CN112608387B

CN112608387B - Cd19和cd20双靶点嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN112608387B
Application number: CN202011519877.3A
Authority: CN
Inventors: 汤朝阳; 请求不公布姓名; 秦乐; 吴迪; 冯世忠; 冯嘉昆; 杨乐旋
Original assignee: Individual
Current assignee: Guangdong Zhaotai Cell Biotechnology Co ltd
Priority date: 2020-12-21
Filing date: 2020-12-21
Publication date: 2023-05-05
Anticipated expiration: 2040-12-21
Also published as: CN112608387A

Abstract

本发明提供了CD19和CD20双靶点嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；所述抗原结合结构域包括抗CD19单链抗体和抗CD20单链抗体。本发明的抗CD19和CD20双靶点嵌合抗原受体对CD19阳性和/或CD20阳性细胞具有靶向活性，表达抗CD19和CD20双靶点嵌合抗原受体的T细胞对CD19抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞、CD20抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞均具有杀伤作用，有利于避免免疫逃逸现象，降低了疾病复发的可能性。

Description

CD19和CD20双靶点嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，涉及CD19和CD20双靶点嵌合抗原受体及其应用。

背景技术

近年来，随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体T细胞疗法(Chimeric antigen receptor T-cell immunotherapy，CAR-T)成为最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)由肿瘤相关抗原结合区、胞外铰链区、跨膜区以及胞内信号转导区组成。通常，CAR分子包含的抗体单链片段可变区(single chain fragment variable，scFv)对肿瘤相关抗原(tumor associated antigen，TAA)具有特异性结合作用，其通过铰链和跨膜区与信号传导分子的胞质结构域偶联。

目前，CAR-T细胞疗法已经广泛应用于治疗B细胞恶性肿瘤，靶向CD19的CAR-T细胞是CAR-T疗法治疗B细胞恶性肿瘤的先驱，为治疗B细胞恶性肿瘤提供了有效方案。然而，医学诊断表明，很多肿瘤细胞并不表达专一、特异的肿瘤抗原。例如，某些血液肿瘤中的肿瘤细胞并不表达CD19分子，而表达CD20分子，仅利用靶向CD19分子的CAR-T细胞治疗效果不佳，一段时间后部分患者出现了肿瘤复发现象。肿瘤异质性已成为阻碍细胞疗法应用于实体肿瘤治疗的一大障碍。

因此，有必要开发双靶向CD19和CD20分子的嵌合抗原受体，提高CAR-T细胞对肿瘤细胞的靶向和清除作用。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了CD19和CD20双靶点嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合抗原受体可以同时靶向CD19和CD20分子，在治疗血液恶性疾病方面具有广阔的前景。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种CD19和CD20双靶点嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；

所述抗原结合结构域包括抗CD19单链抗体和抗CD20单链抗体。

本发明中，与单靶点嵌合抗原受体相比，抗CD19和CD20双靶点嵌合抗原受体对CD19阳性和/或CD20阳性细胞具有更强的靶向活性，对CD19抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞、CD20抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞均具有高效的靶向作用，有利于避免免疫逃逸现象。

优选地，所述抗CD19单链抗体包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:1：

DIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPPRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSAYTFGQGTKLEIKSGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRHGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNQYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLDLQMNSLRVEDTAVYYCARRSITWYGGFDIWGQGTMVTVSSAQTTAPSVYPLAP。

优选地，所述抗CD20单链抗体包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

SEQ ID NO:2：

DIQMTQSPSTMSTSVGDRVSVNCKASQNVGTNVAWYQQKPGKSPKGLIYSASFRYSGVPSRFTGSGSGTDFTLTIFNVQPDDLAEYFCQQYNNYPLTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSSEGSTKGEVQVEESGGGLVQPGGSMRLSCVASGFSFNNYWMNWVRQSPGKGLEWVAEIRLKSNNYATHYVDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGWDDYAMDHWGQGISVTVSS。

优选地，所述抗CD19单链抗体和抗CD20单链抗体通过连接肽连接。

优选地，所述跨膜结构域包括CD28和/或CD8α。

优选地，所述信号转导结构域包括CD3ζ、4-1BB、CD28、TLR1、TLR2、CD27、OX40或DAP10中的任意一种或至少两种的组合。

优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽。

优选地，所述信号肽包括CD8α信号肽。

优选地，所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、抗CD19单链抗体、连接肽、抗CD20单链抗体、CD8α铰链区和跨膜区、TLR1和CD3ζ串联组成。

