CN111748044B - Cd19和pd-l1双靶点嵌合抗原受体及其应用 - Google Patents

Cd19和pd-l1双靶点嵌合抗原受体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了CD19和PD‑L1双靶点嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；所述抗原结合结构域包括抗CD19单链抗体和抗PD‑1抗体。本发明的抗CD19和PD‑L1双靶点嵌合抗原受体不仅可以靶向识别CD19阳性肿瘤细胞，还可以解除肿瘤细胞表面PD‑L1对T细胞的免疫抑制作用，克服了肿瘤细胞的免疫逃逸机制，缓解了CAR‑T治疗的耐药性问题。

Description

CD19和PD-L1双靶点嵌合抗原受体及其应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及CD19和PD-L1双靶点嵌合抗原受体及其应用。
背景技术
近年来，随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成为最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。目前，CAR-T细胞疗法已经广泛应用于治疗B细胞恶性肿瘤，靶向CD19的CAR-T细胞是CAR-T疗法治疗B细胞恶性肿瘤的先驱，为治疗B细胞恶性肿瘤提供了有效方案。
然而，部分患者在接受CD19 CAR-T治疗后，肿瘤再次复发，其原因可能与免疫抑制微环境有关，肿瘤可能通过刺激T细胞上的免疫抑制受体PD-1来逃避免疫监控。PD-L1在肿瘤细胞中的过表达也是一种耐药机制，过表达PD-L1通过与T细胞表面的PD-1结合，从而抑制T细胞的激活，使肿瘤细胞发生免疫逃逸。
因此，有必要提供一种不仅能够有效治疗血液肿瘤、而且能够降低免疫抑制性的CAR-T细胞，解决CAR-T治疗的耐药性问题。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了CD19和PD-L1双靶点嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体可以同时靶向CD19和PD-L1分子，在降低肿瘤复发方面具有广阔的前景。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；
所述抗原结合结构域包括抗CD19单链抗体和抗PD-L1抗体。
本发明中，与单靶点嵌合抗原受体相比，抗CD19和PD-L1双靶点嵌合抗原受体不仅具有靶向CD19阳性细胞的作用，而且有效避免了靶点逃逸现象的发生。
优选地，所述抗CD19单链抗体包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:1：
DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPPRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSAYTFGQGTKLEIKSGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRHGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNQYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLDLQMNSLRVEDTAVYYCARRSITWYGGFDIWGQGTMVTVSSAQTTAPSVYPLAP。
优选地，所述抗PD-L1抗体包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；
SEQ ID NO:2：
MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASDSWIHRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVRDNSKNTLRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSS。
优选地，所述抗CD19单链抗体和抗PD-L1抗体通过连接肽连接。
优选地，所述跨膜结构域包括CD28和/或CD8α。
优选地，所述抗原结合结构域和跨膜结构域通过铰链区连接。
优选地，所述铰链区包括IgG1铰链区和/或CD8α铰链区。
优选地，所述信号转导结构域包括CD3ζ、4-1BB、CD28、TLR1、TLR2、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽。
优选地，所述信号肽包括CD8α信号肽。
优选地，所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、抗CD19单链抗体、连接肽、抗PD-L1抗体、CD8α、4-1BB和CD3ζ串联组成。
优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；
SEQ ID NO:3：
MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPPRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSAYTFGQGTKLEIKSGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRHGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNQYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLDLQMNSLRVEDTAVYYCARRSITWYGGFDIWGQGTMVTVSSAQTTAPSVYPLAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSMLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTRVFGTGTKVTVLGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASDSWIHRYWMSWVRQAPGKGLEWVANIKQDGSEKYYVDSVRDNSKNTLRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREGGWFGELAFDYWGQGTLVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。
第二方面，本发明提供了一种编码基因，所述编码基因编码第一方面所述的嵌合抗原受体。
第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体为含有第二方面所述的编码基因的病毒载体。
优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。
第四方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒为转染有第三方面所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞。
