WO2020259541A1 - 一种用于肿瘤治疗的嵌合抗原受体t淋巴细胞及其制备方法与应用 - Google Patents
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Definitions
- this CAR-T lymphocyte can be Major Histocompatibility Complex (MHC) non-restrictively selectively directs T lymphocytes to tumor cells and specifically kills tumors.
- MHC Major Histocompatibility Complex
- the purpose of the present invention is to provide a chimeric antigen receptor, chimeric antigen receptor T lymphocytes and preparation method and application thereof for tumor treatment.
- Domain, self-cleaving peptide and human CD27 full length, or the chimeric antigen receptor may in turn include a single-chain antibody against tumor cell surface antigen, human hinge transmembrane region, human intracellular signal transduction domain, human intracellular co Stimulation signal domain, self-cleaving peptide and human CD27 full length.
- the chimeric antigen receptor sequentially includes a single-chain antibody against a tumor cell surface antigen, a human hinge transmembrane region, a human intracellular costimulatory signal domain, and a human intracellular signal transduction structure. Domain, self-cleaving peptide and human CD27 full length.
- the P2A peptide is any of the following F1) or F2):
- H2 A protein in which the amino acid sequence shown at positions 546-880 of SEQ ID No. 2 has been substituted and/or deleted and/or added by one or several amino acid residues and has the same function.
- the amino acid sequence is the protein shown in positions 22-264 of SEQ ID No. 6;
- the nucleic acid molecule encoding the chimeric antigen receptor includes the coding gene sequence of human CD8 leader peptide, the coding gene sequence of S15 scFv, and human CD8 hinge transmembrane region coding gene sequence, human 4-1BB intracellular region coding gene sequence, human CD3 ⁇ intracellular region coding gene sequence, P2A peptide coding gene sequence, CSF2Ra signal peptide coding gene sequence, EGFRt protein Coding gene sequence, P2A peptide coding gene sequence, human CD27 full length coding gene sequence.
- a2) A DNA molecule that is 75% or more identical to the nucleotide sequence defined by a1) and encodes the above-mentioned human CD8 leader peptide;
- the coding gene sequence of the human CD8 hinge transmembrane region is any one of the following genes c1)-c3):
- the coding gene sequence of the human 4-1BB intracellular region is any one of the following genes d1)-d3):
- the coding gene sequence of the human CD3 ⁇ intracellular region is any one of the following genes e1)-e3):
- f2 A DNA molecule that has 75% or more identity with the nucleotide sequence defined by f1) and encodes the above-mentioned P2A peptide;
- the BCMA scFv coding gene sequence is any one of the following genes j1)-j3):
- the nucleic acid molecule encoding the chimeric antigen receptor is any one of the following genes IV)-VI):
- identity refers to sequence similarity to natural nucleic acid sequences. “Identity” includes the human CD8 leader peptide, S15 scFv, BCMA scFv, human CD8 hinge transmembrane region, human 4-1BB intracellular region, human CD3 ⁇ intracellular region, P2A peptide, CSF2Ra signal peptide, The nucleotide sequence of human CD27 full length or chimeric antigen receptor is 75% or higher, or 80% or higher, or 85% or higher, or 90% or higher, or 95% or higher. Sexual nucleotide sequence. Identity can be evaluated with the naked eye or computer software. Using computer software, the identity between two or more sequences can be expressed as a percentage (%), which can be used to evaluate the identity between related sequences.
- the vector may be a viral vector.
- the viral vector may be a retroviral vector or a lentiviral vector.
- the retroviral vector is a retroviral vector (MP71). The recombinant vector is to insert the nucleic acid molecule of the chimeric antigen receptor into a viral vector to obtain a recombinant viral vector expressing the chimeric antigen receptor.
- the application of the above-mentioned chimeric antigen receptor or the above-mentioned biological material or the above-mentioned retrovirus or the above-mentioned recombinant retroviral vector or the above-mentioned lentivirus or the above-mentioned recombinant lentiviral vector in the production or preparation of CAR-T cells also belongs to the protection scope of the present invention .
- the above-mentioned chimeric antigen receptor or the above-mentioned biological material or the above-mentioned CAR-T cell or the above-mentioned retrovirus or the above-mentioned recombinant retroviral vector or the above-mentioned lentivirus or the above-mentioned recombinant lentiviral vector are in any one of the following D1)-D4)
- the application also belongs to the protection scope of the present invention:
- the U87-MG cells in the log phase are trypsinized and the complete medium is stopped.
- the cells were pipetted and transferred to a 15ml centrifuge tube, washed twice with PBS.
- S15 CAR-CD27 T B-NDG severe combined immunodeficiency mice were inoculated with U87-MG tumor cell solution (solvent is PBS) through the tail vein, and the inoculation volume was 0.3ml (containing 2 ⁇ 10 6 tumor cells). Five days after tumor cell inoculation, mice were injected with the S15 CAR-CD27 T cell solution prepared in Example 1 (solvent is PBS) into the tail vein. The injection volume of S15 CAR-CD27 T cells was 0.2ml (containing 5 ⁇ 10 6 S15 CAR -CD27 T cells).
- BCMA-CAR gene sequence between the NotI and EcoRI restriction sites of the retroviral vector (MP71), and keep the other sequences of the retroviral vector (MP71) unchanged to obtain the recombinant retroviral vector BCMA-CAR.
- the full-length gene sequence of BCMA-CAR is shown in SEQ ID NO: 5, polynucleotides 1-1476.
- the retroviral liquid obtained from the recombinant retroviral vector BCMA-CAR-CD27 is referred to as BCMA-CAR-CD27 virus liquid.
- the retroviral liquid obtained from the recombinant retroviral vector BCMA-CAR is referred to as the BCMA-CAR virus liquid.
- the three cell lines with the highest virus titers in the 96-well plate were screened out, and they were inoculated into a 24-well plate and continued to be cultured for secondary screening. Continue to use the supernatant on the 5th day after culture as the retrovirus solution to infect HT1080 cells, measure the virus titer by flow cytometry, select the cell with the highest virus titer as the stable yielding strain, and store it in liquid nitrogen for a long time. Using this cell line, viral supernatants can be prepared on a large scale for gene transduction to prepare CAR-T cells.
- Retronectin solution (Takara) at a concentration of 15 ⁇ g/ml, add 1.2ml Retronectin solution to each well of the 6-well plate, protect from light, and 4°C Stay overnight.
- T cells 72 hours after infection with virus solution to obtain CAR-T cells infected with retrovirus The T cells infected with the BCMA-CAR-CD27 virus solution are referred to as BCMA CAR-CD27 T cells.
- the T cells infected with the BCMA-CAR virus solution are referred to as BCMA CAR T cells.
- Example 5 CFSE labeling method to detect the specific killing effect of BCMA-CAR-CD27 gene-modified CAR-T cells on tumor cells
- the effector cells were replaced with BCMA CAR-CD27 T cells, BCMA CAR T cells, and CTR T cells prepared in Example 4, and the target cells were replaced with human multiple myeloma cells RPMI8226, and the other steps were not changed.
- the target cells were replaced with human multiple myeloma cells RPMI8226, and the other steps were not changed.
- mice The experimental materials were randomly divided into 4 experimental groups, each with 6 mice.
- the specific treatment methods for each group are as follows:
- Exb T B-NDG severe combined immunodeficiency mice were inoculated with fluorescein-labeled human lymphoma cell Daudi-Luc solution (solvent is PBS) in the tail vein, and the inoculation volume was 0.3ml (containing 2 ⁇ 10 6 tumor cells). Five days after the tumor cells were inoculated, the Exb T cell solution prepared in Example 4 (the solvent was PBS solution) was injected into the tail vein of the mouse, and the amount of Exb T cell injection was 0.2 ml (containing 5 ⁇ 10 6 Exb T cells).
- the CAR-T therapeutic product targeting Siglec-15 prepared by the present invention can specifically target and kill solid tumor cells, or by targeting Remove tumor-associated macrophages, relieve the main immune suppressor cells in the tumor microenvironment to T cell-mediated specific immune response, thereby enhancing the body's anti-tumor immune response. Therefore, the method of the present invention can be used to prepare CAR-T cells for treating solid tumors.
- the transduction method for modifying T lymphocytes with chimeric antigen receptor genes of the present invention is based on the retroviral transduction method, by screening stable toxin-producing strains, collecting the supernatant of the toxin-producing strains for T cell transduction.
- the method has the advantages of high transduction efficiency, stable expression of foreign genes, high batch stability, and shortening the preparation time of the virus for transducing T cells for clinical use.
