CN111850013B

CN111850013B - 一种共刺激受体增效的嵌合抗原受体及其应用

Info

Publication number: CN111850013B
Application number: CN201910555126.8A
Authority: CN
Inventors: 朱建高; 杨文君
Original assignee: Zhejiang Compvss Biotechnology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Compvss Biotechnology Co ltd
Priority date: 2019-06-25
Filing date: 2019-06-25
Publication date: 2021-05-18
Anticipated expiration: 2039-06-25
Also published as: CN111850013A

Abstract

本发明涉及嵌合抗原受体领域，公开了一种共刺激受体增效的嵌合抗原受体及其应用，具体地，本发明公开了一种多核苷酸序列，选自：（1）：含有依次连接的抗BCMA单链抗体的编码序列、人CD8铰链跨膜区的编码序列、人4‑1BB胞内区的编码序列、人CD3ζ胞内区的编码序列、人P2A肽的编码序列和人CD27全长的编码序列，和（2）：（1）中多核苷酸序列的互补序列。本发明还公开了相关的融合蛋白、核酸构建物、逆转录病毒和基因修饰的T细胞，以及上述物质在制备治疗BCMA介导的疾病的药物中的用途。

Description

一种共刺激受体增效的嵌合抗原受体及其应用

技术领域

本发明涉及嵌合抗原受体领域，尤其涉及一种包含BCMA-CAR并且表达共刺激受体CD27的嵌合抗原受体及其用途。

背景技术

多发性骨髓瘤（MM）是一种恶性浆细胞疾病，表现为骨髓浆细胞恶性克隆性增生，分泌单克隆免疫球蛋白或其片段（M蛋白），导致骨骼、肾脏等相关靶器官或组织损伤，常见临床表现为骨痛、贫血、肾功能不全、感染等。多发性骨髓瘤为血液系统第二大恶性肿瘤，占血液系统恶性肿瘤的10％，多发病于男性，其发病率随着年龄的增长逐年增高，近几年更是有年轻化的趋势。目前，多发性骨髓瘤的常见治疗类似于其他癌症的疗法，诸如化学疗法或放射疗法、干细胞移植或骨髓移植、靶向疗法或生物疗法。虽然目前的多发性骨髓瘤疗法通常会产生缓解，但是几乎所有患者最终都会复发。需要用于治疗多发性骨髓瘤的有效免疫治疗剂。

随着T淋巴细胞肿瘤免疫应答机制的研究日益受到重视，嵌合抗原受体T（CAR-T）细胞治疗正在成为肿瘤免疫治疗领域的一个新的免疫治疗策略。由于T细胞对靶细胞的识别特异性依赖于T淋巴细胞受体（T Cell Receptor, TCR），因此将针对肿瘤细胞相关抗原的单链抗体片段（scFv）与T淋巴细胞受体的 CD3ζ 或 FcεRIγ 等胞内信号激活基序融合成嵌合抗原受体（Chimeric antigen receptor，CAR），并将其通过如逆转录病毒感染等方式基因修饰在T 淋巴细胞表面，这种CAR-T淋巴细胞能够以主要组织相容性复合物（MajorHistocompatibility Complex, MHC）非限制性方式选择性地将T淋巴细胞定向到肿瘤细胞并特异性地杀伤肿瘤。

B细胞成熟抗原（B-cell maturation antigen，BCMA）是一种表达于成熟B细胞和浆细胞表面的特征性分子。研究表明，BCMA在维持浆细胞的存活中起了重要的作用，同时也对骨髓瘤细胞的恶性增生起了重要的促进作用。BCMA普遍表达于多发性骨髓瘤细胞系，而在成熟B细胞、浆细胞之外的正常人体组织无表达，且在CD34+造血细胞中也无表达。

由于BCMA表达特征与CD19的高度相似性，以及抗CD19 CAR-T细胞治疗的成功进展，提示我们BCMA可以作为CAR-T细胞的靶点之一用于多发性骨髓瘤的细胞免疫治疗。目前，以BCMA作为靶点的CAR-T细胞治疗临床研究在世界各地陆续开展，部分已取得较为积极的治疗效果。但是在现有的技术水平下，包括靶向BCMA在内的很多在研的CAR-T疗法，其安全性仍有待提高。另外，CAR-T细胞在体内的增殖能力较差，对肿瘤细胞的杀伤效率较低也会客观上加大CAR-T细胞的使用剂量，容易造成较强的毒副作用，如炎症因子风暴和中枢神经系统毒性。因此，仍然迫切需要对CAR的设计进行改造，进一步提高CAR-T疗法的安全性和有效性。

CAR-T细胞介导的免疫反应是其清除肿瘤细胞的主要手段。在正常的免疫反应中，抗原特异性T细胞需要至少两个信号的刺激才能进行增殖并对抗原产生免疫应答。第一信号，抗原结合的T细胞受体（TCR），和CD3胞内免疫受体酪氨酸激活基序（ITAM）转导信号（CD3ζ）；第二信号，协同刺激信号，由T细胞与抗原提呈细胞(APC)或其它细胞表面的共刺激分子对所介导，包括CD28、CD137、CD134和CD27等表面受体。CAR-T设计考虑到了T细胞激活的免疫学特性，CAR的结构包含胞外结合区，跨膜区和胞内信号区。通常胞外区包含能够识别肿瘤相关抗原的scFv，跨膜区采用CD8、CD28等分子的跨膜区，胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序（ITAM） CD3ζ及共刺激信号分子 CD28、CD137、CD134等的胞内信号区。

