JP2023545907A - 新規共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体及びその使用 - Google Patents

Abstract

【要約】リガンド結合ドメインと、膜貫通ドメインと、ＮＫ活性化受容体又はそのリガンドの細胞内ドメインを含む共刺激ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むキメラ抗原受容体を提供する。また、このようなキメラ抗原受容体を含む改変免疫細胞、及び例えば癌、自己免疫疾患、感染などの疾患の治療におけるそれらの改変免疫細胞の使用も提供される。【選択図】図１

Description

本発明は免疫治療分野に属する。より具体的に、本発明は、新規共刺激ドメインを含むキメラ抗原受容体、このようなキメラ抗原受容体を含む改変免疫細胞及びその使用に関する。

近年、癌免疫治療技術が急速に発展し、特に、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）に関連する免疫療法は、血液腫瘍の治療において優れた臨床効果を奏する。ＣＡＲ－Ｔ細胞免疫療法は、Ｔ細胞をｉｎ ｖｉｖｏで遺伝子改変を行って、腫瘍抗原を認識できるようにさせ、所定数まで増殖した後、患者体内に再注入して癌細胞を殺すことによって、腫瘍を治療するという目的を達成するものである。

現在、技術の発展に伴い、四世代の異なるＣＡＲ構造が出てくる。第一世代のＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、例えばＣＤ３ζなどの一次シグナル伝達ドメインのみを含むので、ＣＡＲ付きの細胞（例えばＣＡＲ－Ｔ細胞）は、活性が低く、ｉｎ ｖｉｖｏでの生存時間が短い。第二世代のＣＡＲは、例えばＣＤ２８又は４－１ＢＢなどの共刺激ドメインを導入し、細胞が継続的に増殖できるようにして、抗腫瘍活性を高める。第三世代のＣＡＲは、２つの共刺激ドメイン（例えばＣＤ２８＋４－１ＢＢ）を含み、第四世代ＣＡＲは、サイトカイン又は共刺激リガンドが加入されてＴ細胞応答がさらに増強し、又は自殺遺伝子が加入されて需要の際にＣＡＲ－Ｔ細胞を自己破壊させる。現在の臨床研究で、依然としてほどんど第二世代のＣＡＲ構造を使用している。

しかし、ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、臨床応用において、例えば血液腫瘍の治療で腫瘍の再発が多く、固形腫瘍の治療で応答率が高くないなどのいくつかの問題がまだ存在し、これらは、複雑な腫瘍微小環境、ＣＡＲ－Ｔ細胞枯渇などの要素によって引き起される可能性がある。

故に、従来のＣＡＲＴ細胞療法を改善して、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＡＲ－Ｔ細胞の増殖を促進し、腫瘍微小環境の免疫抑制効果に抵抗し、腫瘍に対するＣＡＲ－Ｔ細胞療法の全体的な治療効果を高める必要がある。

故に、第１態様で、本発明は、リガンド結合ドメインと、膜貫通ドメインと、ＮＫ活性化受容体又はそのリガンドの細胞内ドメインを含む共刺激ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むキメラ抗原受容体を提供する。

一実施形態において、前記ＮＫ活性化受容体は、２Ｂ４、ＤＮＡＭ－１及びＬＦＡ－１から選択され、より好ましくは２Ｂ４である。

一実施形態において、前記ＮＫ活性化受容体のリガンドは、ＣＤ４８、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２又はＩＣＡＭ３から選択され、より好ましくはＣＤ１５５及びＩＣＡＭ－３である。

好ましい一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体に含まれる共刺激ドメインは、ＣＤ１５５、ＩＣＡＭ３及び２Ｂ４などのタンパク質から選択されるものの細胞内ドメインを含む。一実施形態において、前記ＣＤ１５５の細胞内ドメインは、配列番号２９で示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、ＩＣＡＭ３の細胞内ドメインは、配列番号２７で示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、２Ｂ４の細胞内ドメインは、配列番号３１で示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

一実施形態において、前記共刺激ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ、ＣＤ９４、ＬＴＢ、ＺＡＰ７０及びそれらの組み合わせ等のタンパク質から選択されるもののシグナル伝達ドメインを更に含む。好ましくは、前記共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７又はＣＤ２７８のシグナル伝達ドメイン又はそれらの組み合わせを更に含み、より好ましくは、ＣＤ２８及び／又はＣＤ１３７のシグナル伝達ドメインを更に含む。

一実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、抗体又はその抗原結合部分である。

一実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、免疫グロブリン分子、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、重鎖抗体、直線状抗体、ｓｄＡｂ又はナノ抗体から選択される。

一実施形態において、前記リガンド結合ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ４６、ＣＤ７０、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、ＡＦＰ、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＣＳ１、ＣＤ１３８、ＮＣＡＭ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌｏｏ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、Ｆｕｃｏｓｙｌ ＧＭｌ、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、Ｆｏｌａｔｅ受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ポッドプロテイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、前立腺特異的タンパク質、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ １、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ １、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、及び／又は病原体特異抗原、ビオチン化分子、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ及び／又は他の病原体によって発現される分子、並びに／或いはネオエピトープ又はネオ抗原から選択される１つ又は複数のターゲットに結合される。好ましくは、前記リガンド結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＭＵＣ１、ＡＦＰ、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＣＥＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２、ＥＧＦＲ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＧＤ２、ＮＫＧ２Ｄ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＳ１、ＢＣＭＡ、メソテリン及びそれらの任意の組み合わせから選択されるターゲットに結合される。

一実施形態において、前記膜貫通ドメインは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ζサブユニット、ＣＤ３εサブユニット、ＣＤ３γサブユニット、ＣＤ３δサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４等のタンパク質の膜貫通ドメインから選択される。

一実施形態において、前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄなどのタンパク質のシグナル伝達ドメインから選択され、好ましくは、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインである。

本発明は、上記した新規キメラ抗原受容体をコードする核酸分子と、前記核酸分子を含むベクターとを更に提供する。

第２態様で、本発明は、上記した新規キメラ抗原受容体、核酸分子又はベクターを含む改変免疫細胞をさらに提供する。

一実施形態において、前記改変免疫細胞において、共刺激ドメインとして用いられる対応の内因性ＮＫ活性化受容体又はリガンドの発現は、抑制され又はサイレンシングされる。好ましい一実施形態において、前記ＮＫ活性化受容体は２Ｂ４であり、前記ＮＫ活性化受容体のリガンドはＣＤ１５５又はＩＣＡＭ３である。

一実施形態において、前記改変免疫細胞は、ＣＤ５２、ＧＲ、ｄＣＫ、ＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子（例えばＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ）と、ＭＨＣ関連遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ）と、例えばＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＨＡＶＣＲ２、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２及びＧＵＣＹ１Ｂ３等の免疫チェックポイント遺伝子と、から選択される少なくとも１種類をさらに含む遺伝子の発現が抑制され又はサイレンシングされる。好ましくは、前記改変免疫細胞は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４から選択される少なくとも１種類をさらに含む遺伝子の発現が抑制され又はサイレンシングされる。

一実施形態において、前記改変免疫細胞は、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単核細胞、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞から選択される。好ましくは、前記Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、γδ－Ｔ細胞又はαβ－Ｔ細胞である。一実施形態において、免疫細胞は、例えば成体幹細胞、胚性幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞等の幹細胞から派生される。

一実施形態において、本発明は、本発明に記載の改変免疫細胞、核酸分子又はベクターと、多種薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物をさらに提供する。

第３態様で、本発明は、被験者に対して本発明に記載の免疫細胞又は医薬組成物を有効量だけ投与することを含む癌、感染症又は自己免疫疾患を有する前記被験者を治療する方法を更に提供する。

一実施形態において、本発明は、癌、感染又は自己免疫疾患を治療する薬の調製における、本発明による新規キメラ抗原受容体、核酸分子、ベクター、改変免疫細胞又は医薬組成物の使用をさらに提供する。

本発明のキメラ抗原受容体のメリットとしては、（１）ＮＫ活性化受容体又はそのリガンドの細胞内ドメインを追加の共刺激ドメインとして提供するが、単一の従来の共刺激ドメイン、例えばＣＤ２８又は４－１ＢＢに比べると、より強い活性化能力を有し、ＣＡＲ細胞の殺傷能力を向上させること、（２）汎用型ＣＡＲ細胞の場合に、ホストＮＫ細胞による外因性ＣＡＲ細胞への殺傷を抑制するために、ＣＡＲ細胞における内因性ＮＫ活性化受容体又はそのリガンドの発現を抑制し又はサイレンシングさせる可能性があり、このような場合に、ＣＡＲには対応する抑制され又はサイレンシングされたＮＫ活性化受容体又はそのリガンドの細胞内ドメインが共刺激ドメインとして含まれると、ＣＡＲ細胞の殺傷活性を顕著に向上させることができることにある。

発明の内容

別段の指定がない限り、本明細書で使用されるすべての科学用語および技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。

キメラ抗原受容体
本明細書で使用されるように、「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」という用語とは、人工的に構築されたハイブリッドペプチドを指し、このハイブリッドペプチドは一般的にリガンド結合ドメイン（例えば抗体又はその抗原結合部分）、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含み、各ドメインの間にリンカーにより連結される。ＣＡＲは、抗体の抗原結合特性を用いてＭＨＣ制限なしにＴ細胞と他の免疫細胞の特異性及び反応性を選択されたターゲットに新たにリダイレクトすることができる。非ＭＨＣ制限抗原認識は、ＣＡＲを発現する免疫細胞に抗原処理に関連しない抗原認識能力を付与するため、腫瘍逃避の主要なメカニズムを迂回する。

第１態様で、本発明は、リガンド結合ドメインと、膜貫通ドメインと、ＮＫ活性化受容体又はそのリガンドの細胞内ドメインを含む共刺激ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むキメラ抗原受容体を提供する。

共刺激ドメインは、共刺激分子からの細胞内機能性シグナル伝達ドメインであり、前記共刺激分子の細胞内ドメインの全体、又はその機能断片を含む。「共刺激分子」とは、Ｔ細胞において共刺激リガンドに特異的に結合されることによって、Ｔ細胞の共刺激反応（例えば増殖）を仲介する同源結合配偶体を指す。従来のキメラ抗原受容体は、ＣＤ２８又は４－１ＢＢの細胞内ドメインを共刺激ドメインとして使用する。本発明のキメラ抗原受容体は、新規共刺激ドメインであるＮＫ活性化受容体又はそのリガンドの細胞内ドメインを含む。本発明は、ＮＫ活性化受容体又はそのリガンドの細胞内ドメインが新規共刺激ドメインとして加入されると、ＣＡＲ細胞による標的細胞への殺傷活性を顕著に増加し、特に対応の内因性ＮＫ活性化受容体又はそのリガンドのＣＡＲ細胞内における発現が抑制され又はサイレンシングされた場合にそうであることを見出した。

本明細書で使用される「ＮＫ活性化受容体」という用語とは、通常、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｍｏｔｉｆ，ＩＴＡＭ）を有し、或いはＮＫ細胞活性を活性化できるＮＫ細胞表面受容体を指す。「ＮＫ活性化受容体のリガンド」或いは「ＮＫ活性化リガンド」とは、ＮＫ活性化受容体に結合される分子を指す。ＮＫ活性化受容体の主要機能としては、ＮＫ細胞を活性化し、細胞毒性作用を発揮させサイトカインを放出させることである。ＮＫ細胞は、活性化受容体と抑制性受容体との間のバランスによって活性化状態を調整する。一般な場合には、ＮＫ抑制性受容体は、シグナル伝達バランスにおいて支配的な役割を果たし、ＮＫ細胞の活性を抑制することによって、自体細胞の殺傷を回避する。しかし、ＭＨＣ―Ｉクラス分子の発現の異常時に、例えば人為的に抑制され又はノックアウトされた場合に、ＮＫ活性化受容体が主導し、ＮＫ細胞がこのようなＭＨＣ－Ｉの発現が異常である細胞を「非自己」として認識して殺傷する。