第五方面，本发明提供了一种CAR-T细胞，所述CAR-T细胞表达第一方面所述的嵌合抗原受体。
优选地，所述CAR-T细胞的基因组中整合有第二方面所述的编码基因。
优选地，所述CAR-T细胞包括第三方面所述的表达载体和/或第四方面所述的重组慢病毒。
第六方面，本发明提供了一种第五方面所述的CAR-T细胞的制备方法，所述方法包括将第一方面所述的嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞的步骤。
第七方面，本发明提供了一种第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的编码基因、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的重组慢病毒或第五方面所述的CAR-T细胞在制备疾病治疗药物中的应用。
优选地，所述疾病包括血液肿瘤。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明构建的CD19和PD-L1双靶点嵌合抗原受体不仅可以靶向识别CD19阳性的肿瘤细胞，而且将PD-L1/PD-1传导的抑制信号转换为T细胞激活信号，解除了肿瘤细胞过表达的PD-L1对T细胞的免疫抑制作用，克服了肿瘤细胞的免疫逃逸机制，缓解了CAR-T治疗的耐药性问题；
(2)本发明的CAR-T细胞具有显著提高的抗肿瘤效果，有效避免了靶点逃逸现象的发生，延缓了肿瘤复发。
附图说明
图1为WT、19-CAR-T和19-PDL1-CAR-T对肿瘤细胞K562-CD19在不同E:T比例下的杀伤效率；
图2为WT、PDL1-CAR-T和19-PDL1-CAR-T对肿瘤细胞K562-PD-L1在不同E:T比例下的杀伤效率。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1CAR分子载体的构建
本实施例首先全基因合成CD19和PD-L1双靶点CAR分子(氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)的编码基因，并在两端分别添加HindIII和BamHI酶切位点及其保护碱基；
利用限制性内切酶HindIII和BamHI对编码基因进行双酶切，使用1.5％琼脂凝胶电泳回收获得含有粘性末端的酶切产物，连接入线性化慢病毒表达载体pWPXLd-eGFP中，体系如表1所示；
37℃孵育30min后迅速置于冰上5min，随后加入Trans1-T1感受态20μL，静置30min，42℃热激90s，涂板，得到重组慢病毒载体。
表1
试剂 用量
线性化pWPXLd载体 200ng
CAR分子的编码基因 80ng
5×Exnase Buffer 4μL
Exnase 2μL
ddH<sub>2</sub>O 补齐至20μL
本实施例同时构建抗原结合结构域分别为抗CD19 scFv的CAR(antiCD19scFv-CD8α-4-1BB-CD3ζ)和抗PD-L1的CAR(antiPD-L1-CD8α-4-1BB-CD3ζ)，并构建相应的慢病毒载体。
实施例2慢病毒包装
本实施例对实施例1构建的慢病毒载体进行慢病毒包装，步骤如下：
(1)在10cm培养皿中培养293T细胞，培养基为DMEM高糖培养基+10％FBS(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液)；
(2)待培养皿中的293T细胞密度达80％时，更换培养基为DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；
(3)更换培养基培养2小时后，配制转染试剂，取500μL opti-DMEM至15mL离心管中，加入7.2μL浓度为10μg/μL的PEI(线性聚乙烯亚胺)，轻微混匀后，静置5min；
(4)取500μL opti-DMEM至1.5mL离心管中，取重组慢病毒载体9μg、pMD2.G辅助质粒3μg和psPAX 12μg，加入到离心管中，混匀，加入到转染试剂中，颠倒混匀，静置20min；
(5)将上述混合液全部加到293T细胞中，孵育6h后，更换7mL新鲜的培养基DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；
(6)在更换培养基24h后收集上清，更换7mL新鲜的培养基DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；
(7)24h后再次收集上清，更换7mL新鲜的培养基DMEM高糖培养基+1％FBS+1％双抗；
(8)24h后收集上清，并且丢弃细胞；
(9)培养基上清收集完毕后，在2500g下离心0.5小时，将上清用0.45μm过滤器过滤，得到重组慢病毒。
重组慢病毒载体包括含有靶向CD19和PD-L1双靶点的CAR的编码基因的慢病毒载体、含有靶向CD19单靶点的CAR的编码基因的慢病毒载体、含有靶向PD-L1单靶点的CAR的编码基因的慢病毒载体，pWPXLd-eGFP质粒为不含有CAR编码基因的空载体。
实施例3T细胞激活和慢病毒转染
(1)从脐带血中分选出Pan T细胞后，对细胞进行计数，将浓度调整至1×106个/mL，随后向每毫升细胞悬液中加入10μL美天旎TransAct T细胞试剂，激活48小时后更换为新鲜培养基(IMDM培养基+5％FBS(胎牛血清)+1％双抗(100×青霉素-链霉素混合溶液)+IL-2)；
(2)T细胞激活48h后，去磁珠，300g离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬T细胞，分别加入表达CAR的重组慢病毒或空白对照慢病毒(MOI＝10)，并加入8μg/mL polybrene和300IU/mL IL-2，置于37℃、5％CO2培养箱培养；
(3)24h后，300g离心5min，去上清，用含300IU/mL IL-2的新鲜培养基重悬T细胞，即得CAR-T细胞。
本实施例构建的CAR-T细胞分别为19-PDL1-CAR-T(表达抗CD19和PD-L1双靶点CAR)、19-CAR-T(表达抗CD19单靶点CAR)、PDL1-CAR-T(表达抗PD-L1单靶点CAR)，同时设置WT对照组(转染空白对照慢病毒)。
实施例4体外检测CAR-T细胞对肿瘤细胞K562-CD19的杀伤功能
将实施例3制备的WT、19-CAR-T和19-PDL1-CAR-T分别与1×104个肿瘤细胞K562-CD19按E:T为8:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8的比例混合，加入到96孔板中，每组设置3个复孔，250g离心5min后，置于37℃、5％CO2培养箱共培养18h；
18h后，向96孔板中加入100μL/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较WT、19-CAR-T和19-PDL1-CAR-T对K562-CD19的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：
100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)
结果如图1所示，19-CAR-T和19-PD-L1-CAR-T对K562-CD19的体外杀伤效率显著高于WT。
实施例5体外检测CAR-T细胞对肿瘤细胞K562-PD-L1的杀伤功能
