CN113122504A

CN113122504A - 一种纯化ucart细胞的方法与应用

Info

Publication number: CN113122504A
Application number: CN202011626153.9A
Authority: CN
Inventors: 袁鹏飞; 王飞; 牛立超; 付建强; 谷丰
Original assignee: Edigene Beijing Biotechnology Co ltd
Current assignee: Guangzhou Ji Yin Medical Technology Co ltd
Priority date: 2019-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2021-07-16

Abstract

一种纯化通用型人类CAR‑T细胞的方法，包括：(i)通过基因编辑技术破坏所述人类CAR‑T细胞中：14号染色体第23016448位至第23016490位的TRAC基因区域；和15号染色体第45003745位至第45003788位的B2M基因区域；(ii)然后将靶向TCRα/β的mRNA导入经基因编辑后的CAR‑T细胞；(iii)再将经过上述处理的CAR‑T细胞群体进行体外培养。

Description

一种纯化UCART细胞的方法与应用

技术领域

本申请涉及靶向T细胞的瞬时表达的CAR，具体涉及经过体外培养加入靶向肿瘤细胞的异体CAR-T细胞结合基因编辑的双基因敲除技术，在培养过程中加入能够瞬时表达靶向TCRα/β的mRNA,从而获得制备TCRα/β阴性在约97％以上的通用型CAR-T细胞的方法。

背景技术

恶性肿瘤已成为严重威胁身体健康和生命安全的疾病，肿瘤的治愈一直是人类的梦想。近年来，肿瘤免疫疗法获得了广泛的关注，尤其是CAR-T(Chimeric AntigenReceptor T Cells)技术的出现使得对肿瘤的控制得到了里程碑式的发展。从1989年CAR-T技术首次应用，到2012年宾夕法尼亚大学Carl June教授带领团队治愈的EmilyWhitehead，再到2017年FDA肿瘤药物专家咨询委员会(ODAC)以10:0的压倒优势投票结果一致推荐批准诺华CAR-T药物CTL019用于青少年晚期B细胞急性淋巴性白血病(r/rAll)治疗。

一般地，传统的CAR-T技术T细胞主要来源于患者自身，在GMP环境下经过体外分离T细胞、激活、CAR导入、培养扩增，最后经过质控回输回患者体内。由于患者自身条件的影响导致不适合采血或采血分离T细胞后扩增难的问题会随之而来。当患者病情危急，从T细胞的分离到CAR-T的回输，整个流程的等待时间也将是自体回输要面临的重大问题。这些问题给CAR-T技术的广泛应用带来了局限性，因此目前CAR-T细胞治疗的一个重要研究方向是如何使用一个健康献血者的T细胞制备大量的CAR-T细胞，满足患者的临床使用。这一技术的建立将极大降低CAR-T疗法的成本，可以更好的保证统一制备的细胞质量，而且患者在需要时可以马上得到CAR-T细胞进行治疗。同时异体CART治疗也尤其弊端，比如容易引起GvHD，而现有技术中利用抗体纯化技术手段成本高，工艺复杂，耗时耗力。因此新的纯化方法的建立显得尤为紧迫。

在本说明书的整篇文本中引用了数篇文件。此处的每篇文件(包括任何期刊文章或摘要、公开或未公开的专利申请、授权专利、制造商的说明书、使用说明等)通过题述并入本文。然而，并非认可此处引用的文件事实上是本发明的现有技术。

发明内容

实施本申请的技术方案以解决本领域中存在的上述问题。本申请利用CRISPR/Cas9系统对CAR-T细胞进行双基因(TRAC和B2M)敲除，其敲除效率高达80％以上。然而仍有将近20％的阳性CAR-T细胞表达能够引起GvHD的TCRα/β。因此利用电转的递送平台，将靶向TCRα/β的CAR瞬转进CAR-T细胞中，既可以省去纯化的步骤，又节省了人力，物力和财力。同时，针对靶向T细胞TCRα/β的靶点，本申请为首次发表，这为建立基因编辑技术联合过继免疫在肿瘤及病毒感染性疾病(例如HIV/AIDS)的治疗提供了方法，并为相关疾病治疗的研究奠定了坚实的技术基础。

因此，本发明提供了利用基因编辑技术，例如CRISPR/Cas9系统对CAR-T细胞进行高效的敲除，从而获得基因编辑后的CAR-T细胞，同时利用电转传递系统将表达靶向TCRα/β的CAR瞬转进入CAR-T细胞(TCRα/βCAR除外)中，此时瞬转的CAR可以清除TCRα/β阳性群细胞，从而直接获得通用型CAR-T细胞的方法。该方法提供了除传统方法去除TCRα/β阳性细胞群外的一种既省钱、又省力省时的方法。

具体地，本申请提供了以下各项：

1.一种纯化通用型人类CAR-T细胞的方法，该方法包括：

(i)通过基因编辑技术破坏所述人类CAR-T细胞中的TRAC基因组区域和B2M基因组区域；

(ii)然后将靶向TCRα/β的mRNA导入经步骤(i)基因编辑后的CAR-T细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述靶向TCRα/β的mRNA通过瞬时转染导入CAR-T细胞中，并不嵌入基因组内。

3.根据权利要求1或2所述的方法，还包括，将经过所述方法获得的细胞群体进行体外培养适当时间，以清除TCRα/β阳性细胞。

4.根据权利要求3的方法，其中，所述适当时间为4至8天，优选5至7天，最优选6天。

5.根据权利要求1～4中任一项所述的方法，其中，所述TRAC基因组区域包括人第14号染色体第23016448位至第23016490位的基因组区域，并且所述B2M基因组区域包括人第15号染色体第45003745位至第45003788位的基因组区域。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的方法，其中，所述靶向TCRα/β的mRNA所编码的是抗TCRα/β的scFv分子，其中，

抗TCRα/β的scFv分子的轻链可变区如SEQ ID NO：19(QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSATSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIY DTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK)所示；以及

抗TCRα/β的scFv分子的重链可变区如SEQ ID NO：20(EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYKFTSYVMHWVKQKPGQGLE WIGYINPYNDVTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVHYCARGSYYDYDGFVYWGQGTLVTVSA)所示。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，scFv分子的轻链可变区和scFv分子的重链可变区通过接头连接，所述接头为包含(G)n(S)m的氨基酸序列，其中，n为1-20的正整数，m为1-10的正整数。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述接头序列为SEQ ID NO：21所示的序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS。

9.根据权利要求1～8中任一项所述的方法，其中所述靶向TCRα/β的mRNA所编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：14所示的序列QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSATSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYKFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDVTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVHYCARGSYYDYDGFVYWGQGTLVTVSA。

10.根据权利要求1～9中任一项所述的方法，其中所述TRAC基因组区域和B2M基因组区域通过同源重组、锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术破坏。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9基因编辑技术。

12.根据权利要求11所述的方法，其中：

(i)将包含靶向所述TRAC基因组的向导RNA(sgRNA)导入该T细胞以实现对所述TRAC基因组区域的编辑；和/或

(ii)将包含靶向所述B2M基因组的向导RNA(sgRNA)导入该T细胞以实现对所述B2M基因组区域的编辑。

13.根据权利要求12所述的方法，其中:

(i)靶向所述TRAC基因组的向导RNA(sgRNA)具有选自SEQ ID NOs：2-5中的任一序列；

(ii)靶向所述B2M基因组的向导RNA(sgRNA)具有选自SEQ ID NOs：6-13中的任一序列。

14.根据权利要求13所述的方法，其中：

(i)将编码所述TRAC基因组的sgRNA和Cas9编码核苷酸共同或分别导入T细胞以实现对所述TRAC基因组区域的编辑；和/或

(ii)将编码所述B2M基因组的sgRNA和Cas9编码核苷酸共同或分别导入该T细胞以实现对所述B2M基因组区域的编辑。

15.根据权利要求12～14中任一项所述的方法，其中所述sgRNA经过化学修饰。

16.根据权利要求15所述的方法,其中所述化学修饰包括2’-O-甲基修饰类或核苷酸间3’硫代修饰。

17.根据权利要求16所述的方法,其中所述化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。

18.根据权利要求14～17中任一项所述的方法，其中，通过电转方式将所述sgRNA与Cas9编码核苷酸序列共同导入该T细胞。

19.权利要求18中所述的方法，其中，所述电转条件选自如下条件中的任一项：150-250V，0.5-2ms；150V，2ms；160V，2ms；170V，2ms；180V，2ms；190V，1ms；200V，1ms；210V，1ms；220V，1ms；230V，1ms；240V，1ms；和250V，0.5ms。

20.根据权利要求1～19中任一项所述的方法，其中所述TRAC和B2M分别被敲除的效率为90％以上；同时被敲除的效率在75％以上。

21.根据权利要求1～20中任一项所述的方法，其中，经所述方法获得的细胞群体中，TCR阴性细胞比率为98％或99％以上。

22.一种纯化的通用型人类CAR-T细胞，其中：

(i)所述CAR-T细胞中的TRAC基因组区域和B2M基因组区域通过基因编辑而破坏；

(ii)该CAR-T细胞中导入了靶向TCRα/β的mRNA。

23.根据权利要求22所述的通用型人类CAR-T细胞，其低水平表达或不表达选自以下的一项或多项蛋白：TCRα/β、1类HLA蛋白、PD-1，TIM3，和LAG3。

24.包含如权利要求22或23任一项的通用型人类CAR-T细胞的生物制品。

25.根据权利要求23的生物制品，其中98％或99％以上的所述通用型人类CAR-T细胞为TCR阴性。

26.如权利要求22或23任一项所述的通用型人类CAR-T细胞或如权利要求24或25任一项所述的生物制品在制备治疗受试者疾病的药物中的用途。

27.一种治疗受试者疾病的方法，包括给药受试者有效量的如权利要求22或23所述的通用型人类CAR-T细胞或如权利要求24或25所述的生物制品。

28.根据权利要求27的方法，其中所述疾病为肿瘤。

29.根据权利要求28的方法，其中所述肿瘤为血液系统肿瘤。

30.根据权利要求29的方法，其中所述肿瘤为淋巴瘤或白血病。

附图说明

图1展示了细胞电转后的生长活率变化情况，T细胞和DKO CAR-T细胞活率较好，并且随着培养时间的增长细胞活率达到90％以上，而DKO CAR-T+mRNA第二次电转后，其活率明显降低，随培养时间增加其活率逐渐恢复，MIX(DKO CAR-T:DKO CAR-T+mRNA 1:1)细胞在第六天混合培养后，其活率也显著下降，随培养时间增加活率逐渐恢复。培养至14天活率基本达到90％以上。

