CN110564691A - Hla纯合子来源的通用型car-t细胞的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发提供了基于HLA纯合子来源的通用型CAR‑T细胞的制备方法。本发明通过收集常见型别纯合子PBMC,构建不同HLA‑A/B型别纯合子PBMC细胞库或诱导生成iPSC细胞库。在此基础上根据病人HLA型别进一步诱导相应PBMC或iPSC到成熟T细胞,并敲除TCR并表达CAR结构,给予这种通用型CAR‑T就可以做到完全克服免疫排斥的问题。本发明在CAR结构中加入了Suicide分子开关元件,保证了临床使用安全性,可以有效的终止细胞因子风暴等不良反应。同时该方案只通过一步CRISPR/Cas9达到插入CAR并沉默TCR的目的,并且省去了敲除MHC‑I类分子的步骤,就能够避免宿主对CAR‑T的排斥,比已有的常规方法步骤更省更方便。
Description
技术领域
本发明涉及免疫学和分子生物学领域,特别涉及CAR-T细胞。
背景技术
目前,美国FDA已经批准了诺华公司两款自体CAR-T细胞产品上市,用于治疗淋巴瘤和白血病。大量的临床试验证明了这种个性化的疗法极具抗癌潜力,没有免疫排斥的风险,安全性也比较高。但在产品上市之后,生产制备时间长,并且足够的细胞仅能用于可变参量(患者体重参差不齐)的单剂量治疗,所导致的高额治疗费用也另很多患者望而却步。因此能够大大缩短产品的开发时间,更具成本效益的同种异体CAR-T细胞(通用CAR-T)疗法便顺应发展趋势,成功在细胞治疗领域掀起了研发热,其中参与布局的不乏Gilead/Kite和辉瑞等全球制药巨头。
当前常见的通用型CAR-T细胞产品基本采用单一敲除TCR的方法,因此不具有对宿主的MHC-I类分子的识别并激活能力,可以避免移植物抗宿主反应(GvHD),但是通用型CAR-T细胞表面MHC-I分子的表达,会导致其被激活的宿主T细胞清除而影响治疗效果,如果同时敲除TCR和β2M(MHC-I类分子的重要组合蛋白,敲除后MHC-I组装不起来),但缺少MHC-I分子又会导致通用型CAR-T细胞在体内被宿主NK细胞杀伤。在此基础上又有人企图通过再过表达HLA-E分子,避免通用型CAR-T细胞被宿主NK的杀伤,但是尽管如此也无法完全避免宿主NK的杀伤,并且随着敲除和转化步骤的增多,目的细胞的比例变得越来越低。
目前国内对通用CAR-T的研究与应用尚处于初步阶段,但是我公司计划开发的通用型CAR-T有自己的独特优势,前面列举各个公司的通用型CAR-T产品,虽然排除了抑制物抗宿主反应(GvHD),但是没有排除宿主抗移植物反应(HvGR),尽管也能起到一定效果,但是这种CAR-T细胞在体内存活时间短,并且诱导生成的Central memory T细胞比例和数量少。
发明内容
基于当前通用型CAR-T以上种种问题,根据理论及发明人长期研究表明克服免疫排斥最好的情况,是对受体与供体细胞进行HLA配型。发明人研究表明具体到T细胞,当敲除供体T细胞TCR后,可使其不具有移植物抗宿主效应,同时T细胞在正常状态下HLA-DR/DQ等MHC-II类分子不表达,而HLA-A/B两个位点正常表达,并是与急性免疫排斥相关位点。如果供体T细胞HLA-A/B这2个位点是纯合子,宿主无论是纯合子还是杂合子只要带有供体HLA-A/B的单体型就不会对供体细胞产生免疫排斥(HvGR)。因为宿主T细胞经过胸腺的阴选过程,不会具有对相同单体型的细胞产生反应的T细胞。同时给予的通用型CAR-T细胞,由于TCR的敲除也不会对宿主产生排斥反应(GvHD)。结合发明人在人HLA分型领域研究中的长期经验,创造性的提出以下科学设想:虽然经典的MHC-I类分子HLA-A/B/C具有高度多态性,分别有2132、2798、1672种不同基因型别,但是,在特定人群中其分布成特定的比例,特定人群中由于感染性疾病等自然选择,以及婚配都局限在一定的范围,使得大部分人HLA都只是几种常见型别的组合,即使是罕见单体型也常与常见型别呈杂合子形式出现,HLA-A/B两个位点是与急性免疫排斥相关的位点,约20种特定的A/B型别纯合子组合的T细胞敲除TCR后,可以涵盖70%以上的中国人群使用。
本发明开发的通用型CAR-T细胞产品基于申请人强大的细胞库基础,通过将常见型别纯合子PBMC诱导生成iPSC,构建不同HLA-A/B型别纯合子的iPSC细胞库。在此基础上根据病人HLA型别进一步诱导相应iPSC到成熟T细胞并敲除TCR表达CAR结构,并给予这种通用型CAR-T就可以做到完全克服免疫排斥的问题。同时也能够实现现取现用的目的。也可以直接通过HLA-A/B型别纯合子的PBMC敲除TCR表达CAR结构实现。同时该方案只通过一步CRISPR/Cas9达到插入CAR并沉默TCR的目的,并且省去了敲除MHC-I类分子的步骤,就能够避免宿主对CAR-T的排斥,比已有的常规方法步骤更省更方便。同时安全性更高,杀伤效果更好。
本发明其中一方面提供了通用型CAR-T细胞的制备方法,本通用型CAR-T细胞的制备方法所制备的通用型CAR-T细胞是基于HLA纯合子细胞来源的通用型CAR-T细胞。
本发明其中一方面还提供了通用型CAR-T细胞的制备方法,该通用型CAR-T细胞的制备方法中基于HLA纯合子细胞来源的通用型CAR-T细胞的HLA纯合子细胞来源为iPSC细胞库,构建iPSC细胞库的细胞来源于HLA型别纯合子组合的PBMC。
本发明其中一方面还提供了通用型CAR-T细胞的制备方法,该通用型CAR-T细胞的制备方法中基于HLA纯合子细胞来源的通用型CAR-T细胞的HLA纯合子细胞来源为HLA型别纯合子组合的PBMC。
本发明其中一方面还提供了通用型CAR-T细胞的制备方法,该通用型CAR-T细胞的制备方法中,上述HLA型别纯合子组合的PBMC来源于如下HLA型别纯合子组合的PBMC:
HLA-A位点A*11:01、A*24:02、A*02:07、A*02:01、A*33:03、A*02:03单体型纯合子和/或HLA-B位点B*40:01、B*46:01、B*58:01、B*15:02、B*13:01单体型纯合子的任意相互组合。其中和/或表示可以是A-B两个位点都是纯合子,或者只有A位点是纯合子,或者只有B位点是纯合子。
本发明其中一方面还提供了通用型CAR-T细胞的制备方法,该方法包括如下步骤
步骤1.采用磁珠分选获得高纯度的CD3+T细胞,培养并进行活化处理;
