CN108913709A - 用于治疗hcc的核酸、其制备方法、具有该核酸的car-t细胞及细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了用于治疗HCC的核酸、其制备方法、具有该核酸的CAR‑T细胞及细胞的制备方法，其序列中至少包含有如SEQ ID NO.6所述的CD226共刺激区核酸序列，以及如SEQ ID NO.7所述的4‑1BB共刺激区核酸序列。本发明促进IFN‑γ等细胞因子的产生从而克服肝肿瘤微环境的抑制作用，提高T细胞的浸润率、增殖率和存活率，让GPC3‑226BB‑CART细胞在注射到体内后，在肿瘤内存活并持续增殖，直到肿瘤被消除。

Description

用于治疗HCC的核酸、其制备方法、具有该核酸的CAR-T细胞及 细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及基因技术领域，尤其涉及一种用于治疗HCC的核酸、其制备方法、具有该核酸的CAR-T细胞及细胞的制备方法。
背景技术
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)简称肝癌，是目前全球最为常见的恶性肿瘤之一，其发病率位居全球第五，死亡率位居全球第二。2018年2月，国家癌症中心发布了最新一期的全国癌症统计数据，原发性肝癌全球每年新发病例85.4万例，中国46.6万，约占全球的55％；每年因原发性肝癌死亡81万例，中国为42.2万，约占全球的45％-50％。目前针对常见早期肝癌的治疗手段包括手术、肝脏移植以及放射治疗。然而，许多患者由于很多具体情况不适宜使用上述方法，此外，这些疗法成本高昂而且存在严重的副作用。
嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)修饰T细胞的过继疗法在肿瘤免疫疗法的领域中是近年来新兴的技术。这种治疗方法通过对T细胞进行基因修饰，可使T细胞靶向作用于肿瘤细胞而发挥T细胞的杀伤功能。磷脂酰肌醇蛋白聚糖－3(GPC3)是HCC的一种重要肿瘤相关抗原。据统计，72％-81％的HCC患者肿瘤组织高表达GPC3蛋白。目前，以GPC3为靶抗原，制备表达抗GPC3嵌合抗原受体的T淋巴细胞(GPC3-226BB-CART)用于治疗肝癌已成为研究热点，但其疗效仍不能令人满意。这是因为肝肿瘤的EPR效应和强的免疫抑制微环境降低了CART细胞的浸润率、增殖率和存活率。因此如何调控GPC3-226BB-CART细胞对肝癌细胞的杀伤活性，增强肝肿瘤细胞对GPC3-226BB-CART细胞杀伤的敏感性，是目前肝癌免疫治疗研究中的关键问题。
CAR由三个区域依次组成，即胞外抗原结合区、跨膜区和胞内信号转导区。对T细胞的激活和增殖起决定性作用的是胞内信号区，在最初研究，单个信号转导区即胞内信号域免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM)大多使用CD3ζ或FcεRIγ。ITAM发出的激活信号不能提供长时间的多克隆扩增和持续的体内抗肿瘤效应，只能引起T细胞短暂的分裂和较低水平的细胞因子分泌。后来，CAR引入了共刺激分子，共刺激分子包括B7/CD28和肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体(TNF/TNFR)超家族，常用的是CD28或4-1BB。研究还表明引入不同或不同数量的共刺激分子对CAR-T细胞在体内的存活时间、肿瘤定位的CAR-T细胞数量以及抗肿瘤能力都有影响。专利CN201310164725.X和专利CN201710502507.0都公开嵌合抗原受体scFv(GPC3)-CD28-4-1BB-CD3ζ，其中在专利CN201310164725.X比较了引入不同或不同数量的共刺激分子CAR-T细胞对高表达GPC3肝细胞癌细胞系的杀伤率。然而，这种CAR-T细胞只对体外肝细胞癌细胞系具有杀伤率，对体内肝癌组织的杀伤仍然有待于提高，而本领域技术人员一直没有做出更大的改进。
因此，开发一种新用于治疗HCC的核酸、其制备方法、具有该核酸的CAR-T细胞及细胞的制备方法，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和工业应用潜力，这正是本发明得以完成的动力所在和基础。
发明内容
为了克服上述所指出的现有技术的缺陷，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，从而完成了本发明。
