CN114317607A

CN114317607A - 融合一代靶向cd7 car和二代靶向bcma的双靶点通用car-t细胞及制备方法

Info

Publication number: CN114317607A
Application number: CN202111663968.9A
Authority: CN
Inventors: 彭作翰; 刘佳玫; 豆亚丽; 刘敏; 李玏
Original assignee: Xi'an Soniser Biomedical Co ltd
Current assignee: Xi'an Soniser Biomedical Co ltd
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2022-04-12

Abstract

本发明涉及融合一代靶向CD7 CAR和二代靶向BCMA的双靶点通用CAR‑T细胞及制备方法。所述方法包括：将基因编辑物质递送至T细胞以剪切TRAC和CD7基因组DNA或剪切TRAC、CD7和B2M基因组DNA，以及使用重组腺相关病毒递送模版DNA以将靶向CD7‑BCMA双靶点CAR基因定点整合入TRAC、CD7或B2M基因组位点。本发明的方法更安全，具有高细胞得率、简易的工艺步骤和安全的基因编辑方式，并且所得的双特异通用型CAR‑T细胞具有更好的疗效。

Description

融合一代靶向CD7 CAR和二代靶向BCMA的双靶点通用CAR-T细胞及制备方法

技术领域

本发明涉及细胞治疗领域，特别是涉及融合一代靶向CD7 CAR和二代靶向BCMA基因的双靶点通用型CAR-T细胞及其制备方法。

背景技术

第一代CAR-T细胞技术

1989年以色列科学家Zelig Eshhar和他的同事提出了嵌合抗原受体(ChimericAntigen Receptor，CAR)的概念，他们将抗体单链scFv与CD3ζ或FcRIγ基因的胞内部分融合形成嵌合抗原受体。第一代CAR基因包含胞外抗体单链scFv、跨膜区和单个胞内激活信号CD3ζ或FcRIγ。CD3ζ能够为细胞提供活化的第一信号，激活T细胞和最初的细胞毒性反应，发挥抗肿瘤作用，甚至引起效应T细胞分泌IL-2。

T细胞对抗原的识别依赖TCR-CD3复合体，TCR的α和β链组成决定了TCR的抗原特异性。而CAR以抗原依赖、非MHC限制的方式结合肿瘤抗原，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的肿瘤细胞。但临床试验证明第一代CAR修饰的T细胞在体内扩增能力有限，在体内最多维持63天，在肿瘤部位无法检测到CAR-T细胞，科学家推测可能是由于缺乏第二信号(协同刺激信号)，不能转导增值信号和诱导细胞因子产生，所以T细胞无法增殖而导致杀伤肿瘤效果不佳。因此就有了第二代和第三代CAR的产生。

CAR基因结构发展

在嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)技术中，嵌合抗原受体(CAR)结构的设计是十分重要的环节。CAR的基本结构包括一个胞外肿瘤相关抗原结合区，通常为抗体单链scFv、一个胞外铰链区、一个跨膜区和一个胞内免疫受体酪氨酸活化基序。随着科学技术研究的持续推进，CAR结构的设计主要经历了三次的更新换代。

第一代CAR结构如前述；第二代CAR结构在一代的基础上增加了一个胞内区域的共刺激分子，共刺激分子在增强T细胞抗肿瘤活性、增殖活性以及细胞因子分泌等方面发挥了重要作用。如此二代CAR的胞内区域结构由外向内依次为CD28共刺激结构域、CD3ζ信号链或CD137(4-1BB)共刺激结构域、CD3ζ信号链。共刺激结构域的引入大幅度提高了CAR-T疗法的临床疗效，目前已经上市的CAR-T细胞治疗产品均采用二代CAR结构；第三代CAR结构胞内区域中则搭载了多个共刺激分子，如CD28、CD134(OX40)和CD137等，但目前三代CAR-T细胞疗法的临床应用还不够广泛。

通用型CAR-T治疗

通用型CAR-T(Universal CAR-T，UCAR-T)取自健康人血液，提取T细胞，经过工程改造，回输给不同患者。通用型CAR-T是基于基因编辑、病毒转染技术与电转技术改造人体免疫T细胞而来的。它在已有T细胞上敲除某些基因，使得外来的健康人T细胞不会攻击患者体内细胞引起抗宿主排异反应(GvHD效应)，以及不会被患者免疫系统清除，从而存活在患者体内发挥肿瘤杀伤的作用。通用型CAR-T是摆放在货架的药物，因为它取自已有健康人T细胞，可按照生产药物的严格标准大规模量产。并且，每个不同CAR的靶点可针对不同癌症适应症，也可做到用不同UCAR-T治疗具有不同“分子标记”的肿瘤，极具多样性。通用型CAR-T相比较自体CAR-T，有如下特点：

首先，随时可用，因无需使用患者T细胞，可提前制备，因此是一种“摆在货架上的药品”，可随时取用，病人无需等待。

其次，可规模化量产，成本大幅降低。其不是“私人订制”，可大规模批量生产。一个健康人采血400ml，即可制备满足上百位患者的UCAR-T细胞制品。初步预测对于单剂量的UCAR-T，其成本将是自体CAR-T成本的1/10左右。

第三，无使用限制。因采用健康人血液提取T细胞制备，无需患者自身提供，因此不受患者身体状况(T细胞状态)左右，没有使用限制。

然而，通用型CAR-T治疗仍需克服以下问题：

1)同种异体T细胞移植相容问题

虽然通用型CAR-T治疗有诸多的优势，但是其生产制作和研发难度要大大高于自体CAR-T治疗。其中最影响其疗效的是同种异体排异问题：不同的个体，其组织相容性抗原存在差异，从而导致了受体T细胞对移植物的攻击和排异。为解决这个问题，通常利用基因编辑的方法(如ZFN、TALEN或CRISPR-Cas9)将CAR-T细胞中的B2M基因敲除，从而使HLA-ABC蛋白无法在细胞表面展示，进而可以避免被受体T细胞攻击。也有一些研究者将CIITA基因一并敲除，来降低二类组织相容性抗原的表达。

2)移植物抗宿主反应(GvHD)

移植物抗宿主反应(graft versus host disease，GVHD)是由移植物中的特异性淋巴细胞识别宿主抗原而发生的一种反应。其产生的条件是移植物中包含的T淋巴细胞和移植物与宿主的主要组织相容性抗原不一致。在骨髓移植中，GvHD是主要的障碍，其会杀伤宿主体内的细胞而导致多器官功能衰竭，进而引起其他并发症。在通用型CAR-T细胞治疗中，GvHD是最需要避免的一个问题，否则宿主有严重的副作用。TCR是T淋巴细胞识别靶细胞的主要基因，敲除TCR基因可以避免异体T细胞对宿主细胞的攻击，所以异体移植的通用型CAR-T细胞通常将TCR基因敲除才能避免GvHD。

CRISPR-Cas9技术

CRISPR(Clusters of Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)技术于2012年由麻省理工学院和加州大学伯克利分校的科学家共同发现，它是一种由RNA序列介导的双链DNA内切酶工具。其由两个部分构成，其中之一是100个碱基左右的sgRNA，用于靶向识别目的双链DNA，另一部分是1369个氨基酸的Cas9蛋白，其可结合sgRNA，并且具有DNA酶活性。人为设计的sgRNA和Cas9蛋白形成复合体后可对目的DNA进行特异性切割，当切割造成错配修复，则导致基因移码而起到敲除目的，当添加一段修复DNA序列，则会进行有目的的编辑。自CRISPR-Cas9技术问世至今，已经在很多个领域得到应用。

CD7基因

CD7属于免疫球蛋白超家族成员，是一种40KD的I型跨膜糖蛋白。在1991年，研究者们首次鉴定出了人类CD7基因的结构。CD7基因位于人类第17号染色体上，由4个外显子组成，DNA全长为3.0kb。CD7的前体分子由240个氨基酸组成，其中N端的25个氨基酸为信号肽；CD7的成熟分子由215个氨基酸组成，其中胞内区包含39个氨基酸、跨膜区包含21个氨基酸、胞外区包含155个氨基酸，并且胞外区具有两个糖基化位点。报道指出CD7分子的抗原表位位于1号-38号氨基酸、48号-74号氨基酸和129号-146号氨基酸这三个区域。

作为T细胞以及自然杀伤细胞谱系的一种早期表面抗原，人类的CD7分子主要表达在胸腺细胞、绝大多数T细胞、自然杀伤细胞以及其前体细胞表面，但是依然有少部分外周血T细胞以及自然杀伤细胞不表达CD7。另外，CD7也表达于B细胞和髓样细胞发育的早期。在人体的免疫过程中，CD7分子可通过激活PI(3)k和PI(4)k信号通路结合其配体K12/SECTM1从而在T细胞活化期间起到协同刺激的作用，K12/SECTM1由髓样细胞、胸腺上皮细胞和基质细胞表达。与此相反，当CD7分子与半乳糖凝集素-1结合时则会诱导T细胞的凋亡。尽管如此，CD7分子在T细胞发育和T细胞发挥免疫功能方面似乎并没有起到关键性的作用。报道称将小鼠T祖细胞中的CD7基因敲除后并不影响小鼠T细胞的正常发育进程，并且小鼠机体内环境依然保持稳定，仅仅是小鼠T细胞效应器功能的发挥受到了轻微的影响。对于自然杀伤细胞，CD7分子能够介导自然杀伤细胞的钙离子跨膜流动，报道称采用CD7单克隆抗体处理自然杀伤细胞能够加强其表面抗原的表达，刺激细胞分泌γ干扰素，增强自然杀伤细胞的毒性以及其与纤维连接分子的黏附作用等。另外，CD7分子在单克隆抗体交联反应中具有信号转导以及相关的生物学功能。

目前大量的研究发现CD7与血液系统肿瘤的发生发展密切相关。在多数人急性T淋巴细胞白血病，T细胞淋巴瘤和部分亚型的急性髓细胞白血病肿瘤细胞上均有CD7抗原异常高表达现象的存在，CD7分子的表达与疾病侵袭性、耐药性和不良预后有着密切的关系。另外Fallah Azad等研究结果发现，1例被诊断为急性前B淋巴细胞白血病患儿的癌细胞中存在CD7分子异常表达，并且具有从急性前B淋巴细胞白血病转型为急性T淋巴细胞白血病的复发病史。该报道提示，如果B细胞系肿瘤中出现CD7分子异常表达的情况，则可能预示之后病情复发时疾病谱系的转换。

现阶段血液肿瘤领域的治疗手段主要包括强效化疗、造血干细胞移植和免疫治疗等。虽然也取到了显著的临床疗效，但是治疗耐受、配型困难、复发率高、副作用强等依然是亟待解决的问题。CD7分子作为T细胞系血液肿瘤特异且敏感的抗原指标之一，普遍认为是治疗CD7阳性血液肿瘤的潜在理想靶点。除此之外，CD7分子还与HIV感染、类风湿关节炎的发生有密切关系，应用前景广阔。

