CN113980907B - 一种抗flt3嵌合抗原受体修饰的t细胞及其在制备治疗aml药物中的应用 - Google Patents

一种抗flt3嵌合抗原受体修饰的t细胞及其在制备治疗aml药物中的应用 Download PDF

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    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Abstract

本发明提供一种抗FLT3嵌合抗原受体修饰的T细胞，将表达抗FLT3嵌合抗原受体的基因片段插入载体获得重组表达载体,采用慢病毒包装后感染活化的T细胞，得到抗FLT3嵌合抗原受体修饰的T细胞；所述嵌合抗原受体包括单链抗体scFv‑FLT3；所述单链抗体的核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO.3所示；本发明还提供上述嵌合抗原受体修饰的T细胞在制备治疗AML药物中的应用。在效靶比为10:1时，本发明制备的CAR‑AntiFLT3‑T细胞对FLT3+HL‑60细胞的杀伤效率为95.67%，本发明设计的CAR‑AntiFLT3细胞活性受利妥昔单抗的控制，极大的提高CAR技术的临床安全性。

Description

一种抗FLT3嵌合抗原受体修饰的T细胞及其在制备治疗AML药 物中的应用
技术领域
本发明涉及一种抗FLT3嵌合抗原受体修饰的T细胞及其在制备治疗AML药物中的应用，属于生物医药技术领域。
背景技术
近年来，CAR-T细胞在B细胞恶性血液系统肿瘤治疗中取得了惊人的突破。例如，在临床应用中，CAR-T细胞对CD19阳性的难治复发白血病细胞的靶向杀伤作用及高缓解率（80~90%）的临床疗效。这一事实不仅证实了免疫细胞治疗的临床价值，同时也激发了学者对于肿瘤相关抗原和CAR-T细胞技术的拓展热情。
急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia，AML)是最常见的白血病类型之一，且难以治愈，5年生存率小于33%。急性髓系白血病的治疗首先是进行诱导缓解化学药物治疗，获得缓解后再进行巩固和强化治疗，待患者身体状态良好时进行干细胞移植，可辅助放射治疗，多数患者需长期间歇性治疗，该病愈后一般，多数患者不能治愈。
FLT3属于III型受体酪氨酸激酶家族，FLT3编码1000个氨基酸的蛋白质，其结构由胞外区、跨膜区和胞内区3部分组成。胞内区含有一个近膜（JM）结构、2个激酶区，中间被一个插入结构将酪氨酸激酶分割开，最后一个是C端终点结构。跨膜区有不连续的激酶作用的位点，胞内区为酪氨酸激酶催化区。据报道，在正常人骨髓中，FLT3仅表达于CD34+干/祖细胞，在红细胞系及成熟T、B淋巴细胞和NK细胞中无法表达。研究表明，野生型FLT3基因在AML中普遍高表达70%～100%。因此，FLT3作为一种AML的标志物，可以用来靶向治疗急性髓系白血病。
FLT3标志物的发现，给CAR-T细胞治疗AML提供了一种新的思路。
目前针对AML的治疗主要为化疗、放疗和干细胞移植，利用CAR-FLT3治疗AML最接近的现有技术为WO2019025484A1。该专利中利用FLT3 鼠源的4G8和BV10抗体序列构建合成的CAR，且CAR结构仅为二代CAR的常规结构，并没有涉及到CAR-T的安全性控制。CN108251442A也公开了FLT3嵌合抗原受体及其应用，该专利中FLT3结合结构域为FLT3的配体，并不是FLT3的单链抗体。目前对于FLT3的单链抗体挖掘的较少，而对于人源性FLT3的单链抗体更少。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明提供一种抗FLT3嵌合抗原受体修饰的T细胞及其在制备治疗AML药物中的应用，实现以下发明目的：提高对肿瘤细胞的杀伤效果，设计的CAR-AntiFLT3 细胞活性受利妥昔单抗的控制，提高临床安全性。
为解决上述技术问题，本发明采取以下技术方案：
一种抗FLT3嵌合抗原受体修饰的T细胞，将表达抗FLT3嵌合抗原受体的基因片段插入载体获得重组表达载体,采用慢病毒包装后感染活化的T细胞，得到抗FLT3嵌合抗原受体修饰的T细胞；所述嵌合抗原受体由以下模块依次串联得到：导引子Leader、单链抗体scFv-FLT3、CD8 Hinge区、CD8跨膜区、CD226-CD28共刺激区、CD3ζ胞内区、自剪切区T2A、自杀基因RQR8；
所述导引子Leader的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；所述单链抗体scFv-FLT3的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；所述CD8 Hinge区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示；所述CD8跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示；所述CD226-CD28共刺激区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示；所述CD3ζ胞内区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.7所示；所述自剪切区T2A的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.8所示；所述自杀基因RQR8的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.9所示。
