CO2条件下孵育细胞过夜至293T细胞密度达95％；
将孵育过夜的培养皿每皿去除6mL的慢病毒包装培养基，接着向每个皿中加入6mL的A液-B液混合液，轻混使其分布均匀后置于37℃、5％CO2条件下孵育进行转染；转染6小时后更换293T培养基继续孵育；
至转染24小时后，收集12mL细胞上清液，并加入提前预热的12mL的293T培养基，继续于37℃、5％CO2条件下孵育进行转染；
至转染54小时后第二次收集细胞上清液，与首次收集上清液混合，得细胞上清液；
在室温下，将上一步骤收集的细胞上清液以2000rpm离心10分钟，去除细胞碎片沉淀物，再使用0.45μm滤器过滤上清，得病毒上清液；
按照病毒上清液与浓缩试剂以体积比5:1的比例混合，4℃孵育2h，然后于4℃处离心至离心管底有沉淀(米白色)；
小心移去上清，加入适量体积的DMEM重悬沉淀，得到慢病毒浓缩液，测定其病毒滴度；
(3)T细胞制备：
向含有1mL全血的EP管内添加生物素标记CD8抗体，室温混合30分钟；
再向上述1mL全血内添加150μL微泡，室温混合20分钟，将微泡和被抗体标记的细胞结合，离心；
用200μL移液枪将白色微泡层轻轻转移至另一个2mL的EP管内，用500μL微泡缓冲液冲洗附着在管壁和移液管头上的微泡，并入EP管内，室温下孵育30min；上述微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液：氯化钾200mg/L、磷酸二氢钾200mg/L、氯化钠8000mg/L、七水磷酸氢二钠2160mg/L、1％人血清白蛋白、2mM EDTA；
用超声波破泡，离心，收集细胞沉淀，制得T细胞为CD8+T细胞，对其进行流式细胞仪鉴定；
(4)T细胞激活、转导与扩增：
将收集的CD8+T细胞以5x105个细胞/mL接种于24孔板/6孔板中，使用激活培养基刺激24-48小时，接着加入慢病毒浓缩液(MOI＝10)以及转导培养基进行病毒转导，24-48小时后换成维持培养基；扩增至6-8天时，收获CAR-T细胞。
根据本发明第四方面的方法，其中所述A液-B液混合液是将A液与B液混匀后置室温孵育15min得到的；A液配置：将Opti-MEMI减血清培养基恢复至室温，使用1.5ml的Opti-MEMI与41μL的Lip3000在10cm皿中混匀，得A液；B液配置：将1.5ml的Opti-MEMI、35μL的P3000 Enhancer、12μg质粒混合物混合，得B液。(在转导类型为CAR-1＝(CAR-19-1)+(CAR-19-3)的情况下质粒混合物的质粒比为PMD2.G：pSPAX2：(CAR-19-1/CAR-19-3)＝1:3:(4/3)，在转导类型为CAR-2＝(CAR-19-2)+(CAR-19-3)的情况下质粒混合物的质粒比为PMD2.G：pSPAX2：(CAR-19-2/CAR-19-3)＝1:3:(3.5/3)，在转导类型为CAR-3＝(CAR-19-2)的情况下质粒混合物的质粒比为PMD2.G:pSPAX2:CAR-19-2＝1:3:3.5，在转导类型为CAR-4＝(CAR-19-1)的情况下质粒混合物的质粒比为PMD2.G：pSPAX2：CAR-19-1＝1:3:4)。
根据本发明第四方面的方法，其中激活培养基是包含30ng/mL anti-CD3和20ng/mL CD28的X-VIVOTM15 Medium；转导培养基是包含200U/mL IL-2和5μg/mL Polybrene的X-VIVOTM15Medium；维持培养基是包含200U/mL IL-2的X-VIVOTM15 Medium。
根据本发明第四方面的方法，其中T细胞制备时所用的微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液：氯化钾200mg/L、磷酸二氢钾200mg/L、氯化钠8000mg/L、七水磷酸氢二钠2160mg/L、1％人血清白蛋白(HAS)、2mM EDTA、酒石酸钠25mg/L、脯氨酸120mg/L。如本文所述的，出人意料的发现，使用同时包含酒石酸钠和脯氨酸的微泡缓冲液处理后所得T细胞中CD8+T细胞占分选后总单个核细胞的比例显著高于不加二种试剂的情形。
根据本发明第四方面的方法，其具有如实施例1～4所述的操作步骤。
第五方面，本发明提供一种编码的嵌合抗原受体，包括：
a)作为第一信号的抗原结合结构域、
b)跨膜结构域、
c)作为第二信号的细胞内传导结构域、
d)表达IL-7和CCL-17细胞因子的第三信号域、以及
e)分泌中和PD-1、GM-CSF的anti-PD-1、anti-GM-CSF scFv的第四信号域。
根据本发明第五方面的编码的嵌合抗原受体，其包含序列1所示的核苷酸序列。
根据本发明第五方面的编码的嵌合抗原受体，其包含序列2所示的氨基酸序列。
根据本发明第五方面的编码的嵌合抗原受体，其包含序列5所示的核苷酸序列。
根据本发明第五方面的编码的嵌合抗原受体，其包含序列6所示的氨基酸序列。
根据本发明第五方面的编码的嵌合抗原受体，其包含序列1和序列5所示的核苷酸序列。
根据本发明第五方面的编码的嵌合抗原受体，其包含序列2和序列6所示的氨基酸序列。
第六方面，本发明还提供一种重组质粒，其具有如序列1所示的核苷酸序列。
本发明第六方面还提供一种重组质粒，其具有如序列5所示的核苷酸序列。
本发明第六方面还提供一种重组质粒，其包含序列1和序列5所示的核苷酸序列。
第七方面，本发明还提供一种重组质粒，其具有如序列2所示的氨基酸序列。
本发明第七方面还提供一种重组质粒，其具有如序列6所示的氨基酸序列。
本发明第七方面还提供一种重组质粒，其包含序列2和序列6所示的氨基酸序列。
第八方面，本发明还提供一种CAR-T细胞，其能够分泌表达IL-7、CCL17因子和/或PD-1、GM-CSF抗体。
根据本发明第八方面的CAR-T细胞，其转染了本发明任一项所述的编码的嵌合抗原受体序列。
第九方面，本发明进一步提供了制备CAR-T细胞例如本发明第八方面的CAR-T细胞的方法，其包括以下步骤：
(1)质粒合成：
使用载体pLVX-EF1a-IRES-PGK-puro合成CAR-19-1质粒，该质粒是由CD19单链可变区、CD8a铰链区、CD8a跨膜区、4-1BB信号、CD3ζ的包浆信号、IL-7、CCL17序列构成，并且具有序列1所述核苷酸序列和序列2所述氨基酸序列；
使用载体pLVX-EF1a-IRES-PGK-puro合成CAR-19-2质粒，该质粒是由CD19单链可变区、CD8a铰链区、CD8a跨膜区、4-1BB信号、CD3ζ的包浆信号序列构成，并且具有序列3所述核苷酸序列和序列4所述氨基酸序列；
使用载体pLVX-mCherry-C1合成CAR-19-3质粒，该质粒是由anti-PD-1scFv单链可变区、anti-GM-CSF scFv单链可变区序列构成，并且具有序列5所述核苷酸序列和序列6所述氨基酸序列；
(2)病毒包装：
使用Invitrogen Lipofectamine 3000转染试剂即Lip3000进行病毒包装，293T培养基为添加10％FBS的DMEM-H培养基，慢病毒包装培养基为添加1％GlutaMAX、1mM丙酮酸钠、5％FBS的Opti-MEMI培养基；
将293T细胞以7x106个细胞/孔的密度接种于含12mL的慢病毒包装培养基的10cm培养皿中，置于37℃、5％CO2条件下孵育细胞过夜至293T细胞密度达95％；
将孵育过夜的培养皿每皿去除6mL的慢病毒包装培养基，接着向每个皿中加入6mL的A液-B液混合液，轻混使其分布均匀后置于37℃、5％CO2条件下孵育进行转染；转染6小时后更换293T培养基继续孵育；
至转染24小时后，收集12mL细胞上清液，并加入提前预热的12mL的293T培养基，继续于37℃、5％CO2条件下孵育进行转染；
至转染54小时后第二次收集细胞上清液，与首次收集上清液混合，得细胞上清液；
在室温下，将上一步骤收集的细胞上清液以2000rpm离心10分钟，去除细胞碎片沉淀物，再使用0.45μm滤器过滤上清，得病毒上清液；
按照病毒上清液与浓缩试剂以体积比5:1的比例混合，4℃孵育2h，然后于4℃处离心至离心管底有沉淀(米白色)；
小心移去上清，加入适量体积的DMEM重悬沉淀，得到慢病毒浓缩液，测定其病毒滴度；
(3)T细胞制备：
向含有1mL全血的EP管内添加生物素标记CD8抗体，室温混合30分钟；
再向上述1mL全血内添加150μL微泡，室温混合20分钟，将微泡和被抗体标记的细胞结合，离心；
用200μL移液枪将白色微泡层轻轻转移至另一个2mL的EP管内，用500μL微泡缓冲液冲洗附着在管壁和移液管头上的微泡，并入EP管内，室温下孵育30min；上述微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液：氯化钾200mg/L、磷酸二氢钾200mg/L、氯化钠8000mg/L、七水磷酸氢二钠2160mg/L、1％人血清白蛋白、2mM EDTA；
用超声波破泡，离心，收集细胞沉淀，制得T细胞为CD8+T细胞，对其进行流式细胞仪鉴定；
(4)T细胞激活、转导与扩增：
将收集的CD8+T细胞以5x105个细胞/mL接种于24孔板/6孔板中，使用激活培养基刺激24-48小时，接着加入慢病毒浓缩液(MOI＝10)以及转导培养基进行病毒转导，24-48小时后换成维持培养基；扩增至6-8天时，收获CAR-T细胞。
根据本发明第四方面的方法，其中所述A液-B液混合液是将A液与B液混匀后置室温孵育15min得到的；A液配置：将Opti-MEMI减血清培养基恢复至室温，使用1.5ml的Opti-MEMI与41μL的Lip3000在10cm皿中混匀，得A液；B液配置：将1.5ml的Opti-MEMI、35μL的P3000 Enhancer、12μg质粒混合物混合，得B液。(在转导类型为CAR-1＝(CAR-19-1)+(CAR-19-3)的情况下质粒混合物的质粒比为PMD2.G：pSPAX2：(CAR-19-1/CAR-19-3)＝1:3:(4/3)，在转导类型为CAR-2＝(CAR-19-2)+(CAR-19-3)的情况下质粒混合物的质粒比为PMD2.G：pSPAX2：(CAR-19-2/CAR-19-3)＝1:3:(3.5/3)，在转导类型为CAR-3＝(CAR-19-2)的情况下质粒混合物的质粒比为PMD2.G:pSPAX2:CAR-19-2＝1:3:3.5，在转导类型为CAR-4＝(CAR-19-1)的情况下质粒混合物的质粒比为PMD2.G：pSPAX2：CAR-19-1＝1:3:4)。
根据本发明第九方面的方法，其中激活培养基是包含30ng/mL anti-CD3和20ng/mL CD28的X-VIVOTM15 Medium；转导培养基是包含200U/mL IL-2和5μg/mL Polybrene的X-VIVOTM15Medium；维持培养基是包含200U/mL IL-2的X-VIVOTM15 Medium。
根据本发明第九方面的方法，其中T细胞制备时所用的微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液：氯化钾200mg/L、磷酸二氢钾200mg/L、氯化钠8000mg/L、七水磷酸氢二钠2160mg/L、1％人血清白蛋白(HAS)、2mM EDTA、酒石酸钾25mg/L、脯氨酸120mg/L。如本文所述的，出人意料的发现，使用同时包含酒石酸钾和脯氨酸的微泡缓冲液处理后所得T细胞中CD8+T细胞占分选后总单个核细胞的比例显著高于不加二种试剂的情形。
根据本发明第九方面的方法，其具有如实施例1～4所述的操作步骤。
本发明第十方面还提供了CAR-T细胞例如本发明第三方面和/或本发明第八方面所述CAR-T细胞在制备用于治疗肿瘤的细胞治疗剂中的用途。
本发明的各个方面呈现优良的技术效果。
具体实施方式
下列实例将进一步说明发明的具体步骤以及特征，该等实例仅为示例而用，并非对本发明的限制，说涉及到的试剂和材料非特殊说明均为市售。
