CN114369622A - 同时靶向cd7和cd19的双特异通用型car-t细胞及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及同时靶向CD7和CD19的双特异通用型CAR‑T细胞及其制备方法。所述方法包括:将基因编辑物质递送至T细胞以剪切TRAC和CD7基因组DNA或剪切TRAC、CD7和B2M基因组DNA,以及使用重组腺相关病毒递送模版DNA以将靶向CD7‑CD19双靶点CAR基因定点整合入TRAC、CD7或B2M基因组位点。本发明的方法具有高细胞得率、简易的工艺步骤和安全的基因编辑方式,并且所得的双特异通用型CAR‑T细胞具有更好的疗效。
Description
技术领域
本发明涉及细胞治疗领域,特别是涉及同时靶向CD7和CD19的双特异通用型CAR-T细胞制备方法。
背景技术
CAR-T治疗
传统肿瘤治疗药物包括化疗药、靶向药等,它们虽然在一定程度上提高了癌症患者的生存期,但是同时也带来了严重的副作用,极大地降低了病人的生存质量。更不幸的是,大部分患者在接受这些传统治疗后仍旧会复发,而一旦复发,无药可救是大概率事件。近年来,随着免疫治疗的发展,免疫检验点抑制剂药物(如CTLA-4、PD-1/PD-L1抗体)的出现彻底改变了肿瘤治疗的方式,但是这类药物在不同癌症病人中的有效率只有20%-40%,仍然有大部分的癌症患者等待新的有效治疗方式的出现。CAR-T细胞治疗技术(即嵌合抗原受体T细胞治疗技术)通过体外转导一个识别癌细胞表面抗原的人工基因于人T细胞上,使人T细胞具有特异杀伤肿瘤细胞的能力。CAR-T细胞治疗属于过继性免疫疗法(adoptive celltransfer,ACT),它利用人体免疫细胞来对抗肿瘤,被称为“活体药物”。这种ACT疗法在近年已应用于临床实验当中,特别是在各种白血病的有效探索中,为研究者和医生开辟了一条治疗肿瘤的新路径。2017年末,两款CAR-T药物获得美国FDA的许可上市。然而,这种ACT疗法仍旧处于早期阶段,它与传统药物相比具有如下创新点:首先,精确靶向肿瘤,并且副作用可逆,CAR-T细胞治疗相比化疗药、靶向药具有更特异的肿瘤细胞杀伤能力,在输入病人体内后,虽然短时间内会产生细胞因子效应,但是该副反应可控,病人在获得完全缓解的情况下基本上能和健康人一样生活;其次,持续缓解时间长,CAR-T细胞部分属于记忆T细胞,在输入病人体内后能长期存在于病人身体中,时刻监视身体中是否出现肿瘤细胞,一旦有新的肿瘤细胞出现就会立刻将其杀灭。CAR-T细胞的制备可以分为以下几个步骤:T细胞分离、T细胞激活、CAR基因转导、CAR-T细胞扩增、CAR-T细胞收获。其中CAR基因转导是整个制备过程的核心,近年来,已发展出多个CAR转导方式。
通用型CAR-T治疗
通用型CAR-T(Universal CAR-T,UCAR-T)取自健康人血液,提取T细胞,经过工程改造,回输给不同患者。通用型CAR-T是基于基因编辑、病毒转染技术与电转技术改造人体免疫T细胞而来的。它在已有T细胞上敲除某些基因,使得外来的健康人T细胞不会攻击患者体内细胞引起抗宿主排异反应(GvHD效应),以及不会被患者免疫系统清除,从而存活在患者体内发挥肿瘤杀伤的作用。通用型CAR-T是摆放在货架的药物,因为它取自已有健康人T细胞,可按照生产药物的严格标准大规模量产。并且,每个不同CAR的靶点可针对不同癌症适应症,也可做到用不同UCAR-T治疗具有不同“分子标记”的肿瘤,极具多样性。通用型CAR-T相比较自体CAR-T,有如下特点:
首先,随时可用,因无需使用患者T细胞,可提前制备,因此是一种“摆在货架上的药品”,可随时取用,病人无需等待。
其次,可规模化量产,成本大幅降低。其不是“私人订制”,可大规模批量生产。一个健康人采血400ml,即可制备满足上百位患者的UCAR-T细胞制品。初步预测对于单剂量的UCAR-T,其成本将是自体CAR-T成本的1/10左右。
第三,无使用限制。因采用健康人血液提取T细胞制备,无需患者自身提供,因此不受患者身体状况(T细胞状态)左右,没有使用限制。
然而,通用型CAR-T治疗仍需克服以下问题:
1)同种异体T细胞移植相容问题
虽然通用型CAR-T治疗有诸多的优势,但是其生产制作和研发难度要大大高于自体CAR-T治疗。其中最影响其疗效的是同种异体排异问题:不同的个体,其组织相容性抗原存在差异,从而导致了受体T细胞对移植物的攻击和排异。为解决这个问题,通常利用基因编辑的方法(如ZFN、TALEN或CRISPR-Cas9)将CAR-T细胞中的B2M基因敲除,从而使HLA-ABC蛋白无法在细胞表面展示,进而可以避免被受体T细胞攻击。也有一些研究者将CIITA基因一并敲除,来降低二类组织相容性抗原的表达。
2)移植物抗宿主反应(GvHD)
移植物抗宿主反应(graft versus host disease,GVHD)是由移植物中的特异性淋巴细胞识别宿主抗原而发生的一种反应。其产生的条件是移植物中包含的T淋巴细胞和移植物与宿主的主要组织相容性抗原不一致。在骨髓移植中,GvHD是主要的障碍,其会杀伤宿主体内的细胞而导致多器官功能衰竭,进而引起其他并发症。在通用型CAR-T细胞治疗中,GvHD是最需要避免的一个问题,否则宿主有严重的副作用。TCR是T淋巴细胞识别靶细胞的主要基因,敲除TCR基因可以避免异体T细胞对宿主细胞的攻击,所以异体移植的通用型CAR-T细胞通常将TCR基因敲除才能避免GvHD。
CRISPR-Cas9技术
CRISPR(Clusters of Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)技术于2012年由麻省理工学院和加州大学伯克利分校的科学家共同发现,它是一种由RNA序列介导的双链DNA内切酶工具。其由两个部分构成,其中之一是100个碱基左右的sgRNA,用于靶向识别目的双链DNA,另一部分是1369个氨基酸的Cas9蛋白,其可结合sgRNA,并且具有DNA酶活性。人为设计的sgRNA和Cas9蛋白形成复合体后可对目的DNA进行特异性切割,当切割造成错配修复,则导致基因移码而起到敲除目的,当添加一段修复DNA序列,则会进行有目的的编辑。自CRISPR-Cas9技术问世至今,已经在很多个领域得到应用。
B2M基因
人B2M基因位于第15号染色体上,编码的β-2微球蛋白为MHC I类抗原的轻链,由119个氨基酸组成。β-2微球蛋白是MHC I类抗原展示细胞表面所必需的组分。研究显示,敲除B2M基因的小鼠细胞表面检测不到MHC I类抗原的表达,并且会受到NK细胞的攻击。另外,B2M基因敲除的小鼠并不影响其正常的存活。
CD7基因
CD7属于免疫球蛋白超家族成员,是一种40KD的I型跨膜糖蛋白。在1991年,研究者们首次鉴定出了人类CD7基因的结构。CD7基因位于人类第17号染色体上,由4个外显子组成,DNA全长为3.0kb。CD7的前体分子由240个氨基酸组成,其中N端的25个氨基酸为信号肽;CD7的成熟分子由215个氨基酸组成,其中胞内区包含39个氨基酸、跨膜区包含21个氨基酸、胞外区包含155个氨基酸,并且胞外区具有两个糖基化位点。报道指出CD7分子的抗原表位位于1号-38号氨基酸、48号-74号氨基酸和129号-146号氨基酸这三个区域。
作为T细胞以及自然杀伤细胞谱系的一种早期表面抗原,人类的CD7分子主要表达在胸腺细胞、绝大多数T细胞、自然杀伤细胞以及其前体细胞表面,但是依然有少部分外周血T细胞以及自然杀伤细胞不表达CD7。另外,CD7也表达于B细胞和髓样细胞发育的早期。在人体的免疫过程中,CD7分子可通过激活PI(3)k和PI(4)k信号通路结合其配体K12/SECTM1从而在T细胞活化期间起到协同刺激的作用,K12/SECTM1由髓样细胞、胸腺上皮细胞和基质细胞表达。与此相反,当CD7分子与半乳糖凝集素-1结合时则会诱导T细胞的凋亡。尽管如此,CD7分子在T细胞发育和T细胞发挥免疫功能方面似乎并没有起到关键性的作用。报道称将小鼠T祖细胞中的CD7基因敲除后并不影响小鼠T细胞的正常发育进程,并且小鼠机体内环境依然保持稳定,仅仅是小鼠T细胞效应器功能的发挥受到了轻微的影响。对于自然杀伤细胞,CD7分子能够介导自然杀伤细胞的钙离子跨膜流动,报道称采用CD7单克隆抗体处理自然杀伤细胞能够加强其表面抗原的表达,刺激细胞分泌γ干扰素,增强自然杀伤细胞的毒性以及其与纤维连接分子的黏附作用等。另外,CD7分子在单克隆抗体交联反应中具有信号转导以及相关的生物学功能。
目前大量的研究发现CD7与血液系统肿瘤的发生发展密切相关。在多数人急性T淋巴细胞白血病,T细胞淋巴瘤和部分亚型的急性髓细胞白血病肿瘤细胞上均有CD7抗原异常高表达现象的存在,CD7分子的表达与疾病侵袭性、耐药性和不良预后有着密切的关系。另外Fallah Azad等研究结果发现,1例被诊断为急性前B淋巴细胞白血病患儿的癌细胞中存在CD7分子异常表达,并且具有从急性前B淋巴细胞白血病转型为急性T淋巴细胞白血病的复发病史。该报道提示,如果B细胞系肿瘤中出现CD7分子异常表达的情况,则可能预示之后病情复发时疾病谱系的转换。
现阶段血液肿瘤领域的治疗手段主要包括强效化疗、造血干细胞移植和免疫治疗等。虽然也取到了显著的临床疗效,但是治疗耐受、配型困难、复发率高、副作用强等依然是亟待解决的问题。CD7分子作为T细胞系血液肿瘤特异且敏感的抗原指标之一,普遍认为是治疗CD7阳性血液肿瘤的潜在理想靶点。除此之外,CD7分子还与HIV感染、类风湿关节炎的发生有密切关系,应用前景广阔。
CD19基因
CD19分子属于免疫球蛋白超家族成员,是一种95kD的I型跨膜糖蛋白,又名B4或Leu-12,于1983年首次被Naderl等发现。人类CD19基因位于16号染色体短臂上(16p11.2),该基因含有15个外显子,编码556个氨基酸。CD19分子具有单个跨膜结构域、胞内C末端和胞外N末端。其胞外段含有两个C2型Ig样结构域;胞内结构域高度保守,由242个氨基酸组成,在C末端附近有9个酪氨酸残基。多项研究表明,CD19的生物学功能依赖于三个细胞质酪氨酸残基:Y391、Y482和Y513。
CD19分子作为学术界最早发现的B淋巴细胞表面标记之一,从骨髓B祖细胞即开始被表达,并且B细胞在整个成熟过程中都持续表达CD19分子,直至B细胞分化为浆细胞时消失。另外,CD19分子还表达于生发中心的滤泡树突状细胞,并且在T细胞、单核细胞、粒细胞和其他组织中不表达。通常认为,CD19分子的表达仅限于B细胞系,其在B细胞的活化、信号转导和生长调节等方面都发挥着重要的作用。报道指出,CD19分子可以与CD21分子和CD81分子在B细胞表面形成复合物,即多分子活化共受体,其中CD19分子可以在胞质区传递活化信号;CD21分子可以结合人补体片段3d;CD81可以稳定该复合物的结构。当B细胞识别受体识别抗原时,该多分子活化受体可以通过与B细胞识别受体形成B细胞的双重抗原结合模型来参与B细胞的信号转导,增强B细胞对抗原刺激的敏感性。例如CD19分子可以通过参与B细胞内Ca2+的转运过程来调节B细胞的活化与增殖;或者通过膜结合型免疫球蛋白的信号放大参与B淋巴细胞的发育和再生。有研究表明在CD19缺陷的小鼠模型中,外周淋巴组织中B细胞的数量会明显减少,小鼠对疫苗和丝裂原的应答效率也会下降同时伴有血清Ig水平的减低。
B细胞恶性肿瘤是血液系统中一组恶性异质性疾病,包括多种类型的白血病和淋巴瘤。临床上将CD19分子用于B淋巴细胞白血病和淋巴瘤的免疫分型,以提供诊断依据。绝大多数的B细胞恶性肿瘤都异常高表达CD19分子,代表性疾病如急性B淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、弥漫性大B细胞淋巴瘤和套细胞淋巴瘤等。但是,同样是B细胞恶性肿瘤,从多发性骨髓瘤患者中获取的恶性浆细胞上则缺乏CD19分子的表达,而获取的骨髓瘤前期患者的浆细胞却表现为CD19-以及CD19+的混合表型。另外有报道指出CD19分子也在一部分急性髓系白血病中异常表达。
B细胞恶性肿瘤因其复发率高、预后差等原因临床上较难治愈,除少部分患者可以进行异基因造血干细胞移植外,大部分患者尚无可行的治疗方案,因此寻找新的针对该类血液肿瘤的有效疗法迫在眉睫。值得注意的是,CD19分子不会表达于除B细胞外的大多数正常细胞表面,包括多能造血干细胞,这一特征使得对于B细胞恶性肿瘤而言,CD19分子可以作为一种安全、有效的免疫治疗靶点。目前靶向CD19分子的抗体药物和嵌合抗原受体T细胞疗法已经在B细胞恶性肿瘤的临床治疗上取得了令人振奋的治疗效果,除此之外,CD19分子还可以作为自身免疫性疾病如类风湿性关节炎和多发性硬化症的潜在免疫治疗靶点,应用前景广泛。