步骤2.利用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑,构建CAR表达载体;
步骤3.采用腺相关病毒包装上述步骤2所得的CAR表达载体,扩增,得到携带CAR的腺相关病毒,并侵染上述步骤1所得的CD3+T细胞;
步骤4.步骤3所得的T细胞扩增培养,并采用磁珠分选得到通用型CAR-T细胞。
本发明其中一方面还提供了通用型CAR-T细胞的制备方法,上述步骤2中CAR表达载体携带的CAR基因含有Suicide基因片段,其核苷酸序列为SEQ ID No.8所示。
SEQ ID No.8:
本发明其中一方面还提供了通用型CAR-T细胞的制备方法,上述步骤2中上述CAR表达载体中插入片段由EcoRI酶切位点+TRAC左同源臂+CAR基因+TRAC右同源臂+BamHI酶切位点;通过酶切位点接入载体pAAV-MCS,完成表达载体质粒构建。
本发明其中一方面还提供了通用型CAR-T细胞的制备方法,上述CAR表达载体中携带的CAR基因包含KOZAC-scFv CD19 fmc63(19)-CD3ζ-CD28-CD137(4-1BB)-T2A-Suicide片段,KOZAC-scFv CD19 fmc63(19)-CD3ζ-CD28-CD137(4-1BB)-T2A-Suicide片段核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,KOZAC-scFv CD19 fmc63(19)-CD28-CD137(4-1BB)-CD3ζ-T2A-Suicide片段,由KOZAC基因片段、scFv CD19 fmc63(19)基因片段、CD28基因片段、CD137(4-1BB)基因片段、CD3ζ基因片段、T2A肽基因片段、Suicide基因片段依次连接而成。
SEQ ID No.1:
本发明其中一方面还提供了通用型CAR-T细胞的制备方法,上述KOZAC基因片段、scFv CD19 fmc63(19)基因片段、CD28基因片段、CD137(4-1BB)基因片段、CD3ζ基因片段、T2A肽基因片段、Suicide基因片段的核苷酸序列依次如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示。
SEQ ID No.2:
accatgg 7
SEQ ID No.3:
SEQ ID No.4:
SEQ ID No.5:
SEQ ID No.6:
SEQ ID No.7:
gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtcgagg agaatcctgg ccca 54
SEQ ID No.8:
本发明其中一方面还提供了通用型CAR-T细胞的制备方法,上述腺相关病毒包装还包括扩增、侵染;上述腺相关病毒包装采用转染试剂TransIT2020,上述腺相关病毒包装方法为表达质粒与辅助质粒pAAV-RC、pAAV-Helper转入293T细胞进行包装、扩增,24h和/或48h后收集腺相关病毒颗粒,-80℃保存。
本发明其中一方面还提供了通用型CAR-T细胞的制备方法,上述腺相关病毒为腺相关病毒AAV6,侵染T细胞为将携带CAR的腺相关病毒通过同源整合到宿主T细胞TRAC第一外显子基因位点。
本发明还提供了一种基于HLA纯合子来源的通用型CAR-T细胞的应用,该应用为上述任意一种方法所制备的通用型CAR-T细胞用做肿瘤治疗药。
根据本发明技术其中一方面,本发明的其中一种通用型CAR-T细胞的制备方法如下:
(1)HLA-A/B位点纯合子PBMC收集
不同健康人外周血PBMC提DNA,对经典MHC-I类分子A/B位点PCR-SBT测序分型。收集HLA-A/B位点为纯合子的健康人外周血PBMC。
(2)CRISPR/Cas9定点插入CAR编码基因入TCR基因座位构建CAR-T细胞
CAR结构的设计,使用鼠源的第三代抗人CD19 ScFv结构,同时含有4-1BB和CD3ζ两个共激活结构域。此外在CAR结构编码序列后还添加了一个suicide基因,该基因表达蛋白能够被克隆号QBEND-10的CD34抗体识别,因此能够通过Miltenyi CliniMACS的CD34筛选系统进行临床级别的分选;此外还含有两个利妥昔单抗的模拟表位,能够在发生安全问题时,通过利妥昔单抗迅速清除CAR-T细胞。
CAR结构采用CRISPR/Cas9技术插入TRAC基因座位,可以一方面插入失活T细胞TCR实现TCR的敲除,另一方面,置于TRAC启动子调节之下,可以使得CAR结构得到稳定并表达程度适宜的CAR-T细胞。CAR-T细胞CAR结构的适度表达尤为重要,决定着CAR-T细胞的激活程度,如果CAR结构表达量不够会导致CAR-T细胞杀伤不足;而CAR结构表达过高会导致CAR-T细胞过度活化,大部分细胞向effector memory T细胞转化而不是向central memory T细胞转化,而central memory T细胞是发挥长期抗肿瘤效应的最重要的T细胞类群。
CRISPR/CAS9是现有常用的一种基因敲除手段,其工作原理是crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物,此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点剪切双链DNA。而通过人工设计这两种RNA,可以改造形成具有引导作用的sgRNA(short guide RNA),足以引导Cas9对DNA的定点切割。
CRISPR/Cas9被广泛应用于基因敲除,但其也具有定点插入基因的作用。其原理是gRNA-tracrRNA/crRNA的gRNA通过碱基配对与T细胞的目的序列结合,tracrRNA/crRNA复合物引导核酸酶Cas9蛋白在目的序列靶位点剪切双链DNA;然后通过设计带有左右臂并含有CAR序列的腺相关病毒,利用左右臂与T细胞TRAC基因配对,并通过腺相关病毒将CAR整合到T细胞基因组中,同时实现免疫排斥反应相关基因敲除和CAR-T的基因敲入工作。
采用CRISPR/Cas9一步将CAR结构插入TRAC座位(TCRα链编码基因),同时细胞是HLA-A/B位点对病人进行配型匹配的T细胞,只需一步就完成了通用型CAR-T细胞的制备,因此获得的阳性效率更高,成本也更省。一般情况下每增加一步CRISPR/Cas9或病毒转染,阳性率要下降30%作用。