BCMA基因

B细胞成熟抗原(BCMA)，又名TNFRSF17或CD269，属于缺少信号肽的III型跨膜受体蛋白，是肿瘤坏死因子受体超家族成员，于20世纪90年代初首次被发现。人类TNFRSF17基因位于16号染色体上，其mRNA全长约1.2kb。BCMA分子由184个氨基酸残基组成，胞内区含80个氨基酸残基，胞外区序列很短，含有一个与配体结合有关的半胱氨酸富集区，能够通过蛋白与蛋白之间的相互作用来传导细胞刺激信号。在正常组织中，BCMA表达于成熟B细胞和浆细胞表面，扁桃体B细胞表面也有微弱的表达，其表达量随着B细胞的发育成熟而逐渐增加。BCMA分子可分别与B细胞激活因子BAFF或增殖诱导配体APRIL结合以发挥生物学功能。虽然两种配体之间有着30％的序列同源性，但是BCMA分子会优先同APRIL结合。在健康人组织中APRIL分子的表达相对较弱，仅在单核巨噬细胞、活化的T淋巴细胞、树突状细胞、胰腺和脾脏等组织细胞中低表达，而在肿瘤组织中却高表达。一方面APRIL主要通过破骨细胞分泌并且可以通过蛋白聚糖直接促进恶性浆细胞的存活；另一方面APRIL与BCMA结合后可提升骨髓血细胞和浆母细胞的存活能力，同时可通过上调关键的免疫检查点分子以营造一种免疫抑制的骨髓微环境，另外该结合过程还可以诱导经典与非经典的NF-κB途径，最终增强B细胞的增殖能力和存活率，该生物学功能对包括多发性骨髓瘤在内的许多B细胞恶性肿瘤的生存至关重要。同BCMA亲和力相对较低的BAFF存在着膜结合和可溶性蛋白两种形式，其主要通过单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞等固有免疫细胞表达。BAFF不仅可以与BCMA结合还可以连接到肿瘤坏死因子受体超家族的另外两个成员-B细胞激活因子受体BAFF-R以及跨膜激活剂和钙调亲环素配体相互作用分子TACI，该受配体系统能够通过彼此之间的相互作用管理B细胞以及浆细胞的存活。有报道指出，当BAFF与BCMA、TACI或BAFF-R结合后可活化经典及非经典NF-κB通路和JNK信号通路等，上述信号通路的活化能够上调抗凋亡蛋白表达的同时下调促凋亡蛋白的表达，进而促进多发性骨髓瘤细胞的存活与增殖。此外还有报道指出由于γ-分泌酶的裂解而从血浆细胞表面脱落的可溶形式的BCMA(sBCMA)在多发性骨髓瘤患者中显著升高，并与不良的临床结果相关。由此可见，BCMA分子与多发性骨髓瘤的发生发展息息相关。

不仅如此，研究者们指出BCMA分子还在霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、胶质母细胞瘤等恶性肿瘤中均存在异常高表达的现象。并且在自身免疫性疾病领域，研究者们发现很多自身免疫性疾病都和BAFF和APRIL相关，说明BCMA分子很可能在自身免疫疾病的发病中起到一定作用。Kochenderfer等在已有报道的基础上，又联合应用Q-PCR、FlowCytometry和免疫组化方法深入研究了BCMA的表达特征，确认BCMA在成熟B细胞、浆细胞之外的正常人体组织无表达，且在CD34+造血细胞中也无表达。综上所述，BCMA分子可作为免疫治疗的理想靶点。

多发性骨髓瘤

多发性骨髓瘤(MM)是一种克隆浆细胞异常增殖的恶性疾病，该疾病常见的症状包括骨髓瘤相关器官功能损伤的表现，即血钙增高、肾功能损伤、贫血、骨病和继发淀粉样变性等相关表现。以往的研究发现当浆细胞恶性增殖时，会产生大量类别、亚类、型、亚型、基因型和独特型相同的均一免疫球蛋白-M蛋白，因此临床上根据M蛋白的类型对多发性骨髓瘤进行分型；而在反映肿瘤负荷和临床进程方面可按照传统的Durie-Salmon(DS)分期系统和修订的国际分期系统(Revised International Staging System，R-ISS)进行分期。多发性骨髓瘤在很多国家是血液系统第二位的常见恶性肿瘤，多发于老年。据最新数据统计，中国多发性骨髓瘤的发病率为1.6/10万，并且随着老龄化进程的加快，每年的患者数量也在快速增加，但目前该恶性肿瘤仍无法治愈。临床上指出宿主因素、肿瘤特征和治疗方式以及对治疗的反应这三大因素交织影响着多发性骨髓瘤患者的预后情况。目前临床上多根据病情的严重程度对患者施予相应的化疗方案并桥接造血干细胞移植进行治疗，随着新药的研发和应用，骨髓瘤患者的5年生存率已经提高到了60％，但多数患者经历了缓解、复发、再缓解的过程，最终却发展成为复发/难治性多发性骨髓瘤病人，该类恶性肿瘤的治疗也是国内外学者面临的重大挑战之一，因此目前迫切需要一种新的安全有效的治疗手段来为多发性骨髓瘤患者们带来康复的福音。

同种异体回输排异反应

通用型CAR-T回输异体静脉后，最大的障碍是排异反应，严重的排异反应可导致回输的细胞几天内在机体中消失，从而完全失去疗效。其根据排异类型分为抗HLA抗体排异反应、T细胞排异反应和NK细胞排异反应。根据排异反应起效时间其又分为超急性排异反应、急性排异反应和慢性排异反应。

双靶点CAR-T

双靶点CAR-T细胞是单靶点CAR-T的升级版本，目前已知的优势有：一定程度预防抗原逃逸的发生(如抗CD19-CD22 CAR-T治疗急性B淋巴细胞白血病)；适用更多的病人(抗CD19-BCMA CAR-T和抗CD19-CD123CAR-T)；更好的疗效(如抗CD19-CD20 CAR-T治疗非霍奇金淋巴瘤)。未来双靶点CAR-T还将在更多的治疗上发挥优势。双靶点CAR-T有两种形式，分别是通过P2A或T2A等剪切肽隔开两个完整的CAR-T、两个靶点抗体scFv通过连接肽串联并共用其他元件(Tandem CAR-T)。

靶向BCMA通用型CAR-T国内外研究进展

ALLO-715是Allogene公司靶向BCMA通用型CAR-T产品，是治疗多发性骨髓瘤和其他BCMA阳性癌症的潜在疗法。它利用TALEN基因编辑技术特异性破坏T细胞受体α链和CD52基因座。ALLO-715CAR-T细胞使用第二代CAR构建体，掺入对BCMA高亲和力的全人抗体的新型scFv，以及位于CAR铰链区的“安全开关”，由利妥昔单抗(Rituximab)驱动。临床数据显示，在31例可评估安全性的患者中，未观察到移植物抗宿主病(GvHD)或免疫效应细胞相关神经毒性综合征(ICANS)。1级和2级CRS报告14例(45％)。单次输液治疗的总缓解率为72％，严格的完全缓解率28％。缓解迅速且持久，从接受输液治疗至病情发生缓解的中位时间为30天(范围：15-88天)。

Poseida公司将高保真NextGEN CRISPR基因编辑系统与非病毒piggyBac DNA转座技术结合使用，应用记忆性干细胞样T细胞开发了同种异体P-BCMA-ALLO1细胞产品。临床前数据表明，P-BCMA-ALL01杀伤效果与自体CAR-T相当，甚至高于自体。加入其专有的细胞培养促进分子后，单批生产的通用CAR-T细胞可满足几百位患者使用。

CRISPR Therapeutics采用CRISPR cas9基因编辑技术开发了靶向BCMA的通用型CAR-T(CTX120)产品，通过基因编辑敲除TCR、B2M基因，目前处于临床前开发阶段。

Precision BioSciences基于ARCUS基因编辑核心技术平台开发了靶向BCMA的通用型CAR-T产品PBCAR269A，已获得IND并且获得了FDA授予的孤儿药资格，目前该产品处于临床I期阶段。

Celyad基于其专有的shRNA技术通过敲除编码TCR复合体CD3z成分的RNA来干扰TCR表达，开发了靶向BCMA的同种异体CAR-T细胞产品CYAD-211，2020年7月14日FDA批准其IND申请，用于治疗复发/难治性多发性骨髓瘤。

发明内容

定义

CAR-T(chimeric antigen receptor T cell)：嵌合抗原受体T细胞。

CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4)：细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4，其是最早获批的免疫检验点抑制剂靶点。

PD-1/PD-L1(programmed cell death 1/ligand of PD-1protein)：程序性细胞死亡蛋白1/PD-1蛋白的配体，其是最著名的两个免疫检验点抑制剂靶点。

ACT(adoptive cell transfer)：过继性免疫疗法，是将供体的淋巴细胞转移给受体，增强其细胞免疫功能。过继性细胞免疫可分为特异性和非特异性两类，前者是用已知抗原致敏的淋巴细胞注入受体后使其获得对该抗原的细胞免疫能力，后者是用未经特殊抗原致敏的正常人淋巴细胞注入受体后使其获得对多种抗原的细胞免疫能力。

CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)：一种细菌免疫系统，今年来被科学家改造为最热门的基因编辑工具。

ZFN：一种基因编辑技术，它是一类人工合成的限制性内切酶，由锌指DNA结合域与限制性内切酶的DNA切割域融合而成，研究者可以通过加工改造ZFN的锌指DNA结合域，靶向定位于不同的DNA序列，从而使得ZFN可以结合复杂基因组中的目的序列，并由DNA切割域进行特异性切割。

TALEN：一种基因编辑技术，典型的TALEN由一个包含核定位信号的N端结构域、一个包含可识别特定DNA序列的典型串联TALE重复序列的中央结构域，以及一个具有FokI核酸内切酶功能的C端结构域组成，可以结合复杂基因组中的目的序列，并由DNA切割域进行特异性切割。

ARCUS：一种基因编辑技术，其优点在于所用到的核酸酶结构小巧，易于体内递送。

megaTAL：一种基因编辑技术，由归巢内切核酸酶和转录激活子样效应子的DNA结合域融合在一起，可以结合复杂基因组中的目的序列，并由DNA切割域进行特异性切割。

Knockin：通过基因编辑将目的基因位置引进特定的突变或外源基因。

dsDNA：双链DNA。

RNP：Cas9蛋白和sgRNA形成的复合体简称。

mRNA：信使RNA，是由DNA的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息的能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。以细胞中基因为模板，依据碱基互补配对原则转录生成mRNA后，mRNA就含有与DNA分子中某些功能片段相对应的碱基序列，作为蛋白质生物合成的直接模板。

