CN111909966B

CN111909966B - 一种制备经修饰的免疫细胞的方法

Info

Publication number: CN111909966B
Application number: CN202010253679.0A
Authority: CN
Inventors: 王文博; 冯爱华; 郭佩佩; 林彦妮
Original assignee: Cure Genetics Co ltd
Current assignee: Cure Genetics Co ltd
Priority date: 2020-04-01
Filing date: 2020-04-01
Publication date: 2021-09-21
Anticipated expiration: 2040-04-01
Also published as: CN111909966A; WO2021197391A1

Abstract

本申请涉及一种制备经修饰的免疫细胞的方法，以及根据所述方法得到的CD70敲除的免疫细胞，包含所述免疫细胞的细胞群和药物组合物，本申请还提供了一种包括指导RNA和Cas蛋白的CRISPR/Cas系统。本申请的细胞和方法对肿瘤细胞具有良好的杀伤和控制效果。

Description

一种制备经修饰的免疫细胞的方法

技术领域

本申请涉及生物医药领域，具体的涉及一种嵌合抗原受体T细胞，尤其是一种CD70被敲除的嵌合抗原受体T细胞及其用途。

背景技术

近年来，随着肿瘤免疫疗法的发展和临床研究进展，嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor-T cells，CAR-T)免疫疗法目前是最有前途的肿瘤免疫疗法之一。

虽然CAR-T在血液系统癌症有很好的疗效，但是在实体瘤领域却进展缓慢。实体瘤治疗缺少有效的靶点是限制CAR-T的瓶颈之一。CD70是属于肿瘤坏死因子(tumor necrosisfactor，TNF)家族的成员，又称为肿瘤坏死因子受体超家族(tumor necrosis factorreceptor super-family，TNFSF)因子。CD70由193个氨基酸的多肽组成，具有20个氨基酸亲水的N末端结构域以及包含2个潜在的N-连接糖基化位点的C末端结构域，基于以上这些特征CD70被确定为具有细胞外C末端部分的Ⅱ型跨膜蛋白。在生理条件下，CD70仅短暂表达于已活化而非静止态的T细胞、B细胞及成熟的树突状细胞(dendritic cells，DCs)中，具有调控T细胞和B细胞活化、增殖及分化的能力，在维持机体免疫应答过程中起着重要的作用。除正常细胞表达外，CD70还在肾癌、成神经胶质细胞瘤以及乳腺癌等多种肿瘤组织中高水平表达，尤其是在肾癌中表达率非常高。CD70也被报道在急性髓系白血病干细胞中高表达。CD70在肿瘤组织中的高水平表达，不仅可以诱导免疫逃逸，同时也可以激活部分免疫细胞杀伤肿瘤细胞，可能作为一种潜在的肿瘤治疗靶点，给肿瘤的免疫治疗带来了新的方向。

但是，因为CD70在正常T细胞激活时也会表达，因此在使用T细胞制备CAR-T以后，靶向CD70的CAR-T细胞在激活和杀伤肿瘤细胞时会严重的杀伤自身，导致细胞扩增受限，杀伤肿瘤细胞的能力受到限制。因此，亟需一种免疫细胞新技术。

发明内容

本申请提供了一种经修饰的免疫细胞及其制备方法，所述免疫细胞的CD70基因被敲除，所述免疫细胞还可表达嵌合抗原受体。本申请所述的制备方法可以避免靶向肿瘤特异性抗原的CAR-T细胞对自身的杀伤，能够提高CAR分子在T细胞表面的表达效率，提高CAR依赖性和细胞因子(例如，IL-2和IFN-γ)的表达量。本申请的方法和使用所述方法得到的免疫细胞，以及包含该免疫细胞的细胞群、药物组合物对肿瘤细胞具有良好的杀伤和控制效果。

一方面，本申请提供了一种制备经修饰的免疫细胞的方法，其包括以下步骤：向免疫细胞施用靶向编码CD70的核酸分子的指导RNA，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述的指导RNA序列为5’-(X)n-SEQ ID NO:29-骨架序列-3’，其中X选自A、U、C和G的任一个碱基，n为0-15任一整数。

在某些实施方式中，所述指导RNA包含SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述指导RNA为单链指导RNA。

在某些实施方式中，所述单链指导RNA包含SEQ ID NO:7-15中任一项所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述指导RNA为包含crRNA和tracrRNA的双链指导RNA。

在某些实施方式中，所述crRNA包含SEQ ID NO:7-15中任一项所示的核苷酸序列。

在某些实施方式中，所述方法还包括以下步骤：下调免疫细胞中T细胞受体α恒定区蛋白和/或T细胞受体β恒定区蛋白的表达和/或活性。

在某些实施方式中，所述方法还包括以下步骤：下调免疫细胞中MHC复合物的表达和/或活性。

在某些实施方式中，所述方法还包括以下步骤：使所述经修饰的免疫细胞包括嵌合抗原受体(CAR)和/或T细胞受体(TCR)。

另一方面，本申请还提供了根据所述的方法制得的经修饰的免疫细胞。

在某些实施方式中，所述免疫细胞包括嵌合抗原受体(CAR)和/或T细胞受体(TCR)。

在某些实施方式中，所述免疫细胞包括靶向CD70的单链抗体。

在某些实施方式中，所述单链抗体包含SEQ ID NO:26-27中任一项所示的氨基酸序列。

在某些实施方式中，所述嵌合抗原受体包含SEQ ID NO:21-22中任一项所示的氨基酸序列。

另一方面，本申请还提供了细胞群，所述细胞群包含所述的免疫细胞，且所述细胞群中至少80％的免疫细胞基本上不表达CD70。

另一方面，本申请还提供了药物组合物，所述药物组合物包含所述的免疫细胞和/或所述的细胞群，以及药学上可接受的载体。

另一方面，本申请还提供了所述的免疫细胞、所述的细胞群和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗肿瘤。

在某些实施方式中，所述肿瘤包括肾癌、成神经胶质细胞瘤、乳腺癌和/或急性髓系白血病。

另一方面，本申请还提供了CRISPR/Cas系统，所述系统包括指导RNA和Cas蛋白，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列。

本领域技术人员能够从下文的详细描述中容易地洞察到本申请的其它方面和优势。下文的详细描述中仅显示和描述了本申请的示例性实施方式。如本领域技术人员将认识到的，本申请的内容使得本领域技术人员能够对所公开的具体实施方式进行改动而不脱离本申请所涉及发明的精神和范围。相应地，本申请的附图和说明书中的描述仅仅是示例性的，而非为限制性的。

附图说明

本申请所涉及的发明的具体特征如所附权利要求书所显示。通过参考下文中详细描述的示例性实施方式和附图能够更好地理解本申请所涉及发明的特点和优势。对附图简要说明书如下：

图1显示的是本申请所述的免疫细胞中CD70的表达效率；

图2显示的是本申请所述的免疫细胞中CD70 CAR的表达效率；

图3显示的是本申请所述的肿瘤细胞中CD70的表达效率；

图4显示的是本申请所述免疫细胞与靶细胞共培养后IL-2的释放水平；

图5显示的是本申请所述免疫细胞与靶细胞共培养后IFN-γ的释放水平；

图6显示的是本申请所述免疫细胞对786-O细胞的杀伤能力；

图7显示的是本申请所述免疫细胞对Raji细胞的杀伤能力；

图8显示的是本申请所述免疫细胞对293T-CD70细胞的杀伤能力；

图9显示的是本申请所述免疫细胞对293T细胞的杀伤能力；

图10显示的是本申请所述的免疫细胞中CD70 CAR的表达效率。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本申请发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所公开的内容容易地了解本申请发明的其他优点及效果。除非另有定义，本文使用的所有的技术和科学术语具有与本发明涉及领域的技术人员通常理解的相同的含义。

术语定义

在本申请中，术语“白细胞”通常是指一种有核的血细胞，具有活跃的移动能力，可以从血管内迁移到血管外，或从血管外组织迁移到血管内。除了在血液外，白细胞还可以存在于淋巴系统、脾，扁桃腺以及身体的其他组织。在本申请中，所述白细胞可以包括粒细胞(如中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞)、无粒白细胞(如淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞、吞噬细胞、肥大细胞)。

如本文所用，术语“淋巴细胞”指在血液、淋巴和淋巴组织中发现的任何单核细胞、非吞噬白细胞，例如，B淋巴细胞、T淋巴细胞、天然杀伤(NK)细胞。

在本申请中，术语“外周血单个核细胞”(或peripheral blood mononuclearcell，PBMC)通常是指外周血中具有单个核的任何细胞。例如，在本申请中，所述外周血单个核细胞可以包括T细胞、B细胞、NK细胞、淋巴细胞、单核细胞和树突状细胞。

在本申请中，术语“Cas蛋白”也称为“CRISPR相关蛋白”通常是指与CRISPR序列互补的一类酶，能够使用CRISPR序列作为指导(guide)，从而识别和切割特定的DNA链。Cas蛋白的非限制性实例包括：Casl、CaslB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9(也称为Csnl和Csxl2)、CaslO、Csyl、Csy2、Csy3、Csel、Cse2、Cscl、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmrl、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csbl、Csb2、Csb3、Csxl7、Csxl4、CsxlO、Csxl6、CsaX、Csx3、Csxl、Csxl5、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4，和/或他们的同系物、或其修饰形式。在一些实施例中，该Cas蛋白是Cas9蛋白。

在本申请中，术语“Cas9蛋白”或“Cas9核酸酶”，也称为Csn1或Csx12，通常是指II型CRISPR/Cas系统中一类既参与crRNA生物合成又参与摧毁入侵DNA的蛋白质。Cas9蛋白通常包括RuvC核酸酶结构域和HNH核酸酶结构域，分别切割双链DNA分子的两条不同的链。已经在不同的细菌物种如嗜热链球菌(S.thermophiles)、无害利斯特氏菌(Listeriainnocua)(Gasiunas，Barrangou et al.2012；Jinek，Chylinski et al.2012)和化脓性链球菌(S.Pyogenes)(Deltcheva，Chylinski et al.2011)中描述了Cas9蛋白。例如，化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9蛋白，其氨基酸序列参见SwissProt数据库登录号Q99ZW2；脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitides)Cas9蛋白，其氨基酸序列见UniProt数据库编号A1IQ68；嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Cas9蛋白，其氨基酸序列见UniProt数据库编号Q03LF7；金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)Cas9蛋白，其氨基酸序列见UniProt数据库编号J7RUA5。

在本申请中，术语“CD70”通常是指一种肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)家族的成员，是CD27的配体。本申请的CD70还可包括其功能变体和/或其功能片段，可以是天然来源的或人工合成的。在某些情形中，示例性的CD70基因可参见Genebank登录号：NM_001252.5下。例如，本申请的CD70可包含如SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列，例如，本申请的CD70可包含如SEQ ID NO:23所示的氨基酸序列。

