CN107699591A

CN107699591A - 一种敲除pd‑1的t细胞制备方法及其应用

Info

Publication number: CN107699591A
Application number: CN201710322510.4A
Authority: CN
Inventors: 刘明录; 冯建海; 张传鹏; 强邦明; 金海锋; 万磊; 韩庆梅
Original assignee: Jinan Xingyi Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Jinan Xingyi Medical Technology Co Ltd
Priority date: 2017-05-09
Filing date: 2017-05-09
Publication date: 2018-02-16
Anticipated expiration: 2037-05-09
Also published as: CN107699591B

Abstract

本发明属于生物与新医药技术领域。公开了一种敲除PD‑1的T细胞制备方法，该技术是利用Crispr/Cas9系统来敲除PD‑1基因。本发明还涉及Crispr/Cas9技术修饰的T细胞，所述T细胞表面含有PD‑1蛋白，可与癌细胞表面的PD‑L1蛋白结合，阻碍活化T细胞攻击癌细胞。敲除T细胞中的PD‑1基因，打开了免疫系统的刹车闸，增强免疫系统的功能。

Description

一种敲除PD-1的T细胞制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物与新医药技术领域，更具体的说，是一种敲除PD-1的T细胞制备方法及应用。

背景技术

PD-1(程序性死亡受体1，programmed death 1)是55KD的跨膜蛋白，属于免疫球蛋白超家族成员。其胞外区只有1个IgV样区，胞浆区有2个酪氨酸残基，尾部有1个ITIM(immunoreceptor tryosine-based inhibitory motif)。PD-1可表达于活化的T细胞、B细胞和骨髓细胞，以及CD4-CD8-胸腺细胞。PD-1有两个配体，PD-L1(B7-H1)和PD-L2(B7-DC)，均为B7家族中的新成员。PD-1是免疫抑制性受体，与其配体PD-L1、PD-L2相互作用传递抑制性信号，在免疫应答中发挥负向调控作用。T细胞上的PD-1与肿瘤细胞中的PD-L1/PD-L2的结合，可抑制活化的T细胞攻击肿瘤细胞，导致免疫系统不能发挥全部作用，使肿瘤细胞逃逸。

CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，被称为规律成簇间隔短回文重复，实际上就是一种基因编辑器。研究人员发现，它是一种精确的万能基因武器，可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，这些目标基因包括人、老鼠、斑马鱼和细菌的基因等。CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列区(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。

目前发现的CRISPR/Cas系统有三种不同类型即I型、II型和III型，它们存在于大约40％已测序的真细菌和90％已测序的古细菌中。其中II型的组成较为简单，以Cas9蛋白以及向导RNA(gRNA)为核心组成，也是目前研究中最深入的类型。在II型系统中pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9单独参与。研究结果表明，Cas9还可以剪切线性和超螺旋的质粒，其剪切效率堪比限制性内切酶。本研究中使用的就是Crispr/Cas9系统。

由于PD-1蛋白在免疫应答中发挥负向调控作用，使得部分肿瘤细胞逃避T细胞的攻击，造成肿瘤细胞的扩散。敲除T细胞中的PD-1蛋白，可扩大T细胞的攻击范围，增强T细胞的免疫能力。本研究中利用Crispr/Cas9系统，敲除T细胞中的PD-1基因，使其不表达PD-1蛋白，打开免疫系统的刹车闸，增强免疫系统的功能。

发明内容

本发明提供了一个利用Crispr/Cas9系统敲除PD-1基因，表达所述Crispr/Cas9系统的T淋巴细胞，以及所述T淋巴细胞用于制备治疗恶性肿瘤的药物的用途。具体包括：

(1)pHBLV-gRNA-cas9-GFP-PD-1质粒构建

本发明中提供了一个PD-1的靶点基因，利用该靶点构建pHBLV-gRNA-cas9-GFP-PD-1载体。

(2)重组病毒表达载体

本发明中使用的载体是慢病毒载体pHBLV-gRNA-cas9-GFP，pHBLV-gRNA-cas9-GFP表达基因载体含有一个Cas9蛋白，一个巨细胞病毒的启动子序列(CMV Promoter)和标签蛋白(GFP)及选择性的抗性基因(AmpR)。通过基因合成的PD-1gRNA序列，即目标靶点，在T4连接酶作用下，与线性RNA敲除载体连接，形成完整载体pHBLV-gRNA-cas9-GFP-PD-1(载体图谱见图1)。(3)宿主细胞