具体而言，本发明所要解决的技术问题是：提供用于治疗HCC的核酸、其制备方法、具有该核酸的CAR-T细胞及细胞的制备方法，以促进IFN-γ等细胞因子的产生从而克服肝肿瘤微环境的抑制作用，提高T细胞的浸润率、增殖率和存活率，让GPC3-226BB-CART细胞在注射到体内后，在肿瘤内存活并持续增殖，直到肿瘤被消除。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
第一方面，本发明提供了用于治疗HCC的核酸，其序列中至少包含有
如SEQ ID NO.6所述的CD226共刺激区核酸序列，
以及如SEQ ID NO.7所述的4-1BB共刺激区核酸序列。
在本发明的所述的核酸中，作为一种改进，其序列包括顺序连接的
如SEQ ID NO.2所述的CD8Leader核酸序列；
如SEQ ID NO.3所述的GPC3scFv核酸序列；
如SEQ ID NO.4所述的CD8α铰链区核酸序列；
如SEQ ID NO.5所述的CD8α跨膜区核酸序列；
如SEQ ID NO.6所述的CD226共刺激区核酸序列；
如SEQ ID NO.7所述的4-1BB共刺激区核酸序列；
如SEQ ID NO.8所述的CD3ζ信号传导区核酸序列。
在本发明的所述的核酸中，作为一种改进，所述核酸的序列如SEQ ID NO.1所述。
第二方面，本发明提供了核酸的制备方法，包括如下步骤：
(1)分别按Leader核酸人工序列、GPC3单链抗体核酸人工序列、CD8铰链区核酸人工序列、CD8跨膜区核酸人工序列、CD226共刺激区核酸人工序列、4-1BB共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，得到pUC-GPC3-226BB-CAR；
(2)将pUC-GPC3-226BB-CAR进行双酶切，利用琼胶电泳将GPC3-226BB-CAR DNA片段琼胶部位切下，利用DNA extraction kit溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的GPC3-226BB-CAR DNA片段。
第三方面，本发明提供了CAR-T细胞，包含具有如上所述核酸的质粒。
在本发明的所述的CAR-T细胞中，作为一种改进，所述质粒是将融合基因片段GPC3-226BB-CAR DNA插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP得到的pLent-GPC3-226BB-CAR质粒。
在本发明的所述的CAR-T细胞中，作为一种改进，所述质粒采用如下制备方法制备得到：将上述纯化的GPC3-226BB-CAR DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段在连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；GPC3-226BB-CAR DNA片段：4μl；线性化的pLent-C-GFP DNA片段：4μl，连接形成。
第四方面，本发明提供了CAR-T细胞的制备方法，包括如下步骤：
首先将上述的pLent-GPC3-226BB-CAR质粒进行慢病毒包装，然后利用重组慢病毒感染T细胞。
第五方面，本发明提供了该基因的应用，是指该基因在制备治疗HCC的药物中能够得以应用。所述药物形式包括但不限于试剂盒。
CAR-T细胞的试剂盒，包括
(1)获得如上所述的稳定表达GPC3-226BB-CART的载体；
(2)载体稀释液。
采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：
本发明提供的核酸和CAR-T细胞，引入CD226和4-1BB两个共刺激分子，CD226又名DNAX辅助分子(DNAM-1)，是一种表达于NK细胞、CTL细胞和血小板等多种细胞表面的活化性受体，属于肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体(TNF/TNFR)超家族共刺激分子，由胞膜外区、跨膜区和胞浆区组成，分子量为65～67kDa，胞膜外区有2个IgSF V样结构域和潜在的糖基化位点，胞浆区有磷酸化及与信号分子相互作用的位点。胞内的丝氨酸残基被激酶磷酸化，并与LFA-1分子结合，结合后的蛋白复合体被招募到脂筏上，接着分子的酪氨酸残基被一个或多个Src家族的激酶磷酸化，这一磷酸化引起了依赖的级联信号的放大，引起了T细胞的活化与粘附响应。另外，研究还表明CD226胞质区重组蛋白促进PBMC分泌IFN-γ。
本发明与常规的治疗HCC的CAR相比，促进IFN-γ等细胞因子的产生从而克服肝肿瘤微环境的抑制作用，提高T细胞的浸润率、增殖率和存活率，让GPC3-226BB-CART细胞在注射到体内后，在肿瘤内存活并持续增殖，直到肿瘤被消除。
附图说明