AAV：腺相关病毒载体，一种高效安全的基因递送工具，近年来多用于基因治疗，也可用于大片段基因敲入的修复模版。

CAR-Treg：一种过继性细胞治疗技术，将CAR基因转导入Treg细胞，用于抑制特定的抗原细胞活性，目前处于临床前研究阶段，有望将来用于自身免疫性疾病治疗。

TCR-T：一种过继性细胞治疗技术，是将实验室筛选到的天然或优化的TCR基因转导至T细胞，并在体外扩增培养最后回输病人，可用于治疗多种难治肿瘤。

sgRNA：CRISPR应用中人为发明的一种RNA，其融合了crRNA和tracrRNA，可结合Cas9蛋白并靶向目的DNA。

PolyA：多聚腺苷酸结构，是一种mRNA转录后修饰过程，帮助稳定mRNA并提高翻译效率。

本发明涉及一种制备靶向CD7和BCMA的双靶点通用型CAR-T细胞的方法，所述方法包括：将基因编辑物质递送至T细胞以剪切TRAC和CD7基因组DNA或剪切TRAC、CD7和B2M基因组DNA，以及使用重组腺相关病毒递送模版DNA以将靶向CD7-BCMA双靶点CAR基因定点整合入TRAC、CD7或B2M基因组位点。

将基因编辑物质递送至T细胞所使用的基因编辑方法可以是CRISPR-Cas9、ZFN、ARCRS、TALEN和megaTAL等，优选CRISPR-Cas9，也可以是将来新出现的某种基因编辑方法。基因编辑物质可以是质粒、mRNA、蛋白质、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒，优选mRNA。基因编辑物质的递送可以使用脂质体、磷酸钙、DEAE-葡聚糖、电穿孔、显微注射、基因枪等转染方法，优选电穿孔转染。

在一些实施方案中，使用CRISPR-Cas9基因编辑方法。使用的CRISPR-Cas9基因编辑物质包括Cas9 mRNA或Cas9蛋白和sgRNA。

sgRNA靶向TRAC、CD7和/或B2M基因。首先需要明确敲入的基因组位点，利用该位点周围的DNA序列设计sgRNA。设计的原则是PAM区序列为NGG，其中N为A、T、C和G中的任一碱基。sgRNA包括靶向的crRNA序列和tracrRNA序列，其中crRNA可以是17、18、19、20、21或22个碱基。

在一些实施方案中，sgRNA是化学修饰的。化学修饰包括2-O-甲基化、3-硫代、2-O-甲基化结合3-硫代等。化学修饰可以发生在sgRNA的5’和3’端的1至10个碱基。在一些实施方案中，5’和3’端3个碱基同时进行2-O-甲基化和3-硫代修饰。设计好的sgRNA可以通过T7体外转录获得，也可以直接体外合成。

在一些实施方案中，针对TRAC基因的sgRNA序列(包含PAM序列)如SEQ ID NO:1所示，针对CD7基因的sgRNA序列(包含PAM序列)如SEQ ID NO:2所示，针对B2M基因的sgRNA序列(包含PAM序列)如SEQ ID NO:3所示。

Cas9可以为SpCas9、SaCas9、SpCas9-HF、eSpCas9、xCas9、cpf1或其它不同菌属的Cas9，优选SpCas9。在一些实施方案中，SpCas9的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。Cas9蛋白的N端或C端可以偶联有一个或多个NLS入核信号肽。在一些实施方案中，NLS入核信号肽序列如SEQ ID NO:5所示。Cas9 mRNA可以通过体外转录获得，并且Cas9蛋白可以通过细菌或真核表达细胞表达纯化获得。

在一些实施方案中，使用编码Cas9蛋白的mRNA和sgRNA混合物进行电转。

在一些实施方案中，使用Cas9蛋白和sgRNA形成的RNP复合体进行电转。RNP复合体可以通过直接混合温育Cas9蛋白和sgRNA获得，或者通过将二者混合于特定缓冲液(诸如电转缓冲液)中获得。

当使用电穿孔转染(电转)递送基因编辑物质时，在T细胞激活完成后，离心富集细胞，每个电转单元的T细胞数量取决于仪器设备要求，电转体系的配置根据单个电转单元细胞数量设置。电转体系的缓冲液通常由设备厂家提供，也可以用其他缓冲液替代，诸如PBS、MEM或1640等。将基因编辑物质(例如CRISPR-Cas9基因编辑物质)与电转缓冲液混合，具体加入量取决于单个电转单元的细胞数量。将电转体系与细胞混合后加入电转杯，立即电转，电转的条件可以按照厂家要求，也可以自行摸索。电转完成的细胞可以放置在电转杯一段时间后再加入培养基中。

在本发明中，使用腺相关病毒(rAAV)作为打靶载体用于递送双靶点CAR基因定点敲入的模版DNA。模版DNA包括左同源臂DNA、敲入的外源DNA、右同源臂DNA。

模版DNA的左同源臂与DNA切口5’端序列同源，右同源臂与DNA切口3’端序列同源。在一些实施方案中，左同源臂3’端DNA序列与距离DNA切口0至300个碱基的5’端序列一致，片段长度为10至2000bp；右同源臂5’端DNA序列与距离DNA切口0至300个碱基的3’端序列一致，片段长度为10至2000bp。在一些实施方案中，左右同源臂片段长度为300、600或1000个碱基，优选300个碱基。在一些实施方案中，当双靶点CAR基因敲入TRAC基因组位点时，同源臂序列分别如SEQ ID NO:6-7所示；当双靶点CAR基因敲入CD7基因组位点时，同源臂序列分别如SEQ ID NO:8-9所示；当双靶点CAR基因敲入B2M基因组位点时，同源臂序列分别如SEQID NO:10-11所示。

本发明的双靶点CAR基因可以敲入TRAC、CD7或B2M基因组位点，优选TRAC基因组位点。

当双靶点CAR基因敲入TRAC或CD7基因组位点时，可以依赖内源TCR-α基因启动子或内源CD7基因启动子转录，也可以依赖外源启动子转录，优选依赖外源启动子转录。在一些实施方案中，敲入的外源DNA包含剪切肽或内部核糖体进入位点基因、双靶点CAR基因和polyA。敲入的外源DNA的剪切肽或内部核糖体进入位点基因可以为P2A、T2A、IRES等，优选P2A或T2A。在一些实施方案中，P2A和T2A的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:12-13所示。在一些实施方案中，敲入的外源DNA包含外源启动子基因、双靶点CAR基因和polyA。

当双靶点CAR基因敲入B2M基因组位点时，可以依赖内源B2M基因启动子转录，也可以依赖外源启动子转录。在一些实施方案中，敲入的外源DNA包含双靶点CAR基因和polyA。在一些实施方案中，敲入的外源DNA包含外源启动子基因、双靶点CAR基因和polyA。

在双靶点CAR基因敲入TRAC、CD7或B2M基因组位点的实施方案中，敲入的外源DNA的外源启动子可以是任意一种外源启动子，例如EF1、CMV、PGK、MSCV、SFFV等，优选EF1。在一些实施方案中，EF1的DNA序列如SEQ ID NO:14所示。

在双靶点CAR基因敲入TRAC、CD7或B2M基因组位点的实施方案中，敲入的外源DNA的polyA可以为任一polyA基因，优选miniPolyA或者bGHpA polyA。在一些实施方案中，miniPolyA和bGHpA polyA的DNA序列分别如SEQ ID NO:15-16所示。

双靶点CAR基因由一代靶向CD7 CAR和二/三代靶向BCMA CAR基因(优选二代靶向BCMA CAR基因)融合而成，其中靶向CD7 CAR基因和靶向BCMA CAR基因通过剪切肽偶联。靶向CD7 CAR基因和靶向BCMA CAR基因无顺序要求；换言之，双靶点CAR基因可以包含(5’到3’)：靶向CD7 CAR基因、剪切肽、靶向BCMA CAR基因，或者靶向BCMA CAR基因、剪切肽、靶向CD7 CAR基因。剪切肽可以是P2A或T2A，更优选地P2A的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。

靶向CD7 CAR基因从5’端起包含信号肽、靶向CD7抗体单链scFv、铰链区、跨膜区和激活区。

靶向BCMA CAR基因从5’端起包含信号肽、靶向BCMA抗体单链scFv、铰链区、跨膜区、共刺激区和激活区。

在一些实施方案中，靶向CD7抗体单链scFv和靶向BCMA抗体单链scFv的DNA序列分别如SEQ ID NO:17-18所示。

敲入的外源DNA中的双靶点CAR基因的信号肽选自CD8、IL-2、GM-CSF等信号肽结构域，优选CD8信号肽。在一些实施方案中，CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示。

敲入的外源DNA中的双靶点CAR基因的铰链结构可以是IgG1、IgG4、IgD、CD8等铰链结构域，优选CD8铰链结构。在一些实施方案中，CD8铰链结构的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示。

敲入的外源DNA中的双靶点CAR基因的跨膜结构可以是CD3、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、PD1等跨膜结构域，优选CD8跨膜结构。在一些实施方案中，CD8跨膜结构的氨基酸序列如SEQ IDNO:21所示。

敲入的外源DNA中的双靶点CAR基因的共刺激结构可以是CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54、CD83、CD134、CD137、CD150、CD152、CD223、CD270、CD273、CD274、CD278、CARD11、NKD2C、DAP10、LAT、SLP76、ZAP70、4-1BB等共刺激结构域，优选4-1BB共刺激结构。在一些实施方案中，4-1BB共刺激结构的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。

敲入的外源DNA中的双靶点CAR基因的激活结构可以是CD3ζ激活结构域。在一些实施方案中，CD3ζ激活结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。

在一些实施方案中，剪切肽为P2A，polyA为bGHpA polyA，外源启动子为EF1，信号肽为CD8信号肽、铰链区为CD8铰链结构、跨膜区为CD8跨膜结构、共刺激区为4-1BB共刺激结构，并且激活区为CD3ζ激活结构。

在一个具体实施方案中，当双靶点CAR基因敲入TRAC基因组位点并依赖TCR-α基因启动子时，模版DNA序列为SEQ ID NO:24。

在一个具体实施方案中，当双靶点CAR基因敲入TRAC基因组位点并依赖EF1启动子时模版DNA序列分别为SEQ ID NO:25。

在一个具体实施方案中，当双靶点CAR基因敲入CD7基因组位点并依赖CD7基因启动子时模版DNA序列分别为SEQ ID NO:26。

在一个具体实施方案中，当双靶点CAR基因敲入CD7基因组位点并依赖EF1启动子时模版DNA序列分别为SEQ ID NO:27。

在一个具体实施方案中，当双靶点CAR基因敲入B2M基因组位点依赖B2M基因启动子时模版DNA序列分别为SEQ ID NO:28。

在一个具体实施方案中，当双靶点CAR基因敲入B2M基因组位点并依赖EF1启动子时模版DNA序列分别为SEQ ID NO:29。

在本发明中，将模版DNA克隆至腺相关病毒载体中，包装成重组腺相关病毒(rAAV)，以递送模版DNA。可以通过293T细胞或SF9表达系统包装病毒。rAAV血清型可以是任意血清型，例如AAV1-AAV9、AAV-DJ、AAV-Retro等，优选AAV6型。rAAV的纯化可以采用超速离心或亲和层析等方法。在电转完成后0至6小时后，将rAAV添加至培养细胞中，其中MOI不低于1×10³。