作为本发明上述方法的优选实施方式,上述“步骤(1)HLA-A/B位点纯合子PBMC收集”中,上述PBMC细胞来源于如下HLA型别纯合子相互组合的PBMC如下:
包含但不限于HLA-A位点A*11:01、A*24:02、A*02:07、A*02:01、A*33:03、A*02:03单体型纯合子和/或HLA-B位点B*40:01、B*46:01、B*58:01、B*15:02、B*13:01单体型纯合子的相互组合。
作为本发明上述方法的优选实施方式,上述“步骤(2)CRISPR/Cas9定点插入CAR编码基因入TCR基因座位构建CAR-T细胞”中,具体的步骤如下:
1.采用磁珠分选获得高纯度的CD3+T细胞,进行活化处理;
2.利用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑,构建CAR表达载体;
3.采用腺相关病毒包装上面步骤所得的CAR表达载体,扩增,得到携带CAR的腺相关病毒,并侵染T细胞;
4.T细胞扩增培养,并采用磁珠分选得到CAR-T细胞。
作为本发明上述方法的优选实施方式,上述“步骤(2)CRISPR/Cas9定点插入CAR编码基因入TCR基因座位构建CAR-T细胞”中,上述CAR表达载体中插入片段由EcoRI酶切位点+TRAC左同源臂+CAR基因+TRAC右同源臂+BamHI酶切位点。通过酶切位点接入载体pAAV-MCS,完成表达载体质粒构建。腺相关病毒包装、扩增、侵染:采用转染试剂TransIT2020,将上述表达质粒与辅助质粒pAAV-RC\pAAV-Helper转入293T细胞进行包装、扩增,24h和/或48h后收集腺相关病毒颗粒,-80℃保存。
作为本发明上述方法的优选实施方式,上述“步骤(2)CRISPR/Cas9定点插入CAR编码基因入TCR基因座位构建CAR-T细胞”中,CAR表达载体中携带的CAR基因包含KOZAC-scFvCD19 fmc63(19)-CD28-CD137(4-1BB)-CD3ζ-T2A-Suicide片段,其核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示,上述KOZAC-scFv CD19 fmc63(19)-CD28-CD137(4-1BB)-CD3ζ-T2A-Suicide片段由KOZAC基因片段、scFv CD19 fmc63(19)基因片段、CD28基因片段、CD137(4-1BB)基因片段、CD3ζ基因片段、T2A肽基因片段、Suicide基因片段依次连接而成,上述KOZAC基因片段、scFv CD19 fmc63(19)基因片段、CD28基因片段、CD137(4-1BB)基因片段、CD3ζ基因片段、T2A肽基因片段、Suicide基因片段的核苷酸序列依次如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ IDNo.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示。
作为本发明上述方法的优选实施方式,上述“步骤(2)CRISPR/Cas9定点插入CAR编码基因入TCR基因座位构建CAR-T细胞”中,腺相关病毒为腺相关病毒AAV6,侵染T细胞为将携带CAR的腺相关病毒通过同源整合到宿主T细胞TRAC第一外显子基因位点。
本发明在CAR结构中加入了Suicide分子开关元件,该分子开关分子量小且由两种抗原表位组成,临床上可以应用利妥昔单抗和QBEND10单抗等通过抗体的ADCC效应与CDC效应可以直接诱导CAR-T的细胞凋亡,保证了CAR-T细胞的临床使用安全性,可以有效的终止细胞因子风暴等不良反应。
附图说明
图1:本发明方法构建的通用CAR-T的结构模式图;
图2:细胞杀伤肿瘤细胞毒IFN-γ检测统计;
图3:流式分析本发明方法获得的TRAC(-)CAR-T效率;
图4:流式分析本发明方法获得的通用CAR-T与常规逆转录病毒转染获得的CAR-T的CAR蛋白表达的差异;
图5:本发明方法构建的通用CAR-T显示出更好的留存率;
图6:本发明方法构建的通用CAR-T显著降解肿瘤细胞的数目;
图7:本发明方法构建的通用CAR-T在肿瘤细胞附近的检出率更高;
图8:本发明方法构建的通用CAR-T治疗病人显示出能诱导病人产生更高比例的自体Effector memory T和更低比例的Effector T;
图9:本发明方法构建的通用CAR-T体外被靶向细胞刺激后抑制CAR-T细胞过度分化产生更高比例Central memory T和更低比例的Effector T。
图10:本发明方法构建的通用CAR-T能在体外被QBEND10单抗通过CDC效应被选择清除。
具体实施方式
下述的实施例是为了进一步说明本发明的一些优选实施例,并非全部实施例。本领域专业人员在没有进行创造性劳动的前提下做出的基于本发明的其他实施例,都属于本发明的权利保护范围。下面将结合附图对本发明作进一步的说明。
实施例1:
(1)gRNA设计:以TRAC基因的第一个外显子序列为设计对象,gRNA序列如下:
TRAC gRNA sequence:
5′-GGGTGTCTATAGGTCTTGGGAC-3′
3′-CCCACAGATATCCAGAACCCTG-5′
Cas9 mRNA:SEQ ID No.9。如下:
(2)CD3+T细胞分离活化:iPSC与OP9-DlL4共培养体系诱导的T细胞,经MidiMACSStarting Kit(LS)CD3+分选试剂盒分选,获得纯度大于95%的CD3+T细胞,培养24小时后,1:1000加入T Cell TransAct试剂,37℃5%CO2连续培养4天后进行基因编辑工作。
(3)CRISPR/Cas基因编辑技术:采用Lipofectamine CRISPRMAX转染试剂盒的方法,将分别带有TCR引导序列的gRNA和Cas9 mRNA转入T细胞(5μg RNA/3×106细胞),37℃5%CO2培养4h。
(4)CAR序列融合:带有目的质粒的腺病毒载体侵染(3)中的T细胞,37℃5%CO2培养3天,通过TRAC的左右臂将CAR序列(Seq ID No.1)整合到T细胞的TCRα中,利用其表达系统表达和递呈CAR,完成通用型CAR-T的改造,本发明的通用CAR-T的整体结构模式图见图1。
实施例2:伤功能和细胞毒性检测