本发明所用的宿主细胞为一种异质T淋巴细胞——CIK(多种细胞因子诱导的杀伤细胞，cytokine-induced killer)。CIK细胞实际上是体外扩增出的以CD3+CD56+为主的异质性细胞群，该细胞群是在多种细胞因子(如OKT-3、IL-2和IFN-γ等)的刺激下，由从外周血分离出来的单个核细胞在体外培养扩增而成，具有极强的溶瘤活性。相对与普通的T淋巴细胞，CIK具有以下优势：①细胞增殖能力强；②杀伤活力强，毒副作用小，无严重不良反应；③杀瘤谱广，不受MHC限制，具有广谱杀肿瘤和病毒的作用；④典型的生物治疗模式，通过基因工程方法改良的CIK细胞，可对特定肿瘤进行杀伤。

(4)敲除PD-1基因的T细胞的应用途径及剂量

本发明中敲除PD-1基因的T细胞，是自体的T细胞。所用T细胞的数量为0.5×10⁶～1×10⁹/Kg。通常所用的T细胞的剂量为0.5×10⁶-1.0×10⁷/kg。

附图说明

图1为pHBLV-gRNA-cas9-GFP的载体示意图。

图2是本发明外周血单核细胞诱导的CIK倒置显微镜下视野图。

图3是本发明外周血单核细胞诱导的CIK的表面分子标记CD3+CD56+表达的流式图(CD3表达率为81.6％，CD56表达率为49.5％，双阳性为34.6％)。

图4是本发明所述的293T细胞明视野图。

图5是显微镜下观察pHBLV-gRNA-cas9-GFP-PD-1转染293T细胞图。

图6是荧光显微镜下观察收集的病毒颗粒进行的病毒滴度检测。

图7是本发明所述慢病毒感染CIK细胞免疫荧光显微镜下视野图。

图8是本发明所述慢病毒感染CIK细胞后流式细胞术检测其表达率(病毒感染率为12％)。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均可以通过市面上购买获得的常规产品。

实施例1：将基因片段PD-1插入慢病毒表达载体pHBLV-gRNA-cas9-GFP

上述PD-1的核酸人工序列，委托汉恒生物科技有限公司合成，插入pHBLV-gRNA-cas9-GFP载体(见图1)，转化到E.coli(TOP10)，经测序正确后，使用OMEGA公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得重组表达载体的高品质质粒。

实施例2：pHBLV-gRNA-cas9-GFP敲除PD-1的T细胞的制备

(一)异质性T细胞——CIK的制备

取75ml患者外周血，用TBD样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离出单核细胞。用含有1000IU/mL的重组干扰素γ(购自沈阳三生制药)的CORNING培养基(购自CORNING公司)诱导培养24小时后，加入1500IU/mL的重组白细胞介素2(购自沈阳三生制药)和50ng/mL的OKT-3继续培养24小时。每隔三天倍比加液，同时加入5％的自体血浆，培养至第14天，流式细胞术检测CIK细胞中的CD3和CD56的阳性表达率(CD3-FITC、CD16/CD56-PE抗体购自BECKMAN公司)，当CD3+阳性率﹥80％，CD3+CD56+双阳性率﹥20％，视为CIK诱导成功(见图2，图3)，并留取该CIK待病毒感染。

(二)慢病毒包装质粒脂质体转染293T细胞

从液氮罐中取出冻存的293T细胞，迅速丢入37℃水浴锅中并快速晃动，尽量在1～2min内使细胞溶液完全溶解。将细胞溶液转移到15mL离心管中，并在其中加上1mL新鲜的完全培养基，混匀后离心，156g，5min。去掉上清，加入1mL新鲜的完全培养基重悬细胞沉淀后(使用1mL移液枪重悬细胞，在重悬过程中力度要轻柔，防止将培养基吹出泡沫，但是需要尽可能将细胞吹散，约吹打15次)，转入100mm培养皿，每个培养皿补足到10mL培养基。将培养皿平稳放入37℃、5％CO2和95％相对湿度的培养箱中培养。第二天观察细胞存活率，并更换培养基。以后每天观察细胞生长情况(见图4)。

将状态良好的293T细胞铺在100mm的培养皿中，置于37℃、5％CO2和95％相对湿度的培养箱中培养2天。观察细胞密度，达到70～80％的汇合率即可进行转染。做脂转complex：Opti MEM需在37℃水浴中预热，Lipofiter^TM转染试剂需恢复至室温方可使用，使用前需摇匀。转染后更换含10％胎牛血清FBS的新鲜完全培养基，转染后6h进行换液(见图5)。