将实施例3制备的WT、PD-L1-CAR-T和19-PD-L1-CAR-T分别与1×104个肿瘤细胞K562-PD-L1按E:T为8:1、4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8的比例混合，加入到96孔板中，每组设置3个复孔，250g离心5min后，置于37℃、5％CO2培养箱共培养18h；
18h后，向96孔板中加入100μL/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较WT、PD-L1-CAR-T和19-PD-L1-CAR-T对K562-PD-L1的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：
100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)
结果如图2所示，PD-L1-CAR-T和19-PD-L1-CAR-T对K562-PD-L1的体外杀伤效率显著高于WT。
综上所述，本发明构建的CD19和PD-L1双靶点嵌合抗原受体不仅可以靶向识别CD19阳性的肿瘤细胞，而且将PD-L1/PD-1传导的抑制信号转换为T细胞激活信号，解除了肿瘤细胞过表达的PD-L1对T细胞的免疫抑制作用，克服了肿瘤细胞的免疫逃逸机制，缓解了CAR-T治疗的耐药性问题，CAR-T细胞具有显著提高的抗肿瘤效果，有效避免了靶点逃逸现象的发生，延缓了肿瘤复发。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
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<110> 广东昭泰体内生物医药科技有限公司
<120> CD19和PD-L1双靶点嵌合抗原受体及其应用
<130> 2020
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 244
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Ala Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Gln
100 105 110
Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser
115 120 125
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg His Gly
130 135 140
Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala
145 150 155 160
Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys
165 170 175
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asp Leu
180 185 190
Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
195 200 205
Arg Arg Ser Ile Thr Trp Tyr Gly Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly
210 215 220
Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr
225 230 235 240
Pro Leu Ala Pro
<210> 2
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro
1 5 10 15
Ala Phe Leu Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser
20 25 30
Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser
35 40 45
Gln Asp Val Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys
50 55 60
Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val
65 70 75 80
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr
85 90 95
Ile Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser
100 105 110
Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr
115 120 125
Val Leu Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly
130 135 140
Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
145 150 155 160
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Ser Trp
165 170 175
Ile His Arg Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
180 185 190
Leu Glu Trp Val Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr
195 200 205
Val Asp Ser Val Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Arg Asp Asn Ala
210 215 220
Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr
225 230 235 240
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala
245 250 255
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
260 265 270
<210> 3
<211> 778
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu
20 25 30
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
35 40 45
Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
50 55 60
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro
65 70 75 80
Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile
85 90 95
Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
100 105 110