本方案构建的通用CAR-T细胞、CD19CAR-T细胞、T细胞、空白对照与Daudi细胞共培养24h,监测细胞表面CD107a,用以评估CAR-T细胞对CD19+细胞的杀伤功能。同时通过ELSA检测细胞分泌IFNγ来反应CAR-T CD19的细胞毒性,结果如图2所示。由图2可知,本方案构建的通用CAR-T细胞与传统逆转录病毒制备CAR-T细胞的细胞毒性没有明显差异(结果如图2:细胞杀伤肿瘤细胞毒IFN-γ检测统计)。
本方案优化的CRISPR/Cas基因编辑技术能有效删除TCR的表达,使得TCR阴性细胞达到40-60%。加入AAV后能够获得45%左右的TCR-Car+细胞。表明该系统效率高具有临床应用价值(结果如图3:流式分析本方法获得的TCR-Car+细胞效率)。
流式分析本方法获得的通用CAR-T与逆转录病毒转染获得的CAR-T的CAR蛋白表达的差异。CAR靶向结构由于蛋白在TRAC特定的启动子下表达,CAR MFI表达均一,相比逆转录随机插入的明显区别(结果如图4:流式分析本方法获得的通用CAR-T与常规逆转录病毒转染获得的CAR-T的CAR蛋白表达的差异)。
采用本方案构建的纯合子通用型CAR-T临床治疗白血病病人(组A),并与本方案构建的非纯合子通用型CAR-T治疗病人(组B)和常规CD19靶向的CAR-T治疗病人(组C)进行比较。在处理17天后采用本方案构建的纯合子通用型CAR-T显示出更好的留存率(图5);并且病人肿瘤细胞数量显著降低,而其他各组却是升高的(图6)。本方案构建的纯合子通用型CAR-T处理病人组相比其他各组,肿瘤细胞表面能检测到更高数量的CAR T细胞(图7),并且病人外周血流式分析显示出更高比例的Effector memory T和更低比例的effector T(图8)。
其中如图5所示:本方法构建的通用CAR-T显示出更好的留存率。组A:本方案构建的纯合子通用型CAR-T治疗病人;组B:本方案构建的非纯合子通用型CAR-T治疗病人;组C:常规CD19靶向的CAR-T治疗病人。
其中如图6所示:本方法构建的通用CAR-T显著降解肿瘤细胞的数目。组A:本方案构建的纯合子通用型CAR-T治疗病人;组B:本方案构建的非纯合子通用型CAR-T治疗病人;组C:常规CD19靶向的CAR-T治疗病人。
其中如图7所示:本方法构建的通用CAR-T在肿瘤细胞附近的检出率更高。组A:本方案构建的纯合子通用型CAR-T治疗病人;组B:本方案构建的非纯合子通用型CAR-T治疗病人;组C:常规CD19靶向的CAR-T治疗病人。
其中图8所示:本方法构建的通用CAR-T治疗病人显示出更高比例的Effectormemory T和更低比例的Effector T。组A:本方案构建的纯合子通用型CAR-T治疗病人;组B:本方案构建的非纯合子通用型CAR-T治疗病人;组C:常规CD19靶向的CAR-T治疗病人。
体外实验比较表明CAR结构表达置于TRAC启动子调节下,能阻止CAR-T细胞过度分化,使得大部分CAR-T细胞在靶向细胞的刺激下分化为Central memory T,而Centralmemory T是产生长效抗肿瘤的效应的细胞;并且使得Effector T细胞比例低,可使得炎症因子风暴水平低并可控(图9)。同时本发明构建的通用CAR-T能在体外被QBEND10单抗通过CDC效应被清除(图10)。
其中图9所示:本方法构建的通用CAR-T体外采用CD19阳性细胞不同时间点多次刺激后能分化生成大量Central memory T。组A:本方案构建的CD19靶向的纯合子通用型CAR-T细胞;组B:常规方法构建的CD19靶向的CAR-T细胞;组C:常规方法构建的CD19靶向并且TCR敲除的CAR-T细胞;常规方法构建的无靶向的对照CAR-T细胞。CD45RA+CD62L+为Naive T,CD45RA-CD62L+为Central memory T,CD45RA-CD62L-为Effector memory T,CD45RA+CD62L+为Effector T。
最后所应当说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制,尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
序列表
<110> 青岛华赛伯曼医学细胞生物有限公司
<120> HLA纯合子来源的通用型CAR-T细胞的制备方法
<130> 2019
<141> 2019
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1902
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
accagggaca tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga 60
gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagtaaat atttaaattg gtatcagcag 120
aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc taccatacat caagattaca ctcaggagtc 180
ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 240
gagcaagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtacacgttc 300
ggagggggga ctaagttgga aataacacgg gctgatgctg caccaactgt atccatcttc 360
ccaccatcca gtaatggctc cacctctgga tccggcaagc ccggatctgg cgagggatcc 420
accaagggcg aggtgaaact gcaggagtca ggacctggcc tggtggcgcc ctcacagagc 480
ctgtccgtca catgcactgt ctcaggggtc tcattacccg actatggtgt aagctggatt 540
cgccagcctc cacgaaaggg tctggagtgg ctgggagtaa tatggggtag tgaaaccaca 600
tactataatt cagctctcaa atccagactg accatcatca aggacaactc caagagccaa 660
