CN109265561B

CN109265561B - 抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的NK细胞及应用

Info

Publication number: CN109265561B
Application number: CN201811118803.1A
Authority: CN
Inventors: 刘明录; 王立新; 韩国英; 万磊; 刘敏; 强邦明; 王亮
Original assignee: Shandong Xinrui Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shandong Xinrui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-09-25
Filing date: 2018-09-25
Publication date: 2021-05-25
Anticipated expiration: 2038-09-25
Also published as: CN109265561A

Abstract

本发明属于抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的NK细胞及应用，所述抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体包含CD8leader核酸序列、EGFRvIII scFv核酸序列、CD8α核酸序列、NKG2D核酸序列、2B4核酸序列、CD3ζ核酸序列、自裂解多肽T2A核酸序列以及RQR8核酸序列。本发明提供的抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体可以减小嵌合抗原受体输入体内后因活性过度或活性失控而导致严重的毒副作用。

Description

抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的 NK细胞及应用

技术领域

本发明涉及基因技术领域，具体涉及抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的NK细胞及应用。

背景技术

胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)是目前中枢神经系统最常见的恶性肿瘤，患者整体中位数生存时间仅约15个月。目前该疾病的治疗方案尽管有手术、放疗和化疗等疗法，但是这种肿瘤经常会对治疗产生耐受并复发。

表皮生长因子受体Ⅲ型突变体(epidermal growth factor receper variantIII, EGFRvⅢ)是胶质母细胞瘤等恶性肿瘤中表达率很高的肿瘤特异性抗原，与肿瘤的发生、发展有密切关系，为肿瘤靶向治疗理想的分子靶点。目前临床试验表明靶向EGFRvⅢ嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)修饰的T细胞具有治疗胶质母细胞瘤的效果。

然而，要想最终攻克这一癌症，还需要解决肿瘤微环境中的免疫抑制效应、 CAR-T的安全性以及CAR-T的产业化等问题。

因此，开发抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的NK细胞及应用，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和工业应用潜力，这正是本发明得以完成的动力所在和基础。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提供抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的NK细胞及应用，以减小嵌合抗原受体输入体内后因活性过度或活性失控而导致严重的毒副作用。

第一方面，本发明提供了抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体，其核酸序列中必定包含有分子开关RQR8核酸序列(如SEQ ID NO.9所述)。

上述，分子开关RQR8是由利妥昔单抗结合的最小表位肽(R)，QBEND10 单抗结合的最小表位肽(Q)，利妥昔单抗结合的最小表位肽(R)，CD8铰链跨膜区依次串联而成(8)。利妥昔单抗和QBEND10单抗都可以通过抗体的ADCC、 CDC、直接诱导Anti-EGFRvIII CAR-NK细胞凋亡，避免Anti-EGFRvIII CAR-NK 输入体内后因活性过度或活性失控而导致严重的毒副作用，如靶点毒性、细胞因子风暴和肿瘤溶解征等。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体包含CD8leader核酸序列、EGFRvIII scFv核酸序列、CD8α核酸序列、NKG2D 核酸序列、2B4核酸序列、CD3ζ核酸序列、自裂解多肽T2A核酸序列以及RQR8 核酸序列。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体包含依序连接的

如SEQ ID NO.2所述的CD8leader核酸人工序列；

如SEQ ID NO.3所述的EGFRvIII scFv核酸人工序列；

如SEQ ID NO.4所述的CD8α核酸人工序列；

如SEQ ID NO.5所述的NKG2D核酸人工序列；

如SEQ ID NO.6所述的2B4核酸人工序列；

如SEQ ID NO.7所述的CD3ζ核酸人工序列；

如SEQ ID NO.8所述的自裂解多肽T2A核酸人工序列；

以及如SEQ ID NO.9所述的RQR8核酸人工序列。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.1所述。

第二方面，本发明提供了抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体的制备方法，包括如下步骤：

(1)分别按CD8leader核酸序列、EGFRvIII scFv核酸序列、CD8α核酸序列、NKG2D核酸序列、2B4核酸序列、CD3ζ核酸序列、自裂解多肽T2A 核酸序列以及RQR8核酸序列合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，得到pUC-Anti-EGFRvIII CAR；

(2)将pUC-Anti-EGFRvIII CAR进行双酶切，利用琼胶电泳将 Anti-EGFRvIII CARDNA片段琼胶部位切下，利用DNA extraction kit溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的Anti-EGFRvIII CAR DNA片段，即为抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体。