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Abstract
提供了一种用于肿瘤治疗的嵌合抗原受体T淋巴细胞及其制备方法与应用。所述嵌合抗原受体依次包括抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体、人铰链跨膜区、人胞内信号域、自切割肽和人CD27全长。其中，人胞内信号域包括人胞内共刺激信号结构域和人胞内信号传导结构域。所述嵌合抗原受体T淋巴细胞的制备方法包括如下步骤：将上述嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞中并使所述编码基因得到表达，得到CAR-T细胞。
Description
本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种用于肿瘤治疗的嵌合抗原受体T淋巴细胞及其制备方法与应用，特别涉及一种用于肿瘤治疗的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体T淋巴细胞及其制备方法与应用。
随着T淋巴细胞肿瘤免疫应答机制的研究日益受到重视，嵌合抗原受体T(CAR-T)细胞治疗正在成为肿瘤免疫治疗领域的一个新的免疫治疗策略。由于T细胞对靶细胞的识别特异性依赖于T淋巴细胞受体(T Cell Receptor，TCR)，因此将针对肿瘤细胞相关抗原的单链抗体片段(scFv)与T淋巴细胞受体的CD3ζ或FcεRIγ等胞内信号激活基序融合成嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)，并将其通过如逆转录病毒感染等方式基因修饰在T淋巴细胞表面，这种CAR-T淋巴细胞能够以主要组织相容性复合物(Major Histocompatibility Complex，MHC)非限制性方式选择性地将T淋巴细胞定向到肿瘤细胞并特异性地杀伤肿瘤。
CAR-T细胞介导的免疫反应是其清除肿瘤细胞的主要手段。在正常的免疫反应中，抗原特异性T细胞需要至少两个信号的刺激才能进行增殖并对抗原产生免疫应答。第一信号，抗原结合的T细胞受体(TCR)和CD3胞内免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)转导信号(CD3ζ)；第二信号，协同刺激信号，由T细胞与抗原提呈细胞(APC)或其它细胞表面的共刺激分子对所介导，包括CD28、CD137、CD134和CD27等表面受体。CAR-T设计考虑到了T细胞激活的免疫学特性，CAR的结构包含胞外结合区、跨膜区和胞内信号区。通常胞外区包含能够识别肿瘤相关抗原的scFv，跨膜区采用CD8、CD28等分子的跨膜区，胞内信号区采用免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)CD3ζ及共刺激信号分子CD28、CD137、CD134等的胞内信号区。
从20世纪90年代初，第一款CAR-T的出现开始，CAR基因的结构经历了从第一代到第四代的演化过程。现有技术对于CAR基因结构的优化主要集中在两个部位，一个是CAR与肿瘤细胞作用的肿瘤相关抗原靶点，另一个就是CAR的胞内信号区，包括胞内信号传导结构域和/或共刺激信号结构域。靶点的选择与CAR-T细胞对肿瘤细胞的特异性亲和力有关，理想的靶点应能够尽可能增大CAR-T对肿瘤细胞的亲和力，并且尽可能减少对正常组织细胞的伤害。因此通常选择在肿瘤组织特异性高表达而在正常组织低表达的抗原。增加共刺激信号结构域能够引起T淋巴细胞的持续增殖，从而提高T细胞的细胞毒性、增殖活性，维持T细胞应答，延长T细胞存活时间等。例如，典型第二代CAR结构就是整合了CD28或CD137(又名4-1BB)的胞内信号区。从2010年起基于第二代CAR的临床报道屡次引发震动，特别是对于 复发性、难治性的急性淋巴细胞白血病(ALL)病人，其完全缓解率高达90％以上。
CAR-T细胞治疗的安全性和有效性是业界非常关心的问题。目前，已上市的CAR-T细胞均以第二代CAR为基础设计制备，对于血液肿瘤治疗效果尚可，但是仍然存在几个突出问题：首先是CAR-T体内增殖和存活能力较差，这是造成部分患者复发的直接原因；另外，围绕CAR-T造成的毒副作用，例如细胞因子风暴和中枢神经系统毒性，引发一系列安全性担忧。而CAR-T细胞对肿瘤细胞的杀伤效率不足，会客观上加大CAR-T细胞的使用剂量，从而加重毒副作用，造成对患者不可逆的伤害。因此，迫切需要对CAR的设计进行改造，进一步提高CAR-T疗法的安全性和有效性。
发明公开
本发明的目的是提供一种用于肿瘤治疗的嵌合抗原受体、嵌合抗原受体T淋巴细胞及其制备方法与应用。
为了实现上述目的，本发明首先提供了一种嵌合抗原受体。
本发明提供的嵌合抗原受体依次包括抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体、人铰链跨膜区、人胞内信号域、自切割肽和人CD27全长；
所述人胞内信号域包括人胞内共刺激信号结构域和人胞内信号传导结构域。
上述嵌合抗原受体中，所述肿瘤细胞表面抗原可为现有技术中任一种肿瘤细胞表面抗原或其片段或其修饰物或其衍生物。作为示范性的实施方式，所述肿瘤细胞表面抗原包括但不限于下列群组：CD19(NP_001171569.1，PRI 24-MAY-2020)、CD20(NP_068769.2，PRI 24-APR-2020)、CD22(NP_001762.2，PRI 25-APR-2020)、CD30(NP_001234.3，PRI 07-JUN-2020)、CD33(NP_001763.3，PRI 25-APR-2020)、CD38(NP_001766.2，PRI 24-MAY-2020)、BCMA(NP_001183.2，PRI 24-MAY-2020)、Siglec-15(NP_998767.1，PRI 07-JUN-2020)、CS1(NP_067004.3，PRI 08-MAY-2020)、CD138(NP_001006947.1，PRI 31-MAY-2020)、CD123/IL3Rα(NP_002174.1，PRI 07-JUN-2020)、c-Met(NP_001120972.1，PRI 07-JUN-2020)、gp100(NP_001186983.1，PRI 02-MAY-2020)、MUC1(NP_002447.4，PRI 12-MAY-2020)、IGF-I(NP_001104753.1，PRI 31-MAY-2020)、EPCAM(NP_002345.2，PRI 07-JUN-2020)、EGFR/EGFRvIII(NP_001333870.1，PRI 07-JUN-2020)、HER2(NP_004439.2，PRI 09-JUN-2020)、PD1(NP_005009.2，PRI 07-JUN-2020)、CTLA4(NP_005205.2，PRI 14-JUN-2020)、IGF1R(NP_000866.1，PRI 14-JUN-2020)、mesothelin(NP_001170826.1，PRI 31-MAY-2020)、PSMA(NP_004467.1，PRI 31-MAY-2020)、WT1(NP_077744.4，PRI 13-MAY-2020)、ROR1(NP_005003.2，PRI 24-MAY-2020)、CEA(NP_004354.3，PRI 14-JUN-2020)、NY-ESO-1(NP_001318.1，PRI 24-MAY-2020)、GD-2(CAS#65988-71-8，C
78H
138N
4O
34·2NH
3)、MAGE A3(NP_005353.1，PRI 09-MAY-2020)、GPC3(NP_001158089.1，PRI 12-MAY-2020)、Claudin18.2(NP_001002026.1， PRI 26-APR-2020)。在本发明的一个具体实施例中，所述肿瘤细胞表面抗原为Siglec-15，所述抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体为抗Siglec-15单链抗体(简称S15 scFv)。在本发明的另一个具体实施例中，所述肿瘤细胞表面抗原为BCMA，所述抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体为抗BCMA的单链抗体(简称BCMA scFv)。
上述嵌合抗原受体中，所述人铰链跨膜区可为人CD8铰链跨膜区、人CD28铰链跨膜区或人CD4铰链跨膜区。在本发明的一个具体实施例中，所述人铰链跨膜区为人CD8铰链跨膜区。
所述人胞内共刺激信号结构域可为选自如下分子的胞内区中的任一种：CD28(NP_006130.1，PRI 07-JUN-2020)、4-1BB(CD137，NP_001552.2，PRI 12-MAY-2020)、CD134(OX40，NP_003318.1，PRI 07-JUN-2020)、CD30(NP_001234.3，PRI 07-JUN-2020)、CD40(NP_001241.1，PRI 17-MAY-2020)、PD-1(NP_005009.2，PRI 07-JUN-2020)、LFA-1(NP_000202.3，PRI 17-MAY-2020)、CD2(NP_001315538.1,PRI 29-SEP-2019)、CD7(NP_006128.1,PRI 09-MAY-2020)、LIGHT(NP_003798.2，PRI 07-MAY-2020)、NKG2C(NP_002251.2，PRI 27-APR-2020)、B7-H3(NP_001019907.1，PRI 24-MAY-2020)。在本发明的一个具体实施例中，所述人胞内共刺激信号结构域为人4-1BB胞内区。
所述人胞内信号传导结构域可为选自如下分子的胞内区中的任一种：CD3ζ(NP_932170.1，PRI 13-MAY-2020)、CD3gamma(NP_000064.1，PRI 13-MAY-2020)、CD3delta(NP_000723.1，PRI 13-MAY-2020)、CD3epsilon(NP_031674.1，ROD 07-APR-2020)、common FcR gamma(NP_000560.7，PRI 24-MAY-2020)、FcR beta(NP_001231682.2，PRI 08-MAY-2020)、CD79a(NP_001774.1，PRI 12-MAY-2020)、CD79b(NP_000617.1，PRI 10-MAY-2020)、Fc gamma RIIa(NP_001129691.1，PRI 14-JUN-2020)、DAP10(NP_055081.1，PRI 09-MAY-2020)、DAP12(NP_003323.1，PRI 12-MAY-2020)。在本发明的一个具体实施例中，所述人胞内信号传导结构域为人CD3ζ胞内区。
上述嵌合抗原受体中，所述自切割肽可为本领域常见的任何一种自切割肽，包括E2A、F2A、P2A、T2A等。所述自切割肽是一种来源于病毒的“自裂解”小肽，其平均长度可为18-22个氨基酸。所述自切割肽作用机理如下：在翻译过程中会形成独特的高级结构对核糖体肽基转移酶中心造成空间位阻，导致无法形成正常的肽链连接，但同时核糖体却能继续翻译下游蛋白，从而形成一种类似蛋白水解酶的作用将前后两个蛋白顺式“切开”。基因工程中利用2A元件可以实现不同蛋白的串联表达。在本发明的一个具体实施例中，所述自切割肽为P2A肽。