Asn Ser Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val
130 135 140
Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr
145 150 155 160
Phe Ser Arg His Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly
165 170 175
Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Gln Tyr Tyr
180 185 190
Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys
195 200 205
Asn Thr Leu Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala
210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ser Ile Thr Trp Tyr Gly Gly Phe Asp
225 230 235 240
Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gln Thr Thr
245 250 255
Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
260 265 270
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Leu Leu
275 280 285
Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro Ala Phe Leu
290 295 300
Leu Ile Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala
305 310 315 320
Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val
325 330 335
Ser Thr Ala Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
340 345 350
Leu Leu Ile Tyr Asp Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg
355 360 365
Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly
370 375 380
Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Thr Ser
385 390 395 400
Ser Ser Thr Arg Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly
405 410 415
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
420 425 430
Gly Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly
435 440 445
Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Asp Ser Trp Ile His Arg
450 455 460
Tyr Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
465 470 475 480
Val Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser
485 490 495
Val Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser
500 505 510
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545 550 555 560
Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser
565 570 575
Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr
580 585 590
Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala
595 600 605
Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
610 615 620
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
625 630 635 640
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
645 650 655
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg
660 665 670
Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn
675 680 685
Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg
690 695 700
Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro
705 710 715 720
Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala
725 730 735
Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His
740 745 750
Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp
755 760 765
Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
770 775

Claims (9)

1.一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、抗CD19单链抗体、连接肽、抗PD-L1抗体、CD8α、4-1BB和CD3ζ串联组成；
所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。
2.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因编码权利要求1所述的嵌合抗原受体。
3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体为含有权利要求2所述的编码基因的病毒载体；
所述病毒载体为慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种。