在本申请中，术语“CRISPR/Cas系统”或“CRISPR-Cas系统”可互换地使用，通常是指由成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)和CRISPR结合蛋白(即Cas蛋白)组成的核酸酶系统，能够对真核细胞中几乎所有与原型间隔子邻近基序(protospacer-adjacent motif,PAM)相邻的基因组序列进行切割(Cong et al.Science 2013.339:819-823)。“CRISPR/Cas系统”可用来统称涉及CRISPR相关(“Cas”)基因的转录物，以及涉及其表达或指导其活性的其他元件，可包括编码Cas基因的序列、tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或其活性部分)、tracr配偶序列(在内源CRISPR/Cas系统背景下，涵盖“同向重复”和加工的部分同向重复)、指导序列(在内源CRISPR/Cas系统背景下也称为“spacer”)、或来自CRISPR座位的其他序列和转录物。在某些实施方式中，CRISPR/Cas系统可包含来源于I型、II型、或III型CRISPR/Cas系统的一个或多个元件。在一些实施例中，CRISPR/Cas系统的一个或多个元件来源于包含内源CRISPR系统的特殊生物，如化脓链球菌。

CRISPR复合物(包含杂交到靶序列上并且与一种或多种Cas蛋白复合的指导序列)的形成导致在该靶序列中或其附近(例如在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50、或更多个碱基对之内)的一条链或两条链的切割。该tracr序列(其可以包含或其组成为野生型tracr序列的全部或部分(例如野生型tracr序列的约或多于约20、26、32、45、48、54、63、67、85个、或更多个核苷酸))也可以形成CRISPR复合物的一部分，如通过沿着该tracr序列的至少一部分杂交到与该指导序列可操作地连接的tracr配偶序列的全部或部分上。在某些情形中，该tracr序列与一个tracr配偶序列具有足够的互补性以进行杂交，并参与一种CRISPR复合物的形成。在某些实施方式中，当进行比对时，沿着该tracr配偶序列的长度，该tracr序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、或99％序列互补性。在一些实施方式中，将驱动CRISPR系统的一个或多个元件的表达的一个或多个载体引入到宿主细胞中，使得该CRISPR系统的这些元件的表达在一个或多个靶位点指导CRISPR复合物的形成。

一般而言，tracr配偶序列包括与tracr序列具有足够互补性以促进CRISPR复合物在靶序列处的形成，其中该CRISPR复合物包含杂交到tracr序列上的tracr配偶序列。通常，互补程度是就tracr配偶序列与tracr序列沿着这两个序列的较短者的长度的最佳比对而言。可以通过任何适合的比对算法来确定最佳比对，并且可以进一步将二级结构造成的影响考虑进来，比如在该tracr序列或tracr配偶序列之内的自我互补性。在进行最佳比对时，在该tracr序列与tracr配偶序列之间沿着这两者的较短者的长度的互补程度是约或多于约25％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、97.5％、99％、或更高。该tracr序列在长度上为约或多于约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50个、或更多个核苷酸。

在本申请中，在CRISPR复合物形成的背景下，术语“靶序列”通常是指一个指导序列被设计为对其具有互补性的序列，其中在靶序列与指导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。完全互补性不是必需的，条件是存在足够互补性以引起杂交并且促进一种CRISPR复合物的形成。CRISPR复合物的靶多核苷酸可以是对真核细胞而言内源或外源的任何多核苷酸。例如，该靶多核苷酸可以是一种驻留在真核细胞的细胞核中的多核苷酸。该靶多核苷酸可以是一个编码基因产物(例如，蛋白质)的序列或一个非编码序列(例如，调节多核苷酸或无用DNA)。不希望被理论所束缚，该靶序列应该与PAM(原型间隔子邻近基序)相关；也就是说，由CRISPR复合物识别的短序列相关。

在本申请中，术语“指导RNA”通常是指CRISPR中包含的RNA组分，也可称为guideRNA(gRNA)。指导RNA一般包含指导序列和骨架序列，这两个序列可以在同一个分子中或不同的分子中。指导RNA的作用可以为指导Cas9蛋白切割与指导序列互补的DNA位点，也即靶序列。一般而言，指导序列是与靶序列具有足够互补性以便与该靶序列杂交、并且指导CRISPR复合物与该靶序列特异性结合的任何多核苷酸序列。指导序列与其相应的靶序列之间的互补程度是约或多于约50％或更多。一般一个指导序列的长度为约或多于约12个核苷酸。骨架序列为指导RNA中必须的，除指导序列之外的其余序列，一般包含tracr序列和tracr配偶序列，这些序列一般不会因为靶序列的变化而改变。该术语包括单链指导RNA(sgRNA)以及由crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(反式激活crRNA)组成的双链指导RNA。sgRNA也可称为嵌合型单链指导RNA，一般包含指导序列、tracr配偶序列和tracr序列。

在本申请中，所述Cas蛋白、sgRNA和/或tracr配偶序列以及tracrRNA序列可操作地连接到相同的启动子上并且可以表达。在某些情形中，所述Cas酶、sgRNA、和/或tracr配偶序列以及tracrRNA序列可以各自可操作地连接到位于分开的载体上的分开的调节元件上。

在本申请中，术语“MHC复合物”通常又称为主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex，MHC)，是一组编码动物主要组织相容性抗原的基因群的统称。人类的MHC也叫做HLA(human leukocyte antigen，HLA)复合体。由于MHC的多基因特性，依据其编码分子的结构、组织分布与功能差异，可分为MHC I类、MHC II类、MHC III类基因，分别编码MHC I类分子、MHC II类分子、MHC III类分子。MHC I类分子通常由四个区组成，其中三个区位于α链上(α1-α3)，β2微球蛋白(B2M)组成第四个区。β-2微球蛋白，即B2M，是I类MHC分子的轻链，因此是主要组织相容性复合体(MHC)不可缺少的部分。在人类基因组中，B2M被位于15号染色体上的b2m基因编码，而其他MHC基因在6号染色体上以基因簇的形式存在。人类的B2M蛋白有119个氨基酸(见UniProt数据库编码P61769)。

如本文中所使用的，术语“T细胞”通常是指一类自胸腺衍生的细胞，其参与各种细胞介导的免疫反应。

在本申请中，术语“T细胞受体(TCR)”通常是指T细胞表面的特异性受体。所述T细胞受体是异源二聚体，可以包含两个不同的亚基。大部分的T细胞受体(例如，95％及以上，96％及以上，97％及以上等)包含α亚基和β亚基，还有T细胞受体包含γ亚基和δ亚基，每条肽链又可分为可变区(V区)、恒定区(C区)、跨膜区和胞质区等部分。TCR能识别与MHC分子结合的经过处理的多肽片段，由于识别需要MHC分子的呈递，也称为MHC限制性。当供者和受者的MHC分子不同时，TCR能够识别MHC的不同，并导致T细胞的激活和扩增，可能引起移植物抗宿主疾病(GvHD)。敲除TRAC基因可以去除TCRα链的表达，从而可以将TCR从T细胞表面除去，因此能够防止TCR识别同种异体抗原而引起的移植物抗宿主疾病。

在本申请中，术语“嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)”通常是指包含能够结合抗原的胞外结构域和至少一个胞内结构域的融合蛋白。CAR是嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)的核心部件，其可包括抗原(例如，肿瘤特异性抗原和/或肿瘤相关抗原)结合结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和胞内信号结构域。在本申请中，所述CAR可以基于抗体的抗原(例如CD70)特异性与T细胞受体活化胞内结构域组合在一起。经遗传修饰表达CAR的T细胞可以特异地识别和消除表达靶抗原的恶性细胞。关于CAR和CAR-T细胞的描述，可参见例如Sadelain M,Brentjens R,Rivi`ere I.The basicprinciples of chimeric antigenreceptor design.Cancer Discov.2013；3(4):388-398；Turtle CJ,Hudecek M,JensenMC,Riddell SR.Engineered T cells for anti-cancer therapy.Curr OpinImmunol.2012；24(5):633-639；Dotti G,Gottschalk S,Savoldo B,Brenner MK.Designand development of therapies using chimeric antigen receptor-expressing Tcells.Immunol Rev.2014；257(1):107-126；以及WO2013154760、WO2016014789。

在本申请中，术语“抗原结合结构域”通常是指能够与靶抗原结合的结构域。抗原结合结构域可包含能特异性结合抗原的嵌合抗原受体及其片段、抗体或其抗原结合片段。抗原结合结构域可以为天然来源、合成来源、半合成来源或重组来源。在某些情形中，抗原结合结构与可以包含单链抗体。

在本申请中，术语“抗体”通常是指一种能够特异性识别和/或中和特定抗原的多肽分子。例如，抗体可包含通过二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链组成的免疫球蛋白，并且包括任何包含其抗原结合部分的分子。术语“抗体”包括单克隆抗体、抗体片段或抗体衍生物，包括但不限于人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单域抗体(例如，dAb)，单链抗体(例如，scFv)，以及与抗原结合的抗体片段(例如，Fab、Fab’和(Fab)2片段)。术语“抗体”还包括抗体的所有重组体形式，例如在原核细胞中表达的抗体、未糖基化的抗体以及本申请所述的任何与抗原结合的抗体片段及其衍生物。每条重链可由重链可变区(VH)和重链恒定区构成。每条轻链可由轻链可变区(VL)和轻链恒定区构成。VH和VL区可进一步被区分为称为互补决定区(CDR)的高变区，它们散布在称为构架区(FR)的更保守的区域中。每个VH和VL可由三个CDR和四个FR区构成，它们从氨基端至羧基端可按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。

在本申请中，术语“单链抗体(scFv)”可以是由所述抗体的重链可变区和所述轻链可变区或包含通过连接子(linker)连接而成的抗体。

在本申请中，术语“跨膜结构域(Transmembrane Domain)”通常是指CAR中穿过细胞膜的结构域，其与细胞内信号转导结构域相连接，起着传递信号的作用。

在本申请中，术语“共刺激结构域”通常是指可以提供免疫共刺激分子的胞内结构域，所述共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子。

在本申请中，术语“铰链区”通常是指抗原结合结构域和跨膜区之间的连接区。

在本申请中，术语“信号传导结构域”通常是指位于细胞内部能够转导信号的结构域。在本申请中，所述胞内信号传导结构域可以将信号传导至细胞内。通常，信号传导结构域为用于指导蛋白质寻靶的任何一段连续的氨基酸序列。例如，所述胞内信号传导结构域是所述嵌合抗原受体的胞内信号传导结构域。

在本申请中，术语“免疫细胞”通常是指参与免疫应答，例如促进免疫效应应答的细胞。免疫细胞的示例包括但不限于T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、肥大细胞、粒细胞、单核细胞、淋巴细胞以及巨噬细胞。该术语还包括工程化的免疫细胞，如通过将DNA或RNA形式的外源遗传物质加入细胞的总遗传物质而被基因修饰的免疫细胞。

在本申请中，术语“多肽”、“肽”、“蛋白”和“蛋白质”可互换地使用，通常是指具有任何长度的氨基酸的聚合物。该聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸中断。这些术语还涵盖已经被修饰的氨基酸聚合物。这些修饰可以包含：二硫键形成、糖基化、脂化(lipidation)、乙酰化、磷酸化、或任何其他操纵(如与标记组分结合)。术语“氨基酸”包括天然的和/或非天然的或者合成的氨基酸，包括甘氨酸以及D和L旋光异构体、以及氨基酸类似物和肽模拟物。