急性B细胞淋巴白血病
急性B细胞淋巴白血病(B-ALL)是指与B淋巴细胞发育和增殖相关的基因突变从而阻碍了B淋巴祖细胞的正常分化和成熟过程,伴随着异常增殖而引起的克隆异质性疾病,该疾病按照免疫表型可分为B祖细胞型、早前B细胞型、前B细胞型和成熟B细胞型,其中早前B细胞型又称普通型,在临床上最为常见。急性B细胞淋巴白血病是最常见的血液系统恶性肿瘤之一,约占急性淋巴细胞白血病的85%,其余15%为急性T细胞淋巴白血病。急性B细胞淋巴白血病好发于2-5岁的儿童以及50岁以上的成人,男性的发病率高于女性。目前临床上多根据危险度分型对患者施予相应的化疗方案或采用异基因造血干细胞移植的方法进行治疗。急性B细胞淋巴白血病的治愈率在儿童患者中达80%以上,成人患者因化疗耐药等因素,临床治愈率只有30%以上。但是仍有约20%的儿童患者和60%的成人患者治愈率相比较差,存在复发的风险,这类患者的远期生存率<10%,即便进一步提高化疗强度也无济于事。与此同时配型困难、治疗费用昂贵、依然有复发风险等因素在一定程度上限制了异基因造血干细胞移植疗法的应用。因此目前迫切需要一种新的安全有效的治疗手段来为急性B细胞淋巴白血病患者们带来康复的福音。
非霍奇金淋巴瘤
淋巴瘤是最常见的淋巴造血系统恶性肿瘤,恶性淋巴瘤在我国常见恶性肿瘤中已位列第8位。世界卫生组织将淋巴瘤分为霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma,HL)和非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma,NHL)两类,其中非霍奇金淋巴瘤占比高达89.1%,其余为霍奇金淋巴瘤。非霍奇金淋巴瘤依据细胞来源又可分为以下三种基本类型:B细胞、T细胞和NK/T细胞,其中临床大多数非霍奇金淋巴瘤为B细胞型,占总数的70%至85%,又以弥漫性大B细胞淋巴瘤最为常见。根据我国的流行病学统计,非霍奇金淋巴瘤好发于儿童与青壮年,而美国在2000-2003年的统计数据表明确诊非霍奇金淋巴瘤患者的平均年龄在67岁。目前临床上根据患者的具体病情多采用放化疗结合、单克隆抗体联合化疗和造血干细胞移植的方式对非霍奇金淋巴瘤患者进行治疗。经典CHOP化疗方案的施用在临床上可以获得45%~55%的完全缓解率以及30%~35%的长期无病生存率,但仍有约50%的非霍奇金淋巴瘤患者对CHOP化疗方案耐受,无法取得良好的治疗效果。另外,虽然近年来造血干细胞移植以及单克隆抗体药物治疗的方法在临床上取得了较好的治疗效果,但有限的适应范围以及患者低下的经济承受能力则在一定程度上限制了这些疗法的广泛应用。因此目前迫切需要一种新的安全有效的治疗手段来为非霍奇金淋巴瘤患者带来希望。
急性T细胞淋巴白血病
急性T细胞淋巴白血病(T-ALL)是指因基因突变,T系前体细胞恶性转化,进而导致的造血系统恶性克隆性疾病,临床以感染、出血、贫血和髓外组织器官浸润为主要表现。该疾病按照免疫表型可分为T祖细胞型、前T细胞型、胸腺T细胞型和成熟T细胞型,其中T祖细胞型和前T细胞型的完全缓解率明显低于另外两种亚型(56%和91%)。急性T细胞淋巴白血病占儿童急性淋巴细胞白血病的15%,好发于年长儿,男孩的发病比例显著高于女孩;急性T细胞淋巴白血病占成人急性淋巴细胞白血病的25%,前T细胞型和胸腺T细胞型为成人急性T细胞淋巴白血病的常见亚型。近年来,我国急性T细胞淋巴白血病发病率呈升高趋势。目前临床上多根据危险度分型对患者施予相应的化疗方案或采用异基因造血干细胞移植的方法进行治疗,但是急性T细胞淋巴细胞白血病的预后较差,易复发,并且复发后难以通过强效化疗使患者再次达到完全缓解,对于那些在初次治疗后复发的患者,补救性化疗方案的缓解率只有20%~40%。与此同时配型困难、治疗费用昂贵、依然有复发风险、排异反应强烈等因素影响了异基因造血干细胞移植疗法在临床上发挥作用。因此寻找一种新的安全有效的治疗手段从而提高急性T细胞淋巴白血病患者的生存质量是目前临床上亟待解决的难题。
同种异体回输排异反应
通用型CAR-T回输异体静脉后,最大的障碍是排异反应,严重的排异反应可导致回输的细胞几天内在机体中消失,从而完全失去疗效。其根据排异类型分为抗HLA抗体排异反应、T细胞排异反应和NK细胞排异反应。根据排异反应起效时间其又分为超急性排异反应、急性排异反应和慢性排异反应。
双靶点CAR-T
双靶点CAR-T细胞是单靶点CAR-T的升级版本,目前已知的优势有:一定程度预防抗原逃逸的发生(如抗CD19-CD22 CAR-T治疗急性B淋巴细胞白血病);适用更多的病人(抗CD19-BCMA CAR-T和抗CD19-CD123 CAR-T);更好的疗效(如抗CD19-CD20 CAR-T治疗非霍奇金淋巴瘤)。未来双靶点CAR-T还将在更多的治疗上发挥优势。
发明内容
定义
CAR-T(chimeric antigen receptor T cell):嵌合抗原受体T细胞。
CTLA-4(cytotoxic T-lymphocyte associated protein 4):最早获批的免疫检验点抑制剂靶点。
PD-1/PD-L1(programmed cell death 1/ligand of PD-1protein):最著名的两个免疫检验点抑制剂靶点。
ACT(adoptive cell transfer):过继性免疫疗法,是将供体的淋巴细胞转移给受体,增强其细胞免疫功能。过继性细胞免疫可分为特异性和非特异性两类,前者是用已知抗原致敏的淋巴细胞注入受体后使其获得对该抗原的细胞免疫能力,后者是用未经特殊抗原致敏的正常人淋巴细胞注入受体后使其获得对多种抗原的细胞免疫能力。
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats):一种细菌免疫系统,今年来被科学家改造为最热门的基因编辑工具。
ZFN:一种基因编辑技术,它是一类人工合成的限制性内切酶,由锌指DNA结合域与限制性内切酶的DNA切割域融合而成,研究者可以通过加工改造ZFN的锌指DNA结合域,靶向定位于不同的DNA序列,从而使得ZFN可以结合复杂基因组中的目的序列,并由DNA切割域进行特异性切割。
TALEN:一种基因编辑技术,典型的TALEN由一个包含核定位信号的N端结构域、一个包含可识别特定DNA序列的典型串联TALE重复序列的中央结构域以及一个具有FokI核酸内切酶功能的C端结构域组成,可以结合复杂基因组中的目的序列,并由DNA切割域进行特异性切割。
ARCUS:一种基因编辑技术,其优点在于所用到的核酸酶结构小巧,易于体内递送。
megaTAL:一种基因编辑技术,由归巢内切核酸酶和转录激活子样效应子的DNA结合域融合在一起,可以结合复杂基因组中的目的序列,并由DNA切割域进行特异性切割。
Knockin:通过基因编辑将目的基因位置引进特定的突变或外源基因。
dsDNA:双链DNA。
RNP:Cas9蛋白和sgRNA形成的复合体简称。
mRNA:信使RNA,是由DNA的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息的能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。以细胞中基因为模板,依据碱基互补配对原则转录生成mRNA后,mRNA就含有与DNA分子中某些功能片段相对应的碱基序列,作为蛋白质生物合成的直接模板。
AAV:腺相关病毒载体,一种高效安全的基因递送工具,近年来多用于基因治疗,也可用于大片段基因敲入的修复模版。
CAR-Treg:一种过继性细胞治疗技术,将CAR基因转导入Treg细胞,用于抑制特定的抗原细胞活性,目前处于临床前研究阶段,有望将来用于自身免疫性疾病治疗。
TCR-T:一种过继性细胞治疗技术,是将实验室筛选到的天然或优化的TCR基因转导至T细胞,并在体外扩增培养最后回输病人,可用于治疗多种难治肿瘤。
sgRNA:CRISPR应用中人为发明的一种RNA,其融合了crRNA和tracrRNA,可结合Cas9蛋白并靶向目的DNA。
PolyA:多聚腺苷酸结构,是一种mRNA转录后修饰过程,帮助稳定mRNA并提高翻译效率。
本发明涉及一种制备靶向CD7和CD19的双靶点通用型CAR-T细胞的方法,所述方法包括:将基因编辑物质递送至T细胞以剪切TRAC和CD7基因组DNA或剪切TRAC、CD7和B2M基因组DNA,以及使用重组腺相关病毒递送模版DNA以将靶向CD7-CD19双靶点CAR基因定点整合入TRAC、CD7或B2M基因组位点。
将基因编辑物质递送至T细胞所使用的基因编辑方法可以是CRISPR-Cas9、ZFN、ARCRS、TALEN和megaTAL等,优选CRISPR-Cas9,也可以是将来新出现的某种基因编辑方法。基因编辑物质可以是质粒、mRNA、蛋白质、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒,优选mRNA。基因编辑物质的递送可以使用脂质体、磷酸钙、DEAE-葡聚糖、电穿孔、显微注射、基因枪等转染方法,优选电穿孔转染。
在一些实施方案中,使用CRISPR-Cas9基因编辑方法。使用的CRISPR-Cas9基因编辑物质包括Cas9 mRNA或Cas9蛋白和sgRNA。
sgRNA靶向TRAC、CD7和/或B2M基因。首先需要明确敲入的基因组位点,利用该位点周围的DNA序列设计sgRNA。设计的原则是PAM区序列为NGG,其中N为A、T、C和G中的任一碱基。sgRNA包括靶向的crRNA序列和tracrRNA序列,其中crRNA可以是17、18、19、20、21或22个碱基。
在一些实施方案中,sgRNA是化学修饰的。化学修饰包括2-O-甲基化、3-硫代、2-O-甲基化结合3-硫代等。化学修饰可以发生在sgRNA的5’和3’端的1至10个碱基。在一些实施方案中,5’和3’端3个碱基同时进行2-O-甲基化和3-硫代修饰。设计好的sgRNA可以通过T7体外转录获得,也可以直接体外合成。
在一些实施方案中,针对TRAC基因的sgRNA序列(包含PAM序列)如SEQ ID NO:1所示,针对CD7基因的sgRNA序列(包含PAM序列)如SEQ ID NO:2所示,针对B2M基因的sgRNA序列(包含PAM序列)如SEQ ID NO:3所示。
Cas9可以为SpCas9、SaCas9、SpCas9-HF、eSpCas9、xCas9、cpf1或其它不同菌属的Cas9,优选SpCas9。在一些实施方案中,SpCas9的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。Cas9蛋白的N端或C端可以偶联有一个或多个NLS入核信号肽。在一些实施方案中,NLS入核信号肽序列如SEQ ID NO:5所示。Cas9 mRNA可以通过体外转录获得,并且Cas9蛋白可以通过细菌或真核表达细胞表达纯化获得。
在一些实施方案中,使用编码Cas9蛋白的mRNA和sgRNA混合物进行电转。
在一些实施方案中,使用Cas9蛋白和sgRNA形成的RNP复合体进行电转。RNP复合体可以通过直接混合温育Cas9蛋白和sgRNA获得,或者通过将二者混合于特定缓冲液(诸如电转缓冲液)中获得。
当使用电穿孔转染(电转)递送基因编辑物质时,在T细胞激活完成后,离心富集细胞,每个电转单元的T细胞数量取决于仪器设备要求,电转体系的配置根据单个电转单元细胞数量设置。电转体系的缓冲液通常由设备厂家提供,也可以用其他缓冲液替代,诸如PBS、MEM或1640等。将基因编辑物质(例如CRISPR-Cas9基因编辑物质)与电转缓冲液混合,具体加入量取决于单个电转单元的细胞数量。将电转体系与细胞混合后加入电转杯,立即电转,电转的条件可以按照厂家要求,也可以自行摸索。电转完成的细胞可以放置在电转杯一段时间后再加入培养基中。
在本发明中,使用腺相关病毒(rAAV)作为打靶载体用于递送双靶点CAR基因定点敲入的模版DNA。模版DNA包括左同源臂DNA、敲入的外源DNA、右同源臂DNA。
模版DNA的左同源臂与DNA切口5’端序列同源,右同源臂与DNA切口3’端序列同源。在一些实施方案中,左同源臂3’末端DNA与距离DNA切口0至300个碱基的5’端序列一致,片段长度为10至2000bp;右同源臂5’末端DNA与距离DNA切口0至300个碱基的3’端序列一致,片段长度为10至2000bp。在一些实施方案中,左右同源臂片段长度为300、600或1000个碱基。在一些实施方案中,当双靶点CAR基因敲入TRAC基因组位点时,同源臂序列分别如SEQID NO:6-11所示;当双靶点CAR基因敲入CD7基因组位点时,同源臂序列分别如SEQ ID NO:12-17所示;当双靶点CAR基因敲入B2M基因组位点时,同源臂序列分别如SEQ ID NO:18-23所示。