在一些实施方案中，制备靶向CD7和BCMA的双靶点通用型CAR-T细胞的方法还包括递送基因编辑物质之前的T细胞激活，以及CAR-T细胞扩增和细胞冻存。

在T细胞激活步骤中，T细胞来源于健康志愿者。T细胞来源可以是静脉抽全血，也可以是单采单个核细胞。可以选择分离纯化T淋巴细胞或者不分离。T细胞分离可以采用淋巴细胞分离液，配合普通离心管、sepmate管或者其他硬件设备进行。若需分离纯化T淋巴细胞，可以采用各厂商的试剂盒，包括各种阴选和阳选的方法。T细胞激活可以采用如下方法激活：单独的抗CD3抗体包被、抗CD3抗体/抗CD28抗体包被、直接添加单独的抗CD3抗体、直接添加抗CD3抗体/抗CD28抗体、直接添加抗CD3抗体/抗CD28抗体/CD2抗体、抗CD3抗体/抗CD28抗体磁珠等。激活时间可以为1到8天。若采用抗体磁珠激活，电转前需利用磁极去除磁珠。

感染rAAV后的CAR-T细胞的扩增培养采用1640培养基+血清或其他专用于T细胞培养的无血清培养基，例如X-VIVO-15、ImmunoCult^TM-XF、OpTmizer培养基等。培养可以在培养瓶、培养皿、G-rex或培养袋中进行。培养过程中可以添加一定浓度的细胞因子，例如IL-2、IL-7、IL-15等。

制备的CAR-T细胞按一定细胞浓度进行冻存。冻存液可以为市面上提供的GMP或非GMP级别产品。冻存可以在专用的冻存袋或冻存管中进行。制备的CAR-T细胞经过专用的设备梯度降温后放于负八十度冰箱或液氮罐中保存。

本发明还涉及通过所述方法制备的靶向CD7-BCMA的双靶点通用型CAR-T细胞，其用于治疗疾病。

本发明还涉及通过所述方法制备的靶向CD7-BCMA的双靶点通用型CAR-T细胞用于制备药物的用途，所述药物用于治疗疾病。

具体地，所述疾病包括白血病(例如急性B淋巴细胞白血病、急性T淋巴细胞白血病、NK/T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、多发性骨髓瘤等，特别是多发性骨髓瘤)、实体肿瘤(例如肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、脑胶质瘤、食管癌、胆管癌、子宫内膜癌、卵巢癌、间皮瘤、胸腺癌等)、自身免疫疾病(例如艾滋病等)和CAR-T细胞治疗可及的各种疾病。

靶向CD7-BCMA双靶点CAR基因也可以定点整合至其它常见于T细胞基因编辑的基因组位点(如PD-1，CD3z，CD3e等)，可利用外源启动子(如EF1)或内源基因启动子启动。

一代靶向CD7 CAR基因也可以同其他靶点组成双靶点CAR基因并用于制备同种异体通用型CAR-T细胞治疗。除BCMA外，其它靶点可以是：CD19、CD22、CD20、CD7、、CD79、CD123、CD33、CD38、PSMA、Her2、Mesothelin、CS1、MUC16、GD2、GPC3、CEA、CD138、EGFR、EGFRVIII、LewisY、DLL3、GPRC5D、MG7和IL13Rα2等。

本发明在原本通用型靶向BCMA CAR-T细胞上加装一个靶向CD7 CAR基因，该靶向CD7 CAR基因为一代结构，利用该靶向CD7 CAR杀伤大部分异体的T和NK细胞，从而有效抑制排异反应，同时不影响靶向BCMA CAR-T行使功能，可增强异体回输CAR-T细胞的疗效。另外，为避免CD7 CAR基因对T细胞短暂的“自杀”效应，应用定点整合技术一步实现CAR基因转导和CD7基因敲除，从而高效制备双靶点CAR-T细胞。

去除T细胞表面TCR-CD3复合体蛋白通过敲除TRAC基因实现以防止GvHD反应。敲除CD7基因以防止通用型双靶点CAR-T细胞“自杀”从而可以在体外正常扩增出大量的细胞。可选择敲除或不敲除B2M基因，或采用敲除与不敲除B2M的混合细胞。敲除B2M相当于完全抑制HLA-I类分子表达，有利于进一步压低T细胞排异反应，但同时NK排异反应也会显著增强，靶向CD7 CAR可抑制NK排异反应。

靶向CD7 CAR作为抗排异基因同靶向BCMA CAR基因融合形成双靶点CAR基因，制备成的双靶点CAR-T细胞用于同种异体通用型细胞治疗。该双靶点CAR基因形式是一代靶向CD7 CAR与二/三代靶向BCMA CAR基因通过剪切肽偶联(其中优选二代靶向BCMA CAR基因)。一代靶向CD7CAR基因在保障治疗窗口杀伤NK/T细胞的同时，因为无共刺激结构，不会长期抑制NK/T细胞，不影响患者的免疫系统恢复。

双靶点CAR基因通过CRISPR-Cas9基因编辑方法定点整合至TRAC基因组位点，极大降低CAR基因随机插入几率，避免CAR-T细胞“癌化”，同时一步完成CAR基因转导和基因敲除，可极大避免短时间内“自杀”效应，该方法极大提高双靶点CAR-T细胞的制备得率。

以往靶向BCMA通用型CAR-T主要思路是如何避免同种异体回输的细胞遭遇排异反应，多采用敲除或表达一些基因来抑制异体T或NK细胞的杀伤。而本发明的方案是回输细胞后直接杀伤大部分T和NK细胞来降低排异反应，为靶向BCMA通用型CAR-T细胞发挥作用留下“空间”。在本发明中，以靶向CD7 CAR基因作为抗排异反应的“武器”，将靶向CD7 CAR基因与靶向BCMA CAR基因结合于单个T细胞，制备成双靶点CAR-T细胞。靶向CD7 CAR编码的基因可杀伤大部分异体T或NK细胞，无需额外生物试剂(如CD52单抗)做通用CAR-T细胞回输前的预处理。

本发明的有益技术效果在于：

1.更好的疗效。添加的靶向CD7 CAR基因增强了靶向BCMA通用CAR-T细胞的抗排异反应，因而在异体内存续时间更长，更能发挥靶向BCMA通用CAR-T细胞的作用，增加了疗效。

2.更安全。双靶点CAR-T细胞上的靶向CD7 CAR基因为一代结构，其与靶向BCMACAR基因通过剪切肽基因偶联。一代靶向CD7 CAR基因在保障治疗窗口杀伤NK/T细胞的同时，因为无共刺激结构，不会长期抑制NK/T细胞，不影响患者的免疫系统恢复。

3.更高的细胞得率使成本降低。本发明具有超过90％的得率。本发明外的研究显示一般通用CAR-T的最终得率很难超过50％(单敲除效率不超过80％，慢病毒转染效率不超过60％)，再加上本发明用到CD7靶点的特殊性，若使用慢病毒载体方案，则转染效率不超过10％，而本发明中若将双靶点CAR基因敲入TRAC位点则最终得率超过90％(TCR和CD7敲除效率接近100％，双靶点CAR定点整合效率超过90％)，若将双靶点CAR基因敲入CD7或B2M位点则最终得率也远高于慢病毒载体制备方式。

4.更简易的工艺步骤使成本进一步降低。本发明得到的TCR阴性细胞接近100％，无需额外分选，简化了步骤，进一步节省成本，同时降低了分选对细胞状态的损害和数量的损失。

5.更安全的基因编辑方式。使用慢病毒、逆转录病毒或转座子载体转导CAR基因都是随机插入，可能导致T细胞癌变，本发明使用的CRISPR+rAAV定点整合方式转导CAR基因，使CAR基因随机整合大大降低，减少了T细胞癌变风险，增加了治疗的安全性。

附图说明

图1为双靶点CAR-T细胞的效果示意图。

图2为双靶点CAR-T细胞制备流程示意图。

图3为双靶点CAR基因结构及定点整合的打靶示意图：a.定点整合后依赖TCR-α基因启动子的打靶示意图；b.定点整合后依赖EF1基因启动子的打靶示意图；c.双靶点CAR基因结构示意图。

图4为质粒载体pAAV-MCS的图谱。

图5a为质粒载体pHelper的图谱；图5b为质粒载体pAAV-RC6的图谱。

图6为sgRNA的2-O-甲基化结合3-硫代修饰示意图。

图7为实施例5的流式检测结果。

图8为实施例6的流式检测和杀伤实验结果：a.K562-BCMA和K562-CD7细胞流式鉴定；b.双靶点CAR-T细胞杀伤K562-CD7细胞检测结果；c.双靶点CAR-T细胞杀伤K562-BCMA细胞检测结果。

图9为实施例7中双靶点CAR-T细胞杀伤原代T(a)和NK(b)细胞检测结果。

图10为实施例8中双靶点CAR-T及其对照细胞与PBMC细胞孵育后流式检测的统计结果。

图11为实施例9中双靶点CAR-T及其对照细胞注射荷瘤小鼠后肿瘤大小变化：a.实验过程示意图；b.小鼠荷瘤变化。

图12为实施例10中双靶点CAR-T及其它通用型CAR-T细胞与PBMC细胞孵育后流式检测的统计结果。

图13为实施例11对比的定点整合制备与慢病毒制备方案中双靶点CAR-T细胞的总细胞数(a)、CAR阳性率(b)、TCR阴性细胞比例(c)、CD7阴性细胞比例(d)、有效细胞数(e)。

图14为实施例12中对比本发明和Cellectis公司制备通用型CAR-T细胞后TCR阴性细胞比例变化图。

图15a-c分别示出了实施例13中双靶点CAR基因敲入B2M和CD7基因组位点的打靶示意图和细胞制备结果：a.双靶点CAR基因敲入B2M基因组位点后分别依赖EF1和B2M基因启动子的打靶示意图；b.双靶点CAR基因敲入CD7基因组位点后分别依赖EF1和CD7基因启动子的打靶示意图；c.三种不同敲入方式制备的双靶点CAR-T细胞结果。