术语“多核苷酸”、“核苷酸”、“核苷酸序列”、“核酸”和“寡核苷酸”可互换地使用，通常是指具有任何长度的核苷酸的聚合形式，如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸、或其类似物。多核苷酸可具有任何三维结构，并且可以执行已知或未知的任何功能。以下是多核苷酸的非限制性实例：基因或基因片段的编码区或非编码区、根据连接分析定义的多个座位(一个座位)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转运RNA、核糖体RNA、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、micro-RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离的DNA、任何序列的分离的RNA、核酸探针、和引物。多核苷酸可以包含一个或多个经修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物。如果存在，可以在聚合物组装之前或之后进行核苷酸结构的修饰。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在聚合后，如通过与标记的组分缀合来进一步修饰。

在本申请中，所述“载体”通常是指能够在合适的宿主中自我复制的核酸分子，用以将插入的核酸分子转移到宿主细胞中和/或宿主细胞之间。所述载体可包括主要用于将DNA或RNA插入细胞中的载体、主要用于复制DNA或RNA的载体，以及主要用于DNA或RNA的转录和/或翻译的表达的载体。所述载体还包括具有多种上述功能的载体。所述载体可以是当引入合适的宿主细胞时能够转录并翻译成多肽的多核苷酸。通常，通过培养包含所述载体的合适的宿主细胞，所述载体可以产生期望的表达产物。

在本申请中，术语“质粒”通常是指细菌、酵母菌等生物中染色体或拟核以外的DNA分子，存在于细胞质中，具有自主复制能力，使其能够在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒在遗传工程研究中被用作基因的载体。

在本申请中，术语“逆转录病毒载体”通常是指可以可控并表达外源基因，但不能自我包装成有增殖能力的病毒颗粒。此类病毒多具有反转录酶。反转录病毒至少含有三种基因：gag，包含组成病毒中心和结构的蛋白质的基因；pol，包含反转录酶的基因和env，包含组成病毒外壳的基因。通过逆转录病毒转染，逆转录病毒载体可将自身基因组及其携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中，例如，可将CAR分子整合进宿主细胞中。

在本申请中，术语“慢病毒载体”通常是指属于逆转录病毒的一种二倍体RNA病毒载体。慢病毒载体是以慢病毒的基因组为基础，将其中多个和病毒活性相关的序列结构去除，使其具有生物学的安全性，然后再在这个基因组骨架中引入实验所需要的目标基因的序列和表达结构，并将之制备成载体。通过慢病毒载体转染，逆转录病毒载体可将自身基因组及其携带的外源基因随机、稳定地整合入宿主细胞基因组中，例如，可将CAR分子整合进宿主细胞中。

在本申请中，术语“和/或”应理解为意指可选项中的任一项或可选项的两项。

在本申请中，术语“包含”通常是指包括明确指定的特征，但不排除其他要素。

在本申请中，术语“约”通常是指在指定数值以上或以下0.5％-10％的范围内变动，例如在指定数值以上或以下0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、7.5％、8％、8.5％、9％、9.5％、或10％的范围内变动。

发明详述

指导RNA和CRISPR/Cas系统

一方面，本申请提供了制备经修饰的免疫细胞的方法，所述包括以下步骤：向免疫细胞施用靶向编码CD70的核酸分子的指导RNA。

另一方面，本申请提供了一种CRISPR/Cas系统，所述系统可包括RNA组分，有时被称为指导RNA(gRNA)。

本申请所述的指导RNA可包括单链指导RNA(sgRNA)以及由crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(反式激活crRNA)组成的双链指导RNA。在某些实施方式中，指导RNA是由一条crRNA和一条tracrRNA组成的双链结构。CrRNA一般包含指导序列和tracr配偶序列，tracrRNA一般包含tracr序列。在某些实施方式中，指导RNA可以为单链分子，该单链分子可包含指导序列、tracr配偶序列和tracr序列，这个单链分子也称为嵌合型单链指导RNA(sgRNA)。当tracr序列和tracr配偶序列被包含在单个转录物中，这两者之间的杂交产生具有二级结构(如发夹)的转录物。用于在发夹结构中使用的序列可以是环形成序列，例如，在长度上可以为四个核苷酸的序列，例如，用于在发夹结构中使用的序列可具有序列GAAA的序列。也可以使用更长或更短的环序列，例如可替代的序列。在某些情形种，这些序列可以包括三联体(例如，AAA)，以及其他的核苷酸(例如C或G)。环形成序列的实例可包括CAAA和AAAG。在某些情形中，该转录物或转录的多核苷酸序列可以具有至少两个或更多个发夹。在一些具体的情形中，该转录物可具有两个、三个、四个或五个发夹。在另外一些情形中，该转录物可以具有至多五个发夹。在某些情形中，该单个转录物还可包括一种转录终止序列，例如，为一个Poly-U序列，又例如，为六个U的核苷酸序列。本申请提供了靶向编码CD70的核酸分子的指导RNA，其中所述指导RNA可包含17个核苷酸序列长度的分子，例如，所述指导RNA可包含如SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列：n1n2n3n4n5n6n7n8n9n10n11n12n13n14n15n16n17，其中，n1＝A、C、G或U，n2＝A、C、G或U，n3＝A、C、G或U，n4＝A、C、G或U，n5＝C、G或U，n6＝A、C、G或U，n7＝A、C、G或U，n8＝C、G或U，n9＝A、C、G或U，n10＝A、C、G或U，n11＝A、C、G或U，n12＝A、C、G或U，n13＝C、G或U，n14＝A、C、G或U，n15＝A、C、G或U，n16＝A、C、G或U，n17＝A、C、G或U。例如，按照从5’端至3’端的顺序。

在某些实施方式中，本申请所述的指导RNA可包含SEQ ID NO:7-15中任一项所示的核苷酸序列。

例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列：GCUGGAUGCACACCACG。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列：GUGCGGCGCAGGCCCUA。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列：CGCAGGACGCACCCAUA。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列：CAUCCAGCGCUUCGCAC。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列：GAUCGCCGCGGCGAUGC。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列：ACCCCAAGUGACUCGAG。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列：CUACGUAUCCAUCGUGA。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列：UUGGUCCCAUUGGUCGC。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列：GGCUGCUUUGGUCCCAU。

在某些情形中，本申请所述的指导RNA可包含SEQ ID NO:30所示的核苷酸序列：n1n2n3n4n5n6n7n8n9n10n11n12n13n14n15n16n17，其中，n1＝A、C或G，n2＝A、C、G或U，n3＝A、C、G或U，n4＝A、C、G，n5＝C或G，n6＝A、C、G或U，n7＝A、C、G或U，n8＝C、G或U，n9＝C、G或U，n10＝A、C或G，n11＝A、C、G或U，n12＝A、C、G或U，n13＝C、G或U，n14＝A、C或G，n15＝A、C、G或U，n16＝A、C、G或U，n17＝A、C或G。例如，按照从5’端至3’端的顺序。

在一些更具体的情形中，所述指导RNA可包含SEQ ID NO:7-13中任一项所示的核苷酸序列。

例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列：GCUGGAUGCACACCACG。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列：GUGCGGCGCAGGCCCUA。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列：CGCAGGACGCACCCAUA。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列：CAUCCAGCGCUUCGCAC。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列：GAUCGCCGCGGCGAUGC。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列：ACCCCAAGUGACUCGAG。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列：CUACGUAUCCAUCGUGA。例如，按照从5’端至3’端的顺序。

在本申请中，所述指导RNA序列可以为5’-(X)n-SEQ ID NO:29-骨架序列-3’，其中X可选自A、U、C和G的任一个碱基，n为0-15任一整数。n的取值并不影响所述RNA的功能。例如，n可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。当n为0-15中任一整数时，本申请不同长度的所述指导RNA均可以有效识别靶序列并达到敲除目的。在某些情形中，n＝13，在另一些情形中，n＝2。

本申请提供了靶向编码CD70的核酸分子的指导RNA，所述的指导RNA可包含19个核苷酸长度的序列。在某些情形中，其中所述指导RNA可包含SEQ ID NO:58所示的核苷酸序列：n1n2n3n4n5n6n7n8n9n10n11n12n13n14n15n16n17n18n19，其中，n1＝A、C、G或U，n2＝C、G或U，n3＝A、C、G或U，n4＝A、C、G或U，n5＝A、C、G或U，n6＝A、C、G或U，n7＝C、G或U，n8＝A、C、G或U，n9＝A、C、G或U，n10＝C、G或U，n11＝A、C、G或U，n12＝A、C、G或U，n13＝A、C、G或U，n14＝A、C、G或U，n15＝C、G或U，n16＝A、C、G或U，n17＝A、C、G或U，n18＝A、C、G或U，n19＝A、C、G或U。例如，按照从5’端至3’端的顺序。

在某些实施方式中，本申请所述的指导RNA可包含SEQ ID NO:49-57中任一项所示的核苷酸序列。

例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:49所示的核苷酸序列：GCGCUGGAUGCACACCACG。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:50所示的核苷酸序列：CGGUGCGGCGCAGGCCCUA。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:51所示的核苷酸序列：CCCGCAGGACGCACCCAUA。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:52所示的核苷酸序列：UGCAUCCAGCGCUUCGCAC。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列：GUGAUCGCCGCGGCGAUGC。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列：UCACCCCAAGUGACUCGAG。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:55所示的核苷酸序列：AGCUACGUAUCCAUCGUGA。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:56所示的核苷酸序列：CUUUGGUCCCAUUGGUCGC。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:57所示的核苷酸序列：CGGGCUGCUUUGGUCCCAU。

在某些情形中，本申请所述的指导RNA可包含SEQ ID NO:59所示的核苷酸序列：n1n2n3n4n5n6n7n8n9n10n11n12n13n14n15n16n17n18n19，其中，n1＝A、C、G或U，n2＝C、G或U，n3＝A、C或G，n4＝A、C、G或U，n5＝A、C、G或U，n6＝A、C、G，n7＝C或G，n8＝A、C、G或U，n9＝A、C、G或U，n10＝C、G或U，n11＝C、G或U，n12＝A、C或G，n13＝A、C、G或U，n14＝A、C、G或U，n15＝C、G或U，n16＝A、C或G，n17＝A、C、G或U，n18＝A、C、G或U，n19＝A、C或G。例如，按照从5’端至3’端的顺序。

在一些更具体的情形中，所述指导RNA可包含SEQ ID NO:49-55中任一项所示的核苷酸序列。

例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:49所示的核苷酸序列：GCGCUGGAUGCACACCACG。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:50所示的核苷酸序列：CGGUGCGGCGCAGGCCCUA。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:51所示的核苷酸序列：CCCGCAGGACGCACCCAUA。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:52所示的核苷酸序列：UGCAUCCAGCGCUUCGCAC。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:53所示的核苷酸序列：GUGAUCGCCGCGGCGAUGC。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:54所示的核苷酸序列：UCACCCCAAGUGACUCGAG。例如，本申请所述指导RNA可包含SEQ ID NO:55所示的核苷酸序列：AGCUACGUAUCCAUCGUGA。例如，按照从5’端至3’端的顺序。