本发明的双靶点CAR基因可以敲入TRAC、CD7或B2M基因组位点。
当双靶点CAR基因敲入TRAC基因组位点时,敲入的外源DNA包含剪切肽或内部核糖体进入位点基因、双靶点CAR基因和polyA。敲入的外源DNA的剪切肽或内部核糖体进入位点基因可以为P2A、T2A、IRES等,优选P2A或T2A。在一些实施方案中,P2A和T2A的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:24-25所示。
当双靶点CAR基因敲入CD7基因组位点时,敲入的外源DNA包含外源启动子基因、双靶点CAR基因和polyA。敲入的外源DNA的外源启动子可以是任意一种外源启动子,例如EF1、CMV、PGK、MSCV、SFFV等,优选EF1。在一些实施方案中,EF1的DNA序列如SEQ ID NO:26所示。
当双靶点CAR基因敲入B2M基因组位点时,敲入的外源DNA包含双靶点CAR基因和polyA。
敲入的外源DNA的polyA可以为任一polyA基因,优选miniPolyA或者bGHpA polyA。在一些实施方案中,miniPolyA和bGHpA polyA的DNA序列分别如SEQ ID NO:27-28所示。
双靶点CAR基因为第二代或第三代结构,优选第二代CAR基因结构。在一些实施方案中,双靶点CAR基因包含信号肽、抗体scFv序列、铰链区、跨膜区、共刺激区和激活区。
双靶点CAR基因中的抗体scFv序列包含通过连接肽连接的靶向CD7抗体scFv序列和靶向CD19抗体scFv序列。靶向CD7抗体scFv序列和靶向CD19抗体scFv序列无顺序要求;换言之,抗体scFv序列可以包含(5’到3’):靶向CD7抗体scFv序列、连接肽、靶向CD19抗体scFv序列,或者靶向CD19抗体scFv序列、连接肽、靶向CD7抗体scFv序列。连接肽可以是GGGGS或EAAAK型连接肽,如EAAAKEAAAKEAAAK或GGGGSGGGGSGGGGS等连接肽。在一些实施方案中,靶向CD7抗体scFv序列和靶向CD19抗体scFv序列的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:29-30所示,DNA序列分别如SEQ ID NO:31-32所示。在一些实施方案中,连接肽的氨基酸序列分别如SEQID NO:33-34所示。
双靶点CAR基因中的信号肽选自CD8、IL-2、GM-CSF等信号肽结构域,优选CD8信号肽。在一些实施方案中,CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示,DNA序列如SEQ IDNO:36所示。
双靶点CAR基因中的铰链结构可以是IgG1、IgG4、IgD、CD8等铰链结构域,优选CD8铰链结构。在一些实施方案中,CD8铰链结构的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示,DNA序列如SEQ ID NO:38所示。
双靶点CAR基因中的跨膜结构可以是CD3、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154、PD1等跨膜结构域,优选CD8跨膜结构。在一些实施方案中,CD8跨膜结构的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示,DNA序列如SEQ ID NO:40所示。
双靶点CAR基因中的共刺激结构可以是CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54、CD83、CD134、CD137、CD150、CD152、CD223、CD270、CD273、CD274、CD278、CARD11、NKD2C、DAP10、LAT、SLP76、ZAP70、4-1BB等共刺激结构域,优选4-1BB共刺激结构。在一些实施方案中,4-1BB共刺激结构的氨基酸序列如SEQ ID NO:41所示,DNA序列如SEQ ID NO:42所示。
双靶点CAR基因中的激活结构可以是CD3ζ激活结构域。在一些实施方案中,CD3ζ激活结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示,DNA序列如SEQ ID NO:44所示。
在一些实施方案中,当双靶点CAR基因敲入TRAC基因组位点时,模版DNA序列包含左同源臂(300bp、600bp和1000bp)、P2A、靶向CD7抗体scFv氨基酸+连接肽+靶向CD19抗体scFv氨基酸(或靶向CD19抗体scFv氨基酸+连接肽+靶向CD7抗体scFv氨基酸)、CD8信号肽、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB共刺激区、CD3ζ激活区、bGHpA polyA和右同源臂(300bp、600bp和1000bp)。在具体实施方案中,其序列如SEQ ID NO:45-47(或SEQ ID NO:55-57)所示。
在一些实施方案中,当双靶点CAR基因敲入CD7基因组位点时,模版DNA包含左同源臂(300bp、600bp和1000bp)、EF1启动子基因、靶向CD7抗体scFv氨基酸+连接肽+靶向CD19抗体scFv氨基酸(或靶向CD19抗体scFv氨基酸+连接肽+靶向CD7抗体scFv氨基酸)、CD8信号肽、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB共刺激区、CD3ζ激活区、bGHpA polyA和右同源臂(300bp、600bp和1000bp)。在具体实施方案中,其序列如SEQ ID NO:48-50(或SEQ ID NO:58-60)所示。
在一些实施方案中,当双靶点CAR基因敲入B2M基因组位点时,模版DNA包含左同源臂(300bp、600bp和1000bp)、靶向CD7抗体scFv氨基酸+连接肽+靶向CD19抗体scFv氨基酸(或靶向CD19抗体scFv氨基酸+连接肽+靶向CD7抗体scFv氨基酸)、CD8信号肽、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB共刺激区、CD3ζ激活区、bGHpA polyA和右同源臂(300bp、600bp和1000bp)。在具体实施方案中,其序列如SEQ ID NO:51-53(或SEQ ID NO:61-63)所示。
在本发明中,将模版DNA克隆至腺相关病毒载体中,包装成重组腺相关病毒(rAAV),以递送模版DNA。可以通过293T细胞或SF9表达系统包装病毒。rAAV血清型可以是任意血清型,例如AAV1-AAV9、AAV-DJ、AAV-Retro等,优选AAV6型。rAAV的纯化可以采用超速离心或亲和层析等方法。在电转完成后0至6小时后,将rAAV添加至培养细胞中,其中MOI不低于1×103。
在一些实施方案中,制备靶向CD7和CD19的双靶点通用型CAR-T细胞的方法还包括递送基因编辑物质之前的T细胞激活,以及CAR-T细胞扩增和细胞冻存。
在T细胞激活步骤中,T细胞来源于健康志愿者。T细胞来源可以是静脉抽全血,也可以是单采单个核细胞。可以选择分离纯化T淋巴细胞或者不分离。T细胞分离可以采用淋巴细胞分离液,配合普通离心管、sepmate管或者其他硬件设备进行。若需分离纯化T淋巴细胞,可以采用各厂商的试剂盒,包括各种阴选和阳选的方法。T细胞激活可以采用如下方法激活:单独的抗CD3抗体包被、抗CD3抗体/抗CD28抗体包被、直接添加单独的抗CD3抗体、直接添加抗CD3抗体/抗CD28抗体、直接添加抗CD3抗体/抗CD28抗体/CD2抗体、抗CD3抗体/抗CD28抗体磁珠等。激活时间可以为1到8天。若采用抗体磁珠激活,电转前需利用磁极去除磁珠。
感染rAAV后的CAR-T细胞的扩增培养采用1640培养基+血清或其他专用于T细胞培养的无血清培养基,例如X-VIVO-15、ImmunoCultTM-XF、OpTmizer培养基等。培养可以在培养瓶、培养皿、G-rex或培养袋中进行。培养过程中可以添加一定浓度的细胞因子,例如IL-2、IL-7、IL-15等。
制备的CAR-T细胞按一定细胞浓度进行冻存。冻存液可以为市面上提供的GMP或非GMP级别产品。冻存可以在专用的冻存袋或冻存管中进行。制备的CAR-T细胞经过专用的设备梯度降温后放于负八十度冰箱或液氮罐中保存。
本发明还涉及通过所述方法制备的靶向CD7-CD19的双靶点通用型CAR-T细胞,其用于治疗疾病。
本发明还涉及通过所述方法制备的靶向CD7-CD19的双靶点通用型CAR-T细胞用于制备药物的用途,所述药物用于治疗疾病。
具体地,所述疾病包括白血病(例如急性B淋巴细胞白血病、急性T淋巴细胞白血病、NK/T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病、多发性骨髓瘤等)、实体肿瘤(例如肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、脑胶质瘤、食管癌、胆管癌、子宫内膜癌、卵巢癌、间皮瘤、胸腺癌等)、自身免疫疾病(例如艾滋病等)和CAR-T细胞治疗可及的各种疾病。
靶向CD7-CD19双靶点CAR基因也可以定点整合至其它常见于T细胞基因编辑的基因组位点(如PD-1,CD3z,CD3e等),可利用外源启动子(如EF1)或内源基因启动子启动。
靶向CD7 CAR基因也可以同其他靶点组成双靶点CAR基因并用于制备同种异体通用型CAR-T细胞治疗。除CD19外,其它靶点可以是:CD22、CD20、CD7、、CD79、CD123、CD33、CD38、BCMA、PSMA、Her2、Mesothelin、CS1、MUC16、GD2、GPC3、CEA、CD138、EGFR、EGFRVIII、LewisY、DLL3、MG7和IL13Rα2等。
本发明在原本通用型靶向CD19 CAR-T细胞上加装一个靶向CD7 CAR基因,利用靶向CD7 CAR-T细胞杀伤大部分异体的T和NK细胞,从而有效抑制排异反应,同时不影响靶向CD19 CAR-T行使功能,增强异体回输CAR-T细胞的疗效。另外,为避免CD7 CAR基因对T细胞短暂的“自杀”效应,应用定点整合技术一步实现CAR基因转导和CD7基因敲除,从而高效制备双靶点CAR-T细胞。
去除T细胞表面TCR-CD3复合体蛋白通过敲除TRAC基因实现以防止GvHD反应。敲除CD7基因以防止通用型双靶点CAR-T细胞“自杀”从而可以在体外正常扩增出大量的细胞。可选择敲除或不敲除B2M基因,或采用敲除与不敲除B2M的混合细胞。敲除B2M相当于完全抑制HLA-I类分子表达,有利于进一步压低T细胞排异反应,但同时NK排异反应也会显著增强,靶向CD7 CAR可抑制NK排异反应。
本发明中靶向CD7 CAR做为抗排异基因同靶向CD19 CAR基因融合形成双靶点CAR基因,制备成的双靶点CAR-T细胞用于同种异体通用型细胞治疗。特别地,在本发明的双靶点CAR基因中,单个全长CAR基因通过剪切肽DNA串联,将靶向CD7和CD19抗体scFv基因串联于一个CAR基因上,共用铰链、跨膜、共刺激和激活结构元件。
双靶点CAR基因通过CRISPR-Cas9基因编辑方法定点整合至TRAC基因组位点,极大降低CAR基因随机插入几率,避免CAR-T细胞“癌化”,同时一步完成CAR基因转导和基因敲除,可极大避免短时间内“自杀”效应,该方法极大提高双靶点CAR-T细胞的制备得率。
以往通用型CAR-T主要思路是如何避免同种异体回输的细胞遭遇排异反应,多采用敲除或表达一些基因来抑制异体T或NK细胞的杀伤。而本发明的方案是回输细胞后直接杀伤大部分T和NK细胞来降低排异反应,为CAR-T细胞发挥作用留下“空间”。在本发明中,以靶向CD7 CAR基因做为抗排异反应的“武器”,将靶向CD7 CAR基因与靶向CD19 CAR基因结合于单个T细胞,制备成双靶点CAR-T细胞。靶向CD7 CAR编码的基因可杀伤大部分异体T或NK细胞,无需额外生物试剂(如CD52单抗)做通用CAR-T细胞回输前的预处理。
本发明的有益技术效果在于:
1)更好的疗效。靶向CD7 CAR基因增强了通用CAR-T细胞的抗排异反应,因而在异体内存续时间更长,更能发挥通用CAR-T细胞的作用,增加了疗效。