上述嵌合抗原受体中，所述人胞内信号域包括人胞内共刺激信号结构域和人胞内信号传导结构域，其中，人胞内共刺激信号结构域和人胞内信号传导结构域的先后顺序并无限定，即所述嵌合抗原受体可依次包括抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体、人铰链跨膜区、人胞内共刺激信号结构域、人胞内信号传导结 构域、自切割肽和人CD27全长，或所述嵌合抗原受体可依次包括抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体、人铰链跨膜区、人胞内信号传导结构域、人胞内共刺激信号结构域、自切割肽和人CD27全长。在本发明的一个具体实施例中，所述嵌合抗原受体依次包括抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体、人铰链跨膜区、人胞内共刺激信号结构域、人胞内信号传导结构域、自切割肽和人CD27全长。
上述嵌合抗原受体中，所述抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体前还包括先导肽，即所述嵌合抗原受体依次包括先导肽、抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体、人铰链跨膜区、人胞内共刺激信号结构域、人胞内信号传导结构域、自切割肽和人CD27全长。其中，所述先导肽可以使用人体内的各种蛋白质的信号肽，例如体内分泌的细胞因子蛋白、白细胞分化抗原(CD分子)的信号肽。在本发明的一个具体实施例中，所述先导肽为人CD8先导肽。
上述嵌合抗原受体中，所述嵌合抗原受体还包括EGFRt蛋白，所述嵌合抗原受体依次包括先导肽、抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体、人铰链跨膜区、人胞内共刺激信号结构域、人胞内信号传导结构域、自切割肽、信号肽、EGFRt蛋白、自切割肽和人CD27全长。其中，所述信号肽可以使用人体内的各种蛋白质的信号肽，例如体内分泌的细胞因子蛋白、白细胞分化抗原(CD分子)的信号肽。在本发明的一个具体实施例中，所述信号肽为CSF2Ra信号肽。
进一步的，所述抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体为S15 scFv时，所述嵌合抗原受体依次包括人CD8先导肽、S15 scFv、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、P2A肽、CSF2Ra信号肽、EGFRt蛋白、P2A肽、人CD27全长。
所述抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体为BCMA scFv时，所述嵌合抗原受体依次包括人CD8先导肽、BCMA scFv、所述人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、P2A肽、人CD27全长。
所述人CD8先导肽为如下A1)或A2)中的任一种：
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2第1-21位所示的多肽或蛋白质；
A2)将SEQ ID No.2第1-21位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽或蛋白质。
所述S15 scFv为如下B1)或B2)中的任一种：
B1)氨基酸序列是SEQ ID No.2第22-269位所示的蛋白质；
B2)将SEQ ID No.2第22-269位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
所述人CD8铰链跨膜区为如下C1)或C2)中的任一种：
C1)氨基酸序列是SEQ ID No.2第270-338位所示的蛋白质；
C2)将SEQ ID No.2第270-338位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
所述人4-1BB胞内区为如下D1)或D2)中的任一种：
D1)氨基酸序列是SEQ ID No.2第339-385位所示的蛋白质；
D2)将SEQ ID No.2第339-385位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
所述人CD3ζ胞内区为如下E1)或E2)中的任一种：
E1)氨基酸序列是SEQ ID No.2第386-497位所示的蛋白质；
E2)将SEQ ID No.2第386-497位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
所述P2A肽为如下F1)或F2)中的任一种：
F1)氨基酸序列是SEQ ID No.2第498-523位或第881-906位所示的多肽或蛋白质；
F2)将SEQ ID No.2第498-523位或第881-906位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽或蛋白质。
所述CSF2Ra信号肽为如下G1)或G2)中的任一种：
G1)氨基酸序列是SEQ ID No.2第524-545位所示的多肽或蛋白质；
G2)将SEQ ID No.2第524-545位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的多肽或蛋白质。
所述EGFRt蛋白为如下H1)或H2)中的任一种：
H1)氨基酸序列是SEQ ID No.2第546-880位所示的蛋白质；
H2)将SEQ ID No.2第546-880位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
所述人CD27全长为如下I1)或I2)中的任一种：
I1)氨基酸序列是SEQ ID No.2第907-1167位所示的蛋白质；
I2)将SEQ ID No.2第907-1167位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
所述BCMA scFv为如下J1)或J2)中的任一种：
J1)氨基酸序列是SEQ ID No.6第22-264位所示的蛋白质；
J2)将SEQ ID No.6第22-264位所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质。
更进一步的，所述抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体为S15 scFv时，所述嵌合抗原受体为如下(1)-(4)中的任一种：
(1)氨基酸序列是SEQ ID No.2所示的蛋白质；
(2)在SEQ ID No.2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(3)将SEQ ID No.2所示的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；
(4)与(1)-(3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、 90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
所述抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体为BCMA scFv时，所述嵌合抗原受体为如下(5)-(8)中的任一种：
(5)氨基酸序列是SEQ ID No.6所示的蛋白质；
(6)在SEQ ID No.6所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；
(7)将SEQ ID No.6所示的蛋白质的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；
(8)与(5)-(7)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。
上述任一所述蛋白质中，所述标签具体如表1所示。
表1、标签的序列
所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。
上述任一所述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
为了实现上述目的，本发明又提供了与上述嵌合抗原受体相关的生物材料。
本发明提供的与上述嵌合抗原受体相关的生物材料为下述1)至8)中的任一种：
1)编码上述嵌合抗原受体的核酸分子；
2)含有1)所述核酸分子的表达盒；
3)含有1)所述核酸分子的重组载体；
4)含有2)所述表达盒的重组载体；
5)含有1)所述核酸分子的细胞系；
6)含有2)所述表达盒的细胞系；
7)含有3)所述重组载体的细胞系；
8)含有4)所述重组载体的细胞系。
上述1)中，所述编码上述嵌合抗原受体的核酸分子依次包括抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体的编码基因序列、人铰链跨膜区的编码基因序列、人胞内信号域的编码基因序列、自切割肽的编码基因序列、人CD27全长的编码基因序列。 所述人胞内信号域的编码基因序列包括人胞内共刺激信号结构域的编码基因序列和人胞内信号传导结构域的编码基因序列。
适用于本发明的人CD27全长的编码基因序列为经过基因优化的人CD27基因cDNA全长序列。应理解，基因优化又称为密码子优化，是指在不改变蛋白质氨基酸序列的情况下，通过替换编码某种蛋白质的多核苷酸序列中的一个或多个核苷酸，达到提高蛋白质在特定种属细胞中的表达水平和表达效率的目的。基因优化包括但不限于密码子偏好性优化、RNA高级结构优化、酶切位点优化和GC含量调整等方法。本发明包括运用上述基因优化方法得到的各种编码人CD27的多核苷酸序列，称为oCD27。这些多核苷酸序列的共同特征是采用不同的核苷酸密码子，但是编码的氨基酸序列与野生型人CD27氨基酸序列相同。可采用例如NCBI的BLAST和BLASTp计算两条比对的多核苷酸序列之间和氨基酸序列之间的序列相同性。作为示范性例子，本发明中oCD27的编码序列如SEQ ID No.1第2719-3501位多核苷酸所示或SEQ ID NO:5第1555-2337位多核苷酸所示。
进一步的，所述抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体为S15 scFv时，所述编码上述嵌合抗原受体的核酸分子依次包括人CD8先导肽的编码基因序列、S15 scFv的编码基因序列、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列、人4-1BB胞内区的编码基因序列、人CD3ζ胞内区的编码基因序列、P2A肽的编码基因序列、CSF2Ra信号肽的编码基因序列、EGFRt蛋白的编码基因序列、P2A肽的编码基因序列、人CD27全长的编码基因序列。
所述抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体为BCMA scFv时，所述编码上述嵌合抗原受体的核酸分子依次包括人CD8先导肽的编码基因序列、BCMA scFv的编码基因序列、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列、人4-1BB胞内区的编码基因序列、人CD3ζ胞内区的编码基因序列、P2A肽的编码基因序列、人CD27全长的编码基因序列。
所述人CD8先导肽的编码基因序列为如下a1)-a3)任一所示的基因：