图1为本发明所述嵌合抗原受体Leader-GPC3scFv-CD8α-CD226-4-1BB-CD3ζ原理设计图。
图2为本发明GPC3-226BB CAR T细胞的表达GPC3-226BB CAR的效率为22.2％(右为流式峰图，左为散点图)。
图3为本发明ELIspot实验检测图。左图为GPC3-226BB CAR T分泌IFN-γ的情况；右图GPC3-28BB CAR T分泌IFN-γ的情况；与细胞株Hep3B混合培养的GPC3-226BB-CAR T细胞IFN-γ的分泌能力显著高于GPC3-28BB-CAR T细胞。
图4为ELISA检测荷瘤小鼠血清甲胎蛋白变化图。荷瘤3日小鼠血清甲胎蛋白水平明显升高，说明小鼠荷瘤成功。
图5为肝组织黄绿色荧光图。GPC3-226BB-CART治疗组，小鼠肿瘤内一直含有绿色荧光，而GPC3-28BB-CART治疗组，小鼠肿瘤内一直未发现绿色荧光。因此，本发明治疗HCC的GPC3-226BB CAR与常规的治疗HCC的CAR相比，可以克服肝肿瘤微环境的抑制作用，提高T细胞的浸润率、增殖率和存活率，让GPC3-226BB-CART细胞在注射到体内后，在肿瘤内存活并持续增殖，直到肿瘤被消除。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
实施例1
用于治疗HCC的核酸，其序列中至少包含有如SEQ ID NO.6所述的CD226共刺激区核酸序列，以及如SEQ ID NO.7所述的4-1BB共刺激区核酸序列。
本实施例中，如图1所示，用于治疗HCC的核酸的序列包括顺序连接的如SEQ IDNO.2所述的CD8Leader核酸序列；如SEQ ID NO.3所述的GPC3scFv核酸序列；如SEQ ID NO.4所述的CD8α铰链区核酸序列；如SEQ ID NO.5所述的CD8α跨膜区核酸序列；如SEQ ID NO.6所述的CD226共刺激区核酸序列；如SEQ ID NO.7所述的4-1BB共刺激区核酸序列；如SEQ IDNO.8所述的CD3ζ信号传导区核酸序列。
实施例2
治疗HCC的核酸的制备方法，包括如下步骤：
(1)分别按Leader核酸人工序列、GPC3单链抗体核酸人工序列、CD8铰链区核酸人工序列、CD8跨膜区核酸人工序列、CD226共刺激区核酸人工序列、4-1BB共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，得到pUC-GPC3-226BB-CAR；
(2)将pUC-GPC3-226BB-CAR进行双酶切，利用琼胶电泳将GPC3-226BB-CAR DNA片段琼胶部位切下，利用DNA extraction kit溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的GPC3-226BB-CAR DNA片段。
本实施例中，更详细的步骤为：
(1)分别按Leader核酸人工序列、GPC3单链抗体核酸人工序列、CD8铰链区核酸人工序列、CD8跨膜区核酸人工序列、CD226共刺激区核酸人工序列、4-1BB共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，因此命名为pUC-GPC3-226BB-CAR；
(2)将pUC-GPC3-226BB-CAR载体进行Fast Digest AsiSI(购自ThermoFisher公司)和Fast Digest NotI(购自ThermoFisher公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳将把含有GPC3-226BB-CAR DNA片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。采用DNAextraction kit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500μl DF buffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500μl Wash Buffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DF Column转移至上另一干净的微量离心管，加入25μlElution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的GPC3-226BB-CAR DNA片段。
实施例3