优选地，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示；

SEQ ID NO:3：

MALPVTALLLPLALLLHAARPDIQMTQSPSTLSASVGDRVTITCRASQSISSWLAWYQQKPGKAPKLLIYKASSLESGVPPRFSGSGSGTEFTLTISSLQPDDFATYYCQQYNSAYTFGQGTKLEIKSGGGGQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSRHGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSNQYYVDSVKGRFTISRDNSKNTLDLQMNSLRVEDTAVYYCARRSITWYGGFDIWGQGTMVTVSSAQTTAPSVYPLAPGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSTMSTSVGDRVSVNCKASQNVGTNVAWYQQKPGKSPKGLIYSASFRYSGVPSRFTGSGSGTDFTLTIFNVQPDDLAEYFCQQYNNYPLTFGGGTKLEIKGSTSGSGKPGSSEGSTKGEVQVEESGGGLVQPGGSMRLSCVASGFSFNNYWMNWVRQSPGKGLEWVAEIRLKSNNYATHYVDSVKGRFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTGWDDYAMDHWGQGISVTVSSTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCNIPLEELQRNLQFHAFISYSGHDSFWVKNELLPNLEKEGMQICLHERNFVPGKSIVENIITCIEKSYKSIFVLSPNFVQSEWCHYELYFAHHNLFHEGSNSLILILLEPIPQYSIPSSYHKLKSLMARRTYLEWPKEKSKRGLFWANLRAAINIKLTEQAKKRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。

第二方面，本发明提供了一种编码基因，所述编码基因编码第一方面所述的嵌合抗原受体。

优选地，所述编码基因包括抗CD19单链抗体编码序列和抗CD20单链抗体编码序列。

优选地，所述抗CD19单链抗体编码序列包括SEQ ID NO:4所示的核酸序列；

SEQ ID NO:4：

gacatccagatgacccagagccccagcaccctgagcgccagcgtgggcgaccgcgtgaccatcacctgccgcgccagccagagcatcagcagctggctggcctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacaaggccagcagcctggagagcggcgtgcccccccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgagttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgacgacttcgccacctactactgccagcagtacaacagcgcctacaccttcggccagggcaccaagctggagatcaagtccggtggcggtggccaggtgcagctggtggagagcggcggcggcgtggtgcagcccggccgcagcctgcgcctgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagccgccacggcatgcactgggtgcgccaggcccccggcaagggcctggagtgggtggccgtgatctggtacgacggcagcaaccagtactacgtggacagcgtgaagggccgcttcaccatcagccgcgacaacagcaagaacaccctggacctgcagatgaacagcctgcgcgtggaggacaccgccgtgtactactgcgcccgccgcagcatcacctggtacggcggcttcgacatctggggccagggcaccatggtgaccgtgagcagcgcccagaccaccgcccccagcgtgtaccccctggccccc。

优选地，所述抗CD20单链抗体编码序列包括SEQ ID NO:5所示的核酸序列；

SEQ ID NO:5：

gacatccagatgacccagagccccagcaccatgagcaccagcgtgggcgacagagtgagcgtgaactgcaaggccagccagaacgtgggcaccaacgtggcctggtaccagcagaagcccggcaagagccccaagggcctgatctacagcgccagcttcagatacagcggcgtgcccagcagattcaccggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcttcaacgtgcagcccgacgacctggccgagtacttctgccagcagtacaacaactaccccctgaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagggcagcaccagcggcagcggcaagcccggcagcagcgagggcagcaccaagggcgaggtgcaggtggaggagagcggcggcggcctggtgcagcccggcggcagcatgagactgagctgcgtggccagcggcttcagcttcaacaactactggatgaactgggtgagacagagccccggcaagggcctggagtgggtggccgagatcagactgaagagcaacaactacgccacccactacgtggacagcgtgaagggcagattcaccatcagcagagacgacagcaagagcagcgtgtacctgcagatgaacaacctgagagccgaggacaccggcatctactactgcaccggctgggacgactacgccatggaccactggggccagggcatcagcgtgaccgtgagcagc。