在某些情形中，所述指导RNA可包含骨架序列，骨架序列不影响所述sgRNA对靶序列的识别，因此，骨架序列可以是现有技术中任何可行的序列。骨架序列一般包含tracr配偶序列和tracr序列。骨架序列的结构可参见如文献Nowak et al.Nucleic AcidsResearch 2016.44:9555-9564中的Figure 1(图1)中A和B，Figure 3(图3)中A、B、C，以及Figure 4(图4)中A、B、C、D、E中所记载的除spacer序列之外的部分。

本申请的骨架序列可以来自PCT申请公布文本WO2019011118A1所记载的骨架序列，例如，可以为SEQ ID NO:39-48中任一项所示的核苷酸序列(列出为5’到3’)，其中小写字体的第一区代表tracr配偶序列，且小写字体的第二区代表tracr序列，并且该最后的poly-U序列代表转录终止子。其中poly-U中U的个数不限于此例所示，可以增加或减少。在某些情形中，poly-U可以被去掉而不影响活性。在某些情形中，可以使用与以下序列相似程度达到约或多于约50％、60％、70％、80％、90％或更高的骨架序列。有些时候，该tracr序列可以是一个与包含该tracr配偶序列的转录物分开的转录物。在某些情形中，嵌合型单链指导RNA(sgRNA)设计可以在同向重复与tracrRNA之间掺入至少12bp的双链体结构。在某些情形中，含有与Cas9蛋白结合的关键的RNA二级结构，但序列被突变、或含有插入序列的设计也可以被使用，如已经发表的文献Nowak et al.Nucleic Acids Research 2016.44:9555-9564和Adamson et al.Cell 2016.167:1867-1882所示。

表1 示例性的骨架序列

本申请所述骨架序列可包含SEQ ID NO:37-38中任一项所示的核苷酸序列，例如，所述骨架序列可包含SEQ ID NO:37所示的核苷酸序列。

在本申请中，所述指导RNA可以为单链指导RNA。在另一些情形中，所述指导RNA可以为包含crRNA和tracrRNA的双链指导RNA。

CrRNA一般包含指导序列和tracr配偶序列，tracrRNA一般包含tracr序列。一般来说，指导序列与靶序列具有一定互补性，tracr配偶序列与tracr序列具有一定互补性。Tracr配偶序列(又称同向重复序列)与tracr序列的结构通常如文献(Nowak etal.Nucleic Acids Research 2016.44:9555-9564)的Figure 1(图1)中A所记载的除spacer序列之外的部分，其中tracr配偶序列与tracr序列的互补部分可以截短1至10对碱基对(base pair)而仍然具有良好的活性，如文献(Cong et al.Science 2013.339:819-23)的Figure 2(图2)中B所记载的除spacer序列、指导序列之外的部分。

本申请提供了crRNA，且所述crRNA可包含SEQ ID NO:29所示的核苷酸序列：n1n2n3n4n5n6n7n8n9n10n11n12n13n14n15n16n17，其中，n1＝A、C、G或U，n2＝A、C、G或U，n3＝A、C、G或U，n4＝A、C、G或U，n5＝C、G或U，n6＝A、C、G或U，n7＝A、C、G或U，n8＝C、G或U，n9＝A、C、G或U，n10＝A、C、G或U，n11＝A、C、G或U，n12＝A、C、G或U，n13＝C、G或U，n14＝A、C、G或U，n15＝A、C、G或U，n16＝A、C、G或U，n17＝A、C、G或U。例如，按照从5’端至3’端的顺序。

在某些实施方式中，本申请所述的crRNA可包含SEQ ID NO:7-15中任一项所示的核苷酸序列。

例如，本申请所述crRNA可包含SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列：GCUGGAUGCACACCACG。例如，本申请所述crRNA可包含SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列：GUGCGGCGCAGGCCCUA。例如，本申请所述crRNA可包含SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列：CGCAGGACGCACCCAUA。例如，本申请所述crRNA可包含SEQ ID NO:10所示的核苷酸序列：CAUCCAGCGCUUCGCAC。例如，本申请所述crRNA可包含SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列：GAUCGCCGCGGCGAUGC。例如，本申请所述crRNA可包含SEQ ID NO:12所示的核苷酸序列：ACCCCAAGUGACUCGAG。例如，本申请所述crRNA可包含SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列：CUACGUAUCCAUCGUGA。例如，本申请所述crRNA可包含SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列：UUGGUCCCAUUGGUCGC。例如，本申请所述crRNA可包含SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列：GGCUGCUUUGGUCCCAU。

在本申请中，所述crRNA序列可以为5’-(X)n-SEQ ID NO:29-骨架序列-3’，其中X可选自A、U、C和G的任一个碱基，n为0-15任一整数。n的取值并不影响所述crRNA的功能。例如，n可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。当n为0-15中任一整数时，本申请不同长度的所述crRNA均可以有效识别靶序列并达到敲除目的。在某些情形中，n＝13，在另一些情形中，n＝2。

另一方面，本申请还提供了tracr配偶序列和tracrRNA序列。一般而言，tracr配偶序列可包括与tracrRNA序列具有足够互补性以促进下列一项或多项功能的任何序列：(1)在含有相应tracrRNA序列的细胞中为侧翼含有tracr配偶序列的sgRNA的切除；以及(2)在靶序列处形成CRISPR复合物，其中所述CRISPR复合物可包含于tracrRNA序列杂交的tracr配偶序列。通常，互补的程度是就tracr配偶序列与tracrRNA序列沿着这两个序列的较短者的长度的最佳比对而言。可以通过任何适合的比对算法来确定最佳比对，并且可以进一步计算二级结构，如在所述tracrRNA序列或tracr配偶序列本身的自我互补性。在某些情形中，所述tracrRNA序列和tracr配偶序列可以被包含在单个转录物中，使得在这两者之间的杂交产生具有二级结构(如发夹)的转录物。所述tracrRNA序列可以与tracr配偶序列具有足够的互补性以杂交并且参与形成CRISPR复合物。

本申请的指导RNA还可包含修饰(例如，化学修饰)，例如，核苷酸的缺失、插入、转位、失活和/或激活。所述修饰可包括引入一个或多个突变(包括单个或多个碱基对改变)、增加发夹的数目、交联、断开具体的核苷酸段以及其他修饰。修饰可以包括包含至少一个非天然存在的核苷酸、或一个经修饰的核苷酸、或其类似物。所述指导RNA可以在核糖、磷酸和/或碱基部分处被修饰。经修饰的指导RNA可以包括2’-O-甲基类似物、2’-脱氧类似物或2’-氟代类似物。可以修饰指导RNA的核酸骨架，例如，可以使用硫代磷酸骨架。还可以使用锁核酸(LNA)或桥联核酸(BNA)。指导RNA中的修饰的实例还可包括但不限于：2-氨基嘌呤、5-溴代-尿苷、假尿苷、肌苷、7-甲基鸟苷。这些修饰可以应用于本申请CRISPR系统的任意组分。在某些情形中，可以对RNA组分(例如该指导RNA或嵌合多核苷酸序列)做出这些修饰。例如，所述指导RNA的化学修饰可包括2’-甲氧基和/或3’-硫代磷酸酯修饰。在某些情形中，含有与Cas9蛋白结合的关键的RNA二级结构，但序列被突变、或含有插入序列的设计也可以被使用，如已经发表的文献Nowak et al.Nucleic Acids Research 2016.44:9555-9564和Adamson et al.Cell 2016.167:1867-1882所示。

一般而言，CRISPR/Cas系统的特征为促进在靶序列的位点处的CRISPR复合物(在内源CRISPR系统的背景下也称为原型间隔子)的形成的元件。在CRISPR复合物形成的背景下，“靶序列”是指指导RNA被设计为对其具有互补性的序列，其中在靶序列与指导RNA之间的杂交促进CRISPR复合物的形成。全互补性不是必需的，只要存在引起杂交和促进形成CRISPR复合物的足够的互补性即可。一个靶序列可以包含任何多核苷酸，如DNA或RNA多核苷酸。

在某些实施方式中，本申请的所述方法可包括向宿主细胞(例如，免疫细胞)施用一种或多种所述Cas蛋白。

另一方面，本申请提供了一种CRISPR酶。在一些情形中，所述CRISPR酶可以是II型CRISPR系统酶。在某些情形中，所述CRISPR酶可以是Cas9蛋白。在某些实施例中，所述Cas9蛋白可以是肺炎链球菌、化脓链球菌或嗜热链球菌Cas9蛋白，并且可包括源自于这些生物体的突变的Cas9蛋白。所述Cas蛋白还可以是一种Cas9蛋白的同系物或直向同源物。本申请所述系统可包括所述的Cas蛋白。

所述Cas蛋白可以包含任何其他蛋白质，以及任选地在任何两个结构域之间的连接序列。可以融合到Cas蛋白上的蛋白质的实例包括但不限于，表位标签、报告基因、以及具有下列活性的一者或多者的蛋白质结构域：甲基酶活性、脱甲基酶活性、转录激活活性、转录阻抑活性、转录释放因子活性、组蛋白修饰活性、RNA切割活性和核酸结合活性。

免疫细胞、细胞群和药物组合物

另一方面，本申请提供了一种经修饰的免疫细胞。所述免疫细胞可包括T细胞、B细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、NKT细胞、单核细胞、树突状细胞、粒细胞、淋巴细胞、白细胞和/或外周血单个核细胞。在某些情形中，所述免疫细胞可包括T淋巴细胞。所述T淋巴细胞可包括胸腺细胞、天然T淋巴细胞、未成熟T淋巴细胞、成熟T淋巴细胞、静息T淋巴细胞或活化的T淋巴细胞。所述T细胞可以是辅助T细胞(Th)，例如辅助T细胞1(Th1)或辅助T细胞2(Th2)细胞。所述T淋巴细胞可以是CD4⁺辅助T细胞(HTL；CD4⁺T细胞)、细胞毒性T细胞(CTL；CD8⁺T细胞)、肿瘤浸润细胞毒性T细胞(TIL；CD8⁺T细胞)、CD4⁺/CD8⁺T细胞、CD4^-/CD8^-T细胞或任何其他T淋巴细胞亚型。在某些情形中，所述经修饰的T细胞是人类T细胞。在扩增和遗传修饰本申请的细胞之前，可以通过各种非限制性方法从受试者，例如患者，获得细胞来源。T细胞可以获自许多非限制性来源，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、感染位点的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在某些情形中，可以使用本领域技术人员可利用的和已知的任何数量的T细胞系。在另一些情形中，所述细胞可以源自健康供体、源自确诊患有癌症的患者或获自确诊感染的患者。在另一些情形中，所述细胞是存在不同表型特性的细胞的混合群体的一部分。

在某些情形中，所述免疫细胞可包括B细胞。在某些情形中，所述B细胞可包括效应B细胞(浆细胞)、记忆B细胞。所述B细胞可包括B2细胞、B1细胞、边缘区B细胞、滤泡B细胞、调节性B细胞。在某些情形中，所述免疫细胞可包括巨噬细胞。所述B细胞可包括I型巨噬细胞(M1)、II型巨噬细胞(如M2a、M2B、M2c)。在某些情形中，所述免疫细胞可包括NK细胞。在某些情形中，所述NK细胞可包括CD56bright和CD56dim。在某些情形中，所述NK细胞可包括NK1和NK2。在某些情形中，所述NK细胞可包括A-NK和NA-NK。