第三方面，本发明提供了利用该抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体修饰的NK 细胞，该NK细胞含有如上所述的抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述NK细胞采用包括如下步骤的方法制备得到：

首先将上述的pLent-Anti-EGFRvIII CAR质粒进行慢病毒包装，然后利用重组慢病毒感染免疫细胞。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述pLent-Anti-EGFRvIII CAR质粒是将融合基因片段Anti-EGFRvIII CAR DNA插入慢病毒表达载体 pLent-C-GFP得到的pLent-Anti-EGFRvIII CAR质粒。

本发明中，作为一种优选的技术方案，所述pLent-Anti-EGFRvIII CAR质粒采用包括如下步骤的制备方法得到：将纯化的Anti-EGFRvIII CAR DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段在16℃进行过夜连接形成 pLent-Anti-EGFRvIII CAR质粒；连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；Anti-EGFRvIII CAR DNA：4μl；线性化的pLent-C-GFP DNA：4μl。

第四方面，本发明提供了抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体的应用，是指抗 EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体在制备治疗胶质母细胞瘤的药物中的应用。所述药物形式包括但不限于试剂盒。

在本发明中，作为一种优选的技术方案，该试剂盒，包括

(1)获得如上所述的稳定表达Anti-EGFRvIII CAR的载体；

(2)载体稀释液。

采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：

Anti-EGFRvIII CAR-NK细胞具有以MHC I非依赖识别机制和快速杀伤肿瘤细胞能力、低移植物抗宿主反应(GVHD)风险，这意味着它们能够在许多患者身上发挥作用。因而Anti-EGFRvIII CAR修饰的NK细胞可以批量生产，解决 CAR-T技术的无法产业化的难题。

Anti-EGFRvIII CAR-NK细胞的CAR结构通过加入新型小分子开关RQR8， RQR8是由利妥昔单抗结合的最小表位肽(R)，QBEND10单抗结合的最小表位肽 (Q)，利妥昔单抗结合的最小表位肽(R)，CD8铰链跨膜区依次串联而成(8) 的新型蛋白。利妥昔单抗和QBEND10单抗都可以通过抗体的ADCC、CDC、直接诱导Anti-EGFRvIII CAR-NK细胞凋亡。与传统的自杀基因相比，一是RQR8 的分子量小，有利于转染NK细胞的表达。二是能够高效快速的诱导细胞调亡，利妥昔单抗的作用15min时细胞凋亡率就可到达99％(HSV-TK自杀基因系统需要在更昔洛韦的作用下持续3天才能达到此效果)。

综上所述，本发明提供的抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体及NK细胞，随着RQR8的引入，能够避免Anti-EGFRvIII CAR-NK输入体内后因活性过度或活性失控而导致严重的毒副作用，如靶点毒性、细胞因子风暴和肿瘤溶解征等，提高临床安全性，降低了毒副作用，且Anti-EGFRvIII CAR修饰的NK细胞可以批量生产。

附图说明

图1为本发明所述安全型嵌合抗原受体原理设计图。

图2为本发明所述的嵌合抗原受体 CD8leader-EGFRvIIIscFv-CD8α-NKG2D-2B4-CD3ζ-T2A-RQR8的融合基因片段的设计图。

图3为本发明Anti-EGFRvIII CAR-NK细胞的表达CAR的效率为66.4％。

图4为本发明Anti-EGFRvIII CAR-NK体内杀伤结果图。

具体实施方式

下面将结合具体实施例对本发明技术方案进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1

抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体，如图1所示，其核酸序列中必定包含有分子开关RQR8核酸序列，RQR8核酸序列具有如SEQ ID NO.9所述的核酸序列。 RQR8是由信号肽核酸序列(SEQ ID NO.10)、CD20的模拟表位核酸序列(SEQ ID NO.11)、CD34的模拟表位核酸序列(SEQ ID NO.12)、CD20的模拟表位核酸序列(SEQ ID NO.11)、CD8铰链跨膜区核酸序列(SEQ ID NO.13)依次串联而成，完整核酸序列见SEQ ID NO.9。委托生工生物工程(上海)有限公司合成该核苷酸序列。