图2显示了细胞电转后各组的生长情况，T cell前期增殖速度最快13天后增殖速度缓慢，DKO CAR-T生长趋势基本和T cell相同，培养至14天，其增殖速度基本保持一致。DKO CAR-T+mRNA为经过编辑过的T cell培养至第六天进行2次电转，其生长速度较慢。MIX为培至第六天的DKO CAR-T和二次电DKO CAR-T+mRNA1:1混合培养，混合培养后其增殖速度在DKOCAR-T和DKO CAR-T+mRNA二者之间。

图3展示了导入靶向TCRα/β-CAR的mRNA后基因编辑CAR-T细胞经过培养后的表型分析。通过结果可以看出加入TCRα/β-CAR的DKO-T细胞经过培养后，其TCRα/β阴性比例细胞不少于99％。

图4展示了MIX(DKO CAR-T:DKO CAR-T+mRNA 1:1)培养后其TCRα/β阳性变化情况，混合培养2天后，其TCRα/β阴性比例细胞不少于99％。

图5展示了用STEMCELL对经TRAC/B2M(DKO CAR-T)敲除的T细胞进行筛选纯化其纯化回收率，从图可知其回收率较低，其回收率基本在20％-30％之间。

图6展示了T细胞、CAR-T及DKO CAR-T+mRNA细胞杀伤功能的验证与结果比较。该实验中，T及CAR-T及DKO CAR-T+mRNA细胞为效应细胞，按照效靶比为10:1、5:1、2.5:1、1.25:1、0.625:1进行体外杀伤实验。

图7展示了T细胞、CAR-T及DKO CAR-T+mRNA细胞IFN-γ因子释放。该实验中，以Raji为靶细胞，T细胞、CAR-T及DKO CAR-T+mRNA细胞为效应细胞，按照效靶比为10:1、5:1、2.5:1、1.25:1、0.625:1进行体外共培养后，取1.25:1上清对其中IFN-γ进行检测。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本申请做进一步的详细描述，给出的实施例是为了能够更透彻地理解本发明，并且能够将本发明的范围完整的传达给本领域的技术人员。

需要说明的是，在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定组件。本领域技术人员应可以理解，技术人员可能会用不同名词来称呼同一个组件。本说明书及权利要求并不以名词的差异来作为区分组件的方式，而是以组件在功能上的差异来作为区分的准则。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”或“包括”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。说明书后续描述为实施本发明的较佳实施方式，然所述描述乃以说明书的一般原则为目的，并非用以限定本发明的范围。本发明的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。

本申请的第一方面提供了一种纯化通用型人类CAR-T细胞的方法，在一个具体的实施方式中，该方法包括：

“CAR-T”为“嵌合抗原受体T细胞”的简写形式，其中，嵌合抗原受体(CAR)是CAR-T的核心部件，赋予T细胞HLA非依赖的方式识别靶细胞(如肿瘤)抗原的能力，这使得经过CAR改造的T细胞相较于天然T细胞表面受体TCR能够识别更广泛的目标。在一些实施中，靶向肿瘤的CAR的设计中包括一个肿瘤相关抗原(tumor-associated antigen，TAA)结合区(例如，通常来源于单克隆抗体抗原结合区域的scFV段)，一个胞外铰链区，一个跨膜区和一个胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。

“通用型CAR-T细胞”指能够靶向特异的靶细胞(如肿瘤)相关标志并且细胞表面TCR和MHC功能失活，可以降低同种异体细胞治疗引起的免疫排斥反应的CAR-T细胞。

自体细胞的CAR-T治疗需要抽取血液分离病人自身T淋巴细胞制备，一方面由于病人自身病情以及T淋巴细胞状态不同CAR-T生产过程影响因素较多不能标准化生产影响安全性，另一方面有些病人自体T淋巴细胞经过化疗后活性和数量不足，或受到肿瘤环境影响导致T淋巴细胞活性和增殖能力受限，这样的细胞在制备CAR-T时往往难度较大，治疗的安全性和有效性受到影响；或者在CAR-T细胞制备过程中若出现突发状况已准备细胞不能及时回输给病人也会影响治疗效果，甚至于受到自体T淋巴细胞状态影响有些肿瘤患者不能接受自体的CAR-T细胞过继治疗；可用于同种异体治疗的通用型CAR-T或通用型T淋巴细胞在上述情况下便占有很大的优势。

过继细胞疗法(Adoptive cellular therapy,ACT)、过继免疫疗法(adoptiveimmunotherapy)，例如肿瘤过继免疫疗法(tumor adoptive immunotherapy)，是指将免疫细胞在体外处理，例如加入特异性抗原，对免疫细胞表达的分子进行改造或利用细胞因子对其进行刺激等方法，筛选并大量扩增具有高度特异性的靶细胞(如肿瘤)杀伤性免疫效应细胞，然后输给患者，杀灭靶细胞(如肿瘤)的一种治疗方法，是一种被动免疫治疗。

在本申请中，T细胞来源于健康人。在一些实施方案中，T细胞来源于患者，如癌症患者，例如化疗或放射治疗前的癌症患者。在一些实施方案中，T细胞来源如脐带血，骨髓，或外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)。在一些实施方案中，T细胞来源于干细胞，例如各个分化阶段的造血干细胞。本申请中所述的制备方法可以用于在例如PBMC或干细胞中敲除TRAC,B2M并进一步培养，分化，和/或提纯出相应的基因改造的T细胞。

本申请中的“T细胞受体(TCR)”为所有T细胞表面的特征性标志，其与CD3结合，形成TCR-CD3复合物。TCR由α、β两条肽链组成，每条肽链又可分为可变区(V区)，恒定区(C区)，跨膜区和胞质区。TCR分子属于免疫球蛋白超家族，其抗原特异性存在于V区；V区(Vα、Vβ)又各有三个高变区CDR1、CDR2、CDR3，其中以CDR3变异最大，直接决定了TCR的抗原结合特异性。在TCR识别MHC-抗原肽复合体时，CDR1，CDR2识别和结合MHC分子抗原结合槽的侧壁，而CDR3直接与抗原肽相结合。TCR分为两类：TCR1和TCR2；TCR1由γ和δ两条链组成，TCR2由α和β两条链组成。外周血中，90％-95％的T细胞表达TCR2；而且任一T细胞只表达TCR2和TCR1之一。

“β2微球蛋白(B2M)”是细胞表面人白细胞抗原(HLA)的β链(轻链)部分，是分子质量为11800，由99个氨基酸组成的单链多肽。

在本申请一个具体的实施方式中，所述靶向TCRα/β的编码核苷酸为mRNA，如含有ARCA帽的mRNA。在一些实施方案中，利用电转的递送系统，将该mRNA递送到CAR-T细胞中。瞬时表达的靶向TCRα/β的蛋白可以特异性识别TCRα/β阳性的细胞，在培养的过程中达到清除TCRα/β阳性细胞，避免GvHD的产生的效果。

瞬时转染(transient transfection)是将mRNA导入真核细胞的方式之一。在瞬时转染中，重组mRNA导入感染性强的细胞系以获得目的基因暂时但高水平的表达。转染的mRNA不必整合到宿主染色体。通过瞬转方式导入的mRNA是游离在细胞中，并不嵌入基因组中，可在比稳定转染较短时间内收获转染的细胞，可以在较短的时间内获得更高的表达效率。瞬时表达法具有很多优点：如操作简易和周期短，表达效率高，安全高效，不需要筛选基因等。

“移植物抗宿主反应(GvHD)”是指由于供受体之间存在免疫遗传学差异，例如，一方面，当供体细胞，例如具有免疫活性的供体的T淋巴细胞，在进入受体病人体内并增殖到一定程度后，将受体病人的正常细胞或组织误认为靶标进行攻击从而产生的反应。另一方面，作为异体细胞，受体体内的正常免疫系统也可能会对其进行清除产生“宿主抗移植物反应(HVGR)”。

HVGR与GVHR相关基因包含TCR、HLA分子相关基因，这些基因同时敲除的T淋巴细胞在回输入同种异体病人时不会引起移植物抗宿主病(GvHD)，因此可以称为“通用型T细胞”。例如，单个TRAC基因是编码TCRα链的基因与编码TCRβ的两个TRBC基因形成完整的有功能的TCR复合物，敲除TRAC是可以致使TCR失活，而B2M为MHCⅠ相关基因。这两个基因同时敲除的T淋巴细胞在回输入同种异体病人时不会引起移植物抗宿主病(GvHD)。

在一个具体的实施方式中，所述方法还包括，将获得的细胞群体进行体外培养适当的时间，以清除TCRα/β阳性表达的细胞群。在一个优选的实施方式中，体外培养的时间为4至8天，进一步优选为5至7天，最优选为6天。

在一个具体的实施方式中，所述靶向TCRα/β的mRNA所编码的是抗TCRα/β的scFv分子。“scFv”即指单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker，即接头)连接而成的抗体。scFv分子可以理解为CAR分子的胞外部分，其由轻链可变区、接头和重链可变区共同组成。

在一个具体的实施方式中，抗TCRα/β的scFv分子的轻链可变区如SEQ ID NO：19

(QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSATSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK)所示；抗TCRα/β的scFv分子的重链可变区如SEQ ID NO：20

(EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYKFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDVTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVHYCARGSYYDYDGFVYWGQGTLVTVSA)所示。