胞内信号区仅包含ITAM的为第一代CAR-T淋巴细胞，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-ITAM。该种CAR-T可以激发抗肿瘤的细胞毒性效应，但是缺少足够的第二信号刺激，并且在体内不能激发持久的抗肿瘤效应。

随后发展的第二代CAR-T淋巴细胞加入了CD28或CD137（又名4-1BB）的胞内信号区，其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-ITAM或scFv-TM-CD137-ITAM。胞内信号区发生的B7/CD28或4-1BBL/CD137共刺激作用能够引起T淋巴细胞的持续增殖，从而提高T细胞的细胞毒性、增殖活性，维持T细胞应答，延长T细胞存活时间等。第二代CAR在随后的临床试验中产生了意想不到的效果，从2010年起基于第二代CAR的临床报道屡次引发震动，特别是对于复发性、难治性的急性淋巴细胞白血病（ALL）病人，其完全缓解率高达90％以上。

第三代CAR-T淋巴细胞，则是同时将两种不同的胞内信号域串联表达，使细胞因子持续分泌，T细胞杀伤肿瘤细胞的能力显著增强，意在进一步提高了CAR-T在体内的存活周期和其抗肿瘤效果。例如，最典型的就是宾夕法尼亚大学的Carl June在CD28胞内共刺激信号域后面串联表达CD137（4-1BB）或CD134（OX40）的共刺激信号域。其中嵌合抗原受体各部分按如下形式连接：scFv-TM-CD28-CD137-ITAM或 scFv-TM-CD28-CD134-ITAM。

第四代的CAR-T淋巴细胞则是在第二代的基础上加入了细胞因子或共刺激配体，例如四代CAR可以产生IL-12，其能够调节免疫微环境-增加T细胞的激活，同时激活固有免疫细胞使其发挥作用来清除靶抗原阴性的癌细胞，从而达到双向调节的作用。

人CD27是由二硫键连接的相对分子量为55000 Da的单体组成的二聚体跨膜糖蛋白，是肿瘤坏死因子TNF超家族的重要成员。和CD28、CD137、CD134等共刺激信号不同，CD27通路对于T细胞的激活，增殖和凋亡发挥不同的调节功能。CD27广泛表达于原始T细胞和记忆T细胞表面。CD27主要通过与其配体CD70结合，激活下游的TRAF2和TRAF5信号通路，进一步诱导NF-κB和JNK信号通路的激活。研究表明，CD27-CD70所介导的信号通路对于促进抗原刺激后T细胞向效应T细胞和记忆T细胞的分化至关重要。CD27基因剔除会阻碍效应T细胞和记忆T细胞的形成。记忆T细胞由原始T细胞分化而来，对于细胞应对抗原的二次应答具有重要作用。在抗原刺激下，记忆T细胞可进一步分化为中央记忆T细胞，后者往往浸润淋巴结并长期存活于体内，可起到免疫监视作用。在CD27-CD70信号通路持续激活的情况下，小鼠体内的T细胞反应以及对肿瘤细胞的杀伤能力均显著增强。而在肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中，CD27⁺CD8⁺ T细胞的比例越高，肿瘤治疗的效果越好。

发明内容

为了进一步提高CAR-T对多发性骨髓瘤细胞的杀伤效率，本发明提供了一种包含BCMA-CAR-CD27序列的嵌合抗原受体及其用途。本发明在靶向BCMA的CAR设计基础上进行改进，在BCMA-CAR的C末端增加基因优化的人全长CD27基因片段。较仅表达BCMA-CAR的CAR-T细胞相比，表达BCMA-CAR-CD27的CAR-T细胞具有更强的肿瘤杀伤能力。

在细胞免疫应答过程中，作为第二信号的共刺激受体的表达对于T细胞的激活尤为关键。根据已有研究和过往经验，CAR设计对于共刺激受体的选择更倾向于使用CD28、4-1BB或是OX40的胞内信号结构域。仅使用共刺激受体的信号结构域而不使用全长序列的主要原因，一方面是受到CAR整体长度的限制，另一方面是将共刺激信号域与ITAM信号域串联表达更有利于第二信号的持续激活。然而，随后的研究表明，持续激活某些共刺激配体，例如CD28，更容易引起T细胞耗竭，影响CAR-T细胞治疗效果。事实上，T细胞接收共刺激信号的类型以及时间节点对于T细胞是否完全激活非常关键。例如，CD27和CD28都在原始T细胞中高表达，而终末分化的T细胞中表达较低，说明二者可能在T细胞反应的早期发挥重要功能。相反，其他共刺激受体，如CD137、CD134等在已激活的T细胞中高表达，它们对于抵抗凋亡引起的T细胞耗竭具有重要作用。强行激活其中任何一种共刺激信号都不能完全替代其他共刺激信号的功能。基于这样的理念，有研究将两种或以上的共刺激受体的胞内信号域串联使用，也就是第三代CAR的设计原理。但是，最近的研究结果显示，第三代CAR的抗肿瘤效果未能达到预期，甚至不如第二代CAR，其原因可能由于多个共刺激信号域的串联表达造成多种信号通路相互冲突，不能有效实现信号传递。