本实施例中，所述抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体包含依序连接的如SEQ ID NO.2所述的CD8leader核酸人工序列；如SEQ ID NO.3所述的EGFRvIII scFv 核酸人工序列；如SEQ ID NO.4所述的CD8α核酸人工序列；如SEQ ID NO.5 所述的NKG2D核酸人工序列；如SEQID NO.6所述的2B4核酸人工序列；如 SEQ ID NO.7所述的CD3ζ核酸人工序列；如SEQ IDNO.8所述的自裂解多肽 T2A核酸人工序列；以及如SEQ ID NO.9所述的RQR8核酸人工序列。

也即：如图2所示，抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.1所述。

实施例2

抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体的制备方法，包括如下步骤：

在本实施例中，更详细的说，抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体的制备方法步骤如下：

分别按导引子CD8leader核酸人工序列、EGFRvIII scFv核酸人工序列、 CD8α核酸人工序列、NKG2D核酸人工序列、2B4核酸人工序列、CD3ζ核酸人工序列、自裂解多肽T2A核酸人工序列、RQR8核酸人工序列托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，因此命名为 pUC-Anti-EGFRvIII CAR，

将pUC-Anti-EGFRvIII CAR进行Fast Digest AsiSI(购自ThermoFisher 公司)和Fast Digest NotI(购自ThermoFisher公司)双酶切，37℃，酶切 20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI 酶：3μl；去离子水补足体积。

利用琼胶电泳将分别把含有Anti-EGFRvIII CAR DNA片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。

采用DNA extraction kit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500μl DF buffer，55℃作用10分钟，每 2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500μl Wash Buffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm 离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DF Column转移至上另一干净的微量离心管，加入25μl Elution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的Anti-EGFRvIII CAR DNA片段。

实施例3

制备含有Anti-EGFRvIII CAR DNA片段的质粒，将纯化的Anti-EGFRvIII CAR DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段在16℃进行过夜连接形成 pLent-Anti-EGFRvIIICAR质粒，包括如下步骤：

分别按导引子CD8leader核酸人工序列、EGFRvIII scFv核酸人工序列、CD8α核酸人工序列、NKG2D核酸人工序列、2B4核酸人工序列、CD3ζ核酸人工序列、自裂解多肽T2A核酸人工序列、RQR8核酸人工序列、委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，因此命名为 pUC-Anti-EGFRvIII CAR，

同时将pUC-Anti-EGFRvIII CAR和pLent-C-GFP载体进行Fast Digest AsiSI(购自ThermoFisher公司)和Fast Digest NotI(购自ThermoFisher 公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl； DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积。

利用琼胶电泳将分别把含有Anti-EGFRvIII CAR DNA片段和线性化的 pLent-C-GFP DNA片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。

采用DNA extraction kit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500μl DF buffer，55℃作用10分钟，每 2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500μl Wash Buffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DF Column转移至上另一干净的微量离心管，加入25μl Elution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的Anti-EGFRvIII CAR DNA片段和线性化的 pLent-C-GFP DNA片段。

将上述两种DNA片段在16℃进行过夜连接形成pLent-Anti-EGFRvIII CAR 质粒。连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；Anti-EGFRvIII CAR DNA：4μl；线性化的pLent-C-GFP DNA：4μl。

将上述pLent-Anti-EGFRvIII CAR转化到E.coli(DH5α)。具体步骤如下：将质粒和感受态细胞混匀在冰上孵育半小时，再42℃热激90秒，再冰上放置 2min，最后加液体LB培养基缓摇1个小时左右再3000rpm离心5min，将100μl 菌液涂布在含有氨苄LB固体平板。

实施例4

质粒的纯化步骤：次日挑取单菌落进行过夜培养，采用质粒提取纯化试剂盒(购自Qiagen公司)提取pLent-Anti-EGFRvIII CAR质粒，具体步骤如下： (1)取1.5ml菌液室温10000×g离心1min。(2)去上清，加250μl溶液Ⅰ (含RNase A)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。(3)加入250μl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4-6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min。(4)加350μl 溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000×g离心10min。 (5)特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱。(6)弃滤过液，加500μl Buffer HBC，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。(7)弃滤过液，再用100％乙醇稀释的750μl Wash Buffer清洗吸收柱，10000×g离心1min。(8)再加750μl Wash Buffer清洗吸收柱。(9)必须将吸收柱10000×g离心2min确保乙醇被去除。 (10)将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加50-100μl(取决于需要的终浓度) 无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，10000×g离心5min，收集质粒DNA。(11) 和预知浓度DNA样品(Marker)一起做琼脂糖凝胶电泳，对比结果，得出 pLent-Anti-EGFRvIII CAR质粒浓度为441ng/μl。