所述免疫细胞中的T细胞受体α恒定区蛋白和/或T细胞受体β恒定区蛋白的表达和/或活性下调。在某些情形中，所述下调可包括下调编码所述细胞受体α恒定区蛋白和/或T细胞受体β恒定区蛋白的核酸分子的表达和/或活性；和/或，包括下调所述细胞受体α恒定区蛋白和/或T细胞受体β恒定区蛋白的表达和/或活性。

在某些情形中，所述下调可包括向所述免疫细胞施用一种或多种选自下组的物质：反义RNA、siRNA、shRNA、CRISPR/Cas系统、RNA编辑系统如ADAR、RNA指导的核酸内切酶、锌指蛋白酶、Mega-TAL核酸酶、TALENs和Meganucleases。在某些情形中，所述下调可包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述核酸分子(例如，编码所述细胞受体α恒定区蛋白和/或T细胞受体β恒定区蛋白的核酸分子)外显子部分的指导RNA。例如，所述靶向编码所述细胞受体α恒定区蛋白的核酸分子的指导RNA可包含SEQ ID NO:28所示的核苷酸序列。

所述免疫细胞中的MHC复合物的表达和/或活性下调。在某些情形中，所述下调可包括下调编码所述细胞MHC复合物的核酸分子的表达和/或活性；和/或，包括下调所述细胞MHC复合物蛋白的表达和/或活性。

在某些情形中，所述下调可包括向所述免疫细胞施用一种或多种选自下组的物质：反义RNA、siRNA、shRNA、CRISPR/Cas系统、RNA编辑系统如ADAR、RNA指导的核酸内切酶、锌指蛋白酶、Mega-TAL核酸酶、TALENs和Meganucleases。在某些情形中，所述下调可包括向所述免疫效应细胞施用靶向所述核酸分子(例如，编码所述细胞MHC复合物的核酸分子)外显子部分的指导RNA。在某些情形中，所述MHC复合物可包含B2M。靶向编码所述B2M的核酸分子的指导RNA可使用现有技术中的指导RNA，例如，靶向编码所述B2M的核酸分子的指导RNA可包含SEQ ID NO.33-36中任一项所示的核苷酸序列。

在本申请中，本申请所述的免疫细胞可包含嵌合抗原受体(CAR)和/或T细胞受体(TCR)。

在本申请中，所述CAR可包含靶向肿瘤特异性抗原的嵌合抗原受体，其中所述肿瘤特异性抗原选自以下组：CD70、CD19、CD20、CD123、EpCAM和BCMA。

在某些情形中，所述CAR可包含抗原结合结构域。所述抗原结合结构域可与肿瘤抗原特异性结合，其中所述肿瘤特异性抗原选自以下组：CD70、CD19、CD20、CD123、EpCAM和BCMA。在某些情形中，抗原结合结构域可包括单链抗体scFv。在某些更具体的情形中，所述单链抗体可以是靶向CD70的单链抗体。例如，所述单链抗体可包含SEQ ID NO:26-27中任一项所示的氨基酸序列

在本申请中，所述CAR可包含跨膜结构域。在某些情形中，所述跨膜结构域可包含源自选自下述蛋白的跨膜结构域：CD8、CD28、CD27、CD7、TRAC、TRBC、CD3ζ、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4和BTLA。

在本申请中，所述CAR可包含共刺激结构域。在某些情形中，所述共刺激结构域可包含选自下述蛋白的共刺激结构域或其组合：CD137、CD28、OX40、ICOS、DAP10、2B4、CD27、CD30、CD40、CD40L、TIM1、CD226、DR3、SLAM、NKG2D、CD244、FceRIγ、BTLA、GITR、HVEM、CD2、NKG2C、LIGHT和DAP12。

在本申请中，所述CAR可包含胞内信号转导结构域，其中所述胞内信号转导结构域可包含源自选自下述蛋白的胞内信号转导结构域或其组合：CD3ζ激活区、CD3δ激活区、CD3γ激活区、FceRIγ激活区、FceRIβ激活区、免疫球蛋白α激活区、免疫球蛋白β激活区、牛白血病病毒gp30激活区、EB病毒LMP2A激活区、猿免疫缺陷病毒PBj14Nef激活区、卡波西肉瘤疱疹病毒激活区、DAP-12激活区、免疫受体酪氨酸激活基序(ITAM)。

在本申请中，所述CAR可包含铰链区，所述铰链区可以连接所述抗原结合结构域和所述跨膜结构域。在某些情形中，所述铰链区可包含源自选自下述蛋白的铰链区：铰链区：CD8、CD28、IgG、4-1BB、CD4、CD27、CD7和PD-1。

在本申请中，所述CAR可包含抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和/或信号传导结构域。例如，所述CAR可包含SEQ ID NO:21-22中任一项所示的氨基酸序列。

本申请所述经修饰的免疫细胞可包括所述CAR。例如，所述CAR可包含SEQ ID NO:21-22中任一项所示的氨基酸序列。

本申请所述经修饰的免疫细胞可包括编码所述CAR的核酸分子。例如，编码所述CAR的核酸分子可包含SEQ ID NO:4-5中任一项所示的氨基酸序列。

另一方面，本申请提供了一种细胞群，所述细胞群可包含所述的免疫细胞，且所述细胞群中至少80％(例如，至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多)的免疫细胞基本上不表达CD70。基本上不表达可包含基本上不表达CD70蛋白、不转录CD70RNA和/或基本上不复制CD70DNA。在本申请中，术语“基本上不表达”通常是指使用常规手段检测不到蛋白质和/或核苷酸表达。例如，可使用流式细胞术检测CD70蛋白的表达状况。又例如，可先提取基因组DNA，再使用TIDE分析检测CD70的核酸表达状况。

药物组合物、方法、用途和载体

另一方面，本申请提供了一种药物组合物。所述药物组合物可包含本申请的免疫细胞和/或本申请的细胞群，以及药学上可接受的载体。在本申请中，术语“药学上可接受的载体”通常是指可与本申请的免疫细胞和/或本申请的细胞群施用相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。除非与本申请的免疫细胞和/或本申请的细胞群不相容，否则任何常规介质或试剂均可以考虑用于本申请的药物组合物中。

在一些方面，本申请的所述方法可包括向宿主细胞(例如，免疫细胞)施用一种或多种所述Cas蛋白。在某些情形中，本申请的所述方法可包括向宿主细胞(例如，免疫细胞)施用一种或多种所述tracr配偶序列和tracrRNA序列。本申请的方法还包括向宿主细胞(例如，免疫细胞)递送所述的一种或多种指导RNA、所述的一种或多种载体或其一种或多种转录形式，和/或一种或多种蛋白。在一些方面，本申请进一步提供了通过所述方法产生的细胞以及包括所述细胞或由所述细胞产生的生物体(例如动物、植物、或真菌)。在某些情形中，可以将与指导RNA组合的Cas酶递送至细胞。可以使用常规的病毒和非病毒基的基因转移方法将核酸序列引入哺乳动物细胞或靶组织中。可以使用本申请的方法向培养物中或宿主生物中的细胞引入编码CRISPR/Cas系统的核酸。非病毒载体递送系统包括DNA质粒、RNA(例如，指导RNA)、裸核酸以及与递送赋形剂(如脂质体)复合的核酸。病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，在被递送至细胞后它们具有游离型或整合型基因组。

另一方面，本申请提供了一种载体，其可包含所述的分离的核酸分子。在本申请中，所述载体可选自质粒、逆转录病毒载体和慢病毒载体中的一种或多种。例如，本申请所述载体自5’端依次包含以下的核苷酸序列：编码所述CD70单链抗体的基因、编码CD8a铰链区、编码CD8a跨膜区的基因、编码4-1BB胞内域的基因和编码CD3ζ激活域的基因。此外，所述载体中还可包含其他基因，例如允许在适当的宿主细胞中和在适当的条件下选择该载体的标记基因。此外，所述载体还可包含允许编码区在适当宿主中正确表达的表达控制元件。这样的控制元件为本领域技术人员所熟知的，例如，可包括启动子、核糖体结合位点、增强子和调节基因转录或mRNA翻译的其他控制元件等。在某些实施方式中，所述表达控制序列为可调的元件。所述表达控制序列的具体结构可根据物种或细胞类型的功能而变化，但通常包含分别参与转录和翻译起始的5’非转录序列和5’及3’非翻译序列，例如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。例如，5’非转录表达控制序列可包含启动子区，启动子区可包含用于转录控制功能性连接核酸的启动子序列。本申请所述的一种或多种核酸分子可以与所述表达控制元件可操作地连接。

核酸的非病毒递送方法包括脂转染、核转染、显微注射、基因枪、病毒颗粒、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂质核酸共轭物、裸DNA、人工病毒体以及增强DNA摄取的试剂。可以使用基于RNA或DNA病毒的系统递送核酸，例如，利用病毒能够靶向体内的特定细胞的性质，将病毒有效加载(payload)运至细胞核中。可以将病毒载体直接给予至患者(体内)或可以通过间接的形式，例如，在体外使用病毒处理细胞，然后将处理过的细胞给予至患者(离体)。常规的基于病毒的系统可以包括用于基因转移的逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体以及单纯疱疹病毒载体。在某些情形中，可以用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒的方法将基因转移整合进宿主基因组中，使插入的基因长期表达。慢病毒载体是能够转导或感染非分裂细胞并典型地产生较高病毒效价的逆转录病毒载体。慢病毒载体可包含长末端重复序列5’LTR和截短的3’LTR、RRE、rev应答元件(cPPT)、中央终止序列(CTS)和/或翻译后调控元件(WPRE)。所述分子可以通过BamHI和SalI酶切构建到慢病毒载体上。逆转录病毒基因转移系统的选择将依赖于靶组织。

例如，单个载体可以包含1个或多个(1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个或更多个)所述指导RNA。在某些情形中，可以提供1个或多个(1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个或更多个)所述的含有靶序列的载体，并且任选地将其递送到细胞中。

本申请的方法可包括向免疫效应细胞中引入本申请所述的载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述免疫效应细胞中，例如T淋巴细胞、B细胞、巨噬细胞或天然杀伤(NK)细胞。在某些实施方式中，每种或每个细胞可包含一个或一种本申请所述的载体。在某些实施方式中，每种或每个细胞可包含多个(例如，2个或以上)或多种(例如，2种或以上)本申请所述的载体。例如，可将本申请所述的载体引入所述细胞中。例如，可以通过逆转录病毒载体进行转染免疫效应细胞，将带有编码所述融合蛋白核酸的病毒基因组能整合到宿主基因组，保证目的基因长期、稳定地表达。又例如，利用转座子，通过携带编码所述融合蛋白的核酸的质粒和携带转座酶的质粒导入到靶细胞中。又例如，可以通过基因编辑的方式(例如CRISPR/Cas9)将核酸分子添加进基因组中。在本申请中，可通过本领域已知的方法将本申请所述的带有编码所述融合蛋白的核酸的载体引入所述细胞中，非限制性的实例包括病毒转导、电穿孔转染、脂质体递送、聚合物载体、化学载体、脂质复合物、聚合复合物、树枝状聚合物、纳米粒子、乳剂、天然内吞或吞噬途径、细胞穿透肽、显微注射法、微针递送法、粒子轰击法等。