a1)SEQ ID No.1第1-63位所示的DNA分子；
a2)与a1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述人CD8先导肽的DNA分子；
a3)在严格条件下与a1)或a2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述人CD8先导肽的DNA分子。
所述S15 scFv的编码基因序列为如下b1)-b3)任一所示的基因：
b1)SEQ ID No.1第64-807位所示的DNA分子；
b2)与b1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述S15 scFv的DNA分子；
b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述S15 scFv的DNA分子。
所述人CD8铰链跨膜区的编码基因序列为如下c1)-c3)任一所示的基因：
c1)SEQ ID No.1第808-1014位所示的DNA分子；
c2)与c1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述人CD8铰链跨膜区的DNA分子；
c3)在严格条件下与c1)或c2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述人CD8铰链跨膜区的DNA分子。
所述人4-1BB胞内区的编码基因序列为如下d1)-d3)任一所示的基因：
d1)SEQ ID No.1第1015-1155位所示的DNA分子；
d2)与d1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述人4-1BB胞内区的DNA分子；
d3)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述人4-1BB胞内区的DNA分子。
所述人CD3ζ胞内区的编码基因序列为如下e1)-e3)任一所示的基因：
e1)SEQ ID No.1第1156-1491位所示的DNA分子；
e2)与e1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述人CD3ζ胞内区的DNA分子；
e3)在严格条件下与e1)或e2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述人CD3ζ胞内区的DNA分子。
所述P2A肽的编码基因序列为如下f1)-f3)任一所示的基因：
f1)SEQ ID No.1第1492-1569位或第2641-2718位所示的DNA分子；
f2)与f1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述P2A肽的DNA分子；
f3)在严格条件下与f1)或f2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述P2A肽的DNA分子。
所述CSF2Ra信号肽的编码基因序列为如下g1)-g3)任一所示的基因：
g1)SEQ ID No.1第1570-1635位所示的DNA分子；
g2)与g1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述CSF2Ra信号肽的DNA分子；
g3)在严格条件下与g1)或g2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述CSF2Ra信号肽的DNA分子。
所述EGFRt蛋白的编码基因序列为如下h1)-h3)任一所示的基因：
h1)SEQ ID No.1第1636-2640位所示的DNA分子；
h2)与h1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述EGFRt蛋白的DNA分子；
h3)在严格条件下与h1)或h2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述EGFRt蛋白的DNA分子。
所述人CD27全长的编码基因序列为如下i1)-i3)任一所示的基因：
i1)SEQ ID No.1第2719-3501位所示的DNA分子；
i2)与i1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述人CD27全长的DNA分子；
i3)在严格条件下与i1)或i2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述人CD27全长的DNA分子。
所述BCMA scFv的编码基因序列为如下j1)-j3)任一所示的基因：
j1)SEQ ID No.5第64-792位所示的DNA分子；
j2)与j1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述BCMA scFv的DNA分子；
j3)在严格条件下与j1)或j2)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述BCMA scFv的DNA分子。
更进一步的，所述抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体为S15 scFv时，所述编码上述嵌合抗原受体的核酸分子为如下Ⅰ)-Ⅲ)任一所示的基因：
Ⅰ)SEQ ID No.1所示的DNA分子；
Ⅱ)与Ⅰ)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述嵌合抗原受体的DNA分子；
Ⅲ)在严格条件下与Ⅰ)或Ⅱ)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述嵌合抗原受体的DNA分子。
所述抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体为BCMA scFv时，所述编码上述嵌合抗原受体的核酸分子为如下Ⅳ)-Ⅵ)任一所示的基因：
Ⅳ)SEQ ID No.5所示的DNA分子；
Ⅴ)与Ⅳ)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码上述嵌合抗原受体的DNA分子；
Ⅵ)在严格条件下与Ⅳ)或Ⅴ)限定的核苷酸序列杂交，且编码上述嵌合抗原受体的DNA分子。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码上述人CD8先导肽、S15 scFv、BCMA scFv、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、P2A肽、CSF2Ra信号肽、EGFRt蛋白、人CD27全长或嵌合抗原受体的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码上述人CD8先导肽、S15 scFv、BCMA scFv、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、P2A肽、CSF2Ra信号肽、EGFRt蛋白、人CD27全长或嵌合抗原受体且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码上述人CD8先导肽、S15 scFv、BCMA scFv、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、P2A肽、CSF2Ra信号肽、人CD27全长或嵌合抗原受体的核苷酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高， 或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。
所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M NaPO
4和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗。
上述2)中，所述表达盒依次由启动子、编码上述嵌合抗原受体的核酸分子和终止子组成。
上述3)或4)中，所述载体可为病毒载体。进一步的，所述病毒载体可为逆转录病毒载体或慢病毒载体。更进一步的，所述逆转录病毒载体为逆转录病毒载体(MP71)。所述重组载体是将上述嵌合抗原受体的核酸分子插入病毒载体中，得到表达上述嵌合抗原受体的重组病毒载体。
上述5)或6)或7)或8)中，所述细胞系可为用于病毒包装的细胞系或用于病毒传代培养的细胞系或用于病毒感染的T细胞。所述用于病毒包装的细胞系具体为Phoenix Ecotropic(ECO)细胞，所述用于病毒传代培养的细胞系具体为PG13细胞，所述用于病毒感染的T细胞具体可为CD3
+T细胞。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种CAR-T细胞的制备方法。
本发明提供的CAR-T细胞的制备方法包括如下步骤：将上述嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞中并使所述编码基因得到表达，得到CAR-T细胞。
进一步的，所述嵌合抗原受体的编码基因可通过慢病毒表达系统或逆转录病毒表达系统导入T细胞中。
更进一步的，所述将上述嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞中并使所述编码基因得到表达的方法为方法(一)或方法(二)：
所述方法(一)包括如下步骤：用逆转录病毒感染T细胞；所述逆转录病毒是将重组逆转录病毒载体转染逆转录病毒包装细胞，然后进行细胞培养后得到的；所述重组逆转录病毒载体为将上述嵌合抗原受体的编码基因插入逆转录病毒载体中得到的。
所述方法(二)包括如下步骤：用慢病毒感染T细胞；所述慢病毒是将重组慢病毒载体转染慢病毒包装细胞，然后进行细胞培养后得到的；所述慢病毒载体为将上述嵌合抗原受体的编码基因插入慢病毒载体中得到的。
上述方法(一)中，所述将重组逆转录病毒载体转染逆转录病毒包装细胞，然后进行细胞培养后还包括如下步骤：收集细胞培养上清中的病毒液，将所述病毒液转染传代细胞，并进行克隆筛选和培养，得到病毒滴度最高的产毒细胞株。该病毒滴度最高的产毒细胞株培养上清中的病毒即为上述方法(一)中的逆转录病毒。
在本发明的一个具体实施例中，所述嵌合抗原受体的编码基因通过逆转录病毒表达系统导入T细胞中。所述逆转录病毒载体具体为逆转录病毒载体(MP71)。所述重组逆转录病毒载体具体为将上述嵌合抗原受体的编码基因插 入逆转录病毒载体(MP71)的NotI和EcoRI酶切位点间，且保持逆转录病毒载体(MP71)的其他序列不变得到的载体。所述逆转录病毒包装细胞具体为Phoenix Ecotropic(ECO)细胞。所述传代细胞具体为PG13细胞。
上述方法制备得到的CAR-T细胞或上述方法中的逆转录病毒或重组逆转录病毒载体或慢病毒或重组慢病毒载体也属于本发明的保护范围。
上述嵌合抗原受体或上述生物材料或上述逆转录病毒或上述重组逆转录病毒载体或上述慢病毒或上述重组慢病毒载体在生产或制备CAR-T细胞中的应用也属于本发明的保护范围。
上述嵌合抗原受体或上述生物材料或上述CAR-T细胞或上述逆转录病毒或上述重组逆转录病毒载体或上述慢病毒或上述重组慢病毒载体在如下D1)-D4)中任一种中的应用也属于本发明的保护范围：
D1)制备治疗或辅助治疗肿瘤的产品；
D2)治疗或辅助治疗肿瘤；
D3)制备杀伤肿瘤细胞的产品；
