CN106755109A - 一种表达人cd19和cd20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体 - Google Patents

一种表达人cd19和cd20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种表达人CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体，其是由含有表达人CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒穿梭表达载体pLVX和辅助包装质粒来提供慢病毒所需的整合，逆转录酶和结构蛋白及外膜蛋白构建而成。还提供了该慢病毒载体的构建方法。本发明所构建的表达人CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体，其含有的CD19和CD20嵌合抗原受体基因可同时高效表达CD19和CD20嵌合抗原受体基因，将人T细胞转化成对B细胞肿瘤具有特异性识别和杀伤的效应细胞，从而为抗体治疗、肿瘤治疗、干细胞治疗的研究提供重要基础，是我国血液系统肿瘤细胞治疗的新方向。

Description

一种表达人CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体
技术领域：
本发明涉及抗体基因工程技术领域，具体涉及一种表达人CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体及其构建方法。
背景技术：
淋巴T细胞是构成细胞免疫的主要成分，而利用基因工程使T细胞表达嵌合抗原受体能使T细胞转化成为具有特异性杀伤肿瘤细胞的效应细胞，是一种有前景的肿瘤免疫治疗策略。嵌合性抗原受体应用的关键是确定一种肿瘤相关抗原，这种抗原具有在肿瘤细胞表面过表达或高表达，而在正常组织无表达或低表达，CD19是表达于B淋巴细胞及滤泡树突状细胞的表面蛋白，属于免疫球蛋白(Ig)超家族成员，位于16号染色体短臂上(16p11.2)，编码556个氨基酸的Ⅰ型跨膜糖蛋白，分子量95KD。细胞外有N端及两个C2-Ig区，一个跨膜区，细胞内有C端及含9个酪氨酸残基的高度保守功能区。CD19在早期B细胞的发育中扮演重要的角色，所有的B细胞性急性白血病都表达CD19。CD20是一种磷酸化蛋白质分子，分子质量约为35kD，属于4次跨膜的蛋白质超家族。它表达于90％以上的B淋巴瘤细胞和正常B淋巴细胞，而在造血干细胞、原始B淋巴细胞、正常血细胞以及其他组织上不表达。因此，CD19和CD20可作为恶性淋巴细胞白血病免疫治疗的一种有效的靶抗原，构建靶向CD19和CD20嵌合抗原受体基因对于B细胞性恶性淋巴细胞白血病细胞免疫治疗具有重要的临床意义。
对于载体的选择，目前大多数基因治疗仍以病毒载体介导为主。目前，基因治疗的病毒载体有逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、单纯疱疹病毒和黄病毒等，但受到不能转导非分裂细胞、不能稳定整合到宿主基因组、诱导宿主的免疫反应和/或依赖于辅助病毒来产生感染等限制。逆转录病毒载体尚存在容量有限、不易制备且稳定性差、病毒滴度低、转基因效率不高等缺点，这大大限制了逆转录病毒的使用。
目前，已有4代慢病毒载体系统，其中：第一代系统主要特点是在构建包装质粒时最大限度的减少了个包装质粒之间的同源序列，不过保留了其辅助基因；第二代慢病毒载体在生物安全性上做了大量改进，包装结构基因质粒上进一步删去了编码辅蛋白Nef、Vif、Vpr的基因；第三代载体系统其安全性又进一步提高，它删除了病毒3′端LTR上的U3，而U3是病毒的启动子，删除后病毒基因组就不能复制，即使在发生病毒基因组与宿主基因组重组的情况下，病毒基因组也不能复制，因此只能转录整合目的基因，消除了产生活性病毒的可能性；第四代载体系统是利用分离基因的形式包装病毒，Clontech公司的Lenti-XHTPackaging System将pol序列分离出来，使gag、pol和env成为三个有区别的独立实体，与第三代包装系统相比，产生病毒颗粒多需要一种重组组分，使产生具有复制能力病毒的可能性降低了一个数量级，安全性更高，并且Lenti-X HT包装系统利用反式激活级联反应(Tet-Off技术)来高水平表达病毒蛋白质。但第四代载体系统因为应用四种质粒，所获的的慢病毒滴度不高。因此，亟需提供一种高效表达CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体表达系统，为抗体治疗、肿瘤治疗、干细胞治疗的研究提供重要基础。
发明内容：
针对现有技术存在的问题，本发明的目的旨在提供一种表达人CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体及其构建方法。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种表达人CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体，该慢病毒载体是由含有表达人CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒穿梭表达载体pLVX和辅助包装质粒来提供慢病毒所需的整合，逆转录酶和结构蛋白及外膜蛋白构建而成的。
上述表达人CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体的构建方法，包括以下步骤：