优选地，所述嵌合抗原受体的编码基因包括SEQ ID NO:6所示的核酸序列；

SEQ ID NO:6：

atggcactgcctgtgactgccctgctgctccctctcgcactcctgctgcacgcagcccgcccagacatccagatgacccagagccccagcaccctgagcgccagcgtgggcgaccgcgtgaccatcacctgccgcgccagccagagcatcagcagctggctggcctggtaccagcagaagcccggcaaggcccccaagctgctgatctacaaggccagcagcctggagagcggcgtgcccccccgcttcagcggcagcggcagcggcaccgagttcaccctgaccatcagcagcctgcagcccgacgacttcgccacctactactgccagcagtacaacagcgcctacaccttcggccagggcaccaagctggagatcaagtccggtggcggtggccaggtgcagctggtggagagcggcggcggcgtggtgcagcccggccgcagcctgcgcctgagctgcgccgccagcggcttcaccttcagccgccacggcatgcactgggtgcgccaggcccccggcaagggcctggagtgggtggccgtgatctggtacgacggcagcaaccagtactacgtggacagcgtgaagggccgcttcaccatcagccgcgacaacagcaagaacaccctggacctgcagatgaacagcctgcgcgtggaggacaccgccgtgtactactgcgcccgccgcagcatcacctggtacggcggcttcgacatctggggccagggcaccatggtgaccgtgagcagcgcccagaccaccgcccccagcgtgtaccccctggcccccggtggaggcggcagtggcggaggtgggagcggagggggcggttccggtggcgggggatctgacatccagatgacccagagccccagcaccatgagcaccagcgtgggcgacagagtgagcgtgaactgcaaggccagccagaacgtgggcaccaacgtggcctggtaccagcagaagcccggcaagagccccaagggcctgatctacagcgccagcttcagatacagcggcgtgcccagcagattcaccggcagcggcagcggcaccgacttcaccctgaccatcttcaacgtgcagcccgacgacctggccgagtacttctgccagcagtacaacaactaccccctgaccttcggcggcggcaccaagctggagatcaagggcagcaccagcggcagcggcaagcccggcagcagcgagggcagcaccaagggcgaggtgcaggtggaggagagcggcggcggcctggtgcagcccggcggcagcatgagactgagctgcgtggccagcggcttcagcttcaacaactactggatgaactgggtgagacagagccccggcaagggcctggagtgggtggccgagatcagactgaagagcaacaactacgccacccactacgtggacagcgtgaagggcagattcaccatcagcagagacgacagcaagagcagcgtgtacctgcagatgaacaacctgagagccgaggacaccggcatctactactgcaccggctgggacgactacgccatggaccactggggccagggcatcagcgtgaccgtgagcagcaccacgacgccagcgccgcgaccaccaacaccggcgcccaccatcgcgtcgcagcccctgtccctgcgcccagaggcgtgccggccagcggcggggggcgcagtgcacacgagggggctggacttcgcctgtgatatctacatctgggcgcccttggccgggacttgtggggtccttctcctgtcactggttatcaccctttactgcaacatacccttagaagaactccaaagaaatctccagtttcatgcatttatttcatatagtgggcacgattctttctgggtgaagaatgaattattgccaaacctagagaaagaaggtatgcagatttgccttcatgagagaaactttgttcctggcaagagcattgtggaaaatatcatcacctgcattgagaagagttacaagtccatctttgttttgtctcccaactttgtccagagtgaatggtgccattatgaactctactttgcccatcacaatctctttcatgaaggatctaatagcttaatcctgatcttgctggaacccattccgcagtactccattcctagcagttatcacaagctcaaaagtctcatggccaggaggacttatttggaatggcccaaggaaaagagcaaacgtggccttttttgggctaacttaagggcagccattaatattaagctgacagagcaagcaaagaaaagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgc。

第三方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体为含有第二方面所述的编码基因的病毒载体。

优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体中的任意一种。

第四方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒由转染有第三方面所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞制备得到。

第五方面，本发明提供了一种CD19和CD20双靶点CAR-T细胞，所述CD19和CD20双靶点CAR-T细胞表达第一方面所述的嵌合抗原受体。

优选地，所述CD19和CD20双靶点CAR-T细胞的基因组中整合有第二方面所述的编码基因。

优选地，所述CD19和CD20双靶点CAR-T细胞包括第三方面所述的表达载体和/或第四方面所述的重组慢病毒。

第六方面，本发明提供了一种第五方面所述的CD19和CD20双靶点CAR-T细胞的制备方法，所述方法包括将第一方面所述的嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞的步骤。