申请人经过大量的前期研究发现，在CAR设计中将两种共刺激信号解除偶联，使其在抗原存在的情况下分别激活，可以显著增强CAR-T细胞的应答水平。具体实现方式是通过将人全长CD27基因序列嫁接到CAR的C末端，并用P2A肽分隔；表达含有4-1BB共刺激结构域的CAR序列的同时表达全长CD27，在细胞内蛋白酶的作用下切割P2A肽，释放游离的CD27；游离的CD27被转运到细胞表面，在这里接触CD70等配体，实现CD27信号通路的激活。该设计的最大特色是实现4-1BB和CD27两种共刺激信号通路的非偶联式激活。

本发明的具体技术方案为：

第一，本发明公开了一种多核苷酸序列，所述多核苷酸序列选自：

（1）：含有依次连接的抗BCMA单链抗体的编码序列，人CD8铰链跨膜区的编码序列，人4-1BB胞内区的编码序列，人CD3ζ胞内区的编码序列、P2A肽的编码序列和人CD27全长的编码序列，和

（2）：（1）中多核苷酸序列的互补序列。

作为优选，所述人CD27全长的编码序列为经过基因优化的人CD27全长cDNA序列，称为oCD27。进一步优选地，所述oCD27的编码序列如SEQ ID NO:1 第1555-2337位多核苷酸所示或其同源性至少80%且具有相似或相近生物学活性的多核苷酸序列。

作为优选，所述多核苷酸序列在所述抗BCMA单链抗体的编码序列前还含有信号肽的编码序列，优选地，所述信号肽的编码多核苷酸序列如SEQ ID NO:1第1-63位多核苷酸所示。

作为优选，所述抗BCMA单链抗体的编码序列如SEQ ID NO:1第64-792位多核苷酸所示。

作为优选，所述人CD8铰链跨膜区的编码序列如SEQ ID NO:1 第793-999位多核苷酸所示。

作为优选，所述人4-1BB胞内区的编码序列如SEQ ID NO:1 第1000-1140位多核苷酸所示。

作为优选，所述人CD3ζ胞内区的编码序列如SEQ ID NO:1 第1141-1476位多核苷酸所示。

作为优选，所述P2A肽的编码序列如SEQ ID NO:1第1477-1554位核苷酸序列所示。

第二，本发明公开了一种融合蛋白，所述融合蛋白选自：

（1）：含有依次连接的抗BCMA单链抗体、人CD8α铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、P2A肽和人CD27的融合蛋白；和

（2）：在（1）限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且相似或相近生物学活性的由（1）衍生的融合蛋白。

作为优选，所述融合蛋白在所述抗BCMA单链抗体的编码序列N端还含有信号肽。进一步优选地，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第1-21位氨基酸所示或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列。

作为优选，所述抗BCMA单链抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第22-264位氨基酸所示或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列。

作为优选，所述人CD8铰链跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 第265-333位氨基酸所示或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列。

作为优选，所述人4-1BB胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 第334-380位氨基酸所示或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列。

作为优选，所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 第381-492位氨基酸所示或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列。

作为优选，所述P2A肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第493-518位核苷酸序列所示或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸。

作为优选，所述人CD27的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 第519-778位氨基酸所示或与其具有相似或相近生物学活性的氨基酸序列。

第三，本发明公开了一种核酸构建物，所述核酸构建物含有前文所述的多核苷酸序列，或其他能够编码前文所述融合蛋白的多核苷酸序列。作为优选，所述核酸构建物为载体。进一步优选地，所述核酸构建物为逆转录病毒载体，含有复制起始位点，3’ LTR，5’LTR，前文所述的多核苷酸序列，以及任选的可选择的标记。

第四，本发明公开了一种逆转录病毒，所述逆转录病毒含有前文所述的核酸构建物，优选含有所述载体，更优选含有所述逆转录病毒载体。

第五，本发明公开了一种逆转录病毒的转导方法，所述转导方法包括小规模包装前文所述的逆转录病毒的方法、筛选和建立产毒细胞株的方法，以及用产毒细胞株上清大规模转导T细胞的方法。

第六，本发明公开了一种基因修饰的T细胞，所述细胞含有前文所述的多核苷酸序列，或含有前文所述的核酸构建物，或感染了前文所述的逆转录病毒，或稳定表达前文所述的融合蛋白。

第七，本发明公开了前本所述的基因修饰的T细胞在制备治疗BCMA介导的疾病的药物中的用途。

作为优选，所述BCMA介导的疾病为多发性骨髓瘤。

与现有技术对比，本发明的有益效果是：

本发明采用抗BCMA单链抗体的基因序列，并从NCBI GenBank数据库中搜索到人的CD8铰链跨膜区、人的4-1BB胞内区、人的CD3ζ胞内区、P2A肽和人CD27基因cDNA全长序列（nCD27）信息。nCD27序列经过基因优化得到在人T细胞中表达效率最高的CD27全长序列（oCD27）。