S1：CD19抗体轻链可变区(VH)和重链可变区(VL)cDNA的扩增或合成
1)从杂交瘤细胞株中克隆CD19抗体轻链可变区(VH)和重链可变区(VL)cDNA，即：
a.用人CD19蛋白免疫BALB/c小鼠；
b.制备鼠抗人CD19杂交瘤细胞；
c.筛选高亲和力的鼠抗人CD19杂交瘤细胞；
d.从鼠抗人CD19杂交瘤细胞中提取RNA；
e.反转录合成cDNA；
f.利用兼并引物扩增CD19抗体轻链可变区和重链可变区cDNA；
g.克隆CD19抗体轻链可变区和重链可变区cDNA并测定序列；
2)根据已发表CD19抗体轻链可变区和重链可变区cDNA序列合成基因；
3)CD19抗体轻链可变区和重链可变区cDNA的人源化优化；
S2：CD20抗体轻链可变区(VH)和重链可变区(VL)cDNA的扩增或合成
1)从杂交瘤细胞株中克隆CD20抗体轻链可变区(VH)和重链可变区(VL)cDNA；
a.制备鼠抗人CD20杂交瘤细胞；
b.从鼠抗人CD20杂交瘤细胞中提取RNA；
c.反转录合成cDNA；
d.利用兼并引物扩增CD20抗体轻链可变区和重链可变区cDNA；
e.克隆CD20抗体轻链可变区和重链可变区cDNA并测定序列；
2)根据已发表CD20抗体轻链可变区和重链可变区cDNA序列合成基因；
3)CD20抗体轻链可变区和重链可变区cDNA的人源化优化；
S3：铰链，CD8的穿膜区，4-1BB和CD3ζ的细胞质信号转导区cDNA合成；
S4：利用重叠拼接延伸长PCR方法将上述基因拼接起来；
S5：将拼接后的基因克隆至克隆载体并测序；
S6：将测序验证后的基因克隆至慢病毒穿梭表达载体pLVX；
S7：按照cGMP标准制备慢病毒穿梭表达质粒和辅助包装质粒。
本发明构建的表达人CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体可同时高效表达CD19和CD20嵌合抗原受体基因，治疗及预防因为CD19抗原丢失导致的复发，而CD20抗原不易因治疗或调控降低表达。
本发明构建的表达人CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体在3‘端具备自失活及缺失功能以确保其安全性，并可转化多种原代细胞及传代细胞系。
本发明构建的表达人CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体，其含有的CD19和CD20嵌合抗原受体基因可将人T细胞转化成对B细胞肿瘤具有特异性识别和杀伤的效应细胞，从而为抗体治疗、肿瘤治疗、干细胞治疗的研究提供重要基础，是我国血液系统肿瘤细胞治疗的新方向。
附图说明：
图1是本发明表达人CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体的构建示意图；
图2是本发明实施例中重叠拼接延伸长PCR方法拼接后的基因片段的示意图。
具体实施方式：
下面对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。
如图1所示，表达人CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体的构建方法，包括以下步骤：
S1：CD19抗体轻链可变区(VH)和重链可变区(VL)cDNA的扩增或合成
1)从杂交瘤细胞株中克隆CD19抗体轻链可变区(VH)和重链可变区(VL)cDNA，即：
a.用人CD19蛋白免疫BALB/c小鼠；
b.制备鼠抗人CD19杂交瘤细胞；
c.筛选高亲和力的鼠抗人CD19杂交瘤细胞；
d.从鼠抗人CD19杂交瘤细胞中提取RNA；
e.反转录合成cDNA；
f.利用兼并引物扩增CD19抗体轻链可变区和重链可变区cDNA；
g.克隆CD19抗体轻链可变区和重链可变区cDNA并测定序列；
2)根据已发表CD19抗体轻链可变区和重链可变区cDNA序列合成基因；
3)CD19抗体轻链可变区和重链可变区cDNA的人源化优化；
S2：CD20抗体轻链可变区(VH)和重链可变区(VL)cDNA的扩增或合成
1)从杂交瘤细胞株中克隆CD20抗体轻链可变区(VH)和重链可变区(VL)cDNA；
a.制备鼠抗人CD20杂交瘤细胞；
b.从鼠抗人CD20杂交瘤细胞中提取RNA；
c.反转录合成cDNA；
d.利用兼并引物扩增CD20抗体轻链可变区和重链可变区cDNA；
e.克隆CD20抗体轻链可变区和重链可变区cDNA并测定序列；
2)根据已发表CD20抗体轻链可变区和重链可变区cDNA序列合成基因；
3)CD20抗体轻链可变区和重链可变区cDNA的人源化优化；
S3：铰链，CD8的穿膜区，4-1BB和CD3ζ的细胞质信号转导区cDNA合成；
S4：利用重叠拼接延伸长PCR方法将上述基因拼接起来，所拼接的基因片段如图2所示；
S5：将拼接后的基因克隆至克隆载体并测序；
S6：将测序验证后的基因克隆至慢病毒穿梭表达载体pLVX；
S7：按照cGMP标准制备慢病毒穿梭表达质粒和辅助包装质粒。
上述构建的表达人CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体可同时高效表达CD19和CD20嵌合抗原受体基因，因此，治疗及预防因CD19抗原丢失导致的复发和CD20抗原不易因治疗或调控降低表达。同时，为确保其安全性，该慢病毒载体在3‘端具备自失活及缺失功能，能够转化多种原代细胞及传代细胞系，将人T细胞转化成对B细胞肿瘤具有特异性识别和杀伤的效应细胞，为抗体治疗、肿瘤治疗、干细胞治疗的研究提供了重要基础。