以下是对上述技术方案的进一步改进：
上述抗FLT3嵌合抗原受体修饰的T细胞在制备治疗AML药物中的应用。
与现有技术相比，本发明取得以下有益效果：
本发明通过对CAR-AntiFLT3修饰的T细胞进行体外杀伤实验验证了CAR-AntiFLT3的杀伤肿瘤效果，在效靶比为10:1时，本发明制备的CAR-AntiFLT3-T细胞对FLT3+ HL-60细胞的杀伤效率为95.67%，高于CAR-FLT3-4G8-T细胞对FLT3+ HL-60细胞的杀伤效率（72.35%）和未转染T细胞对FLT3+ HL-60细胞的杀伤效率（40.35%）。
本发明设计的CAR-AntiFLT3 细胞活性受利妥昔单抗的控制，极大的提高CAR技术的临床安全性，利妥昔单抗对CAR-FLT3细胞活性的控制率为98.11%。
附图说明
图1为CAR-AntiFLT3和CAR-FLT3-4G8的整体结构示意图；
其中1a为CAR-AntiFLT3的整体结构示意图；1b为CAR-FLT3-4G8的整体结构示意图；
图2为慢病毒转染293T细胞的荧光图和明场图；
其中2a为荧光图，2b为明场图；
图3为流式细胞术检测慢病毒感染活化的 T细胞的效率图；
其中3a为CAR-AntiFLT3感染活化的 T细胞的效率图；3b为CAR-FLT3-4G8感染活化的T细胞的效率图；
图4为CAR-FLT3修饰的T细胞体外杀伤率折线图；
图5为CAR-FLT3修饰的T细胞与HL-60共培养后上清中IFN-γ的分泌量的柱状图。
具体实施方式
实施例1 重组表达载体pLent-EF1α-CAR-AntiFLT3的构建
CAR-AntiFLT3模块示意见图1(完整核酸序列见附录SEQ ID NO.1)。
CAR-AntiFLT3各模块序列
（1）导引子Leader (SEQ ID NO.2)
（2）单链抗体scFv-FLT3(SEQ ID NO.3)
（3）CD8 Hinge区(SEQ ID NO.4)
（4）CD8跨膜区 (SEQ ID NO.5)
（5）CD226-CD28共刺激区(SEQ ID NO.6)
（6）CD3ζ胞内区(SEQ ID NO.7)
（7）自剪切区T2A（SEQ ID NO.8）
（8）自杀基因RQR8 (SEQ ID NO.9)
分别按照上述从（1）-（8）的顺序委托上海捷瑞生物工程有限公司合成其整个表达框，插入pLent-EF1α载体(购自Vigene公司) BamHI-NotI位点，转化到E.coli(Top10)，经测序正确后，使用OMEGA公司的质粒提取试剂盒提取质粒，获得重组表达载体pLent-EF1α-CAR-AntiFLT3。本发明中，重组表达载体pLent-EF1α-CAR-AntiFLT3的浓度为1.1µg/µL。
同时采用WO2019025484A1中公开的FLT3 4G8作为单链抗体，其余模块均采用本发明的序列，构建包含鼠源FLT3 4G8序列的CAR，命名为pLent-EF1α-CAR-FLT3-4G8，其余操作如上，其质粒浓度为1.0µg/µL。
实施例2 慢病毒的包装及滴度测定
1）包装细胞系的复苏
本发明使用的包装细胞系为293T细胞。从液氮罐中取出冻存的293T细胞，迅速丢入37℃水浴锅中并快速晃动，尽量在2min内使细胞溶液完全溶解。将细胞溶液转移到50mL离心管中，加入生理盐水清洗DMSO，混匀后离心，1500 rpm 5 min。去掉上清，加入5mL新鲜的高糖DMEM（含10Vol%FBS）培养基重悬细胞，转入T75瓶中，每个瓶中补足到10mL高糖DMEM（含10Vol% FBS）培养基。将培养瓶平稳放入37℃、5%CO2 的培养箱中培养。第二天观察细胞存活率，并更换培养基。以后每天观察细胞生长情况，在细胞铺满瓶底的90%时传代，传代2次后细胞用于转染。
2）慢病毒的包装及滴度测定
当传代2代后293T细胞铺板达到80%时，用于转染。
转染试剂的准备：在5mL离心管中，分别配制A管与B管试剂（Tube A and Tube B），
具体配制见表1。
表1
Figure 618191DEST_PATH_IMAGE001
配好后，放置5min，然后将A管缓慢加入B管，混合均匀。室温放置20min，形成脂质体-DNA混合物。将混合物加入培养瓶中，轻微混匀。置于37℃，5%CO2培养箱中培养48h，用免疫荧光显微镜观察转染情况（图2），收取全部上清和细胞，转移至50mL离心管，4000g离心30min，去除沉淀，浓缩纯化，分装保存在-80℃冰箱中。利用倍比稀释技术法测定病毒滴度，本发明中pLent-EF1α-CAR-AntiFLT3的病毒液的滴度为1.04×108TU/mL，pLent-EF1α-CAR-FLT3-4G8的病毒液的滴度为1.02×108TU/mL。
实施例3 CAR-AntiFLT3修饰T细胞的制备
1. T细胞的制备
取75mL供者外周血，用淋巴细胞分离液（购自天津灏洋生物科技有限公司）分离外周血单个核细胞。分离后的细胞用BD公司提供的CD4+和CD8+分选试剂分选出CD4+和CD8+ T细胞，进行细胞计数，按1×106个细胞/mL，加入相应量的KBM551细胞培养基(购自Corning)。将细胞中加入与细胞相同量的CD3CD28磁珠（购自北京同立海源生物科技有限公司）进行活化T细胞，活化8h后取出磁珠，进行下一步实验。本发明中的T细胞即为CD4+和CD8+T细胞。