将上述的pLent-Anti-EGFRvIII CAR质粒委托生工生物工程(上海)有限公司进行测序。经测序正确后备用。

实施例5

利用该抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体修饰的NK细胞，该NK细胞含有如上所述的抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体，首先将上述的 pLent-Anti-EGFRvIII CAR质粒进行慢病毒包装，然后利用重组慢病毒感染免疫细胞，具体包括如下步骤：

(1)慢病毒包装及滴度检测

采用Lentiviral Packaging Kit慢病毒包装试剂盒，将慢病毒包装细胞系293T接种于含有DMEM+10％FBS 10cm培养皿中，37℃，5％的CO2条件下培养，贴壁率为70％-80％时准备转染。取无菌的15ml离心管，按下列组分配制反应体系：无血清DMEM：4ml；pLent-Anti-EGFRvIII CAR质粒：10μg；GM easyTM Lentiviral Mix：10μl(10μg)；HG TransgeneTMReagent：60μl。混匀后，室温放置20min后，均匀滴加到含有293T细胞培养皿中，后置于CO2培养箱中培养。转染24后，小心吸掉细胞培养液弃于盛有消毒液的废液杯中，然后加15ml含有10％血清新鲜的培养基继续培养。48h后，吸取细胞上清液于50ml 离心管，4℃，500g离心5min，上清液用0.45μm滤器过滤后转移到新的离心管中。此时上清液中的病毒颗粒可以直接去检测滴度。取上述100μl病毒液采用慢病毒载体(HIV P24)快速检测卡测定滴度，重组慢病毒的滴度1.25×10⁶ TU/ml。

(2)NK细胞的制备

1)血浆的提取

取脐血50ml，平均分装于2支50ml离心管中，于室温下650g离心15 min，取上层淡黄色血浆至新的50ml离心管中(下层红色液体用于提取单个核细胞)，于56℃水浴锅中灭活30min，然后900g离心10min，取上清，置于-20℃，15min，再次离心，900g，10min，取上清，置于4℃保存。(离心机调节升速1，降速1)

2)单核细胞的分离

A.取上一步血浆提取中得到的下层红色液体用生理盐水等体积稀释，总体积约20ml，颠倒混均，备用。B.另取2支新的50ml的离心管，每管加入淋巴细胞分离液20ml。C.仔细地将20ml稀释后的血液加入到含20ml淋巴细胞分离液的离心管中，使血液和淋巴细胞分离液形成一个明显的分层，注意不要将稀释血液混入到淋巴细胞分离液中，室温650g离心30min。D.轻轻吸取单核细胞(白膜层)以及它下面一半的淋巴细胞分离液并转移至新的50ml离心管内；加入等体积生理盐水，室温650g离心10min。弃上清。重复清洗步骤，用生理盐水重悬细胞，同时取少量细胞悬液台盼蓝染色计数，计数后260g 离心10min，弃上清，备用。

3)单核细胞的接种与诱导活化

A.第0天，细胞计数，按细胞密度2×10⁶cells/ml接种25ml含YC005 的NK无血清细胞培养基，添加5％比例的自体血浆，置于二氧化碳培养箱中孵育1h，再添加YC00B，混均后继续培养。B.第三天，添加诱导因子YC00C一支，补加50ml含YC005的NK无血清细胞培养基，添加5％比例的自体血浆。 C.第5天，按照175ml补液即可，同时添加诱导因子YC00D一支，以及添加8.75ml自体血浆。D.第7天根据密度补液，添加因子YC00E一支以及剩余血浆。补液密度维持在0.6-0.8×10⁶cells/ml。E.第9天根据密度补液，补液密度维持在0.6-0.8×10⁶cells/ml。F.第12天根据密度补液，补液密度维持在0.6-0.8×10⁶cells/ml。培养至第14天，流式细胞术检测T细胞中的 CD3-、CD56+的表达率(CD3-FITC，CD56-PE抗体购自BECKMAN公司，A07735)。 CD3-CD56+->80％，视为NK诱导成功，并留取该NK待病毒感染(以上YC005、YC00D等诱导因子均购自友康恒业生物科技有限公司)。