第七方面，本发明提供了第一方面所述的嵌合抗原受体、第二方面所述的编码基因、第三方面所述的表达载体、第四方面所述的重组慢病毒或第五方面所述的CD19和CD20双靶点CAR-T细胞在制备疾病治疗药物中的应用。

优选地，所述疾病包括血液肿瘤。

优选地，所述疾病包括CD19阳性和/或CD20阳性疾病。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明构建的抗CD19和CD20双靶点嵌合抗原受体与单靶点嵌合抗原受体相比，对CD19阳性和/或CD20阳性细胞具有更强的靶向活性，对CD19抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞、CD20抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞均具有高效的靶向作用，有利于避免免疫逃逸现象；

(2)本发明表达抗CD19和CD20双靶点嵌合抗原受体的T细胞对CD19阳性和/或CD20阳性细胞具有高效的靶向活性和杀伤效力，对CD19抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞、CD20抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞均具有杀伤作用，有利于避免免疫逃逸现象，降低了疾病复发的可能性。

附图说明

图1为CAR-T细胞对肿瘤细胞K562-CD19-GL在不同E:T比下的杀伤效率；

图2为CAR-T细胞K562-CD20-GL在不同E:T比下的杀伤效率。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1 CAR分子载体的构建

本实施例首先基因合成抗CD19和CD20双靶点嵌合抗原受体的编码基因(SEQ IDNO:6)，并在编码基因的C端和N端分别添加限制性内切酶Pme1酶切位点及其保护碱基和限制性内切酶Spe1酶切位点及其保护碱基；

利用限制性内切酶Pme1和Spe1对编码基因进行双酶切，琼脂凝胶电泳回收获得含有粘性末端的酶切产物，连接入同样经Pme1和Spe1双酶切的线性化pWPXLd-eGFP质粒(含粘性末端)中，连接反应在T4 DNA聚合酶(Invitrogent公司)的参与下进行，得到含有靶向CD19和CD20双靶点的CAR的编码基因的慢病毒载体。

本实施例同时构建抗原结合结构域分别为抗CD19 scFv的CAR(antiCD19 scFv-CD8α-T1-CD3ζ)和抗CD20 scFv的CAR(antiCD20 scFv-CD8α-T1-CD3ζ)，并构建相应的慢病毒载体。

实施例2慢病毒包装

为了将CAR分子导入T细胞，采用293T细胞制备重组慢病毒，当293T细胞铺100mm培养皿板底达80～90％时，进行慢病毒包装：

病毒包装前2h，更换培养基为含1％胎牛血清的DMEM，加入量为6mL/100mm培养皿；

配制如表1所示的质粒混合液，pWPXLd-表达质粒包括含有靶向CD19和CD20双靶点的CAR的编码基因的慢病毒载体、含有靶向CD19单靶点的CAR的编码基因的慢病毒载体、含有靶向CD20单靶点的CAR的编码基因的慢病毒载体，pWPXLd-eGFP质粒为不含有CAR编码基因的空载体；

表1

将36μg PEI加至另一500μL opti-MEM培养基内，混匀，室温静置5min；

将表1所示的质粒混合液与PEI混合，吹打混匀，室温静置20min；

将上述混合液逐滴加至培养在100mm培养皿中的293T细胞上；

培养6h后，更换培养基为含1％胎牛血清的DMEM，加入量为7mL/100mm培养皿；

包装后24h、48h和72h，收取病毒上清，同时向293T细胞补加培养基，加入量为7mL/100mm培养皿；

1000g离心10min，0.45μm滤器过滤，得到表达CAR的重组慢病毒或空白对照eGFP慢病毒，4℃保存待用。

实施例3 T细胞激活和慢病毒转染

采用Ficoll密度梯度离心试剂盒(GE公司)从全血中分离外周血单个核细胞(PBMC)，去除红细胞后，再利用MACS Pan-T磁珠分选出T细胞；

分选出来的T细胞采用培养基(AIM-V培养基+5％FBS+青霉素100U/mL+链霉素0.1mg/mL)稀释至细胞浓度为2.5×10⁶个/mL待用；

采用CD2/CD3/CD28 T细胞激活扩增试剂盒(美天旎公司)激活T细胞，即包被磁珠与T细胞以1:2比例混合，T细胞最终密度为5×10⁶个/mL/cm²，混合后，置于37℃、5％CO₂培养箱培养刺激48h；