例如，可采用电穿孔转染法，可以使用的电传孔仪器的非限制性实例包括：Neon转染系统(Thermo Fisher Scientific)、Gemini仪器和AgilePulse/CytoPulse仪器(BTX-Harvard apparatus)、4D-Nucleofector系统、Amaxa Nucleofector II、Nucleofector 202b仪器(Lonza)、CTX-1500A仪器(Celetrix)、MaxCyte GT或VLX仪器(MaxCyte)、GenePulser Xcell(Biorad)。在厂商的指导的基础上，可修改脉冲持续时间、强度，脉冲之间的间隔，脉冲次数，已达到高转染效率而低死亡率的最佳条件。

在本申请的实施例中，主要转染的细胞类型为人类原代的T细胞、淋巴细胞、外周血单个核细胞，理论上多数细胞类型都可以使用电穿孔转染方法将载体递送至细胞内。在某些情形中，可以转染单个供者的淋巴细胞，或多个供者的淋巴细胞的混合物。由于原代淋巴细胞多数情况下取自人类供者的外周血，从单个供者身上每次最多能得到的细胞数量有限，对每批次能处理的细胞总数产生了限制。如果能转染来自多个供者的细胞的混合物，使得单个批次处理的细胞不需来自于同一个供者，就能够成倍增加可处理的细胞总数，提高单个批次可生产的细胞数量，扩大生产规模，从而降低生产的成本。

另一方面，本申请提供了所述的免疫细胞、所述的细胞群和/或所述的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗肿瘤。在某些情形中，所述肿瘤可包括肾癌、成神经胶质细胞瘤、乳腺癌和/或急性髓系白血病。

不欲被任何理论所限，下文中的实施例仅仅是为了阐释本申请的融合蛋白、制备方法和用途等，而不用于限制本申请发明的范围。缩写词意义如下：“h”指小时，“min”指分钟，“s”指秒，“ms”指毫秒，“d”指天，“μL”指微升，“mL”指毫升，“L“指升，“bp”指碱基对，“mM”指毫摩尔，“μM”指微摩尔。

实施例

实施例1:获取CD70 CAR序列

通过专利检索，从国际申请PCT/US2015/025047得到靶向CD70的CAR序列：ΔCD27-4-1-BB-CD3ζ，命名为CD70-CAR-01。CD70-CAR-01的序列结构为：依次连接的人CD27胞外区、人CD27跨膜结构域、4-1BB共刺激信号传导区和CD3信号传导结构域，其氨基酸序列如SEQID NO:18所示，编码CD70-CAR-01的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。从PCT/EP2012/054733得到一种人CD70抗体：克隆41D12，其抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:19所示，编码其抗体重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，其抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示，编码其抗体轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。将41D12改造为scFv，重链可变区和轻链可变区之间通过3个GGGGS连接肽连接。设计两种不同连接顺序的scFv，从5’端至3’端，一种是重链可变区在前轻链可变区在后(41D12 scFv-02，氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示)，一种是轻链可变区在前重链可变区在后(41D12 scFv-03，氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示)。

将这两种靶向CD70的scFv依次与CD8a铰链区、CD8a跨膜区、4-1BB胞内域和CD3ζ激活域连接后得到两种CAR序列，分别命名为：CD70-CAR-02(氨基酸序列如SEQ ID NO:21所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示)和CD70-CAR-03(氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示)。scFv的5’端与CD8a信号肽(氨基酸序列如SEQ ID NO:24所示)通过linker-Flag-linker(氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示)连接。

实施例2：构建CD70嵌合抗原受体分子并克隆至慢病毒载体

2.1合成含有嵌合抗原受体的基因序列

靶向CD70的嵌合抗原受体基因序列由苏州金唯智生物科技有限公司合成并克隆至pUC57载体(苏州金唯智生物科技有限公司)上。在合成基因时，在基因5’端和3’端分别添加限制性内切酶BamHI(NEB：R3136S)和SalI(NEB：R3138S)酶切位点。

2.2构建表达CD70嵌合抗原受体的慢病毒载体

利用BamHI和SalI两个酶切位点将CD70嵌合抗原受体的基因序列：CD70-CAR-01、CD70-CAR-02、CD70-CAR-03分别从pUC57载体酶切下来，酶切条带经琼脂糖凝胶电泳检测后分别进行胶回收纯化(QIAGEN，货号28706)得到CD70嵌合抗原受体DNA片段。将酶切回收的CD70嵌合抗原受体DNA片段通过T4连接酶(NEB：M0202S)克隆至慢病毒载体(Addgene，货号12252)上，得到3个表达CD70嵌合抗原受体的重组质粒：p-lenti-CD70-CAR-01、p-lenti-CD70-CAR-02、p-lenti-CD70-CAR-03。将3个慢病毒载体送苏州金唯智生物科技有限公司测序验证，测序引物为：Lenti-For：TCAAGCCTCAGACAGTGGTTC(SEQ ID NO:16)，Lenti-Rev：CCTCATAAAGAGACAGCAACCAGG(SEQ ID NO:17)，测序验证3个慢病毒载体均构建正确。

实施例3：制备CD70嵌合抗原受体分子的慢病毒

3.1抽提质粒

将测序验证正确的重组质粒重新转化大肠杆菌stbl3(购自北京科瑞思博公司)。从转化好的平板上挑取单克隆到3ml含有氨卞青霉素的液体LB培养基的摇菌管中，37℃220rpm，摇床振荡培养8h。从活化好的菌液中吸取500μl接种到250ml含有氨卞青霉素的液体LB培养基中，37℃220rpm，摇床振荡培养12-16h。使用Qiagen HiSpeed Plasmid MaxiKit试剂盒(货号：12662)按照试剂盒提供的实验流程进行质粒提取。提取质粒后使用Nanodrop(Thermo Fisher Scientific)测定质粒浓度，并通过DNA琼脂糖凝胶检测超螺旋质粒含量。

3.2培养293T细胞

将冻存的293T细胞(购自ATCC)从液氮中取出后，在37℃水浴锅内不断摇动促其融化。用医用酒精擦拭管口后，移到提前已加入10ml预热的DMEM完全培养基(90％DMEM+10％FBS+1％青霉素/链霉素)的15ml离心管中，轻轻吹匀，1000rpm离心3min，吸弃上清。加入10ml DMEM完全培养基，轻轻吹匀后接种到10cm培养皿中，在37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养。第二天当细胞密度达到80％-90％时对其细胞进行传代，吸掉培养基用10ml PBS清洗1次，加入3ml含0.25％EDTA的胰蛋白酶，放入培养箱1-2min(期间需要拿出在显微镜下观察细胞是否变圆)。细胞变圆后加1ml的DMEM完全培养基终止胰酶消化，转移到15ml离心管中，1000rpm离心3min，吸弃上清。根据实验需要，按照1:3或1:5的比例传代，接种到新的10cm培养皿中继续培养或者冻存。

3.3制备慢病毒

第一天，接种293T细胞：按照约1.7×10⁷个/T175瓶(30ml培养基培养)接种细胞，使其第二天细胞密度达到80-90％时可转染。

第二天，质粒转染：转染前培养基需换成有10％FBS但无双抗的DMEM培养基。首先分别准备质粒复合物：将以下质粒加入到1.5ml Opti-MEM(Thermo Fisher Scientific，货号31985-070)内加入后混匀：9μg的psPAX2质粒(Addgene，货号：12260)，18μg的pMD2.G质粒(Addgene，货号：12259)，18μg的病毒载体质粒。病毒载体质粒共有3种：p-lenti-CD70-CAR-01、p-lenti-CD70-CAR-02、p-lenti-CD70-CAR-03。再准备转染试剂复合物：按照质粒与PEI质量比1:3，将67.5μl(2mg/ml)PEI(polysciences，货号24765)加入到1.5ml Opti-MEM内混匀，室温静置5min；再将转染试剂复合物加入到质粒复合物中，混匀后静置20min。最后将转染复合物慢慢滴入到293T细胞培养皿中，轻轻混匀，37℃含5％CO₂的细胞培养箱中培养。

第四天，收病毒：转染48h收取培养基上清，2000rpm离心10min去除细胞碎片。使用0.45μm滤膜过滤上清，滤液转移到专用离心管中配平。使用超速离心机25000rpm超速离心2h。倒掉上清后，使用X-VIVO-15培养基重悬慢病毒，并将慢病毒分装后保存在-80℃超低温冰箱中。按照该流程分别获得含有CD70-CAR-01、CD70-CAR-02和CD70-CAR-03的慢病毒。

实施例4：分离和激活人原代T细胞

将人外周血单个核细胞(PBMCs，购自上海妙顺生物)稀释到2×10⁶/ml，按照细胞与磁珠1:3的比例使用抗人的CD3/CD28磁珠(Thermo Fisher Scientific)激活T细胞，同时培养基中添加300IU/ml的IL-2(PeproTech：200-02)。在激活第3、5、7和10天的对照T细胞中分别检测CD70的表达。将细胞密度调整到1×10⁶/ml，取一定体积的T细胞，加入CD70抗体(BD Biosciences，货号561935)对细胞进行染色，4℃孵育半小时。染色完成后，使用PBS清洗细胞后重悬。使用流式细胞仪检测CD70的表达情况。结果发现CD70在激活的T细胞内高表达，在第5天表达CD70的T细胞占到12％(见图1)。

实施例5：制备CD70 sgRNA

5.1设计CD70 gRNA

使用ChopChop软件设计靶向人CD70基因的gRNA。首先登录ChopChop网站：http://chopchop.cbu.uib.no/。然后在网站页面做如下操作：Target条码框输入CD70；In条码框选择Homo sapiens(hg38/GRCh38)；Using条码框选择：CRISPR/Cas9；For条码框，选择knock-out。最后点击Find target sites按钮，获得CD70靶序列。根据前述CD70靶序列得到的指导序列见表2。

表2 sgRNA的核苷酸序列

在表2的指导序列的3’端连接骨架序列(以SEQ ID NO:37为例)即得到靶向CD70的sgRNA的核苷酸序列。

5.2制备并纯化sgRNA

首先，PCR扩增合成转录模板，反应体系为20μl，如下表3，反应条件如下表4。

表3 PCR反应体系

试剂	体积(μl)
		Q5 hot start HF 2X mix	10
正向引物(10μM)：sgRNA引物	1
		反向引物(10μM)：通用引物	1
ddH<sub>2</sub>O	8

表4 PCR反应条件

然后进行sgRNA体外转录，反应体系为20μl，见表5。加入试剂在冰上操作，然后37℃反应2-4h，结束后加入1μl的DNAase酶，在37℃反应15min。具体操作步骤可参见PCT专利申请公布文本WO2019011118A1。