进一步的，scFv分子的轻链可变区和scFv分子的重链可变区通过接头连接，所述接头为包含(G)n(S)m的氨基酸序列，其中，n为1-20的正整数，m为1-10的正整数。具体地，n可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20；而m可以为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。在此，G为甘氨酸的缩写形式，也可以简写为Gly；在此，S为丝氨酸的缩写形式，也可以简写为Ser。

进一步的，所述接头序列为SEQ ID NO：21所示的序列GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS。

在一个具体的实施方式中，所述靶向TCRα/β的mRNA所编码的氨基酸序列为SEQ IDNO：14所示的序列

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSATSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELKGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYKFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDVTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVHYCARGSYYDYDGFVYWGQGTLVTVSA。

本申请的另一方面提供了一种制备基因编辑的CAR-T细胞的方法，包括：通过基因编辑技术破坏所述CAR-T细胞中：

(i)14号染色体第23016448位至第23016490位的TRAC基因组区域；(ii)15号染色体第45003745位至第45003788位的B2M基因组区域。

在一个具体的实施方式中，所述TRAC基因组区域、B2M基因组区域均被编辑。

在一个具体的实施方式中，所述TRAC基因组区域和B2M基因组区域通过同源重组、锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术破坏。

在又一具体实施方式中，所述基因编辑技术为CRISPR/Cas9技术。

如本申请使用的，“CRISPR/Cas”是一种基因编辑技术，包括但不限于各种自然存在或人工设计的CRISPR/Cas系统,如CRISPR/Cas9系统。自然存在的CRISPR/Cas系统(Naturally occurring CRISPR/Cas system)是细菌和古细菌在长期演化过程中形成的一种适应性免疫防御，可用来对抗入侵的病毒及外源DNA。例如，CRISPR/Cas9的工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计tracrRNA和crRNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(singleguide RNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶能够共定位RNA、DNA和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。CRISPR/Cas系统可使用一类，二类或三类Cas蛋白。本发明的一些实施方式中，所述方法使用Cas9。其他适用的CRISPR/Cas系统包括但不限于WO2013176772，WO2014065596，WO2014018423，US8,697,359中所描述的系统和方法。

在一个具体的实施方式中，本申请提供了一种制备基因编辑的CAR-T细胞的方法，包括通过基因编辑技术破坏所述CAR-T细胞中：(i)与选自SEQ ID NOs：2-5中任一的序列互补的TRAC基因组靶核苷酸序列；(ii)与选自SEQ ID NOs：6-13中任一的序列互补的B2M基因组的靶核苷酸序列。其中，所述TRAC基因组区域和B2M基因组区域通过同源重组、锌指核酸酶的基因编辑技术、TALEN基因编辑技术或CRISPR/Cas基因编辑技术破坏。

在一个具体的实施方式中，本申请提供了一种制备基因编辑的T细胞的方法，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术破坏所述T细胞中:

(i)与SEQ ID NO：2的序列互补的TRAC基因组的靶核苷酸序列；

(ii)与SEQ ID NO：8的序列互补的B2M基因组的靶核苷酸序列。

在一个具体的实施方式中，本申请提供了一种制备基因编辑的CAR-T细胞的方法，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术破坏所述T细胞中:

(i)与SEQ ID NO：2的序列互补的TRAC基因组的靶核苷酸序列；

(ii)与SEQ ID NO：8的序列互补的B2M基因组的靶核苷酸序列。

在一个具体的实施方式中，本申请提供了一种制备基因编辑的T细胞的方法，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术破坏所述CAR-T细胞中:

(i)与SEQ ID NO：3的序列互补的TRAC基因组的靶核苷酸序列；

(ii)与SEQ ID NO：7的序列互补的B2M基因组的靶核苷酸序列。

进一步的，在一个具体的实施方式中，本申请提供一种制备基因编辑的CAR-T细胞的方法，包括：

在一个具体的实施方式中，该方法包括将编码所述sgRNA和编码Cas9的核苷酸序列共同或分别导入所述T细胞。

在本申请中，“sgRNA(single guide RNA)”和“gRNA(guide RNA)”或可以是“单指导RNA”、“合成的指导RNA”或“指导RNA”可互换使用。本申请的sgRNA包含靶向目标序列的指导序列(guide sequence)。

在一个具体的实施方式中，sgRNA靶向TCR2的α和/或β链的恒定区的编码基因，从而破坏CAR-T细胞表面TCR的结构，使该分子失去功能。

在一个具体的实施方式中，sgRNA靶向β2微球蛋白(B2M)的编码基因，例如靶向B2M蛋白编码基因的第一个外显子区域，从而破坏B2M的结构，使该分子失去功能。

进一步的，在一个具体的实施方式中，提供一种制备基因编辑的CAR-T细胞的方法，包括：(i)将包含选自SEQ ID NOs：2-5中任一序列的sgRNA导入T细胞以实现对所述TRAC基因组区域的编辑；(ii)将包含选自SEQ ID NOs：6-13中任一序列的sgRNA导入CAR-T细胞以实现对所述B2M基因组区域的编辑。在一些实施方案中，该方法包括将编码所述sgRNA和编码Cas9的核苷酸序列共同或分别导入所述T细胞。

在本申请的一个具体实施方式中，提供一种制备通用CAR-T细胞的方法，包括：(i)将TRAC-sg3 sgRNA导入T细胞以实现对所述TRAC基因组区域的编辑；(ii)将B2M-sg2 sgRNA导入T细胞以实现对所述B2M基因组区域的编辑。在一些实施方案中，该方法包括将编码所述sgRNA和编码Cas9的核苷酸序列共同或分别导入所述T细胞。

在本申请的一个具体实施方式中，提供一种制备通用CAR-T细胞的方法，包括：(i)将包含SEQ ID NOs：2或3的序列的sgRNA导入CAR-T细胞以实现对所述TRAC基因组区域的编辑；(ii)将包含选自SEQ ID NOs：7-11中任一的序列的sgRNA导入T细胞以实现对所述B2M基因组区域的编辑。在一些实施方案中，该方法包括将Cas9或其编码核苷酸导入CAR-T细胞。

在一些实施方案中，上述sgRNA是经过化学修饰的。例如是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的。在一些实施方案中，所述化学修饰为对所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物的修饰。

一般而言，sgRNA中的指导序列是与靶多核苷酸序列具有足够的互补性以与靶序列杂交并指导CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的任何多核苷酸序列。在一些实施方案中，当使用适当的比对算法最佳比对时，指导序列及其相应靶序列间的互补程度为约或大于约80％、85％、90％、95％、97.5％、99％或更多。最佳比对可使用用于比对序列的任何适当的算法确定，其非限制性实例包括Smith-Waterman算法、Needleman-Wimsch算法、基于Burrows-Wheeler Transform的算法(例如Burrows Wheeler Aligner)、ClustalW、Clustai X、BLAT、Novoalign(Novocraft Technologies)、ELAND(Illumina,San Diego,CA)、SOAP(可在soap.genomics.org.cn获得)和Maq(可在maq.sourceforge.net获得)。在一些实施方案中，指导序列长度可以为约或大于约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或更多个核苷酸。在一些实施方案中，指导序列长度少于约75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、12或更少的核苷酸。指导序列指导CR1SPR复合物与靶序列的序列特异性结合的能力可通过任何适当的测定方法评估。例如，可向具有相应靶序列的宿主细胞提供足以形成CRISPR复合物的CRISPR系统的组件(包括待测试的指导序列)，如可通过使用编码CRISPR序列组件的载体转染，随后评估靶序列内的优先切割来进行。同样地，靶多核苷酸序列的切割可在测试管中通过提供靶序列、CRISPR复合物(包含待测试的指导序列和不同于指导序列的对照指导序列)的组件，并比较测试和对照指导序列在靶序列的结合或切割率，以此进行评估。也可以使用本领域技术人员知道的其它测定方法进行上述测定和评估。

在一个具体实施方式中，通过电转方式将所述sgRNA与编码Cas9的mRNA核苷酸序列共同导入所述T细胞。

具体的，所述靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和/或Cas9编码核苷酸(如mRNA)通过电转导入该T细胞。在一些实施方案中，所述靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA和Cas9编码核苷酸通过电转方式共同导入T细胞。

具体的，所述Cas9编码核苷酸为mRNA，如含有ARCA帽的mRNA。在一些实施方案中，所述Cas9编码核苷酸在病毒载体中，如慢病毒载体。在一些实施方案中，所述Cas9编码核苷酸包含如SEQ ID NO：1所述的序列。在一些实施方案中，所述靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA与Cas9编码核苷酸在同一载体中。

在一些具体的实施方案中，所述电转条件选自如下条件中的任一项：150-250V，0.5-2ms；180-250V，0.5-2ms；150V，2ms；160V，2ms；170V，2ms；180V，2ms；190V，1ms；200V，1ms；210V，1ms；220V，1ms；230V，1ms；240V，1ms；250V，0.5ms。

在本申请一些实施方案中，靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA同时导入CAR-T细胞。在具体实施方案中，靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA同时导入CAR-T细胞时，靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA之间的量可以是近似的或等同的。在一些实施方案中，靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA以任何合适的顺序逐一导入CAR-T细胞。在一些实施方案中，靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA与Cas9编码核苷酸同时导入CAR-T细胞。在一些实施方案中，Cas9编码核苷酸先于靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA导入CAR-T细胞。在一些实施方案中，CAR-T细胞包含Cas9编码核苷酸或Cas9蛋白。

进一步的，本申请提供了一种通过CRISPR/Cas9基因编辑技术制备基因改造的CAR-T细胞的方法，其中:

(i)将包含选自SEQ ID NOs：2-5中任一序列的sgRNA导入CAR-T细胞以实现对14号染色体第23016448位至第23016490位的TRAC基因组区域的编辑；

(ii)将包含选自SEQ ID NOs：6-13中任一序列的sgRNA导入CAR-T细胞以实现对15号染色体第45003745位至第45003788位的B2M基因组区域的编辑。

在一些实施方案中，本发明提供了一种通过CRISPR/Cas9基因编辑技术制备基因改造的CAR-T细胞的方法，其中:

(i)将包含选自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中任一序列的sgRNA导入CAR-T细胞以实现对14号染色体第23016448位至第23016490位的TRAC基因组区域的编辑；

(ii)将包含选自SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8中任一序列的sgRNA导入CAR-T细胞以实现对15号染色体第45003745位至第45003788位的B2M基因组区域的编辑。

(i)将包含SEQ ID NO：2的序列的sgRNA导入CAR-T细胞以实现对14号染色体第23016448位至第23016490位的TRAC基因组区域的编辑；

(ii)将包含SEQ ID NO：8的序列的sgRNA导入CAR-T细胞以实现对15号染色体第45003745位至第45003788位的B2M基因组区域的编辑。

(i)将包含SEQ ID NO：3的序列的sgRNA导入CAR-T细胞以实现对14号染色体第23016448位至第23016490位的TRAC基因组区域的编辑；

(ii)将包含SEQ ID NO：7的序列的sgRNA导入CAR-T细胞以实现对15号染色体第45003745位至第45003788位的B2M基因组区域的编辑。

在一些实施方案中，同时向该CAR-T细胞导入所述靶向TRAC的sgRNA和靶向B2M的sgRNA。在一些实施方案中，所述sgRNA(包括靶向TRAC的sgRNA和靶向B2M的sgRNA)是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的。在一些实施方案中，所述化学修饰为所述sgRNA(包括靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA)的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。

在一些实施方案中，将上述sgRNA(包括靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA)通过电转方式导入所述CAR-T细胞。在一些实施方案中，上述sgRNA(包括靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA)与Cas9编码核苷酸(如mRNA)通过电转方式共同导入该CAR-T细胞。在一些实施方案中，所述电转条件包括选自如下的任一项：150-250V，0.5-2ms；150V，2ms；160V，2ms；170V，2ms；180V，2ms；190V，1ms；200V，1ms；210V，1ms；220V，1ms；230V，1ms；240V，1ms；250V，0.5ms。

在一些实施方案中，还包括从经过基因编辑的CAR-T细胞中筛选TRAC和B2M表达量低的CAR-T细胞。例如，所述TRAC和B2M在经过基因编辑的CAR-T细胞中的表达量为未经基因编辑的CAR-T细胞的表达量的2/10。

在一些实施方案中，所述TRAC和B2M分别被敲除的效率为90％以上；同时被敲除的效率在75％以上。进一步的，双基因同时的敲除效率在80％以上。与现有技术相比，本发明的T细胞基因敲除方法获得了高效的基因敲除效率

“敲除效率”可以在基因水平上以产生基因敲除的INDEL的效率来表示，也可以在细胞水平上以所述基因敲除致使该基因表达蛋白消失或显著降低的细胞的百分比来表示。在本发明中，“敲除效率”是指基于后者计算的敲除效率。本领域技术人员可以理解，高的敲除效率可以提高目的细胞的收获率，降低生产成本和治疗成本。本申请使用的“Indel”全称为插入/缺失,即插入和缺失突变。

在本申请提出的方法中，基因编辑的CAR-T细胞导入表达TCRα/β抗体的mRNA，经过24-48h的表达期，其特异性识别并清除TCRα/β阳性的T细胞，在培养的过程中就可以达到高纯度的双基因(TRAC和B2M)敲除CAR-T细胞。经所述方法获得的细胞群体中，TCR阴性细胞比率为98％或99％以上。该方法既节省了生产时间成本，也节省了人力和物力成本。

本申请的另一方面，还涉及一种制备通用型CAR-T细胞的方法，包括:

(i)将嵌合抗原受体(CAR)或其编码核苷酸导入激活的T细胞；

在一些实施方案中，所述方法还包含将CAS9或其编码核苷酸导入激活的T细胞；和

(ii)将包含靶向14号染色体第23016448位至第23016490位的TRAC基因组的sgRNA导入T细胞以破坏所述TRAC基因组区域；和/或

(iii)将包含靶向15号染色体第45003745位至第45003788位的B2M基因组区域的sgRNA导入该T细胞以破坏所述B2M基因组区域；和

(iv)将靶向TCRα/β的mRNA：

CAGAUCGUGCUGACCCAGAGCCCCGCCAUCAUGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGUGACCAUGACCUGCAGCGCCACCAGCAGCGUGAGCUACAUGCACUGGUAUCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCUGGAUCUACGACACCAGCAAGCUGGCCAGCGGCGUGCCCGCCCGCUUCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCUGACCATCAGCAGCAUGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCUACUACUGCCAGCAGUGGAGCAGCAACCCCCUGACCUUCGGCGCCGGCACCAAGCUGGAGCUGAAGGGUGGCGGUGGCUCGGGCGGUGGUGGGUCGGGUGGCGGCGGAUCUGAGGUGCAGCUGCAGCAGAGCGGCCCCGAGCUGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGUGAAGAUGAGCUGCAAGGCCAGCGGCUACAAGUUCACCAGCUACGUGAUGCACUGGGUGAAGCAGAAGCCCGGCCAGGGCCUGGAGUGGAUCGGCUACAUCAACCCCUACAACGACGUGACCAAGUACAACGAGAAGUUCAAGGGCAAGGCCACCCUGACCAGCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCUACAUGGAGCUGAGCAGCCUGACCAGCGAGGACAGCGCCGUGCACUACUGCGCCCGCGGCAGCUACUACGACUACGACGGCUUCGUGUACUGGGGCCAGGGCACCCUGGUGACCGUGAGCGCC(其中带下划线的部分为连接体(linker)序列)导入基因编辑后的CAR-T细胞，清除TCRα/β阳性的细胞，从而获得终产品即通用型CAR-T细胞。

在一些实施方案中，所述制备通用型CAR-T细胞的方法包括：

(i)将嵌合抗原受体(CAR)的编码核苷酸导入人类T细胞的基因组以制成CAR-T细胞；

所述方法还包含将CAS9或其编码核苷酸导入T细胞；和

(ii)将包含选自SEQ ID NOs：2-5中任一的sgRNA导入T细胞以实现对14号染色体第23016448位至第23016490位的TRAC基因组区域的编辑；

(iii)将包含选自SEQ ID NOs：6-13中任一的sgRNA导入T细胞以实现对15号染色体第45003745位至第45003788位的B2M基因组区域的编辑；和

(iv)将靶向TCRα/β的mRNA导入基因编辑后的CAR-T细胞，清除TCRα/β阳性的细胞，从而获得终产品即通用型CAR-T细胞。

在一些实施方案中，所述制备通用型CAR-T细胞的方法包括:

(i)将嵌合抗原受体(CAR)的编码核苷酸导入人类T细胞基因组；

所述方法还包含将CAS9或其编码核苷酸导入T细胞；和

(ii)将包含选自SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3中任一序列的sgRNA导入CAR-T细胞以实现对14号染色体第23016448位至第23016490位的TRAC基因组区域的编辑；和/或

(iii)将包含选自SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8中任一序列的sgRNA导入CAR-T细胞以实现对15号染色体第45003745位至第45003788位的B2M基因组区域的编辑；和

在一些实施方案中，所述制备通用型CAR-T细胞的方法包括：

(i)将嵌合抗原受体(CAR)的编码核苷酸导入人类T细胞基因组；

所述方法还包含将Cas9或其编码核苷酸导入T细胞；同时

(ii)将包含SEQ ID NO：2的序列的sgRNA导入T细胞以实现对14号染色体第23016448位至第23016490位的TRAC基因组区域的编辑；

(iii)将包含SEQ ID NO：8的序列的sgRNA导入T细胞以实现对15号染色体第45003745位至第45003788位的B2M基因组区域的编辑；和

在一些实施方案中，所述制备CAR-T细胞的方法包括：

(i)将嵌合抗原受体(CAR)的编码核苷酸导入T细胞基因组；

所述方法还包含将CAS9或其编码核苷酸导入T细胞；以及

(ii)将包含SEQ ID NO：3的序列的sgRNA导入T细胞以实现对14号染色体第23016448位至第23016490位的TRAC基因组区域的编辑；

(iii)将包含SEQ ID NO：7的序列的sgRNA导入T细胞以实现对15号染色体第45003745位至第45003788位的B2M基因组区域的编辑；和

在一些实施方案中，向激活的T细胞中导入嵌合抗原受体(CAR)的编码核苷酸。同时向上述CAR-T导入所述靶向TRAC的sgRNA和靶向B2M的sgRNA。在一些实施方案中，所述sgRNA(包括靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA)是经过2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰的。在一些实施方案中，所述化学修饰为所述sgRNA(包括靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA)的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物修饰。

在一些实施方案中，将CAR的编码核苷酸导入T细胞基因组以激活T细胞。

在一些实施方案中，将上述sgRNA(包括靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA)通过电转方式导入所述CAR-T细胞。在一些实施方案中，上述sgRNA(包括靶向TRAC的sgRNA、靶向B2M的sgRNA)与Cas9编码核苷酸(如mRNA)通过电转方式共同导入该T细胞。在一些实施方案中，所述电转条件包括选自如下的任一项：150-250V，0.5-2ms；180-250V，0.5-2ms；150V，2ms；160V，2ms；170V，2ms；180V，2ms；190V，1ms；200V，1ms；210V，1ms；220V，1ms；230V，1ms；240V，1ms；250V，0.5ms。

在一些实施方案中，将靶向TCRα/β的mRNA导入基因编辑后的CAR-T细胞，清除TCRα/β阳性的细胞。

一方面，本发明涉及通过上述方法制备的通用型CAR-T细胞。

一方面，本发明涉及CAR-T细胞,包含表达嵌合抗原受体(CAR)的上述基因改造的T细胞。

一个方面，本发明涉及CAR-T细胞，其中所述CAR-T细胞中：

(i)14号染色体第23016448位至第23016490位的TRAC基因组区域被编辑；

(ii)15号染色体第45003745位至第45003788位的B2M基因组区域被编辑。

本发明以上所提及的TRAC基因组区域、B2M基因组区域的位置信息是以参考数据库：GRCh37(hg19)中所述基因的野生序列位置信息而确定的。本领域技术人员知道如何参照其它数据库获得上述基因组区域的相应位置信息。