2. 慢病毒感染活化的T细胞
从-80℃拿出实施例2制备的病毒液解冻后加入培养基，用该病毒液重悬1×106个活化的T细胞。将细胞悬液加入到6孔板中，使病毒颗粒数与T细胞数比例约为5:1，37℃，5%的CO2培养箱中培养6h后，用新鲜培养基稀释一倍，继续培养1天后收集细胞去除剩余的病毒颗粒进行培养，培养15天使细胞扩增至足够的用量，分别得到CAR-AntiFLT3修饰的T细胞、CAR-FLT3-4G8修饰的T细胞，通过流式细胞术检测嵌合抗原受体表达。以经过CD3CD28磁珠活化的T细胞作为阴性对照。本发明中pLent-EF1α-CAR-AntiFLT3对活化后的T细胞的感染率为65.1%，pLent-EF1α-CAR-FLT3-4G8对活化的T细胞的感染率为61.3%（图3）。
实施例4 CAR-AntiFLT3修饰的T细胞体外杀伤活性研究
以FLT3+ HL-60细胞作为靶细胞，效应细胞为CAR-AntiFLT3修饰的T细胞(CAR-AntiFLT3-T细胞)、CAR-FLT3-4G8修饰的T细胞(CAR-FLT3-4G8-T细胞)和未转染T细胞（T细胞），效靶比分别为10:1、5:1和1:1，靶细胞数量为1×105/孔，根据不同效靶比对应效应细胞。各组均设3个复孔，取3个复孔的平均值。效应细胞和靶细胞共同培养6h后，检测对靶细胞的杀伤力。
其中各实验组和各对照组如下：
各实验组：靶细胞+表达不同嵌合抗原受体的T细胞；
对照组1：靶细胞最大释放LDH，需加入一定体积的细胞裂解液；
对照组2：靶细胞自发释放LDH；
对照组3：效应细胞自发释放LDH；
对照组4：空白培养基的背景；
对照组5：体积校准的背景，空白培养基加入一定体积的细胞裂解液。
检测方法：采用CytoTox96®非放射性细胞毒性检测试剂盒（Promega公司）进行检测效应细胞对靶细胞的杀伤效率。该方法是基于比色法的检测方法，可替代51Cr释放法。CytoTox检测定量地测量乳酸脱氢酶（LDH）。LDH是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来，其释放方式与51Cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的LDH培养基上清中，可通过30分钟偶联的酶反应来检测，在酶反应中LDH可使一种四唑盐（INT）转化为红色的甲臜（formazan）。生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。具体参照CytoTox96®非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书。
细胞毒性计算公式为：
Figure 207435DEST_PATH_IMAGE002
如表2和图4所示，在效靶比为10:1时，CAR-AntiFLT3-T细胞对FLT3+ HL-60细胞的杀伤效率为95.67%高于CAR-FLT3-4G8-T细胞对FLT3+ HL-60细胞的杀伤效率（72.35%）和未转染T细胞对FLT3+ HL-60细胞的杀伤效率（40.35%）。
表2 CAR-T细胞对FLT3+ HL-60细胞的体外杀伤活性
Figure 878850DEST_PATH_IMAGE003
实施例5 ELISA检测CAR-T细胞与HL-60细胞系共培养上清中IFN-γ的水平
将HL-60细胞按照1×105细胞/孔接种24孔板。按每孔1×106个细胞分别加入CAR-AntiFLT3-T、CAR-FLT3-4G8-T、未转染T细胞，补充培养液至1mL于孵箱中共培养24小时后。采用人IFN-γ检测试剂盒(R&D公司)，对共培养上清进行检测(具体步骤见ELISA检测试剂盒说明书)。
结果如图5所示，CAR-AntiFLT3-T细胞与HL-60共培养上清中含有的IFN-γ的量（9.64ng/mL）明显高于CAR-FLT3-4G8-T与HL-60共培养上清中的IFN-γ的量（6.52ng/mL）。
实施例6 安全“开关”系统对CAR-AntiFLT3-T细胞活性的控制
将CAR-AntiFLT3-T细胞按照密度1×105个/mL接种96孔板中，每孔100μL，置于5%CO2、37℃培养箱培养24h。加入10nM利妥昔单抗（购自罗氏），12h后每孔加入20μL CCK-8(MCE公司产品)，继续孵育2h后上酶标仪检测，于450nm波长处读取OD值。设置未加利妥昔单抗的 CAR-AntiFLT3-T细胞对照组和只加利妥昔单抗无细胞的空白对照组。CAR-AntiFLT3-T细胞的死亡率=[1-(加利妥昔单抗组OD值-空白对照组OD值)/(未加利妥昔单抗组OD值-空白对照组OD值)]×100%。CAR-AntiFLT3-T细胞的死亡率为63.87%，利妥昔单抗对CAR-AntiFLT3-T细胞活性的控制率=死亡率/重组慢病毒感染CIK的阳性率=98.11%；结果说明本发明设计的CAR-AntiFLT3-T细胞活性受利妥昔单抗的控制，极大的提高CAR技术的临床安全性。
序列表
<110> 山东兴瑞生物科技有限公司
<120> 一种抗FLT3嵌合抗原受体修饰的T细胞及其在制备治疗AML药物中的应用
<130> 2021
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2184
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60