D4)杀伤肿瘤细胞。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种治疗或辅助治疗肿瘤或杀伤肿瘤细胞的产品。
本发明提供的治疗或辅助治疗肿瘤或杀伤肿瘤细胞的产品的活性成分为上述嵌合抗原受体或上述生物材料或上述CAR-T细胞或上述逆转录病毒或上述重组逆转录病毒载体或上述慢病毒或上述重组慢病毒载体。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种治疗或辅助治疗肿瘤的方法。
本发明提供的治疗或辅助治疗肿瘤的方法包括如下步骤：给受试者施用上述CAR-T细胞进行治疗或辅助治疗肿瘤。
上述任一所述应用或产品或方法中，所述肿瘤包括实体肿瘤或血液肿瘤。
进一步的，所述实体肿瘤为Siglec-15阳性的实体肿瘤，如脑胶质瘤、黑色素瘤、膀胱癌、肝癌、肺癌、肾癌、直肠癌、子宫内膜癌和甲状腺癌。在本发明的一个具体实施例中，所述实体肿瘤为脑胶质瘤，所述肿瘤细胞为人脑胶质瘤细胞(如U87-MG)。
所述血液肿瘤为BCMA阳性的血液肿瘤，如多发性骨髓瘤。在本发明的一个具体实施例中，所述血液肿瘤为多发性骨髓瘤，所述肿瘤细胞为人多发性骨髓瘤细胞(如RPMI8226)。
更进一步的，所述受试者包括人和非人动物。所述非人动物包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物。
图1为CAR的结构示意图。上图为S15-CAR基因结构，下图为S15-CAR-CD27基因结构。
图2为流式细胞术分析逆转录病毒感染T细胞3天后CD4
+亚群和CD8
+亚群的 CAR-T细胞中EGFR(CAR)的阳性率。
图3为流式细胞术分析逆转录病毒感染T细胞3天后CD4
+亚群和CD8
+亚群的CAR-T细胞中IFNγ的阳性率。
图4为流式细胞术分析逆转录病毒感染T细胞3天后CD4
+亚群和CD8
+亚群的CAR-T细胞中CD107a的阳性率。
图5为使用CAR-T细胞和靶细胞按照不同效靶比共培养后，用CFSE染料标记法检测靶细胞裂解率。
图6为小鼠肿瘤体积的统计结果。
图7为小鼠存活率的统计结果。
图8为BCMA-CAR-CD27的结构示意图。ScFv：单链抗体可变区；Hinge：CD8铰链区；TM：CD8跨膜区。
图9为流式细胞术分析显示逆转录病毒感染T细胞3天后CD4+亚群和CD8+亚群的CAR-T细胞，表面结合Protein L的阳性率，即BCMA-CAR的表达效率。
图10为流式细胞术分析显示逆转录病毒感染后，BCMA&CD27 T、CTR T和BCMA T细胞表面CD27的表达水平。MFI：平均荧光强度。
图11为使用CAR-T细胞和靶细胞按照不同效靶比共培养后的细胞裂解率。
图12为肿瘤移植模型中，尾静脉注射CAR-T细胞后，D-luciferin钠盐成像，观察小鼠体内的肿瘤细胞残留情况。A为主要实验流程；B为统计不同时间点各组别小鼠体内的荧光素强度；C为各组别小鼠钠盐成像结果。
实施发明的最佳方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的逆转录病毒载体(MP71)记载于文献“Engels,B.,et al.,Retroviral vectors for high-level transgene expression in T lymphocytes.Hum Gene Ther,2003.14(12):p.1155-68.”中，公众可从浙江康佰裕生物科技有限公司获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、S15-CAR-CD27基因修饰的CAR-T细胞的制备
一、逆转录病毒载体的构建
1、野生型人CD27基因cDNA全长序列的优化
将野生型人CD27基因cDNA全长序列称为nCD27。为了使nCD27更适合在人类细胞中表达，在保证nCD27编码的氨基酸序列不变的情况下，将nCD27序列在网站http://sg.idtdna.com/site上进行了密码子优化，得到oCD27，oCD27的核苷酸序列如SEQ ID NO.1第2719-3501位所示。
2、S15-CAR-CD27基因序列的设计及合成
S15-CAR-CD27基因序列依次包括人CD8先导肽的编码基因序列、S15 scFv的编码基因序列、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列、人4-1BB胞内区的编码 基因序列、人CD3ζ胞内区的编码基因序列、P2A肽(记作P2A肽-1)的编码基因序列、CSF2Ra信号肽的编码基因序列、EGFRt蛋白的编码基因序列、P2A肽(记作P2A肽-2)的编码基因序列、oCD27的编码基因序列。S15-CAR-CD27基因序列如SEQ ID NO.1所示，其中，人CD8先导肽的编码基因序列为SEQ ID NO.1第1-63位，S15 scFv的编码基因序列为SEQ ID NO.1第64-807位、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列为SEQ ID NO.1第808-1014位、人4-1BB胞内区的编码基因序列为SEQ ID NO.1第1015-1155位、人CD3ζ胞内区的编码基因序列为SEQ ID NO.1第1156-1491位、P2A肽-1的编码基因序列为SEQ ID NO.1第1492-1569位、CSF2Ra信号肽的编码基因序列为SEQ ID NO.1第1570-1635位、EGFRt蛋白的编码基因序列为SEQ ID NO.1第1636-2640位、P2A肽-2的编码基因序列为SEQ ID NO.1第2641-2718位、oCD27的编码基因序列为SEQ ID NO.1第2719-3501位。S15-CAR-CD27基因序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
S15-CAR基因序列依次包括人CD8先导肽的编码基因序列、S15 scFv的编码基因序列、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列、人4-1BB胞内区的编码基因序列、人CD3ζ胞内区的编码基因序列、P2A肽的编码基因序列、CSF2Ra信号肽的编码基因序列、EGFRt蛋白的编码基因序列。S15-CAR基因序列如SEQ ID NO.3所示，其中，人CD8先导肽的编码基因序列为SEQ ID NO.3第1-63位，S15 scFv的编码基因序列为SEQ ID NO.3第64-807位、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列为SEQ ID NO.3第808-1014位、人4-1BB胞内区的编码基因序列为SEQ ID NO.3第1015-1155位、人CD3ζ胞内区的编码基因序列为SEQ ID NO.3第1156-1491位、P2A肽的编码基因序列为SEQ ID NO.3第1492-1569位、CSF2Ra信号肽的编码基因序列为SEQ ID NO.3第1590-1635位、EGFRt蛋白的编码基因序列为SEQ ID NO.3第1636-2643位。
S15-CAR-CD27基因序列和S15-CAR基因序列中的主要元件结构示意图如图1所示。
委托擎科生物科技有限公司合成S15-CAR-CD27基因序列和S15-CAR基因序列。将合成的基因序列克隆在pUC57载体上进行测序鉴定。
3、逆转录病毒载体的构建
将SEQ ID NO.1所示的S15-CAR-CD27基因序列插入逆转录病毒载体(MP71)的NotI和EcoRI酶切位点间，且保持逆转录病毒载体(MP71)的其他序列不变，得到重组逆转录病毒载体S15-CAR-CD27。
将SEQ ID NO.3所示的S15-CAR基因序列插入逆转录病毒载体(MP71)的NotI和EcoRI酶切位点间，且保持逆转录病毒载体(MP71)的其他序列不变，得到重组逆转录病毒载体S15-CAR。
将SEQ ID NO.4所示的非靶向S15-CAR基因序列插入逆转录病毒载体(MP71)的NotI和EcoRI酶切位点间，且保持逆转录病毒载体(MP71)的其他序列不变， 得到对照逆转录病毒载体。
二、逆转录病毒包装和产毒株的建立
将步骤一中制备得到的重组逆转录病毒载体S15-CAR-CD27和S15-CAR及对照逆转录病毒载体，按照以下方法分别包装得到两种逆转录病毒及对照逆转录病毒：
1、包装细胞的培养
每10cm细胞培养皿中添加6×10
6个Phoenix Ecotropic(ECO)细胞(ATCC，CRL-3214)(小于20代，不过分长满)和10ml的DMEM培养基，充分混匀细胞，37℃培养过夜。
2、包装细胞的转染
待ECO细胞融合度达到50-60％左右进行转染；在一个管中添加目的质粒12.5μg，1.25M CaCl
2 250μl，H
2O 1ml，总体积为1.25ml；在另一个管里添加与质粒复合物等体积的2×HBS溶液，将质粒复合物加入2×HBS溶液中，边加质粒复合物边涡旋震荡20s，得到混合物。轻柔地将混合物沿着边加入到ECO细胞培养皿中，37℃培养6h，去除培养基，重新加入预热的新鲜培养基。
3、病毒液的获得
转染48h后收集上清并用0.45μm滤器过滤后，得到病毒液，分装保存于-80℃。将由重组逆转录病毒载体S15-CAR-CD27获得的逆转录病毒液记作S15-CAR-CD27病毒液。将由重组逆转录病毒载体S15-CAR获得的逆转录病毒液记作S15-CAR病毒液。将由对照逆转录病毒载体获得的逆转录病毒液记作对照逆转录病毒液。
4、产毒细胞株的建立
将步骤3获得的逆转录病毒液感染PG13细胞(ATCC，CRL-10686)，感染两天后，用EGFR抗体(Biolegend)和MACS Anti-APC/PE Micro beads(美天旎，货号为130-090-855)对CAR表达阳性的细胞进行富集，得到富集后的细胞。取一部分富集后的细胞用流式检测CAR的表达效率，另取一部分富集后的细胞稀释成单细胞，铺至96孔板，将在96孔板培养后第5天的上清作为逆转录病毒液，进一步通过感染HT1080细胞，流式测定病毒滴度。筛选出96孔板中病毒滴度最高的三个细胞株，接种至24孔板中继续培养，进行二次筛选。继续用培养后第5天的上清作为逆转录病毒液，感染HT1080细胞，流式测定病毒滴度，选择病毒滴度最高的细胞作为稳产株，在液氮中长期保存。利用此细胞株可以大规模制备病毒上清用于基因转导制备CAR-T细胞。
三、CAR-T细胞的制备
1、复苏冻存的健康人外周血单个核细胞(PBMC)，用含10％FBS的RPMI-1640完全培养基调整细胞密度为(1-2)×10
6个/ml。
2、用Ficoll分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)收集PBMC，采用磁珠法从PBMC中分离获得较纯的CD3
+T细胞，按磁珠:CD3
+细胞体积比为3:1 的比例加入临床级Dynabeads Human T Expander CD3/CD28磁珠(Invitrogen)活化T细胞。
3、T细胞活化后第二天，用浓度为15μg/ml的Retronectin溶液(Takara)包被含有CD3
+T细胞的6孔板，6孔板每孔加入1.2ml Retronectin溶液，避光，4℃过夜备用。
4、T细胞活化培养两天后，取出包被retronectin的6孔板，吸弃包被液，加入PBS洗板一次。
5、将步骤二制备的逆转录病毒液(病毒滴度最高的产毒细胞株培养上清)加入孔内，每孔加5-6ml，32℃、2000×g离心2h，弃未结合的病毒上清液，每孔加入3ml含hIL-2(上海华新生物高技术有限公司)(500U/ml)的新鲜RPMI-1640完全培养基的T细胞培养液，初始细胞密度大约为2×10