一方面，本发明还涉及包含上述基因改造的T细胞，CAR-T细胞的组合物(如药物组合)、试剂盒、和医用制品。

一方面，本发明涉及一种治疗受试者疾病的方法，包括给药受试者有效量的上述CAR-T细胞。在一些实施方案中，所述疾病为肿瘤。在一些实施方案中，所述肿瘤为血液系统肿瘤。在一些实施方案中，所述肿瘤为淋巴瘤或白血病。

一方面，本发明涉及到纯化基因编辑T细胞和/或CAR-T细胞得到99％TCRα/β阴性的通用型CAR-T细胞的方法。在一些实施方案中，所述靶向TCRα/β并具有清除TCRα/β阳性细胞作用的mRNA翻译后表达蛋白质序列为：

QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSATSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK；

EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYKFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDVTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVHYCARGSYYDYDGFVYWGQGTLVTVSA；

连接体(Linker)序列为：GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS

一方面，本发明涉及包含SEQ ID NOs：2-13任一项的sgRNA或其载体。在一些实施方案中，所述sgRNA是经过化学修饰的，所述化学修饰例如2’-O-甲基类似物和/或核苷酸间3’硫代修饰。在一些实施方案中，化学修饰为所述sgRNA的5’端前一个、二个和/或三个碱基和/或3’端的最后一个碱基的2’-O-甲基类似物的修饰。

在一些实施方案中，本发明的通用型CAR-T细胞的TCR和\或HLA基因被敲除。

在一些具体的实施方案中，所述TCR的α链恒定编码区(即TRAC)基因被敲除。B2M的编码区被敲除。

在一些具体的实施方案中，所述TCR的α链恒定编码区(即TRAC)基因被敲除。例如，在具体实施方案中，本发明TCRα链恒定编码区基因被引入所述细胞的TRAC-sg 2、3、4、6分子之一(见表1)以及Cas 9分子敲除。优选所述TCR的α链恒定编码区基因被引入细胞的TRAC-sg 2和Cas9分子或TRAC-sg 3和Cas9分子进行敲除。

表1

T2	GCUGGUACACGGCAGGGUCA	SEQ ID NO：2
			T3	CUCUCAGCUGGUACACGGCA	SEQ ID NO：3
T4	AUUUGUUUGAGAAUCAAAAU	SEQ ID NO：4
			T6	UCUCUCAGCUGGUACACGGC	SEQ ID NO：5
B1	ACUCUCUCUUUCUGGCCUGG	SEQ ID NO：6
			B2	GAGUAGCGCGAGCACAGCUA	SEQ ID NO：7
B3	CGCGAGCACAGCUAAGGCCA	SEQ ID NO：8
			B4	UCACGUCAUCCAGCAGAGAA	SEQ ID NO：9
B5	GCUACUCUCUCUUUCUGGCC	SEQ ID NO：10
			B6	UUUGACUUUCCAUUCUCUGC	SEQ ID NO：11
B7	CGUGAGUAAACCUGAAUCUU	SEQ ID NO：12
			B8	CUCGCGCUACUCUCUCUUUC	SEQ ID NO：13

在另一些具体的实施方案中，所述HLA的恒定编码区B2M基因被敲除。例如，在具体实施方案中，本发明B2M恒定编码区基因被引入所述细胞的B2M-sg 1-8分子之一(见表1)以及Cas 9分子，优选所述B2M的恒定编码区基因被引入细胞的B2M-sg 2或B2M-sg 6分子和Cas9分子进行敲除。

在另一些具体的实施方案中，所述TCR的α链恒定编码区(即TRAC)基因及B2M基因被敲除。例如，在具体实施方案中，本发明TRAC及B2M基因被引入所述细胞的TRAC-sg3及B2M-sg2分子(见表1)以及Cas 9分子进行敲除。

在一些实施方案中，本发明提供了一种高效编辑CAR-T细胞的方法，所述方法包括如下步骤:

在CAR-T细胞中引入sgRNA分子和Cas9分子:

在一些实施方案中，所述sgRNA分子包含与来自TCR的α链恒定编码区(即TRAC)基因、B2M基因的恒定编码区基因靶区域互补的靶向结构域。

在一些实施方案中，所述sgRNA分子是指一段包含与待敲除的基因的靶区域互补的靶向结构域的核酸序列，其能识别靶标DNA序列并引导Cas9分子剪切靶位点，其可以实现一步高效(敲除效率85％以上)敲除相应位点。

在一些实施方案中，所述sgRNA分子所包含的靶向结构域的序列如表1中之一所示。

在一些优选的实施方案中，所述靶向结构域的序列如T2、B3所示。

在一些优选的实施方案中，通过电转技术将所述sgRNA分子和编码Cas9分子的mRNA引入所述CAR-T细胞中。

在一些具体的实施方案中，上述方法中使用的T细胞来自健康人，例如健康成人外周血，或自然分娩的健康人的脐带血。

在一些实施方案中，本发明的第三方面提供了经过特定修饰后的具有高效编辑效率的sgRNA序列(表1)。

在一些具体的实施方案中，利用化学方法合成并修饰sgRNA，使sgRNA比普通的体外转录(IVT)所获得的sgRNA具有更稳定及更高的编辑效率。优选地，用电转的方法对CAR-T细胞进行一次电转，化学合成并经过修饰的sgRNA基因编辑效率是普通的IVT所获得的sgRNA的10倍以上。

在一些实施方案中，利用普通的体外转录(IVT)方法获得表达靶向TCRα/β的mRNA,利用电转递送方式将其递送到已经进行基因编辑过的CAR-T细胞中。随着时间的培养增长，在收货的时候获得TCRα/β阴性的通用型CAR-T细胞。

在一些实施方案中，提供了本发明所述的通用型CAR-T细胞用于制备治疗疾病(如肿瘤)的药物的用途。

在一些具体的实施方案中，所述TCR的α链恒定编码区(即TRAC)基因，HLA的恒定编码区B2M基因。例如，在具体实施方案中，本发明TCRα链恒定编码区基因被引入所述细胞的TRAC-sg 2分子，本发明B2M恒定编码区基因被引入所述细胞的B2M-sg6分子以及Cas 9分子:优选所述TCR的α链恒定编码区基因被引入细胞的TRAC-sg2、B2M恒定编码区基因被引入细胞的B2M-sg6和Cas9分子进行敲除。

本申请的另一方面，还提供了一种制备CAR-T细胞(如通用CAR-T细胞)的方法。在一些实施方案中，该方法包括将CAR或其编码核苷酸或载体导入本发明所描述的任何基因改造的T细胞(如通用T细胞)。

在一些实施方案中，提供了一种制备CAR-T细胞的方法，包括:

(i)将嵌合抗原受体(CAR)或其编码核酸导入该T细胞；和

(ii)将包含靶向14号染色体第23016448位至第23016490位的TRAC基因组的sgRNA导入T细胞以破坏所述TRAC基因组区域；和

(iv)将包含靶向2号染色体第242800936位至第242800978位的PD-1基因组区域，或2号染色体第242795009位至第242795051位的PD-1基因组区域的sgRNA导入该T细胞以破坏所述B2M基因组区域；

(v)将靶向TCRα/β的mRNA导入基因编辑后的CAR-T细胞，清除TCRα/β阳性的细胞，从而获得终产品即通用型CAR-T细胞。

CAR或其编码核酸以及靶向TRAC的sgRNA，靶向B2M的sgRNA和CAR或其编码核苷酸可以以任何适合的顺序导入T细胞，但靶向TCRα/β的mRNA必须导入基因编辑后的CAR-T细胞中，从而获得终产品即通用型CAR-T细胞。在一些实施方案中，靶向TRAC的sgRNA,靶向B2M的sgRNA和CAR或其编码核苷酸同时导入该T细胞，然后，将靶向TCRα/β的mRNA导入基因编辑后的CAR-T细胞中。在一些实施方案中，CAR或其编码核苷酸先于靶向TRAC的sgRNA,靶向B2M的sgRNA导入该T细胞，然后，将靶向TCRα/β的mRNA导入基因编辑后的CAR-T细胞中。在一些实施方案中，CAR或其编码核苷酸导入已经实现基因编辑的T细胞中，该T细胞的TRAC,B2M基因组区域已经通过编辑被破坏。在一些实施方案中，该方法还包括将Cas9或其编码核苷酸于说所述sgRNA一并导入该T细胞，然后，将靶向TCRα/β的mRNA导入基因编辑后的CAR-T细胞中。

在一些实施方案中，本发明的通用型CAR-T细胞所表达的CAR可以是靶向癌变细胞的除了TCRα/β以外的任何一个CAR，进而发挥杀伤作用。

在一些实施方案中，本发明的CAR-T细胞中表达的CAR包含顺序连接的信号肽、胞外结合区、铰链区、跨膜区和胞内信号区。本文使用的术语"信号肽"是指引导新合成的蛋白质向分泌通路转移的短(例如长度5-30个氨基酸)肽链。在本发明中，可以使用人体内的各种蛋白质的信号肽，例如体内分泌的细胞因子蛋白、白细胞分化抗原(CD分子)的信号肽。

在一些实施方案中，所述信号肽为CD8信号肽，例如其氨基酸序列如发明专利申请US20140271635A1中所示。

在一些实施方案中，所述绞链区可以使用各种不同抗体或抗原受体的铰链区，特别是CD分子的铰链区。在一个具体的实施方案中，所述铰链区可以选自CD8或CD28等蛋白的铰链区。所述CD8或CD28是T细胞表面的天然标记物。

在本发明中，可以使用各种人体内蛋白的跨膜区，特别是各种不同抗原受体的跨膜区。优选使用的跨膜区是CD分子的跨膜区。在一个实施方案中，所述跨膜区选自CD8蛋白的跨膜区。