2)更高的细胞得率使成本降低。本发明实现了超过90%的得率。本发明外的研究显示一般通用CAR-T的最终得率很难超过50%(单敲除效率不超过80%,慢病毒转染效率不超过60%),再加上本发明用到CD7靶点的特殊性,若使用慢病毒载体方案,则转染效率不超过10%,而本发明中若将双靶点CAR基因敲入TRAC位点则最终得率超过90%(TCR和CD7敲除效率接近100%,双靶点CAR定点整合效率超过90%),若将双靶点CAR基因敲入CD7或B2M位点则最终得率也远高于慢病毒载体制备方式。
3)更简易的工艺步骤使成本进一步降低。本发明得到的TCR阴性细胞接近100%,无需额外分选,简化了步骤,进一步节省成本,同时降低了分选对细胞状态的损害和数量的损失。
4)更安全的基因编辑方式。使用慢病毒、逆转录病毒或转座子载体转导CAR基因都是随机插入,可能导致T细胞癌变,本发明使用的CRISPR+rAAV定点整合方式转导CAR基因,使CAR基因随机整合大大降低,减少了T细胞癌变风险,增加了治疗的安全性
附图说明
图1为双靶点通用型CAR-T细胞效果示意图,根据双靶CAR结构和敲除的基因不同分为a-d四种情况:a.靶向CD7-CD19通用型CAR-T细胞(同时敲除TRAC和CD7基因);b.靶向CD7-CD19通用型CAR-T细胞(同时敲除TRAC、B2M和CD7基因);c.靶向CD7/靶向CD19通用型CAR-T细胞(同时敲除TRAC和CD7基因);d.靶向CD7/靶向CD19通用型CAR-T细胞(同时敲除TRAC、B2M和CD7基因)。
图2为靶向CD7-CD19通用型CAR-T细胞的制备方法。T细胞第一天激活后,于第二至九天内敲除TRAC、CD7和B2M基因的同时敲入靶向CD7-CD19 CAR基因,制备的细胞于第十至二十天收获分装。
图3a为靶向CD7-CD19 CAR基因敲入TRAC基因组DNA示意图。模版DNA(包括左同源臂DNA、CAR基因、右同源臂DNA)连接至质粒载体后包装腺相关病毒,CRISPR-Cas9剪切TRAC基因第一个外显子DNA后,利用腺相关病毒将CAR基因高效同源重组至剪切位点,完成后CAR基因依赖TRAC基因启动子转录表达;图3b为两种靶向CD7-CD19 CAR结构示意图,其中一种靶向CD7 scFv结构在N端,另一种靶向CD19 scFv结构在N端。
图4为腺相关病毒载体构建质粒pAAV-MCS图谱。
图5为腺相关病毒载体辅助质粒pHelper和pAAV-RC6图谱。
图6为sgRNA修饰示意图。
图7a和7b示出了实施例5的流式检测结果。
图8为使用TIDE方法检测CRISPR-Cas9敲除TRAC和CD7基因的脱靶情况。
图9a示出了实施例7的流式检测结果,检测构建的K562-CD7和K562-CD19细胞系的表达情况;图9b示出了使用LDH方法检测靶向CD7-CD19 CAR-T细胞杀伤靶向细胞;图9c示出了检测图9b杀伤实验中的细胞因子(IFNG)释放。
图10a示出了在志愿者中检测原代T细胞表达CD7情况;图10b示出了在志愿者中检测原代NK细胞表达CD7情况;图10c和10d分别示出了使用LDH方法检测靶向CD7-CD19 CAR-T细胞杀伤原代T和NK细胞。
图11a-c示出了实施例9的流式检测结果。
图12a-b示出了实施例10的流式检测结果。
图13a-b示出了实施例11的流式检测结果。
图14a-b示出了实施例12的流式检测结果。
图15示出了靶向CD7-CD19 CAR-T细胞治疗小鼠CD19阳性急性淋巴细胞白血病的生存曲线。
图16示出了靶向CD7-CD19 CAR-T细胞对CD7阳性小鼠肿瘤模型的体内疗效检测(结果为小鼠生存曲线)。
图17示出了双靶点通用CAR-T细胞在异体人源化小鼠模型存留情况:a.实验流程;b.回输小鼠后受体细胞占比曲线;c.回输小鼠后供体细胞(即双靶点通用CAR-T细胞)占比曲线。
图18示出了双靶点通用CAR-T细胞在异体人源化且带CD19阳性荷瘤小鼠模型疗效检测:a.实验流程;b.双靶点CAR-T对比单靶向CD19 CAR-T在异体人源化且带CD19阳性荷瘤小鼠模型的疗效对比(生存曲线结果)。
图19示出了本发明对比其他研究方法制备的靶向CD19通用型CAR-T的抗排异反应检测,图为不同时间节点采用流式细胞技术检测共孵育细胞占比情况。
图20示出了定点整合对比慢病毒转导方法制备靶向CD7-CD19双靶点CAR-T的细胞得率:a.得到的总细胞数对比;b.得到的CAR阳性细胞占比对比;c.得到的TCR阴性细胞占比对比;d.得到的CD7阴性细胞占比对比;e.得到的有效细胞总数对比。
图21示出了本发明对比法国Cellectis公司制备的靶向CD19通用型CAR-T的TCR基因敲除效率。
图22示出了双靶点CAR基因分别敲入TRAC、CD7或B2M基因组并对比分析敲入的CAR基因表达及TRAC、CD7和B2M基因敲除:a.敲入CD7基因组的模版DNA设计图;b.敲入B2M基因组的模版DNA设计图;c.三种不同敲入方式制备的双靶点CAR-T细胞结果。
具体实施方式
实施例1:模版DNA的分子设计
靶向CD7-CD19双靶点CAR基因敲入T细胞的TRAC基因组位点。
修复的模版DNA包含了两大部分:
a.左右同源臂。左右同源臂用于识别目的DNA,并且进行重组交换。为了使敲入基因能正确表达,将敲入基因“登陆”到TRAC基因组外显子1的5’端区域。根据碱基序列的长短,分别设计了300、600、1000个碱基的同源臂,序列如SEQ ID NO:6-11,具体如下:
序列名称(敲入TRAC基因组) | 序列编号 |
300个碱基左同源臂 | SEQ ID NO:6 |
300个碱基右同源臂 | SEQ ID NO:7 |
600个碱基左同源臂 | SEQ ID NO:8 |
600个碱基右同源臂 | SEQ ID NO:9 |
1000个碱基左同源臂 | SEQ ID NO:10 |
1000个碱基右同源臂 | SEQ ID NO:11 |
b.敲入的外源DNA。敲入的外源DNA包括剪切肽或内部核糖体进入位点基因、双靶点CAR基因、polyA;所采用的剪切肽或内部核糖体进入位点基因为P2A;CAR基因采用二代结构,包含信号肽、靶向CD7抗体scFv序列/靶向CD19抗体scFv序列、CD8铰链区、CD8跨膜区、4-1BB共刺激区、CD3ζ激活区;PolyA采用bGHpA polyA。各基因结构序列如下:
实施例2:修复模版DNA克隆至腺相关病毒载体。
将SEQ ID NO:45/46/47/54修复模版DNA酶切后克隆至pAAV-MCS质粒载体中。该过程分为如下几步:
1)目的片段PCR制备,首先需要配制PCR反应体系:
然后将PCR反应体系置于PCR扩增仪中,按如下条件进行扩增:
2)载体酶切,反应体系如下:
将酶切反应体系置于37度水浴中酶切两小时。
3)目的片段与载体连接:于冰盒上将目的基因与线性化载体以一定的摩尔比加入到离心管进行连接反应,在室温反应一小时,反应体系如下所示:
4)反应产物转化涂板:冰上融化一管100μl的StbI3感受态细胞,轻弹管壁使细胞重悬起来,加入10μl的连接反应液到感受态细胞中,轻弹数下,冰浴30分钟;42℃水浴锅中热激90秒后快速放入冰上5分钟;加入500μl LB液体培养基,37℃摇床孵育45-60分钟;5000rpm离心3分钟收集菌体,弃300μl的上清,将剩余一定量的菌体涂于含氨苄抗生素的平板上,置于37℃的温箱孵育过夜。
5)挑取单克隆,进行质粒提取(货号:DP103-03,天根生化)。柱平衡步骤:向吸附柱CP3中加入500μl的平衡液BL,12,000rpm(13,400×g)离心1分钟,倒掉收集管中的废液,将吸附柱重新放回收集管中;取5ml过夜培养的菌液,加入离心管中,使用常规台式离心机,12,000rpm(13,400×g)离心1分钟,尽量吸除上清;向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1,使用移液器或涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀;向离心管中加入250μl溶液P2,温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解;向离心管中加入350μl溶液P3,立即温和地上下翻转6-8次,充分混匀,此时将出现白色絮状沉淀;12,000rpm(13,400×g)离心10分钟;将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中);12,000rpm(13,400×g)离心30-60秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3放入收集管中;向吸附柱CP3中加入500μl去蛋白液PD,12,000rpm(13,400×g)离心30到60秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3重新放回收集管中;向吸附柱CP3中加入600μl漂洗液PW,12,000rpm(13,400×g)离心30-60秒,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3放入收集管中;重复操作上一步骤;将吸附柱CP3放入收集管中,12,000rpm(13,400×g)离心2分钟,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除;将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位滴加50-100μl洗脱缓冲液EB,室温放置2分钟,12,000rpm(13,400×g)离心2分钟将质粒溶液收集到离心管中。将得到的溶液重新加入吸附柱中,室温放置2分钟,12,000rpm(13,400×g)离心2分钟,将质粒溶液收集到离心管中。
6)测序确认。
实施例3:重组腺相关病毒包装、纯化和滴度测定
(1)包装:293T细胞(购自ATCC)在转染前一天在225cm2培养皿中长至95%左右密度后按1:3进行传代,单个培养皿培养基为20ml,单个腺相关病毒包装5个225cm2培养皿。先配制转染体系(针对1个225cm2培养皿),如下:
混匀转染体系后,静置10分钟,小心加入293T细胞中。6小时后换新鲜培养基。72小时后分别收取培养基和细胞。
(2)纯化:先用高速离心机将培养基以50000g离心2小时,去除培养基上清,加入1ml PBS重悬所有病毒沉淀,放置于4度冰箱备用;将收取的293T细胞用10ml PBS重悬,反复在液氮和37度水浴锅冻融4次,加入备用的上清病毒后,加入全能核酸酶(购自Millipore公司)在37度处理30分钟,2000rpm 4度离心30分钟去除细胞碎片,取上清;按下表配制不同浓度的碘克沙醇,分别为:60%、40%、25%、15%;取一个32ml PP超速离心管(购自Beckman公司),逐层加入60%层5ml、40%层5ml、25%层5ml、15%层5ml,最后小心加入样品至加满管口;70000rpm超速离心3小时;离心结束毕后,使用注射器在40%和60%交界层吸取5ml,后加入PBS 18ml稀释并使用100KDa超滤管离心浓缩rAAV病毒,弃掉离心下来的液体,重新加入PBS进行超速离心,最后得到约200μl的病毒量;超滤换液后,使用0.22μm PVDF微滤器过滤。
(3)滴度测定:1μl病毒液检测(稀释20倍),第一步先用DNA酶消化,体系如下:
混匀后放置于37度水浴锅反应10分钟,再置于75度水浴锅10分钟终止反应。第二步用蛋白酶K(购自ThermoFisher公司)消化腺相关病毒外壳,配制反应体系如下(进一步稀释了5倍):
成分 | 含量 |
第一步反应 | 20μl |
去离子水 | 79μl |
蛋白酶K(20mg/ml) | 1μl |
混匀后放置于55度水浴锅反应30分钟,再置于95度水浴锅10分钟终止反应。第三步,配制荧光定量PCR反应体系,如下:
其中引物序列分别是:
引物F(10μM) | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT |
引物R(10μM) | CGGCCTCAGTGAGCGA |
混用后放置在荧光定量PCR仪上(IT-TS),进行如下反应:
反应结束后得到Ct值,如下:
最后根据Ct值结果计算腺相关病毒滴度为:
pAAV-0045 | 1.065×10<sup>12</sup> |