6个/ml，继续培养1天。
6、细胞感染后，每天观察细胞的密度，适时补加含hIL-2(100U/ml)的新鲜RPMI-1640完全培养基的T细胞培养液，细胞密度控制在5×10
5个/ml，便于细胞扩增。
收集感染病毒液72小时后的T细胞，得到感染逆转录病毒的CAR-T细胞。将感染S15-CAR-CD27病毒液的T细胞记作S15 CAR-CD27 T细胞。将感染S15-CAR病毒液的T细胞记作S15 CAR T细胞。
按照上述步骤，将逆转录病毒液替换为等体积PBS溶液或对照逆转录病毒液，分别得到NO CAR T细胞或CTR CAR T细胞。
四、流式细胞仪检测感染后T淋巴细胞的比例及CAR基因的表达水平
由于CAR基因中带有EGFRt基因，通过检测EGFRt表达水平来反映CAR基因的表达水平。以步骤三获得的S15 CAR-CD27 T细胞、S15 CAR T细胞、CTR CAR T细胞及No CAR T细胞为供试细胞，采用FACS方法通过EGFR抗体检测EGFRt表达水平，具体步骤如下：用FACS缓冲液(含2％(体积分数)FBS的PBS溶液)将供试细胞洗涤1次后弃上清，加入FITC标记的EGFR抗体(Biolegend)避光30min后再用FACS缓冲液洗涤，重悬，得到重悬后的细胞。流式细胞仪检测重悬后的细胞FITC的荧光强度。
结果如图2所示。结果显示：使用步骤二制备得到的逆转录病毒感染T细胞3天后，CD4
+T细胞中EGFR(CAR)的阳性率在50％-80％之间，CD8
+T细胞中EGFR(CAR)的阳性率在30％-70％之间。
五、流式细胞仪检测感染后T淋巴细胞的功能指标
1、IFNγ表达水平的检测
IFNγ是反映T淋巴细胞功能的重要指标，细胞内IFNγ的含量越高，证明T细胞的活性程度越高。以步骤三获得的S15 CAR-CD27 T细胞、S15 CAR T细胞、CTR CAR T细胞为供试细胞，通过胞内细胞因子染色法检测细胞内IFNγ的表达水平，以检测T细胞的活化程度。具体步骤如下：
将S15 CAR-CD27 T细胞、S15 CAR T细胞、CTR CAR T细胞分别与人脑胶质瘤细胞U87-MG(ATCC)按细胞个数比为1:1的比例在DMEM培养基中共同培养(每孔中含有2×10
5个U87-MG)，向共培养体系中加入Golgi Plug试剂(BD购买)，6小时后收集细胞。将收集后的细胞先进行细胞表面染色，然后进行胞内染色和流式细胞仪检测。
结果如图3所示。结果显示：与CTR CAR T细胞相比，S15 CAR T细胞和S15 CAR-CD27 T细胞在与靶细胞共培养后，IFNγ的表达水平显著增强。尤其是CD8
+T细胞亚群(细胞毒性T细胞)，IFNγ的阳性率超过50％。
2、CD107a表达水平的检测
溶酶体相关膜蛋白l(CD107a)是囊泡膜蛋白的主要成分。T细胞活化后，会分化成为细胞毒性T细胞(Cytotoxic T-lymphocyte，CTL细胞)，CTL细胞的重要特征是胞浆内含有高浓度以囊泡形式存在的细胞毒性颗粒。CTL细胞和NK细胞杀伤靶细胞时，毒性颗粒将到达细胞膜并与细胞膜融合(此时CD107a分子会被转运到细胞膜表面)，引起颗粒内容物释放，最终导致靶细胞的死亡。因此，CD107a分子是CTL细胞脱颗粒的一种敏感标志，与细胞毒活性直接相关，通过流式细胞仪检测CD107a的表达水平，以反映T细胞杀伤活性水平。具体步骤如下：
将S15 CAR-CD27 T细胞、S15 CAR T细胞、CTR CAR T细胞分别与人脑胶质瘤细胞U87-MG(ATCC)按细胞个数比为1:1的比例在DMEM培养基中共同培养(每孔中含有2×10
5个U87-MG)，向共培养体系中加入APC标记的抗CD107a抗体(Biolegend)培养1小时后，再加入Golgi Stop试剂(BD)继续培养3小时，收集细胞。将收集后的细胞进行表面染色和流式细胞仪检测。
结果如图4所示。结果显示：与CTR CAR T细胞相比，S15 CAR T和S15 CAR-CD27 T细胞在与靶细胞共培养后，CD107a的表达水平显著增强。尤其是CD8
+T细胞亚群(细胞毒性T细胞)，CD107a的阳性率达到80％-90％。
实施例2、CFSE标记法检测S15-CAR-CD27基因修饰的CAR-T细胞对肿瘤细胞特异性杀伤作用
CFSE(CFDA-SE)是一种可对活细胞进行荧光标记的细胞染色试剂，能够轻易穿透细胞膜，在活细胞内与胞内蛋白共价结合，水解后释放出绿色荧光。可以利用CFSE标记活细胞的原理对肿瘤细胞进行标记和定量，从而检测CAR-T细胞对肿瘤靶细胞的杀伤效率。具体方法为：靶细胞等量分成两个组，调整至相同的细胞密度。分别用低浓度和高浓度CFSE染色，其中高浓度染色的靶细胞与不染色的免疫细胞按照一定比例共培养。孵育一段时间后，将高浓度染色的靶细胞管(连同免疫细胞)与低浓度染色的靶细胞管等量混合。最后，通过比较CFSE低浓度标记组和CFSE高浓度标记组的靶细胞百分比，计算CAR T细胞对靶细胞的杀伤率。具体步骤如下：
1、将对数期的U87-MG细胞用胰酶消化，完全培养基中止。吹打细胞，并转移到15ml离心管中，用PBS洗2遍。
2、300-500g离心1-5min，去上清。用PBS重悬细胞，调整细胞密度至(1-2)×10
7个/ml。
3、将细胞密度为(1-2)×10
7个/ml的U87-MG细胞悬液等量分成两份，一份记作CFSE高标记细胞，另一份记作CFSE低标记细胞。CFSE低标记细胞用低浓度CFSE(0.5μM)染色，CFSE高标记细胞用高浓度CFSE(5μM)标记。染色方法具体如下：在管内按照既定浓度加入CFSE染料(Invitrogen)，避光37℃孵育10min。
4、加入至少2倍体积冷的完全培养基终止标记，300-500g离心5min。
5、去上清，收集细胞沉淀，用完全培养基洗2遍。
6、将染色的U87-MG接种至96孔板中，CFSE高标记组(CFSE高标记细胞+T细胞)：每个孔接种U87-MG细胞(5×10
4个/100μl)，加入不同数量的CAR-T细胞(S15 CAR-CD27 T细胞、S15 CAR T细胞或CTR CAR T细胞)，使CAR-T细胞与U87-MG细胞的个数比分别为1:1、1:3、1:9、1:27；CFSE低标记组(只有CFSE低标记细胞)：每个孔接种U87-MG细胞(5×10
4个/100μl)单独培养，并用完全培养基补足至相同体积。同时设置未与T细胞共培养的CFSE高标记细胞孔作为对照组。
7、37℃孵育6小时后，CFSE高标记组与CFSE低标记组所有细胞，按1:1混合，并将混合后的细胞记作实验组混合细胞。同时收集对照组(只有CFSE高标记细胞)与CFSE低标记组所有细胞，按1:1混合，并将混合后的细胞记作对照组混合细胞。
8、流式上机，检测各个组FITC单通道的荧光值(图2)。
9、靶细胞裂解率分析：流式上机后，应检测出两个FITC阳性峰，分别是CFSE高标记和低标记细胞峰，测得CFSE高标记组和标记组靶细胞比例。然后按照以下公式计算T细胞对靶细胞杀伤率(％)：
T细胞对靶细胞的杀伤率(％)＝100％-[(实验组混合细胞中CFSE高标记细胞占比％/实验组混合细胞中CFSE低标记细胞占比％)/(对照组混合细胞中CFSE高标记细胞占比％/对照组混合细胞中CFSE低标记细胞占比％)]×100％。
例如，测得实验组混合细胞中CFSE高标记细胞占比42.5％，CFSE低标记细胞占比57.5％；测得对照组混合细胞中CFSE高标记细胞占比49.5％，CFSE低标记细胞占比51.5％，那么特异性裂解率(％)＝100％-(42.5％/57.5％)/(49.5％/51.5％)×100％。
实验结果如图5和表2所示。结果显示：使用S15 CAR-CD27 T细胞和靶细胞U87-MG按照不同效靶比共培养后，在效靶比为1:1时，细胞裂解率达到80％以上；效靶比为1:27时，细胞裂解率仍有20％左右。
表2、CAR T细胞的细胞裂解率(％)
实施例3、肿瘤移植模型检测S15-CAR-CD27基因修饰的CAR-T细胞在动物体内的肿瘤杀伤作用
实验材料：5-6周龄、体重为18-22g的B-NDG重度联合免疫缺陷小鼠(百奥赛图基因生物技术有限公司)。
实验分组：将实验材料随机分为3个实验组，每组各5只小鼠。每组处理方法具体如下：
S15 CAR-CD27 T：将B-NDG重度联合免疫缺陷小鼠尾静脉接种U87-MG肿瘤细胞溶液(溶剂为PBS)，接种量为0.3ml(含2×10
6个肿瘤细胞)。接种肿瘤细胞5天后，在小鼠尾静脉注射实施例1制备的S15 CAR-CD27 T细胞溶液(溶剂为PBS)，S15 CAR-CD27 T细胞注射量为0.2ml(含5×10
6个S15 CAR-CD27 T细胞)。
S15 CAR T：将B-NDG重度联合免疫缺陷小鼠尾静脉接种U87-MG肿瘤细胞溶液(溶剂为PBS)，接种量为0.3ml(含2×10
6个肿瘤细胞)。接种肿瘤细胞5天后，在小鼠尾静脉注射实施例1制备的S15 CAR T细胞溶液(溶剂为PBS)，S15 CAR T细胞注射量为0.2ml(含5×10
6个S15 CAR T细胞)。
CTR CAR T：将B-NDG重度联合免疫缺陷小鼠尾静脉接种U87-MG肿瘤细胞溶液(溶剂为PBS)，接种量为0.3ml(含2×10
6个肿瘤细胞)。接种肿瘤细胞5天后，在小鼠尾静脉注射实施例1制备的CTR CAR T细胞溶液(溶剂为PBS溶液)，CTR CAR T细胞注射量为0.2ml(含5×10
6个CTR CAR T细胞)。
实验方法：在注射CAR-T细胞之后的42天之内，每三天测量一次小鼠肿瘤直径。统计各个时间点的肿瘤直径并作图。在注射CAR-T细胞之后的90天之内，统计小鼠的存活数量，绘制存活曲线。
结果如图6和图7所示。结果显示：与S15 CAR-T对照组相比，S15 CAR-CD27 T组小鼠体内的U87-MG细胞残留明显减少。说明S15 CAR-CD27 T细胞杀伤肿瘤的效果更好。
实施例4、BCMA-CAR-CD27基因修饰的CAR-T细胞的制备
一、逆转录病毒载体的构建
1、BCMA-CAR-CD27基因序列的设计及合成
BCMA-CAR-CD27基因序列依次包括人CD8先导肽的编码基因序列、BCMA scFv的编码基因序列、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列、人4-1BB胞内区的编码基因序列、人CD3ζ胞内区的编码基因序列、P2A肽的编码基因序列、oCD27的编码基因序列。
BCMA-CAR-CD27基因序列如SEQ ID NO.5所示，其中，人CD8先导肽的编码基因序列为SEQ ID NO.5第1-63位，BCMA scFv的编码基因序列为SEQ ID NO.5第64-792位、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列为SEQ ID NO.5第793-999位、人4-1BB胞内区的编码基因序列为SEQ ID NO.5第1000-1140位、人CD3ζ胞内区的编码基因序列为SEQ ID NO.5第1141-1476位、P2A肽的编码基因序列为SEQ ID NO.5第1477-1554位、oCD27的编码基因序列为SEQ ID NO.5第1555-2337位。BCMA-CAR-CD27基因序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。BCMA-CAR-CD27基因序列中的主要元件结构示意图如图8所示。
BCMA-CAR基因序列依次包括人CD8先导肽的编码基因序列、BCMA scFv的编码基因序列、人CD8铰链跨膜区的编码基因序列、人4-1BB胞内区的编码基因序列、人CD3ζ胞内区的编码基因序列。