质粒，所述质粒是将融合基因片段GPC3-226BB-CAR DNA插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP得到的pLent-GPC3-226BB-CAR质粒。所述质粒采用如下制备方法制备得到：将上述纯化的GPC3-226BB-CAR DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段在连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；GPC3-226BB-CAR DNA片段：4μl；线性化的pLent-C-GFP DNA片段：4μl，连接形成。
本实施例中，该质粒采用如下的方法制备得到：
分别按Leader核酸人工序列、GPC3单链抗体核酸人工序列、CD8铰链区核酸人工序列、CD8跨膜区核酸人工序列、CD226共刺激区核酸人工序列、4-1BB共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，因此命名为pUC-GPC3-226BB-CAR，同时将pUC-GPC3-226BB-CAR和pLent-C-GFP载体进行Fast Digest AsiSI(购自ThermoFisher公司)和Fast Digest NotI(购自ThermoFisher公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳将分别把含有GPC3-226BB-CAR DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。采用DNA extraction kit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500μl DF buffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500μl Wash Buffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DF Column转移至上另一干净的微量离心管，加入25μlElution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的GPC3-226BB-CAR DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段。
将上述两种DNA片段在16℃进行过夜连接形成pLent-GPC3-226BB-CAR质粒。连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；GPC3-226BB-CAR DNA：4μl；线性化的pLent-C-GFPDNA：4μl。
实施例4
质粒的纯化：将上述pLent-GPC3-226BB-CAR转化到E.coli(DH5α)。具体步骤如下：将质粒和感受态细胞混匀在冰上孵育半小时，再42度热激90秒，再冰上放置2min，最后加液体LB培养基缓摇1个小时左右再3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有氨苄LB固体平板。次日挑取单菌落进行过夜培养，采用质粒提取纯化试剂盒(购自Qiagen公司)提取pLent-GPC3-226BB-CAR质粒，具体步骤如下：(1)取1.5ml菌液室温10000×g离心1min。(2)去上清，加250μl溶液Ⅰ(含RNase A)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。(3)加入250μl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4～6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min。(4)加350μl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000×g离心10min。(5)特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱。(6)弃滤过液，加500μl Buffer HBC，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。(7)弃滤过液，再用100％乙醇稀释的750μl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min。(8)再加750μl Wash Buffer清洗吸收柱。(9)必须将吸收柱10000×g离心2min确保乙醇被去除。(10)将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加50-100μl(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，10000×g离心5min，收集质粒DNA。(11)和预知浓度DNA样品(Marker)一起做琼脂糖凝胶电泳，对比结果，得出pLent-GPC3-226BB-CAR质粒浓度为556ng/μl。