具体实施方式

实施例1：模版DNA的分子设计

靶向CD7-BCMA双靶点CAR基因敲入T细胞的TRAC基因组位点。修复的模版DNA包含了两个部分：

a.左右同源臂。左右同源臂用于识别目的DNA，并且进行重组交换，为了使敲入基因能正确表达，将敲入基因“登陆”到TRAC基因组外显子1的5’端区域。设计了300个碱基的同源臂，序列如SEQ ID NO：6-7，具体如下：

序列名称(敲入TRAC基因组)	序列编号
		300个碱基左同源臂	SEQ ID NO：6
300个碱基右同源臂	SEQ ID NO：7

b.敲入的外源DNA。当双靶点CAR基因敲入TRAC基因组位点并依赖TCR-α基因启动子时，敲入的外源DNA包括剪切肽P2A基因、双靶点CAR基因和polyA；当双靶点CAR基因敲入TRAC基因组位点并依赖EF1启动子时，敲入的外源DNA包括EF1启动子基因、双靶点CAR基因和polyA。双靶点CAR基因结构如图3c所示，包含通过剪切肽P2A偶联的靶向CD7 CAR基因和靶向BCMA CAR基因，其中靶向CD7 CAR基因包含CD8信号肽、靶向CD7抗体单链scFv、CD8铰链区、CD8跨膜区和CD3ζ激活区，并且靶向BCMA CAR基因包含CD8信号肽、靶向BCMA抗体单链scFv、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB共刺激区和CD3ζ激活区。PolyA采用bGHpA polyA。各基因结构序列如下：

实施例2：修复模版DNA克隆至腺相关病毒载体。

将SEQ ID NO：25修复模版DNA酶切后克隆至pAAV-MCS质粒载体中。该过程分为如下几步：

1)目的片段PCR制备，首先需要配制PCR反应体系：

试剂	使用量(μl)
		5×primeSTAR GXL缓冲液	10
dNTP Mix	4
		引物F	1
引物R	1
		DNA片段(南京金斯瑞公司提供DNA合成服务)	0.5
灭菌水	32.5
		PrimeSTAR GXL DNA聚合酶(购自Takara公司)	1
总体积	50

然后将PCR反应体系置于PCR扩增仪中，按如下条件进行扩增：

2)载体酶切，反应体系如下：

试剂	使用量(μl)
		10×Cusmart缓冲液	5
pAAV-MCS质粒(如图4)或DNA片段(SEQ ID NO：25)	2μg
		Not1-HF酶(购自NEB公司)	0.5
灭菌水	补至50μl
		总体积	50

将酶切反应体系置于37度水浴中酶切两小时。

3)目的片段与载体连接：于冰盒上将目的基因与线性化载体以一定的摩尔比加入到离心管进行连接反应，在室温反应一小时，反应体系如下所示：

试剂	使用量(μl)
		已酶切pAAV-MCS质粒	2
已酶切DNA片段(SEQ ID NO：25)	3
		2×Ligation Mix(购自Takara公司)	5
总体积	10

4)反应产物转化涂板：冰上融化一管100μl的StbI3感受态细胞，轻弹管壁使细胞重悬起来，加入10μl的连接反应液到感受态细胞中，轻弹数下，冰浴30分钟；42℃水浴锅中热激90秒后快速放入冰上5分钟；加入500μl LB液体培养基，37℃摇床孵育45-60分钟；5000rpm离心3分钟收集菌体，弃300μl的上清，将剩余一定量的菌体涂于含氨苄抗生素的平板上，置于37℃的温箱孵育过夜。

5)挑取单克隆，进行质粒提取(货号：DP103-03，天根生化)。柱平衡步骤：向吸附柱CP3中加入500μl的平衡液BL，12,000rpm(13,400×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中；取5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机，12,000rpm(13,400×g)离心1分钟，尽量吸除上清；向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1，使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；向离心管中加入250μl溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；向离心管中加入350μl溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀；12,000rpm(13,400×g)离心10分钟；将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)；12,000rpm(13,400×g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD，12,000rpm(13,400×g)离心30到60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3重新放回收集管中；向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW，12,000rpm(13,400×g)离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；重复操作上一步骤；将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除；将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟将质粒溶液收集到离心管中。将得到的溶液重新加入吸附柱中，室温放置2分钟，12,000rpm(13,400×g)离心2分钟，将质粒溶液收集到离心管中。

6)测序确认。

实施例3：重组腺相关病毒包装、纯化和滴度测定

(1)包装：293T细胞(购自ATCC)在转染前一天在225cm²培养皿中长至95％左右密度后按1:3进行传代，单个培养皿培养基为20ml，共包装5个225cm²培养皿。先配制转染体系(针对1个225cm²培养皿)，如下：

转染体系	含量
		pAAV-0025	10μg
pHelper质粒(图谱参见图5a)	10μg
		pRC6质粒(图谱参见图5b)	10μg
Opti-MEM(Gibco)	2000μl
		PEI-MAX	120μl

混匀转染体系后，静置10分钟，小心加入293T细胞中。6小时后换新鲜培养基。72小时后分别收取培养基和细胞。

(2)纯化：先用高速离心机将培养基以50000g离心2小时，去除培养基上清，加入1ml PBS重悬所有病毒沉淀，放置于4度冰箱备用；将收取的293T细胞用10ml PBS重悬，反复在液氮和37度水浴锅冻融4次，加入备用的上清病毒后，加入全能核酸酶(购自Millipore公司)在37度处理30分钟，2000rpm 4度离心30分钟去除细胞碎片，取上清；按下表配制不同浓度的碘克沙醇，分别为：60％、40％、25％、15％；取一个32ml PP超速离心管(购自Beckman公司)，逐层加入60％层5ml、40％层5ml、25％层5ml、15％层5ml，最后小心加入样品至加满管口；70000rpm超速离心3小时；离心结束毕后，使用注射器在40％和60％交界层吸取5ml，后加入PBS 18ml稀释并使用100KDa超滤管离心浓缩rAAV病毒，弃掉离心下来的液体，重新加入PBS进行超速离心，最后得到约1ml的病毒量；超滤换液后，使用0.22μm PVDF微滤器过滤。

(3)滴度测定：1μl病毒液检测(稀释20倍)，第一步先用DNA酶消化，体系如下：

成分	含量
		病毒液	1μl
去离子水	17μl
		10×DNase缓冲液	2μl
DNase I(购自NEB公司)	1μl

混匀后放置于37度水浴锅反应10分钟，再置于75度水浴锅10分钟终止反应。第二步用蛋白酶K(购自ThermoFisher公司)消化腺相关病毒外壳，配制反应体系如下(进一步稀释了5倍)：

成分	含量
		第一步反应	20μl
去离子水	79μl
		蛋白酶K(20mg/ml)	1μl

混匀后放置于55度水浴锅反应30分钟，再置于95度水浴锅10分钟终止反应。第三步，配制荧光定量PCR反应体系，如下：

其中引物序列分别是：

引物F(10μM)	GGAACCCCTAGTGATGGAGTT
		引物R(10μM)	CGGCCTCAGTGAGCGA

混用后放置在荧光定量PCR仪上(IT-TS)，进行如下反应：

反应结束后得到Ct值，如下：

样品名称	Ct值
		标准品10<sup>8</sup>	9.240
标准品10<sup>7</sup>	12.53
		标准品10<sup>6</sup>	18.1
标准品10<sup>5</sup>	23.29
		pAAV-0025	13.3

最后根据Ct值结果计算腺相关病毒滴度为：

pAAV-0025

1.04×10<sup>12</sup>

实施例4：sgRNA设计和合成

本发明所用到的sgRNA均由体外合成并且经过化学修饰，其中化学修饰的sgRNA在5′端和3′端各3个碱基进行3-硫代和2-O-甲基化修饰，修饰基团如图6所示，以使sgRNA更稳定而不容易在转导入细胞后被核酸酶迅速降解，化学合成相应sgRNA后均采用HLPC纯化，以下为本发明用到的各化学合成的sgRNA序列：

实施例5：定点敲入型靶向CD7和BCMA通用型CAR-T细胞制备

1)细胞制备

PBMC提取：招募健康志愿者，志愿者无感冒发烧症状，由专业医务人员在人肘正中静脉处取血100ml接至BD抗凝血管；采完血后，血液与等量的PBS缓冲液(含2％的胎牛血清)混合；取PBMC分离管Sepmate-50，小心加入15ml的Ficoll缓冲液，再加入血液PBS的混合液，每管小心加入30ml左右；1200g离心10分钟后迅速将上清倒入新50ml管中，后200g离心8分钟，弃上清，加入10ml PBS缓冲液重悬沉淀，再弃上清后加10ml PBS缓冲液重悬，离心弃上清后10ml PBS缓冲液重悬细胞沉淀；对重悬细胞计数，取10μl混悬液加入10μl 0.1％的台盼蓝混匀，上机计细胞数和存活率。

T细胞纯化：取少量得到的PBMC细胞，流式细胞仪计算CD3阳性T比例；根据实验需要与CD3阳性细胞比例，取出所需的PBMC细胞，需要细胞应为所取细胞的70％；用阳选缓冲液重悬总PBMC细胞，使总细胞浓度为3×10⁷/ml；每1×10⁸个细胞加入100μl CD3抗体(Release Human CD3 Positive Selection Cocktail)；室温孵育3分钟；用涡旋混合仪提前混匀磁珠(Releasable Rapid Sphenes)30秒，每1×10⁸细胞加入100μl磁珠，室温孵育3分钟；将细胞悬液转移至专用分选管内，并用阳选缓冲液定容至2.5ml，置于磁力架上室温孵育5分钟；小心抓紧磁力架，倾倒分选管，弃去未结合细胞悬液，用2.5ml阳选缓冲液重悬贴合的磁珠与细胞，再次置于磁力架上室温孵育3分钟，再次弃去未结合细胞悬液；从磁力架上取下分选管，往混悬液中加入“释放缓冲液(Release buffer)”，室温孵育3分钟；置于磁力架上室温孵育5分钟；小心抓紧磁力架，倾倒分选管，收集未结合细胞悬液于一干净无菌15ml离心管内，此细胞即为提取的T细胞。

T细胞激活：取上述纯化T细胞1×10⁷个，用抗-CD3/抗-CD28磁珠激活；取抗-CD3/抗-CD28磁珠(ThermoFisher)3×10⁷个，用PBS缓冲液(含2mM的EDTA和1％的胎牛血清)重悬，后加入磁极中静置2分钟后小心弃去上清；重复上述过程；取洗后磁珠，磁珠加入T细胞，混匀，放入37度培养两天；两天后取出磁珠，首先将T细胞用移液枪重悬多次，后将细胞悬液置于磁极中，静置两分钟后，弃去管壁上的磁珠；上机计细胞数和存活率。