本发明使用的一些主要实验材料包括：Endo-Free Plasmid Maxi Kit(Omega)，NaCl、蛋白胨、EDTA、NaoH、酵母粉(上海生工生物工程股份有限公司)，感受态Stbl3(全式金生物科技有限公司)，lip3000转染试剂(内含P3000 Enhancer)、Opti-MEM减血清培养基、丙酮酸钠、DMEM-H、calcein AM(ThermoFisher)、DiI细胞膜荧光探针(meilunbio)，HIV-1P24蛋白快速检测卡、慢病毒滴度(HIV P24)ELISA检测试剂(博奥龙)，Polybrene(合生基因)、BioGeek TM慢病毒浓缩试剂盒(合生基因)，Millipore一次性针头滤器0.45μm(Millipore)，96孔板、24孔板、6孔板、10CM、T25培养瓶、T75培养瓶、5ml移液管、10ml移液管、25ml移液管(Corning-Costar)，X-VIVOTM15 Medium(LONZA)，Ultra-LEAF Purifiedanti-mouse CD28、Ultra-LEAF Purified anti-mouse CD3ε(Biolegend)，IL-2(Peprotech)，BD PharmingenTMBiotin Mouse Anti-Human CD8、PerCP-CyTM5.5MouseAnti-Human CD8(BD)，慢病毒载体(淼灵生物)，序列合成(通用生物)，GM-CSF ELISA试剂盒(Abcam)。其余常用试剂和材料均为市售可得。
实施例1：构建重组质粒
1、CAR-19-1质粒合成：
CAR-19-1序列是由CD19单链可变区、CD8a铰链区、CD8a跨膜区、4-1BB信号、CD3ζ的包浆信号、IL-7、CCL17序列构成，所用载体为pLVX-EF1a-IRES-PGK-puro，由通用生物系统(安徽)有限公司合成。
CAR-19-1核苷酸序列如下(在本发明中可称为序列1)：
ATGGCCCTGCCCGTGACCGCTCTGCTGCTGCCACTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCTAGACCTGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCCGGCCCTGGCCTGGTGGCTCCTTCCCAGTCCCTGAGCGTGACCTGTACAGTGTCCGGCGTGTCCCTGCCTGATTACGGCGTGTCCTGGATCAGGCAGCCTCCCAGAAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCTCCGAGACAACCTACTACAATTCCGCCCTGAAGTCCAGGCTGACAATCATCAAGGACAATAGCAAGAGCCAGGTGTTTCTGAAGATGAACTCCCTGCAGACAGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCTCCTACGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCCTCCGGCGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCTGGCGGCGGCGGTTCCGATATCCAGATGACCCAGACAACAAGCAGCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACAGAGTGACCATCTCCTGCAGGGCCTCCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGATGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCTCCAGACTGCACTCCGGCGTGCCTTCCAGATTTTCCGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTTTGCCAGCAGGGCAATACCCTGCCTTACACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCACAAGGGCCGATGCCGCCCCCACAGTGAGCATCTTTCCCCCTAGCTCCAACGCCAAGCCCACAACAACCCCTGCCCCTAGACCCCCCACACCCGCTCCTACCATCGCCAGCCAGCCTCTGAGCCTGAGACCTGAGGCCTGTAGGCCCGCCGCCGGAGGAGCTGTTCACACAAGGGGCCTGGACTTTGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGTGGAGTTCTGCTGCTGAGCCTGGTCATTACCAAGAGGGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCTTTCATGAGACCCGTGCAGACAACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGATTCCCTGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGTGAGCTGAGGGTGAAGTTCTCCAGGAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAACAGGGACAGAATCAGCTGTACAATGAGCTGAACCTGGGCAGAAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCCAGAGGAGGAAGAATCCCCAGGAGGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGTCCACCGCCACAAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCAAGAGGAAGCGGAGCCACCAATTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGACCTATGTTCCATGTTTCTTTTAGGTATATCTTTGGACTTCCTCCCCTGATCCTTGTTCTGTTGCCAGTAGCATCATCTGATTGTGATATTGAAGGTAAAGATGGCAAACAATATGAGAGTGTTCTAATGGTCAGCATCGATCAATTATTGGACAGCATGAAAGAAATTGGTAGCAATTGCCTGAATAATGAATTTAACTTTTTTAAAAGACATATCTGTGATGCTAATAAGGAAGGTATGTTTTTATTCCGTGCTGCTCGCAAGTTGAGGCAATTTCTTAAAATGAATAGCACTGGTGATTTTGATCTCCACTTATTAAAAGTTTCAGAAGGCACAACAATACTGTTGAACTGCACTGGCCAGGTTAAAGGAAGAAAACCAGCTGCCCTGGGTGAAGCCCAACCAACAAAGAGTTTGGAAGAAAATAAATCTTTAAAGGAACAGAAAAAACTGAATGACTTGTGTTTCCTAAAGAGACTATTACAAGAGATAAAAACTTGTTGGAATAAAATTTTGATGGGCACTAAAGAACACGGCTCCGGCGAAGGCAGAGGCTCTTTACTGACTTGTGGAGACGTGGAAGAGAACCCCGGTCCCATGGCCCCACTGAAGATGCTGGCCCTGGTCACCCTCCTCCTGGGGGCTTCTCTGCAGCACATCCACGCAGCTCGAGGGACCAATGTGGGCCGGGAGTGCTGCCTGGAGTACTTCAAGGGAGCCATTCCCCTTAGAAAGCTGAAGACGTGGTACCAGACATCTGAGGACTGCTCCAGGGATGCCATCGTTTTTGTAACTGTGCAGGGCAGGGCCATCTGTTCGGACCCCAACAACAAGAGAGTGAAGAATGCAGTTAAATACCTGCAAAGCCTTGAGAGGTCT
CAR-19-1表达的氨基酸序列(在本发明中可称为序列2)：
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu HisAla Ala Arg Pro Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro SerGln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly ValSer Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp GlySer Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys AspAsn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr AlaIle Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr TrpGly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly GlySer Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser AlaSer Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys TyrLeu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His ThrSer Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr AspTyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys GlnGln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr ArgAla Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Asn Ala Lys Pro ThrThr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro LeuSer Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg GlyLeu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly ValLeu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile PheLys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser CysArg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg SerAla Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn LeuGly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu MetGly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu GlnLys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg ArgGly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr TyrAsp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe SerLeu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Phe His Val SerPhe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile Leu Val Leu Leu Pro Val Ala SerSer Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met ValSer Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn AsnGlu Phe Asn Phe Phe Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe LeuPhe Arg Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp PheAsp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu Asn Cys Thr GlyGln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu Ala Gln Pro Thr Lys Ser LeuGlu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu LysArg Leu Leu Gln Glu Ile Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys GluHis Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu AsnPro Gly Pro Met Ala Pro Leu Lys Met Leu Ala Leu Val Thr Leu Leu Leu Gly AlaSer Leu Gln His Ile His Ala Ala Arg Gly Thr Asn Val Gly Arg Glu Cys Cys LeuGlu Tyr Phe Lys Gly Ala Ile Pro Leu Arg Lys Leu Lys Thr Trp Tyr Gln Thr SerGlu Asp Cys Ser Arg Asp Ala Ile Val Phe Val Thr Val Gln Gly Arg Ala Ile CysSer Asp Pro Asn Asn Lys Arg Val Lys Asn Ala Val Lys Tyr Leu Gln Ser Leu GluArg Ser
2、CAR-19-2质粒合成：
CAR-19-2序列是由CD19单链可变区、CD8a铰链区、CD8a跨膜区、4-1BB信号、CD3ζ的包浆信号序列构成，所用载体为pLVX-EF1a-IRES-PGK-puro，由通用生物系统(安徽)有限公司合成。
CAR-19-2核苷酸序列如下(在本发明中可称为序列3)：
ATGGCCCTGCCCGTGACCGCTCTGCTGCTGCCACTGGCCCTGCTGCTGCACGCCGCTAGACCTGAGGTGAAGCTGCAGGAGTCCGGCCCTGGCCTGGTGGCTCCTTCCCAGTCCCTGAGCGTGACCTGTACAGTGTCCGGCGTGTCCCTGCCTGATTACGGCGTGTCCTGGATCAGGCAGCCTCCCAGAAAGGGCCTGGAGTGGCTGGGCGTGATCTGGGGCTCCGAGACAACCTACTACAATTCCGCCCTGAAGTCCAGGCTGACAATCATCAAGGACAATAGCAAGAGCCAGGTGTTTCTGAAGATGAACTCCCTGCAGACAGACGACACCGCCATCTACTACTGCGCCAAGCACTACTACTACGGCGGCTCCTACGCCATGGATTACTGGGGCCAGGGCACCAGCGTGACAGTGTCCTCCGGCGGCGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGATCTGGCGGCGGCGGTTCCGATATCCAGATGACCCAGACAACAAGCAGCCTGTCCGCCTCCCTGGGCGACAGAGTGACCATCTCCTGCAGGGCCTCCCAGGACATCAGCAAGTACCTGAACTGGTACCAGCAGAAGCCCGATGGCACCGTGAAGCTGCTGATCTACCACACCTCCAGACTGCACTCCGGCGTGCCTTCCAGATTTTCCGGCTCCGGCAGCGGCACCGACTACAGCCTGACCATCAGCAACCTGGAGCAGGAGGACATCGCCACCTACTTTTGCCAGCAGGGCAATACCCTGCCTTACACCTTTGGCGGCGGCACAAAGCTGGAGATCACAAGGGCCGATGCCGCCCCCACAGTGAGCATCTTTCCCCCTAGCTCCAACGCCAAGCCCACAACAACCCCTGCCCCTAGACCCCCCACACCCGCTCCTACCATCGCCAGCCAGCCTCTGAGCCTGAGACCTGAGGCCTGTAGGCCCGCCGCCGGAGGAGCTGTTCACACAAGGGGCCTGGACTTTGCCTGCGACATCTACATCTGGGCCCCCCTGGCCGGCACCTGTGGAGTTCTGCTGCTGAGCCTGGTCATTACCAAGAGGGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCTTTCATGAGACCCGTGCAGACAACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGATTCCCTGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGTGAGCTGAGGGTGAAGTTCTCCAGGAGCGCCGACGCCCCCGCCTACCAACAGGGACAGAATCAGCTGTACAATGAGCTGAACCTGGGCAGAAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGAGGAGGGGCAGGGACCCTGAGATGGGCGGCAAGCCCCAGAGGAGGAAGAATCCCCAGGAGGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAGGACAAGATGGCCGAGGCCTACAGCGAGATCGGCATGAAGGGCGAGAGGAGGAGAGGCAAGGGCCACGATGGCCTGTACCAGGGCCTGTCCACCGCCACAAAGGACACCTACGACGCCCTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCAAGA
CAR-19-2表达的氨基酸序列如下(在本发明中可称为序列4)：
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu HisAla Ala Arg Pro Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro SerGln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly ValSer Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp GlySer Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys AspAsn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr AlaIle Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr TrpGly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly GlySer Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser AlaSer Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys TyrLeu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His ThrSer Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr AspTyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys GlnGln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr ArgAla Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Asn Ala Lys Pro ThrThr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro LeuSer Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg GlyLeu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly ValLeu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile PheLys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser CysArg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg SerAla Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn LeuGly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu MetGly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu GlnLys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg ArgGly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr TyrAsp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
3、CAR-19-3质粒合成：
CAR-19-3序列是由anti-PD-1scFv单链可变区、anti-GM-CSF scFv单链可变区序列构成，所用载体为pLVX-mCherry-C1，由通用生物系统(安徽)有限公司合成。
CAR-19-3核苷酸序列如下(在本发明中可称为序列5)：