ccccaggtcc aactggtgca gtctggggct gaggtgaaga agcctggggc ttcagtgaag 120
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tacaatcaga agttcaagga cagagtcaca atgactaggg acacgtccac gagcacagtc 300
tacatggagc tcagcagcct gagatctgag gacacggcgg tctattattg tgcaagagcg 360
attacgacga ccccctttga cttctggggc caaggcaccc tggtcacagt ctcctcagga 420
ggaggaggaa gcggaggagg aggaagcgga ggaggaggaa gcggaggagg aggaagcgaa 480
attgtgctaa ctcagtctcc agactttcag tctgtgactc caaaggagaa agtcaccatc 540
acctgcaggg ccagccagag tattagcaac aacctacact ggtatcaaca aaaaccagat 600
cagtctccaa agcttctcat caagtatgct tcccagtcca tctctggggt cccctccagg 660
ttcagtggca gtggatcagg gacagatttc actctcacca tcaacagtct ggaggctgaa 720
gatgctgcag cgtattactg tcaacagagt aacacctggc cgtacacgtt cggagggggg 780
accaaggtgg aaataaaacg gaccacgacg ccagcgccgc gaccaccaac accggcgccc 840
accatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc ccagaggcgt gccggccagc ggcggggggc 900
gcagtgcaca cgagggggct ggacttcgcc tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc 960
gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg gttatcaccc tttactgcaa cagaaggaga 1020
aggagagaga gaagagatct atttacagag tcctgggata cacagaaggc acccaataac 1080
tatagaagtc ccatctctac ctctcaacct accaatcaat ccatggatga tacaagagag 1140
gatatttatg tcaactatcc aaccttctct cgcagaccaa agactagagt tttctgggtg 1200
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 1260
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 1320
tccagagtga agttcagcag gagcgcagac gcccccgcgt acaagcaggg ccagaaccag 1380
ctctataacg agctcaatct aggacgaaga gaggagtacg atgttttgga caagagacgt 1440
ggccgggacc ctgagatggg gggaaagccg agaaggaaga accctcagga aggcctgtac 1500
aatgaactgc agaaagataa gatggcggag gcctacagtg agattgggat gaaaggcgag 1560
cgccggaggg gcaaggggca cgatggcctt taccagggtc tcagtacagc caccaaggac 1620
acctacgacg cccttcacat gcaggccctg ccccctcgcg aaggccgagg gagcctgctg 1680
acatgtggcg atgtggagga aaacccagga ccaatgggca ccagcctcct ctgctggatg 1740
gccctgtgtc tcctgggggc agatcacgca gatgcttgtc cttactctaa cccctctctc 1800
tgttctggag gtggaggatc tgagttacct acccagggaa cattttcaaa tgtttctaca 1860
aatgtatccc ctgctaagcc tacaacaact gcatgtcctt actctaaccc ctctctctgt 1920
tctggaggtg gaggatctcc tgctcctcgt cctcctaccc ctgctcctac tatcgcgtcg 1980
cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cgggtggcgc agtgcacacg 2040
aggggtctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 2100
gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaacc acagaaatag gagaagagtt 2160
tgcaagtgtc ctagacctgt tgtt 2184
<210> 2
<211> 63
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60
ccc 63
<210> 3
<211> 738
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
caggtccaac tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcttc agtgaaggtt 60
tcctgcaagg catccgggta caccttcacc agctactgga tgcactgggt gaggcaggcc 120
cctggacaag gccttgagtg gatgggagag attgatcctt ctgacagtta taaagactac 180
aatcagaagt tcaaggacag agtcacaatg actagggaca cgtccacgag cacagtctac 240
atggagctca gcagcctgag atctgaggac acggcggtct attattgtgc aagagcgatt 300
acgacgaccc cctttgactt ctggggccaa ggcaccctgg tcacagtctc ctcaggagga 360
ggaggaagcg gaggaggagg aagcggagga ggaggaagcg gaggaggagg aagcgaaatt 420
gtgctaactc agtctccaga ctttcagtct gtgactccaa aggagaaagt caccatcacc 480
tgcagggcca gccagagtat tagcaacaac ctacactggt atcaacaaaa accagatcag 540
tctccaaagc ttctcatcaa gtatgcttcc cagtccatct ctggggtccc ctccaggttc 600
agtggcagtg gatcagggac agatttcact ctcaccatca acagtctgga ggctgaagat 660
gctgcagcgt attactgtca acagagtaac acctggccgt acacgttcgg aggggggacc 720
aaggtggaaa taaaacgg 738
<210> 4
<211> 135
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 4
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 5
<211> 72
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 5
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 6
<211> 315
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 6
aacagaagga gaaggagaga gagaagagat ctatttacag agtcctggga tacacagaag 60
gcacccaata actatagaag tcccatctct acctctcaac ctaccaatca atccatggat 120
gatacaagag aggatattta tgtcaactat ccaaccttct ctcgcagacc aaagactaga 180
gttttctggg tgaggagtaa gaggagcagg ctcctgcaca gtgactacat gaacatgact 240
ccccgccgcc ccgggcccac ccgcaagcat taccagccct atgccccacc acgcgacttc 300
gcagcctatc gctcc 315
<210> 7
<211> 336
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 7
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 8
<211> 54
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 8
gaaggccgag ggagcctgct gacatgtggc gatgtggagg aaaacccagg acca 54
<210> 9
<211> 471
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 9
atgggcacca gcctcctctg ctggatggcc ctgtgtctcc tgggggcaga tcacgcagat 60
gcttgtcctt actctaaccc ctctctctgt tctggaggtg gaggatctga gttacctacc 120
cagggaacat tttcaaatgt ttctacaaat gtatcccctg ctaagcctac aacaactgca 180