一実施形態において、ＮＫ活性化受容体は２Ｂ４である。２Ｂ４は、ＣＤ２４４とも呼ばられ、膜タンパク質であり、ＮＫ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、単核細胞及び顆粒細胞の表面に広く発現される。２Ｂ４の細胞外領域は、１つのＶ型免疫グロブリンドメインと１つのＣ２型免疫グロブリン様ドメインを有するが、膜貫通領域には任意の荷電アミノ酸が含有されず、細胞内ドメインには免疫受容体チロシンスイッチモチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｓｗｉｔｃｈ ｍｏｔｉｆ，ＩＴＳＭ）が含有され、このモチーフは、アダプタータンパク質ＳＡＰ、ＥＡＴ－２、ＤＲＴなどの細胞質ＳＨ２領域によって認識されることができる。２Ｂ４架橋によっては、ＩＴＳＭのチロシンをリン酸化し、アダプタータンパク質を募集し、２Ｂ４とＳＡＰによって形成された複合体はＮＫ細胞を活性化できる。２Ｂ４は独立した受容体ではなく、ＮＫ細胞の共刺激受容体として、その起動が他のＮＣＲ受容体との協力に依存している。２Ｂ４のリガンドはＣＤ４８であり、造血細胞株および一部のＢリンパ球に高度に発現される。故に、一実施形態において、ＮＫ活性化受容体のリガンドはＣＤ４８である。

一実施形態において、ＮＫ活性化受容体はＤＮＡＭ－１である。ＤＮＡＭ－１は、ＣＤ２２６とも呼ばれ、ＮＫ細胞が機能を発揮するように起動する主要な共刺激受容体である。ＤＮＡＭ－１は、２つの免疫グロブリンＶ様ドメインの細胞外領域、１つの膜貫通領域、及びチロシンとセリン残基の潜在的なリン酸化部位を含む細胞質領域を含む。ＤＮＡＭ－１は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、単核細胞、顆粒細胞及び血小板を含む様々な血液細胞に発現される。ＤＮＡＭ－１はＣＤ１５５とＣＤ１１２との共通受容体である。ＣＤ１１２は、単純ヘルペスウイルス受容体であり、ヒトネクチン（ｎｅｃｔｉｎ）ファミリーに属し、Ｃａ２＋非依存性ＩｇＳＦ接着分子であり、そのファミリーメンバー間に同源又は異源の形式で互いに作用し、細胞間接着を引き起こす。ＣＤ１５５は、ｎｅｃｔｉｎ構造と類似し、ポリオウイルス受容体（Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｔｏ Ｐｏｌｉｏｖｉｒｕｓ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＰＶＲ）とも呼ばられる。故に、一実施形態において、ＮＫ活性化受容体のリガンドはＣＤ１１２及びＣＤ１５５から選択される。

一実施形態において、ＮＫ活性化受容体はＬＦＡ－１である。ＬＦＡ－１は、αサブユニット（ＣＤ１１ａ）及びβサブユニット（ＣＤ１８）という２本のポリペプチド鎖が非共有結合によって連結されたものである。ＬＦＡ－１のリガンドは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーであるＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２及びＩＣＡＭ３を含み、それらが細胞間の接着分子であり、損傷部位の上皮細胞への白血球の局在化および接着において重要な役割を果たす。ＩＣＡＭ１は、例えばリンパ球、内皮細胞、単核細胞、腫瘍細胞などの様々な細胞に発現され、且つサイトカインの誘導調整を受けることができる。ＩＣＡＭ２は、白血球、内皮細胞及び血小板に発現されることができるが、ＩＣＡＭ３は白血球のみに発現され、この両者は、サイトカインの誘導調整を受けない。この三種類のリガンドはそれぞれＬＦＡ－１のαサブユニット内の異なる領域に結合される。ＩＣＡＭ分子とＬＦＡ－１との間の相互結合は、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞の仲介する免疫殺傷へ所要の共刺激シグナルを提供して、免疫反応を活性化する。研究によると、ＩＣＡＭ１は、ＮＫＧ２Ｄが仲介するＮＫ細胞による結腸直腸癌細胞への殺傷作用を増強することができると表明される。故に、一実施形態において、ＮＫ活性化受容体のリガンドはＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２及びＩＣＡＭ３から選択される。

一実施形態において、２Ｂ４、ＣＤ４８、ＤＮＡＭ－１、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＬＦＡ－１、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２又はＩＣＡＭ３などのタンパク質から選択されるもの、より好ましくは２Ｂ４、ＣＤ１５５及びＩＣＡＭ３の細胞内ドメインは、本発明のキメラ抗原受容体の共刺激ドメインとして用いられてもい。

一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体は２Ｂ４の細胞内ドメインを共刺激ドメインとして含み、配列番号３１で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又はそのコード配列は、配列番号３２で示されるヌクレオチド配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体はＣＤ１５５の細胞内ドメインを共刺激ドメインとして含み、配列番号２９で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又はそのコード配列は、配列番号３０で示されるヌクレオチド配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体はＩＣＡＭ３の細胞内ドメインを共刺激ドメインとして含み、配列番号２７で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又はそのコード配列は、配列番号２８で示されるヌクレオチド配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体は、他の既知のＮＫ活性化受容体又はそのリガンドの細胞内ドメインを共刺激ドメインとして含んでもよく、このような実例は、例えばＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｆ、ＮＫＧ２ＨのようなＮＫＧ２ファミリータンパク質と、例えばＨＬＡ－Ｅ、Ｑａ１ｂ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、ＵＬＢＰ４、ＵＬＢＰ５、ＵＬＢＰ６、Ｒａｅ－１、Ｈ６０、ＭＵＬＴ１等のようなＮＫＧ２ファミリータンパク質に結合されるリガンドと、例えばＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６又はＮＫｐ８０のような天然細胞毒性受容体（Ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，ＮＣＲ）ファミリーと、例えばＢ７－Ｈ６、ＢＡＧ６、ＰｆＥＭＰ１、ＨＳＰＧＳ、ＡＩＣＬのような天然細胞毒性受容体に結合されるリガンドと、例えばＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＳ１等のようなＫＩＲ－Ｓファミリーに結合されるリガンドと、例えばＣＤ２のようなコアクチベーター受容体と、例えばＣＤ５８、ＣＤ５９のようなコアクチベーター受容体に結合されるリガンドと、例えばＳＴＡＴ１、ＪＡＫ１、ＩＦＮＧＲ２、ＪＡＫ２、ＩＦＮＧＲ１等のようなＩＦＮγシグナル伝達経路関連分子と、を含むが、それらに限定されない。

本発明で提供されるＮＫ活性化受容体又はそのリガンドの細胞内ドメインは、共刺激ドメインとするほかに、本発明のキメラ抗原受容体は、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ８３、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）、ＣＤ２７０（ＨＶＥＭ）、ＣＤ２７２（ＢＴＬＡ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ２７８（ＩＣＯＳ）、ＣＤ３５７（ＧＩＴＲ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ、ＣＤ９４、ＬＴＢ又はＺＡＰ７０、好ましくは４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０又はその組み合わせ、より好ましくは４－１ＢＢ、ＣＤ２８などのタンパク質の細胞内ドメインから選択される１つ以上の追加の共刺激ドメインを含んでもよい。一実施形態において、本発明のＣＡＲは、２Ｂ４の細胞内ドメイン及び４－１ＢＢの細胞内ドメインを共刺激ドメインとして含む。一実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＣＤ１５５の細胞内ドメイン及び４－１ＢＢの細胞内ドメインを共刺激ドメインとして含む。一実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＩＣＡＭ３の細胞内ドメイン及び４－１ＢＢの細胞内ドメインを共刺激ドメインとして含む。一実施形態において、本発明のＣＡＲは、２Ｂ４の細胞内ドメイン及びＣＤ２８の細胞内ドメインを共刺激ドメインとして含む。一実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＣＤ１５５の細胞内ドメイン及びＣＤ２８の細胞内ドメインを共刺激ドメインとして含む。一実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＩＣＡＭ３の細胞内ドメイン及びＣＤ２８の細胞内ドメインを共刺激ドメインとして含む。

共刺激ドメインである４－１ＢＢ及びＣＤ２８の細胞内ドメインは、当業者によって知られている。例えば、４－１ＢＢの細胞内ドメインは、配列番号９で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又はそのコード配列は配列番号１０で示されるヌクレオチド配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。ＣＤ２８の細胞内ドメインは、配列番号７で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又はそのコード配列は配列番号８で示されるヌクレオチド配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

本明細書で使用されるように、「リガンド結合ドメイン」とは、リガンド（例えば抗原）に結合可能な任意の構成又はその機能性バリアントを指す。リガンド結合ドメインは抗体構造であってもよく、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、リコンビナント抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、ネズミ抗体、キメラ抗体及びその抗原結合断片を含むが、それらに限定されない。例えば、リガンド結合ドメインは、免疫グロブリン分子、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、抗体の重鎖可変領域（ＶＨ）又は軽鎖可変領域（ＶＬ）、直線状抗体、重鎖抗体、シングルドメイン抗体（Ｓｉｎｇｌｅ ｄｏｍａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ，ｓｄＡｂ）、ナノ抗体（Ｎａｎｏｂｏｄｙ，Ｎｂ）、組換えフィブロネクチンドメイン、ａｎｔｉｃａｌｉｎ及びＤＡＲＰＩＮ等を含むが、それらに限定されなく、好ましくは免疫グロブリン分子、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、直線状抗体、重鎖抗体、ｓｄＡｂ及びナノ抗体から選択され、より好ましくはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、重鎖抗体、ｓｄＡｂ及びナノ抗体から選択される。本発明で、リガンド結合ドメインは、単価又は二価であってもよいし、単一特異性、二重特異性または多重特異性抗体であってもよい。「Ｆａｂ」とは、免疫グロブリン分子がパパインによって分解されて生じた２つの同一断片のうちのいずれか１つであり、ジスルフィドにより連結された完全軽鎖及び重鎖Ｎ端部分からなり、重鎖Ｎ端部分が重鎖可変領域及びＣＨ１を含む。完全のＩｇＧに比べると、ＦａｂはＦｃ断片を有せず、流動性及び組織浸透能力が高く、且つ抗体効果を仲介せずに抗原に単価で結合されることができる。

「単鎖抗体」又は「ｓｃＦｖ」は、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖可変領域（ＶＬ）とがリンカーにより連結された抗体である。リンカーの最適長さ及び／又はアミノ酸組成を選択することができる。リンカーの長さは、ｓｃＦｖの可変領域の折り畳み及び相互作用の状況に明らかに影響をもたらす。実際に、短いリンカー（例えば５～１０個のアミノ酸にある）を使用すると、鎖内折り畳みを防止することができる。リンカーの大きさ及び組成の選択について、例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ等，１９９３Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４－６４４８、アメリカ専利出願公報番号２００５／０１００５４３、２００５／０１７５６０６、２００７／００１４７９４、及びＰＣＴ公報番号ＷＯ２００６／０２０２５８及びＷＯ２００７／０２４７１５を参照し、その全文が引用されて本明細書に合併する。ｓｃＦｖは、例えばＶＨ－リンカー－ＶＬ又はＶＬ－リンカー－ＶＨのような、任意の順序で連結されるＶＨ及びＶＬを含んでもよい。