ATGGCCCTGCCTGTGACCGCCCTGCTGCTGCCACTGGCCCTGCTGCTCCACGCCGCTAGACCTCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCCGGCGTGGAGGTGAAGAAGCCCGGCGCCTCCGTGAAGGTGTCCTGCAAGGCCTCCGGCTACACCTTTACAAATTACTACATGTACTGGGTGAGGCAGGCCCCCGGCCAGGGACTGGAATGGATGGGCGGCATCAATCCCTCCAATGGCGGCACAAACTTTAACGAGAAGTTTAAGAACAGGGTGACCCTGACCACCGATAGCTCCACCACAACAGCCTACATGGAGCTGAAGTCCCTGCAGTTCGATGATACCGCCGTGTACTACTGTGCCAGGAGGGACTACAGGTTTGATATGGGCTTCGATTACTGGGGCCAGGGCACCACCGTGACCGTGTCCTCCGGCGGAGGCGGAAGCGGAGGAGGAGGAAGCGGCGGAGGCGGTAGCGAGATCGTGCTGACACAGAGCCCTGCCACACTGTCCCTGTCCCCTGGCGAGAGAGCCACCCTGAGCTGCAGAGCCTCCAAGGGCGTGAGCACCTCCGGCTACAGCTACCTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCAGGCTGCTGATCTACCTGGCCTCCTACCTGGAGTCCGGCGTGCCCGCTAGATTCTCCGGCTCCGGCAGCGGCACCGATTTTACCCTGACAATCTCCAGCCTGGAGCCTGAGGACTTCGCCGTGTACTATTGTCAGCACTCCAGGGATCTGCCTCTGACCTTTGGCGGCGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCTCCGGCGCCACAAACTTTAGCCTGCTGAAGCAGGCCGGCGACGTGGAGGAGAACCCTGGCCCACAGGTGCAGCTCGTGCAGTCCGGAGCCGAGGTGAAGAAACCCGGCGCCAGCGTGAAGGTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCGGCTACTACATGCACTGGGTGAGACAGGCCCCCGGACAGGGCCTGGAGTGGATGGGATGGATCAATCCTAACAGCGGCGGCACCAATTACGCCCAGAAGTTCCAGGGCAGGGTGACAATGACAAGGGATACCTCCATCAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGGCTGAGAAGCGACGACACAGCCGTGTACTACTGCGTGAGAAGAGATAGGTTTCCCTACTACTTTGATTACTGGGGACAGGGCACCCTGGTGACCGTGAGCTCCGGCGGAGGAGGCTCCGGAGGAGGAGGTAGCGGCGGAGGAGGATCTGAGATCGTGCTCACCCAGTCCCCCGCCACCCTGTCCGTGTCCCCTGGAGAGAGGGCCACACTGAGCTGTAGAGCCTCCCAGAGCATCGGCTCCAATCTGGCCTGGTACCAGCAAAAGCCTGGCCAGGCCCCAAGGGTGCTGATCTACTCCACCTCCTCCAGGGCCACAGGCATCACAGATAGGTTTAGCGGCTCCGGCTCCGGAACCGATTTCACCCTGACCATCAGCAGACTGGAGCCCGAGGACTTCGCTGTGTACTACTGCCAGCAGTTTAATAGATCCCCCCTGACCTTCGGCGGCGGCACAAAGGTGGAGATTAAG
CAR-19-3表达的氨基酸序列如下(在本发明中可称为序列6)：
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu HisAla Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val Lys Lys Pro GlyAla Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr MetTyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Asn ProSer Asn Gly Gly Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr ThrAsp Ser Ser Thr Thr Thr Ala Tyr Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp ThrAla Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe Asp Tyr TrpGly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly GlySer Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser LeuSer Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr SerGly Tyr Ser Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu LeuIle Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser GlySer Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala ValTyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys ValGlu Ile Lys Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp ValGlu Glu Asn Pro Gly Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys LysPro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly TyrTyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Trp IleAsn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr MetThr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser AspAsp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Val Arg Arg Asp Arg Phe Pro Tyr Tyr Phe Asp TyrTrp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly GlyGly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu SerVal Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly SerAsn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Val Leu Ile Tyr SerThr Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Thr Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly ThrAsp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr CysGln Gln Phe Asn Arg Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
实施例2：病毒包装
使用Invitrogen Lipofectamine 3000转染试剂(Lip3000)进行病毒包装，试验操作基本上参照该转染试剂说明书进行。
1、293T培养基配置
培养基为DMEM-H，添加10％FBS。(DMEM-H为添加4.5g/L葡萄糖、110mg/L丙酮酸钠的DMEM培养基)。
2、慢病毒包装培养基配置：
培养基为Opti-MEMI，添加1％的GlutaMAX、添加丙酮酸钠(1mM)、5％FBS。(Opti-MEMI培养基为Gibco产品)。
3、慢病毒包装：
A)将293T细胞以7x106个细胞/孔的密度接种于含12mL的慢病毒包装培养基的10cm培养皿中，置于37℃、5％CO2条件下孵育细胞过夜。
B)至293T细胞密度达95％时进行转染，转染方法为：
A液配置：首先将Opti-MEMI减血清培养基恢复至室温，使用1.5ml的Opti-MEMI与41μL的Lip3000在10cm皿中混匀，得A液，备用；
B液配置：将1.5ml的Opti-MEMI、35μL的P3000 Enhancer、12μg质粒混合物混合，得B液，备用；(在转导类型为CAR-1＝(CAR-19-1)+(CAR-19-3)的情况下质粒混合物的质粒比为PMD2.G：pSPAX2：(CAR-19-1/CAR-19-3)＝1:3:(4/3)，在转导类型为CAR-2＝(CAR-19-2)+(CAR-19-3)的情况下质粒混合物的质粒比为PMD2.G：pSPAX2：(CAR-19-2/CAR-19-3)＝1:3:(3.5/3)，在转导类型为CAR-3＝(CAR-19-2)的情况下质粒混合物的质粒比为PMD2.G:pSPAX2:CAR-19-2＝1:3:3.5，在转导类型为CAR-4＝(CAR-19-1)的情况下质粒混合物的质粒比为PMD2.G：pSPAX2：CAR-19-1＝1:3:4，PMD2.G、pSPAX2、pLVX-EF1a-IRES-PGK-puro和pLVX-mCherry-C1均为淼灵生物公司产品)
将A液转移至B液中充分混匀，室温孵育15min，得A液-B液混合液；
步骤A)孵育过夜的培养皿每皿去除6mL的慢病毒包装培养基，接着向每个皿中加入6mL的A液-B液混合液，轻混使其分布均匀后置于37℃、5％CO2条件下孵育进行转染；转染6小时后更换293T培养基继续孵育。
C)至转染24小时后，收集12mL细胞上清液，并加入提前预热的12mL的293T培养基，继续于37℃、5％CO2条件下孵育进行转染。
D)至转染54小时后第二次收集细胞上清液，与首次收集上清液混合，得细胞上清液。
4、慢病毒浓缩：
A)在室温下，将上一步骤收集的细胞上清液以2000rpm离心10分钟，去除细胞碎片沉淀物，再使用0.45μm滤器过滤上清，得病毒上清液。
B)按照病毒上清液与浓缩试剂以体积比5:1的比例混合，4℃放置2h。
C)将孵育好的混合液于4℃以4000g离心30min，离心管底有米白色沉淀。
D)小心移去上清，加入适量体积的DMEM重悬沉淀，为慢病毒浓缩液，(并按照实验需求)分装病毒，测定病毒滴度，-80℃保存。
经本发明方法测定，本实施例所得病毒的滴度为：5.74x106TU/ml。
5、病毒滴度测试的方法：
本发明可按如下方法测定病毒滴度。
A)将HT1080细胞以7000个细胞/孔的密度接种于含有100μL培养基的96孔板中，培养4-5小时后进行转导，HT1080细胞培养基为DMEM-H，其中添加10％FBS、1％GlutaMAX、10μg/mL Polybrene、200nM丙酮酸钠。
B)稀释病毒液：首先将15mL新鲜培养基与12μL的10mg/mL Polybrene试剂混合(终浓度为8μg/mL)，涡旋混匀作为稀释液。接着，对每个病毒样本，将上一步制备的135μL培养基即稀释液加入96孔圆底培养板的16个孔中，采用4孔x4孔的模式。将15μL浓缩的慢病毒悬液加至第一排的各孔中，总体积150μL，依次按照1:10稀释剩余三排细胞。
C)转导细胞：去除HT1080细胞中的培养基，将100μL制备好的稀释液转移至每个相应孔中，室温下以2000rpm离心培养板30分钟，孵育培养板过夜。
D)去除包含病毒上清液的培养基，替换成新鲜的HT1080培养基(不含Polybrene试剂)，孵育三天后使用流式细胞仪分析GFP阳性细胞的百分比。
E)滴度(TU/mL)计算公式(根据GFP阳性细胞的百分比确定适当的稀释因子)如下：
滴度＝(F×C/V)×D，其中F＝GFP阳性细胞的百分比，C＝转导时的每孔细胞数，V＝菌液体积(mL)，D＝慢病毒稀释因子，选择合适的慢病毒稀释因子进行后续转导实验。
实施例3：T细胞制备
1、T细胞制备
A)向含有1mL全血的EP管内添加抗体(20μL，CD8 biotin antibody，生物素标记CD8抗体，BD产品，货号555365)，在室温下用旋转混悬仪混合30分钟。实验用全血取自8名健康男性志愿者(26～33岁，体重58～71kg)，分别进行T细胞的制备。