本发明通过全基因合成嵌合抗原受体抗BCMA scFv-CD8铰链跨膜区-4-1BB-CD3ζ-oCD27的基因片段，插入到逆转录病毒载体中。重组质粒在ECO细胞中包装病毒，感染T细胞，使T细胞表达该嵌合抗原受体。本发明用嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞的转导方法是基于逆转录病毒转导方法，通过筛选稳定的产毒株，收集产毒株上清进行T细胞转导。该方法具有转导效率高，外源基因能够稳定表达，批次稳定性高且可以缩短体外培养T淋巴细胞到达临床级数量的时间等优点。转导的核酸通过转录、翻译表达在CAR-T细胞表面。用流式细胞术，通过检测与抗BCMA单链抗体κ链结合的protein L的含量，可以计算出逆转录病毒感染的T淋巴细胞的比例和细胞表面CAR的表达情况。本发明通过逆转录病毒转导T淋巴细胞，得到CAR阳性T淋巴细胞的比例高达80%。通过流式细胞术检测发现，CAR-T细胞高表达CD27，说明逆转录病毒载体成功转导至T细胞并在细胞表面表达CD27。CAR-T细胞对特异性肿瘤细胞的杀伤功能可以通过乳酸脱氢酶（LDH）细胞毒性检测实验进行检测。本发明制备的CAR-T细胞对BCMA阳性的肿瘤细胞具强烈的杀伤功能，在效靶比是3比1的情况下，杀伤效率超过80％。

本发明首次以非偶联的方式在CAR之外激活CD27信号通路。动物体内的研究结果证明，BCMA-CAR-CD27设计显著提高了CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效率。因此，本发明增强了CAR-T细胞在BCMA介导的多发性骨髓瘤中的应用效果。

附图说明

图1为BCMA-CAR-CD27全长序列示意图；ScFv：单链抗体可变区；Hinge：CD8铰链区；TM：CD8跨膜区。

图2为流式细胞术分析显示逆转录病毒感染T细胞3天后CD4⁺亚群和CD8⁺亚群的CAR-T细胞，表面结合Protein L的阳性率，即BCMA-CAR的表达效率。

图3为流式细胞术分析显示逆转录病毒感染后，B&CD27 T，Control T和BCMA T细胞表面CD27的表达水平。MFI，平均荧光强度。

图4 为使用CAR-T细胞和靶细胞按照不同效靶比共培养后，用LDH法检测靶细胞裂解率。

图5 为肿瘤移植模型中，尾静脉注射CAR-T细胞后，D-luciferin钠盐成像，观察小鼠体内的肿瘤细胞残留情况。A，主要实验流程；B，统计不同时间点各组别小鼠体内的荧光素强度；C，图片显示各组别小鼠钠盐成像结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述。

本发明提供一种包含靶向BCMA的嵌合抗原受体（CAR）的融合蛋白。该融合蛋白含有依次连接的抗BCMA单链抗体、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、P2A肽和人CD27全长的片段。

本发明包括编码本发明融合蛋白的多核苷酸序列。本发明的多核苷酸序列可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

适用于本发明的人CD27全长片段的编码序列为经过基因优化的人CD27基因cDNA全长序列。应理解，基因优化又称为密码子优化，是指在不改变蛋白质氨基酸序列的情况下，通过替换编码某种蛋白质的多核苷酸序列中的一个或多个核苷酸，达到提高蛋白质在特定种属细胞中的表达水平和表达效率的目的。基因优化包括但不限于密码子偏好性优化、RNA高级结构优化、酶切位点优化和GC含量调整等方法。本发明包括运用上述基因优化方法得到的各种编码人CD27的多核苷酸序列，称为oCD27。这些多核苷酸序列的共同特征是采用不同的核苷酸密码子，但是编码的氨基酸序列与野生型人CD27氨基酸序列相同。可采用例如NCBI的BLAST和BLASTp计算两条比对的多核苷酸序列之间和氨基酸序列之间的序列相同性。作为示范性例子，本发明中oCD27的编码序列如SEQ ID NO:1第1555-2337位多核苷酸所示。

适用于本发明的抗BCMA单链抗体可衍生自本领域周知的各种抗BCMA单克隆抗体。单链抗体的基本结构包含轻链可变区、接头序列和重链可变区。优选地，轻链可变区为κ链类型。作为示范性例子，本发明中抗BCMA单链抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第22-132位氨基酸所示。作为示范性例子，本发明中抗BCMA单链抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第148-264位氨基酸所示。单链抗体的轻链可变区和重链可变区之间由接头序列连接。接头序列可以是本领域周知的适用于抗体的接头序列，例如含G和S的接头序列。通常，接头含有一个或多个前后重复的基序。优选地，基序可以是GGGS、GGGGS、SSSSG、GSGSA和GGSGG，接头包含1~5个重复基序，相邻重复基序之间没有插入氨基酸残基。作为示范性例子，本发明抗BCMA单链抗体的轻链可变区和重链可变区之间由（GGGGS）3连接，接头序列的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第133-147位氨基酸所示。