「重鎖抗体」とは、軽鎖が自然に欠損している抗体を指し、この抗体は１つの重鎖可変領域と、従来のＣＨ２およびＣＨ３領域を含み、主にラクダ科で存在する。近年、軟骨魚において軽鎖又は他のタンパク質分子を含まない重鎖抗体に類似する抗原受容体（ｎｅｗ ｏｒ ｎｕｒｓｅ ｓｈａｒｋ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＮＡＲ）が発見された。ＮＡＲ分子は、膜貫通および分泌方式でＩｇサブタイプと同様の機能特性を持つため、免疫グロブリンネオアンチゲン受容体（Ｉｇ ｎｅｗ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＩｇＮＡＲ）とも呼ばられる。

「シングルドメイン抗体」又は「ｓｄＡｂ」とは、軽鎖抗体可変領域又は重鎖抗体可変領域のみからなる遺伝子改変抗体を指す。ラクダ科において発見されたｓｄＡｂは重鎖抗体可変領域のみを含み、ＶＨＨ又は「ナノ抗体」と呼ばられ、元の重鎖抗体に相当する構造安定性、及び抗原との結合活性を有し、ターゲット抗原に結合可能な現在既知の最小単位である。基本のＶＨＨは、Ｎ端からＣ端にかけて、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４という構造を有し、ＣＤＲが相補性決定領域、ＦＲがフレームワーク領域を指す。

「機能性バリアント」又は「機能性断片」という用語は、基本的に親アミノ酸配列を含むが、この親アミノ酸配列に比べて少なくとも１つのアミノ酸修飾（置換、欠失、挿入など）のバリアントを含有し、条件として前記バリアントが親アミノ酸配列の生物活性を保留することである。例えば、抗体について、その機能断片はその抗原結合部分である。一実施形態において、前記アミノ酸修飾は、保守的な修飾が好ましい。

本明細書で使用されるように、「保守的な修飾」という用語は、当該アミノ酸配列を含有する抗体又は抗体断片の結合特徴を明らかに影響又は変更しないアミノ酸修飾を指す。これらの保守的な修飾はアミノ酸置換、添加及び欠失を含む。修飾は、当分野での既知の標準技術、例えば部位特異的変異導入及びＰＣＲ仲介による変異導入により、本発明のキメラ抗原受容体に導入される。保守的なアミノ酸置換は、アミノ酸残基は、類似する側鎖を有するアミノ酸残基に置換えられることである。類似する側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは当分野で定義され、塩基性側鎖（例えばリジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えばアスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えばグリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えばアラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、ホルマジンチオニン、トリプトファン）、β－分岐側鎖（例えばスレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えばチロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。保守的な修飾は、例えば極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は係わる残基の両親媒性の類似性に応じて選択されてもよい。

従って、「機能性バリアント」又は「機能性断片」は、親アミノ酸配列に少なくとも７５％、好ましくは少なくとも７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有し、且つ親アミノ酸の生物活性、例えば結合活性を保留する。

本明細書で使用されるように、「配列同一性」という用語は、２つの（ヌクレオチド又はアミノ酸）配列が比較において同一位置で同じ残基を有する程度を表し、且つ一般的にパーセンテージとして表される。好ましくは、同一性は、比較される配列の全体長さで決められる。従って、完全に同じ配列を有する２つのコピーは、１００％の同一性を有する。当業者は、いくつかのアルゴリズムが標準パラメータを用いて配列同一性を特定することに用いられてもよく、例えばＢｌａｓｔ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２）、Ｂｌａｓｔ２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ等（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０）、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ｓｍｉｔｈ等（１９８１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５－１９７）及びＣｌｕｓｔａｌＷであると認識している。

リガンド結合ドメインの選択は、認識対象である具体的な疾患状態に関する標的細胞における細胞表面マーカー、例えば腫瘍特異的抗原又は腫瘍関連抗原によって決められる。従って、一実施形態において、本発明のリガンド結合ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ４６、ＣＤ７０、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌ ｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＮＣＡＭ、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌＯＯ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、Ｆｕｃｏｓｙｌ ＧＭｌ、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、Ｆｏｌａｔｅ受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ポッドプロテイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、前立腺特異的タンパク質、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ １、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ １、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、及び／又は病原体特異抗原、ビオチン化分子、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ及び／又は他の病原体によって発現される分子、並びに／或いはネオエピトープ又はネオ抗原から選択される１つ又は複数のターゲットに結合される。好ましくは、前記ターゲットは、ＣＤ７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＡＰ、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＣＡＩＸ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＧＰＣ３、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、ＮＫＧ２Ｄ及びそれらの任意の組み合わせから選択される。ターゲティング対象である抗原により、本発明のＣＡＲは、この抗原に対して特異性を有するリガンド結合ドメインを含むように設計されてもよい。例えば、ＣＤ１９がターゲティング対象である抗原であれば、ＣＤ１９抗体は本発明のリガンド結合ドメインとして用いられることができる。

一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体は、ＣＤ１９を標的にする。故に、好ましい一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体は、（ｉ）それぞれ配列番号３３、３４及び３５で示されるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３と、配列番号３６、３７及び３８で示されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３と、を含み、又は（ｉｉ）それぞれ配列番号３９、４０及び４１で示されるＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２及びＣＤＲ－Ｌ３と、配列番号４２、４３及び４４で示されるＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３と、を含む抗ＣＤ１９抗体を含む。好ましくは、前記抗ＣＤ１９抗体は、配列番号１の１－１０７位又は配列番号２５の１－１０７位で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する軽鎖可変領域配列と、配列番号１の１２３－２４２位又は配列番号２５の１２３－２３８位で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％、９９％又は１００％の配列同一性を有する重鎖可変領域配列と、含む。

本明細書で使用されるように、「膜貫通ドメイン」という用語は、キメラ抗原受容体を免疫細胞（例えばリンパ球、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞）表面に発現させ、且つ免疫細胞の標的細胞に対する細胞応答をガイドするペプチド構造を指す。膜貫通ドメインは、天然又は合成のものであってもよいし、任意の膜結合タンパク質又は膜貫通タンパク質に由来してもよい。キメラ抗原受容体と標的抗原とが結合する場合に、膜貫通ドメインはシグナル伝達を行うことができる。特に本発明における膜貫通ドメインに適用され、例えばＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ζサブユニット、ＣＤ３εサブユニット、ＣＤ３γサブユニット、ＣＤ３δサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４及びその機能性断片に由来してもよい。或いは、膜貫通ドメインは合成したものであってもよく、且つ主に疎水性残基、例えばロイシンとバリンを含んでもよい。好ましくは、前記膜貫通ドメインは、ＣＤ８α鎖又はＣＤ２８に由来し、配列番号３又は５で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又はそのコード配列は配列番号４又は６で示されるヌクレオチド配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体は、リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置するヒンジ領域を含んでもよい。本明細書で使用されるように、「ヒンジ領域」という用語は、一般的に膜貫通ドメインをリガンド結合ドメインに連結するように機能する任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。具体的には、ヒンジ領域は、リガンド結合ドメインに対してより高い柔軟性とアクセス性を提供するように用いられる。ヒンジ領域は、最大３００個のアミノ酸、好ましくは１０～１００個のアミノ酸、最も好ましくは２５～５０個のアミノ酸を含んでもよい。ヒンジ領域は、全部又は一部が天然分子に由来し、例えば全部又は一部がＣＤ８、ＣＤ４又はＣＤ２８の細胞外領域に由来し、又は全部又は一部が抗体定常領域に由来してもよい。或いは、ヒンジ領域は、自然に発生するヒンジ配列に対応する合成配列であってもよいし、又は完全に合成したヒンジ配列であってもよい。好ましい実施形態において、前記ヒンジ領域は、ＣＤ８α鎖、ＦｃγＲＩＩＩα受容体、ＣＤ２８、ＩｇＧ４又はＩｇＧ１のヒンジ領域部分を含み、より好ましくはＣＤ８α、ＣＤ２８又はＩｇＧ４からのヒンジであり、配列番号１９、２１又は２３で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、或いは、そのコード配列は配列番号２０、２２又は２４で示されるヌクレオチド配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

本明細書で使用されるように、「細胞内シグナル伝達ドメイン」という用語とは、エフェクター機能シグナルを形質導入し、細胞が所定機能を行うように指導するタンパク質部分を指し、一次シグナル伝達ドメインとも呼ばられる。細胞内シグナル伝達ドメインは、リガンド結合ドメインが抗原に結合された細胞内シグナル伝達を担うことによって、免疫細胞及び免疫反応の活性化を招く。言い換えると、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＡＲを発現する免疫細胞の正常のエフェクター機能の少なくとも１種類を担う。例えば、Ｔ細胞のエフェクター機能は、細胞溶解活性又はヘルパー活性であってもよく、サイトカインの分泌を含む。

一実施形態において、本発明のキメラ抗原受容体に含まれる細胞内シグナル伝達ドメインは、抗原受容体結合後に一緒に機能してシグナル伝達を誘導するＴ細胞受容体及び共刺激受容体の細胞質配列と、これらの配列の任意のデリバティブ又はバリアントと、同一又は類似の機能を有する任意の合成配列であってもよい。細胞内シグナル伝達ドメインは、沢山の免疫受容体チロシン活性化モチーフ（Ｉｍｍｕｎｏｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｔｙｒｏｓｉｎｅ－ｂａｓｅｄ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｍｏｔｉｆｓ，ＩＴＡＭ）を含んでもよい。本発明の細胞内シグナル伝達ドメインの非限定的な例は、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄなどの細胞内ドメインを含むが、それらに限定されない。好ましい実施形態において、本発明のＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞内ドメインを含んでもよく、配列番号１１又は１３で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又はそのコード配列は、配列番号１２又は１４で示されるヌクレオチド配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

一実施形態において、共刺激ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインは、任意の順序で操作可能に連結されてもよい。例えば、共刺激ドメインが近位端に位置し、細胞内シグナル伝達ドメインが遠位端に位置するようにしてもよいし、或いは、共刺激ドメインが遠位端に位置し、細胞内シグナル伝達ドメインが近位端に位置するようにしてもよい。２つ以上の共刺激ドメインを含む場合に、共刺激ドメインは細胞内シグナル伝達ドメインの一側又は両側に位置してもよい。

一実施形態において、本発明のＣＡＲは、細胞、例えばＴ細胞で発現される場合に、新生タンパク質が小胞体まで導入されてから細胞表面まで導入されるように、シグナルペプチドを含んでもよい。シグナルペプチドのコアは、長い疎水性アミノ酸セグメントを含んでもよく、単一のα－螺旋を形成する傾向がある。シグナルペプチドの末端には、一般的にシグナルペプチダーゼによって認識、カットされたアミノ酸セグメントがある。シグナルペプチダーゼは、移行中又は完成後にカットされ、遊離シグナルペプチド及び成熟タンパク質が生成する。その後、遊離シグナルペプチドは特定のプロテアーゼに消化される。本発明に適用可能なシグナルペプチドは、当業者によって周知されるものであり、例えばＣＤ８α、ＩｇＧ１、ＧＭ－ＣＳＦＲα、Ｂ２Ｍ等から派生されるシグナルペプチドである。一実施形態において、本発明に適用可能なシグナルペプチドは、配列番号１５又は１７で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、又は当該シグナルペプチドのコード配列は、配列番号１６又は１８で示されるアミノ酸配列に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する。