gttttcttaa aaatgaacag tctgcaaact gatgacacag ccatttacta ctgtgccaaa 720
cattattact acggtggtag ctatgctatg gactactggg gtcaaggaac ctcagtcacc 780
gtctcctcaa ggagtaagag gagcaggctc ctgcacagtg actacatgaa catgactccc 840
cgccgccccg ggcccacccg caagcattac cagccctatg ccccaccacg cgacttcgca 900
gcctatcgct ccaaacgggg cagaaagaaa ctcctgtata tattcaaaca accatttatg 960
agaccagtac aaactactca agaggaagat ggctgtagct gccgatttcc agaagaagaa 1020
gaaggaggat gtgaactgag agtgaagttc agcaggagcg cagacgcccc cgcgtaccag 1080
cagggccaga accagctcta taacgagctc aatctaggac gaagagagga gtacgatgtt 1140
ttggacaaga gacgtggccg ggaccctgag atggggggaa agccgagaag gaagaaccct 1200
caggaaggcc tgtacaatga actgcagaaa gataagatgg cggaggccta cagtgagatt 1260
gggatgaaag gcgagcgccg gaggggcaag gggcacgatg gcctttacca gggtctcagt 1320
acagccacca aggacaccta cgacgccctt cacatgcagg ccctgccccc tcgcgagggc 1380
agaggaagtc tgctaacatg cggtgacgtc gaggagaatc ctggcccaat gggcaccagc 1440
ctgctgtgct ggatggccct gtgcctgctg ggcgccgacc acgccgacgc ctgcccctac 1500
agcaacccca gcctgtgcag cggcggcggc ggcagcgagc tgcccaccca gggcaccttc 1560
agcaacgtga gcaccaacgt gagccccgcc aagcccacca ccaccgcctg cccctacagc 1620
aaccccagcc tgtgcagcgg cggcggcggc agccccgccc ccaggccccc cacccccgcc 1680
cccaccatcg ccagccagcc cctgagcctg aggcccgagg cctgcaggcc cgccgccggc 1740
ggcgccgtgc acaccagggg cctggacttc gcctgcgaca tctacatctg ggcccccctg 1800
gccggcacct gcggcgtgct gctgctgagc ctggtgatca ccctgtactg caaccacagg 1860
aacaggagga gggtgtgcaa gtgccccagg cccgtggtgt aa 1902
<210> 2
<211> 7
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
accatgg 7
<210> 3
<211> 783
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
gacatccaga tgacacagac tacatcctcc ctgtctgcct ctctgggaga cagagtcacc 60
atcagttgca gggcaagtca ggacattagt aaatatttaa attggtatca gcagaaacca 120
gatggaactg ttaaactcct gatctaccat acatcaagat tacactcagg agtcccatca 180
aggttcagtg gcagtgggtc tggaacagat tattctctca ccattagcaa cctggagcaa 240
gaagatattg ccacttactt ttgccaacag ggtaatacgc ttccgtacac gttcggaggg 300
gggactaagt tggaaataac acgggctgat gctgcaccaa ctgtatccat cttcccacca 360
tccagtaatg gctccacctc tggatccggc aagcccggat ctggcgaggg atccaccaag 420
ggcgaggtga aactgcagga gtcaggacct ggcctggtgg cgccctcaca gagcctgtcc 480
gtcacatgca ctgtctcagg ggtctcatta cccgactatg gtgtaagctg gattcgccag 540
cctccacgaa agggtctgga gtggctggga gtaatatggg gtagtgaaac cacatactat 600
aattcagctc tcaaatccag actgaccatc atcaaggaca actccaagag ccaagttttc 660
ttaaaaatga acagtctgca aactgatgac acagccattt actactgtgc caaacattat 720
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tca 783
<210> 4
<211> 123
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
aggagtaaga ggagcaggct cctgcacagt gactacatga acatgactcc ccgccgcccc 60
gggcccaccc gcaagcatta ccagccctat gccccaccac gcgacttcgc agcctatcgc 120