将上述的pLent-GPC3-226BB-CAR质粒委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序。经测序正确后备用。
实施例5
CAR-T细胞，包含具有如上所述核酸的质粒。
该CAR-T细胞的制备方法包括如下步骤：首先将上述的pLent-GPC3-226BB-CAR质粒进行慢病毒包装，然后利用重组慢病毒感染T细胞。
本实施例中，CAR-T细胞的制备方法为：
A.慢病毒包装，滴度检测
采用Lentiviral Packaging Kit慢病毒包装试剂盒，具体方法如下：将慢病毒包装细胞系293T接种于含有DMEM+10％FBS 10cm培养皿中，37℃，5％的CO2条件下培养，贴壁率为70％-80％时准备转染。取无菌的1.5ml EP管或15ml离心管，按下列组分配制反应体系：无血清DMEM：4ml；pLent-GPC3-226BB-CAR质粒：10μg；GM easyTM Lentiviral Mix：10μl(10μg)；HG TransgeneTM Reagent：60μl。混匀后，室温放置20min后，均匀滴加到含有293T细胞培养皿中，后置于CO2培养箱中培养。转染24后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15ml含有10％血清新鲜的培养基继续培养。换液48h后，吸取细胞上清液于50ml离心管，4℃，500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中。此时上清液中的病毒颗粒可以直接去检测滴度。取上述100μl病毒液采用慢病毒载体(HIVP24)快速检测卡测定滴度，重组慢病毒的滴度1.25×106TU/ml。
B.GPC3-226BB-CAR T的制备
T细胞的制备
取75ml健康捐赠者的新鲜外周血，用TBD样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离外周血单个核细胞PBMC方法如下：
1)将外周血75ml与生理盐水按1:1的比例稀释。将稀释后的血液小心地加在同等体积淋巴细胞分离液上，形成明显分层，室温水平离心1200rpm/min，20min。此时离心管中自上而下形成4层；血清、由PBMC构成的白膜层，淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞沉淀层。
2)用吸管小心吸取白膜层，尽量全部吸出PBMC。加2倍量生理盐水，洗涤细胞2次，每次混匀后离心、800rpm/min，10min。低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板和淋巴细胞分离液，离心后弃去上清，收集PBMC细胞。
用含有1000IU/ml的重组干扰素α2a(购自沈阳三生制药)的培养基(购自CORNING公司，88-551-CM)诱导培养上述单个核细胞，24小时后，加入1000IU/ml的重组白细胞介素2(购自沈阳三生制药)、50ng/ml的OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时。每隔两天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测T细胞中的CD3+、CD56+的阳性表达率(CD3-FITC，CD16/CD56-PE抗体购自BECKMAN公司，A07735)。CD3+阳性率>80％，CD3+CD56+双阳性率>20％，视为T诱导成功，并留取该T待病毒感染。
慢病毒感染T细胞及感染后T细胞的扩增培养
以MOI＝5用上述重组慢病毒感染T细胞。感染后的细胞37℃，5％CO2培养箱中培养12小时后，收集细胞弃上清，重新加入等量病毒液，Polybrene(8μg/ml)和细胞培养液，37℃，5％CO2培养箱中继续培养，12h后吸弃培养上清，加入10ml的新鲜CORNING培养基，继续扩大培养，培养17天至细胞扩增至足够的用量。通过FC500流式细胞仪(购自BECKMAN公司)FL1通道检测嵌合抗原受体表达(图2)。以未感染的T淋巴细胞作为阴性对照，重组慢病毒感染T细胞其阳性率22.2％。
实施例6