Claims (5)

1.一种表达人CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体，其特征在于：所述慢病毒载体是由含有表达人CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒穿梭表达载体pLVX和辅助包装质粒来提供慢病毒所需的整合，逆转录酶和结构蛋白及外膜蛋白构建而成的。
2.根据权利要求1所述的表达人CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1：CD19抗体轻链可变区(VH)和重链可变区(VL)cDNA的扩增或合成
1)从杂交瘤细胞株中克隆CD19抗体轻链可变区(VH)和重链可变区(VL)cDNA，即：
a.用人CD19蛋白免疫BALB/c小鼠；
b.制备鼠抗人CD19杂交瘤细胞；
c.筛选高亲和力的鼠抗人CD19杂交瘤细胞；
d.从鼠抗人CD19杂交瘤细胞中提取RNA；
e.反转录合成cDNA；
f.利用兼并引物扩增CD19抗体轻链可变区和重链可变区cDNA；
g.克隆CD19抗体轻链可变区和重链可变区cDNA并测定序列；
2)根据已发表CD19抗体轻链可变区和重链可变区cDNA序列合成基因；
3)CD19抗体轻链可变区和重链可变区cDNA的人源化优化；
S2：CD20抗体轻链可变区(VH)和重链可变区(VL)cDNA的扩增或合成
1)从杂交瘤细胞株中克隆CD20抗体轻链可变区(VH)和重链可变区(VL)cDNA；
a.制备鼠抗人CD20杂交瘤细胞；
b.从鼠抗人CD20杂交瘤细胞中提取RNA；
c.反转录合成cDNA；
d.利用兼并引物扩增CD20抗体轻链可变区和重链可变区cDNA；
e.克隆CD20抗体轻链可变区和重链可变区cDNA并测定序列；
2)根据已发表CD20抗体轻链可变区和重链可变区cDNA序列合成基因；
3)CD20抗体轻链可变区和重链可变区cDNA的人源化优化；
S3：铰链，CD8的穿膜区，4-1BB和CD3ζ的细胞质信号转导区cDNA合成；
S4：利用重叠拼接延伸长PCR方法将上述基因拼接起来；
S5：将拼接后的基因克隆至克隆载体并测序；
S6：将测序验证后的基因克隆至慢病毒穿梭表达载体pLVX；
S7：按照cGMP标准制备慢病毒穿梭表达质粒和辅助包装质粒。
3.根据权利要求1或2所述的表达人CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体，其特征在于：所述表达人CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体能够同时高效表达CD19和CD20嵌合抗原受体基因。
4.根据权利要求3所述的表达人CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体，其特征在于：所述表达人CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体在3‘端具备自失活及缺失功能，以确保其安全性。
5.根据权利要求3所述的表达人CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体，其特征在于：所述表达人CD19和CD20嵌合抗原受体基因的慢病毒载体能够转化多种原代细胞及传代细胞系。
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