委托擎科生物科技有限公司合成BCMA-CAR-CD27基因序列和BCMA-CAR基因序列。将合成的基因序列克隆在pUC57载体上进行测序鉴定。
2、逆转录病毒载体的构建
将SEQ ID NO.5所示的BCMA-CAR-CD27基因序列插入逆转录病毒载体(MP71)的NotI和EcoRI酶切位点间，且保持逆转录病毒载体(MP71)的其他序列不变，得到重组逆转录病毒载体BCMA-CAR-CD27。
将BCMA-CAR基因序列插入逆转录病毒载体(MP71)的NotI和EcoRI酶切位点间，且保持逆转录病毒载体(MP71)的其他序列不变，得到重组逆转录病毒载体BCMA-CAR。BCMA-CAR全长基因序列如SEQ ID NO:5第1-1476位多核苷酸所示。
将实施例1步骤一中的对照逆转录病毒载体作为非靶向BCMA的对照逆转录病毒载体。
二、逆转录病毒包装和产毒株的建立
将步骤一中制备得到的重组逆转录病毒载体BCMA-CAR-CD27和BCMA-CAR及对照逆转录病毒载体，按照以下方法分别包装得到两种逆转录病毒及对照逆转录病毒：
1、包装细胞的培养
每10cm细胞培养皿中添加0.6×10
6个Phoenix Ecotropic(ECO)细胞(ATCC，CRL-3214)(小于20代，不过分长满)和10ml的DMEM培养基，充分混匀细胞，37℃培养过夜。
2、包装细胞的转染
待ECO细胞融合度达到90％左右进行转染；在一个管中添加目的质粒 12.5μg，1.25M CaCl
2 250μl，H
2O 1ml，总体积为1.25ml；在另一个管里添加与质粒复合物等体积的2×HBS溶液，将质粒复合物加入2×HBS溶液中，边加质粒复合物边涡旋震荡20s，得到混合物。轻柔地将混合物沿着边加入到ECO细胞培养皿中，37℃培养6h，去除培养基，重新加入预热的新鲜培养基。
3、病毒液的获得
转染48h后收集上清并用0.45μm滤器过滤后，得到病毒液，分装保存于-80℃。将由重组逆转录病毒载体BCMA-CAR-CD27获得的逆转录病毒液记作BCMA-CAR-CD27病毒液。将由重组逆转录病毒载体BCMA-CAR获得的逆转录病毒液记作BCMA-CAR病毒液。
4、产毒细胞株的建立
将步骤3获得的逆转录病毒液感染PG13细胞(ATCC，CRL-10686)，感染两天后，用MACS Anti-APC/PE Micro beads(美天旎，货号为130-090-855)对CAR表达阳性的细胞进行富集，得到富集后的细胞。取一部分富集后的细胞用流式检测CAR的表达效率，另取一部分富集后的细胞稀释成单细胞，铺至96孔板，将在96孔板培养后第5天的上清作为逆转录病毒液，进一步通过感染HT1080细胞，流式测定病毒滴度。筛选出96孔板中病毒滴度最高的三个细胞株，接种至24孔板中继续培养，进行二次筛选。继续用培养后第5天的上清作为逆转录病毒液，感染HT1080细胞，流式测定病毒滴度，选择病毒滴度最高的细胞作为稳产株，在液氮中长期保存。利用此细胞株可以大规模制备病毒上清用于基因转导制备CAR-T细胞。
三、逆转录病毒感染人的T细胞
1、复苏冻存的健康人外周血单个核细胞(PBMC)，用含10％FBS的RPMI-1640完全培养基调整细胞密度为(1-2)×10
6个/ml。
2、用Ficoll分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)收集PBMC，采用磁珠法从PBMC中分离获得较纯的CD3
+T细胞，按磁珠:CD3
+细胞体积比为3:1的比例加入临床级Dynabeads Human T Expander CD3/CD28磁珠(Invitrogen)活化T细胞。
3、T细胞活化后第二天，用浓度为15μg/ml的Retronectin溶液(Takara)包被含有CD3
+T细胞的6孔板，6孔板每孔加入1.2ml Retronectin溶液，避光，4℃过夜备用。
4、T细胞活化培养两天后，取出包被retronectin的6孔板，吸弃包被液，加入PBS洗板一次。
5、将步骤二制备的逆转录病毒液(病毒滴度最高的产毒细胞株培养上清)加入孔内，每孔加5-6ml，32℃、2000×g离心2h，弃未结合的病毒上清液，每孔加入3ml含hIL-2(上海华新生物高技术有限公司)(500U/ml)的新鲜RPMI-1640完全培养基的T细胞培养液，初始细胞密度大约为2×10
6个/ml，继续培养1天。
6、细胞感染后，每天观察细胞的密度，适时补加含hIL-2(100U/ml)的新鲜RPMI-1640完全培养基的T细胞培养液，细胞密度控制在5×10
5个/ml，便于细胞扩增。
收集感染病毒液72小时后的T细胞，得到感染逆转录病毒的CAR-T细胞。将感染BCMA-CAR-CD27病毒液的T细胞记作BCMA CAR-CD27 T细胞。将感染BCMA-CAR病毒液的T细胞记作BCMA CAR T细胞。
按照上述步骤，将逆转录病毒液替换为等体积PBS溶液或对照逆转录病毒液，分别得到CTR T细胞或CTR CAR T细胞(记作Exb T细胞)。
四、流式细胞仪检测感染后T淋巴细胞的比例及表面CAR蛋白和CD27蛋白的表达
1、CAR阳性T淋巴细胞的比例和CAR蛋白的表达
由于抗BCMA单链抗体的轻链是κ链能结合Protein L，因此用FACS方法通过检测与CAR-T细胞结合的生物素标记的Protein L来说明CAR阳性T淋巴细胞的比例和CAR蛋白的表达。具体步骤如下：
分别离心收集感染后72小时的步骤三制备得到的两种CAR-T细胞和CTR T细胞(对照组)，先用含1％BSA的PBS溶液洗涤1次后弃上清，然后加入生物素(biotin)标记的protein L抗体(Biolegend)避光30min后用含1％BSA的PBS溶液洗涤，重悬；再加入PE标记的亲和素(Streptavidin)(Sigma)避光10min后用含1％BSA的PBS溶液洗涤，重悬；最后流式细胞仪检测PE的荧光强度。
结果如图9所示。结果显示：使用步骤三制备得到的逆转录病毒感染T细胞3天后，CD4
+T细胞和CD8
+T细胞中Protein L(CAR)的阳性率均达到80％。
2、CD27表达水平的检测
用流式细胞术检测细胞表面CD27的表达水平。具体步骤如下：分别离心收集感染后72小时的步骤三制备得到的两种CAR-T细胞和CTR T细胞(对照组)。
结果如图10所示。结果显示：BCMA CAR-CD27 T细胞中的CD27表达水平显著高于CTR T和BCMA CAR T细胞。说明CD27确实在CAR-T细胞表面表达。
实施例5、CFSE标记法检测BCMA-CAR-CD27基因修饰的CAR-T细胞对肿瘤细胞特异性杀伤作用
按照实施例2中的方法，将效应细胞替换为实施例4中制备的BCMA CAR-CD27T细胞、BCMA CAR T细胞和CTR T细胞，靶细胞替换为人多发性骨髓瘤细胞RPMI8226，且保持其他步骤不变，检测BCMA-CAR-CD27基因修饰的CAR-T细胞对肿瘤细胞特异性杀伤作用。
结果如图11和表3所示。结果显示：使用BCMA CAR-CD27 T细胞和靶细胞 RPMI-8226按照不同效靶比共培养后，在效靶比3:1时，细胞裂解率达到80％以上；效靶比1:3时，细胞裂解率仍有20％左右。
表3、CAR T细胞的细胞裂解率(％)
实施例6、肿瘤移植模型检测BCMA-CAR-CD27基因修饰的CAR-T细胞在动物体内的肿瘤杀伤作用
实验材料：5-6周龄、体重为18-22g的B-NDG重度联合免疫缺陷小鼠(百奥赛图基因生物技术有限公司)。
实验分组：将实验材料随机分为4个实验组，每组各6只小鼠。每组处理方法具体如下：
BCMA CAR-CD27 T：将B-NDG重度联合免疫缺陷小鼠尾静脉接种带有荧光素标记的人淋巴瘤细胞Daudi-Luc(上海美轩生物科技有限公司，MXC193)溶液(溶剂为PBS)，接种量为0.3ml(含2×10
6个肿瘤细胞)。接种肿瘤细胞5天后，在小鼠尾静脉注射实施例4制备的BCMA CAR-CD27 T细胞溶液(溶剂为PBS)，BCMA CAR-CD27 T细胞注射量为0.2ml(含5×10
6个BCMA CAR-CD27 T细胞)。
BCMA CAR T：将B-NDG重度联合免疫缺陷小鼠尾静脉接种荧光素标记的人淋巴瘤细胞Daudi-Luc溶液(溶剂为PBS)，接种量为0.3ml(含2×10
6个肿瘤细胞)。接种肿瘤细胞5天后，在小鼠尾静脉注射实施例4制备的BCMA CAR T细胞溶液(溶剂为PBS)，BCMA CAR T细胞注射量为0.2ml(含5×10
6个BCMA CAR T细胞)。
Exb T：将B-NDG重度联合免疫缺陷小鼠尾静脉接种荧光素标记的人淋巴瘤细胞Daudi-Luc溶液(溶剂为PBS)，接种量为0.3ml(含2×10
6个肿瘤细胞)。接种肿瘤细胞5天后，在小鼠尾静脉注射实施例4制备的Exb T细胞溶液(溶剂为PBS溶液)，Exb T细胞注射量为0.2ml(含5×10
6个Exb T细胞)。
实验方法：分别在注射CAR-T细胞7天、14天和21天后，在小鼠腹腔注射3mg的D-luciferin进行钠盐成像，观察小鼠体内残留肿瘤细胞的数量，统计荧光素强度(光子密度)。
结果如图12所示。结果显示：与BCMA CAR T相比，注射BCMA CAR-CD27 T的小鼠体内的人淋巴瘤细胞残留明显减少。说明BCMA CAR-CD27 T细胞杀伤肿瘤的效果更好。
工业应用
1)本发明首次将CD27作为CAR基因的共刺激信号，并且以非偶联的方式在CAR之外激活CD27信号通路。根据已有研究和过往经验，CAR设计对于共刺激受体的选择更倾向于使用CD28、4-1BB或是OX40的胞内信号结构域。仅使用共刺激受体的信号结构域而不使用全长序列的主要原因，一方面是受到CAR整体长度的限制，另一方面是将共刺激信号域与ITAM信号域串联表达更有利于第二信号的持续激活。然而，随后的研究表明，持续激活某些共刺激配体，例如CD28，更容易引起T细胞耗竭，影响CAR-T细胞治疗效果。事实上，T细胞接收共刺激信号的类型以及时间节点对于T细胞是否完全激活非常关键。例如，CD27和CD28都在原始T细胞中高表达，而终末分化的T细胞中表达较低，说明二者可能在T细胞反应的早期发挥重要功能。相反，其他共刺激受体，如CD137、CD134等在已激活的T细胞中高表达，它们对于抵抗凋亡引起的T细胞耗竭具有重要作用。强行激活其中任何一种共刺激信号都不能完全替代其他共刺激信号的功能。基于这样的理念，有研究将两种或以上的共刺激受体的胞内信号域串联使用，也就是第三代CAR的设计原理。但是，最近的研究结果显示，第三代CAR的抗肿瘤效果未能达到预期，甚至不如第二代CAR，其原因可能由于多个共刺激信号域的串联表达造成多种信号通路相互冲突，不能有效实现信号传递。本发明申请人经过大量的前期研究发现，激活CAR-T细胞中的CD27通路，能显著促进抗原刺激后T细胞向效应T细胞和记忆T细胞的分化，对于CAR-T细胞在人体内的持续存活和二次应答至关重要。另外，在CAR设计中将两种共刺激信号解除偶联，使其在抗原存在的情况下分别激活，可以显著增强CAR-T细胞的应答水平。具体实现方式是在靶向Siglec-15的CAR的C末端增加基因优化的人全长CD27基因片段，并用P2A肽分隔；表达含有4-1BB共刺激结构域的CAR序列的同时表达全长CD27，在细胞内蛋白酶的作用下切割P2A肽，释放游离的CD27；游离的CD27被转运到细胞表面，在这里接触CD70等配体，实现CD27信号通路的激活。该设计的最大特色是实现4-1BB和CD27两种共刺激信号通路的非偶联式激活。