一実施形態において、本発明のＣＡＲは、ＣＡＲの発現時間をコントロールするようにスイッチ構造をさらに含んでもよい。例えば、スイッチ構造は、二量体化ドメインの形式であってもよく、その対応するリガンドとの結合によりコンフォメーションの変化を引き起こし、細胞外結合ドメインを露出させることにより、それをターゲティング対象抗原に結合させてシグナル伝達通路を活性化する。或いは、スイッチドメインにより結合ドメインとシグナル伝達ドメインをそれぞれ連結し、スイッチドメインが互いに結合される（例えば誘導化合物の存在で）場合のみに、結合ドメイン及びシグナル伝達ドメインは、二量体によって連結されてシグナル通路を活性化するようにしてもよい。スイッチ構造は、マスキングペプチドの形式であってもよい。マスキングペプチドは、細胞外結合ドメインをマスクし、ターゲティング対象抗原との結合を阻止することができ、例えばプロテアーゼによってマスキングペプチドがカットされた後、細胞外結合ドメインを露出させて、１つの「通常」ののＣＡＲ構造とする。当業者の知っている様々なスイッチ構造はいずれも本発明に適用できる。

一実施形態において、本発明のＣＡＲは自殺遺伝子を含んでもよく、即ち、外因性物質によって誘導される１つの細胞死シグナルを発現させて需要時（例えば深刻な副作用を引き起こす時）にＣＡＲ細胞を除去する。例えば、自殺遺伝子は、插入されたエピトープの形式であってもよく、例えばＣＤ２０エピトープ、ＲＱＲ８等であり、需要時に、これらのエピトープをターゲティングする抗体又は試薬を加入することでＣＡＲ細胞を除去することができる。自殺遺伝子は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ－ＴＫ）であってもよく、この遺伝子は、細胞がガンシクロビルの治療を受けて誘導されて死亡するようにできる。自殺遺伝子はｉＣａｓｐａｓｅ－９であってもよく、例えばＡＰ１９０３、ＡＰ２０１８７等のような化学誘発剤によりｉＣａｓｐａｓｅ－９を二量体化させるように誘導して、下流のＣａｓｐａｓｅ３分子を活性化し、アポトーシスを引き起こす。当業者の知っている様々な自殺遺伝子はいずれも本発明に適用できる。

核酸とベクター
本発明は、本発明のキメラ抗原受容体をコードする核酸配列を含む核酸分子をさらに提供する。本発明は、このような核酸分子を含むベクターを更に提供する。

本明細書で使用されるように、「核酸分子」という用語は、リボヌクレオチド及びデオキシリボヌクレオチドの配列、例えば修飾済又は未修飾のＲＮＡ又はＤＮＡ、それぞれが単鎖及び／又は双鎖の形式である直線状又は環状、又はそれらの混合物（ハイブリッド分子を含む）を含む。故に、本発明に係わる核酸は、ＤＮＡ（例えばｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｃＤＮＡ）、ＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｉｖｔＲＮＡ）、それらの組み合わせ又はデリバティブ（例えばＰＮＡ）を含む。好ましくは、前記核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡ、より好ましくはｍＲＮＡである。

核酸は、通常のホスホジエステル結合又は非通常の結合（例えばアミド結合、ペプチド核酸（ＰＮＡ）で発見されたもの）を含んでもよい。本発明の核酸は、例えばトリチル化塩基と珍しい塩基（例えばイノシン）のような１種類又は複数種類の修飾塩基を含んでもよい。化学、酵素又は代謝修飾を含む他の修飾も想到でき、本発明のマルチチェーンＣＡＲはポリヌクレオチドから発現されればいい。核酸は分離の形式で提供されてもよい。一実施形態において、核酸は、例えば転写制御要素（プロモーター、エンハンサー、オペレーター、リプレッサー、及び転写終結シグナルを含む）、リボソーム結合部位、イントロン等の調節配列を含んでもよい。

本発明の核酸配列に対してコドン最適化を行い、所要の宿主細胞（例えば免疫細胞）において最適な発現を行うことができ、或いは、細菌、酵母又は昆虫細胞での発現に用いられる。コドン最適化とは、対象配列に存在する所定の物種の高度発現の遺伝子において一般的に珍しいコドンを、このような物種の高度発現の遺伝子において一般的に普通のコドンに置き換え、置換前後のコドンコードが同一であるアミノ酸を指す。従って、最適なコドンの選択は、宿主ゲノムのコドン使用バイアスに決められる。

本明細書で使用されるように、「ベクター」という用語は、（外因性）の遺伝子材料を宿主細胞に転移するためのメディエーター核酸分子であり、この宿主細胞において前記核酸分子は、例えばコピーされ、且つ／又は発現されてもよい。

ベクターは一般的にターゲティングベクターと発現ベクターを含む。「ターゲティングベクター」は、例えば同源リコンビナントにより又は特異的標的部位での配列のハイブリッドリコンビナーゼを用いて分離した核酸を細胞内部まで送達する媒体である。「発現ベクター」は、異種核酸配列（例えば、本発明のキメラ抗原受容体ペプチドをコードするそれらの配列）の適合な宿主細胞での転写及びそれらのｍＲＮＡの翻訳に用いられるベクターである。本発明に適用できる適当なベクターは当分野で既知されるものであり、たくさん購買され取得されることができる。一実施形態において、本発明のベクターは、プラスミド、例えばレトロウィルス、レンチウィルス、アデノウィルス、ワクシニアウィルス、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）のようなウィルス、ポリオーマウィルス及びアデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）等、ファージ、ファージミド、コスミド及び人工染色体（ＢＡＣとＹＡＣを含む）を含むが、それらに限定されない。ベクター自身は一般的にヌクレオチド配列であり、一般的に挿入物（遺伝子導入）を含むＤＮＡ配列と、ベクターの「スケルトン」である大きい配列である。改変ベクターには、一般的に宿主細胞での自己複製の起源（ポリヌクレオチドの安定的発現の必要があれば）、選択マーカー及び制限酵素切断部位（例えばマルチクローニングサイト，ＭＣＳ）も含む。ベクターは、プロモーター、ポリＡテール（ｐｏｌｙＡ）、３’ＵＴＲ、エンハンサー、ターミネーター、インシュレーター、オペレーター、選択マーカー、レポーター遺伝子、ターゲティング配列及び／又はタンパク質精製タグ等のエレメントをさらに含んでもよい。具体的な一実施形態で、前記ベクターは、インビトロ転写のベクターである。

改変免疫細胞
本発明は、本発明のキメラ抗原受容体、核酸分子又はベクターを含む改変免疫細胞を提供する。

本明細書で使用されるように、「免疫細胞」という用語とは、１種類又は多種のエフェクター機能（例えば、細胞傷害性細胞の活性への殺傷、サイトカインの分泌、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣの誘導）を有する免疫システムの任意の細胞を指す。例えば、免疫細胞は、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単核細胞、ＮＫ細胞及び／又はＮＫＴ細胞である。一実施形態において、免疫細胞は、例えば成体幹細胞、胚性幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞等の幹細胞から派生される。好ましくは、免疫細胞はＴ細胞である。Ｔ細胞は、任意のＴ細胞であってもよく、例えば原代Ｔ細胞のようなｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されたＴ細胞、或いはＪｕｒｋａｔ、ＳｕｐＴ１等のようなｉｎ ｖｉｔｒｏで培養されたＴ細胞株からのもの、又は被験者から取得されたＴ細胞である。被験者の実例は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット及びそれらの遺伝子組み換え種を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髓、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、腫瘍の複数のソースから取得されることができる。Ｔ細胞は、濃縮され又は精製されてもよい。Ｔ細胞は、任意の発育段階にあってもよく、ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞（例えばＴｈ１及びＴｈ２細胞）、ＣＤ８＋Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔ細胞）、ＣＤ４－ＣＤ８－Ｔ細胞、腫瘍浸潤細胞、メモリーＴ細胞、ナイーブＴ細胞、γδ－Ｔ細胞、αβ－Ｔ細胞等を含むが、それらに限定されない。好ましい一実施形態において、免疫細胞は、ヒトＴ細胞である。当業者に既知される多種技術、例えばＦｉｃｏｌｌ分離を用いて被験者の血液からＴ細胞を取得することができる。

当分野での既知の一般的な方法（例えば形質導入、トランスフェクション、形質転換等）を採用して、キメラ抗原受容体をコードする核酸配列及び任意の外因性遺伝子を免疫細胞に導入する。「トランスフェクション」は、核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）を標的細胞に導入するプロセスである。一例としては、ＲＮＡトランスフェクションであり、即ち、ＲＮＡ（例えばインビトロ転写のＲＮＡ，ｉｖｔＲＮＡ）を宿主細胞に導入するプロセスである。この用語は、主に真核細胞での非ウイルスアプローチに用いられる。「形質導入」という用語は一般的にウィルスの仲介する核酸分子又はポリヌクレオチドの転移を説明するためのものである。動物細胞のトランスフェクションは、材料摂取を許容するように、一般的に細胞膜の一時的に開かれる孔または「穴」に係わる。リン酸カルシウムを用い、エレクトロポレーション、細胞押し出しにより、又カチオン性脂質と材料とを混合させて細胞膜に融合してそれらのキャリアを内部に沈着する脂質体が生成し、トランスフェクションを行うことができる。真核宿主細胞のトランスフェクションに用いる例示的技術は、脂質ベシクル媒介の取り込み、ヒートショック媒介の取り込み、リン酸カルシウム媒介のトランスフェクション（リン酸カルシウム／ＤＮＡ共沈）、マイクロインジェクション及びエレクトロポレーションを含む。「形質転換」という用語は、核酸分子又はポリヌクレオチド（ベクターを含む）が細菌中、非動物真核細胞（植物細胞を含む）中の非ウィルスへも転移することを説明するためのものである。従って、形質転換は、細菌又は非動物真核細胞の遺伝子変更であり、細胞膜によりその周囲から直接的に取り込んでから外因性の遺伝子材料（核酸分子）に組み込んで生成される。形質転換は、人工手段により実現されてもよい。形質転換の発生のために、細胞又は細菌は有能な状態であればならない。原核形質転換について、技術は、ヒートショック媒介の取り込み、完全細胞の細菌プロトプラストとの融合、マイクロインジェクション及びエレクトロポレーションを含む。核酸又はベクターを免疫細胞に導入すると、当業者は、一般的な技術により取得した免疫細胞を増殖、活性化することができる。