(3)慢病毒感染NK细胞及感染后NK细胞的扩增培养

以MOI＝5用上述重组慢病毒感染NK细胞。感染后的细胞37℃，5％CO₂培养箱中培养12小时后，收集细胞弃上清，重新加入等量病毒液， Polybrene(8μg/ml)和细胞培养液，37℃，5％CO2培养箱中继续培养，12h 后吸弃培养液，重新加入新鲜CORNING培养基，继续扩大培养，培养17天至细胞扩增至足够的用量。

通过FC500流式细胞仪(购自BECKMAN公司)FL1通道检测嵌合抗原受体表达(图3)。以未感染的NK淋巴细胞作为阴性对照，重组慢病毒感染NK细胞其阳性率66.4％。

实施例6

分子开关对Anti-EGFRvIII CAR-NK细胞的控制有效性分析实施例

将Anti-EGFRvIII CAR-NK细胞按照密度1×10⁵个/ml接种96孔板中，每孔100ul，置于5％CO₂、37℃培养箱培养24h；加入10nM利妥昔单抗(罗氏产品)，15min后每孔加入20μLCCK-8(MCE公司产品)，继续孵育2h后上酶标仪检测，于450nm波长处读取OD值。设置未加利妥昔单抗的Anti-EGFRvIII CAR-NK细胞对照组和只加利妥昔单抗无细胞的空白对照组。

NK细胞的死亡率＝[1-(加利妥昔单抗组OD值-空白对照组OD值)/(未加利妥昔单抗组OD值-空白对照组OD值)]×100％。NK细胞的死亡率为66.23％，利妥昔单抗对CAR-NK细胞活性的控制率＝死亡率/重组慢病毒感染NK的阳性率＝99.74％；结果说明本发明设计的Anti-EGFRvIII CAR-NK细胞活性受利妥昔单抗的控制，且利妥昔单抗在15min之内就能诱导99％以上的细胞凋亡，极大的提高CAR技术的临床安全性。

实施例7

Anti-EGFRvIII CAR-NK细胞体外杀伤实施例

EGFRv III+U87细胞作为靶细胞，效应细胞为Anti-EGFRvIII CAR-NK和未转染NK细胞。

按E：T(效应细胞和靶细胞比)为1：6.25，加入6.25×10⁶个EGFRv III+U87 细胞，待细胞完全贴壁后，收集Anti-EGFRvIII CAR-NK和未转染NK，分别调整细胞浓度为1×10⁷/ml，每孔加入100μL，37℃，5％的CO₂条件下培养12h。弃上清加入20μL稀释的CCK8(购自MCE公司)，孵育4-6小时，酶标仪检测 OD450的吸光值。杀伤率＝[1-(效应细胞+靶细胞孔OD值-单独效应细胞的OD 值)/单独靶细胞的OD值]×100％。Anti-EGFRvIII CAR-NK细胞对EGFRvIII+U87 细胞的杀伤效率为95.67±10.35％明显高于未转染NK细胞(未转染PBMC细胞对Raji细胞的杀伤效率为20.35±7.29％)。

实施例8

Anti-EGFRvIII CAR-NK细胞体内杀伤实施例

EGFRv III+U87细胞用高糖DMEM培养基(含10％FBS)、37℃、5％CO₂培养箱中培养。长至对数期时用0.25％胰蛋白酶消化，收集至15ml离心管中，用高糖DMEM培养基洗涤细胞，弃上清液。用无菌PBS重悬制成细胞密度为 5×10⁷/ml的单细胞悬液备用。用碘酊和乙醇消毒裸鼠右侧背部皮肤，用带6 号针头的注射器抽取100ul细胞悬液接种于裸小鼠右侧背部皮下，拔针后压迫针孔片刻，接种后送回SPF饲养室饲养。接种后，每天观察小鼠饮食、排便及精神等状况，称量体重。观察各注射点有无红肿破溃，并用游标卡尺测量肿块的长度和宽度。肿瘤体积评估，按V＝0.5×a×b2(a为长度，b为宽度)计算。

当肿瘤体积达到约500mm³时，将裸小鼠按每组10只随机分为3组。按如下将细胞溶于1ml PBS通过尾静脉注射小鼠体内。

A组：1×10⁷Anti-EGFRvIII CAR-NK细胞；

B组：1×10⁷NK细胞。

C组：空白对照只加1ml PBS。

输注后，继续按如上方法观察，每天观察小鼠精神、饮食及排便等状况，称量小鼠体重，观察各注射点有无红肿破溃，并用游标卡尺测量肿瘤结节的长度和宽度，评估肿瘤体积，共观察60d。当肿瘤体积达到>2000mm³时，处死老鼠。统计各组数据，绘制图表(结果见图4)。