tgtccttact ctaacccctc tctctgttct ggaggtggag gatctcctgc tcctcgtcct 240
cctacccctg ctcctactat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg 300
ccagcggcgg gtggcgcagt gcacacgagg ggtctggact tcgcctgtga tatctacatc 360
tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac 420
tgcaaccaca gaaataggag aagagtttgc aagtgtccta gacctgttgt t 471

Claims (2)

1. 一种抗FLT3嵌合抗原受体修饰的T细胞，其特征在于：将表达抗FLT3嵌合抗原受体的基因片段插入载体获得重组表达载体，采用慢病毒包装后感染活化的T细胞，得到抗FLT3嵌合抗原受体修饰的T细胞；所述嵌合抗原受体由以下模块依次串联得到：导引子Leader、单链抗体scFv-FLT3、CD8 Hinge区、CD8跨膜区、CD226-CD28共刺激区、CD3ζ胞内区、自剪切区T2A、自杀基因RQR8；
所述导引子Leader的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；所述单链抗体scFv-FLT3的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；所述CD8 Hinge区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示；所述CD8跨膜区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示；所述CD226-CD28共刺激区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.6所示；所述CD3ζ胞内区的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.7所示；所述自剪切区T2A的核苷酸序列如序列表中SEQ IDNO.8所示；所述自杀基因RQR8的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.9所示。
2.如权利要求1所述的抗FLT3嵌合抗原受体修饰的T细胞在制备治疗AML药物中的应用。
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Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107206024A (zh) * 2014-10-31 2017-09-26 宾夕法尼亚大学董事会 改变cart细胞中的基因表达及其用途
CN108251442A (zh) * 2018-02-07 2018-07-06 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） Flt3嵌合抗原受体及其应用
CN109265559A (zh) * 2018-09-25 2019-01-25 山东兴瑞生物科技有限公司 嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的nk细胞及治疗hbv感染的应用
CN109265560A (zh) * 2018-09-25 2019-01-25 山东兴瑞生物科技有限公司 分子开关、具有该分子开关的抗hiv-1嵌合抗原受体、制备方法、nk细胞及应用
CN111247167A (zh) * 2017-06-02 2020-06-05 辉瑞公司 Flt3的特异性抗体及其用途
CN111269925A (zh) * 2019-03-15 2020-06-12 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 携带自杀基因的robo1 car-nk细胞及其制备方法和应用
CN111533808A (zh) * 2020-03-10 2020-08-14 南京医科大学 一种可自分泌TLR4 scFv且靶向cMet的嵌合抗原受体修饰的T细胞及其应用
CN111732666A (zh) * 2020-07-30 2020-10-02 山东兴瑞生物科技有限公司 一种抗clec14a嵌合抗原受体、及其修饰的t细胞和应用
CN111808821A (zh) * 2020-06-24 2020-10-23 南方医科大学珠江医院 Flt3-nkg2d双靶点car-t的构建与制备
WO2020223445A1 (en) * 2019-04-30 2020-11-05 Senti Biosciences, Inc. Chimeric receptors and methods of use thereof
KR20210033436A (ko) * 2019-09-18 2021-03-26 주식회사 에스엘바이젠 신규 키메라 항원 수용체 암호화 유전자가 형질도입된 유전자 변형 nk 세포주 및 그의 용도