一実施形態において、前記改変免疫細胞において、共刺激ドメインとして用いられる対応の内因性ＮＫ活性化受容体又はリガンドの発現は、抑制され又はサイレンシングされる。汎用型ＣＡＲ細胞を調製して、移植片対宿主病のリスクを軽減する場合に、通常、ＣＡＲ細胞における内因性ＭＨＣ関連遺伝子、例えばＨＬＡ、Ｂ２Ｍ、ＣＩＩＴＡ、ＲＦＸ５等をノックアウトすることによって、ＣＡＲ細胞が受容体のＴ細胞から攻撃され、さらにＣＡＲ細胞の生存と有効性に影響することを回避する。しかしながら、あるＮＫ抑制性受容体、例えばＮＫＧ２Ａも、ＭＨＣ関連遺伝子に結合される。このような結合によって、通常の状況下でＮＫ細胞における抑制シグナルが支配的な地位を占め、細胞を「自己」として認識し、攻撃しないようになる。故に、ＣＡＲ細胞における内因性ＭＨＣ関連遺伝子の発現を抑制又はサイレンシングさせると、患者体内のＮＫ細胞の抑制シグナルが解除され、活性化シグナルが支配的になるようにし、その結果、ＣＡＲ細胞は患者体内のＮＫ細胞によって「非自己」として認識され、殺傷する。このような場合に、ＮＫ細胞の活性化シグナルを減少し、ｉｎ ｖｉｖｏ でのＮＫ細胞による外因性ＣＡＲ細胞への殺傷を低減させるように、ＣＡＲ細胞における内因性ＮＫ活性化受容体又はそのリガンドの発現を抑制又はサイレンシングさせる必要がある可能である。

発明者は初めて、ＮＫ活性化受容体又はそのリガンドの発現が抑制され又はサイレンシングされたＣＡＲ細胞において、対応する抑制され又はサイレンシングされたＮＫ活性化受容体又はそのリガンドの細胞内ドメインが共刺激ドメインとして含まれるのは、ＣＡＲ細胞の殺傷活性を顕著に向上させることができ、ＮＫ活性化リガンドの発現が抑制され又はサイレンシングされたＣＡＲ細胞において、対応する抑制され又はサイレンシングされたＮＫ活性化リガンド又はその受容体の細胞内ドメインが共刺激ドメインとして含まれるのは、ＣＡＲ細胞の殺傷活性を顕著に向上させることができることを発見した。

故に、一実施形態において、本発明の改変免疫細胞の内因性ＮＫ活性化リガンドであるＣＤ１５５の発現は、抑制され又はサイレンシングされ、かつその発現したキメラ抗原受容体は、ＣＤ１５５細胞内ドメイン又はＣＤ１５５の受容体（例えばＤＮＡＭ－１）の細胞内ドメインを共刺激ドメインとして含む。一実施形態において、本発明の改変免疫細胞の内因性ＮＫ活性化リガンドＩＣＡＭ３の発現は、抑制され又はサイレンシングされ、かつその発現したキメラ抗原受容体は、ＩＣＡＭ３の細胞内ドメイン又はＩＣＡＭ３の受容体（例えばＬＦＡ－１）の細胞内ドメインを共刺激ドメインとして含む。一実施形態において、本発明の改変免疫細胞の内因性ＮＫ活性化受容体である２Ｂ４の発現は、抑制され又はサイレンシングされ、かつその発現したキメラ抗原受容体は、２Ｂ４の細胞内ドメイン又は２Ｂ４のリガンド（例えばＣＤ４８）の細胞内ドメインを共刺激ドメインとして含む。

また、発明者は、ＮＫ活性化リガンド又はその受容体の発現を単独に抑制又はサイレンシングさせるのは、ｉｎ ｖｉｖｏ での改変免疫細胞（例えばＣＡＲ－Ｔ細胞）の増殖レベルを高めるとともにその耐久性を延ばして、腫瘍細胞への継続的な殺傷効果を向上させ、ｉｎ ｖｉｖｏ での腫瘍抑制効果を改善することができることを予想外に発見した。

故に、一実施形態において、本発明は、ＮＫ活性化受容体又はそのリガンドの発現が抑制され又はサイレンシングされ、前記ＮＫ活性化受容体が２Ｂ４、ＤＮＡＭ－１及びＬＦＡ－１から選択され、前記ＮＫ活性化受容体のリガンドがＣＤ４８、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２及びＩＣＡＭ３から選択され、好ましくはＣＤ４８又はＩＣＡＭ３の発現が抑制され又はサイレンシングされる改変免疫細胞をさらに提供する。

好ましい一実施形態において、ＮＫ活性化リガンド又はその受容体の発現が抑制され又はサイレンシングされた改変免疫細胞は、キメラ抗原受容体又は組換えＴ細胞受容体をさらに発現する。より好ましくは、ＮＫ活性化リガンド又はその受容体の発現が抑制され又はサイレンシングされた改変免疫細胞は、リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体をさらに発現し、前記共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７又はＣＤ２７８のシグナル伝達ドメイン又はそれらの組み合わせから選択される。別の一実施形態において、ＮＫ活性化リガンド又はその受容体の発現が抑制され又はサイレンシングされた改変免疫細胞の発現したキメラ抗原受容体には、前記ＮＫ活性化受容体又はそのリガンドの細胞内ドメインが含まれない。

一実施形態において、移植片対宿主病のリスクを軽減するために、前記改変免疫細胞は、ＣＤ５２、ＧＲ、ｄＣＫ、ＴＣＲ／ＣＤ３遺伝子（例えばＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ）と、ＭＨＣ関連遺伝子（ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ－ＤＰＡ、ＨＬＡ－ＤＱ、ＨＬＡ－ＤＲＡ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ）と、例えばＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＨＡＶＣＲ２、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＴＧＦＢＲＩＩ、ＴＧＦＲＢＲＩ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２及びＧＵＣＹ１Ｂ３等の免疫チェックポイント遺伝子と、から選択される少なくとも１種類をさらに含む遺伝子の発現が抑制され又はサイレンシングされる。好ましくは、前記改変免疫細胞は、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、より好ましくは、ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡから選択される少なくとも１種類をさらに含む遺伝子の発現が抑制され又はサイレンシングされる。

遺伝子発現を抑制し又は遺伝子をサイレンシングさせる方法は、当業者に周知される。例えば、アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡデコイ、ＲＮＡアプタマー、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ／ｍｉＲＮＡ、トランスドミナントネガティブタンパク質（ＴＮＰ）、キメラ／融合タンパク質、ケモカインリガンド、抗感染細胞タンパク質、細胞内抗体（ｓＦｖ）、ヌクレオシド類似体（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド類似体（ＮＮＲＴＩ）、インテグラーゼ阻害剤（オリゴヌクレオチド、ジヌクレオチド及び化学剤）及びプロテアーゼ阻害剤を用いて遺伝子の発現を抑制することができる。また、例えば大範囲のヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥヌクレアーゼ又はＣＲＩＳＰＲシステムにおけるＣａｓ酵素によりＤＮＡブレークを仲介して、遺伝子をサイレンシングさせることもできる。

医薬組成物
本発明は、活性剤として本発明に記載のキメラ抗原受容体、核酸分子、ベクター又は改変免疫細胞と、多種薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物とをさらに提供する。

本明細書で使用されるように、「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、被験者および有効成分と薬理学的および／または生理学的に適合する（即ち、何らかの希望しない局部又は全身の作用を果たすことがなく、所要の治療効果を果たす）ベクター及び／又は賦形剤を指し、本分野で周知される（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ．Ｅｄｉｔｅｄ ｂｙ Ｇｅｎｎａｒｏ ＡＲ，１９ｔｈ ｅｄ．Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９５参照）。薬学的に許容される賦形剤の実例は、充填剤、結合剤、崩壊剤、コーティング剤、吸着剤、粘着防止剤、流動促進剤、酸化防止剤、香料、着色剤、甘味料、溶媒、共溶媒、緩衝剤、キレート剤、界面活性剤、希釈剤、湿潤剤、防腐剤、乳化剤、コーティング剤、等張剤、吸収遅延剤、安定剤および等張化剤を含むが、それらに限定されない。当業者は、適当な賦形剤を選択して本発明の所望の医薬組成物を調製することを知っている。本発明に用いる医薬組成物における例示的賦形剤は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、及び水である。通常、適当な賦形剤の選択は、特に使用される活性剤、治療対象の疾患及び医薬組成物の所望の剤型によって決められる。

本発明に係わる医薬組成物は、複数の経路で投与される。一般的に、非経口で投与を完了する。非経口投与法は、局所、動脈内、筋肉内、皮下、髄内、くも膜下腔内、心室内、静脈内、腹腔内、子宮内、膣内、舌下、または鼻腔内で投与することを含む。

本発明の医薬組成物は、例えば固体、液体、気体、凍結乾燥形態等の各種形式で調製されることができ、特に軟膏、クリーム、経皮パッチ、ゲル、粉末、錠剤、溶液、エアゾール、顆粒、丸剤、懸濁液、乳液、カプセル、シロップ、エリキシル剤、エキス剤、チンキ剤、液体エキス剤抽出物の形態であってもよく、或いは、特に所要の施用方法に適用する形態である。本発明で既知の薬を製造するプロセスは、例えば、ルーチンの混合、溶解、造粒、糖衣製造、製粉、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥のプロセスを含んでもよい。例えば本明細書に記載の免疫細胞を含む医薬組成物は一般的に溶液の形態で提供され、且つ好ましくは薬学的に許容される緩衝剤を含む。

本発明に係わる医薬組成物は、治療及び／又は治療対象の疾患の予防に適用する１種類又は多種の他の薬剤と組み合わせて投与されることもできる。組み合わせに適用する薬剤の好ましい実例は、例えばシスプラチン、メイタンシン誘導体、ラチェルマイシン（ｒａｃｈｅｌｍｙｃｉｎ）、カリケアマイシン（ｃａｌｉｃｈｅａｍｉｃｉｎ）、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーポルフィリンナトリウムＩＩ（ｓｏｒｆｉｍｅｒ ｓｏｄｉｕｍｐｈｏｔｏｆｒｉｎ ＩＩ）、テモゾロミド、トポテカン、グルクロン酸トリメトレキサート（ｔｒｉｍｅｔｒｅａｔｅ ｇｌｕｃｕｒｏｎａｔｅ）、アウリスタチンＥ（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ Ｅ）、ビンクリスチン及びアドリアマイシン等の既知の抗癌薬と、例えばリシン、ジフテリア毒素、シュードモナス外毒素Ａ、ＤＮＡ酵素及びＲＮＡ酵素等のペプチド細胞毒素と、例えばヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イリジウム９０、ビスマス２１０及び２１３、アクチニウム２２５及びアスタチン２１３等の放射性核種と、例えば抗体指向性酵素プロドラッグのプロドラッグと、例えば血小板因子４、黒色腫増殖刺激タンパク質等の免疫刺激剤と、例えば抗ＣＤ３抗体又はその断片のような抗体又はその断片と、補体活化剤と、ヘテロタンパク質ドメインと、ホモタンパク質ドメインと、ウイルス／細菌タンパク質ドメインと、ウィルス／細菌ペプチドと、を含む。また、本発明の医薬組成物は、例えば化学療法、放射線療法等の他の１種類又は多種の治療方法と組み合わせて使用されてもよい。

治療への応用
本発明は、被験者に対して本発明に記載の免疫細胞又は医薬組成物を有効量だけ投与することを含む癌、感染症または自己免疫疾患を有する前記被験者を治療する方法を更に提供する。従って、本発明は、癌、感染又は自己免疫疾患を治療する薬の調製における、前記キメラ抗原受容体、核酸分子、ベクター、改変免疫細胞及び医薬組成物の使用を更にカバーする。