电转：激活后，得1.2×10⁷个T细胞，取两个5×10⁶个细胞悬液置于两个离心管中进行离心，转速为200g，5分钟，离心后完全去除培养基待用；其中一管采用CRISPR-Cas9技术同时将基因组中的TCR (TRAC)和CD7基因敲除，该方法所制备的CAR-T细胞命名为T-KO；另一管将基因组中的TCR和CD7基因敲除之后再借助腺相关病毒载体将靶向CD7-BCMA双靶点CAR基因(SEQ ID NO：25)定点敲入T细胞TRAC基因组中，该方法所制备的CAR-T细胞分别命名为UCART-CD7-BCMA-25；配制Lonza电转缓冲液，后加入Cas9 mRNA 10μg和设计合成的sgRNA-0001及sgRNA-0002各1μg，室温混匀后与细胞沉淀混匀并加入电转杯中，E0-115程序电击，电击完成后立刻加入37度培养箱15分钟，后加入至5ml预热的细胞培养基中。

rAAV转染：电转完成后，隔4小时加入实施例3纯化的rAAV(pAAV-0025)，5ml细胞悬液加入0.5ml rAAV；24小时后，换新培养基，去除rAAV；使用添加了10ng/ml细胞因子白介素2的无血清T细胞扩增培养基对细胞进行扩增，同时扩增T细胞和敲除TCR和CD7基因的T细胞(T-KO)；进行双靶点通用CAR-T细胞的纯化收集以及质检。

2)流式检测

各取少量细胞，PBS洗一遍后，分别加入抗-小鼠Fab-FITC(用于检测靶向BCMACAR)，CD7-FITC(用于检测靶向CD7 CAR)，抗-TCR-PE和抗-CD7-APC抗体染色25分钟，PBS再洗一遍，最后用PBS重悬细胞，上流式细胞仪分析，结果如图7所示，从流式结果中可看出靶向CD7 CAR和靶向BCMA CAR表达相当且超过60％的阳性率(其中靶向BCMA CAR超过90％)(这相当于敲入效率)，相较于一般的慢病毒转染，效率更高；CD7阴性细胞比率接近100％(靶向CD7 CAR杀伤CD7阴性细胞的原因)，但意外的是，TCR敲除率也接近100％。

实施例6：双靶点CAR-T(UCART-CD7-BCMA-25)对靶细胞的杀伤检测

采用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测方法来进行细胞杀伤实验。在细胞培养至第10天后，分别吸取效应细胞和靶细胞的细胞悬液到1.5ml EP管中，其中靶细胞的构建是采用高速离心的方式将分别含有CD7或BCMA基因的慢病毒载体转导入原本不表达CD7和BCMA基因的K562细胞系中，再经过扩大培养构建而成的(细胞鉴定如图8a所示)；然后将以上细胞300g，5分钟离心，同时配置含有1％牛血清的1640培养基；离心结束后将细胞中的上清尽可能的多的弃掉，然后均用200μl配置好的培养基重悬细胞，充分混匀后进行细胞计数；根据计数的结果，分别按照效靶比为0.2:1、1:1和5:1配置体系；依次加入圆底96孔板中；添加结束后将细胞板放入离心机，100g，2分钟离心，离心结束后将细胞板置于培养箱中；第二天早上，仅向体积对照、K562-CD7和K562-BCMA最大释放的个孔中添加20μl裂解液，该裂解液来自于LDH细胞杀伤实验检测试剂盒(购自Promega公司)之后再将96孔板放入培养箱中孵育45分钟，同时将试剂盒中的底物放置到室温中溶解；孵育结束后每孔吸出50μl液体转移到96孔平底板中，后用排枪快速向每孔中加入50μl试剂盒中的底物，待检测液体和底物在室温反应大约30分钟后，即此时可明显看到最大释放的孔变色，再向每孔中快速加入50μl试剂盒中的终止反应液；然后等待约3分钟后，每孔的颜色稳定下来，用干净的针头将气泡扎破，之后利用酶标仪(Thermo Fisher Multiskan FC型)在490nm处检测每孔的值，最后按照试剂盒说明书的公式对原始数据进行处理；对照细胞以及CAR-T细胞分别对靶细胞K562-CD7/K562-BCMA的杀伤效果检测结果如图8b-8c所示，结果显示双靶点通用型CAR-T细胞都能有效杀伤CD7阳性或BCMA阳性靶细胞，且随效靶比增加而提高。

实施例7：双靶点通用CAR-T细胞(UCART-CD7-BCMA-25)对原代T和NK细胞的杀伤检测

在所采用的双靶方案中，靶向CD7 CAR可主动杀伤宿主病人T和NK细胞，以达到降低排异反应的目的。为验证该思路，在体外检测制备的双靶点CAR-T细胞对原代T和NK细胞对杀伤。

双靶点通用CAR-T细胞及其对照细胞同实施例5。

外周血原代T细胞的提取：在双靶点通用CAR-T细胞激活后10天，提取六个健康人外周血单个核细胞，并采用台盼蓝染色法检测细胞的数量和活率；提取外周血单个核细胞中的T细胞，使用T细胞磁珠阴选试剂盒(购自STEMCELL公司)对外周血单个核细胞中的T细胞进行纯化和收集；检测外周血T细胞的提取效果，取适量T细胞进行荧光抗体染色(CD7-APC)，采用流式细胞分析术进行分析，可以看出90％以上的T细胞表达CD7。

外周血原代NK细胞的提取：在双靶点通用CAR-T细胞激活后10天，提取两个健康人外周血单个核细胞，并采用台盼蓝染色法检测细胞的数量和活率；提取外周血单个核细胞中的NK细胞，使用自然杀伤细胞磁珠阴选试剂盒(来自Miltenyi公司)对外周血单个核细胞中的自然杀伤细胞进行纯化和收集；检测外周血自然杀伤细胞的提取效果，取适量NK细胞进行荧光抗体染色(CD7-APC，CD56-FITC)，采用流式细胞分析术进行分析，可以看出90％以上的NK细胞表达CD7。

双靶点通用CAR-T细胞(UCART-CD7-BCMA-25)在体外水平对原代T细胞杀伤效果的检测：效应细胞以及靶细胞的准备，在双靶点通用CAR-T细胞激活后10天，采用台盼蓝染色法检测以下细胞的数量和活率：TCR阴性纯化的T敲除细胞(T-KO)、TCR阴性纯化的UCART-CD7-BCMA-25细胞和外周血原代T细胞，其中纯化的T-KO和UCART-CD7-BCMA-25细胞为效应细胞，外周血原代T(取志愿者1)细胞为靶细胞；效应细胞与靶细胞的混合，按照以下方案进行细胞的混合孵育，孵育培养基为RPMI培养基1640+1％胎牛血清，孵育体积为每孔200ul，每孔中效应细胞活细胞数量为6×10⁴，每孔中靶细胞活细胞数量为4×10⁴，孵育在96孔圆底板中，铺板结束后将96孔板放入离心机，100g，2分钟离心，最后将细胞板放置在5％CO2、37℃细胞培养箱中；效应细胞对靶细胞杀伤效果的检测，孵育16小时后，使用乳酸脱氢酶法体外细胞毒性实验检测试剂盒(购自Promega公司)对杀伤效果进行检测，首先仅向原代T细胞最大释放的孔中添加20ul裂解液，添加结束后再把96孔板放入培养箱中孵育45分钟，同时将试剂盒中的底物放置到室温中溶解，孵育结束后将96孔板放入离心机，100g，2分钟离心，离心结束后每孔吸出50ul上清转移到96孔平底板中，然后用排枪快速向每孔中加入50ul底物，待室温避光反应大约30分钟后，即此时可明显看到最大释放的孔变色，再向每孔中快速加入50ul的终止反应液，避免产生气泡，待室温反应大约3分钟后，利用酶标仪在490nm处检测每个孔的吸光值，最后按照试剂盒说明书的公式对原始数据进行处理，计算出效应细胞对靶细胞的杀伤效率，计算结果如图9a所示，可以看出本方案制备的双靶点通用CAR-T细胞相比对照细胞可显著杀伤异体T细胞。

双靶点通用CAR-T细胞在体外水平对原代NK细胞杀伤效果的检测：效应细胞以及靶细胞的准备，在双靶点通用CAR-T细胞激活后10天，采用台盼蓝染色法检测以下细胞的数量和活率：TCR阴性纯化的T-KO细胞、TCR阴性纯化的UCART-CD7-BCMA-25细胞及外周血原代NK细胞，其中纯化的T-KO及UCART-CD7-BCMA-25细胞为效应细胞，外周血原代NK细胞为靶细胞(取志愿者7)；效应细胞与靶细胞的混合，按照下表进行细胞的混合孵育，孵育培养基为RPMI培养基1640+1％胎牛血清，孵育体积为每孔200ul，每孔中效应细胞活细胞数量为6×10⁴，每孔中靶细胞活细胞数量为4×10⁴，孵育在96孔圆底板中，铺板结束后将96孔板放入离心机，100g，2分钟离心，最后将细胞板放置在5％CO₂、37℃细胞培养箱中；效应细胞对靶细胞杀伤效果的检测同上。最终计算结果如图9b所示，可以看出本方案制备的双靶点通用CAR-T细胞相比对照细胞可显著杀伤异体NK细胞。

实施例8：双靶点通用CAR-T及对照细胞分别与异体PBMC细胞共孵育检测体外异体排异反应。

双靶点通用CAR-T及对照细胞的制备同实施例5，所使用血液来自HLA-A2阴性健康志愿者。

提取基因型为HLA-A2阳性的健康人外周血单个核细胞(PBMC)，具体步骤同实施例7。

异体细胞孵育实验：采用台盼蓝染色法检测以下细胞的数量和活率：TCR阴性的T-KO细胞、TCR阴性的UCART-CD7-BCMA-25细胞以及外周血单个核细胞(PBMC)；细胞的混合孵育：按照下表进行细胞的混合孵育，孵育培养基为RPMI培养基1640+10％胎牛血清+细胞因子白介2(10ng/ml)，孵育体积为200ul，孵育在96孔平底板中，铺板结束后将96孔板放置在5％CO2、37℃细胞培养箱中；在孵育第4天时将剩余所有孔的孵育培养基更换成RPMI培养基1640+10％胎牛血清，孵育体积为200ul，之后每隔2-3天按同样的操作进行换液，直至孵育到第12天；孵育效果的检测，在相应的天数，将每组混合实验细胞混匀后取100ul体积转移至1.5ml离心管中进行荧光抗体染色(抗体：HLA-A2-PE、CD7-APC)，采用流式细胞分析术进行分析并对HLA-A2阴性细胞占比进行统计，结果如图10所示，可以看出UCART-CD7-BCMA-25细胞占比随孵育时间不断增加，而T-KO细胞占比则先增加后减少，且UCART-CD7-BCMA-25和PBMC混合细胞均为CD7阴性，说明UCART-CD7-BCMA-25细胞在体外不仅能对抗排异反应，而且可以排异细胞为靶点进行细胞扩增。