B)再向上述1mL全血内添加150μL微泡(streptavidin，链霉亲和素标记，ThermoGenesis产品)，在室温下用旋转混悬仪混合20分钟，将微泡和被抗体标记的细胞结合。
C)以400xg的转速将细胞离心5分钟。
D)用200μL移液枪将白色微泡层轻轻转移至另一个2mL的EP管内。用500μL微泡缓冲液冲洗附着在管壁和移液管头上的微泡，并入EP管内，室温下孵育30min。(上述微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液：氯化钾200mg/L、磷酸二氢钾200mg/L、氯化钠8000mg/L、七水磷酸氢二钠2160mg/L、1％人血清白蛋白、2mM EDTA)。
E)用400W功率超声(超声2次，每次1秒)破泡以回收靶细胞。
F)以1000rpm离心10min，收集细胞沉淀，制得T细胞，备用。
2、流式细胞仪鉴定CD8+T细胞
A)PBS清洗分选后的T细胞，并使用PBS稀释T细胞浓度在1.2～1.4x106个细胞/mL范围内。
B)取100μL细胞悬液并加入2μL的anti-CD8(PerCP-CyTM5.5Mouse Anti-HumanCD8)，并混匀。
C)4℃孵育20min，PBS清洗，使用200μL PBS重悬沉淀后上机检测，鉴定CD8+T细胞。
补充进行本段落所述如下实施例操作。实施例3a：参照实施例3之“1、T细胞制备”，不同的仅是其中步骤D)所用微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液：氯化钾200mg/L、磷酸二氢钾200mg/L、氯化钠8000mg/L、七水磷酸氢二钠2160mg/L、1％人血清白蛋白(HAS)、2mMEDTA、酒石酸钠25mg/L、脯氨酸120mg/L，所得T细胞同法鉴定CD8+T细胞。实施例3b：参照实施例3之“1、T细胞制备”，不同的仅是其中步骤D)所用微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液：氯化钾200mg/L、磷酸二氢钾200mg/L、氯化钠8000mg/L、七水磷酸氢二钠2160mg/L、1％人血清白蛋白(HAS)、2mM EDTA、酒石酸钠25mg/L，所得T细胞同法鉴定CD8+T细胞。实施例3c：参照实施例3之“1、T细胞制备”，不同的仅是其中步骤D)所用微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液：氯化钾200mg/L、磷酸二氢钾200mg/L、氯化钠8000mg/L、七水磷酸氢二钠2160mg/L、1％人血清白蛋白(HAS)、2mM EDTA、脯氨酸120mg/L，所得T细胞同法鉴定CD8+T细胞。由8名健康男性志愿者全血使用上述实施例3及实施例3a～3c制得的T细胞经检测，结果如下：分选前CD8+T细胞占外周血单个核细胞的比例(％)＝6.38±1.31，实施例3分选后CD8+T细胞占分选后总单个核细胞的比例(％)＝61.47±9.24**，实施例3a分选后CD8+T细胞占分选后总单个核细胞的比例(％)＝86.35±10.51，实施例3b分选后CD8+T细胞占分选后总单个核细胞的比例(％)＝58.84±8.47**，实施例3c分选后CD8+T细胞占分选后总单个核细胞的比例(％)＝63.73±11.53**，其中**是与实施例3a组比较p<0.01。由此结果可见，使用同时包含酒石酸钠和脯氨酸的微泡缓冲液处理后所得T细胞中CD8+T细胞占分选后总单个核细胞的比例显著高于不加二种试剂的情形。
补充进行本段落所述如下实施例操作。实施例31a：参照实施例3之“1、T细胞制备”，不同的仅是其中步骤D)所用微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液：氯化钾200mg/L、磷酸二氢钾200mg/L、氯化钠8000mg/L、七水磷酸氢二钠2160mg/L、1％人血清白蛋白(HAS)、2mM EDTA、酒石酸钾25mg/L、脯氨酸120mg/L，所得T细胞同法鉴定CD8+T细胞。实施例31b：参照实施例3之“1、T细胞制备”，不同的仅是其中步骤D)所用微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液：氯化钾200mg/L、磷酸二氢钾200mg/L、氯化钠8000mg/L、七水磷酸氢二钠2160mg/L、1％人血清白蛋白(HAS)、2mM EDTA、酒石酸钾25mg/L，所得T细胞同法鉴定CD8+T细胞。由8名健康男性志愿者全血使用上述实施例31a及实施例31b制得的T细胞经检测，结果如下：实施例31a分选后CD8+T细胞占分选后总单个核细胞的比例(％)＝87.64±9.38，实施例31b分选后CD8+T细胞占分选后总单个核细胞的比例(％)＝56.46±9.76**，其中**是与前述实施例3a组比较p＜0.01。
实施例4：T细胞激活、转导与扩增：
1、CAR-T细胞制备
参照Milone MC、Lamers CH的文献(Milone MC，Fish JD，Carpenito C，etal.Chimeric receptors containing CD137signal transduction domains mediateenhanced survival of T cells and increased antileukemic efficacy in vivo[J].Mol Ther，2009，17(8)：1453-64；Lamers CH，van Steenbergen-Langeveld S，et al.Tcell receptor-engineered T cells to treat solid tumors：T cell processingtoward optimal T cell fitness.Hum Gene Ther Methods.2014Dec；25(6)：345-57.doi：10.1089/hgtb.2014.051.)进行。简述如下：
将实施例3收集的CD8+T细胞以5x105个细胞/mL接种于24孔板中，使用激活培养基(X-VIVOTM15Medium，内含30ng/mL anti-CD3和20ng/mL CD28)刺激24-48小时，接着加入实施例2所得慢病毒浓缩液(MOI＝10)以及转导培养基(X-VIVOTM15 Medium，内含200U/mLIL-2和5μg/mL Polybrene)进行病毒转导，24-48小时后换成维持培养基(X-VIVOTM15Medium，内含200U/mL IL-2)；扩增至6-8天时，收获CAR-T细胞。
另外进行CAR-T细胞检测及后续杀伤实验。
2、CAR-T细胞转染效率检测：
CAR-19-1和CAR-19-2为绿色荧光标记，CAR-19-3为红色荧光标记，利用流式细胞仪FITC通道及PE通道对转染效率进行检测，结果如下表所示。
表：不同种类CAR-T细胞转导效率
转导类型 转导效率
CAR-1＝(CAR-19-1)+(CAR-19-3) 26％
CAR-2＝(CAR-19-2)+(CAR-19-3) 32％
CAR-3＝(CAR-19-2) 48％
CAR-4＝(CAR-19-1) 41％
3、ELISA验证CAR-T细胞是否分泌anti-PD-1、GM-CSF、IL-7和CCL-17：
A)留取CAR-1、CAR-2、CAR-3、CAR-4细胞及培养上清至无菌离心管中(效靶比为5∶1组)，在4℃条件下1000×g离心10min，然后将上清等量分装于小EP管并于-20℃下保存(24小时内检测可放入2-8℃储存)，避免反复冻融，细胞沉淀调整(2-4)x106cells每管，每管样本使用1mL的Trizol裂解液10min(4℃)后放入-80保存备用。
B)ELISA验证CAR-T细胞是否分泌anti-PD-1、GM-CSF、IL-7和CCL-17，根据Abcam相应ELISA Kit说明书进行操作(anti-PD-1检测现检现包被：用双抗体夹心ELISA方法，使用人源的PD-1重组蛋白包被酶标板，带HRP标记的山羊抗人IgG(H&L)的二抗检测，以商品化的PD-1抗体作为标准品，待测样本5倍稀释后定量检测基因修饰后的T细胞分泌PD-1抗体的表达量)。
方法简述如下：
a)根据说明书准备样本及标准品；
b)加50μL标准品及样本到孔板中；
c)加50μL Antibody Cocktai到每孔；
d)室温孵育60min；
e)每次使用350μL 1xWash Buffer清洗三次；
f)每孔加入100μL TMB Development Solutin，孵育10min；
g)每孔加入100μL Stop Solution后使用酶标仪在450nm OD值读数；
h)根据说明书要求计算anti-PD-1、GM-CSF、IL-7、CCL-17浓度，结果如下表所示。
表：不同CAR-T细胞的anti-PD-1、GM-CSF、IL-7、CCL-17分泌量
CAR-1 CAR-2 CAR-3 CAR-4 T(Control)
Anti-PD-1 8800pg/ml 9200pg/ml 15pg/ml 30pg/ml 40pg/ml
GM-CSF 175pg/ml 190pg/ml 800pg/ml 860pg/ml 720pg/ml
IL-7 1380pg/ml 110pg/ml 110pg/ml 1450pg/ml 105pg/ml
CCL-17 1200pg/ml 110pg/ml 120pg/ml 1100pg/ml 120pg/ml
4、CAR-T细胞杀伤实验：
A)以人急性B淋巴细胞白血病细胞系Raji为阳性靶细胞，效应细胞分别为：
CAR-1＝(CAR-19-1)+(CAR-19-3)；
CAR-2＝(CAR-19-2)+(CAR-19-3)；
CAR-3＝(CAR-19-2)；
CAR-4＝(CAR-19-1)。
以2x104细胞/mL的靶细胞浓度(经1μM的Calcein-AM预染)接种于96孔板，100μL/孔，按照效靶比(5:1)加入各组效应细胞，设3个复孔，于37℃、5％CO2共孵育10小时后进行离心(1000rpm/min，5min)，检测；设置最大释放孔加入裂解液(2.5％TritonX-100)，自发释放孔加入PBS，处理后置于酶标仪扫描读取荧光值。根据以下公示计算各组效应细胞的细胞毒性：
特异性裂解百分比＝(实验组荧光值-自发释放组荧光值)/(最大释放组荧光值-自发释放组荧光值)x100％。
结果如下表所示。
表：不同种类CAR-T细胞杀伤效率(特异性裂解百分比)
根据上述结果可见，本发明制备得到的4种CAR-T细胞均呈现优良的细胞杀伤效果，表明本发明方法制备得到的CAR-T细胞可用于肿瘤的治疗。
本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 英科博雅基因科技（天津）有限公司
<120> CD19-CAR-T细胞及其制备方法
<130> Y21040-XXC2113jq
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2451
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atggccctgc ccgtgaccgc tctgctgctg ccactggccc tgctgctgca cgccgctaga 60
cctgaggtga agctgcagga gtccggccct ggcctggtgg ctccttccca gtccctgagc 120
gtgacctgta cagtgtccgg cgtgtccctg cctgattacg gcgtgtcctg gatcaggcag 180
cctcccagaa agggcctgga gtggctgggc gtgatctggg gctccgagac aacctactac 240
aattccgccc tgaagtccag gctgacaatc atcaaggaca atagcaagag ccaggtgttt 300
ctgaagatga actccctgca gacagacgac accgccatct actactgcgc caagcactac 360