pAAV-0046 | 9.211×10<sup>11</sup> |
pAAV-0047 | 4.93×10<sup>11</sup> |
pAAV-0054 | 1.23×10<sup>12</sup> |
实施例4:sgRNA设计和合成
本发明所用到的sgRNA均由体外合成并且经过化学修饰,其中化学修饰的sgRNA在5′端和3′端各3个碱基进行3-硫代和2-O-甲基化修饰,修饰基团如图6所示,以使sgRNA更稳定而不容易在转导入细胞后被核酸酶迅速降解,化学合成相应sgRNA后均采用HLPC纯化,以下为本发明用到的各化学合成的sgRNA序列:
实施例5:定点整合型靶向CD7和CD19通用型CAR-T细胞制备
1)细胞制备
PBMC提取:招募健康志愿者,志愿者无感冒发烧症状,由专业医务人员在人肘正中静脉处取血100ml接至BD抗凝血管;采完血后,血液与等量的PBS缓冲液(含2%的胎牛血清)混合;取PBMC分离管Sepmate-50,小心加入15ml的Ficoll缓冲液,再加入血液PBS的混合液,每管小心加入30ml左右;1200g离心10分钟后迅速将上清倒入新50ml管中,后200g离心8分钟,弃上清,加入10ml PBS缓冲液重悬沉淀,再弃上清后加10ml PBS缓冲液重悬,离心弃上清后10ml PBS缓冲液重悬细胞沉淀;对重悬细胞计数,取10μl混悬液加入10μl 0.1%的台盼蓝混匀,上机计细胞数和存活率。
T细胞纯化:取少量得到的PBMC细胞,流式细胞仪计算CD3阳性T比例;根据实验需要与CD3阳性细胞比例,取出所需的PBMC细胞,需要细胞应为所取细胞的70%;用阳选缓冲液重悬总PBMC细胞,使总细胞浓度为1×108/ml;每1×108细胞加入100μl CD3抗体(ReleaseHuman CD3 Positive Selection Cocktail);室温孵育3分钟;用涡旋混合仪提前混匀磁珠(Releasable Rapid Sphenes)30秒,每1×108个细胞加入100μl磁珠,室温孵育3分钟;将细胞悬液转移至专用分选管内,并用阳选缓冲液定容至2.5ml,置于磁力架上室温孵育5分钟;小心抓紧磁力架,倾倒分选管,弃去未结合细胞悬液,用2.5ml阳选缓冲液重悬贴合的磁珠与细胞,再次置于磁力架上室温孵育3分钟,再次弃去未结合细胞悬液;从磁力架上取下分选管,往混悬液中加入“释放缓冲液(Release buffer)”,室温孵育3分钟;置于磁力架上室温孵育5分钟;小心抓紧磁力架,倾倒分选管,收集未结合细胞悬液于一干净无菌15ml离心管内,此细胞即为提取的T细胞。
T细胞激活:取上述纯化T细胞5×107个,用抗-CD3/抗-CD28磁珠激活;取抗-CD3/抗-CD28磁珠(ThermoFisher)1.5×108个,用PBS缓冲液(含2mM的EDTA和1%的胎牛血清)重悬,后加入磁极中静置2分钟后小心弃去上清;重复上述过程;取洗后磁珠,磁珠加入T细胞,混匀,放入37度培养两天;两天后取出磁珠,首先将T细胞用移液枪重悬多次,后将细胞悬液置于磁极中,静置两分钟后,弃去管壁上的磁珠;上机计细胞数和存活率。
电转:激活后,得6×107个T细胞,分装12管,每管取5×106个细胞悬液置于离心管中进行离心,转速为200g,5分钟,离心后完全去除培养基待用;分两组,一组6管采用CRISPR-Cas9技术同时将基因组中的TCR(TRAC)和CD7基因敲除,之后再借助腺相关病毒载体将靶向CD7-CD19双靶点CAR基因定点整合入T细胞TRAC基因组中,该方法所制备的CAR-T细胞命名为UCART-7-19-1。另一组6管将基因组中的TCR、B2M和CD7基因敲除,之后再借助腺相关病毒载体将靶向CD7-CD19双靶点CAR基因定点整合入T细胞TRAC基因组中,该方法所制备的CAR-T细胞命名为UCART-7-19-2。配制Lonza电转缓冲液,后加入Cas9 mRNA 10μg和设计合成的sgRNA-0001及sgRNA-0002各1μg或sgRNA-0001、sgRNA-0002和sgRNA-0003各1μg,室温混匀后与细胞沉淀混匀并加入电转杯中,EH-115程序电击,电击完成后立刻加入400μl培养基并放置37度培养箱15分钟,后加入至5ml预热的细胞培养基中。
rAAV转染:电转完成后,隔4小时加入实施例3纯化的rAAV(pAAV-0045),每5ml细胞悬液加入1ml rAAV(滴度为5×1011vg/ml);24小时后,换新培养基,去除rAAV;使用添加了10ng/ml细胞因子白介素2的无血清T细胞扩增培养基对细胞进行扩增,同时进行扩增的还包括仅敲除TCR和CD7基因的T细胞(T-Mock-1)和仅敲除TCR、B2M和CD7基因的T细胞(T-Mock-2);进行双靶点通用CAR-T细胞的纯化收集以及质检:在双靶点通用CAR-T细胞激活后8天,使用CD3磁珠对细胞进行TCR阴性细胞纯化。
2)流式检测
各取细胞1×106个,PBS洗一遍后,分别加入CD19-FITC、CD7-FITC、TCR-PE、CD7-APC和HLA-ABC-APC抗体染色25分钟,PBS再洗一遍,最后用PBS重悬细胞,上流式细胞仪分析,结果如图7a和7b所示。从流式结果中可看出靶向CD7 CAR和靶向CD19 CAR表达相当且超过80%的阳性率(相当于敲入效率),相较于一般的慢病毒转染,效率更高。CD7阴性细胞比率为100%(靶向CD7 CAR杀伤CD7阴性细胞的原因),但意外的是,TCR敲除率也接近100%。
实施例6:TIDE方法检测sgRNA脱靶概率
CRISPR-Cas9基因编辑技术的脱靶问题是一个关注的热点,本发明中潜在脱靶来源于两个因素,分别是:sgRNA特异性和AAV载体介导的基因敲入特异性。本实施例将验证所用到的两个主要sgRNA的特异性,即脱靶概率。
利用网站https://design.synthego.com/分析sgRNA-0001(针对TRAC基因)脱靶位点和sgRNA-0002(针对CD7基因),选取其中编码氨基酸的潜在脱靶位点,分别得到结果如下:
根据这些位点所在DNA序列分别设计引物,这些引物PCR片段大小约为700至1000个碱基(潜在脱靶序列位于PCR片段中间位置),具体引物序列如下:
所检测的细胞为实施例5制备的TCR阴性分选过的通用型靶向CD7-CD19 CAR-T和未经修饰的T对照细胞;提取这两组细胞的基因组DNA(采用天根生物试剂盒);分别利用上述两组脱靶检测引物进行PCR扩增,配制的PCR体系和程序分别如下:
试剂 | 使用量(μl) |
5×primeSTAR GXL缓冲液 | 4 |
dNTP Mix | 1.6 |
引物F | 0.5 |
引物R | 0.5 |
基因组DNA | 2.5 |
灭菌水 | 10.4 |
PrimeSTAR GXL DNA聚合酶 | 0.5 |
总体积 | 20 |
PCR完成后,进行DNA电泳;切胶回收DNA(采用天根生物试剂盒);分别用引物F测序;将测序得到的ab1文件利用网站https://tide.nki.nl/分别成对进行TIDE比对;比对结果分别如图8a和8b所示。
图8a和8b比对结果显示sgRNA-0001和sgRNA-0002未有脱靶发生,分析原因可能在于两点:T细胞较为保守,基因编辑T细胞准确度高;本实施例所采用的递送方式为mRNA(Cas9)电穿孔,CRISPR剪切为一过性,相对病毒和质粒递送更加精确。
实施例7:双靶点CAR-T对靶细胞的杀伤和细胞因子释放检测
采用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测方法来进行细胞杀伤实验。在细胞培养至第10天后,分别吸取效应细胞和靶细胞的细胞悬液到1.5ml EP管中,其中靶细胞的构建是采用高速离心的方式将分别含有CD7或CD19基因的慢病毒载体转导入原本不表达CD7和CD19基因的K562细胞系中,再经过扩大培养构建而成的(细胞鉴定如图9a所示);然后将以上细胞300g,5分钟离心,同时配置含有1%牛血清的1640培养基;离心结束后将细胞中的上清尽可能的多的弃掉,然后均用200μl配置好的培养基重悬细胞,充分混匀后进行细胞计数;根据计数的结果,分别按照效靶比为0.2:1,1:1和5:1配置体系;依次加入圆底96孔板中;添加结束后将细胞板放入离心机,100g,2分钟离心,离心结束后将细胞板置于培养箱中;第二天早上,仅向体积对照、K562-CD7和K562-CD19最大释放的个孔中添加20μl裂解液,该裂解液来自于LDH细胞杀伤实验检测试剂盒(购自Promega公司)之后再将96孔板放入培养箱中孵育45分钟,同时将试剂盒中的底物放置到室温中溶解;孵育结束后每孔吸出50μl液体转移到96孔平底板中,后用排枪快速向每孔中加入50μl试剂盒中的底物,待检测液体和底物在室温反应大约30分钟后,即此时可明显看到最大释放的孔变色,再向每孔中快速加入50μl试剂盒中的终止反应液;然后等待约3分钟后,每孔的颜色稳定下来,用干净的针头将气泡扎破,之后利用酶标仪(Thermo Fisher Multiskan FC型)在490nm处检测每孔的值,最后按照试剂盒说明书的公式对原始数据进行处理。对照细胞以及CAR-T细胞分别对靶细胞K562-CD7/K562-CD19的杀伤效果检测结果如图9b所示,结果显示双靶点通用型CAR-T细胞(无论是否敲除B2M基因)都能有效杀伤CD7阳性或CD19阳性靶细胞,且随效靶比增加而提高。
细胞因子释放检测使用达科为公司的IFN-γ检测试剂盒(货号:1110002)检测,所用实验样品来自上述杀伤实验孵育细胞后的培养基,具体步骤为:将所有试剂充分混匀,避免产生泡沫;根据实验孔(空白和标准品)数量,确定所需的板条数目;加样:100μL/孔加入稀释后的细胞因子标准品至标准品孔,100μL/孔加入样本至样本孔,100μL/孔加入稀释缓冲液R(1×)至空白对照孔;加检测抗体:50μL/孔加入生物素化抗体工作液;混匀后盖上封板膜,室温(18-25℃)孵育2小时;洗板:扣去孔内液体,300μL/孔加入1×洗涤缓冲液工作液,停留1分钟后弃去孔内液体;重复3次,每一次在滤纸上扣干;加酶:100μL/孔加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶工作液,盖上封板膜,室温(18-25℃)孵育20分钟;重复洗板步骤;显色:100μL/孔加入TMB,室温(18-25℃)避光孵育5-30分钟,根据孔内颜色的深浅(深蓝色)来判定终止反应,通常显色10-20分钟可以达到很好的效果;终止反应:100μL/孔迅速加入终止液终止反应;读板:终止后10分钟内,用检测波长450nm读值;经计算,双靶点通用CAR-T细胞杀伤靶细胞K562-CD7和K562-CD19所释放的IFN-γ细胞因子如图9c所示。结果显示双靶点通用CAR-T细胞杀伤靶细胞后可显著释放IFN-γ细胞因子。
实施例8:双靶点通用CAR-T细胞对原代T和NK细胞的杀伤检测
在所采用的双靶方案中,靶向CD7 CAR可主动杀伤宿主病人T和NK细胞,以达到降低排异反应的目的。为验证该思路,在体外检测制备的双靶点CAR-T细胞对原代T和NK细胞对杀伤。
双靶点通用CAR-T细胞的制备:激活细胞:使用CD3/CD28磁珠激活基因型为HLA-A2阴性的健康人T细胞;CAR基因的转导:激活48小时后,采用CRISPR-Cas9技术同时将T细胞基因组中的TCR和CD7基因敲除,之后借助腺相关病毒载体将靶向CD7-CD19双靶点CAR基因定点整合入T细胞TRAC基因组中,该方法所制备的CAR-T细胞命名为UCART-7-19;使用添加了10ng/ml细胞因子白介素2的无血清T细胞扩增培养基对UCART-7-19细胞进行扩增,同时进行扩增的还包括仅敲除TCR和CD7基因的T细胞(T-Mock);双靶点通用CAR-T细胞的纯化收集以及质检,在双靶点通用CAR-T细胞激活后8天,使用CD3磁珠对T-Mock细胞以及UCART-7-19细胞进行TCR阴性细胞纯化,之后取适量目标细胞进行荧光抗体染色后采用流式细胞分析术进行分析,确定所制备的细胞同上述实施例一致。
外周血原代T细胞的提取:复苏外周血单个核细胞,在双靶点通用CAR-T细胞激活后8天,复苏基因型为HLA-A2阳性的六个健康人外周血单个核细胞,并采用台盼蓝染色法检测细胞的数量和活率;提取外周血单个核细胞中的T细胞,使用T细胞磁珠阴选试剂盒(购自STEMCELL公司)对外周血单个核细胞中的T细胞进行纯化和收集;检测外周血T细胞的提取效果,取适量T细胞进行荧光抗体染色(CD7-APC),采用流式细胞分析术进行分析,结果如图10a所示,可以看出90%以上的T细胞表达CD7。