GPC3-226BB-CAR T细胞与靶细胞共培养后IFN-γ分泌检测
高表达GPC3的肝细胞癌靶细胞系Hep3B(购自南京凯基生物科技发展有限公司)为靶细胞，效应细胞为上述GPC3-226BB-CAR T，其中专利CN201710502507.0公开靶向GPC3的CAR T作为阴性对照组，其结构为GPC3scFv-CD8α-CD28-4-1BB-CD3ζ，以下简称GPC3-28BB-CAR T。
将GPC3-226BB-CAR T和GPC3-28BB-CAR T分别按E：T(效应细胞和靶细胞比)为1：1与细胞株Hep3B混合培养20h时，并用ELIspot实验(购自eBioscience公司)分别检测GPC3-226BB-CAR T和GPC3-28BB-CAR T细胞IFN-γ的分泌。ELIspot具体步骤：
第1天：细胞培养(无菌操作)1.预包被板活化：每孔加入RPMI-1640培养基，室温静置5-10分钟后拍板去净培养基。2.加入细胞悬液：将调整好浓度的细胞悬液加入各实验孔，100μL/孔；阳性对照孔：细胞浓度1×105/孔，加入细胞培养基和PHA；阴性对照孔：细胞浓度1×105/孔，加入等体积细胞培养基；背景负对照：加入含胎牛血清的RPMI-1640培养基。3.孵育：放入37℃，5％CO2培养箱培养16-20小时。
第2天：培养后操作(不再需要无菌操作)4.裂解细胞：倾倒孔内细胞及培养基。加冰浴过的去离子水，200μL/孔，4℃冰箱放置10分钟低渗裂解细胞。5.洗板：倾倒孔内液体，1×Washing buffer，200μL/孔，洗涤5-7次。每次静置30-60s。最后一次，在吸水纸上拍板去净液体。6.检测抗体孵育：将生物素标记的抗体溶液加入板孔，100μL/孔。37℃孵育1小时。7.洗板：倾倒孔内液体，1×Washing buffer，200μL/孔，洗涤5次。每次静置30-60秒。最后一次，在吸水纸上拍板去净液体。8.酶联亲和素孵育：将稀释好的酶标亲和素溶液加入板孔，100μL/孔。37℃孵育1小时。9.洗板：倾倒孔内液体，1×Washing buffer，200μL/孔，洗涤5次。每次静置30-60秒。最后一次，在吸水纸上拍板去净液体。10.显色：将现配的AEC显色液加入各板孔，100μL/孔。室温避光静置显色25分钟，11.终止显色：倾倒孔内液体，揭开板底座，用去离子水洗涤3-5遍，终止显色。板放置在室温阴凉处，待其自然晾干后合上底座。12.ELISPOT板斑点拍照并分析。
结果表明：与细胞株Hep3B混合培养的GPC3-226BB-CAR T细胞IFN-γ的分泌能力显著高于GPC3-28BB-CAR T细胞(图3)。
实施例7
GPC3-226BB-CART细胞杀伤实验
(1)小鼠肝癌模型的建立
选用高表达GPC3的肝细胞癌靶细胞系Hep3B，注射入BALB/c小鼠(购自南京大学模式动物研究所)腹腔扩增，待小鼠出现腹水后抽取腹水提取Hep3B细胞，抽取腹水离心弃上清后加入预冷的PBS溶液吹打冲洗1000rpm离心后弃上清，重复以上过程2-3次，再加入预冷的PBS溶液吹匀后500rpm离心，红细胞留于上清，弃上清保留沉淀细胞，加入1640细胞培养基制成Hep3B细胞悬液，将BALB/c小鼠以戊巴比妥钠麻醉，固定后于小鼠剑突下剪开皮肤和腹膜，使小鼠肝左叶暴露出切口，用微量注射器抽取1×107 5μL细胞悬液注射入小鼠肝脏；微量注射器拔出后立即以75％酒精棉签按压针孔至肝脏表面不再渗血，用粘合剂封闭针孔。3天后，通过小鼠静脉采血测定AFP来评估建模是否成功，具体步骤如按照甲胎蛋白ELISA酶免试剂盒(BioCheck，Inc)进行操作。
1)取荷瘤小鼠和正常小鼠的血液，离心取血清；
2)配制工作用洗涤液：浓缩洗涤液20ml/瓶，用蒸馏水1∶20稀释后使用；
3)加样：设空白对照1孔，阴、阳性对照各2孔，分别加阴、阳性对照各50μl和50μl待测样本于相应孔内；
4)加酶：除空白对照孔外，每孔加1滴(50μl)酶标记物，轻轻振荡，用透明胶条将板孔封好；
5)温育：37℃水浴30min；
6)洗涤：扣去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置20s，除去洗涤液，重复4次后在吸水纸上拍干；
7)显色：每孔加入底物液A、B各1滴，轻轻振荡封板后，置37℃水浴15分钟；
8)结果判定：每孔加终止液1滴，用酶标仪检测(波长450nm)各孔OD值(空白孔调零)。
结果检测到荷瘤后3日小鼠血清甲胎蛋白表达水平明显升高(见图4)，说明小鼠肝癌模型建立成功。
(2)GPC3-226BB-CAR T细胞体内杀伤
将培养2周的荷瘤小鼠随机分成3组，每组21只，开始注射治疗实验。实验组分别为：
a.对照组，尾部静脉注射同等体积的生理盐水；