tactacggcg gctcctacgc catggattac tggggccagg gcaccagcgt gacagtgtcc 420
tccggcggcg gcggaagcgg aggaggagga tctggcggcg gcggttccga tatccagatg 480
acccagacaa caagcagcct gtccgcctcc ctgggcgaca gagtgaccat ctcctgcagg 540
gcctcccagg acatcagcaa gtacctgaac tggtaccagc agaagcccga tggcaccgtg 600
aagctgctga tctaccacac ctccagactg cactccggcg tgccttccag attttccggc 660
tccggcagcg gcaccgacta cagcctgacc atcagcaacc tggagcagga ggacatcgcc 720
acctactttt gccagcaggg caataccctg ccttacacct ttggcggcgg cacaaagctg 780
gagatcacaa gggccgatgc cgcccccaca gtgagcatct ttccccctag ctccaacgcc 840
aagcccacaa caacccctgc ccctagaccc cccacacccg ctcctaccat cgccagccag 900
cctctgagcc tgagacctga ggcctgtagg cccgccgccg gaggagctgt tcacacaagg 960
ggcctggact ttgcctgcga catctacatc tgggcccccc tggccggcac ctgtggagtt 1020
ctgctgctga gcctggtcat taccaagagg ggcagaaaga agctgctgta catcttcaag 1080
cagcctttca tgagacccgt gcagacaacc caggaggagg acggctgcag ctgcagattc 1140
cctgaggagg aggagggcgg ctgtgagctg agggtgaagt tctccaggag cgccgacgcc 1200
cccgcctacc aacagggaca gaatcagctg tacaatgagc tgaacctggg cagaagagag 1260
gagtacgacg tgctggacaa gaggaggggc agggaccctg agatgggcgg caagccccag 1320
aggaggaaga atccccagga gggcctgtac aatgaactgc agaaggacaa gatggccgag 1380
gcctacagcg agatcggcat gaagggcgag aggaggagag gcaagggcca cgatggcctg 1440
taccagggcc tgtccaccgc cacaaaggac acctacgacg ccctgcacat gcaggccctg 1500
cccccaagag gaagcggagc caccaatttc agcctgctga agcaggccgg cgacgtggag 1560
gagaaccccg gacctatgtt ccatgtttct tttaggtata tctttggact tcctcccctg 1620
atccttgttc tgttgccagt agcatcatct gattgtgata ttgaaggtaa agatggcaaa 1680
caatatgaga gtgttctaat ggtcagcatc gatcaattat tggacagcat gaaagaaatt 1740
ggtagcaatt gcctgaataa tgaatttaac ttttttaaaa gacatatctg tgatgctaat 1800
aaggaaggta tgtttttatt ccgtgctgct cgcaagttga ggcaatttct taaaatgaat 1860
agcactggtg attttgatct ccacttatta aaagtttcag aaggcacaac aatactgttg 1920
aactgcactg gccaggttaa aggaagaaaa ccagctgccc tgggtgaagc ccaaccaaca 1980
aagagtttgg aagaaaataa atctttaaag gaacagaaaa aactgaatga cttgtgtttc 2040
ctaaagagac tattacaaga gataaaaact tgttggaata aaattttgat gggcactaaa 2100
gaacacggct ccggcgaagg cagaggctct ttactgactt gtggagacgt ggaagagaac 2160
cccggtccca tggccccact gaagatgctg gccctggtca ccctcctcct gggggcttct 2220
ctgcagcaca tccacgcagc tcgagggacc aatgtgggcc gggagtgctg cctggagtac 2280
ttcaagggag ccattcccct tagaaagctg aagacgtggt accagacatc tgaggactgc 2340
tccagggatg ccatcgtttt tgtaactgtg cagggcaggg ccatctgttc ggaccccaac 2400
aacaagagag tgaagaatgc agttaaatac ctgcaaagcc ttgagaggtc t 2451
<210> 2
<211> 817
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
20 25 30
Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val
35 40 45
Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys
85 90 95
Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala
100 105 110
Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
145 150 155 160
Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr
165 170 175
Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr
180 185 190
Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser
195 200 205
Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala
225 230 235 240
Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
245 250 255
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
260 265 270
Ile Phe Pro Pro Ser Ser Asn Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
275 280 285
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
325 330 335
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg
340 345 350
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
355 360 365
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
370 375 380
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
385 390 395 400
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
405 410 415
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
420 425 430
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
435 440 445
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
450 455 460
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
465 470 475 480
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
485 490 495
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu
500 505 510
Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Phe His
515 520 525
Val Ser Phe Arg Tyr Ile Phe Gly Leu Pro Pro Leu Ile Leu Val Leu
530 535 540
Leu Pro Val Ala Ser Ser Asp Cys Asp Ile Glu Gly Lys Asp Gly Lys
545 550 555 560
Gln Tyr Glu Ser Val Leu Met Val Ser Ile Asp Gln Leu Leu Asp Ser
565 570 575
Met Lys Glu Ile Gly Ser Asn Cys Leu Asn Asn Glu Phe Asn Phe Phe
580 585 590
Lys Arg His Ile Cys Asp Ala Asn Lys Glu Gly Met Phe Leu Phe Arg
595 600 605
Ala Ala Arg Lys Leu Arg Gln Phe Leu Lys Met Asn Ser Thr Gly Asp
610 615 620
Phe Asp Leu His Leu Leu Lys Val Ser Glu Gly Thr Thr Ile Leu Leu
625 630 635 640
Asn Cys Thr Gly Gln Val Lys Gly Arg Lys Pro Ala Ala Leu Gly Glu
645 650 655
Ala Gln Pro Thr Lys Ser Leu Glu Glu Asn Lys Ser Leu Lys Glu Gln
660 665 670
Lys Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Leu Lys Arg Leu Leu Gln Glu Ile
675 680 685
Lys Thr Cys Trp Asn Lys Ile Leu Met Gly Thr Lys Glu His Gly Ser
690 695 700
Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn
705 710 715 720
Pro Gly Pro Met Ala Pro Leu Lys Met Leu Ala Leu Val Thr Leu Leu
725 730 735
Leu Gly Ala Ser Leu Gln His Ile His Ala Ala Arg Gly Thr Asn Val