T细胞激活48h后，去磁珠，300g离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬T细胞，分别加入表达CAR的重组慢病毒或空白对照eGFP慢病毒(MOI＝10)，并加入8μg/mL polybrene和300IU/mL IL-2，置于37℃、5％CO₂培养箱培养；

24h后，300g离心5min，去上清，用含300IU/mL IL-2的新鲜培养基重悬T细胞，即得CAR-T细胞；

将CAR-T细胞密度维持在1×10⁶个/mL左右，每2～3天进行一次半量换液，两周后，CAR-T细胞数扩增了100倍。

本实施例构建的CAR-T细胞分别为19.20.T1.zT(表达抗CD19和CD20双靶点CAR)、19T1zT(表达抗CD19单靶点CAR)、20T1zT(表达抗CD20单靶点CAR)，同时设置WT对照组(转染空白对照eGFP慢病毒)。

实施例4 T细胞对CAR分子的表达

由于表达CAR分子的慢病毒载体上携带有eGFP基因，可以通过eGFP指示T细胞上CAR分子的表达，本实施例采用流式细胞仪ACEA Novocyte，检测T细胞上的eGFP。

结果发现，WT细胞对CAR分子的表达效率为1.2％，19T1zT对CAR分子的表达效率为25.6％，20T1zT对CAR分子的表达效率为18.9％，19.20.T1.zT对CAR分子的表达效率为14.1％。

实施例5体外检测CAR-T细胞对肿瘤细胞K562-CD19-GL的杀伤功能将实施例3制备的WT、19T1zT和19.20.T1.zT分别与1×10⁴个肿瘤细胞K562-CD19-GL按E:T为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8的比例混合，加入到96孔板中，每组设置3个复孔，250g离心5min后，置于37℃、5％CO₂培养箱共培养18h；

18h后，向96孔板中加入100μL/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较WT、19T1zT和19.20.T1.zT对K562-CD19-GL的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：

100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)

结果如图1所示，19T1zT和19.20.T1.zT对K562-CD19-GL的体外杀伤效率显著高于WT，而19.20.T1.zT的杀伤能力又略高于19T1zT。

实施例6体外检测CAR-T细胞对肿瘤细胞K562-CD20-GL的杀伤功能

将实施例3制备的WT、20T1zT和19.20.T1.zT分别与1×10⁴个肿瘤细胞K562-CD20-GL按E:T为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8的比例混合，加入到96孔板中，每组设置3个复孔，250g离心5min后，置于37℃、5％CO₂培养箱共培养18h；

18h后，向96孔板中加入100μL/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定RLU(relative light unit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(Luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较WT、20T1zT和19.20.T1.zT对K562-CD20-GL的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：

结果如图2所示，20T1zT和19.20.T1.zT对K562-CD20-GL的体外杀伤效率显著高于WT，而20T1zT和19.20.T1.zT对CD20阳性细胞的杀伤能力相当，说明双靶点抗原结合结构域并不影响CAR-T的杀伤能力，19.20.T1.zT对CD19和/或CD20阳性均具有有效的肿瘤细胞毒性。

综上所述，本发明构建的抗CD19和CD20双靶点嵌合抗原受体对CD19阳性和/或CD20阳性细胞具有靶向活性，表达抗CD19和CD20双靶点嵌合抗原受体的T细胞对CD19抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞、CD20抗原表达量少或不表达的肿瘤细胞均具有杀伤作用，有利于避免免疫逃逸现象，降低了疾病复发的可能性。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广东昭泰体内生物医药科技有限公司

<120> CD19和CD20双靶点嵌合抗原受体及其应用

<130> 202012

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Ala Tyr Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser Gly Gly Gly Gly Gln

100 105 110

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser

115 120 125

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg His Gly

130 135 140

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala

145 150 155 160

Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Gln Tyr Tyr Val Asp Ser Val Lys

165 170 175

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Asp Leu

180 185 190

Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

195 200 205

Arg Arg Ser Ile Thr Trp Tyr Gly Gly Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly

210 215 220

Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gln Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr

225 230 235 240

Pro Leu Ala Pro

<210> 2

<211> 244

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Met Ser Thr Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Ser Val Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Gly Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Phe Asn Val Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Leu Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly

100 105 110

Ser Gly Lys Pro Gly Ser Ser Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln

115 120 125

Val Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Met Arg

130 135 140

Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr Trp Met Asn

145 150 155 160

Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile

165 170 175

Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Val Asp Ser Val Lys

180 185 190

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu

195 200 205

Gln Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr

210 215 220

Gly Trp Asp Asp Tyr Ala Met Asp His Trp Gly Gln Gly Ile Ser Val

225 230 235 240

Thr Val Ser Ser

<210> 3

<211> 872

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 3

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu

20 25 30

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Pro Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Gln Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr

100 105 110

Asn Ser Ala Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val

130 135 140

Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr

145 150 155 160

Phe Ser Arg His Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

165 170 175

Leu Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Gln Tyr Tyr

180 185 190

Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys

195 200 205

Asn Thr Leu Asp Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala

210 215 220

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Ser Ile Thr Trp Tyr Gly Gly Phe Asp

225 230 235 240

Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Gln Thr Thr

245 250 255

Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

260 265 270

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln

275 280 285

Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val

290 295 300

Ser Val Asn Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala Trp

305 310 315 320

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Gly Leu Ile Tyr Ser Ala

325 330 335

Ser Phe Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser

340 345 350

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Phe Asn Val Gln Pro Asp Asp Leu

355 360 365

Ala Glu Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Tyr Pro Leu Thr Phe Gly

370 375 380

Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys

385 390 395 400

Pro Gly Ser Ser Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Gln Val Glu Glu

405 410 415

Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Met Arg Leu Ser Cys

420 425 430

Val Ala Ser Gly Phe Ser Phe Asn Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg

435 440 445

Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu Ile Arg Leu Lys

450 455 460

Ser Asn Asn Tyr Ala Thr His Tyr Val Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe

465 470 475 480

Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser Val Tyr Leu Gln Met Asn

485 490 495

Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr Tyr Cys Thr Gly Trp Asp

500 505 510

Asp Tyr Ala Met Asp His Trp Gly Gln Gly Ile Ser Val Thr Val Ser

515 520 525

Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile

530 535 540

Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala

545 550 555 560

Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr

565 570 575

Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu

580 585 590

Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn Ile Pro Leu Glu Glu Leu Gln Arg Asn

595 600 605

Leu Gln Phe His Ala Phe Ile Ser Tyr Ser Gly His Asp Ser Phe Trp

610 615 620

Val Lys Asn Glu Leu Leu Pro Asn Leu Glu Lys Glu Gly Met Gln Ile

625 630 635 640

Cys Leu His Glu Arg Asn Phe Val Pro Gly Lys Ser Ile Val Glu Asn

645 650 655

Ile Ile Thr Cys Ile Glu Lys Ser Tyr Lys Ser Ile Phe Val Leu Ser

660 665 670

Pro Asn Phe Val Gln Ser Glu Trp Cys His Tyr Glu Leu Tyr Phe Ala

675 680 685

His His Asn Leu Phe His Glu Gly Ser Asn Ser Leu Ile Leu Ile Leu

690 695 700

Leu Glu Pro Ile Pro Gln Tyr Ser Ile Pro Ser Ser Tyr His Lys Leu

705 710 715 720

Lys Ser Leu Met Ala Arg Arg Thr Tyr Leu Glu Trp Pro Lys Glu Lys

725 730 735

Ser Lys Arg Gly Leu Phe Trp Ala Asn Leu Arg Ala Ala Ile Asn Ile

740 745 750

Lys Leu Thr Glu Gln Ala Lys Lys Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala

755 760 765

Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu

770 775 780

Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly

785 790 795 800

Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu

805 810 815

Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser

820 825 830

Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly

835 840 845

Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu

850 855 860

His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

865 870

<210> 4

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gacatccaga tgacccagag ccccagcacc ctgagcgcca gcgtgggcga ccgcgtgacc 60