实施例9：双靶点通用CAR-T细胞在异体人源化且带BCMA阳性荷瘤小鼠模型中的存留和疗效检测。

通用型双靶点CAR-T及其它对照细胞制备同实施例5，所使用血液来自HLA-A2阴性健康志愿者。

小鼠模型建立：共四组实验，每组3只NOG小鼠，每组实验设计如下表，每只NOG小鼠于第一天接受1.2Gy辐照；第二天：每只小鼠尾静脉回输1×10⁷个原代T细胞(经过8天的培养)，该细胞基因型为HLA-A2阳性；第三天：每只小鼠皮下注射1×10⁶个RPMI8226细胞；第十天：每只小鼠通过尾静脉回输2×10⁶个通用型双靶点CAR-T及其对照细胞；第十一至五十二天：监测小鼠荷瘤及体重变化。整个实验过程如图11a所示。

小鼠荷瘤变化如图11b所示，同注射异体T细胞的三组中，对照组回输T-KO细胞小鼠荷瘤最大，单靶点BCMA CAR-T细胞相对抑制了荷瘤形成，而双靶点CD7-BCMA CAR-T则显著抑制了成瘤，甚至瘤体完全消失。对比同注射异体T细胞的单靶点BCMA CAR-T细胞组，只注射单靶点BCMA CAR-T细胞组小鼠荷瘤也能完全抑制荷瘤，说明在排异反应存在下单靶点BCMA CAR-T疗效受到显著抑制，而双靶点CD7-BCMA CAR-T细胞则能对抗排异反应并完全抑制小鼠荷瘤。

实施例10：双靶点通用CAR-T细胞对比其他研究方法制备的靶向BCMA通用型CAR-T的抗排异反应检测

分别比较本发明制备的双靶点通用CAR-T细胞、TCR单基因敲除的靶向BCMA CAR-T细胞、TCR/HLA双基因敲除的靶向BCMA CAR-T细胞、TCR/HLA双基因敲除且表达HLA-E的靶向BCMA CAR-T细胞的异体抗排异反应。

靶细胞制备：a.本发明制备的双靶点通用CAR-T细胞：第一天：激活T细胞，使用CD3/CD28磁珠激活基因型为HLA-A2阴性的健康人T细胞；第三天：CAR基因的转导，T细胞激活48小时后，采用CRISPR-Cas9技术同时将T细胞基因组中的TCR及CD7基因敲除，之后再借助腺相关病毒载体将靶向CD7-BCMA双靶点CAR基因定点敲入T细胞TRAC基因组中，该方法所制备的CAR-T细胞命名为UCART-CD7-BCMA-25。b.TCR单基因敲除的靶向BCMA CAR-T细胞：激活T细胞，使用CD3/CD28磁珠激活基因型为HLA-A2阴性的健康人T细胞；第二天：转染靶向BCMA CAR慢病毒载体，MOI为5；第四天：CRISPR-Cas9技术敲除TCR基因，所用到的方法为Cas9 mRNA与化学修饰合成的sgRNA共同电转T细胞，所采用的试剂量及电转设备与前述实施例一致，该方法所制备的CAR-T细胞命名为UCART-BCMA-TCR-。c.TCR/B2M双基因敲除的靶向BCMA CAR-T细胞：激活T细胞，使用CD3/CD28磁珠激活基因型为HLA-A2阴性的健康人T细胞；第二天：转染靶向BCMA CAR慢病毒载体，MOI为5；第四天：CRISPR-Cas9技术敲除TCR和B2M基因，所用到的方法为Cas9 mRNA与化学修饰合成的sgRNA共同电转T细胞，所采用的试剂量及电转设备与前述实施例一致，该方法所制备的CAR-T细胞命名为UCART-BCMA-TCR-/B2M-。d.TCR/HLA双基因敲除且表达HLA-E的靶向BCMA CAR-T细胞，第一天：激活T细胞，使用CD3/CD28磁珠激活基因型为HLA-A2阴性的健康人T细胞；第三天：T细胞激活48小时后，采用CRISPR-Cas9技术同时将T细胞基因组中的TCR及B2M基因敲除，之后再借助腺相关病毒载体将靶向BCMA CAR基因和B2M-HLA-E融合基因定点整合入T细胞B2M基因组中，该方法所制备的CAR-T细胞命名为UCART-BCMA-E-TCR-/B2M-。四组细胞均用CD3抗体磁柱进行TCR阴性细胞分选。

效应细胞制备(获取外周血单个核细胞PBMC)：上述靶细胞激活后10天，提取基因型为HLA-A2阳性的健康人外周血单个核细胞，并采用台盼蓝染色法检测细胞的数量和活率；检测外周血单个核细胞中T细胞以及自然杀伤细胞所占比例情况，取适量外周血单个核细胞进行荧光抗体染色(CD3-PC5.5，CD56-FITC)，采用流式细胞分析术进行分析。

细胞孵育：按照下表进行细胞的混合孵育，孵育培养基为RPMI培养基1640+10％胎牛血清+细胞因子白介2(10ng/ml)，孵育体积为200ul，孵育在96孔平底板中，铺板结束后将96孔板放置在5％CO2、37℃细胞培养箱中；在孵育第4天时将剩余所有孔的孵育培养基更换成RPMI培养基1640+10％胎牛血清，孵育体积为200ul，之后每隔2-3天按同样的操作进行换液，直至孵育到第12天。

孵育效果的检测：分别在3、6、9、12天将将每组实验细胞混匀后取100ul体积转移至1.5ml离心管中进行后续荧光抗体染色，分别染色抗体HLA-A2-PE和CD7-APC，后采用流式细胞分析术检测结果，总结结果如图12所示。

图12显示本发明采用方案制备的通用CAR-T细胞在和异体PBMC细胞共孵育后，不仅未被排异，反而随着孵育时间不断增加细胞比例，而其他三组通用CAR-T细胞随着孵育时间均出现细胞比例下滑或未明显改变的情况，其中，UCART-BCMA-TCR-细胞因受T细胞排异，细胞比例至12天后逐渐减少，UCART-BCMA-TCR-/B2M-细胞和UCART-BCMA-E-TCR-/B2M-细胞由于受NK杀伤在孵育至第3天时细胞比例显著下降，UCART-BCMA-E-TCR-/B2M-组细胞由于HLA-E保护，细胞比例要高于UCART-BCMA-TCR-/B2M-组。

本实施例说明本发明采用方案制备的通用CAR-T细胞相比其他通用CAR-T细胞制备方案有更好的抗排异反应，提示在成药后具有更好的体内存留时间和药效。

实施例11：定点敲入对比慢病毒转导方法制备靶向CD7-BCMA双靶点CAR-T的得率。

本发明采用的细胞制备方法为定点敲入方式制备靶向CD7-BCMA双靶点CAR-T细胞，简要概述为：第一天：激活5×10⁶个原代T细胞；第三天：CRISPR-Cas9敲除TCR和CD7基因，所用到的方法为Cas9 mRNA与化学修饰合成的两个sgRNA(sgRNA-0001和sgRNA-0002)共同电转T细胞，所采用的试剂量及电转设备与前述实施例一致。电转后两小时转染含靶向CD7-BCMA双靶点CAR的腺相关病毒载体(pAAV-0025)，MOI为5×10⁴；分别于第6、8、10、12、14天进行细胞计数同时流式检测CAR基因表达及TCR和CD7基因敲除效率。

采用慢病毒方式制备靶向CD7-BCMA双靶点CAR-T细胞，简要概述为：第一天：激活5×10⁶个原代T细胞；第三天：CRISPR-Cas9敲除TCR及CD7基因，所用到的方法为Cas9 mRNA与化学修饰合成的两个sgRNA(sgRNA-0001和sgRNA-0002)共同电转T细胞，所采用的试剂量及电转设备与前述实施例一致；第四天：转染靶向CD7-BCMA双靶点CAR慢病毒载体，MOI为5；分别于分别于第6、8、10、12、14天进行细胞计数同时流式检测CAR基因表达及TCR和CD7基因敲除效率。

结果：两种方式制备的双靶点CAR-T总细胞计数结果如图13a所示，靶向BCMA CAR基因表达比例/TCR基因敲除率/CD7基因敲除率分别如图13b-d所示，两种方式制备的有效双靶点通用CAR-T细胞(TCR-/CD7-/靶向CD7-BCMA CAR+)数如图13e所示。可以看出定点敲入方式制备的通用CAR-T细胞在总数和有效细胞数量上都超过了慢病毒方式制备的通用CAR-T细胞，特别是有效细胞数是慢病毒方式制备的10倍以上。

制备靶向CD7-BCMA双靶点CAR-T细胞难点是靶向CD7 CAR基因对T细胞的“自杀效应”(表达CD7蛋白)，因此需要对CD7基因进行敲除，但CD7蛋白在CRISRP-Cas9敲除CD7基因后有个缓慢降解的过程，因此CAR基因的表达需要在CRISPR-Cas9电转后至少两天时间，才能一定程度避免“自杀效应”，因此慢病毒制备方式必须在CRISPR-Cas9电转后至少一天再转染慢病毒才能最大程度避免“自杀效应”但电转后再转染慢病毒效率会极大降低，同时影响细胞状态。而本发明采用的定点整合方式是CRISPR-Cas9敲除CD7基因的同时敲入双靶点CAR基因，敲入的CAR基因表达的时间至少3天，可很好避开“自杀效应”同时不影响敲入效率，因此得率更高，另外，本实施例结果意外发现定点敲入的CAR基因表达可随着时间推移进一步提高。

实施例12：双靶点通用CAR-T细胞对比其他研究方法制备的靶向BCMA通用型CAR-T的TCR基因敲除效率检测。

提取1×10⁷个T细胞，分成两组，一组采用的细胞制备方法如前述实施例，简要概述为：第一天：激活5×10⁶个原代T细胞；第三天：CRISPR-Cas9敲除TCR和CD7基因，所用到的方法为Cas9 mRNA与化学修饰合成的两个sgRNA(sgRNA-0001和sgRNA-0002)共同电转T细胞，所采用的试剂量及电转设备与前述实施例一致。电转后两小时转染含靶向CD7-BCMA双靶点CAR的腺相关病毒载体(pAAV-0025)，MOI为10⁵；分别于电转后第2、4、6、8天通过流式细胞仪检测TCR阴性细胞比例。

另一组采用其他研究(如Cellecits公司)的制备方法，简要概述为：第一天：激活5×10⁶个原代T细胞；第二天：转染靶向BCMA CAR慢病毒载体，MOI为5；第四天：CRISPR-Cas9敲除TCR及CD52基因，所用到的方法为Cas9 mRNA与化学修饰合成的两个sgRNA共同电转T细胞，用到的针对TRAC基因的sgRNA为sgRNA-0001，用到的针对CD52基因的sgRNA序列为sgRNA-0004(序列如下表)，所采用的试剂量及电转设备与前述本发明方案一致；分别于电转后第2、4、6、8天通过流式细胞仪检测TCR阴性细胞比例。