740 745 750
Gly Arg Glu Cys Cys Leu Glu Tyr Phe Lys Gly Ala Ile Pro Leu Arg
755 760 765
Lys Leu Lys Thr Trp Tyr Gln Thr Ser Glu Asp Cys Ser Arg Asp Ala
770 775 780
Ile Val Phe Val Thr Val Gln Gly Arg Ala Ile Cys Ser Asp Pro Asn
785 790 795 800
Asn Lys Arg Val Lys Asn Ala Val Lys Tyr Leu Gln Ser Leu Glu Arg
805 810 815
Ser
<210> 3
<211> 1509
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggccctgc ccgtgaccgc tctgctgctg ccactggccc tgctgctgca cgccgctaga 60
cctgaggtga agctgcagga gtccggccct ggcctggtgg ctccttccca gtccctgagc 120
gtgacctgta cagtgtccgg cgtgtccctg cctgattacg gcgtgtcctg gatcaggcag 180
cctcccagaa agggcctgga gtggctgggc gtgatctggg gctccgagac aacctactac 240
aattccgccc tgaagtccag gctgacaatc atcaaggaca atagcaagag ccaggtgttt 300
ctgaagatga actccctgca gacagacgac accgccatct actactgcgc caagcactac 360
tactacggcg gctcctacgc catggattac tggggccagg gcaccagcgt gacagtgtcc 420
tccggcggcg gcggaagcgg aggaggagga tctggcggcg gcggttccga tatccagatg 480
acccagacaa caagcagcct gtccgcctcc ctgggcgaca gagtgaccat ctcctgcagg 540
gcctcccagg acatcagcaa gtacctgaac tggtaccagc agaagcccga tggcaccgtg 600
aagctgctga tctaccacac ctccagactg cactccggcg tgccttccag attttccggc 660
tccggcagcg gcaccgacta cagcctgacc atcagcaacc tggagcagga ggacatcgcc 720
acctactttt gccagcaggg caataccctg ccttacacct ttggcggcgg cacaaagctg 780
gagatcacaa gggccgatgc cgcccccaca gtgagcatct ttccccctag ctccaacgcc 840
aagcccacaa caacccctgc ccctagaccc cccacacccg ctcctaccat cgccagccag 900
cctctgagcc tgagacctga ggcctgtagg cccgccgccg gaggagctgt tcacacaagg 960
ggcctggact ttgcctgcga catctacatc tgggcccccc tggccggcac ctgtggagtt 1020
ctgctgctga gcctggtcat taccaagagg ggcagaaaga agctgctgta catcttcaag 1080
cagcctttca tgagacccgt gcagacaacc caggaggagg acggctgcag ctgcagattc 1140
cctgaggagg aggagggcgg ctgtgagctg agggtgaagt tctccaggag cgccgacgcc 1200
cccgcctacc aacagggaca gaatcagctg tacaatgagc tgaacctggg cagaagagag 1260
gagtacgacg tgctggacaa gaggaggggc agggaccctg agatgggcgg caagccccag 1320
aggaggaaga atccccagga gggcctgtac aatgaactgc agaaggacaa gatggccgag 1380
gcctacagcg agatcggcat gaagggcgag aggaggagag gcaagggcca cgatggcctg 1440
taccagggcc tgtccaccgc cacaaaggac acctacgacg ccctgcacat gcaggccctg 1500
cccccaaga 1509
<210> 4
<211> 503
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Glu Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu
20 25 30
Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val
35 40 45
Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr
65 70 75 80
Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys
85 90 95
Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala
100 105 110
Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
145 150 155 160
Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr
165 170 175
Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr Leu Asn Trp Tyr
180 185 190
Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr His Thr Ser
195 200 205
Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
210 215 220
Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala
225 230 235 240
Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly
245 250 255
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser
260 265 270
Ile Phe Pro Pro Ser Ser Asn Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro
275 280 285
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
290 295 300
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
305 310 315 320
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
325 330 335
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Lys Arg Gly Arg
340 345 350
Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln
355 360 365
Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu
370 375 380
Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala
385 390 395 400
Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu
405 410 415
Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp
420 425 430
Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Gln Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
435 440 445
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
450 455 460
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
465 470 475 480
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
485 490 495
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
500
<210> 5
<211> 1590
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atggccctgc ctgtgaccgc cctgctgctg ccactggccc tgctgctcca cgccgctaga 60
cctcaggtgc agctggtgca gtccggcgtg gaggtgaaga agcccggcgc ctccgtgaag 120
gtgtcctgca aggcctccgg ctacaccttt acaaattact acatgtactg ggtgaggcag 180
gcccccggcc agggactgga atggatgggc ggcatcaatc cctccaatgg cggcacaaac 240
tttaacgaga agtttaagaa cagggtgacc ctgaccaccg atagctccac cacaacagcc 300
tacatggagc tgaagtccct gcagttcgat gataccgccg tgtactactg tgccaggagg 360
gactacaggt ttgatatggg cttcgattac tggggccagg gcaccaccgt gaccgtgtcc 420
tccggcggag gcggaagcgg aggaggagga agcggcggag gcggtagcga gatcgtgctg 480
acacagagcc ctgccacact gtccctgtcc cctggcgaga gagccaccct gagctgcaga 540
gcctccaagg gcgtgagcac ctccggctac agctacctgc actggtacca gcagaagccc 600
ggccaggccc ccaggctgct gatctacctg gcctcctacc tggagtccgg cgtgcccgct 660
agattctccg gctccggcag cggcaccgat tttaccctga caatctccag cctggagcct 720
gaggacttcg ccgtgtacta ttgtcagcac tccagggatc tgcctctgac ctttggcggc 780
ggcaccaagg tggagatcaa gggctccggc gccacaaact ttagcctgct gaagcaggcc 840