atcacctgcc gcgccagcca gagcatcagc agctggctgg cctggtacca gcagaagccc 120

ggcaaggccc ccaagctgct gatctacaag gccagcagcc tggagagcgg cgtgcccccc 180

cgcttcagcg gcagcggcag cggcaccgag ttcaccctga ccatcagcag cctgcagccc 240

gacgacttcg ccacctacta ctgccagcag tacaacagcg cctacacctt cggccagggc 300

accaagctgg agatcaagtc cggtggcggt ggccaggtgc agctggtgga gagcggcggc 360

ggcgtggtgc agcccggccg cagcctgcgc ctgagctgcg ccgccagcgg cttcaccttc 420

agccgccacg gcatgcactg ggtgcgccag gcccccggca agggcctgga gtgggtggcc 480

gtgatctggt acgacggcag caaccagtac tacgtggaca gcgtgaaggg ccgcttcacc 540

atcagccgcg acaacagcaa gaacaccctg gacctgcaga tgaacagcct gcgcgtggag 600

gacaccgccg tgtactactg cgcccgccgc agcatcacct ggtacggcgg cttcgacatc 660

tggggccagg gcaccatggt gaccgtgagc agcgcccaga ccaccgcccc cagcgtgtac 720

cccctggccc cc 732

<210> 5

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gacatccaga tgacccagag ccccagcacc atgagcacca gcgtgggcga cagagtgagc 60

gtgaactgca aggccagcca gaacgtgggc accaacgtgg cctggtacca gcagaagccc 120

ggcaagagcc ccaagggcct gatctacagc gccagcttca gatacagcgg cgtgcccagc 180

agattcaccg gcagcggcag cggcaccgac ttcaccctga ccatcttcaa cgtgcagccc 240

gacgacctgg ccgagtactt ctgccagcag tacaacaact accccctgac cttcggcggc 300

ggcaccaagc tggagatcaa gggcagcacc agcggcagcg gcaagcccgg cagcagcgag 360

ggcagcacca agggcgaggt gcaggtggag gagagcggcg gcggcctggt gcagcccggc 420

ggcagcatga gactgagctg cgtggccagc ggcttcagct tcaacaacta ctggatgaac 480

tgggtgagac agagccccgg caagggcctg gagtgggtgg ccgagatcag actgaagagc 540

aacaactacg ccacccacta cgtggacagc gtgaagggca gattcaccat cagcagagac 600

gacagcaaga gcagcgtgta cctgcagatg aacaacctga gagccgagga caccggcatc 660

tactactgca ccggctggga cgactacgcc atggaccact ggggccaggg catcagcgtg 720

accgtgagca gc 732

<210> 6

<211> 2616

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggcactgc ctgtgactgc cctgctgctc cctctcgcac tcctgctgca cgcagcccgc 60