尾静脉注射Anti-EGFRvIII CAR-NK细胞的A组，15d时肿瘤达到最大，平均肿瘤体积为(623±55.23)mm³，之后肿瘤的生长明显被抑制，30d时平均肿瘤体积为(498±65.98)mm³，60d时平均肿瘤体积为(154±40.54)mm³。尾静脉注射NK细胞的B组，肿瘤的生长的趋势与A组相似，但是肿瘤体积始终大于A组。A组和B组间肿瘤体积的Student t检验，P值<0.05，两者有显著性差异。尾静脉注射PBS的C组，10只小鼠全部成瘤，从第5～7d自行觅食、饮水较正常鼠减少，体重及警觉性有所下降，肿瘤结节早期生长比较缓慢，侵袭不明显；15d后，出现显的进食减少，行动迟缓，精神萎靡，肿瘤生长速度加快，数例发生皮肤溃疡。30d后仍全部存活，多为恶病质，8只濒死状态，平均肿瘤体积为(1978±156.27)mm³。由此说明Anti-EGFRvIII CAR-NK细胞能在体内显著抑制肿瘤细胞的生长。

实施例9

抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体在制备治疗胶质母细胞瘤的药物中的应用。所述药物形式包括但不限于试剂盒。

本实施例中，试剂盒，包括

(1)获得如上所述的稳定表达Anti-EGFRvIII CAR的载体；

(2)载体稀释液；

(3)使用说明书，该说明书中包含有如上述实施例的使用方法。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

序列表

<110> 山东兴瑞生物科技有限公司

<120> 抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的NK细胞及应用

<130> 2018

<160> 13

<170> SIPO Sequence Listing 1.0

<210> 1

<211> 3144

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 1

atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60

ccccaggtta ccttgaagga gtctggtcct gtgctggtga aacccacaga gaccctcacg 120

ctgacctgca ccgtctctgg gttctcactc aataatgcta gaatgggtgt gagctggatc 180

cgtcagcccc cagggaaggc cctggagtgg tttgcacaca ttttttcgac tgacgaaaaa 240

tccttcagaa catctctgcg gagcaggctc accctctcca aggacacctc caaaagccag 300

gtggtcctta ccatgaccaa catggaccct gtggacacag ccacatatta ctgtgcacgg 360

gattctagca attacgaagg ttactttgac tactggggcc agggaattct ggtcaccgtc 420

tcgagcggag gaggaggaag cggaggagga ggaagcggag gaggaggaag cgaaatagtg 480

atgacgcagt ctccagccac cctgtctgtg tctccagggg aaagagccac cctctcctgc 540

agggccagtc agagtgttag caataactta gcctggtacc agcagaaacc tggccaggct 600

cccaggctcc tcatctatgg tgcatccacc agggccactg gtgtcccagc caggttcagt 660

ggcagtgatt ctgggacaga gttctctctc accatcagca gcctgcagtc tgaagatttt 720

gcagtttatt tctgtcagca gtataaggac tggcccttca ctttcggccc agggaccaag 780

gtggagatca aaaccacgac gccagcgccg cgaccaccaa caccggcgcc caccatcgcg 840

tcgcagcccc tgtccctgcg cccagaggcg tgccggccag cggcgggggg cgcagtgcac 900

acgagggggc tggacttcgc ctgtgatcca ttttttttct gctgcttcat cgctgtagcc 960

atgggaatcc gtttcattat tatggtagca tggaggagaa agaggaagga gaagcagtca 1020

gagaccagtc ccaaggaatt tttgacaatt tacgaagatg tcaaggatct gaaaaccagg 1080

agaaatcacg agcaggagca gacttttcct ggagggggga gcaccatcta ctctatgatc 1140

cagtcccagt cttctgctcc cacgtcacaa gaacctgcat atacattata ttcattaatt 1200

cagccttcca ggaagtctgg atccaggaag aggaaccaca gcccttcctt caatagcact 1260

atctatgaag tgattggaaa gagtcaacct aaagcccaga accctgctcg attgagccgc 1320

aaagagctgg agaactttga tgtttattcc agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc 1380

cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc tataacgagc tcaatctagg acgaagagag 1440

gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga 1500

aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc 1560

tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc cggaggggca aggggcacga tggcctttac 1620

cagggtctca gtacagccac caaggacacc tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc 1680

cctcgcgaag gccgagggag cctgctgaca tgtggcgatg tggaggaaaa cccaggacca 1740

atgggcacca gcctcctctg ctggatggcc ctgtgtctcc tgggggcaga tcacgcagat 1800

gcttgtcctt actctaaccc ctctctctgt tctggaggtg gaggatctga gttacctacc 1860

cagggaacat tttcaaatgt ttctacaaat gtatcccctg ctaagcctac aacaactgca 1920

tgtccttact ctaacccctc tctctgttct ggaggtggag gatctcctgc tcctcgtcct 1980

cctacccctg ctcctactat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg 2040

ccagcggcgg gtggcgcagt gcacacgagg ggtctggact tcgcctgtga tatctacatc 2100

tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac 2160

tgcaaccaca gaaataggag aagagtttgc aagtgtccta gacctgttgt tgaaggccga 2220

gggagcctgc tgacatgtgg cgatgtggag gaaaacccag gaccaatgtt ccatgtttct 2280

tttaggtata tctttggact tcctcccctg atccttgttc tgttgccagt agcatcatct 2340

gattgtgata ttgaaggtaa agatggcaaa caatatgaga gtgttctaat ggtcagcatc 2400

gatcaattat tggacagcat gaaagaaatt ggtagcaatt gcctgaataa tgaatttaac 2460

ttttttaaaa gacatatctg tgatgctaat aaggaaggta tgtttttatt ccgtgctgct 2520

cgcaagttga ggcaatttct taaaatgaat agcactggtg attttgatct ccacttatta 2580

aaagtttcag aaggcacaac aatactgttg aactgcactg gccaggttaa aggaagaaaa 2640

ccagctgccc tgggtgaagc ccaaccaaca aagagtttgg aagaaaataa atctttaaag 2700

gaacagaaaa aactgaatga cttgtgtttc ctaaagagac tattacaaga gataaaaact 2760

tgttggaata aaattttgat gggcactaaa gaacacgaag gccgagggag cctgctgaca 2820

tgtggcgatg tggaggaaaa cccaggacca atggccctgc tactggccct cagcctgctg 2880

gttctctgga cttccccagc cccaactctg agtggcacca atgatgctga agactgctgc 2940

ctgtctgtga cccagaaacc catccctggg tacatcgtga ggaacttcca ctaccttctc 3000

atcaaggatg gctgcagggt gcctgctgta gtgttcacca cactgagggg ccgccagctc 3060

tgtgcacccc cagaccagcc ctgggtagaa cgcatcatcc agagactgca gaggacctca 3120

gccaagatga agcgccgcag cagt 3144

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 2

atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60

ccc 63

<210> 3

<211> 729

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 3

caggttacct tgaaggagtc tggtcctgtg ctggtgaaac ccacagagac cctcacgctg 60

acctgcaccg tctctgggtt ctcactcaat aatgctagaa tgggtgtgag ctggatccgt 120

cagcccccag ggaaggccct ggagtggttt gcacacattt tttcgactga cgaaaaatcc 180

ttcagaacat ctctgcggag caggctcacc ctctccaagg acacctccaa aagccaggtg 240

gtccttacca tgaccaacat ggaccctgtg gacacagcca catattactg tgcacgggat 300

tctagcaatt acgaaggtta ctttgactac tggggccagg gaattctggt caccgtctcg 360

agcggaggag gaggaagcgg aggaggagga agcggaggag gaggaagcga aatagtgatg 420

acgcagtctc cagccaccct gtctgtgtct ccaggggaaa gagccaccct ctcctgcagg 480

gccagtcaga gtgttagcaa taacttagcc tggtaccagc agaaacctgg ccaggctccc 540

aggctcctca tctatggtgc atccaccagg gccactggtg tcccagccag gttcagtggc 600

agtgattctg ggacagagtt ctctctcacc atcagcagcc tgcagtctga agattttgca 660

gtttatttct gtcagcagta taaggactgg cccttcactt tcggcccagg gaccaaggtg 720

gagatcaaa 729

<210> 4

<211> 135

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 4

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 5

<211> 63

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 5