b.治疗一组，尾部静脉注射2×106个细胞/只GPC3-226BB-CAR T细胞；
c.治疗二组，尾部静脉注射2×106个细胞/只GPC3-28BB-CAR T细胞。
注射CAR-T细胞后第7天、第14天和第21天，取各组小鼠以10g/L戊巴比妥钠腹腔麻醉，解剖观察瘤的形态；取部分肝脏组织用40g/L中性福尔马林固定，脱水、石蜡包埋，切片，荧光显微镜下通过绿色荧光观察CAR T的在肿瘤内的增殖和持续存在的情况。
本专利GPC3-226BB-CART治疗组，小鼠肿瘤逐渐的缩小，其中2只小鼠肿瘤全部消失，而GPC3-28BB-CART治疗组，小鼠肿瘤无变化。通过组织切片可知，GPC3-226BB-CART治疗组，小鼠肿瘤内含有GPC3-226BB-CART。而GPC3-28BB-CART治疗组，小鼠肿瘤内一直未发现GPC3-28BB-CART细胞(见图5)。
实施例8
CAR-T细胞的试剂盒，包括
(1)获得如上所述的稳定表达GPC3-226BB-CART的载体；
(2)载体稀释液；
(3)使用说明书；
其中，使用说明书包括如上所述实施例7所述静脉注射方法。
应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。

Claims (10)

1.用于治疗HCC的核酸，其特征在于：其序列中至少包含有
如SEQ ID NO.6所述的CD226共刺激区核酸序列，
以及如SEQ ID NO.7所述的4-1BB共刺激区核酸序列。
2.如权利要求1所述的用于治疗HCC的核酸，其特征在于：其序列包括顺序连接的
如SEQ ID NO.2所述的CD8 Leader核酸序列；
如SEQ ID NO.3所述的GPC3scFv核酸序列；
如SEQ ID NO.4所述的CD8α铰链区核酸序列；
如SEQ ID NO.5所述的CD8α跨膜区核酸序列；
如SEQ ID NO.6所述的CD226共刺激区核酸序列；
如SEQ ID NO.7所述的4-1BB共刺激区核酸序列；
如SEQ ID NO.8所述的CD3ζ信号传导区核酸序列。
3.如权利要求2所述的用于治疗HCC的核酸，其特征在于：其序列如SEQ ID NO.1所述。
4.制备如权利要求2所述核酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)分别按Leader核酸人工序列、GPC3单链抗体核酸人工序列、CD8铰链区核酸人工序列、CD8跨膜区核酸人工序列、CD226共刺激区核酸人工序列、4-1BB共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，得到pUC-GPC3-226BB-CAR；
(2)将pUC-GPC3-226BB-CAR进行双酶切，利用琼胶电泳将GPC3-226BB-CAR DNA片段琼胶部位切下，利用DNA extraction kit溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的GPC3-226BB-CAR DNA片段。
5.CAR-T细胞，其特征在于：包含具有如权利要求1-3任一项所述核酸的质粒。
6.如权利要求5所述的CAR-T细胞，其特征在于：所述质粒是将融合基因片段GPC3-226BB-CAR DNA插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP得到的pLent-GPC3-226BB-CAR质粒。
7.如权利要求6所述的CAR-T细胞，其特征在于：所述质粒采用如下制备方法制备得到：将上述纯化的GPC3-226BB-CAR DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段在连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；GPC3-226BB-CAR DNA片段：4μl；线性化的pLent-C-GFPDNA片段：4μl，连接形成。
8.制备如权利要求5所述的CAR-T细胞的方法，其特征在于：包括如下步骤：首先将上述的pLent-GPC3-226BB-CAR质粒进行慢病毒包装，然后利用重组慢病毒感染T细胞。
9.如权利要求5所述的CAR-T细胞在制备治疗HCC的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：所述药物形式包括但不限于试剂盒，该试剂盒，包括
(1)获得如上所述的稳定表达GPC3-226BB-CART的载体；
(2)载体稀释液。
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