tcc 123
<210> 5
<211> 126
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 6
<211> 336
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtacc agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 7
<211> 54
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gagggcagag gaagtctgct aacatgcggt gacgtcgagg agaatcctgg ccca 54
<210> 8
<211> 471
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
atgggcacca gcctgctgtg ctggatggcc ctgtgcctgc tgggcgccga ccacgccgac 60
gcctgcccct acagcaaccc cagcctgtgc agcggcggcg gcggcagcga gctgcccacc 120
cagggcacct tcagcaacgt gagcaccaac gtgagccccg ccaagcccac caccaccgcc 180
tgcccctaca gcaaccccag cctgtgcagc ggcggcggcg gcagccccgc ccccaggccc 240
cccacccccg cccccaccat cgccagccag cccctgagcc tgaggcccga ggcctgcagg 300
cccgccgccg gcggcgccgt gcacaccagg ggcctggact tcgcctgcga catctacatc 360
tgggcccccc tggccggcac ctgcggcgtg ctgctgctga gcctggtgat caccctgtac 420
tgcaaccaca ggaacaggag gagggtgtgc aagtgcccca ggcccgtggt g 471
<210> 9
<211> 4047
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
atgaaaagcg aaaaaaaata ttatatcgga ttggatgtag gtactaatag tgtaggatgg 60
gctgtgactg acgaattcta taatattctt agagccaaag gaaaagattt gtggggagta 120
agattatttg aaaaagcaga cactgcagca aacacaagaa tatttagaag tggtagaaga 180
agaaacgaca gaaaaggtat gcgtcttcaa attttgagag aaatttttga agatgaaatc 240
aaaaaggttg acaaagactt ctatgacaga cttgatgaaa gcaaattctg ggctgaagac 300
aagaaagtat ctgggaaata ttcgttattt aatgataaaa atttcagcga caagcaatat 360
tttgaaaagt ttcctactat ttttcatctt agaaaatatt taatggaaga acatggaaaa 420
gtagacatta gatactattt tctagctatc aatcaaatga tgaaaagaag gggacatttt 480
ctaatagatg gtcagatttc tcacgttaca gatgataaac cattaaaaga acaacttatt 540
ctattaataa atgatttatt aaaaatcgaa ttagaagaag agcttatgga ttcgatattt 600
gaaattttgg cggatgtgaa cgagaaaaga acagacaaga aaaacaatct aaaagagctt 660
ataaaaggac aagattttaa taaacaagaa ggtaacatcc taaactcgat ttttgaatca 720
atagttactg gtaaagcaaa aataaaaaat ataatttcag atgaagacat tcttgaaaaa 780
ataaaggaag ataacaagga agatttcgtt cttacaggag atagctacga ggaaaatctc 840
caatattttg aggaagtttt acaagaaaac ataacattgt ttaacacact taaatcaaca 900
tatgattttt taatccttca atctatttta aaaggtaaga gcacactttc tgatgcacaa 960
gtcgaacgat acgatgaaca taaaaaagac ctcgaaatac ttaaaaaagt aataaaaaaa 1020
tacgatgaag atggaaaatt gttcaagcaa gtattcaagg aagataatgg aaatggatat 1080
gtttcatata ttggatatta tttgaacaaa aacaaaaaga ttaccgcaaa gaagaaaata 1140
tcaaatattg aatttacaaa atacgttaaa ggaattcttg aaaaacaatg cgactgtgaa 1200
gatgaagatg ttaagtattt attggggaaa atagaacaag aaaactttct attaaaacaa 1260
atatcatcca taaattcggt tattccacat caaattcacc tttttgaatt agataaaata 1320
ttggaaaact tagccaaaaa ctaccctagc tttaataata agaaggaaga atttacaaaa 1380
atagaaaaga tcagaaaaac atttacattt aggattccat attatgttgg accattaaat 1440