适用于本发明的人CD8铰链跨膜区可以是本领域常用于CAR的各种人CD8铰链跨膜区序列。作为示范性例子，本发明中人CD8α铰链跨膜区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第265-333位氨基酸所示。

适用于本发明的人4-1BB胞内区可以是本领域已知的各种用于CAR的人4-1BB胞内区。作为示范性例子，本发明使用的人4-1BB胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第334-380位所示。

适用于本发明的人CD3ζ胞内区可以是本领域常规用于CAR的各种人CD3ζ胞内区。作为示范性例子，所述人CD3ζ胞内区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第381-492位氨基酸所示。

适用于本发明的P2A肽可以是本领域常规用于CAR的各种自剪切序列。作为示范性例子，所述P2A肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2第493-518位氨基酸所示。

本发明也包括SEQ ID NO:2第22-492位氨基酸序列所示的CAR、SEQ ID NO:2第22-778位氨基酸序列所示的CAR、SEQ ID NO:2第1-492位氨基酸序列所示的CAR或SEQ ID NO:2所示的CAR的突变体。这些突变体包括：与该CAR具有至少80％，优选至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少97％的序列相同性并保留该CAR的生物学活性(如活化T细胞)的氨基酸序列。可采用例如NCBI的BLASTp计算两条比对的序列之间的序列相同性。

突变体还包括：在SEQ ID NO:2第22-492位所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:2第22-913位所示的氨基酸序列、SEQ ID NO:2第1-492位所示的氨基酸序列或SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列中具有一个或数个突变(插入、缺失或取代)、同时仍保留该CAR的生物学活性的氨基酸序列。所述数个突变通常指1－10个以内，例如1－8个、1－5个或1－3个。取代优选是保守性取代。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行保守性取代时，通常不会改变蛋白质或多肽的功能。“性能相近或相似的氨基酸”包括例如，具有相似侧链的氨基酸残基的家族，这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在本发明多肽中用来自同一侧链类的另一氨基酸残基替换一个或几个位点，将不会在实质上影响其活性。

本发明采用抗BCMA单链抗体（具体是衍生自克隆号C11D5.3的scFV）的基因序列，并从NCBI GenBank数据库中搜索到人的CD8铰链跨膜区、人的4-1BB胞内区、人的CD3ζ胞内区、P2A肽和人CD27基因cDNA全长序列（nCD27）信息。nCD27序列经过基因优化得到在人T细胞中表达效率最高的CD27全长序列（oCD27）。

本发明通过在BCMA-CAR多核苷酸序列的C末端增加基因优化的人CD27全长编码序列，得到BCMA-CAR-CD27多核苷酸序列。较BCMA-CAR-T细胞相比，表达BCMA-CAR-CD27的CAR-T细胞在动物体内具有更强的肿瘤杀伤能力。

本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地进行描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。实施例中所用的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。

实施例1：BCMA-CAR-CD27基因序列的确定和逆转录病毒载体的构建

从NCBI网站数据库搜索到人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区和人CD27全长cDNA序列信息。野生型人CD27基因cDNA全长序列称为nCD27。将nCD27序列在网站http://sg .idtdna .com/site上进行密码子优化得到oCD27，保证在编码氨基酸序列不变的情况下更适合人类细胞表达。oCD27的多核苷酸序列如SEQ ID NO.1第1555-2337位多核苷酸所示。

按照BCMA scFv、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、P2A肽、oCD27的顺序得到BCMA-CAR-CD27全长多核苷酸序列。同时构建仅包含BCMA scFv、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区的BCMA-CAR全长多核苷酸序列。BCMA-CAR-CD27全长多核苷酸序列和氨基酸序列信息见核苷酸序列表（SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2）。BCMA-CAR全长多核苷酸序列如SEQ ID NO:1第1-1476位多核苷酸所示。以上全部多核苷酸在擎科生物科技有限公司合成，克隆在pUC57载体上，并再次测序确定。

用NotI（NEB）和EcoRI（NEB）双酶切CAR-CD27的核苷酸序列，经T4连接酶（NEB）连接后，插入逆转录病毒载体（MP71）的NotI-EcoRI位点，转化到感受态大肠杆菌（DH5α）。

使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，得到的BCMA-CAR-CD27质粒可进行逆转录病毒包装实验。

按照上述同样方法将BCMA-CAR序列插入逆转录病毒载体，构建得到包含BCMA-CAR序列的逆转录病毒载体。提取质粒进行逆转录病毒包装。

本实施例所构建得到的质粒图谱如图1所示。

实施例2：逆转录病毒包装和产毒株的建立

使用实施例1制备得到的包含BCMA-CAR和BCMA-CAR-CD27的逆转录病毒载体，按照以下方法分别包装得到两种逆转录病毒：

1. 第1天：Phoenix Ecotropic（ECO）细胞应是小于20代，不过分长满的。以0.6×10⁶/ml细胞密度铺板，10cm皿添加10ml的DMEM培养基，充分混匀细胞，37℃培养过夜；

2. 第2天：ECO细胞融合度达到90％左右进行转染（通常是铺板14-18h左右）；准备质粒MP71-目的基因 12.5μg，1.25M CaCl₂ 250μl，H₂O 1ml，总体积为1.25ml；在另一个管里添加跟质粒复合物等体积的2× HBS，边加质粒复合物边涡旋震荡20s。温柔地将混合物沿着边加入到ECO皿中，37℃培养4h，去除培养基，PBS洗一遍，重新加入预热的新鲜培养基。