外周血原代NK细胞的提取:复苏外周血单个核细胞,在双靶点通用CAR-T细胞激活后8天,复苏基因型为HLA-A2阳性的两个健康人外周血单个核细胞,并采用台盼蓝染色法检测细胞的数量和活率;提取外周血单个核细胞中的NK细胞,使用自然杀伤细胞磁珠阴选试剂盒(来自Miltenyi公司)对外周血单个核细胞中的自然杀伤细胞进行纯化和收集;检测外周血自然杀伤细胞的提取效果,取适量NK细胞进行荧光抗体染色(CD7-APC,CD56-FITC),采用流式细胞分析术进行分析,结果如图10b所示,可以看出90%以上的NK细胞表达CD7。
双靶点通用CAR-T细胞在体外水平对原代T细胞杀伤效果的检测:效应细胞以及靶细胞的准备,在双靶点通用CAR-T细胞激活后8天,采用台盼蓝染色法检测以下细胞的数量和活率:TCR阴性纯化的T-Mock细胞、TCR阴性纯化的UCART-7-19细胞和外周血原代T细胞,其中纯化的T-Mock和UCART-7-19细胞为效应细胞,外周血原代T(取志愿者1)细胞为靶细胞;效应细胞与靶细胞的混合,按照以下方案进行细胞的混合孵育,孵育培养基为RPMI培养基1640+1%胎牛血清,孵育体积为每孔200ul,每孔中效应细胞活细胞数量为6×104,每孔中靶细胞活细胞数量为4×104,孵育在96孔圆底板中,铺板结束后将96孔板放入离心机,100g,2分钟离心,最后将细胞板放置在5%CO2、37℃细胞培养箱中;效应细胞对靶细胞杀伤效果的检测,孵育16小时后,使用乳酸脱氢酶法体外细胞毒性实验检测试剂盒(来自Promega公司)对杀伤效果进行检测,首先仅向原代T细胞最大释放的孔中添加20ul裂解液,添加结束后再把96孔板放入培养箱中孵育45分钟,同时将试剂盒中的底物放置到室温中溶解,孵育结束后将96孔板放入离心机,100g,2分钟离心,离心结束后每孔吸出50ul上清转移到96孔平底板中,然后用排枪快速向每孔中加入50ul底物,待室温避光反应大约30分钟后,即此时可明显看到最大释放的孔变色,再向每孔中快速加入50ul的终止反应液,避免产生气泡,待室温反应大约3分钟后,利用酶标仪在490nm处检测每个孔的吸光值,最后按照试剂盒说明书的公式对原始数据进行处理,计算出效应细胞对靶细胞的杀伤效率,计算结果如图10c所示,可以看出本方案制备的双靶点通用CAR-T细胞相比对照细胞可显著杀伤异体T细胞。
双靶点通用CAR-T细胞在体外水平对原代NK细胞杀伤效果的检测:效应细胞以及靶细胞的准备,在双靶点通用CAR-T细胞激活后8天,采用台盼蓝染色法检测以下细胞的数量和活率:TCR阴性纯化的T-Mock细胞、TCR阴性纯化的UCART-7-19细胞及外周血原代NK细胞,其中纯化的T-Mock及UCART-7-19细胞为效应细胞,外周血原代NK细胞为靶细胞(取志愿者7);效应细胞与靶细胞的混合,按照下表进行细胞的混合孵育,孵育培养基为RPMI培养基1640+1%胎牛血清,孵育体积为每孔200ul,每孔中效应细胞活细胞数量为6×104,每孔中靶细胞活细胞数量为4×104,孵育在96孔圆底板中,铺板结束后将96孔板放入离心机,100g,2分钟离心,最后将细胞板放置在5%CO2、37℃细胞培养箱中;效应细胞对靶细胞杀伤效果的检测同上。最终计算结果如图10d所示,可以看出本方案制备的双靶点通用CAR-T细胞相比对照细胞可显著杀伤异体NK细胞。
实施例9:双靶点通用CAR-T和对照细胞分别与异体PBMC细胞共孵育检测体外异体排异反应
双靶点通用CAR-T细胞的制备:激活细胞:使用CD3/CD28磁珠激活基因型为HLA-A2阴性的健康人T细胞;CAR基因的转导:激活48小时后,其中一组T细胞采用CRISPR-Cas9技术同时将基因组中的TCR(TRAC)和CD7基因敲除,之后再借助腺相关病毒载体将靶向CD7-CD19双靶点CAR基因定点整合入T细胞TRAC基因组中,该方法所制备的CAR-T细胞命名为UCART-7-19-1,另一组T细胞同时将基因组中的TCR、B2M和CD7基因敲除,之后再借助腺相关病毒载体将靶向CD7-CD19双靶点CAR基因定点整合入T细胞TRAC基因组中,该方法所制备的CAR-T细胞命名为UCART-7-19-2;使用添加了10ng/ml细胞因子白介素2的无血清T细胞扩增培养基对UCART-7-19细胞进行扩增,同时进行扩增的还包括仅敲除TCR和CD7基因的T细胞(T-Mock-1)和仅敲除TCR、B2M和CD7基因的T细胞(T-Mock-2);双靶点通用CAR-T细胞的纯化收集以及质检,在双靶点通用CAR-T细胞激活后8天,使用CD3磁珠对T-Mock细胞以及UCART-7-19细胞进行TCR阴性细胞纯化,之后取适量目标细胞进行荧光抗体染色后采用流式细胞分析术进行分析,结果如图11a所示。
复苏外周血单个核细胞(PBMC),在双靶点通用CAR-T细胞激活后8天,复苏基因型为HLA-A2阳性的两个健康人外周血单个核细胞(PBMC),并采用台盼蓝染色法检测细胞的数量和活率,同时流式细胞检测CD3和CD56阳性细胞比例,结果如图11b所示,可见PBMC中存在原代的T和NK细胞。
异体细胞孵育实验:细胞的准备,在双靶点通用CAR-T细胞激活后8天,采用台盼蓝染色法检测以下细胞的数量和活率:未经任何处理的T细胞、TCR阴性的T-Mock-1细胞、TCR阴性的T-Mock-2细胞、TCR阴性的UCART-7-19-1细胞、TCR阴性的UCART-7-19-2细胞以及外周血单个核细胞(PBMC);细胞的混合孵育:按照下表进行细胞的混合孵育,孵育培养基为RPMI培养基1640+10%胎牛血清+细胞因子白介2(10ng/ml),孵育体积为200ul,孵育在96孔平底板中,铺板结束后将96孔板放置在5%CO2、37℃细胞培养箱中;在孵育第4天时将剩余所有孔的孵育培养基更换成RPMI培养基1640+10%胎牛血清,孵育体积为200ul,之后每隔2-3天按同样的操作进行换液,直至孵育到第12天;孵育效果的检测,在相应的天数,将每组混合实验细胞混匀后取100ul体积转移至1.5ml离心管中进行荧光抗体染色(抗体:HLA-A2-PE、CD7-APC),采用流式细胞分析术进行分析,结果如图11c所示,可以看出共同孵育9天后,对照细胞T-Mock-1和T-Mock-2比例显著少于UCART-7-19-1和UCART-7-19-2,且UCART-7-19-1和UCART-7-19-2组混合细胞均为CD7阴性。
实施例10:双靶点通用CAR-T和对照细胞分别与异体PBMC(去除NK)细胞共孵育检测体外异体排异反应
双靶点通用CAR-T和对照细胞的制备与实施例9为同一批细胞。
去除NK细胞的外周血单个核细胞提取:复苏外周血单个核细胞,在双靶点通用CAR-T细胞激活后8天,复苏基因型为HLA-A2阳性的健康人外周血单个核细胞,并采用台盼蓝染色法检测细胞的数量和活率;去除外周血单个核细胞中的NK细胞,采用CD56微珠联合细胞分选柱的阴性筛选方法(试剂盒来自Miltenyi公司),对去除NK细胞的外周血单个核细胞进行纯化和收集,最终得到的目标细胞命名为PBMC(去除NK)细胞;检测外周血单个核细胞中自然杀伤细胞的去除效果以及CD7的表达情况,取适量PBMC(去除NK)细胞进行荧光抗体染色(抗体:CD3-PC5.5,CD56-FITC,CD7-APC),采用流式细胞分析术分析,结果如图12a所示。
异体细胞孵育实验:细胞的准备,在双靶点通用CAR-T细胞激活后8天,采用台盼蓝染色法检测以下细胞的数量和活率:TCR阴性的T-Mock-1细胞、TCR阴性的T-Mock-2细胞、TCR阴性的UCART-7-19-1细胞、TCR-的UCART-7-19-2细胞以及PBMC(去除NK)细胞;细胞的混合孵育,按照下表进行细胞的混合孵育,孵育培养基为RPMI培养基1640+10%胎牛血清+细胞因子白介素2(10ng/ml),孵育体积为200ul,孵育在96孔平底板中,铺板结束后将96孔板放置在5%CO2、37℃细胞培养箱中;需要注意:在孵育第4天时将剩余所有孔的孵育培养基更换成RPMI培养基1640+10%胎牛血清,孵育体积为200ul,之后每隔2-3天按同样的操作进行换液,直至孵育到第13天;孵育效果的检测在相应的天数,将每组混合实验细胞混匀后取100ul体积转移至1.5ml离心管中进行后续荧光抗体染色(抗体:HLA-A2-PE、CD7-APC),采用流式细胞分析术进行分析,结果如图12b所示,可以看出共同孵育9天后,对照细胞T-Mock-1和T-Mock-2比例显著少于UCART-7-19-1和UCART-7-19-2,且UCART-7-19-1和UCART-7-19-2组混合细胞均为CD7阴性。
实施例11:双靶点通用CAR-T及对照细胞分别与异体NK细胞共孵育检测体外异体排异反应
双靶点通用CAR-T和对照细胞的制备与实施例9为同一批细胞。
外周血自然杀伤(NK)细胞的提取:复苏外周血单个核细胞(PBMC),在双靶点通用CAR-T细胞激活后8天,复苏基因型为HLA-A2阳性的健康人外周血单个核细胞,并采用台盼蓝染色法检测细胞的数量和活率;提取外周血单个核细胞中的NK细胞,使用NK细胞磁珠阴选试剂盒(来自Miltenyi公司)对外周血单个核细胞中的NK细胞进行纯化和收集;检测外周血自然杀伤细胞的提取效果,取适量自然杀伤细胞进行荧光抗体染色(抗体:CD3-PC5.5,CD56-FITC),采用流式细胞分析术进行分析,结果图13a所示。
异体细胞孵育实验:细胞的准备,在双靶点通用CAR-T细胞激活后8天,采用台盼蓝染色法检测以下细胞的数量和活率:TCR阴性的T-Mock-1细胞、TCR阴性的T-Mock-2细胞、TCR阴性的UCART-7-19-1细胞、TCR阴性的UCART-7-19-2细胞以及外周血NK细胞;细胞的混合孵育,按照下表进行细胞的混合孵育,孵育培养基为RPMI培养基1640+10%胎牛血清+细胞因子白介2(10ng/ml),孵育体积为200ul,孵育在96孔平底板中,铺板结束后将96孔板放置在5%CO2、37℃细胞培养箱中;孵育效果的检测,在相应的天数,将每组混合实验细胞混匀后取100ul体积转移至1.5ml离心管中进行后续荧光抗体染色(抗体:HLA-A2-PE、CD7-APC),采用流式细胞分析术进行分析,结果如图13b所示,可以看出共同孵育1天后,对照细胞T-Mock-2(B2M基因敲除)比例显著少于T-Mock-1,UCART-7-19-1和UCART-7-19-2,说明即使B2M基因敲除的UCART-7-19-2也能很好对抗NK细胞的杀伤。
实施例12:双靶点通用CAR-T和对照细胞分别与异体T细胞共孵育检测体外异体排异反应。
双靶点通用CAR-T及对照细胞的制备与实施例9为同一批细胞。
外周血T细胞的提取:复苏外周血单个核细胞,在双靶点通用CAR-T细胞激活后8天,复苏基因型为HLA-A2阳性的健康人外周血单个核细胞,并采用台盼蓝染色法检测细胞的数量和活率;提取外周血单个核细胞中的T细胞,使用T细胞磁珠阴选试剂盒(购自Stemcell公司)对外周血单个核细胞中的T细胞进行纯化和收集;检测外周血T细胞的提取效果,取适量T细胞进行荧光抗体染色(抗体:CD3-PC5.5),采用流式细胞分析术进行分析,结果如图14a所示。
异体细胞孵育实验:细胞的准备,在双靶点通用CAR-T细胞激活后8天,采用台盼蓝染色法检测以下细胞的数量和活率:TCR阴性的T-Mock-1细胞、TCR阴性的T-Mock-2细胞、TCR阴性的UCART-7-19-1细胞、TCR-的UCART-7-19-2细胞以及外周血T细胞;细胞的混合孵育,按照下表进行细胞的混合孵育,孵育培养基为RPMI培养基1640+10%胎牛血清+细胞因子白介2(10ng/ml),孵育体积为200ul,孵育在96孔平底板中,铺板结束后将96孔板放置在5%CO2、37℃细胞培养箱中;需要注意:在孵育第4天时将剩余所有孔的孵育培养基更换成RPMI培养基1640+10%胎牛血清,孵育体积为200ul,之后每隔2-3天按同样的操作进行换液,直至孵育到第13天;孵育效果的检测,在相应的天数,将每组混合实验细胞混匀后取100ul体积转移至1.5ml离心管中进行后续荧光抗体染色(抗体:HLA-A2-PE、CD7-APC),采用流式细胞分析术进行分析,结果如图14b所示,可以看出共同孵育9天后,对照细胞T-Mock-1和T-Mock-2比例显著少于UCART-7-19-1和UCART-7-19-2,且UCART-7-19-1和UCART-7-19-2组混合细胞均为CD7阴性。
实施例13:双靶点通用CAR-T细胞对CD19阳性肿瘤模型的体内疗效检测