检测结果：对比本发明与Cellectis方案的TCR敲除效率动态(如图14所示)，本发明的TCR阴性细胞比例随着时间推移，逐渐趋近于100％，而Cellectis方案则基本维持不变。

本发明采用的定点整合双靶点CAR-T制备过程中TCR阴性细胞比例可逐渐趋近于100％，而Cellectis研究的通用CAR-T细胞方案中敲除TCR基因后，TCR阴性细胞基本维持不变(通常不超过90％)，推测可能的原因是本发明方案中TCR阳性细胞同时也是CD7阳性细胞，可被双靶点CAR-T细胞清除。由于TCR阳性细胞回输异体后可能导致致命的GvHD效应，故通常在通用型CAR-T细胞制备完成前需要一步TCR阴性细胞的纯化，对于大量的TCR阴性细胞分选是复杂且昂贵的，而且可能导致细胞污染，本发明采用的制备方案可将TCR阴性细胞比例趋近于100％，无需分选，使得通用CAR-T细胞制备更加简单，成本进一步降低。

实施例13：对比双靶点CAR基因分别敲入TRAC、CD7或B2M基因，及其得率分析。

为一步法获得双靶点CAR-T细胞，双靶点CAR基因除敲入TRAC基因外，还可以敲入CD7、B2M、PD-1、CD3z、CD3e等通用型CAR-T常编辑基因。本实施例中将双靶点CAR基因分别敲入TRAC、CD7和B2M基因。

敲入B2M和CD7基因组的模版DNA设计如图15a和15b所示；其中敲入CD7基因组的模版DNA包含左同源臂、EF1外源启动子、双靶点CAR基因、PolyA和右同源臂(依赖外源启动子转录)，或包含左同源臂、剪切肽P2A基因、双靶点CAR基因、PolyA和右同源臂(依赖CD7基因启动子转录)；敲入B2M基因组的模版DNA包含左同源臂、EF1外源启动子、双靶点CAR基因、PolyA和右同源臂(依赖外源启动子转录)，或包含左同源臂、双靶点CAR基因、PolyA和右同源臂(依赖B2M基因启动子转录)。双靶点CAR基因包含通过剪切肽P2A偶联的靶向CD7 CAR基因和靶向BCMA CAR基因，其中靶向CD7 CAR基因包含CD8信号肽、靶向CD7抗体单链scFv、CD8铰链区、CD8跨膜区和CD3ζ激活区，并且靶向BCMA CAR基因包含CD8信号肽、靶向BCMA抗体单链scFv、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB共刺激区和CD3ζ激活区。PolyA采用bGHpA polyA。

各基因序列如下表：

模版DNA设计完成后，进行基因合成；将合成基因SEQ ID NO：26-29分别克隆至腺相关病毒载体pAAV-MCS，具体步骤同实施例2；包装相关腺相关病毒载体，具体步骤同实施例3；敲入B2M或CD7的双靶点CAR-T细胞制备：本制备方法如前述实施例，简要概述为：第一天：激活5×10⁶个原代T细胞；第三天：CRISPR-Cas9敲除TCR、B2M和CD7基因，所用到的方法为Cas9 mRNA与化学修饰合成的三个sgRNA(sgRNA-0001，sgRNA-0002和sgRNA-0003，其中sgRNA-0003序列如下)共同电转T细胞，所采用的试剂量及电转设备与前述实施例一致。电转后两小时分别转染腺相关病毒载体pAAV-25/26/27/28/29，MOI为5×10⁴；分别于电转后第6天进行流式检测双靶点CAR基因表达及TCR，HLA-ABC和CD7基因敲除效率。

结果如图15c所示，可以看出当双靶点CAR基因敲入TRAC位点且依赖EF1启动子时，CAR阳性比例最高；但敲入CD7或B2M基因组位点制备的阳性双靶点CAR细胞比例仍远高于慢病毒方法制备(无论依赖外源还是内源基因启动子)；TCR、HLA-ABC和CD7基因的敲除率在三组细胞中相当，都超过80％。

该结果证明靶向CD7-BCMA双靶点CAR-T细胞采用定点整合方式(敲入TRAC、CD7或B2M基因组)制备得率相对慢病毒方法更高，且可以敲入/敲除反应一步完成，其中，敲入TRAC基因组位点得率最高。

Claims

1.一种制备靶向CD7和BCMA的双靶点通用型CAR-T细胞的方法，所述方法包括：将基因编辑物质递送至T细胞以剪切TRAC和CD7基因组DNA或剪切TRAC、CD7和B2M基因组DNA，以及使用重组腺相关病毒递送模版DNA以将靶向CD7-BCMA双靶点CAR基因定点整合入TRAC、CD7或B2M基因组位点。

2.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括：

递送所述基因编辑物质之前的T细胞激活，

CAR-T细胞扩增，和/或

细胞冻存。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中使用选自CRISPR-Cas9、ZFN、ARCRS、TALEN和megaTAL的基因编辑方法递送所述基因编辑物质，优选CRISPR-Cas9；

所述基因编辑物质是质粒、mRNA、蛋白质、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒，优选mRNA；并且

递送所述基因编辑物质的方式包括使用脂质体、磷酸钙、DEAE-葡聚糖、电穿孔、显微注射或基因枪的转染方法，优选电穿孔转染。

4.根据权利要求3所述的方法，其中CRISPR-Cas9基因编辑物质包括Cas9 mRNA或Cas9蛋白和sgRNA，

优选地，sgRNA是化学修饰的，其中化学修饰包括2-O-甲基化、3-硫代以及2-O-甲基化结合3-硫代，

优选地，化学修饰发生在sgRNA的5’和3’端的1至10个碱基，

优选地，sgRNA的5’和3’端3个碱基同时进行2-O-甲基化和3-硫代修饰，

优选地，针对TRAC基因的sgRNA序列如SEQ ID NO:1所示，针对CD7基因的sgRNA序列如SEQ ID NO:2所示，针对B2M基因的sgRNA序列如SEQ ID NO:3所示。

5.根据权利要求3所述的方法，其中Cas9包括SpCas9、SaCas9、SpCas9-HF、eSpCas9、xCas9和cpf1，优选SpCas9，更优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示，

优选地，Cas9蛋白的N端或C端偶联有一个或多个NLS入核信号肽，更优选地NLS入核信号肽序列如SEQ ID NO:5所示。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述模版DNA包括左同源臂DNA、敲入的外源DNA、右同源臂DNA。

7.根据权利要求6所述的方法，其中左同源臂DNA和右同源臂DNA分别具有10至2000bp的片段长度，优选地300bp、600bp或1000bp的片段长度，

优选地，当双靶点CAR基因敲入TRAC基因组位点时，同源臂序列分别如SEQ ID NO:6-7所示；当双靶点CAR基因敲入CD7基因组位点时，同源臂序列分别如SEQ ID NO:8-9所示；当双靶点CAR基因敲入B2M基因组位点时，同源臂序列分别如SEQ ID NO:10-11所示。

8.根据权利要求6所述的方法，其中当双靶点CAR基因敲入TRAC或CD7基因组位点时，所述敲入的外源DNA包含剪切肽或内部核糖体进入位点基因、双靶点CAR基因和polyA，其中所述剪切肽或内部核糖体进入位点基因选自P2A、T2A和IRES，优选P2A或T2A，更优选P2A和T2A的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:12-13所示；或者所述敲入的外源DNA包含外源启动子基因、双靶点CAR基因和polyA；

当双靶点CAR基因敲入B2M基因组位点时，所述敲入的外源DNA包含双靶点CAR基因和polyA，或者所述敲入的外源DNA包含外源启动子基因、双靶点CAR基因和polyA；

优选地，所述外源启动子选自EF1、CMV、PGK、MSCV和SFFV，优选EF1，更优选地EF1的DNA序列如SEQ ID NO:14所示；

优选地，所述polyA是miniPolyA或bGHpA polyA，优选地miniPolyA和bGHpA polyA的DNA序列分别如SEQ ID NO:15-16所示。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述双靶点CAR基因包含通过剪切肽偶联的靶向CD7 CAR基因和靶向BCMA CAR基因，

优选地，所述靶向CD7 CAR基因包含信号肽、靶向CD7抗体单链scFv、铰链区、跨膜区和激活区，

优选地，所述靶向BCMA CAR基因包含信号肽、靶向BCMA抗体单链scFv、铰链区、跨膜区、共刺激区和激活区，

优选地，所述剪切肽是P2A或T2A，更优选地P2A的氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示。

10.根据权利要求9所述方法，其中所述靶向CD7抗体单链scFv和所述靶向BCMA抗体单链scFv的DNA序列分别如SEQ ID NO:17-18所示。

11.根据权利要求9所述方法，其中所述信号肽选自CD8、IL-2和GM-CSF信号肽结构域，优选CD8信号肽，更优选CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示；

所述铰链区选自IgG1、IgG4、IgD和CD8铰链结构域，优选CD8铰链结构，更优选CD8铰链结构的氨基酸序列如SEQ ID NO:20所示；

所述跨膜区选自CD3、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154或PD1跨膜结构域，优选CD8跨膜结构，更优选CD8跨膜结构的氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示；

所述共刺激区选自CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54、CD83、CD134、CD137、CD150、CD152、CD223、CD270、CD273、CD274、CD278、CARD11、NKD2C、DAP10、LAT、SLP76、ZAP70或4-1BB共刺激结构域，优选4-1BB共刺激结构，更优选4-1BB共刺激结构的氨基酸序列如SEQ IDNO:22所示；

所述激活区为CD3ζ激活结构域，优选地CD3ζ激活结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:23所示。

12.根据权利要求9所述的方法，其中当双靶点CAR基因敲入TRAC基因组位点时，所述模版DNA序列如SEQ ID NO:24-25所示；

当双靶点CAR基因敲入CD7基因组位点时，所述模版DNA序列如SEQ ID NO:26-27所示；

当双靶点CAR基因敲入B2M基因组位点时，所述模版DNA序列如SEQ ID NO:28-29所示。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法制备的靶向CD7-BCMA的双靶点通用型CAR-T细胞。

14.根据权利要求13所述的靶向CD7-BCMA的双靶点通用型CAR-T细胞用于制备药物的用途，所述药物用于治疗疾病。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述疾病包括白血病、实体肿瘤和自身免疫疾病，

优选地所述白血病选自急性B淋巴细胞白血病、急性T淋巴细胞白血病、NK/T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病和多发性骨髓瘤，特别是多发性骨髓瘤；

优选地所述实体肿瘤选自肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、脑胶质瘤、食管癌、胆管癌、子宫内膜癌、卵巢癌、间皮瘤和胸腺癌，

优选地所述自身免疫疾病为艾滋病。