ccagacatcc agatgaccca gagccccagc accctgagcg ccagcgtggg cgaccgcgtg 120

accatcacct gccgcgccag ccagagcatc agcagctggc tggcctggta ccagcagaag 180

cccggcaagg cccccaagct gctgatctac aaggccagca gcctggagag cggcgtgccc 240

ccccgcttca gcggcagcgg cagcggcacc gagttcaccc tgaccatcag cagcctgcag 300

cccgacgact tcgccaccta ctactgccag cagtacaaca gcgcctacac cttcggccag 360

ggcaccaagc tggagatcaa gtccggtggc ggtggccagg tgcagctggt ggagagcggc 420

ggcggcgtgg tgcagcccgg ccgcagcctg cgcctgagct gcgccgccag cggcttcacc 480

ttcagccgcc acggcatgca ctgggtgcgc caggcccccg gcaagggcct ggagtgggtg 540

gccgtgatct ggtacgacgg cagcaaccag tactacgtgg acagcgtgaa gggccgcttc 600

accatcagcc gcgacaacag caagaacacc ctggacctgc agatgaacag cctgcgcgtg 660

gaggacaccg ccgtgtacta ctgcgcccgc cgcagcatca cctggtacgg cggcttcgac 720

atctggggcc agggcaccat ggtgaccgtg agcagcgccc agaccaccgc ccccagcgtg 780

taccccctgg cccccggtgg aggcggcagt ggcggaggtg ggagcggagg gggcggttcc 840

ggtggcgggg gatctgacat ccagatgacc cagagcccca gcaccatgag caccagcgtg 900

ggcgacagag tgagcgtgaa ctgcaaggcc agccagaacg tgggcaccaa cgtggcctgg 960

taccagcaga agcccggcaa gagccccaag ggcctgatct acagcgccag cttcagatac 1020

agcggcgtgc ccagcagatt caccggcagc ggcagcggca ccgacttcac cctgaccatc 1080

ttcaacgtgc agcccgacga cctggccgag tacttctgcc agcagtacaa caactacccc 1140

ctgaccttcg gcggcggcac caagctggag atcaagggca gcaccagcgg cagcggcaag 1200

cccggcagca gcgagggcag caccaagggc gaggtgcagg tggaggagag cggcggcggc 1260

ctggtgcagc ccggcggcag catgagactg agctgcgtgg ccagcggctt cagcttcaac 1320

aactactgga tgaactgggt gagacagagc cccggcaagg gcctggagtg ggtggccgag 1380

atcagactga agagcaacaa ctacgccacc cactacgtgg acagcgtgaa gggcagattc 1440

accatcagca gagacgacag caagagcagc gtgtacctgc agatgaacaa cctgagagcc 1500

gaggacaccg gcatctacta ctgcaccggc tgggacgact acgccatgga ccactggggc 1560

cagggcatca gcgtgaccgt gagcagcacc acgacgccag cgccgcgacc accaacaccg 1620

gcgcccacca tcgcgtcgca gcccctgtcc ctgcgcccag aggcgtgccg gccagcggcg 1680

gggggcgcag tgcacacgag ggggctggac ttcgcctgtg atatctacat ctgggcgccc 1740

ttggccggga cttgtggggt ccttctcctg tcactggtta tcacccttta ctgcaacata 1800

cccttagaag aactccaaag aaatctccag tttcatgcat ttatttcata tagtgggcac 1860

gattctttct gggtgaagaa tgaattattg ccaaacctag agaaagaagg tatgcagatt 1920

tgccttcatg agagaaactt tgttcctggc aagagcattg tggaaaatat catcacctgc 1980

attgagaaga gttacaagtc catctttgtt ttgtctccca actttgtcca gagtgaatgg 2040

tgccattatg aactctactt tgcccatcac aatctctttc atgaaggatc taatagctta 2100

atcctgatct tgctggaacc cattccgcag tactccattc ctagcagtta tcacaagctc 2160

aaaagtctca tggccaggag gacttatttg gaatggccca aggaaaagag caaacgtggc 2220

cttttttggg ctaacttaag ggcagccatt aatattaagc tgacagagca agcaaagaaa 2280

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 2340

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 2400

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 2460

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 2520

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 2580

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 2616

Claims

1.一种CD19和CD20双靶点嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和信号转导结构域；

所述抗原结合结构域包括抗CD19单链抗体和抗CD20单链抗体；

所述抗CD19单链抗体为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

所述抗CD20单链抗体为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；

所述抗CD19单链抗体和抗CD20单链抗体通过连接肽连接；

所述嵌合抗原受体由CD8α信号肽、抗CD19单链抗体、连接肽、抗CD20单链抗体、CD8α铰链区和跨膜区、TLR1和CD3ζ串联组成；

所述嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

2.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因编码权利要求1所述的嵌合抗原受体。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因包括抗CD19单链抗体编码序列和抗CD20单链抗体编码序列；

所述抗CD19单链抗体编码序列为SEQ ID NO:4所示的核酸序列；

所述抗CD20单链抗体编码序列为SEQ ID NO:5所示的核酸序列；

所述嵌合抗原受体的编码基因为SEQ ID NO:6所示的核酸序列。

4.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体为含有权利要求2或3所述的编码基因的病毒载体。

5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述病毒载体包括慢病毒载体、腺相关病毒载体或逆转录病毒载体中的任意一种。

6.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒由转染有权利要求4或5所述的表达载体和辅助质粒的哺乳细胞制备得到。

7.一种CD19和CD20双靶点CAR-T细胞，其特征在于，所述CD19和CD20双靶点CAR-T细胞表达权利要求1所述的嵌合抗原受体。

8.根据权利要求7所述的CD19和CD20双靶点CAR-T细胞，其特征在于，所述CD19和CD20双靶点CAR-T细胞的基因组中整合有权利要求2或3所述的编码基因。

9.根据权利要求7所述的CD19和CD20双靶点CAR-T细胞，其特征在于，所述CD19和CD20双靶点CAR-T细胞包括权利要求4或5所述的表达载体和/或权利要求6所述的重组慢病毒。

10.一种如权利要求7-9中任一项所述的CD19和CD20双靶点CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求1所述的嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞的步骤。

11.权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求2或3所述的编码基因、权利要求4或5所述的表达载体、权利要求6所述的重组慢病毒或权利要求7-9中任一项所述的CD19和CD20双靶点CAR-T细胞在制备疾病治疗药物中的应用；

所述疾病为血液肿瘤；

所述疾病为CD19阳性和/或CD20阳性疾病。