一実施形態において、被験者に対して有效量の本発明の免疫細胞及び／又は医薬組成物を直接的に投与する。

別の一実施形態において、本発明の治療方法は、生体外治療である。具体的には、この方法は、（ａ）免疫細胞を含むサンプルを提供するステップと、（ｂ）ｉｎ ｖｉｔｒｏで、本発明のキメラ抗原受容体及び外因性遺伝子（存在する場合）を前記免疫細胞に導入し、前記免疫細胞における特定の遺伝子の発現を任意選択的に抑制又はサイレンシングさせ（需要の場合）、修飾された免疫細胞を取得するステップと、（ｃ）前記修飾された免疫細胞を、それを必要とする被験者に投与するステップと、を含む。好ましくは、ステップ（ａ）で提供される免疫細胞は、マクロファージ、樹状細胞、単核細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及び／又はＮＫＴ細胞から選択され、且つ前記免疫細胞は、当分野での既知の一般的方法で被験者のサンプル（特に血液サンプル）から取得されることができる。しかし、本発明のキメラ抗原受容体を発現し、本明細書に記載の所要の生物効果機能を発揮することができる他の免疫細胞を使用してもよい。また、一般的に選択された免疫細胞は、被験者の免疫システムに適合し、即ち好ましくは前記免疫細胞は免疫原性応答を誘発しない。例えば、「ユニバーサル受容細胞」、即ち所要の生物効果機能を発揮する普遍的に適合する生体外培養及び増殖によるリンパ球を使用してもよい。このような細胞の使用は、被験者自身のリンパ球を取得、且つ／又は提供する必要がなくなる。ステップ（ｃ）の生体外導入は、エレクトロポレーションを介して本明細書に記載の核酸又はベクターを免疫細胞に導入し、又はウィルスベクターにより免疫細胞を感染することによって実施されることができ、前記ウィルスベクターは、上記したレンチウィルスベクター、アデノウィルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター又はレトロウィルスベクターである。想到できる他の方法は、トランスフェクション試剤（例えば脂質体）又は一過性ＲＮＡトランスフェクションの使用を含む。

一実施形態において、前記免疫細胞は、自家又は同種異系の細胞であり、好ましくはＴ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単核細胞、ＮＫ細胞及び／又はＮＫＴ細胞、より好ましくはＴ細胞、ＮＫ細胞又はＮＫＴ細胞である。

本明細書で使用されるように、「自家」という用語とは、個体に由来する任意の材料が後に当該同一個体に再びに導入されるという意味である。

本明細書で使用されるように、「同種異系」という用語は、任意の材料が当該材料に導入された個体と同一物種の異なる動物又は異なる患者に由来するという意味である。１つ又は複数の遺伝子座の所在する遺伝子が異なる場合に、２つ又はより多い個体が互い同種異系のものであると認定される。いくつかの場合に、同一物種のそれぞれの個体の同種異系材料の遺伝子における相違によっては、抗原相互作用が発生する可能性が高い。

本明細書で使用されるように、「被験者」という用語は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、人間以外の霊長類動物、マウス、ラット、犬、猫、馬又は牛であってもよいが、これらの実例に限定されない。人間以外の哺乳動物は、癌動物モデルを代表する被験者として有利的に用いられる。好ましくは、前記被験者はヒトである。

一実施形態において、前記癌は、脳神経膠腫、芽細胞腫、肉腫、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳・中枢神経癌、乳癌、腹膜癌、子宮頸癌、絨毛癌、結腸・直腸癌、結合組織癌、消化器系癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌（胃腸癌を含む）、神経膠芽腫（ＧＢＭ）、肝臓癌、肝細胞腫、上皮内腫瘍、腎臓癌、喉頭癌、肝臓腫瘍、肺癌（例えば小細胞肺癌、非小細胞肺癌、腺癌及び扁平上皮癌）、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌（例えば唇、舌、口及び咽頭）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、中皮腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系癌、唾液腺癌、皮膚癌、扁平上皮癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、子宮又は子宮内膜癌、泌尿器系悪性腫瘍、外陰癌、Ｗａｌｄｅｎｓｔｒｏｍマクログロブリン血症、リンパ腫（例えばＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中等度／濾胞性ＮＨＬ、中等度びまん性ＮＨＬ、高度免疫芽細胞性ＮＨＬ、高度リンパ芽球性ＮＨＬ、高度切れ込みの無い小細胞型ＮＨＬ、大塊疾患ＮＨＬを含む）、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、ＭＡＬＴリンパ腫、辺縁帯リンパ腫、形質芽細胞性リンパ腫、形質細胞様樹状突起細胞腫瘍等のホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含む）、白血病（急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、例えば急性骨髄芽球性白血病（未分化および部分分化を含む）、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、赤白血病、急性巨核芽球性白血病等の急性非リンパ性白血病のような急性白血病と、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性単球性白血病のような慢性白血病と、有毛細胞白血病、前リンパ球性白血病、形質細胞白血病、成人Ｔ細胞白血病、好酸球性白血病、好塩基性白血病等の他の特殊なタイプの白血病と、を含む）、芽球性形質細胞様樹状細胞腫瘍、悪性リンパ増殖性疾患、骨髄異形成、多発性骨髄腫、骨髄形成異常、及び移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）から選択される。好ましくは、本発明の改変免疫細胞又は医薬組成物を用いて治療する疾患は、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、脳神経膠腫、膵臓癌、胃癌等から選択される。

一実施形態において、前記感染は、ウィルス、細菌、真菌及び寄生虫による感染を含むが、それらに限定されない。

一実施形態において、前記自己免疫疾患は、Ｉ型糖尿病、セリアック病、グレーブス病、炎症性腸疾患、多発性硬化症、乾癬、関節リウマチ、アジソン病、シェーグレン症候群、橋本甲状腺炎、重症筋無力症、血管炎、悪性貧血及び全身性エリテマトーデス等を含むが、それらに限定されない。

以下、図面を参照しながら実例を合わせて本発明を詳細に説明する。説明すべきこととして、当業者は、本発明の図面及びその実施例が例示なものに過ぎず、本発明に対する任意の制限を構成しないと理解するはずである。矛盾しない場合、本出願における実施例及び実施例における特徴は互いに組み合わせることができる。

ｂｂｚｉ３－ＣＡＲ Ｔ細胞及びｂｂｚ１５５－ＣＡＲ Ｔ細胞におけるｓｃＦｖの発現レベルを示す。 ｂｂｚｉ３－ＣＡＲ Ｔ細胞及びｂｂｚ１５５－ＣＡＲ Ｔ細胞による標的細胞への殺傷効果を示す。 ｂｂｚｉ３－ＣＡＲ Ｔ細胞及びｂｂｚ１５５－ＣＡＲ Ｔ細胞のサイトカイン放出レベルを示す。 中でも対応する内因性ＮＫ活性化受容体のリガンドがノックアウトされたＣＡＲ－Ｔ細胞ｓｃＦｖの発現レベルを示す。 中でも対応する内因性ＮＫ活性化受容体のリガンドがノックアウトされたＣＡＲ－Ｔ細胞による標的細胞への殺傷効果を示す。 中でも対応する内因性ＮＫ活性化受容体のリガンドがノックアウトされたＣＡＲ－Ｔ細胞のサイトカイン放出レベルを示す。 ｂｂｚ２Ｂ４－ＣＡＲ Ｔ細胞、及びその中のＣＤ４８がノックアウトされたＣＡＲ－Ｔ細胞のｓｃＦｖ発現レベルを示す。 ｂｂｚ２Ｂ４－ＣＡＲ Ｔ細胞、及びその中のＣＤ４８がノックアウトされたＣＡＲ－Ｔ細胞による標的細胞への殺傷効果を示す。 マウス体内でのｉ３ＫＯ－ｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞及びｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖レベルの経時変化を示す。 ｉ３ＫＯ－ｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞及びｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞処理を受けたマウスの腫瘍負荷の経時変化を示す。

本発明のすべての実施例で使用されるＴ細胞は、Ｆｉｃｏｌｌ－ＰａｑｕｅＴＭ ＰＲＥＭＩＵＭ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，商品番号１７－５４４２－０２）によって白血球除去で健康なドナーから分離された初代ヒトＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
実施例１．ＣＡＲ Ｔ細胞の調製

ＣＤ８αシグナルペプチド（配列番号１５）、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ（配列番号１）、ＣＤ８αヒンジ領域（配列番号１９）、ＣＤ８α膜貫通領域（配列番号３）、４－１ＢＢの細胞内ドメイン（配列番号９）、ＣＤ３ζの細胞内ドメイン（配列番号１１）、及び 追加の共刺激ドメインであるＮＫ活性化リガンドの細胞内ドメイン（ＣＤ１５５の細胞内ドメイン（配列番号２９）又はＩＣＡＭ３の細胞内ドメイン（配列番号２７））のようなタンパク質をコードする配列を合成し、それをｐＬＶＸベクター（Ｐｕｂｌｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｐｌａｓｍｉｄ Ｌｉｂｒａｒｙ（ＰＰＬ），商品番号：ＰＰＬ００１５７－４ａ）にクローンするとともに、シーケンスによりターゲットシーケンスの正しい挿入を確認する。

無菌管に３ｍｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ，商品番号３１９８５－０７０）に加入して上記プラスミドを希釈してから、プラスミド：ウイルス包装ベクター：ウイルスエンベロープベクター＝４：２：１という比率で、包装ベクターｐｓＰＡＸ２（Ａｄｄｇｅｎｅ，商品番号１２２６０）及びエンベロープベクターｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ，商品番号１２２５９）を加入する。そして、１２０ｕｌのＸ－ｔｒｅｍｅ ＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試剤（Ｒｏｃｈｅ，商品番号０６３６６２３６００１）を加入し、すぐに均一に混ぜて、室温で１５分間孵化させ、その後、プラスミド／ベクター／トランスフェクション試剤混合物を２９３Ｔ細胞の培養瓶に一滴ずつ加入する。２４時間及び４８時間の後にウイルスを収集し、それを合わせた後に、超遠心分離して（２５０００ｇ，４℃，２．５時間）濃縮レンチウイルスを取得する。

ＤｙｎａＢｅａｄｓ ＣＤ３／ＣＤ２８ ＣＴＳＴＭ（Ｇｉｂｃｏ，商品番号４０２０３Ｄ）を用いてＴ細胞を活性化し、３７℃及び５％のＣＯ２で１日間培養する。そして、濃縮レンチウイルスを加入し、３日間連続培養後に、ｂｂｚｉ３－ＣＡＲ及びｂｂｚ１５５－ＣＡＲを発現するＴ細胞を取得する。追加の共刺激ドメインを含まないｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞（即ち、ＣＤ８αシグナルペプチド－抗ＣＤ１９ ｓｃＦｖ－ＣＤ８αのヒンジ領域－ＣＤ８αの膜貫通領域－４－１ＢＢの細胞内ドメイン－ＣＤ３ζの細胞内ドメイン）、及び未修飾の野生型Ｔ細胞（ＮＴ）は、コントロールとして使用される。

３７℃及び５％のＣＯ２で１１日間培養した後、Ｂｉｏｔｉｎ－ＳＰ（ｌｏｎｇ ｓｐａｃｅｒ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’）_２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ｍｉｎ Ｘ Ｈｕ，Ｂｏｖ，Ｈｒｓ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）（ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，商品番号１１５－０６５－０７２）を一次抗体とし、ＡＰＣ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，商品番号５５４０６７）又はＰＥ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，商品番号５５４０６１）を二次抗体として用い、フローサイトメトリーによりＣＡＲ－Ｔ細胞におけるｓｃＦｖの発現レベルを検出し、結果を図１に示す。

これからわかるように、本発明で調製されるＣＡＲ Ｔ細胞におけるｓｃＦｖは、いずれも効果的に発現されることができる。
実施例２：ＣＡＲ Ｔ細胞による標的細胞への殺傷効果及びサイトカイン放出
２．１ 標的細胞への殺傷能力の検出