在一些实施方案中，所述铰链区为CD8a铰链区(CD8-hinge)，其氨基酸序列如发明专利申请US20140271635A1中所示。

所述“胞外结合区”是指包含特异性识别靶抗原的区域。在一些实施方案中，该胞外结合区包含特异性识别靶肿瘤细胞表面抗原的区域。例如这个区域可以是scFv或其他抗体的抗原结合片段。本文使用的术语“scFv”是指通过连接区(linker)连接的重链可变区(variable region of heavy chain，VH)和轻链可变区(variable region of lightchain，VL)的重组蛋白，连接区使得这两个结构域相关联，最终形成抗原结合位点。scFv通常是由一条核苷酸链编码的氨基酸序列。上述scFv还可以包括其衍生物。

本发明使用的CAR及其各结构域可通过单独或联合使用本领域己知的常规技术，例如氨基酸缺失、插入、取代、增加，和/或重组以及/或其他修饰方法作进一步修饰。根据一种抗体的氨基酸序列在其DNA序列中引入这种修饰的方法对本领域技术人员来说是公知的(参见例如，Sambrook分子克隆:实验手册，Cold Spring Harbor Laboratory(1989)N.Y.)。所述修饰优选在核酸水平上进行。

本文使用的术语"特异性识别"意指本发明的抗原识别区不与或基本上不与目标抗原以外的任意多肽交叉反应。其特异性的程度可以通过免疫学技术来判断，包括但不限于免疫印迹，免疫亲和层析，流式细胞分析等。

在一些实施方案中，所述胞外结合区为特异性识别除了TCRα/β靶点的抗原结合区域。

在本发明中，所述胞内信号区为CD137(4-1BB)蛋白的胞内信号区。CD3分子由五个亚单位组成，其中CD3ζ亚单位(又称CD3zeta，简称ζ)含有3个ITAM基序，该基序是TCR-CD3复合体中重要的信号转化区。FcεRI y主要分布在肥大细胞和嗜碱性粒细胞表面，其含有一个ITAM基序，在结构、分布及功能上与CD3ζ类似。此外如前所述，CD137是共剌激信号分子，在与各自配体结合后其胞内信号区段产生的共刺激作用引起T细胞的持续增殖，并能够提高T细胞分泌IL-2和IFN-γ等细胞因子的水平，同时提高CAR-T细胞在体内的存活周期和抗肿瘤效果。

本发明中，体外转录(IVT)的表达靶向TCRα/β的mRAN序列，经过电转将其递送到基因编辑后CAR-T细胞中，通过体内翻译，表达出靶向TCRα/β蛋白，因为是瞬时转染，该蛋白只能存在4-5天，在其行驶完清除TCRα/βT细胞功能后即将消失。保证最终得到的产品为纯的通用型CAR-T。

在某些实施方案中，由单独CAR产生的信号不足以完全活化天然T细胞，需要通过TCR起始抗原依赖性初次活化的序列(初级细胞内信号传导结构域)以及以不依赖于抗原的方式作用以提供共刺激信号的序列(共刺激性结构域)。初级信号传导结构域以刺激性方式或以抑制性方式调控TCR复合物的初次活化。以刺激性方式作用的初级细胞内信号传导结构域可以含有信号传导基序，称为免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)。本发明中的含有ITAM的初级细胞质信号传导序列为CD3ζ。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含修饰的ITAM结构域，例如活性相较于天然ITAM结构域有所改变(例如增加或降低)的突变的ITAM结构域，或截短的ITAM的初级细胞内信号传导结构域。在一个实施方案中，初级信号传导结构域包含一个或多个ITAM基序。

共刺激信号传导结构域是指TCR中包含共刺激分子细胞内结构域的部分。共刺激分子是淋巴细胞对抗原高效反应所需的除抗原受体或其配体外的细胞表面分子。本发明的共刺激分子区域为4-1BB(CD137)。

在一些实施方案中，本发明提供了一种制备CAR-T细胞，例如通用型CAR-T细胞的方法，所述方法包括如下步骤:

1)在所述T细胞中引入CAR分子；

2)在CAR-T细胞中引入sgRNA分子和Cas9分子:

在一些实施方案中，所述sgRNA分子包含与来自TCR的α链恒定编码区(即TRAC)基因、HLA恒定编码区B2M基因及PD-1的恒定编码区基因靶区域互补的靶向结构域。

3)在CAR-T细胞中引入靶向TCRα/β的mRNA分子；

在一些实施方案中,所述靶向TCRα/β的mRNA分子为体外转录分子，其能够在细胞内翻译成蛋白并在细胞膜上表达，进行清除TCRα/β阳性T细胞的作用。

在一些实施方案中，所述Cas9分子是指Cas9 mRNA，其能够在sgRNA的引导下对靶位点进行剪切。

在一些具体的实施方案中，所述sgRNA分子所包含的靶向结构域的序列如表1中之一所示。

在一些优选的实施方案中，所述靶向结构域的序列如T2、B3所示(表1)。

在一些优选的实施方案中，通过电转技术将所述sgRNA分子和编码Cas9分子的mRNA引入所述T细胞中。

在一些实施方案中，通过例如慢病毒转染技术将所述CAR分子引入所述T细胞中。

在一些具体的实施方案中，包括分离和/或激活来自健康人外周血或脐带血的T细胞的步骤；优选地，所述方法在上述步骤2)之后还包括对通用型CAR-T细胞进行分选的步骤；进行上述步骤3)之后再对所得的CAR-T细胞，例如通用型CAR-T细胞进行功能性验证。

在一些实施方案中，本发明提供了上述CAR-T细胞用于制备治疗疾病(如肿瘤)的用途。

本发明在一个方面提供了一种治疗受试者疾病的方法，包括给药受试者有效量的本发明所述的CAR-T细胞。本发明所述的治疗方法包括但不限于癌症和HIV/AIDS.在一些实施方案中，该疾病为肿瘤，包括血液系统肿瘤，如淋巴瘤或白血病。在一些实施方案中，CAR可以靶向除TCRα/β抗原以外的其他癌细胞靶点。在一些实施方案中，所述T细胞不是从受试者得到的。例如，所述T细胞可以来源于健康的捐助者。

本发明涉及的CAR－T细胞可以通过给药包含细胞成分的医药制品常规使用的途径，例如静脉输注途径，给药有此需要的受试者。给药剂量可以基于受试者的病情和一般健康状况具体确定。

本申请中，还涉及T细胞来源。在进行扩增和基因修饰之前，从受试者获得T细胞来源。术语“受试者”意图包括能够引起免疫反应的活生物体(例如哺乳动物)。受试者的实例包括人。T细胞可以从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸膜积液、脾组织及肿瘤。本发明的T细胞还可来源于各个分化阶段的造血干细胞。在定向分化培养条件下，造血干细胞向T细胞分化。在本发明的某些方面，可以使用本领域中可得到的多种T细胞系。

在本发明的某些方面，T细胞可以使用熟练技术人员已知的多种技术，如FicollTM分离从受试者收集的血液获得。也可以通过单采血液成分术(apheresis)从个体的循环血获得细胞。单采血液成分术产物典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它有核白细胞、红细胞及血小板。在一个方面，可以对通过单采血液成分术收集的细胞进行洗涤以去除血浆部分并将细胞放入适当缓冲液或介质中用于后续加工步骤。

可以通过将红细胞溶解并例如经PERCOLLTM梯度离心或逆流离心淘选耗尽单核细胞，从外周血淋巴细胞分离出T细胞。特定T细胞亚群，如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+及CD45RO+T细胞可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离。举例来说，在一个方面，T细胞通过与抗CD3/抗CD28(例如3×28)偶联珠粒，如DYNABEADSTM M-450CD3/CD28T一起孵育一段足以对所希望的T细胞进行阳性选择的时间来分离。可以从肿瘤组织分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)。

本申请的一个方面，还提供了靶向TRAC的sgRNA,靶向B2M的sgRNA。所述sgRNA含有选自SEQ ID NOs:2-22的任一核苷酸序列。在一些实施方案中，所述sgRNA是经化学修饰的。

本申请还包括sgRNA组合物，试剂盒或制品，其包括本发明涉及的sgRNA或其载体。在一些实施方案中，该试剂盒包括：i)包含选自SEQ ID NOs：2-5中任一序列的sgRNA；(ii)包含选自SEQ ID NOs：6-13中任一序列的sgRNA；和/或(iii)包含选自SEQ ID NOs：15-22中任一序列的sgRNA。在一些实施方案中，该试剂盒包括：(i)包含SEQ ID NO：3序列的的sgRNA；(ii)包含选自SEQ ID NO：16序列的的sgRNA；和(iii)包含SEQ ID NO：7序列的的sgRNA。在一些实施方案中，该试剂盒还包括Cas6编码核酸或其载体。在一些实施方案中，所述sgRNA是经化学修饰的。

在一些实施方案中，本发明中的T细胞基因改造方法使用化学修饰的sgRNA。本发明人采用的经过化学修饰的sgRNA认为具有以下两个优点。第一、由于sgRNA是单链形式的RNA，其半衰期非常短，进入到细胞后，会迅速降解(最长不超过12小时)，而Cas9蛋白结合sgRNA发挥基因编辑作用则至少需要48hrs。因此，采用经过化学修饰的sgRNA，进入细胞后，稳定表达，与Cas9蛋白结合后，能高效基因编辑基因组，产生Indels。第二、未经修饰的sgRNA穿透细胞膜能力差，无法有效进入细胞或组织发挥相应功能。而经过了化学修饰的sgRNA穿透细胞膜的能力通常是增强的。在本发明中可以采用本领域中常用的化学修饰方法，只要能够提高sgRNA稳定性(延长半衰期)和提升进入细胞膜能力，均可以使用。除了实施例中使用的具体的化学修饰之外，还包括采用其它的修饰方法，例如，Deleavey GF1,Damha MJ.Designing chemically modified oligonucleotides for targeted genesilencing.Chem Biol.2012Aug 24；19(8):937-54，以及Hendel et al.Chemicallymodified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primarycells.Nat Biotechnol.2015Sep；33(9):985-989文献中报道的化学修饰方法。