表5 转录反应体系

试剂	体积(μl)
		上一步的PCR产物	8
转录buffer	10
		T7转录酶	2

接下来纯化sgRNA，将磁珠(Beckman，A63987)从冰箱取出后上下颠倒8-10次，并且多次震荡，直到所有磁珠都充分悬浮。然后按照1:1.8倍体积在sgRNA产物中加入磁珠，并在室温下孵育5-10分钟。孵育后放置在磁性分离器上2分钟，吸出上清液，将EP管继续留在磁性分离器上。在每管中加入200μl 80％的乙醇清洗，无需震荡并保持EP管在磁性分离器上，吸出上清液，重复此步骤一次，最后尽可能吸尽上清液。室温下风干5分钟后加入100μlRNAase free水混匀，室温下静置2-5分钟，将EP管放在磁性分离器上1-2分钟直到磁珠被磁铁吸附，将带有sgRNA的上清液转移到新的EP管中。最后使用Nanodrop根据操作说明测定纯化的sgRNA浓度。

实施例6：制备CD70敲除的T细胞

6.1敲除CD70

将激活的T细胞去除磁珠后，使用CRISPR/Cas9电转敲除T细胞中的CD70。细胞处理操作流程参考专利WO2019011118A1进行。简而言之，用实施例5中的sgRNA与从IDT购买的Cas9蛋白在Neon试剂盒(Thermo，MPK1096)提供的T缓冲液中混合，室温孵育5到10分钟，然后按照厂家提供的T细胞电转指南与重悬在T缓冲液的数量为0.2×10⁶/ml的6μl T细胞混合，在Neon的10μl移液器枪头中进行电转。电转方法请参见文献Schumann et al.PNAS2015.112:10437-10442。

T细胞用表1中的sgRNA敲除，敲除后分别命名为T-KO-sgRNA-19、T-KO-sgRNA-17、T-KO-sgRNA-8、T-KO-sgRNA-7、T-KO-sgRNA-13、T-KO-sgRNA-18、T-KO-sgRNA-4、T-KO-sgRNA-6、T-KO-sgRNA-24、T-KO-sgRNA-66和T-KO-sgRNA-15，同时选择未敲除的T细胞(对照T细胞)做阴性对照。

6.2检测CD70敲除效率

将敲除CD70的T细胞和对照T细胞继续培养一段时间后分别用流式细胞术和TIDE分析检测敲除效率。

(1)将敲除CD70的T细胞继续培养72h后通过荧光抗体染色和流式细胞术检测CD70分子在细胞内的表达情况，基本步骤如下：分别离心收集一定体积培养的T细胞，加入相应的荧光抗体避光30min孵育，用PBS洗涤一次后使用适量体积PBS重悬，最后使用流式细胞仪检测CD70分子表达。以未敲除的细胞为对照，按照CD70的表达情况计算敲除效率，计算公式为敲除效率＝(未敲除细胞CD70百分比-敲除细胞CD70百分比)/未敲除细胞CD70百分比。注：通过该方法计算消除效率时，对于T-KO-sgRNA-66和T-KO-sgRNA-15，流式检测扣除空白背景后，计算得到敲除效率为负数。可能是由于细胞应激，导致CD70表达上调，因此将敲除效率记为0％。

(2)敲除CD70的T细胞和对照T细胞培养到一定的数量后，收集细胞，用QIAGENDNeasy Blood&Tissue Kit(货号69504)按照操作说明书提取基因组，然后将提取的基因组DNA用琼脂糖凝胶电泳检测。以提取的基因组DNA为模板，设计合适的引物对目标基因PCR扩增后进行割胶纯化回收，将对照T细胞和敲除T细胞都测序，将测序结果放入网站https://tide.deskgen.com/，分析每个不同的sgRNA敲除CD70的效率。未使用该方法对T-KO-sgRNA-66和T-KO-sgRNA-15检测敲除效率。

敲除效率见表6。

表6 CD70敲除效率

实施例7：使用先转染再敲除的方法制备CD70敲除的抗CD70-CAR-T细胞

T细胞激活2天后，对T细胞计数后将其细胞浓度调至为1×10⁶/ml，每孔500μl接种到24孔中，分别将实施例3的含有CD70-CAR-01、CD70-CAR-02和CD70-CAR-03DNA序列的慢病毒加入到T细胞培养孔内转染T细胞，未转染的T细胞作为阴性对照，得到不同组别的可表达靶向人CD70抗原的嵌合抗原受体T细胞，命名为：CD70-CAR-T-01、CD70-CAR-T-02和CD70-CAR-T-03。

然后按照实施例6的步骤，使用电转将CD70 sgRNA-19导入到未转染的T细胞、CD70-CAR-T-01A、CD70-CAR-T-02A和CD70-CAR-T-03A的T细胞内，进行CD70敲除，得到的T细胞分别命名为：对照T细胞-KO(T-KO)、CD70KO-CAR-T-01A、CD70KO-CAR-T-02A和CD70KO-CAR-T-03A的T细胞。未转染也未敲除的T细胞为对照T细胞(CT)。继续培养各组T细胞至静息态。根据实施例6，提取各组T细胞基因组，通过PCR和TIDE分析确定在这些CAR-T细胞中，CD70已经被成功敲除。T-KO、CD70KO-CAR-T-01A、CD70KO-CAR-T-02A和CD70KO-CAR-T-03A细胞敲除效率如表7所示。

表7 CD70敲除效率

实施例8：检测CD70敲除的抗CD70-CAR在T细胞内的表达情况

通过荧光抗体染色和流式细胞术检测实施例7制得的敲除了CD70基因的抗CD70-CAR分子在各组T细胞内的表达情况，基本步骤如下：分别离心收集慢病毒感染48h的抗CD70-CAR-T细胞(CD70KO-CAR-T-01A、CD70KO-CAR-T-02A和CD70KO-CAR-T-03A细胞)和慢病毒未感染的T细胞，加入生物素化人CD70蛋白(100μg/ml)(Acrobiosystems)，4℃避光孵育30分钟，PBS清洗1次。使用适量体积PBS重悬后加入二抗PE-Streptavidin(BDBiosciences，货号554061)，4℃避光孵育20分钟，PBS清洗1次后再用适量的PBS重悬，最后使用流式细胞仪检测抗CD70-CAR分子在T细胞表面的表达效率，结果如图2所示，其中，对照T细胞未染色为未敲除CD70也未转染病毒的对照T细胞，对照T细胞为敲除CD70的未转染病毒的T细胞。

实施例9：CD70敲除的抗CD70-CAR-T与不同的靶细胞共培养后细胞因子的检测

首先检测786-O细胞(购自中国科学院细胞库)、Raji细胞(购自中国科学院细胞库)、K562(购自中国科学院细胞库)和293T(购自ATCC)细胞内的表达情况。取一定体积的细胞，使用CD70抗体染色后流式细胞仪分析，发现786-O和Raji细胞高表达CD70，K562细胞和293T细胞不表达CD70(见图3)。使用带有CD70基因(Genebank：NM_001252.5，SEQ ID NO:6)的慢病毒转染293T细胞，制备得到表达CD70蛋白的293T-CD70细胞系。慢病毒制备流程参见实施例3。对CD70敲除的抗CD70-CAR-T细胞和对照T细胞计数后将浓度调至1×10⁶/ml，然后按照100μl每孔接种到平底96孔板中，置于37℃孵育。将表达CD70蛋白的786-O、Raji细胞和293T-CD70、不表达CD70蛋白的阴性细胞293T按照效靶比1:1，即细胞浓度1×10⁶/ml，100μl/孔，加入到抗CD70-CAR-T细胞或者对照T细胞中共培养。

将上述细胞共培养24h后的上清转移到新的96孔板，使用ELISA试剂盒(ThermoFisher Scientific，货号88-7316)检测CAR-T细胞IL-2和IFN-γ细胞因子的分泌。平板制备和上清细胞因子的检测按照试剂盒提供的标准流程操作。

结果见图4和图5，从图中可以看出，CD70敲除的抗CD70-CAR-T细胞与CD70阳性的细胞(786-O、Raji和293T-CD70)共培养后释放高水平的IL-2和IFN-γ。而抗CD70-CAR-T细胞与CD70阴性的细胞293T共培养后几乎没有分泌细胞因子释放，而且阴性对照T细胞无论与CD70阳性的细胞和CD70阴性的细胞共培养不诱导细胞因子的释放，这验证了共培养测定中的细胞因子释放是CAR依赖性和CD70特异性的。

实施例10：CD70敲除的抗CD70-CAR-T对靶细胞杀伤能力检测

首先细胞铺板，使用带有荧光素酶(GenBank:AAR29591.1)的慢病毒转染786-O细胞、Raji细胞、293T-CD70细胞和293T细胞，制备得到标记有荧光素酶的细胞系，分别命名为：786-O.luc细胞、Raji.luc细胞、293T.CD70.luc细胞和293T.luc细胞。将标记有荧光素酶的细胞系，按照细胞浓度1×10⁵/ml，50μl/孔铺至96孔平底不透明白板中。设置2.5:1、1:1和0.5:1共3个效靶比，将各组T细胞与靶细胞共培养。将96孔板放置于37℃5％CO₂细胞培养箱中培养过夜。

细胞共培养24h后测定靶细胞剩余的荧光素酶活性(相对光单位，RLU)，来检测每种CAR-T对不同靶细胞的杀伤能力。具体步骤为：共培养后的细胞800rpm离心5min，吸掉上清后加入100μl的D-luciferin底物(Thermo Fisher Scientific：88293)混匀避光显色5min，在酶标仪用化学发光模式检测荧光强度。在不存在效应细胞的情况下，通过将培养基加入靶细胞来获得最大荧光素酶活性作为对照。

各组T细胞与靶细胞共培养24h后，其杀伤结果见图6-图9。数据证实，CD70敲除的抗CD70-CAR-T细胞都对786-O.luc、Raji.luc和表达CD70的稳定细胞系293T-CD70.luc呈现不同水平的杀伤能力，并且CAR-T具有针对786-O.luc、Raji.luc和293T.CD70.luc细胞的剂量依赖性杀伤作用，在效靶比2.5:1情况下其中超过60％克隆其杀伤效率超过50％以上，在效靶比1:1和0.5:1下其杀伤效率开始降低。同时图9数据证实CAR T细胞与CD70阴性细胞系293T.luc共培养时，在3种效靶比下都未检测到荧光素酶的活性显著降低，也就是其杀伤率并没有显著增加，说明CAR T细胞针对CD70阴性细胞系293T.luc不具有细胞的剂量依赖性杀伤作用。以上数据证明了抗CD70 CAR T细胞针对肿瘤细胞的杀伤作用是CD70特异性的。