4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为慢病毒载体。
5.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒由转染有权利要求3或4所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞所制备得到。
6.一种CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞表达权利要求1所述的嵌合抗原受体；
所述CAR-T细胞的基因组中整合有权利要求2所述的编码基因。
7.根据权利要求6所述的CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞包括权利要求3或4所述的表达载体和/或权利要求5所述的重组慢病毒。
8.权利要求6或7所述的CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将编码权利要求1所述的嵌合抗原受体的基因导入T细胞的步骤。
9.权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求2所述的编码基因、权利要求3或4所述的表达载体、权利要求5所述的重组慢病毒或权利要求6或7所述的CAR-T细胞在制备疾病治疗药物中的应用；
所述疾病为血液肿瘤。
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Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111944850B (zh) * 2020-08-28 2023-03-31 澳门大学 表达抗cd22嵌合抗原受体和pd-l1阻断蛋白的细胞的制备方法、表达载体及应用
CN112048481B (zh) * 2020-09-09 2023-02-10 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种靶向cd19的嵌合抗原受体nk细胞及其应用
CN112226412B (zh) * 2020-10-12 2023-05-02 汤朝阳 一种表达免疫抑制检查点受体分子的t细胞及其应用
CN113527494B (zh) * 2020-11-26 2022-08-02 四川大学华西医院 一种新型的抗肿瘤转换受体t细胞
CN112521515B (zh) * 2020-12-21 2022-02-15 汤朝阳 Cd19和cd10双靶点嵌合抗原受体及其应用
CN112608387B (zh) * 2020-12-21 2023-05-05 汤朝阳 Cd19和cd20双靶点嵌合抗原受体及其应用

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107326014A (zh) * 2017-07-31 2017-11-07 时力生物科技（北京）有限公司 一种双特异性嵌合抗原受体修饰的t淋巴细胞及其制备方法和应用
CN108250301A (zh) * 2016-12-29 2018-07-06 天津天锐生物科技有限公司 一种多靶点嵌合抗原受体
CN108383914A (zh) * 2018-02-23 2018-08-10 北京美康基免生物科技有限公司 一种基于cd19的嵌合抗原受体及其应用
CN108864286A (zh) * 2017-05-16 2018-11-23 上海恒润达生生物科技有限公司 靶向cd19的嵌合抗原受体及联合表达抗pd1抗体可变区的方法和及其用途
CN109485732A (zh) * 2018-12-20 2019-03-19 四川大学华西医院 基因工程修饰的双靶点嵌合抗原受体及其用途
CN109734813A (zh) * 2019-01-28 2019-05-10 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种嵌合抗原受体及其应用
CN109748975A (zh) * 2019-03-05 2019-05-14 南京市第一医院 一种双特异性嵌合抗原受体及其应用
CN109971712A (zh) * 2017-12-28 2019-07-05 上海细胞治疗研究院 特异性靶向cd19抗原且高水平稳定表达pd-1抗体的car-t细胞及用途
CN111411085A (zh) * 2020-04-10 2020-07-14 格源致善(上海)生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞及其应用

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108250301A (zh) * 2016-12-29 2018-07-06 天津天锐生物科技有限公司 一种多靶点嵌合抗原受体
CN108864286A (zh) * 2017-05-16 2018-11-23 上海恒润达生生物科技有限公司 靶向cd19的嵌合抗原受体及联合表达抗pd1抗体可变区的方法和及其用途
CN107326014A (zh) * 2017-07-31 2017-11-07 时力生物科技（北京）有限公司 一种双特异性嵌合抗原受体修饰的t淋巴细胞及其制备方法和应用
CN109971712A (zh) * 2017-12-28 2019-07-05 上海细胞治疗研究院 特异性靶向cd19抗原且高水平稳定表达pd-1抗体的car-t细胞及用途
CN108383914A (zh) * 2018-02-23 2018-08-10 北京美康基免生物科技有限公司 一种基于cd19的嵌合抗原受体及其应用
CN109485732A (zh) * 2018-12-20 2019-03-19 四川大学华西医院 基因工程修饰的双靶点嵌合抗原受体及其用途
CN109734813A (zh) * 2019-01-28 2019-05-10 广东昭泰体内生物医药科技有限公司 一种嵌合抗原受体及其应用
CN109748975A (zh) * 2019-03-05 2019-05-14 南京市第一医院 一种双特异性嵌合抗原受体及其应用
CN111411085A (zh) * 2020-04-10 2020-07-14 格源致善(上海)生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞及其应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Rui Zhang等.Effect and changes in PD‑1 expression of CD19 CAR‑T cells from T cells highly expressing PD‑1 combined with reduced‑dose PD‑ inhibitor.《Oncol Rep.》.2019,第41卷(第6期),第3455-3463页. *
The killing effect of novel bi-specific Trop2/PD-L1 CAR-T cell targeted gastric cancer;Wei Zhao等;《Am J Cancer Res.》;20190801;第9卷(第8期);摘要，第1846页左栏第1段-第1854页右栏第2段 *

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