ggcgacgtgg aggagaaccc tggcccacag gtgcagctcg tgcagtccgg agccgaggtg 900
aagaaacccg gcgccagcgt gaaggtgagc tgcaaggcca gcggctacac cttcaccggc 960
tactacatgc actgggtgag acaggccccc ggacagggcc tggagtggat gggatggatc 1020
aatcctaaca gcggcggcac caattacgcc cagaagttcc agggcagggt gacaatgaca 1080
agggatacct ccatcagcac cgcctacatg gaactgagca ggctgagaag cgacgacaca 1140
gccgtgtact actgcgtgag aagagatagg tttccctact actttgatta ctggggacag 1200
ggcaccctgg tgaccgtgag ctccggcgga ggaggctccg gaggaggagg tagcggcgga 1260
ggaggatctg agatcgtgct cacccagtcc cccgccaccc tgtccgtgtc ccctggagag 1320
agggccacac tgagctgtag agcctcccag agcatcggct ccaatctggc ctggtaccag 1380
caaaagcctg gccaggcccc aagggtgctg atctactcca cctcctccag ggccacaggc 1440
atcacagata ggtttagcgg ctccggctcc ggaaccgatt tcaccctgac catcagcaga 1500
ctggagcccg aggacttcgc tgtgtactac tgccagcagt ttaatagatc ccccctgacc 1560
ttcggcggcg gcacaaaggt ggagattaag 1590
<210> 6
<211> 530
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Val Glu Val
20 25 30
Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Thr Asn Tyr Tyr Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Asn Pro Ser Asn Gly Gly Thr Asn
65 70 75 80
Phe Asn Glu Lys Phe Lys Asn Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Ser Ser
85 90 95
Thr Thr Thr Ala Tyr Met Glu Leu Lys Ser Leu Gln Phe Asp Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Asp Tyr Arg Phe Asp Met Gly Phe
115 120 125
Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu
145 150 155 160
Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr
165 170 175
Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Gly Val Ser Thr Ser Gly Tyr Ser Tyr
180 185 190
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
195 200 205
Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly
210 215 220
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
225 230 235 240
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Ser Arg Asp Leu Pro Leu
245 250 255
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gly Ser Gly Ala Thr
260 265 270
Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly
275 280 285
Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly
290 295 300
Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly
305 310 315 320
Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp
325 330 335
Met Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys
340 345 350
Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala
355 360 365
Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
370 375 380
Cys Val Arg Arg Asp Arg Phe Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
385 390 395 400
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
405 410 415
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala
420 425 430
Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala
435 440 445
Ser Gln Ser Ile Gly Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
450 455 460
Gln Ala Pro Arg Val Leu Ile Tyr Ser Thr Ser Ser Arg Ala Thr Gly
465 470 475 480
Ile Thr Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
485 490 495
Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
500 505 510
Gln Phe Asn Arg Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu
515 520 525
Ile Lys
530

Claims (4)

1.一种CAR-T细胞，其能够分泌表达IL-7、CCL17因子和PD-1抗体、GM-CSF抗体，所述CAR-T细胞转染了具有序列1所示核苷酸序列的重组质粒和具有序列5所示核苷酸序列的重组质粒。
2.权利要求1所述的CAR-T细胞的制备方法，其包括以下步骤：
(1)质粒合成：
使用载体pLVX-EF1a-IRES-PGK-puro合成CAR-19-1质粒，该质粒包含CD19单链可变区、CD8a铰链区、CD8a跨膜区、4-1BB信号、CD3ζ的包浆信号、IL-7、CCL17的序列，并且具有序列1所示核苷酸序列；
使用载体pLVX-mCherry-C1合成CAR-19-3质粒，该质粒包含anti-PD-1scFv单链可变区、anti-GM-CSF scFv单链可变区的序列，并且具有序列5所示核苷酸序列；
(2)病毒包装：
使用Invitrogen Lipofectamine 3000转染试剂即Lip3000进行病毒包装，293T培养基为添加10%FBS的DMEM-H培养基，慢病毒包装培养基为添加1%GlutaMAX、1mM丙酮酸钠、5%FBS的Opti-MEMI培养基；
将293T细胞以7x106个细胞/孔的密度接种于含12mL的慢病毒包装培养基的10cm培养皿中，置于37℃、5%CO2条件下孵育细胞过夜至293T细胞密度达95%；
将孵育过夜的培养皿每皿去除6mL的慢病毒包装培养基，接着向每个皿中加入6mL的A液-B液混合液，轻混使其分布均匀后置于37℃、5%CO2条件下孵育进行转染；转染6小时后更换293T培养基继续孵育；所述A液-B液混合液是将A液与B液混匀后置室温孵育15min得到的；A液配置：将Opti-MEMI减血清培养基恢复至室温，使用1.5ml的Opti-MEMI与41μL的Lip3000在10cm皿中混匀，得A液；B液配置：将1.5ml的Opti-MEMI、35μL的P3000 Enhancer、12μg质粒混合物混合，得B液，其中质粒混合物的质粒比为PMD2.G：pSPAX2：(CAR-19-1/CAR-19-3)＝1:3:(4/3)；
至转染24小时后，收集12mL细胞上清液，并加入提前预热的12mL的293T培养基，继续于37℃、5%CO2条件下孵育进行转染；
至转染54小时后第二次收集细胞上清液，与首次收集上清液混合，得细胞上清液；
在室温下，将上一步骤收集的细胞上清液以2000rpm离心10分钟，去除细胞碎片沉淀物，再使用0.45μm滤器过滤上清，得病毒上清液；
按照病毒上清液与浓缩试剂以体积比5:1的比例混合，4℃孵育2h，然后于4℃处离心至离心管底有米白色沉淀；
小心移去上清，加入适量体积的DMEM重悬沉淀，得到慢病毒浓缩液，测定其病毒滴度；
(3)T细胞制备：
向含有1mL全血的EP管内添加生物素标记CD8抗体，室温混合30分钟；
再向上述1mL全血内添加150μL微泡，室温混合20分钟，将微泡和被抗体标记的细胞结合，离心；
用200μL移液枪将白色微泡层轻轻转移至另一个2mL的EP管内，用500μL微泡缓冲液冲洗附着在管壁和移液管头上的微泡，并入EP管内，室温下孵育30min；上述微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液：氯化钾200mg/L、磷酸二氢钾200mg/L、氯化钠8000mg/L、七水磷酸氢二钠2160mg/L、1%人血清白蛋白、2mM EDTA；
用超声波破泡，离心，收集细胞沉淀，制得T细胞为CD8+T细胞，对其进行流式细胞仪鉴定；
(4)T细胞激活、转导与扩增：
将收集的CD8+T细胞以5x105个细胞/mL接种于24孔板/6孔板中，使用激活培养基刺激24-48小时，接着加入MOI＝10的慢病毒浓缩液以及转导培养基进行病毒转导，24-48小时后换成维持培养基；扩增至6-8天时，收获CAR-T细胞。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其中：激活培养基是包含30ng/mL anti-CD3和20ng/mL CD28的X-VIVOTM15 Medium；转导培养基是包含200U/mL IL-2和5μg/mLPolybrene的X-VIVOTM15Medium；维持培养基是包含200U/mL IL-2的X-VIVOTM15 Medium；T细胞制备时所用的微泡缓冲液是包含如下组分的水溶液：氯化钾200mg/L、磷酸二氢钾200mg/L、氯化钠8000mg/L、七水磷酸氢二钠2160mg/L、1%人血清白蛋白、2mM EDTA、酒石酸钾25mg/L、脯氨酸120mg/L。
4.权利要求1所述CAR-T细胞在制备用于治疗急性B淋巴细胞白血病的细胞治疗剂中的用途。
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