ccattttttt tctgctgctt catcgctgta gccatgggaa tccgtttcat tattatggta 60

gca 63

<210> 6

<211> 360

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 6

tggaggagaa agaggaagga gaagcagtca gagaccagtc ccaaggaatt tttgacaatt 60

tacgaagatg tcaaggatct gaaaaccagg agaaatcacg agcaggagca gacttttcct 120

ggagggggga gcaccatcta ctctatgatc cagtcccagt cttctgctcc cacgtcacaa 180

gaacctgcat atacattata ttcattaatt cagccttcca ggaagtctgg atccaggaag 240

aggaaccaca gcccttcctt caatagcact atctatgaag tgattggaaa gagtcaacct 300

aaagcccaga accctgctcg attgagccgc aaagagctgg agaactttga tgtttattcc 360

<210> 7

<211> 336

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 7

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 8

<211> 54

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 8

gaaggccgag ggagcctgct gacatgtggc gatgtggagg aaaacccagg acca 54

<210> 9

<211> 471

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 9

atgggcacca gcctcctctg ctggatggcc ctgtgtctcc tgggggcaga tcacgcagat 60

gcttgtcctt actctaaccc ctctctctgt tctggaggtg gaggatctga gttacctacc 120

cagggaacat tttcaaatgt ttctacaaat gtatcccctg ctaagcctac aacaactgca 180

tgtccttact ctaacccctc tctctgttct ggaggtggag gatctcctgc tcctcgtcct 240

cctacccctg ctcctactat cgcgtcgcag cccctgtccc tgcgcccaga ggcgtgccgg 300

ccagcggcgg gtggcgcagt gcacacgagg ggtctggact tcgcctgtga tatctacatc 360

tgggcgccct tggccgggac ttgtggggtc cttctcctgt cactggttat caccctttac 420

tgcaaccaca gaaataggag aagagtttgc aagtgtccta gacctgttgt t 471

<210> 10

<211> 63

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 10

atgggcacca gcctcctctg ctggatggcc ctgtgtctcc tgggggcaga tcacgcagat 60

gct 63

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 11

tgtccttact ctaacccctc tctctgttct 30

<210> 12

<211> 72

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 12

gagttaccta cccagggaac attttcaaat gtttctacaa atgtatcccc tgctaagcct 60

acaacaactg ca 72

<210> 13

<211> 246

<212> DNA

<213> 人种(Homo sapiens)

<400> 13

cctgctcctc gtcctcctac ccctgctcct actatcgcgt cgcagcccct gtccctgcgc 60

ccagaggcgt gccggccagc ggcgggtggc gcagtgcaca cgaggggtct ggacttcgcc 120

tgtgatatct acatctgggc gcccttggcc gggacttgtg gggtccttct cctgtcactg 180

gttatcaccc tttactgcaa ccacagaaat aggagaagag tttgcaagtg tcctagacct 240

gttgtt 246

Claims

1.抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体，其特征在于：编码所述嵌合抗原受体的核酸序列中必定包含有分子开关RQR8的核酸序列；

所述编码抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体的核酸序列包含依序连接的

如SEQ ID NO.2所述的CD8leader核酸人工序列；

如SEQ ID NO.3所述的EGFRvIII scFv核酸人工序列；

如SEQ ID NO.4所述的CD8α核酸人工序列；

如SEQ ID NO.5所述的NKG2D核酸人工序列；

如SEQ ID NO.6所述的2B4核酸人工序列；

如SEQ ID NO.7所述的CD3ζ核酸人工序列；

如SEQ ID NO.8所述的自裂解多肽T2A核酸人工序列；

以及如SEQ ID NO.9所述的RQR8核酸人工序列；

所述编码抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.利用抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体修饰的NK细胞，其特征在于：该NK细胞含有如权利要求1所述的抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体。

3.如权利要求2所述的NK细胞，其特征在于：所述NK细胞采用包括如下步骤的方法制备得到：

首先将pLent-Anti-EGFRvIII CAR质粒进行慢病毒包装，然后利用重组慢病毒感染NK细胞。

4.如权利要求3所述的NK细胞，其特征在于：所述pLent-Anti-EGFRvIII CAR质粒是将融合基因片段Anti-EGFRvIII CAR DNA插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP得到的pLent-Anti-EGFRvIII CAR质粒。

5.如权利要求1所述的抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体在制备治疗胶质母细胞瘤的药物中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于：所述药物形式包括但不限于试剂盒；该试剂盒，包括

(1)稳定表达Anti-EGFRvIII CAR的载体；

(2)载体稀释液。