转染每皿100mm的complex成分如下：

转染后48h和72h分别两次收集病毒上清。在48h收毒时，将100mm dish中的培养基倒入50mL离心管中，注意培养皿壁不要接触离心管口，以防出现细菌污染，随后补入10mL含10％FBS的新鲜完全培养基，平稳置于37℃，5％CO2的恒温培养箱中继续培养。在72h收毒时，直接将100mm dish中的培养基倒入50mL离心管中，同样注意培养皿壁不要接触离心管口，以防出现细菌污染。收完72h的病毒原液后，该dish便可以舍弃。将50mL离心管中的病毒上清，4℃，2000g，10min，去除细胞碎片；然后收集病毒原液上清置于超速离心机中，4℃，82700g，离心120min，最后将慢病毒超离液分装到灭菌处理的病毒管中。按照要求分装病毒，-80℃冰箱保存。

(三)滴度检测

将生长状态良好的293T细胞消化计数后稀释至1×10⁵/mL,加入96孔板，100μL/孔，为每个病毒准备6个孔。放入37℃，5%CO2培养箱中培养。第二天，准备6个1.5mL EP管，第一个EP管中加入10μL病毒液，然后做3倍梯度稀释，共6个稀释度。第三天，有需要加puro筛选的孔，先吸弃100μL含病毒培养基，加入100μL含1.5μg/mL puro的10%FBS完全培养基。第五天，在荧光显微镜下观察结果，在观察结果前6h需更换新鲜培养基，从孔中吸出80μL培养基，然后加入80μL新鲜10%FBS完全培养基，放入37℃，5%CO2培养箱中培养。6h后荧光显微镜下观察结果，荧光百分比在10～30%的孔计算病毒滴度（见图6）。根据公式：滴度（TU/mL）=细胞数×荧光百分比×MOI(1)×病毒稀释倍数×10³计算病毒滴度，本次实验中获得的病毒滴度为1×10⁸TU/mL。

（四）慢病毒感染CIK细胞及感染后CIK细胞的扩增培养

从-80℃拿出2ml病毒液解冻后加入培养基，将聚凝胺（购自Sigma公司）加入上述培养基稀释，使其终浓度为10μg/ml。用该病毒液重悬1×10⁶个上述诱导的CIK细胞。将细胞悬液加入到6孔板中，使病毒颗粒数与CIK细胞数比例约为2:1，400g，120min。37℃，5%的CO₂培养箱中培养16小时后，用新鲜培养基稀释一倍，继续培养1天后收集细胞去除剩余的病毒颗粒进行正常培养。为了提高CIK细胞的感染效率，可重复此感染步骤1-2次。根据细胞生长状态及时加入新鲜的完全培养基，培养15-17天使细胞扩增至足够的用量。

（五）免疫荧光显微镜观察pHBLV-gRNA-cas9-GFP在CIK中的表达，利用流式细胞技术检测pHBLV-gRNA-cas9-GFP在CIK中的表达效率；

以100μL生理盐水重悬病毒感染后的CIK细胞，取细胞悬液制作细胞涂片，用荧光显微镜观察pHBLV-gRNA-cas9-GFP在CIK中的表达效率（见图7）。

从培养瓶中取出2mL感染的CIK细胞，利用流式细胞仪检测感染细胞FITC（异硫氰酸盐）通道中感染细胞的阳性表达率（见图8）。

实施例3：敲除PD-1基因的T细胞抗肿瘤作用

（一）治疗前相关工作：

病人在进行敲除PD-1基因的T细胞治疗前，一定要进行全身身体检查，尤其是心、肺、肝、肾功能及血液检测，以确保病人治疗安全，具体检查如下：

1：心脏功能检查：

治疗前，对病人心脏功能进行评级，如果病人心脏功能在三级或三级以上，则病人不适宜进行此治疗。

2：肺功能检查：

肺功能检查通常包括肺通气试验和血液中血氧饱和度检查，如果用力吹气试验(FEV1)小于50％或小于200毫升，血氧饱和度低于90％，则病人不适宜进行治疗，需要进行相应的治疗后，然后考虑进行嵌合抗原受体T细胞治疗。

3：血液常规检查：

在治疗前，对病人进行血液常规检查，检查结果要求病人中性白细胞要大于1500个/mm3,血小板大于100000个/mm3,血红蛋白大于8g/dl,如果病人不能满足要求，则需要进行相应治疗以满足上述要求。

4：肝肾功能检查：

血生化检查中，谷丙转氨酶、天门冬氨酸氨基转移酶不能超出正常值上限的两倍，总胆红素不能超出正常值上限的1.5倍，肌酐要小于或等于1.6mg/ml,或肌酐清除率要大于70ml/(min·1.73m²)。