CN112673093A (zh) * 2018-07-04 2021-04-16 赛通免疫治疗公司 靶向flt3、pd-1和/或pd-l1的免疫疗法的组合物和方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4324851A2 (en) * 2018-07-19 2024-02-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Chimeric antigen receptors with bcma specificity and uses thereof

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107206024A (zh) * 2014-10-31 2017-09-26 宾夕法尼亚大学董事会 改变cart细胞中的基因表达及其用途
CN111247167A (zh) * 2017-06-02 2020-06-05 辉瑞公司 Flt3的特异性抗体及其用途
CN108251442A (zh) * 2018-02-07 2018-07-06 中国医学科学院血液病医院（血液学研究所） Flt3嵌合抗原受体及其应用
CN112673093A (zh) * 2018-07-04 2021-04-16 赛通免疫治疗公司 靶向flt3、pd-1和/或pd-l1的免疫疗法的组合物和方法
CN109265559A (zh) * 2018-09-25 2019-01-25 山东兴瑞生物科技有限公司 嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的nk细胞及治疗hbv感染的应用
CN109265560A (zh) * 2018-09-25 2019-01-25 山东兴瑞生物科技有限公司 分子开关、具有该分子开关的抗hiv-1嵌合抗原受体、制备方法、nk细胞及应用
CN111269925A (zh) * 2019-03-15 2020-06-12 阿思科力(苏州)生物科技有限公司 携带自杀基因的robo1 car-nk细胞及其制备方法和应用
WO2020223445A1 (en) * 2019-04-30 2020-11-05 Senti Biosciences, Inc. Chimeric receptors and methods of use thereof
KR20210033436A (ko) * 2019-09-18 2021-03-26 주식회사 에스엘바이젠 신규 키메라 항원 수용체 암호화 유전자가 형질도입된 유전자 변형 nk 세포주 및 그의 용도
CN111533808A (zh) * 2020-03-10 2020-08-14 南京医科大学 一种可自分泌TLR4 scFv且靶向cMet的嵌合抗原受体修饰的T细胞及其应用
CN111808821A (zh) * 2020-06-24 2020-10-23 南方医科大学珠江医院 Flt3-nkg2d双靶点car-t的构建与制备
CN111732666A (zh) * 2020-07-30 2020-10-02 山东兴瑞生物科技有限公司 一种抗clec14a嵌合抗原受体、及其修饰的t细胞和应用

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAR T-cells targeting FLT3 have potent acivity against FLT3-ITD+ AML and act synergistically with the FLT3-inhibitor crenolanib;Hardikkumar Jetani等;《Leukemia》;20180205;第32卷(第5期);全文 *
Mehedad Mahalleh等.Reinforcing the primary immunotherapy modulators against acute leukemia *
monoclonal antibodies in AML.《Immunotherapy》.2019,第11卷(第18期), *
Mus musculus sFv antibody mRNA, containing VH and VK regions, partial cds;Pauza M E等;《GenBank》;19951213;全文 *
Natural Flt3Lg-Based Chimeric Antigen Receptor (Flt3-CAR) T Cells Successfully Target Flt3 on AML Cell Lines;Varvara maiorova等;《Vaccine》;20211025;第9卷(第11期);全文 *
Pharmacologic Control of CAR T Cells;Benjiaming Caulier等;《Int. J. Mol. Sci.》;20210421;全文 *
Preclinical Development of Anti-FLT3 CAR-T Therapy for the Treatment of Acute Myeloid Leukemia;Elina Shrestha等;《Blood》;20201105;第136卷(第S1期);全文 *
Synthetic construct scFv-3A8-antipigCD11c gene, partial cds;Bernelin-Cottet等;《GenBank》;20190729;全文 *

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