目的:双靶点通用型CAR-T细胞治疗B急性淋巴细胞白血病药效观察。
实验材料:品种:NOG小鼠(购自维通利华公司);周龄:6-8周龄;性别:雌性;移植的肿瘤细胞:Raij-GFP-Luciferase细胞;实验细胞:双靶点通用CAR-T及对照细胞的制备与实施例10为同一批细胞。
方法:将小鼠分为两组,分组如下表;每只小鼠注射Raji-GFP-Luciferase细胞3.5×105个(注射方式:尾静脉);Raji细胞注射后第5天,回输2×106个双靶点通用CAR-T及对照细胞(注射方式:尾静脉);观察小鼠后续存活情况,观察周期70天,每周称重记录体重数据。
结果:小鼠生存曲线如图15所示,从图中可看出UCART-7-19-1相比对照细胞组明显延长B急性淋巴细胞白血病小鼠的生存时间,证明双靶点通用型CAR-T对抗CD19阳性肿瘤在体内有显著疗效。
实施例14:双靶点通用CAR-T细胞对CD7阳性肿瘤模型的体内疗效检测
目的:双靶点通用型CAR-T细胞治疗T急性淋巴细胞白血病药效观察。
实验材料:品种:NOG小鼠(购自维通利华公司);周龄:6-8周龄;性别:雌性;移植的肿瘤细胞:CCRF细胞;实验细胞:双靶点通用CAR-T及对照细胞的制备与实施例10为同一批细胞。
方法:将小鼠分为两组,分组如下表;每只小鼠注射CCRF细胞1×106个(注射方式:尾静脉);CCRF细胞注射后第5天,回输2×106个双靶点通用CAR-T及对照细胞(注射方式:尾静脉);观察小鼠后续存活情况,观察周期90天,每周称重记录体重数据。
结果:小鼠生存曲线如图16所示,从图中可看出UCART-7-19-1相比对照细胞组明显延长T急性淋巴细胞白血病小鼠的生存时间,证明双靶点通用型CAR-T对抗CD7阳性肿瘤在体内有显著疗效。
实施例15:双靶点通用CAR-T细胞在异体人源化小鼠模型存留检测
通用型双靶点CAR-T及其它对照细胞制备:激活细胞,使用CD3/CD28磁珠激活基因型为HLA-A2阴性的健康人T细胞;CAR基因的转导,激活48小时后,其中一组T细胞采用CRISPR-Cas9技术同时将基因组中的TCR及CD7基因敲除,之后再借助腺相关病毒载体将靶向CD7-CD19双靶点CAR基因定点整合入T细胞TRAC基因组中,该方法所制备的CAR-T细胞命名为UCART-7-19,另一组T细胞同时将基因组中的TCR及CD7基因敲除,之后再借助腺相关病毒载体将靶向CD19单靶点CAR基因定点整合入T细胞TRAC基因组中,该方法所制备的CAR-T细胞命名为UCART-19,最后一组T细胞只敲除TCR基因,该细胞命名为T;使用添加了10ng/ml细胞因子白介素2的无血清T细胞扩增培养基对三组细胞进行扩增;细胞激活后8天,使用CD3磁珠对三组细胞细胞进行TCR阴性细胞纯化,之后取适量目标细胞进行荧光抗体染色后采用流式细胞分析术进行分析。
小鼠模型建立:共四组实验,每组6只NOG小鼠,每组实验设计如下表;每只NOG小鼠于第一天接受1.2Gy辐照;第二天:每只小鼠尾静脉回输1×107个原代T细胞(经过8天的培养),该细胞基因型为HLA-A2阳性;第六天:每只小鼠通过尾静脉回输2×106个通用型双靶点CAR-T及其它对照细胞;第二、六、十一、十六、二十一、二十六天:每只小鼠内眦采血50μl,裂解红细胞后流式检测CD3/HLA-A2基因表达。整个实验过程如图17a所示。
以回输后HLA-A2阳性细胞比例变化作图(根据上述流式结果),结果如图17b所示,该细胞为受体排异细胞,可看出受体细胞+T和受体细胞+UCART19两组中HLA-A2阳性受体细胞比例随时间呈上升趋势,而受体细胞+UCART7-19组中HLA-A2阳性受体细胞比例于第六天开始迅速下降。
以回输后HLA-A2阴性细胞比例变化作图(根据上述流式结果),结果如图17c所示,该细胞为受体排异细胞,可看出受体细胞+T和受体细胞+UCART19两组中HLA-A2阴性细胞比例随时间呈明显下降趋势,且最终趋近于零,而受体细胞+UCART7-19组中HLA-A2阳性受体细胞比例随时间先呈上升后下降趋势。
综合结果图17b-c,证明相对对照细胞,双靶点通用CAR-T细胞(UCART-7-19)在体内可很好抑制排异细胞及其产生的排斥反应。
实施例16:双靶点通用CAR-T细胞在异体人源化且带CD19阳性荷瘤小鼠模型存留及疗效检测
通用型双靶点CAR-T及其它对照细胞制备:同实施例15。
小鼠模型建立:共四组实验,每组6只NOG小鼠,每组实验设计如下表,每只NOG小鼠于第一天接受1.2Gy辐照;第二天:每只小鼠尾静脉回输1×107个原代T细胞(经过8天的培养),该细胞基因型为HLA-A2阳性;第三天:每只小鼠尾经脉回输3×105个Raji-GFP.FFluc细胞;第六天:每只小鼠通过尾静脉回输2×106个通用型双靶点CAR-T及其它对照细胞;第七至六十天:监测小鼠生存及体重变化。整个实验过程如图18a所示。
小鼠生存曲线如图18b所示,同注射异体T细胞的三组中,对照组回输TCR阴性T细胞小鼠生存时间最短,单靶点CD19 CAR-T细胞(TCR阴性)相对延长了小鼠生存时间,而双靶点CD7-19 CAR-T小鼠存活时间最长。对比同注射异体T细胞的单靶点CD19 CAR-T细胞组,只注射单靶点CD19 CAR-T细胞组小鼠生存时间更长,说明在排异反应存在下单靶点CD19CAR-T疗效受到显著抑制,而双靶点CD7-19 CAR-T则能对抗排异反应并显著延长小鼠生存时间。
实施例17:双靶点通用CAR-T细胞对比其他研究方法制备的靶向CD19通用型CAR-T的抗排异反应检测
分别比较本发明制备的双靶点通用CAR-T细胞、TCR单基因敲除的靶向CD19 CAR-T细胞、TCR/HLA双基因敲除的靶向CD19 CAR-T细胞、TCR/HLA双基因敲除且表达HLA-E的靶向CD19 CAR-T细胞的异体抗排异反应。
靶细胞制备:a.本发明制备的双靶点通用CAR-T细胞:第一天:激活T细胞,使用CD3/CD28磁珠激活基因型为HLA-A2阴性的健康人T细胞;第三天:CAR基因的转导,T细胞激活48小时后,采用CRISPR-Cas9技术同时将T细胞基因组中的TCR及CD7基因敲除,之后再借助腺相关病毒载体将靶向CD7-CD19双靶点CAR基因定点整合入T细胞TRAC基因组中,该方法所制备的CAR-T细胞命名为UCART-7-19。b.TCR单基因敲除的靶向CD19 CAR-T细胞:激活T细胞,使用CD3/CD28磁珠激活基因型为HLA-A2阴性的健康人T细胞;第二天:转染靶向CD19CAR慢病毒载体,MOI为5;第四天:CRISPR-Cas9技术敲除TCR基因,所用到的方法为Cas9mRNA与化学修饰合成的sgRNA共同电转T细胞,所采用的试剂量及电转设备与前述实施例一致,该方法所制备的CAR-T细胞命名为UCART19-TCR-。c.TCR/B2M双基因敲除的靶向CD19CAR-T细胞:激活T细胞,使用CD3/CD28磁珠激活基因型为HLA-A2阴性的健康人T细胞;第二天:转染靶向CD19 CAR慢病毒载体,MOI为5;第四天:CRISPR-Cas9技术敲除TCR和B2M基因,所用到的方法为Cas9 mRNA与化学修饰合成的sgRNA共同电转T细胞,所采用的试剂量及电转设备与前述实施例一致,该方法所制备的CAR-T细胞命名为UCART19-TCR-/B2M-。d.TCR/HLA双基因敲除且表达HLA-E的靶向CD19 CAR-T细胞,第一天:激活T细胞,使用CD3/CD28磁珠激活基因型为HLA-A2阴性的健康人T细胞;第三天:T细胞激活48小时后,采用CRISPR-Cas9技术同时将T细胞基因组中的TCR及B2M基因敲除,之后再借助腺相关病毒载体将靶向CD19 CAR基因和B2M-HLA-E融合基因定点整合入T细胞B2M基因组中,该方法所制备的CAR-T细胞命名为UCART19-E-TCR-/B2M-。
效应细胞制备(获取外周血单个核细胞PBMC):上述靶细胞激活后8天,复苏基因型为HLA-A2阳性的健康人外周血单个核细胞,并采用台盼蓝染色法检测细胞的数量和活率;检测外周血单个核细胞中T细胞以及自然杀伤细胞所占比例情况,取适量外周血单个核细胞进行荧光抗体染色(CD3-PC5.5,CD56-FITC),采用流式细胞分析术进行分析。
细胞孵育:按照下表进行细胞的混合孵育,孵育培养基为RPMI培养基1640+10%胎牛血清+细胞因子白介2(10ng/ml),孵育体积为200ul,孵育在96孔平底板中,铺板结束后将96孔板放置在5%CO2、37℃细胞培养箱中;在孵育第4天时将剩余所有孔的孵育培养基更换成RPMI培养基1640+10%胎牛血清,孵育体积为200ul,之后每隔2-3天按同样的操作进行换液,直至孵育到第12天。
孵育效果的检测:分别在3、6、9、12天将将每组实验细胞混匀后取100ul体积转移至1.5ml离心管中进行后续荧光抗体染色,分别染色抗体HLA-A2-PE和CD7-APC,后采用流式细胞分析术检测结果,总结结果如图19所示。
图19显示本发明采用方案制备的通用CAR-T细胞在和异体PBMC细胞共孵育后,不仅未被排异,反而随着孵育时间不断增加细胞比例,而其他三组通用CAR-T细胞随着孵育时间均出现细胞比例下滑的情况,其中,UCART19-TCR-细胞因受T细胞排异,细胞比例至12天后趋近于无,UCART19-TCR-/B2M-细胞和UCART19-E-TCR-/B2M-细胞由于受NK杀伤在孵育至第3天时细胞比例显著下降,UCART19-E-TCR-/B2M-组细胞由于HLA-E保护,细胞比例要高于UCART19-TCR-/B2M-组。
本实施例说明本发明采用方案制备的通用CAR-T细胞相比其他通用CAR-T细胞制备方案有更好的抗排异反应,提示在成药后具有更好的体内存留时间和药效。
实施例18:定点整合对比慢病毒转导方法制备靶向CD7-CD19双靶点CAR-T的得率。
本发明采用的细胞制备方法为定点整合方式制备靶向CD7-CD19双靶点CAR-T细胞,简要概述为:第一天:激活5×106个原代T细胞;第三天:CRISPR-Cas9敲除TCR和CD7基因,所用到的方法为Cas9 mRNA与化学修饰合成的两个sgRNA(sgRNA-0001和sgRNA-0002)共同电转T细胞,所采用的试剂量及电转设备与前述实施例一致。电转后两小时转染含靶向CD7-CD19双靶点CAR的腺相关病毒载体(如前述实施例),MOI为105;分别于第6、8、10、12、14天进行细胞计数同时流式检测CAR基因表达及TCR和CD7基因敲除效率。
采用慢病毒方式制备靶向CD7-CD19双靶点CAR-T细胞,简要概述为:第一天:激活5×106个原代T细胞;第三天:CRISPR-Cas9敲除TCR及CD7基因,所用到的方法为Cas9 mRNA与化学修饰合成的两个sgRNA(sgRNA-0001和sgRNA-0002)共同电转T细胞,所采用的试剂量及电转设备与前述实施例一致;第四天:转染靶向CD7-CD19双靶点CAR慢病毒载体,MOI为5;分别于分别于第6、8、10、12、14天进行细胞计数同时流式检测CAR基因表达及TCR和CD7基因敲除效率。
结果:两种方式制备的双靶点CAR-T总细胞计数结果如图20a所示,CAR基因表达比例/TCR基因敲除率/CD7基因敲除率分别如图20b-d所示,两种方式制备的有效双靶点通用CAR-T细胞(TCR-/CD7-/靶向CD7-CD19 CAR+)数如图20e所示。可以看出定点整合方式制备的通用CAR-T细胞在总数和有效细胞数量上都超过了慢病毒方式制备的通用CAR-T细胞,特别是有效细胞数是慢病毒方式制备的10倍以上。
制备靶向CD7-CD19双靶点CAR-T细胞难点是靶向CD7 CAR基因对T细胞的“自杀效应”(表达CD7蛋白),因此需要对CD7基因进行敲除,但CD7蛋白在CRISRP-Cas9敲除CD7基因后有个缓慢降解的过程,因此CAR基因的表达需要在CRISPR-Cas9电转后至少两天时间,才能一定程度避免“自杀效应”,因此慢病毒制备方式必须在CRISPR-Cas9电转后至少一天再转染慢病毒才能最大程度避免“自杀效应”但电转后再转染慢病毒效率会极大降低,同时影响细胞状态。而本发明采用的定点整合方式是CRISPR-Cas9敲除CD7基因的同时敲入双靶点CAR基因,敲入的CAR基因表达的时间至少3天,可很好避开“自杀效应”同时不影响敲入效率,因此得率更高,另外,本实施例结果意外发现定点整合的CAR基因表达可随着时间推移进一步提高。
实施例19:双靶点通用CAR-T细胞对比其他研究方法制备的靶向CD19通用型CAR-T的TCR基因敲除效率检测