gattatcaca aaaacaatgg cggaaatgct tggatattca gaaataaagg cgaaaaaata 1500
agaccatgga attttgaaaa aatagttgat cttcataaaa gtgaagaaga atttatcaaa 1560
agaatgctaa atcaatgcac ttatcttcca gaagagacag ttcttcctaa atcttctatt 1620
ctttattcag aatatatggt gctaaatgaa ttgaataatt tgaggattaa tggaaagcca 1680
ctagataccg atgttaagtt gaaattaatt gaagaattat tcaagaaaaa gacaaaagtc 1740
actctcaaat cgatcagaga ttatatggta aggaataact ttgcagataa agaagacttt 1800
gataattcag agaaaaactt ggaaatagca tccaatatga aatcatatat tgattttaac 1860
aatatattag aagacaagtt tgacgtagaa atggtggaag atctcattga gaaaattaca 1920
attcatacgg gaaataagaa acttttgaaa aaatacatcg aggaaactta tcccgattta 1980
tcaagttctc aaattcaaaa aattatcaac cttaaataca aagattgggg aagattatca 2040
agaaaattat tagacggaat aaaaggaaca aaaaaagaaa cagaaaagac tgatactgta 2100
attaatttct tgagaaattc aagtgacaat ttgatgcaaa taattggaag ccaaaattac 2160
agctttaatg aatatattga taagttaagg aaaaaatata ttcctcaaga aataagttat 2220
gaagtggttg aaaatcttta cgtatctcca tctgtaaaaa agatgatatg gcaagttata 2280
agagttacag aagaaatcac aaaggttatg ggatatgacc cggataaaat cttcatagaa 2340
atggcaaaat ctgaagagga aaaaaagacg acaatttcta gaaaaaataa attactagac 2400
ctatataagg cgataaaaaa agatgaaaga gatagtcaat atgaaaagct attaacaggg 2460
ttgaataaat tagacgatag cgatcttaga agcagaaaac tttatcttta ctacactcaa 2520
atgggtagag atatgtacac tggcgaaaag attgacctgg ataaattatt cgattctaca 2580
cactacgata aagaccacat aatacctcaa agtatgaaaa aagatgattc gataataaac 2640
aacttggtat tagtaaataa aaatgcaaac caaaccacaa aaggcaacat ataccctgta 2700
ccatccagta taagaaacaa tccaaagatt tacaattact ggaagtattt gatggaaaaa 2760
gagttcatca gcaaagaaaa atacaataga ttaataagaa atacaccact aacaaatgaa 2820
gaacttggcg gattcatcaa cagacaactt gtagaaacaa gacaatcaac aaaagcaatc 2880
aaagaattat ttgaaaagtt ctaccaaaaa tcaaaaataa tacctgtaaa agcaagtctt 2940
gcaagtgatt tgagaaaaga catgaatacc cttaaatcca gagaagtaaa tgaccttcac 3000
catgctcacg atgcgttttt gaatattgta gcaggagatg tgtggaatcg agagttcaca 3060
tcaaatccaa taaattatgt caaagaaaac agagaaggtg acaaggtaaa atattcgtta 3120
agcaaagatt ttacaagacc tcgtaaatcc aaaggaaaag ttatctggac acctgaaaaa 3180
ggtagaaaat tgattgtaga tacattgaat aaaccatcag ttctaatcag caatgaaagt 3240
catgtaaaaa aaggagagtt attcaacgct accattgcag ggaaaaagga ttacaagaaa 3300
ggtaaaatat atcttccact aaaaaaagac gatagattac aagatgtatc gaaatatgga 3360
ggatataagg ctataaatgg agcgttcttt ttcttggtag agcatactaa aagcaagaaa 3420
agaataagaa gcatagaatt atttccgtta catttgctta gtaaatttta tgaagataaa 3480
aatacagtat tagattatgc gataaatgta ttgcaattac aagatccaaa gataataata 3540
gacaaaatta attatcgtac agaaataatt atagataatt ttagttattt aatatccact 3600
aaatcgaatg atggtagtat aactgttaaa ccaaatgagc aaatgtattg gagagttgat 3660
gaaatttcga atttgaaaaa aatagaaaat aaatacaaaa aagatgccat attaacagaa 3720
gaggatagaa aaattatgga gagttatatt gataaaatct atcaacaatt caaggcagga 3780