本发明将经过化学修饰的sgRNA与Cas9编码基因共同电转进入T细胞，产生高效的基因编辑效率(如，以Indels％表示)，其中sgRNA的化学修饰是本发明中的关键因素之一。实施例中的数据显示，如果和Cas9 mRNA一起电转的是未经化学修饰的sgRNA，其Indels效率远远低于电转经化学修饰的sgRNA时获得的Indels效率。

以下通过具体实施例来说明本发明的内容。应理解，所述具体实施例仅为说明目的，并不意味着本发明的内容仅限于具体实施例。

在本说明书的整篇文本中引用了数篇文件。此处的每篇文件(包括任何期刊文章或摘要、公开或未公开的专利申请、授权专利、制造商的说明书、使用说明等)通过提述并入本文。然而，并非认可此处引用的文件事实上是本发明的现有技术。

实施例

以下将结合具体实施方式说明本申请内容，但本申请范围不限于此。

如果没有特殊说明，以下实施方式中使用的试剂和仪器都是本领域常规试剂和仪器，可以通过商购方式获得。所使用的方法均为常规实验方法，本领域技术人员根据实施例内容可以毫无疑问地实施所述方案并获得相应结果。

实施例1:通用型CAR-T细胞的制备

通用型CAR-T细胞的制备和扩增

利用细胞因子对分选后的T细胞进行激活，然后用T细胞培养基将细胞密度调至1×10⁶个细胞/mL。24h后将包含有CAR(胞外区CD19 scFv、链接区(Linker)、CD8 alpha铰链区(CD8 alpha hinge)、CD8跨膜区(CD8 transmemberane domain)、4-11BB信号区(4-11BBsignaling domain)及CD3 zeta，具体结构参见US20140271635A1，具体序列如表2所示)的病毒按照MOI＝4对T细胞进行侵染；72h后观察细胞的状态，收集细胞悬液，以300g离心7min，弃上清，用DPBS溶液(生产商：Gibco；货号：1924294)清洗2遍，然后用电转试剂培养基将细胞密度调至2.5×10⁷个细胞/mL。

表2

使用HISCRIBE TM T7 ARCA mRNA Kit(带尾)(生产商：NEB,货号：cat#E2060S)制备好的Cas9 mRNA及合成的sgRNA(靶向TRAC序列的sgRNA:GCUGGUACACGGCAGGGUCA；靶向B2M序列的sgRNA：GAGUAGCGCGAGCACAGCUA)，将T细胞和RNA混合，使其最终浓度达到每100μL中含2.5×10⁶个细胞和8μg RNA(Cas9 mRNA和sgRNA各4μg)，然后利用电转仪BTX Agilepulse MAX将RNA 导入细胞中后进行培养。在培养到第5天的时候，使用HISCRIBE TM T7ARCA mRNA Kit(带尾)(生产商：NEB,货号：cat#E2060S)制备好的靶向TCRα/βmRNA CAGAUCGUGCUGACCCAGAGCCCCGCCAUCAUGAGCGCCAGCCCCGGCGAGAAGGUGACCAUGACCUGCAGCGCCACCAGCAGCGUGAGCUACAUGCACUGGUAUCAGCAGAAGAGCGGCACCAGCCCCAAGCGCUGGAUCUACGACACCAGCAAGCUGGCCAGCGGCGUGCCCGCCCGCUUCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCUGACCATCAGCAGCAUGGAGGCCGAGGACGCCGCCACCUACUACUGCCAGCAGUGGAGCAGCAACCCCCUGACCUUCGGCGCCGGCACCAAGCUGGAGCUGAAGGGUGGCGGUGGCUCGGGCGGUGGUGGGUCGGGUGGCGGCGGAUCUGAGGUGCAGCUGCAGCAGAGCGGCCCCGAGCUGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGUGAAGAUGAGCUGCAAGGCCAGCGGCUACAAGUUCACCAGCUACGUGAUGCACUGGGUGAAGCAGAAGCCCGGCCAGGGCCUGGAGUGGAUCGGCUACAUCAACCCCUACAACGACGUGACCAAGUACAACGAGAAGUUCAAGGGCAAGGCCACCCUGACCAGCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCUACAUGGAGCUGAGCAGCCUGACCAGCGAGGACAGCGCCGUGCACUACUGCGCCCGCGGCAGCUACUACGACUACGACGGCUUCGUGUACUGGGGCCAGGGCACCCUGGUGACCGUGAGCGCC(其中带下划线的部分为连接体(linker)序列)与CAR-T细胞混合，使其终浓度达到每200uL中含有2×10⁷个细胞，然后利用电转仪BTX Agilepulse MAX将RNA 导入细胞中后，将该细胞与未经过电转该mRNA的细胞进行1:2的细胞数混合培养。每天观察细胞的生长状况，每隔一天进行细胞计数补液。如图1所示，细胞在扩增培养过程中的活率监测，加入靶向TCRα/β的mRNA后，后期细胞活率不好，因为细胞可以自我杀伤TCRα/β阳性的T细胞，但随着培养时间的增长，细胞活率与其他两组无明显差异。图2所示，细胞在培养到14天后扩增的倍数。由于加入CAR的细胞进行自我杀伤，所以扩增倍数不如其他对照组。

图4展示了MIX(DKO CAR-T:DKO CAR-T+mRNA1:1)培养后其TCRα/β阳性变化情况，混合培养2天后，其TCRα/β阴性比例细胞不少于99％。

在本实施例中，TCR阳性率为1％，TCR和B2M DKO的T细胞阳性率<1％。

实施例2:通用型CAR-T功能验证

观察实施例1得到的通用型CAR-T细胞(即效应细胞)对B细胞型急性淋巴细胞白血病细胞的杀伤作用。

通用型CAR-T对特异性肿瘤细胞的体外杀伤作用

本发明实验步骤如下:

第一步:靶细胞标记

使用CELL TRACETM Far Red Cell Proliferation Kit(生产商：Gibco；货号：1888569)标记靶细胞(人Burkitt’s淋巴瘤细胞Raji、K562,所有细胞来自ATCC)。

1.将Cell TraceTM Far Red Cell Proliferation用双蒸水稀释成1mmol溶液；

2.取1×10 ⁶个靶细胞400g离心5分钟后去上清；

3.加入Cell TraceTM Far Red Cell Proliferation溶液1ul，37℃、避光孵育20min。

4.将细胞加入T细胞培养基，37℃孵育5min。

5.400g离心5分钟后去上清，标记完成。

第二步:效应细胞对靶细胞的杀伤检测

将标记好的靶细胞用R1640+10％FBS培养液按照2×10⁵个细胞/mL的密度重悬，取500μL加入到48孔板中。按照适当的效靶比(2.5:1、1.25:1、0.6:1)，每孔加入500μL效应细胞，同时以T细胞和健康人脐血CAR-T细胞(在T细胞培养到第2天时，以MOI＝2-10的比例加入包装有CAR的慢病毒(CAR的结构由抗CD19 scFv、链接区(Linker)、CD8alpha铰链区(CD8alpha hinge)、CD8跨膜区(CD8 transmembrane domain)、4-11BB信号区(4-11BBsignaling domain)及CD3 zeta组成)，其序列如上所示，制得的CAR-T作为对照)作为对照细胞，每组3个平行，设计单独的靶细胞组，检测其死亡率；37℃、5％CO2培养12-16h，400g离心5min，取细胞沉淀，用150ul用DPBS(生产商：Gibco；货号：1924294)重悬。利用PI(生产商：Sigma；货号：P4170)染色后，用流式细胞仪检测靶细胞死亡率，结果如图6所示，通用型CAR-T相较与其他的CAR-T细胞在对特异性靶细胞的杀伤作用上基本保持一致，效果都优于T细胞。同时对非特异性靶细胞的几乎无杀伤功能。

第三步:细胞因子释放的ELISA检测

将标记好的靶细胞用RPMI 1640+10％FBS按照2X105个/mL的密度重悬，取500μL加入到48孔板中。按照适当的效靶比(10:1)每孔加入500μL效应细胞，同时以T细胞和健康人脐血CAR-T作为对照细胞，每组3个平行，设计单独的靶细胞组，37℃、5％CO₂培养12-16h，每孔取培养上清100ul，400g离心5min去沉淀，取上清后利用LEGEND MAXTM Human IL-2/IFN-gama(生产商：Biolegend；货号分别为：431807、430108)试剂盒检测因子释放。

具体实验步骤如下：

1、稀释标准品

2、每孔300ul Wash Buffer(1×)洗板4次，每孔加入50ul Assay Buffer

3、每孔加入样本50ul

4、200rpm震荡孵育2h

5、300ul Wash Buffer(1×)洗板4次，加入Detection Antibody solution100ul/孔,200rpm震荡孵育1h

6、300ul Wash Buffer(1×)洗板4次，加入Svidin-HRP A solution100ul/孔,200rpm震荡孵育30min

7、300ul Wash Buffer(1×)洗板5次,加入Solution F避光孵育20min。

8、加入Stop Solution 100ul/孔。

9、用酶标仪读取450nm与570nm吸光度值。

所得结果如图7所示，该实验中，以Raji为靶细胞，T细胞、CAR-T及DKO CAR-T+mRNA细胞为效应细胞，按照效靶比为10:1、5:1、2.5:1、1.25:1、0.625:1进行体外共培养后，取1.25:1上清对其中IFN-γ进行检测。可以看出，通用型CAR-T对Raji细胞的杀伤能力与普通CAR-T杀伤能力基本一致或稍好于普通CAR-T的杀伤能力，尤其TCRneg CAR-T IFN-r释放量远远高于普通CAR-T且都对K562的杀伤力较低，因此因子释放相对较少。这表明了CAR靶向的特异性，并未表现出on-target off-tumor的现象。

以上所述，仅是本申请的较佳实施例而已，并非是对本申请作任何形式的限制。任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本申请技术方案内容，依据本申请的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本申请技术方案的保护范围。