本发明采用的细胞制备方法如前述实施例,简要概述为:第一天:激活5×106个原代T细胞;第三天:CRISPR-Cas9敲除TCR和CD7基因,所用到的方法为Cas9 mRNA与化学修饰合成的两个sgRNA(sgRNA-0001和sgRNA-0002)共同电转T细胞,所采用的试剂量及电转设备与前述实施例一致。电转后两小时转染含靶向CD7-CD19双靶点CAR的腺相关病毒载体(如前述实施例),MOI为105;分别于电转后第2、4、6、8天通过流式细胞仪检测TCR阴性细胞比例。
另一其他研究(如Cellecits公司)采用的制备方法,简要概述为:第一天:激活5×106个原代T细胞;第二天:转染靶向CD19 CAR慢病毒载体,MOI为5;第四天:CRISPR-Cas9敲除TCR及CD52基因,所用到的方法为Cas9 mRNA与化学修饰合成的两个sgRNA共同电转T细胞,用到的针对TRAC基因的sgRNA为sgRNA-0001,用到的针对CD52基因的sgRNA序列为sgRNA-0004(序列如下表),所采用的试剂量及电转设备与前述本发明方案一致;分别于电转后第2、4、6、8天通过流式细胞仪检测TCR阴性细胞比例。
检测结果:对比本发明与Cellectis方案的TCR敲除效率动态(如图21),本发明的TCR阴性细胞比例随着时间推移,逐渐趋近于100%,而Cellectis方案则基本维持不变。
本发明采用的定点整合双靶点CAR-T制备过程中TCR阴性细胞比例可逐渐趋近于100%,而Cellectis研究的通用CAR-T细胞方案中敲除TCR基因后,TCR阴性细胞基本维持不变(通常不超过90%),推测可能的原因是本发明方案中TCR阳性细胞同时也是CD7阳性细胞,可被双靶点CAR-T细胞清除。由于TCR阳性细胞回输异体后可能导致致命的GvHD效应,故通常在通用型CAR-T细胞制备完成前需要一步TCR阴性细胞的纯化,对于大量的TCR阴性细胞分选是复杂且昂贵的,而且可能导致细胞污染,本发明采用的制备方案可将TCR阴性细胞比例趋近于100%,无需分选,使得通用CAR-T细胞制备更加简单,成本进一步降低。
实施例20:对比双靶点CAR基因分别敲入TRAC、CD7或B2M基因,及其得率分析
为一步法获得双靶点CAR-T细胞,双靶点CAR基因除敲入TRAC基因外,还可以敲入CD7、B2M、PD-1、CD3z、CD3e等通用型CAR-T常编辑基因。本实施例中将双靶点CAR基因分别敲入TRAC、CD7和B2M基因。
敲入CD7和B2M基因组的模版DNA设计如图22a和22b所示,其中敲入CD7基因组的模版DNA包含:左同源臂、外源启动子、双靶点CAR基因、PolyA基因和右同源臂;敲入B2M基因组的模版DNA包含:左同源臂、双靶点CAR基因、PolyA基因和右同源臂。敲入CD7基因组DNA的双靶点CAR基因依赖外源启动子转录,而敲入B2M基因组DNA的双靶点CAR基因依赖B2M基因启动子转录。各基因序列如下表:
模版DNA设计完成后,进行基因合成;将合成基因SEQ ID NO:48-53分别克隆至腺相关病毒载体pAAV-MCS,具体步骤同实施例2;包装相关腺相关病毒载体,具体步骤同实施例3;敲入B2M或CD7的双靶点CAR-T细胞制备:本制备方法如前述实施例,简要概述为:第一天:激活1.5×107个原代T细胞;第三天:CRISPR-Cas9敲除TCR、B2M和CD7基因(分两管,每管5×106个激活T细胞),所用到的方法为Cas9 mRNA与化学修饰合成的三个sgRNA(sgRNA-0001,sgRNA-0002和sgRNA-0003)共同电转T细胞,所采用的试剂量及电转设备与前述实施例一致。电转后两小时分别转染腺相关病毒载体pAAV-0045、pAAV-0048和pAAV-0051,MOI为105;分别于分别于第10天进行流式检测双靶点CAR基因表达及TCR,HLA-ABC和CD7基因敲除效率。
结果如图22c所示,可以看出当双靶点CAR基因敲入TRAC位点时,CAR阳性比例最高;但敲入CD7或B2M基因组位点制备的阳性双靶点CAR细胞比例仍远高于慢病毒方法制备(高约10倍);TCR、HLA-ABC和CD7基因的敲除率在三组细胞中相当,都超过90%。
该结果证明靶向CD7-CD19双靶点CAR-T细胞采用定点整合方式(敲入TRAC、CD7或B2M基因组)制备得率相对慢病毒方法更高,且可以敲入/敲除反应一步完成,其中,敲入TRAC基因组位点得率最高。
Claims (15)
1.一种制备靶向CD7和CD19的双靶点通用型CAR-T细胞的方法,所述方法包括:将基因编辑物质递送至T细胞以剪切TRAC和CD7基因组DNA或剪切TRAC、CD7和B2M基因组DNA,以及使用重组腺相关病毒递送模版DNA以将靶向CD7-CD19双靶点CAR基因定点整合入TRAC、CD7或B2M基因组位点。
2.根据权利要求1所述的方法,所述方法还包括:
递送所述基因编辑物质之前的T细胞激活,
CAR-T细胞扩增,和/或
细胞冻存。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中使用选自CRISPR-Cas9、ZFN、ARCRS、TALEN和megaTAL的基因编辑方法递送所述基因编辑物质,优选CRISPR-Cas9;
所述基因编辑物质是质粒、mRNA、蛋白质、慢病毒、逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒,优选mRNA;并且
递送所述基因编辑物质的方式包括使用脂质体、磷酸钙、DEAE-葡聚糖、电穿孔、显微注射或基因枪的转染方法,优选电穿孔转染。
4.根据权利要求3所述的方法,其中CRISPR-Cas9基因编辑物质包括Cas9 mRNA或Cas9蛋白和sgRNA,
优选地,sgRNA是化学修饰的,其中化学修饰包括2-O-甲基化、3-硫代以及2-O-甲基化结合3-硫代,
优选地,化学修饰发生在sgRNA的5’和3’端的1至10个碱基,
优选地,sgRNA的5’和3’端3个碱基同时进行2-O-甲基化和3-硫代修饰,
优选地,针对TRAC基因的sgRNA序列如SEQ ID NO:1所示,针对CD7基因的sgRNA序列如SEQ ID NO:2所示,针对B2M基因的sgRNA序列如SEQ ID NO:3所示。
5.根据权利要求3所述的方法,其中Cas9包括SpCas9、SaCas9、SpCas9-HF、eSpCas9、xCas9和cpf1,优选SpCas9,更优选其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示,
优选地,Cas9蛋白的N端或C端偶联有一个或多个NLS入核信号肽,更优选地NLS入核信号肽序列如SEQ ID NO:5所示。
6.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述模版DNA包括左同源臂DNA、敲入的外源DNA、右同源臂DNA。
7.根据权利要求6所述的方法,其中左同源臂DNA和右同源臂DNA分别具有10至2000bp的片段长度,优选地300bp、600bp或1000bp的片段长度,
优选地,当双靶点CAR基因敲入TRAC基因组位点时,同源臂序列分别如SEQ ID NO:6-11所示;当双靶点CAR基因敲入CD7基因组位点时,同源臂序列分别如SEQ ID NO:12-17所示;当双靶点CAR基因敲入B2M基因组位点时,同源臂序列分别如SEQ ID NO:18-23所示。
8.根据权利要求6所述的方法,其中当双靶点CAR基因敲入TRAC基因组位点时,所述敲入的外源DNA包含剪切肽或内部核糖体进入位点基因、双靶点CAR基因和polyA,其中所述剪切肽或内部核糖体进入位点基因选自P2A、T2A和IRES,优选P2A或T2A,更优选P2A和T2A的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:24-25所示;
当双靶点CAR基因敲入CD7基因组位点时,所述敲入的外源DNA包含外源启动子基因、双靶点CAR基因和polyA,其中所述外源启动子选自EF1、CMV、PGK、MSCV和SFFV,优选EF1,更优选地EF1的DNA序列如SEQ ID NO:26所示;
当双靶点CAR基因敲入B2M基因组位点时,所述敲入的外源DNA包含双靶点CAR基因和polyA;
其中polyA是miniPolyA或bGHpA polyA,优选地miniPolyA和bGHpA polyA的DNA序列分别如SEQ ID NO:27-28所示。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述双靶点CAR基因包含信号肽、抗体scFv序列、铰链区、跨膜区、共刺激区和激活区。
10.根据权利要求9所述方法,其中所述抗体scFv序列包含通过连接肽连接的靶向CD7抗体scFv序列和靶向CD19抗体scFv序列,优选地靶向CD7抗体scFv序列和靶向CD19抗体scFv序列的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:29-30所示,
其中所述连接肽是GGGGS或EAAAK型连接肽,优选EAAAKEAAAKEAAAK或GGGGSGGGGSGGGGS连接肽,更优选所述连接肽的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:33-34所示。
11.根据权利要求9所述方法,其中
所述信号肽选自CD8、IL-2和GM-CSF信号肽结构域,优选CD8信号肽,更优选CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:35所示;
所述铰链区选自IgG1、IgG4、IgD或CD8铰链结构域,优选CD8铰链结构,更优选CD8铰链结构的氨基酸序列如SEQ ID NO:37所示;
所述跨膜区选自CD3、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD33、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD152、CD154或PD1跨膜结构域,优选CD8跨膜结构,更优选CD8跨膜结构的氨基酸序列如SEQ ID NO:39所示;
所述共刺激区选自CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54、CD83、CD134、CD137、CD150、CD152、CD223、CD270、CD273、CD274、CD278、CARD11、NKD2C、DAP10、LAT、SLP76、ZAP70或4-1BB共刺激结构域,优选4-1BB共刺激结构,更优选4-1BB共刺激结构的氨基酸序列如SEQ IDNO:41所示
所述激活区为CD3ζ激活结构域,优选CD3ζ激活结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO:43所示。
12.根据权利要求9所述的方法,其中当双靶点CAR基因敲入TRAC基因组位点时,所述模版DNA序列如SEQ ID NO:45-47或SEQ ID NO:55-57所示;
当双靶点CAR基因敲入CD7基因组位点时,所述模版DNA序列如SEQ ID NO:48-50或SEQID NO:58-60所示;
当双靶点CAR基因敲入B2M基因组位点时,所述模版DNA序列如SEQ ID NO:51-53或SEQID NO:61-63所示。
13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法制备的靶向CD7-CD19的双靶点通用型CAR-T细胞。
14.根据权利要求13所述的靶向CD7-CD19的双靶点通用型CAR-T细胞用于制备药物的用途,所述药物用于治疗疾病。
15.根据权利要求14所述的用途,其中所述疾病包括白血病、实体肿瘤和自身免疫疾病,
优选地所述白血病选自急性B淋巴细胞白血病、急性T淋巴细胞白血病、NK/T细胞淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病和多发性骨髓瘤,
优选地所述实体肿瘤选自肺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌、结直肠癌、前列腺癌、胰腺癌、脑胶质瘤、食管癌、胆管癌、子宫内膜癌、卵巢癌、间皮瘤和胸腺癌。
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