aaatacaaga atagacgcac tactgataca ataatagaaa aatatgaaat aatcgatcta 3840
gacactctag ataataaaca attataccaa ttactggtag cttttatttc actttcatat 3900
aaaacatcaa ataatgcagt ggactttact gtaattggac taggtactga atgtggaaag 3960
ccaagaatta cgaatttacc tgacaacaca tatctagtat ataaatcaat aacaggaata 4020
tatgaaaaga ggataagaat aaaataa 4047
Claims (12)
1.通用型CAR-T细胞的制备方法,其特征在于,所述通用型CAR-T细胞的制备方法所制备的通用型CAR-T细胞是基于HLA纯合子细胞来源的通用型CAR-T细胞。
2.根据权利要求1所述的通用型CAR-T细胞的制备方法,其特征在于,所述基于HLA纯合子细胞来源的通用型CAR-T细胞的HLA纯合子细胞来源为iPSC细胞库,构建所述iPSC细胞库的细胞来源于HLA型别纯合子组合的PBMC。
3.根据权利要求1所述的通用型CAR-T细胞的制备方法,其特征在于,所述基于HLA纯合子细胞来源的通用型CAR-T细胞的HLA纯合子细胞来源为HLA型别纯合子组合的PBMC。
4.根据权利要求2-3所述的任意一项通用型CAR-T细胞的制备方法,其特征在于,所述HLA型别纯合子组合的PBMC来源于如下HLA型别纯合子组合的PBMC:
HLA-A位点A*11:01、A*24:02、A*02:07、A*02:01、A*33:03、A*02:03单体型纯合子和/或HLA-B位点B*40:01、B*46:01、B*58:01、B*15:02、B*13:01单体型纯合子。
5.根据权利要求1所述的通用型CAR-T细胞的制备方法,其特征在于,所述包括如下步骤:
步骤1.采用磁珠分选获得高纯度的CD3+T细胞,培养并进行活化处理;
步骤2.利用CRISPR/Cas9技术进行基因编辑,构建CAR表达载体;
步骤3.采用腺相关病毒包装所述步骤2所得的CAR表达载体,扩增,得到携带CAR的腺相关病毒,并侵染所述步骤1所得的CD3+T细胞;
步骤4.步骤3所得的T细胞扩增培养,并采用磁珠分选得到通用型CAR-T细胞。
6.根据权利要求5所述的通用型CAR-T细胞的制备方法,其特征在于,所述步骤2中所述CAR表达载体携带的CAR基因含有Suicide基因片段,其核苷酸序列为SEQ ID No.8所示。
7.根据权利要求5-6所述的通用型CAR-T细胞的制备方法,其特征在于,所述步骤2中所述CAR表达载体中插入片段由EcoRI酶切位点+TRAC左同源臂+CAR基因+TRAC右同源臂+BamHI酶切位点;通过酶切位点接入载体pAAV-MCS,完成表达载体质粒构建。
8.根据权利要求7所述的通用型CAR-T细胞的制备方法,其特征在于,所述CAR表达载体中携带的CAR基因包含KOZAC-scFv CD19 fmc63(19)-CD3ζ-CD28-CD137(4-1BB)-T2A-Suicide片段,所述KOZAC-scFv CD19 fmc63(19)-CD3ζ-CD28-CD137(4-1BB)-T2A-Suicide片段核苷酸序列如SEQ ID No.1所示,所述KOZAC-scFv CD19 fmc63(19)-CD28-CD137(4-1BB)-CD3ζ-T2A-Suicide片段,由KOZAC基因片段、scFv CD19 fmc63(19)基因片段、CD28基因片段、CD137(4-1BB)基因片段、CD3ζ基因片段、T2A肽基因片段、Suicide基因片段依次连接而成。
9.根据权利要求8所述的通用型CAR-T细胞的制备方法,其特征在于,所述KOZAC基因片段、scFv CD19 fmc63(19)基因片段、CD28基因片段、CD137(4-1BB)基因片段、CD3ζ基因片段、T2A肽基因片段、Suicide基因片段的核苷酸序列依次如SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQID No.4、SEQ ID No.5、SEQ ID No.6、SEQ ID No.7、SEQ ID No.8所示。
10.根据权利要求5所述的通用型CAR-T细胞的制备方法,其特征在于,所述腺相关病毒包装还包括扩增、侵染;所述腺相关病毒包装采用转染试剂TransIT2020,所述腺相关病毒包装方法为表达质粒与辅助质粒pAAV-RC、pAAV-Helper转入293T细胞进行包装、扩增,24h和/或48h后收集腺相关病毒颗粒,-80℃保存。
11.根据权利要求5所述的通用型CAR-T细胞的制备方法,其特征在于,所述腺相关病毒为腺相关病毒AAV6,侵染T细胞为将携带CAR的腺相关病毒通过同源整合到宿主T细胞TRAC第一外显子基因位点。
12.基于HLA纯合子来源的通用型CAR-T细胞的应用,其特征在于,所述权利要求1至11任意一种方法所制备的通用型CAR-T细胞用做肿瘤治疗药。
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Cited By (1)
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---|---|---|---|---|
WO2023274386A1 (zh) * | 2021-07-01 | 2023-01-05 | 宁波茂行生物医药科技有限公司 | 靶向egfr的通用型car-t细胞及其制备方法 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN106459918A (zh) * | 2014-04-24 | 2017-02-22 | 得克萨斯州大学系统董事会 | 施加诱导多能干细胞产生过继细胞疗法产品 |
CN110023491A (zh) * | 2016-10-05 | 2019-07-16 | 富士胶片细胞动力公司 | 多能干细胞定向分化为hla纯合免疫细胞的方法 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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