まず、１ｘ１０^４／孔でルシフェリン遺伝子を持つＮａｌｍ６標的細胞を９６孔プレートに入れ、その後、２：１のエフェクター：標的比（即ちエフェクターＴ細胞と標的細胞との比率）でＮＴ細胞、ｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞、ｂｂｚｉ３－ＣＡＲ Ｔ細胞及びｂｂｚ１５５－ＣＡＲ Ｔ細胞を９６孔プレートに入れて一緒に培養し、１６～１８時間の後にマイクロプレートリーダーを用いて蛍光値を測定する。計算式：（標的細胞蛍光平均値－サンプル蛍光平均値）／標的細胞蛍光平均値×１００％に基づいて、殺傷効率を算出して取得し、結果を図２に示す。

これからわかるように、従来構造のｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞に比べると、さらにＮＫ活性化リガンドＩＣＡＭ３又はＣＤ１５５の細胞内ドメインを共刺激ドメインとして含むと、ＣＡＲ Ｔ細胞の殺傷能力を顕著に増強させることができる。
２．２ サイトカイン放出レベルの検出
（１）細胞共培養上澄み液の収集

１ｘ１０^５／孔の濃度で標的細胞Ｎａｌｍ６又は非標的細胞Ｊｕｒｋａｔを９６孔プレートに入れ、その後、１：１の比率で本発明のＮＴ細胞、ｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞、ｂｂｚｉ３－ＣＡＲ Ｔ細胞及びｂｂｚ１５５－ＣＡＲ Ｔ細胞をそれぞれ標的細胞又は非標的細胞とともに培養し、１８～２４時間後に細胞共培養上澄み液を収集する。
（２）上清におけるＩＬ－２及びＩＦＮ－γの分泌量のＥＬＩＳＡ検出

捕獲抗体Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩＬ２ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，商品番号５００３０２）又はＰｕｒｉｆｉｅｄ ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ ＩＦＮ－γＡｎｔｉｂｏｄｙ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，商品番号５０６５０２）を用いて９６孔プレートを被覆させて４℃で１晩孵化させ、その後、抗体溶液を除去し、２％のＢＳＡ（ｓｉｇｍａ，商品番号Ｖ９００９３３－１ｋｇ）含有の２５０μＬのＰＢＳＴ（０．１％トゥイーン含有の１ＸＰＢＳ）溶液を加入し、３７℃で２時間孵化させる。そして、２５０μＬのＰＢＳＴ（０．１％トゥイーン含有の１ＸＰＢＳ）を用いてプレートを３回洗浄する。各孔に５０μＬの細胞共培養上澄み液又は標準品を加入し、３７℃で１時間孵化させ、その後、２５０μＬのＰＢＳＴ（０．１％トゥイーン含有の１ＸＰＢＳ）を用いてプレートを３回洗浄する。そして、各孔にそれぞれ５０μＬの検出抗体であるＡｎｔｉ－Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｇａｍｍａ抗体［ＭＤ－１］（Ｂｉｏｔｉｎ）（ａｂｃａｍ，商品番号ａｂ２５０１７）を加入し、３７℃で１時間孵化させた後、２５０μＬのＰＢＳＴ（０．１％トゥイーン含有の１ＸＰＢＳ）を用いてプレートを３回洗浄する。ＨＲＰ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，商品番号４０５２１０）を再加入して、３７℃で３０分間孵化させた後、上澄み液を放棄し、２５０μＬのＰＢＳＴ（０．１％トゥイーン含有の１ＸＰＢＳ）を加入し、５回洗浄する。各孔に５０μＬのＴＭＢ基質溶液を加入する。反応を室温で暗い場所で３０分間発生させ、その後、各孔に５０μＬの１ｍｏｌ／Ｌ Ｈ_２ＳＯ_４を加入して反応を停止させる。反応の停止中の３０分間において、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍにおける吸光度を検出し、標準曲線（標準品の読み取り値及び濃度に基づいて描いたもの）に基づいてサイトカインの含有量を算出し、結果を図３に示す。

これからわかるように、従来構造のｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞に比べると、さらにＮＫ活性化リガンドＩＣＡＭ３又はＣＤ１５５の細胞内ドメインを共刺激ドメインとして含むと、ＣＡＲ Ｔ細胞のサイトカイン放出レベルを顕著に増強させることができる。
実施例３． ＮＫ活性化リガンドがノックアウトされたＣＡＲＴ細胞

ＣＲＩＳＰ／Ｃａｓ９システムによりｂｂｚｉ３－ＣＡＲ及びｂｂｚ１５５－ＣＡＲ Ｔ細胞における対応するＮＫ活性化リガンドをそれぞれノックアウトし、ＩＣＡＭ３がノックアウトされたｉ３ＫＯ－ｂｂｚｉ３－ＣＡＲ Ｔ細胞及びＣＤ１５５がノックアウトされた１５５ＫＯ－ｂｂｚ１５５－ＣＡＲ Ｔ細胞を取得する。同じ方式でｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＩＣＡＭ３又はＣＤ１５５をノックアウトし、中でも、ＩＣＡＭ３がノックアウトされたｉ３ＫＯ－ｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞及びＣＤ１５５がノックアウトされた１５５ＫＯ－ｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞を取得する。

ＣＡＲ Ｔ細胞を３７℃及び５％のＣＯ２で１１日間培養した後、ＡＰＣ－ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＣＤ１５５（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，商品番号３３７６１８）及びＰＥ－ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩＣＡＭ３（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，商品番号３３０００５）抗体を用いて、フローサイトメトリーによりＣＤ１５５及びＩＣＡＭ３の遺伝子編集効率を検出し、結果を下記の表１に示す。

表１．遺伝子編集効率

これからわかるように、各種類のＮＫ活性化リガンドはいずれも効果的にノックアウトされる。

３７℃及び５％のＣＯ２で１１日間培養した後に、Ｂｉｏｔｉｎ－ＳＰ（ｌｏｎｇ ｓｐａｃｅｒ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’）_２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ｍｉｎ Ｘ Ｈｕ，Ｂｏｖ，Ｈｒｓ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）（ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，商品番号１１５－０６５－０７２）を一次抗体とし、ＡＰＣ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，商品番号５５４０６７）又はＰＥ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，商品番号５５４０６１）を二次抗体として用い、フローサイトメトリーにより上記ＣＡＲ Ｔ細胞におけるｓｃＦｖの発現レベルを検出し、結果を図４に示す。

これからわかるように、本発明で調製されるＣＡＲ Ｔ細胞におけるｓｃＦｖは、いずれも効果的に発現されることができる。

実施例２．１に記載の方法に基づいて上記ＣＡＲ Ｔ細胞によるＮａｌｍ６標的細胞への殺傷能力を検出し、結果を図５に示す。

これからわかるように、対応するＮＫ活性化リガンドがノックアウトされた後、さらにＮＫ活性化リガンドの細胞内ドメインを含むのは、ＣＡＲ－Ｔ細胞の殺傷能力を顕著に増強することができる。

実施例２．２に記載の方法に基づいて上記ＣＡＲ Ｔ細胞とＮａｌｍ６標的細胞との共培養後のサイトカイン放出レベルを検出し、結果を図６に示す。

これからわかるように、対応するＮＫ活性化リガンドがノックアウトされた後、さらにＮＫ活性化リガンドの細胞内ドメインを含むＣＡＲ Ｔ細胞は、より強いＩＦＮ－γ分泌能力を有する。また、ｉ３ＫＯ－ｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔグループに比べると、ｉ３ＫＯ－ｂｂｚｉ３－ＣＡＲ Ｔグループの細胞ＩＬ－２の分泌レベルも、顕著に増強する。上記結果から、ＮＫ活性化リガンドがノックアウトされた背景で、さらに対応するＮＫ活性化リガンドの細胞内ドメインを含むと、ＣＡＲ－Ｔ細胞のサイトカイン分泌能力を増強させることができると表明される。
実施例４ ＮＫ活性化受容体細胞内セグメントを発現するＣＡＲ Ｔ細胞

実施例１における方式に基づいてｂｂｚ２Ｂ４－ＣＡＲ Ｔ細胞を調製するが、ｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞との相違としては、単にＣＡＲ構造にさらにＮＫ活性化受容体２Ｂ４の細胞内ドメイン（配列番号３１）が追加の共刺激ドメインとして含まれる点である。同時に、ＣＲＩＳＰ／Ｃａｓ９システムによりｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞及びｂｂｚ２Ｂ４－ＣＡＲ Ｔ細胞におけるＣＤ４８遺伝子（即ち２Ｂ４のリガンド）をノックアウトし、そのうち、ＣＤ４８がノックアウトされた４８ＫＯ－ｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞及び４８ＫＯ－ｂｂｚ２Ｂ４－ＣＡＲ Ｔ細胞を取得する。

ＣＡＲ Ｔ細胞を３７℃及び５％のＣＯ２で１１日間培養した後、ＣＤ４８が効果的にノックアウトされたことを確認するように、ＰＥ－ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＣＤ４８（ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，商品番号３３６７０８）を用いてＣＤ４８の遺伝子編集効率を検出し、結果を下記の表２に示す。

表２．遺伝子編集効率

３７℃及び５％のＣＯ２で１１日間培養した後に、Ｂｉｏｔｉｎ－ＳＰ（ｌｏｎｇ ｓｐａｃｅｒ）ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅ Ｇｏａｔ Ａｎｔｉ－Ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ，Ｆ（ａｂ’）_２ Ｆｒａｇｍｅｎｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ（ｍｉｎ Ｘ Ｈｕ，Ｂｏｖ，Ｈｒｓ Ｓｒ Ｐｒｏｔ）（ｊａｃｋｓｏｎ ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ，商品番号１１５－０６５－０７２）を一次抗体とし、ＡＰＣ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，商品番号５５４０６７）又はＰＥ Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ，商品番号５５４０６１）を二次抗体として用い、フローサイトメトリーにより上記ＣＡＲ Ｔ細胞におけるｓｃＦｖの発現レベルを検出し、結果を図７に示す。

これからわかるように、本発明で調製されるＣＡＲ Ｔ細胞におけるｓｃＦｖは、いずれも効果的に発現されることができる。

実施例２における２．１の方式に基づいて上記ＣＡＲ Ｔ細胞によるＮａｌｍ６細胞への殺傷効果を検出する（図８）。結果として、従来構造のＣＡＲ Ｔ細胞（即ちｂｂｚ－ＣＡＲ）に比べても、或いは中でも、ＮＫ活性化リガンドＣＤ４８がノックアウトされたＣＡＲ－Ｔ細胞（即ち、４８ＫＯ－ｂｂｚ－ＣＡＲ）に比べても、さらにＣＡＲ構造にＮＫ活性化リガンドの受容体２Ｂ４の細胞内ドメインが追加の共刺激ドメインとして含まれると、いずれもＣＡＲ Ｔ細胞の殺傷能力を顕著に増強させることができることが示される。

また、出願人は、従来のＣＡＲ－Ｔ細胞に比べると、さらにＮＫ活性化リガンドＣＤ４８をノックアウトすることによっても、ＣＡＲ－Ｔ細胞による標的細胞への殺傷能力を顕著に向上させることをさらに予想外に発見した（図８を参照，ｂｂｚ－ＣＡＲ ｖｓ ４８ＫＯ－ｂｂｚ－ＣＡＲ）。
実施例５ ＮＫ活性化リガンドがノックアウトされたＣＡＲ－Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｖｏ での抗腫瘍効果