3. 第4天：转染48h后收集上清并用0.45um滤器过滤后，即得到逆转录病毒溶液，分装保存于-80℃。

4. 产毒株的建立：从上得到的逆转录病毒再感染HY268细胞，感染两天后进行流式细胞分选，筛选分泌逆病毒滴度最高的单细胞来源的细胞株并长期保存。利用此细胞株可以大规模制备逆转录病毒上清用于基因转导制备CAR-T细胞。

实施例3：逆转录病毒感染人的T细胞

1. 复苏冻存的健康人外周血PBMC，用含10% FBS的RPMI-1640完全培养基调整细胞密度为1-2×10⁶/ml。

2. Ficoll分离液（天津灏洋）收集PBMC，磁珠法分离获得较纯的CD3⁺T细胞，按磁珠:CD3⁺细胞比为3:1加入临床级Dynabeads Human T Expander CD3/CD28磁珠（Invitrogen）活化T细胞。

3. T细胞活化后第二天，用PBS稀释至终浓度为15μg/ml的Retronectin （Takara）包被非组织处理培养板，6孔板每孔1.2 ml。避光，4℃过夜备用。

4. T细胞活化培养两天后，取出包被好的6孔板，吸弃包被液，加入PBS洗板一次。

5. 实施例2制备的逆转录病毒液加入孔内，每孔加5-6ml，32℃，2000×g，离心2h。每孔加入含hIL-2（500 U/ml）的新鲜完全培养基3 ml，继续培养1天。

6. 细胞感染后，每天观察细胞的密度，适时补加含IL-2 100 U/ml的T细胞培养液，使T细胞的密度维持在5×10⁵/ml左右，便于细胞扩增。

7.由此获得感染了实施例2制备的逆转录病毒的CAR-T细胞，分别命名为B&CD27 T细胞（表达实施例1的BCMA-CAR-CD27）和BCMA T细胞（表达实例1的BCMA-CAR）。

8 设置不感染病毒的对照组，用等体积PBS溶液替代逆转录病毒液，按照上述同样的方法得到Control T细胞。

实施例4：流式细胞仪检测感染后T淋巴细胞的比例及表面CAR蛋白和CD27蛋白的表达

由于抗BCMA单链抗体的轻链是κ链能结合Protein L，因此我们用FACS方法通过检测与CAR-T细胞结合的生物素标记的Protein L来说明CAR阳性T淋巴细胞的比例和CAR蛋白的表达。

分别离心收集感染后72小时的实施例3制备得到的两种CAR-T细胞和NT细胞（对照组），1%BSA-PBS洗涤1次后弃上清，加入生物素（biotin）标记的protein L抗体避光30min后1%BSA-PBS洗涤，重悬；再加入PE标记的亲和素（Streptavidin），避光10min后1%BSA-PBS洗涤，重悬；最后流式细胞仪检测PE的荧光强度。

图2显示，使用实施例3制备得到的逆转录病毒感染T细胞3天后，CD4⁺T细胞和CD8⁺T细胞中Protein L（CAR）的阳性率均达到80％。

分别离心收集感染后72小时的实施例3制备得到的两种CAR-T细胞和Control T细胞（对照组），用流式细胞术检测几种细胞表面CD27的表达水平。

图3显示，B&CD27 T细胞中的CD27表达水平显著高于Control T和BCMA T细胞。该结果确证CD27确实在CAR-T细胞表面表达。

实施例5：乳酸脱氢酶（LDH）法检测肿瘤特异性细胞杀伤作用

1. 调整靶细胞（RPMI-8226）浓度为4×10⁵个/mL，取靶细胞和效应细胞（效靶比分别为3:1, 1:1, 1:3）各50μl，加入U型96孔培养板中。效应细胞分别是Control T细胞，BCMAT细胞和B&CD27 T细胞。另外，设置靶细胞自然释放孔、效应细胞自然释放孔和靶细胞最大释放孔，加靶细胞和培养液各50μl。上述各项均设三个复孔。

2. 上述细胞在37℃、5% CO₂培养箱中培养4 h。

3. 终止细胞培养前45 min, 靶细胞最大释放孔加裂解液10μl。

4. 96孔板以1500 rpm/min离心5 min，每孔吸取上清50μl置平底96孔培养板中，同时加入LDH底物50μl，室温避光反应30 min。

5. 每孔加入50μl 1mol/L的醋酸溶液终止，在酶标仪490 nm处测定光密度值（A490），使用630 nm波长作为参考波长进行双波长测定。

% 细胞毒性率=（实验组–效应细胞自放组–靶细胞自放组）×100/（靶细胞最大释放组–靶细胞自放组）

图4显示，使用B&CD27 T细胞和靶细胞RPMI-8226按照不同效靶比3:1, 1:1, 1:3共培养后，用LDH法检测靶细胞裂解率。结果表明，在效靶比3比1时，细胞裂解率达到80%以上；效靶比1比3时，细胞裂解率仍有20%左右。