2)本发明首次以Siglec-15为靶点，开发了靶向Siglec-15的CAR-T治疗产品。Siglec-15作为一种新型的T细胞负性调节剂，不仅在包括膀胱癌、肝癌、肺癌、肾癌、直肠癌、子宫内膜癌以及甲状腺癌等众多类型的实体肿瘤细胞高表达，也在肿瘤微环境免疫抑制细胞-肿瘤相关巨噬细胞(TAM)中高表达，本发明制备的靶向Siglec-15的CAR-T治疗产品可以特异地靶向并杀死实体肿瘤细胞，也可以通过靶向去除肿瘤相关巨噬细胞，解除肿瘤微环境中主要的免疫抑制细胞对T细胞介导的特异性免疫应答，从而提高机体的抗肿瘤免疫反应。因此，本发明的方法可以用于制备治疗实体肿瘤的CAR-T细胞。
3)除了BCMA和Siglec-15，本发明构建的CAR也可以应用于靶向其他肿瘤相关抗原的CAR-T细胞的制备，从而治疗不同种类的实体肿瘤和血液肿瘤。
4)本发明用嵌合抗原受体基因修饰T淋巴细胞的转导方法是基于逆转录病毒转导方法，通过筛选稳定的产毒株，收集产毒株上清进行T细胞转导。该方法具有转导效率高，外源基因能够稳定表达，批次稳定性高且可以缩短临床用转导T细胞用病毒的制备时间等优点。
Claims (45)
- 一种嵌合抗原受体，其依次包括抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体、人铰链跨膜区、人胞内信号域、自切割肽和人CD27全长；所述人胞内信号域包括人胞内共刺激信号结构域和人胞内信号传导结构域。
- 根据权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述肿瘤细胞表面抗原选自如下肿瘤细胞表面抗原中的至少一种：CD19、CD20、CD22、CD30、CD33、CD38、BCMA、Siglec-15、CS1、CD138、CD123/IL3Rα、c-Met、gp100、MUC1、IGF-I、EPCAM、EGFR/EGFRvIII、HER2、PD1、CTLA4、IGF1R、mesothelin、PSMA、WT1、ROR1、CEA、NY-ESO-1、GD-2、MAGE A3、GPC3和Claudin18.2。
- 根据权利要求1或2所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述肿瘤细胞表面抗原为Siglec-15。
- 根据权利要求1-3任一所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述肿瘤细胞表面抗原为BCMA。
- 根据权利要求1-4任一所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述人铰链跨膜区为人CD8铰链跨膜区、人CD28铰链跨膜区或人CD4铰链跨膜区。
- 根据权利要求1-5任一所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述人铰链跨膜区为人CD8铰链跨膜区。
- 根据权利要求1-6任一所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述人胞内共刺激信号结构域选自如下分子的胞内区中的任一种：CD28、4-1BB、CD134、CD30、CD40、PD-1、LFA-1、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3。
- 根据权利要求1-7任一所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述人胞内共刺激信号结构域为人4-1BB胞内区。
- 根据权利要求1-8任一所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述人胞内信号传导结构域选自如下分子的胞内区中的任一种：CD3ζ、CD3 gamma、CD3 delta、CD3 epsilon、common FcR gamma、FcR beta、CD79a、CD79b、Fc gamma RIIa、DAP10、DAP12。
- 根据权利要求1-9任一所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述人胞内信号传导结构域为人CD3ζ胞内区。
- 根据权利要求1-10任一所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述自切割肽为P2A肽。
- 根据权利要求1-11任一所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体依次包括抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体、人铰链跨膜区、人胞内共刺激信号结构域、人胞内信号传导结构域、自切割肽和人CD27全长。
- 根据权利要求1-12任一所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体依次包括先导肽、抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体、人铰链跨膜区、 人胞内共刺激信号结构域、人胞内信号传导结构域、自切割肽和人CD27全长。
- 根据权利要求13所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述先导肽为人CD8先导肽。
- 根据权利要求1-14任一所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体还包括EGFRt蛋白。
- 根据权利要求15所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体依次包括先导肽、抗肿瘤细胞表面抗原的单链抗体、人CD8铰链跨膜区、人4-1BB胞内区、人CD3ζ胞内区、自切割肽、信号肽、EGFRt蛋白、自切割肽和人CD27全长。
- 根据权利要求16所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述信号肽为CSF2Ra信号肽。
- 根据权利要求1-17任一所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体为如下A1)-A3)中的任一种：A1)氨基酸序列是SEQ ID No.2或SEQ ID No.6所示的蛋白质；A2)将SEQ ID No.2或SEQ ID No.6所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
- 与权利要求1-18任一所示的嵌合抗原受体相关的生物材料，为下述B1)至B8)中的任一种：B1)编码权利要求1-18任一所述的嵌合抗原受体的核酸分子；B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系；B6)含有B2)所述表达盒的细胞系；B7)含有B3)所述重组载体的细胞系；B8)含有B4)所述重组载体的细胞系。
- 根据权利要求19所述的生物材料，其特征在于：B1)所述核酸分子为如下C1)-C3)任一所示的基因：C1)其编码序列是SEQ ID No.1或SEQ ID No.5所示的DNA分子；C2)与C1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1-18任一所述的嵌合抗原受体的DNA分子；C3)在严格条件下与C1)或C2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1-18任一所述的嵌合抗原受体的DNA分子。
- 权利要求1-18任一所述的嵌合抗原受体或权利要求19或20所述的生物材料在生产或制备CAR-T细胞中的应用。
- 一种CAR-T细胞的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1-18任一所 述的嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞中并使所述编码基因得到表达，得到CAR-T细胞。
- 根据权利要求22所述的方法，其特征在于：所述嵌合抗原受体的编码基因通过慢病毒表达系统或逆转录病毒表达系统导入T细胞中。
- 根据权利要求22或23所述的方法，其特征在于：所述将权利要求1-18任一所述的嵌合抗原受体的编码基因导入T细胞中并使所述编码基因得到表达的方法为方法(一)或方法(二)：所述方法(一)包括如下步骤：用逆转录病毒感染T细胞；所述逆转录病毒是将重组逆转录病毒载体转染逆转录病毒包装细胞，然后进行细胞培养后得到的；所述重组逆转录病毒载体为将上述嵌合抗原受体的编码基因插入逆转录病毒载体中得到的；所述方法(二)包括如下步骤：用慢病毒感染T细胞；所述慢病毒是将重组慢病毒载体转染慢病毒包装细胞，然后进行细胞培养后得到的；所述慢病毒载体为将上述嵌合抗原受体的编码基因插入慢病毒载体中得到的。
- 根据权利要求24所述的方法，其特征在于：所述逆转录病毒载体为逆转录病毒载体(MP71)。
- 按照权利要求22-25任一所述的方法制备得到的CAR-T细胞。
- 权利要求24中所述的逆转录病毒或重组逆转录病毒载体或慢病毒或重组慢病毒载体。
- 权利要求26所述的CAR-T细胞或权利要求27所述的逆转录病毒或重组逆转录病毒载体或慢病毒或重组慢病毒载体在如下D1)-D4)中任一种中的应用：D1)制备治疗或辅助治疗肿瘤的产品；D2)治疗或辅助治疗肿瘤；D3)制备杀伤肿瘤细胞的产品；D4)杀伤肿瘤细胞。
- 根据权利要求28所述的应用，其特征在于：所述肿瘤包括实体肿瘤或血液肿瘤。
- 根据权利要求29所述的应用，其特征在于：所述实体肿瘤为Siglec-15阳性的实体肿瘤。
- 根据权利要求30所述的应用，其特征在于：所述Siglec-15阳性的实体肿瘤包括脑胶质瘤、黑色素瘤、膀胱癌、肝癌、肺癌、肾癌、直肠癌、子宫内膜癌和甲状腺癌。
- 根据权利要求29所述的应用，其特征在于：所述血液肿瘤为BCMA阳性的血液肿瘤。
- 根据权利要求32所述的应用，其特征在于：所述BCMA阳性的血液肿瘤包括多发性骨髓瘤。
- 一种治疗或辅助治疗肿瘤或杀伤肿瘤细胞的产品，其活性成分为权利要求1-18任一所述的嵌合抗原受体或权利要求19或20所述的生物材料或权利要求26所述的CAR-T细胞或权利要求27所述的逆转录病毒或重组逆转录病毒载体或慢病毒或重组慢病毒载体。
- 根据权利要求34所述的产品，其特征在于：所述肿瘤包括实体肿瘤或血液肿瘤。
- 根据权利要求35所述的产品，其特征在于：所述实体肿瘤为Siglec-15阳性的实体肿瘤。
- 根据权利要求36所述的产品，其特征在于：所述Siglec-15阳性的实体肿瘤包括脑胶质瘤、黑色素瘤、膀胱癌、肝癌、肺癌、肾癌、直肠癌、子宫内膜癌和甲状腺癌。
- 根据权利要求35所述的产品，其特征在于：所述血液肿瘤为BCMA阳性的血液肿瘤。
- 根据权利要求38所述的产品，其特征在于：所述BCMA阳性的血液肿瘤包括多发性骨髓瘤。
- 一种治疗或辅助治疗肿瘤的方法，包括如下步骤：给受试者施用权利要求26所述的CAR-T细胞进行治疗或辅助治疗肿瘤。
- 根据权利要求40所述的方法，其特征在于：所述肿瘤包括实体肿瘤或血液肿瘤。
- 根据权利要求41所述的方法，其特征在于：所述实体肿瘤为Siglec-15阳性的实体肿瘤。
- 根据权利要求42所述的方法，其特征在于：所述Siglec-15阳性的实体肿瘤包括脑胶质瘤、黑色素瘤、膀胱癌、肝癌、肺癌、肾癌、直肠癌、子宫内膜癌和甲状腺癌。
- 根据权利要求41所述的方法，其特征在于：所述血液肿瘤为BCMA阳性的血液肿瘤。
- 根据权利要求44所述的方法，其特征在于：所述BCMA阳性的血液肿瘤包括多发性骨髓瘤。
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