ＮＫ活性化リガンドのノックアウトによるＣＡＲ－Ｔ細胞体内機能への影響をさらに検証するために、発明者は下記の実験を行った。

１５匹の８週齢の健康な雌ＮＣＧマウスを、ＮＴグループ（ネガティブコントロール）、ｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔグループ（ポジティブコントロール）、ｉ３ＫＯ－ｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔグループの３グループに分けた。０日目（Ｄ０）に、各マウスの尾静脈に５×１０^５個のＲａｊｉ細胞を注射した。３日間後（Ｄ３）、グループ分けに応じて、各マウスの尾静脈に２×１０^６個のＮＴ細胞、ｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞又はｉ３ＫＯ－ｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞を注射した。ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍負荷及びＣＡＲ Ｔ細胞増殖の変化を、フローサイトメトリーにより定期的に評価した。

図９は、マウス体内でのＣＡＲ Ｔ細胞の増殖レベルの経時変化を示す。Ｄ２１以降、ｉ３ＫＯ－ｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖レベルは、従来のｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞の増殖レベルよりもはるかに高いことがわかった。さらに、ｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｄ２８以降にマウス体内で検出されない一方、ｉ３ＫＯ－ｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞は、マウス体内でＤ４８まで増殖し続けた。これは、ＮＫ活性化リガンドＩＣＡＭ３をノックアウトすると、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＡＲ Ｔ細胞の増殖レベルが向上し、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＡＲ Ｔ細胞の生存時間を延長できることを示す。

図１０は、マウス体内腫瘍負荷の経時変化を示す。ＮＴグループに比べて、ｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞及びｉ３ＫＯ－ｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔ細胞はいずれも腫瘍の成長を効果的に抑制できることがわかった。しかし、Ｄ３９から、ｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔグループのマウス体内の腫瘍は再発し始めたが、ｉ３ＫＯ－ｂｂｚ－ＣＡＲ Ｔグループのマウス体内の腫瘍は抑制され続けた。

上記データは、ＮＫ活性化リガンド（例えばＩＣＡＭ３）のみをノックアウトすることで、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＡＲ Ｔ細胞の耐久性を延ばして、腫瘍細胞への持続的な殺傷効果を向上させ、ｉｎ ｖｉｖｏでの腫瘍抑制効果を改善し、マウスの生存率を高めることができることを示す。

説明すべきこととして、上記は、本発明の好ましい実施例に過ぎなく、本発明を制限するものではなく、当業者にとって、本発明は様々の変更及び変化を行うことができる。当業者によって理解されるように、本発明の思想と原則で行われたいかなる修正、同等置換、改善などは、いずれも本発明の保護範囲内に含まれるべきである。

Claims (21)

1. リガンド結合ドメインと、膜貫通ドメインと、ＮＫ活性化受容体又はそのリガンドの細胞内ドメインを含む共刺激ドメインと、細胞内シグナル伝達ドメインと、を含むキメラ抗原受容体であって、前記ＮＫ活性化受容体は２Ｂ４、ＤＮＡＭ－１及びＬＦＡ－１から選択され、前記ＮＫ活性化受容体のリガンドはＣＤ４８、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２及びＩＣＡＭ３から選択されるキメラ抗原受容体。
2. 前記共刺激ドメインは、ＣＤ１５５、ＩＣＡＭ３及び２Ｂ４などのタンパク質から選択されるタンパク質の細胞内ドメインを含む請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
3. 前記ＣＤ１５５の細胞内ドメインは、配列番号２５で示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、ＩＣＡＭ３の細胞内ドメインは、配列番号２７で示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有し、２Ｂ４の細胞内ドメインは、配列番号２７で示されるアミノ酸配列に少なくとも９０％、９５％、９７％又は９９％又は１００％の配列同一性を有する請求項２に記載のキメラ抗原受容体。
4. 前記共刺激ドメインは、ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０、ＣＡＲＤ１１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ８３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ２７０、ＣＤ２７２、ＣＤ２７６、ＣＤ２７８、ＣＤ３５７、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＬＡＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＰ７６、ＰＤ－１、ＬＩＧＨＴ、ＴＲＩＭ、ＣＤ９４、ＬＴＢ、ＺＡＰ７０及びそれらの組み合わせ等のタンパク質から選択されるタンパク質のシグナル伝達ドメインを更に含む請求項１から３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
5. 前記共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７又はＣＤ２７８のシグナル伝達ドメイン又はそれらの組み合わせを更に含む請求項１から３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
6. 前記リガンド結合ドメインは、免疫グロブリン分子、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ｓｃＦｖ、直線状抗体、重鎖抗体、ｓｄＡｂ又はナノ抗体から選択される請求項１から５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
7. 前記リガンド結合ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ４６、ＣＤ７０、ＴＳＨＲ、ＣＤ１９、ＣＤ１２３、ＣＤ２２、ＢＡＦＦ－Ｒ、ＣＤ３０、ＣＤ１７１、ＣＳ－１、ＣＬＬ－１、ＣＤ３３、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＢＣＭＡ、ＧＰＲＣ５Ｄ、Ｔｎ Ａｇ、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、ＦＬＴ３、ＦＡＰ、ＴＡＧ７２、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＥＡ、ＥＰＣＡＭ、Ｂ７Ｈ３、ＫＩＴ、ＩＬ－１３Ｒａ２、メソテリン、ＩＬ－ｌ ｌＲａ、ＰＳＣＡ、ＰＲＳＳ２１、ＶＥＧＦＲ２、ＬｅｗｉｓＹ、ＣＤ２４、ＰＤＧＦＲ－β、ＳＳＥＡ－４、ＣＤ２０、ＡＦＰ、Ｆｏｌａｔｅ受容体α、ＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２／ｎｅｕ）、ＭＵＣ１、ＥＧＦＲ、ＣＳ１、ＣＤ１３８、ＮＣＡＭ、Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２、Ｐｒｏｓｔａｓｅ、ＰＡＰ、ＥＬＦ２Ｍ、Ｅｐｈｒｉｎ Ｂ２、ＩＧＦ－Ｉ受容体、ＣＡＩＸ、ＬＭＰ２、ｇｐｌｏｏ、ｂｃｒ－ａｂｌ、チロシナーゼ、ＥｐｈＡ２、Ｆｕｃｏｓｙｌ ＧＭｌ、ｓＬｅ、ＧＭ３、ＴＧＳ５、ＨＭＷＭＡＡ、ｏ－アセチル－ＧＤ２、Ｆｏｌａｔｅ受容体β、ＴＥＭ１／ＣＤ２４８、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＣＸＯＲＦ６１、ＣＤ９７、ＣＤ１７９ａ、ＡＬＫ、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＮＹ－ＢＲ－１、ＵＰＫ２、ＨＡＶＣＲ１、ＡＤＲＢ３、ＰＡＮＸ３、ＧＰＲ２０、ＬＹ６Ｋ、ＯＲ５１Ｅ２、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＥ－ｌａ、ＭＡＧＥ－Ａ１、ポッドプロテイン、ＨＰＶ Ｅ６、Ｅ７、ＭＡＧＥ Ａｌ、ＥＴＶ６－ＡＭＬ、精子タンパク質１７、ＸＡＧＥ１、Ｔｉｅ ２、ＭＡＤ－ＣＴ－１、ＭＡＤ－ＣＴ－２、Ｆｏｓ関連抗原１、ｐ５３、ｐ５３変異体、前立腺特異的タンパク質、サバイビン及びテロメラーゼ、ＰＣＴＡ－ｌ／Ｇａｌｅｃｔｉｎ ８、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴｌ、Ｒａｓ変異体、ｈＴＥＲＴ、肉腫転座ブレークポイント、ＭＬ－ＩＡＰ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２ ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、アンドロゲン受容体、Ｃｙｃｌｉｎ Ｂｌ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ－２、ＣＹＰ１Ｂ １、ＢＯＲＩＳ、ＳＡＲＴ３、ＰＡＸ５、ＯＹ－ＴＥＳ １、ＬＣＫ、ＡＫＡＰ－４、ＳＳＸ２、ＲＡＧＥ－１、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２、腸内カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０－２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７２、ＬＡＩＲ１、ＦＣＡＲ、ＬＩＬＲＡ２、ＣＤ３００ＬＦ、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＢＳＴ２、ＥＭＲ２、ＬＹ７５、ＧＰＣ３、ＦＣＲＬ５、ＩＧＬＬ１、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＴＧＦβ、ＡＰＲＩＬ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、及び／又は病原体特異抗原、ビオチン化分子、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＢＶ及び／又は他の病原体によって発現される分子、並びに／或いはネオエピトープ又はネオ抗原から選択される１つ又は複数のターゲットに結合される請求項１から６のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
8. 前記膜貫通ドメインは、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲγ鎖、ＴＣＲδ鎖、ＣＤ３ζサブユニット、ＣＤ３εサブユニット、ＣＤ３γサブユニット、ＣＤ３δサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８α、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７及びＣＤ１５４等のタンパク質の膜貫通ドメインから選択される請求項１から７のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
9. 前記細胞内シグナル伝達ドメインは、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３ζ、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ及びＣＤ６６ｄ等のタンパク質のシグナル伝達ドメインから選択される請求項１から８のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
10. 請求項１から９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸分子。
11. 請求項１０に記載の核酸分子を含むベクター。
12. 請求項１から９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項１０に記載の核酸分子、又は請求項１１に記載のベクターを含む改変免疫細胞。
13. 前記改変免疫細胞において、共刺激ドメインとして用いられる対応の内因性ＮＫ活性化受容体又はリガンドの発現は、抑制され又はサイレンシングされる請求項１２に記載の改変免疫細胞。
14. ＮＫ活性化受容体又はそのリガンドの発現が抑制され又はサイレンシングされ、前記ＮＫ活性化受容体が２Ｂ４、ＤＮＡＭ－１及びＬＦＡ－１から選択され、前記ＮＫ活性化受容体のリガンドがＣＤ４８、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２及びＩＣＡＭ３から選択される改変免疫細胞。
15. ＴＲＡＣ、ＴＲＢＣ、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、Ｂ２Ｍ、ＲＦＸ５、ＲＦＸＡＰ、ＲＦＸＡＮＫ、ＣＩＩＴＡ、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４から選択される少なくとも１種類をさらに含む遺伝子の発現が抑制され又はサイレンシングされる請求項１２から１４のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
16. 前記免疫細胞は、Ｔ細胞、マクロファージ、樹状細胞、単核細胞、ＮＫ細胞、又はＮＫＴ細胞から選択される請求項１２から１５のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
17. 前記免疫細胞は、成体幹細胞、胚性幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髓幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞又は造血幹細胞から派生される請求項１２から１６のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
18. 前記免疫細胞は、キメラ抗原受容体又は組換えＴ細胞受容体をさらに発現する請求項１２から１６のいずれか一項に記載の改変免疫細胞。
19. 前記免疫細胞は、リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体をさらに発現し、前記共刺激ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７又はＣＤ２７８のシグナル伝達ドメイン又はそれらの組み合わせから選択される請求項１８に記載の改変免疫細胞。
20. 請求項１２から１９のいずれか一項に記載の改変免疫細胞と、多種薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物。
21. 癌、感染又は自己免疫疾患を治療する薬の調製における、請求項１から９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項１０に記載の核酸分子、請求項１１に記載のベクター、請求項１２から１９のいずれか一項に記載の改変免疫細胞又は請求項２０に記載の医薬組成物の使用。