5：传染性疾病检查：

同时，对病人进行HIV,乙肝、丙肝等检查，以排除病人可能的医院传染。

6：同时要对适龄已婚妇女进行相关检查，排除病人已经怀孕可能。

7：与病人家属签署知情同意书。

(二)治疗前用药：

通过上述检查，病人符合进行敲除PD-1基因的T细胞治疗要求，安排病人进行T细胞回输。

回输前30分钟，给予病人苯海拉明20mg,im，同时给予地塞米松5mg，iv。

(三)回输治疗：

本发明中，T细胞回输的总剂量为5×10⁵个。分3次回输，连续3天，回输剂量比例按照1:3:6。

在回输过程中，要求静脉滴注速度在5-10ml/min，如果病人因为身体原因不能耐受，可以把滴注速度适当放缓，以满足病人要求。

同时，在回输过程中，用心电检测仪对病人生命体征进行持续监测至回输完成后3小时。

(四)回输后跟踪随访：

病人回输完成后，要密切观察病人的生命体征及可能出现的副作用。

常见的副作用有：

1：皮肤发红、瘙痒

2：病人出现心慌、胸闷、呼吸困难

3：腹泻

4：皮下出血、皮疹

5：持续高热

6：谵妄，臆语等神经系统症状

如果出现上述症状，说明病人可能出现了细胞因子综合征，或者是移植物抗宿主病反应，应给予病人激素及对应治疗，这些症状一般持续一周左右后消失。

对于治疗效果的观察，一般表现为病人临床症状的改善。对于实体瘤来说，在回输后的一个月、三个月及半年、一年用影像跟踪观察瘤体大小的变化进行评价治疗效果。血液肿瘤要通过骨髓穿刺来确定骨髓造血细胞中肿瘤细胞的变化，一般在回输治疗后的一个月、三个月、半年及一年进行疗效的评估。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界。

PD-1人工序列（SEQ ID NO.1）

<110> 山东兴瑞生物科技有限公司

<120>一种敲除PD-1的T细胞制备方法及应用

<130> 2017

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

aggcg cagat caaag agag 19

Claims

1.一种敲除PD-1的T细胞制备方法，其特征在于：在PD-1的基因序列中选取19个碱基序列作为靶点，构建pHBLV-gRNA-cas9-GFP-PD-1质粒，利用慢病毒包装体系将PD-1基因包装到慢病毒中，将所述携带PD-1基因的慢病毒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞，得到敲除PD-1基因的T淋巴细胞。

2.如权利要求1所述的一种敲除PD-1的T细胞的制备方法，其特征在于：所述19个碱基序列为序列表SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的一种敲除PD-1的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，所述单核细胞诱导的异质T淋巴细胞如下制备：取患者自身的外周血，分离单个核细胞，用含有重组干扰素γ的Lymphocyte Serum-free Medium KBM 551培养基诱导培养24小时后，加入重组白细胞介素-2和OKT-3诱导继续培养24小时；每隔三天倍比加含有重组白细胞介素-2的培养基，同时加入5％的患者自体血浆，培养至第14天，流式细胞术检测CIK细胞的分子标记CD3+、CD56+的阳性表达率；当CD3+阳性率>80％，CD3+CD56+双阳性率>20％，视为CIK诱导成功，收获患者自体单核细胞诱导的异质T淋巴细胞，用于慢病毒感染。

4.如权利要求1所述的一种敲除PD-1的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，将所述携带PD-1基因的慢病毒感染单核细胞诱导的异质T淋巴细胞如下操作：所述pHBLV-gRNA-cas9-GFP-PD-1质粒和慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒共同转染293T细胞，所述293T细胞内PD-1基因被包装成慢病毒颗粒，释放到细胞外，收集含有慢病毒的上清，并用收集到的上清感染诱导的异质T淋巴细胞。

5.如权利要求1所述的一种敲除PD-1的T淋巴细胞的制备方法，其特征在于，所述敲除PD-1的基因靶点片段如下制取：通过基因合成技术合成PD-1基因。

6.一种治疗癌症的药物，其特征在于：含有权利要求1所述的敲除PD-1的T细胞。

7.权利要求1所述的敲除PD-1的T细胞用于制备治疗恶性肿瘤的药物的用途。

8.如权利要求7所述的制备治疗恶性肿瘤的药物的用途，其特征在于：所述恶性肿瘤为胃癌，肠癌，胰腺癌，间皮瘤，肺癌，乳腺癌和卵巢癌等肿瘤。