实施例6：肿瘤移植模型检测CAR-T细胞在动物体内的肿瘤杀伤作用

1. B-NDG重度联合免疫缺陷小鼠（百奥赛图）的尾静脉接种带有荧光素标记的人淋巴瘤细胞Daudi-Luc。接种量为2×10⁶/0.3ml。随机分为4个实验组，分别是无CAR-T细胞对照组，非靶向BCMA的CAR-T对照组（Exb T），BCMA T细胞对照组，和B&CD27 T细胞组，每组各6只小鼠。

2. 接种肿瘤细胞5天后，在小鼠尾静脉分别注射不同类型的CAR-T细胞（无CAR-T细胞对照组注射生理盐水），注射的CAR-T细胞量为5×10⁶ CAR⁺T/0.2 ml。

3. 分别在注射CAR-T细胞7天、14天和21天后，在小鼠腹腔注射3mg的D-luciferin进行钠盐成像。观察小鼠体内残留肿瘤细胞的数量，统计荧光素强度（光子密度）。

图5显示，与BCMA-CAR-T对照组相比，注射B&CD27 T的小鼠体内的人淋巴瘤细胞残留明显减少。说明B&CD27 T细胞杀伤肿瘤的效果更好。

本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

序列表

<110> 浙江康佰裕生物科技有限公司

<120> 一种共刺激受体增效的嵌合抗原受体及其应用

<130> 2019

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2337

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atggctctgc ctgtgaccgc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca cgccgctcgg 60

cctgacatcg ttttgacaca atctcctgcg tcattggcca tgagtctcgg gaagcgcgca 120

acaatatcct gtcgcgccag tgaatctgtg tctgtgatag gagcgcactt gatccattgg 180

tatcagcaga aacctggaca acctcccaag ctgctcatct acctcgccag taaccttgaa 240

acaggagtac ctgctcggtt ttcaggttcc gggtcaggga cggatttcac tttgactatc 300

gacccagttg aggaagacga cgtagccata tatagctgcc tgcagtctcg gatcttcccg 360

cgcacgttcg ggggaggaac taagctggag attaagggcg gcgggggttc tggtggcggc 420

ggcagcggcg gtggaggatc acaaatccaa ctggttcagt ccggtccaga actgaaaaag 480

ccgggggaga cggtgaaaat ctcctgtaag gcctcaggtt ataccttcac cgattacagc 540

atcaattggg taaagcgggc tccagggaaa ggtctgaaat ggatgggttg gatcaacaca 600

gaaacccgag aaccagccta tgcttacgac tttcgaggtc gattcgcttt ttccttggaa 660

acttccgcaa gcacagccta tctgcaaatc aacaatctca agtacgaaga tacggccacg 720

tatttttgtg ccctggatta cagctatgca atggattact ggggtcaggg gacgtctgtt 780

acagtttcta gtactacaac tccagcaccc agacccccta cacctgctcc aactatcgca 840

agtcagcccc tgtcactgcg ccctgaagcc tgtcgccctg ctgccggggg agctgtgcat 900

actcggggac tggactttgc ctgtgatatc tacatctggg cgcccttggc cgggacttgt 960

ggggtccttc tcctgtcact ggttatcacc ctttactgca ggttcagtgt cgtgaagaga 1020

ggccggaaga agctgctgta catcttcaag cagcctttca tgaggcccgt gcagactacc 1080

caggaggaag atggatgcag ctgtagattc cctgaagagg aggaaggagg ctgtgagctg 1140

agagtgaagt tctcccgaag cgcagatgcc ccagcctatc agcagggaca gaatcagctg 1200

tacaacgagc tgaacctggg aagacgggag gaatacgatg tgctggacaa aaggcggggc 1260

agagatcctg agatgggcgg caaaccaaga cggaagaacc cccaggaagg tctgtataat 1320

gagctgcaga aagacaagat ggctgaggcc tactcagaaa tcgggatgaa gggcgaaaga 1380

aggagaggaa aaggccacga cggactgtac caggggctga gtacagcaac aaaagacacc 1440

tatgacgctc tgcacatgca ggctctgcca ccaagacgag ctaaacgagg ctcaggcgcg 1500

acgaacttta gtttgctgaa gcaagctggg gatgtagagg aaaatccggg tcccatggcc 1560

agaccccacc cctggtggct gtgcgtgctg ggaaccctgg tgggcctgtc tgccaccccc 1620

gctcctaaga gctgccccga gagacactac tgggcccagg gcaagctgtg ctgccagatg 1680

tgcgaacccg gcacctttct ggtgaaagat tgcgatcagc atagaaaggc cgcccagtgt 1740

gacccctgca tccccggagt gagcttcagc ccagaccatc acaccaggcc ccactgcgag 1800

agctgcagac actgcaacag tggcctgctg gtgagaaact gcacaattac agccaacgct 1860

gagtgcgcct gcagaaatgg atggcagtgc agagacaagg agtgcaccga atgcgacccc 1920

ctgcccaacc ccagcctgac agcccgaagc agccaggccc tgagccccca tccccagcct 1980

acccacctgc cctacgtgag tgagatgctg gaagccagaa ccgccggcca catgcagacc 2040

ctggccgact tcagacagct gcccgccaga accctgagca cccactggcc cccccagaga 2100

agcctgtgca gcagcgactt tatcagaatc ctggtgatct tctctggcat gttcctggtg 2160

tttacactgg ccggcgccct gtttctgcac cagagacgca agtaccgcag caacaaggga 2220

gaaagccccg tggagcccgc tgagccctgc agatactcct gccccagaga ggaggagggc 2280

agcaccattc ccatccagga ggactacaga aaacccgagc ccgcctgcag cccatga 2337

<210> 2

<211> 778

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu

20 25 30

Ala Met Ser Leu Gly Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu

35 40 45

Ser Val Ser Val Ile Gly Ala His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys

50 55 60

Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu

65 70 75 80

Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Thr Ile Asp Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Ile Tyr Ser

100 105 110

Cys Leu Gln Ser Arg Ile Phe Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

115 120 125

Leu Glu Ile Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

130 135 140

Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys

145 150 155 160

Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

165 170 175

Thr Asp Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala

195 200 205

Tyr Asp Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser

210 215 220

Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr

225 230 235 240

Tyr Phe Cys Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

245 250 255

Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro

260 265 270

Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro

275 280 285

Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu

290 295 300

Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys

305 310 315 320

Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Arg Phe Ser

325 330 335

Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro

340 345 350

Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys

355 360 365

Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe

370 375 380

Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu

385 390 395 400

Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp

405 410 415

Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys

420 425 430

Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala

435 440 445

Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys

450 455 460

Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr

465 470 475 480

Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg Arg Ala Lys Arg

485 490 495

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

500 505 510

Glu Glu Asn Pro Gly Pro Met Ala Arg Pro His Pro Trp Trp Leu Cys

515 520 525

Val Leu Gly Thr Leu Val Gly Leu Ser Ala Thr Pro Ala Pro Lys Ser

530 535 540

Cys Pro Glu Arg His Tyr Trp Ala Gln Gly Lys Leu Cys Cys Gln Met

545 550 555 560

Cys Glu Pro Gly Thr Phe Leu Val Lys Asp Cys Asp Gln His Arg Lys

565 570 575

Ala Ala Gln Cys Asp Pro Cys Ile Pro Gly Val Ser Phe Ser Pro Asp

580 585 590

His His Thr Arg Pro His Cys Glu Ser Cys Arg His Cys Asn Ser Gly

595 600 605

Leu Leu Val Arg Asn Cys Thr Ile Thr Ala Asn Ala Glu Cys Ala Cys

610 615 620

Arg Asn Gly Trp Gln Cys Arg Asp Lys Glu Cys Thr Glu Cys Asp Pro

625 630 635 640

Leu Pro Asn Pro Ser Leu Thr Ala Arg Ser Ser Gln Ala Leu Ser Pro

645 650 655

His Pro Gln Pro Thr His Leu Pro Tyr Val Ser Glu Met Leu Glu Ala

660 665 670

Arg Thr Ala Gly His Met Gln Thr Leu Ala Asp Phe Arg Gln Leu Pro

675 680 685

Ala Arg Thr Leu Ser Thr His Trp Pro Pro Gln Arg Ser Leu Cys Ser

690 695 700

Ser Asp Phe Ile Arg Ile Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe Leu Val

705 710 715 720

Phe Thr Leu Ala Gly Ala Leu Phe Leu His Gln Arg Arg Lys Tyr Arg

725 730 735

Ser Asn Lys Gly Glu Ser Pro Val Glu Pro Ala Glu Pro Cys Arg Tyr

740 745 750

Ser Cys Pro Arg Glu Glu Glu Gly Ser Thr Ile Pro Ile Gln Glu Asp

755 760 765

Tyr Arg Lys Pro Glu Pro Ala Cys Ser Pro

770 775

Claims

1.一种融合蛋白，其特征在于：氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.一种编码权利要求1所述融合蛋白的多核苷酸。

3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.一种核酸构建物，其特征在于：含有可编码权利要求1中所述融合蛋白的多核苷酸序列。

5.如权利要求4所述的核酸构建物，其特征在于：所述多核苷酸序列为权利要求2或3所述的多核苷酸的序列。

6.如权利要求4所述的核酸构建物，其特征在于：所述核酸构建物为载体。

7.如权利要求6所述的核酸构建物，其特征在于：所述核酸构建物为逆转录病毒载体，含有复制起始位点，3’ LTR，5’ LTR，权利要求2或3所述的多核苷酸的序列，以及标记。

8.一种逆转录病毒，其特征在于：含有权利要求4-7之一所述的核酸构建物。

9.一种逆转录病毒的转导方法，其特征在于：所述转导方法包括小规模包装如权利要求8所述的逆转录病毒的方法、筛选和建立产毒细胞株的方法。

10.一种基因修饰的T细胞，其特征在于：所述T细胞含有权利要求2或3所述的多核苷酸的序列，或含有权利要求4-7之一所述的核酸构建物，或感染了权利要求8所述的逆转录病毒，或稳定表达权利要求1所述的融合蛋白。

11.如权利要求10所述基因修饰的T细胞在制备治疗BCMA介导的多发性骨髓瘤疾病的药物中的用途。