序列表

<110> 博雅辑因（北京）生物科技有限公司

<120> 一种纯化UCART细胞的方法与应用

<130> PD01317

<150> 2019113947267

<151> 2019-12-30

<160> 24

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 4101

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> artificial

<400> 1

gacaagaagu acagcaucgg ccuggacauc ggcaccaacu cugugggcug ggccgugauc 60

accgacgagu acaaggugcc cagcaagaaa uucaaggugc ugggcaacac cgaccggcac 120

agcaucaaga agaaccugau cggagcccug cuguucgaca gcggcgaaac agccgaggcc 180

acccggcuga agagaaccgc cagaagaaga uacaccagac ggaagaaccg gaucugcuau 240

cugcaagaga ucuucagcaa cgagauggcc aagguggacg acagcuucuu ccacagacug 300

gaagaguccu uccuggugga agaggauaag aagcacgagc ggcaccccau cuucggcaac 360

aucguggacg agguggccua ccacgagaag uaccccacca ucuaccaccu gagaaagaaa 420

cugguggaca gcaccgacaa ggccgaccug cggcugaucu aucuggcccu ggcccacaug 480

aucaaguucc ggggccacuu ccugaucgag ggcgaccuga accccgacaa cagcgacgug 540

gacaagcugu ucauccagcu ggugcagacc uacaaccagc uguucgagga aaaccccauc 600

aacgccagcg gcguggacgc caaggccauc cugucugcca gacugagcaa gagcagacgg 660

cuggaaaauc ugaucgccca gcugcccggc gagaagaaga auggccuguu cggcaaccug 720

auugcccuga gccugggccu gacccccaac uucaagagca acuucgaccu ggccgaggau 780

gccaaacugc agcugagcaa ggacaccuac gacgacgacc uggacaaccu gcuggcccag 840

aucggcgacc aguacgccga ccuguuucug gccgccaaga accuguccga cgccauccug 900

cugagcgaca uccugagagu gaacaccgag aucaccaagg ccccccugag cgccucuaug 960

aucaagagau acgacgagca ccaccaggac cugacccugc ugaaagcucu cgugcggcag 1020

cagcugccug agaaguacaa agagauuuuc uucgaccaga gcaagaacgg cuacgccggc 1080

uacauugacg gcggagccag ccaggaagag uucuacaagu ucaucaagcc cauccuggaa 1140

aagauggacg gcaccgagga acugcucgug aagcugaaca gagaggaccu gcugcggaag 1200

cagcggaccu ucgacaacgg cagcaucccc caccagaucc accugggaga gcugcacgcc 1260

auucugcggc ggcaggaaga uuuuuaccca uuccugaagg acaaccggga aaagaucgag 1320

aagauccuga ccuuccgcau ccccuacuac gugggcccuc uggccagggg aaacagcaga 1380

uucgccugga ugaccagaaa gagcgaggaa accaucaccc ccuggaacuu cgaggaagug 1440

guggacaagg gcgcuuccgc ccagagcuuc aucgagcgga ugaccaacuu cgauaagaac 1500

cugcccaacg agaaggugcu gcccaagcac agccugcugu acgaguacuu caccguguau 1560

aacgagcuga ccaaagugaa auacgugacc gagggaauga gaaagcccgc cuuccugagc 1620

ggcgagcaga aaaaggccau cguggaccug cuguucaaga ccaaccggaa agugaccgug 1680

aagcagcuga aagaggacua cuucaagaaa aucgagugcu ucgacuccgu ggaaaucucc 1740

ggcguggaag aucgguucaa cgccucccug ggcacauacc acgaucugcu gaaaauuauc 1800

aaggacaagg acuuccugga caaugaggaa aacgaggaca uucuggaaga uaucgugcug 1860

acccugacac uguuugagga cagagagaug aucgaggaac ggcugaaaac cuaugcccac 1920

cuguucgacg acaaagugau gaagcagcug aagcggcgga gauacaccgg cuggggcagg 1980

cugagccgga agcugaucaa cggcauccgg gacaagcagu ccggcaagac aauccuggau 2040

uuccugaagu ccgacggcuu cgccaacaga aacuucaugc agcugaucca cgacgacagc 2100

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gagcacauug ccaaucuggc cggcagcccc gccauuaaga agggcauccu gcagacagug 2220

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uacuggcggc agcugcugaa cgccaagcug auuacccaga gaaaguucga caaucugacc 2700

aaggccgaga gaggcggccu gagcgaacug gauaaggccg gcuucaucaa gagacagcug 2760

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aaguacgacg agaaugacaa gcugauccgg gaagugaaag ugaucacccu gaaguccaag 2880

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caccacgccc acgacgccua ccugaacgcc gucgugggaa ccgcccugau caaaaaguac 3000

ccuaagcugg aaagcgaguu cguguacggc gacuacaagg uguacgacgu gcggaagaug 3060

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aucaugaacu uuuucaagac cgagauuacc cuggccaacg gcgagauccg gaagcggccu 3180

cugaucgaga caaacggcga aaccggggag aucguguggg auaagggccg ggauuuugcc 3240

accgugcgga aagugcugag caugccccaa gugaauaucg ugaaaaagac cgaggugcag 3300

acaggcggcu ucagcaaaga gucuauccug cccaagagga acagcgauaa gcugaucgcc 3360

agaaagaagg acugggaccc uaagaaguac ggcggcuucg acagccccac cguggccuau 3420

ucugugcugg ugguggccaa aguggaaaag ggcaagucca agaaacugaa gagugugaaa 3480

gagcugcugg ggaucaccau cauggaaaga agcagcuucg agaagaaucc caucgacuuu 3540

cuggaagcca agggcuacaa agaagugaaa aaggaccuga ucaucaagcu gccuaaguac 3600

ucccuguucg agcuggaaaa cggccggaag agaaugcugg ccucugccgg cgaacugcag 3660

aagggaaacg aacuggcccu gcccuccaaa uaugugaacu uccuguaccu ggccagccac 3720

uaugagaagc ugaagggcuc ccccgaggau aaugagcaga aacagcuguu uguggaacag 3780

cacaagcacu accuggacga gaucaucgag cagaucagcg aguucuccaa gagagugauc 3840

cuggccgacg cuaaucugga caaagugcug uccgccuaca acaagcaccg ggauaagccc 3900

aucagagagc aggccgagaa uaucauccac cuguuuaccc ugaccaaucu gggagccccu 3960

gccgccuuca aguacuuuga caccaccauc gaccggaaga gguacaccag caccaaagag 4020

gugcuggacg ccacccugau ccaccagagc aucaccggcc uguacgagac acggaucgac 4080

cugucucagc ugggaggcga c 4101

<210> 2

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> artificial

<400> 2

gcugguacac ggcaggguca 20

<210> 3

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> artificial

<400> 3

cucucagcug guacacggca 20

<210> 4

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> artificial

<400> 4

auuuguuuga gaaucaaaau 20

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<212> RNA

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<220>

<223> artificial

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ucucucagcu gguacacggc 20

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<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> artificial

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acucucucuu ucuggccugg 20

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<223> artificial

<400> 7

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<210> 8

<211> 20

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<223> artificial

<400> 8

cgcgagcaca gcuaaggcca 20

<210> 9

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> artificial

<400> 9

ucacgucauc cagcagagaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> artificial

<400> 10

gcuacucucu cuuucuggcc 20

<210> 11

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> artificial

<400> 11

uuugacuuuc cauucucugc 20

<210> 12

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> artificial

<400> 12

cgugaguaaa ccugaaucuu 20

<210> 13

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> artificial

<400> 13

cucgcgcuac ucucucuuuc 20

<210> 14

<211> 246

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> artificial

<400> 14

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val

115 120 125

Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val

130 135 140

Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr Val Met

145 150 155 160

His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr

165 170 175

Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly

180 185 190

Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu

195 200 205

Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val His Tyr Cys Ala Arg

210 215 220

Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

225 230 235 240

Leu Val Thr Val Ser Ala

245

<210> 15

<211> 135

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> artificial

<400> 15

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 16

<211> 72

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> artificial

<400> 16

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gc 72

<210> 17

<211> 126

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> artificial

<400> 17

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 18

<211> 336

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> artificial

<400> 18

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

<210> 19

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> artificial

<400> 19

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 20

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> artificial

<400> 20

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Lys Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Val Met His Trp Val Lys Gln Lys Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Tyr Asn Asp Val Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ser Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val His Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Ser Tyr Tyr Asp Tyr Asp Gly Phe Val Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 21

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> artificial

<400> 21

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 22

<211> 321

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial

<400> 22

gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60

atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120

gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180

aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240

gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300

gggaccaagc tggagatcac a 321

<210> 23

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial

<400> 23

ggtggcggtg gctcgggcgg tggtgggtcg ggtggcggcg gatct 45

<210> 24

<211> 360

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Artificial

<400> 24

gaggtgaaac tgcaggagtc aggacctggc ctggtggcgc cctcacagag cctgtccgtc 60

acatgcactg tctcaggggt ctcattaccc gactatggtg taagctggat tcgccagcct 120

ccacgaaagg gtctggagtg gctgggagta atatggggta gtgaaaccac atactataat 180

tcagctctca aatccagact gaccatcatc aaggacaact ccaagagcca agttttctta 240

aaaatgaaca gtctgcaaac tgatgacaca gccatttact actgtgccaa acattattac 300

tacggtggta gctatgctat ggactactgg ggccaaggaa cctcagtcac cgtctcctca 360

Claims

1.一种纯化通用型人类CAR-T细胞的方法，该方法包括：

2.根据权利要求1所述的方法，其中，将所述靶向TCRα/β的mRNA通过瞬时转染导入CAR-T细胞中。

抗TCRα/β的scFv分子的轻链可变区如SEQ ID NO：19(QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSATSSVSYMHWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSSNPLTFGAGTKLELK)所示；以及

抗TCRα/β的scFv分子的重链可变区如SEQ ID NO：20(EVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYKFTSYVMHWVKQKPGQGLEWIGYINPYNDVTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVHYCARGSYYDYDGFVYWGQGTLVTVSA)所示。