实施例11：使用先敲除再转染的方法制备CD70敲除的抗CD70-CAR-T细胞

将人外周血单个核细胞(PBMCs，购自上海妙顺生物)稀释到2×10⁶/ml，按照实施例6.1的方法，使用电转将实施例5得到的CD70 sgRNA-19导入到T细胞内，进行CD70敲除。电转后24小时，对T细胞计数后将其细胞浓度调至为1×10⁶/ml，按照细胞与磁珠1:3的比例使用抗人的CD3/CD28磁珠(Thermo Fisher Scientific)激活T细胞，同时培养基中添加300IU/ml的IL-2(PeproTech，货号200-02)。T细胞激活2天后，分别将含有CD70-CAR-01、CD70-CAR-02和CD70-CAR-03DNA序列的慢病毒加入到T细胞培养孔内转染T细胞，未转染的T细胞作为阴性对照，得到不同组别的可表达靶向人CD70抗原的嵌合抗原受体T细胞，命名为：CD70KO-CAR-T-01B、CD70KO-CAR-T-02B和CD70KO-CAR-T-03B。CD70KO-CAR-T-01B、CD70KO-CAR-T-02B和CD70KO-CAR-T-03B在静息态抗CD70的表达效率见图10。CD70敲除效率见表8。结果说明，在激活T细胞之前进行电转敲除CD70也可以制备CD70敲除的抗CD70-CAR-T细胞。

表8 CD70敲除效率

组别	敲除效率(％)
		对照T细胞	0.18
对照T细胞-KO	93.5
		CD70 KO-CAR-T-01B	95.5
CD70 KO-CAR-T-02B	95.3
		CD70 KO-CAR-T-03B	93.1

实施例12：制备通用型抗CD70-CAR-T细胞

实施例7中的CD70-CAR-T-01、CD70-CAR-T-02和CD70-CAR-T-03细胞激活3天后，按照实施例6.1的步骤，使用电转将TRAC gRNA(SEQ ID NO:28)和CD70 sgRNA-19(SEQ ID NO:49)导入到未转染的T细胞、CD70-CAR-T-01、CD70-CAR-T-02和CD70-CAR-T-03T细胞内，敲除它们的TRAC和CD70，得到的T细胞分别命名为：对照UT细胞、CD70KO-UCAR-T-01、CD70KO-UCAR-T-02和CD70KO-UCAR-T-03T细胞。未转染也未敲除的T细胞为对照T细胞。继续培养各组T细胞至静息态。按照实施例6.2中步骤，提取各组T细胞基因组，通过PCR和TIDE分析确定在这些CAR-T细胞中，CD70已经被成功敲除。

可以从PCT申请WO2019011118A1获得TRAC gRNA靶序列、B2M gRNA的靶序列，分别得到TRAC sgRNA的指导序列(SEQ ID NO:28)和B2M sgRNA的指导序列(SEQ ID NO:33-36)，在这些指导序列的3’端连接骨架序列(SEQ ID NO:37)，得到TRAC sgRNA和4条B2M sgRNA(称为B2M sgRNA-1、B2M sgRNA-2、B2M sgRNA-3、B2M sgRNA-4)。

将这些sgRNA和靶向CD70的sgRNA-19(SEQ ID NO:49)导入到未转染的T细胞、CD70-CAR-T-01、CD70-CAR-T-02和CD70-CAR-T-03T细胞内，敲除它们的TRAC、B2M和CD70，得到敲除了CD70的通用型CAR T细胞。然后提取各组CAR T细胞基因组，通过PCR和TIDE分析确定在这些CAR-T细胞中，CD70已经被成功敲除。

前述详细说明是以解释和举例的方式提供的，并非要限制所附权利要求的范围。目前本文所列举的实施方式的多种变化对本领域普通技术人员来说是显而易见的，且保留在所附的权利要求和其等同方案的范围内。

序列表

<110> 苏州克睿基因生物科技有限公司

<120> 一种制备经修饰的免疫细胞的方法

<130> 0141-PA-006

<160> 59

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1110

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CD70-CAR-01核苷酸序列

<400> 1

atggcacggc cacatccctg gtggctgtgc gttctgggga ccctggtggg gctctcagct 60

actccagccc ccaagagctg cccagagagg cactactggg ctcagggaaa gctgtgctgc 120

cagatgtgtg agccaggaac attcctcgtg aaggactgtg accagcatag aaaggctgct 180

cagtgtgatc cttgcatacc gggggtctcc ttctctcctg accaccacac ccggccccac 240

tgtgagagct gtcggcactg taactctggt cttctcgttc gcaactgcac catcactgcc 300

aatgctgagt gtgcctgtcg caatggctgg cagtgcaggg acaaggagtg caccgagtgt 360

gatcctcttc caaacccttc gctgaccgct cggtcgtctc aggccctgag cccacaccct 420

cagcccaccc acttacctta tgtcagtgag atgctggagg ccaggacagc tgggcacatg 480

cagactctgg ctgacttcag gcagctgcct gcccggactc tctctaccca ctggccaccc 540

caaagatccc tgtgcagctc cgattttatt cgcatccttg tgatcttctc tggaatgttc 600

cttgttttca ccctggccgg ggccctgttc ctccgtttct ctgttgttaa acggggcaga 660

aagaagctcc tgtatatatt caaacaacca tttatgagac cagtacaaac tactcaagag 720

gaagatggct gtagctgccg atttccagaa gaagaagaag gaggatgtga actgagagtg 780

aagttcagca ggagcgcaga cgcccccgcg taccagcagg gccagaacca gctctataac 840

gagctcaatc taggacgaag agaggagtac gatgttttgg acaagagacg tggccgggac 900

cctgagatgg ggggaaagcc gagaaggaag aaccctcagg aaggcctgta caatgaactg 960

cagaaagata agatggcgga ggcctacagt gagattggga tgaaaggcga gcgccggagg 1020

ggcaaggggc acgatggcct ttaccagggt ctcagtacag ccaccaagga cacctacgac 1080

gcccttcaca tgcaggccct gccccctcgc 1110

<210> 2

<211> 366

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 克隆41D12重链可变区核苷酸序列

<400> 2

gaggtgcagc tcgtggagtc tgggggaggc ttggtgcagc ctggggggtc tctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt caccttcagt gtctactaca tgaactgggt ccgccaggct 120

ccagggaagg ggctcgagtg ggtctcagat attaataatg aaggtggtac tacatactat 180

gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca actctaagaa cagcctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgcg cgccgaggac acggccgtgt actactgcgc gagagatgcc 300

ggatatagca accatgtacc catctttgat tcttggggcc aggggaccct ggtcactgtc 360

tcctca 366

<210> 3

<211> 333

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 克隆41D12轻链可变区核苷酸序列

<400> 3

caggcagtgg tgacccagga gccttccctg acagtgtctc caggagggac ggtcacgctc 60

acctgcggcc tcaaatctgg gtctgtcact tccgataact tccccacttg gtaccagcag 120

acaccaggcc aggctccccg attgcttatc tacaacacaa acacccgtca ctctggcgtc 180

cccgaccgct tctccggatc catcctgggc aacaaagccg ccctcaccat cacgggggcc 240

caggccgacg acgaggccga atatttctgt gctctgttca taagtaatcc tagtgttgag 300

ttcggcggag ggacccaact gaccgtccta ggt 333

<210> 4

<211> 1518

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CD70-CAR-02

<400> 4

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgggcggca gcgactacaa agacgatgac gacaagggtg gctccgaggt gcagctcgtg 120

gagtctgggg gaggcttggt gcagcctggg gggtctctga gactctcctg tgcagcctct 180

ggattcacct tcagtgtcta ctacatgaac tgggtccgcc aggctccagg gaaggggctc 240

gagtgggtct cagatattaa taatgaaggt ggtactacat actatgcaga ctccgtgaag 300

ggccgattca ccatctccag agacaactct aagaacagcc tgtatctgca aatgaacagc 360

ctgcgcgccg aggacacggc cgtgtactac tgcgcgagag atgccggata tagcaaccat 420

gtacccatct ttgattcttg gggccagggg accctggtca ctgtctcctc aggtggcggt 480

ggctcgggcg gtggtgggtc gggtggcggc ggatctcagg cagtggtgac ccaggagcct 540

tccctgacag tgtctccagg agggacggtc acgctcacct gcggcctcaa atctgggtct 600

gtcacttccg ataacttccc cacttggtac cagcagacac caggccaggc tccccgattg 660

cttatctaca acacaaacac ccgtcactct ggcgtccccg accgcttctc cggatccatc 720

ctgggcaaca aagccgccct caccatcacg ggggcccagg ccgacgacga ggccgaatat 780

ttctgtgctc tgttcataag taatcctagt gttgagttcg gcggagggac ccaactgacc 840

gtcctaggta ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 900

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 960

agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 1020

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1080

tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1140

agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1200

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1260

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1320

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1380

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1440

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1500

caggccctgc cccctcgc 1518

<210> 5

<211> 1518

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CD70-CAR-03

<400> 5

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccgggcggca gcgactacaa agacgatgac gacaagggtg gctcccaggc agtggtgacc 120

caggagcctt ccctgacagt gtctccagga gggacggtca cgctcacctg cggcctcaaa 180

tctgggtctg tcacttccga taacttcccc acttggtacc agcagacacc aggccaggct 240

ccccgattgc ttatctacaa cacaaacacc cgtcactctg gcgtccccga ccgcttctcc 300

ggatccatcc tgggcaacaa agccgccctc accatcacgg gggcccaggc cgacgacgag 360

gccgaatatt tctgtgctct gttcataagt aatcctagtg ttgagttcgg cggagggacc 420

caactgaccg tcctaggtgg tggcggtggc tcgggcggtg gtgggtcggg tggcggcgga 480

tctgaggtgc agctcgtgga gtctggggga ggcttggtgc agcctggggg gtctctgaga 540

ctctcctgtg cagcctctgg attcaccttc agtgtctact acatgaactg ggtccgccag 600

gctccaggga aggggctcga gtgggtctca gatattaata atgaaggtgg tactacatac 660

tatgcagact ccgtgaaggg ccgattcacc atctccagag acaactctaa gaacagcctg 720

tatctgcaaa tgaacagcct gcgcgccgag gacacggccg tgtactactg cgcgagagat 780

gccggatata gcaaccatgt acccatcttt gattcttggg gccaggggac cctggtcact 840

gtctcctcaa ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac cggcgcccac catcgcgtcg 900

cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg cggggggcgc agtgcacacg 960

agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc ccttggccgg gacttgtggg 1020

gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcaaac ggggcagaaa gaaactcctg 1080

tatatattca aacaaccatt tatgagacca gtacaaacta ctcaagagga agatggctgt 1140

agctgccgat ttccagaaga agaagaagga ggatgtgaac tgagagtgaa gttcagcagg 1200

agcgcagacg cccccgcgta ccagcagggc cagaaccagc tctataacga gctcaatcta 1260

ggacgaagag aggagtacga tgttttggac aagagacgtg gccgggaccc tgagatgggg 1320

ggaaagccga gaaggaagaa ccctcaggaa ggcctgtaca atgaactgca gaaagataag 1380

atggcggagg cctacagtga gattgggatg aaaggcgagc gccggagggg caaggggcac 1440

gatggccttt accagggtct cagtacagcc accaaggaca cctacgacgc ccttcacatg 1500

caggccctgc cccctcgc 1518

<210> 6

<211> 579

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CD70核苷酸序列

<400> 6

atgccggagg agggttcggg ctgctcggtg cggcgcaggc cctatgggtg cgtcctgcgg 60

gctgctttgg tcccattggt cgcgggcttg gtgatctgcc tcgtggtgtg catccagcgc 120

ttcgcacagg ctcagcagca gctgccgctc gagtcacttg ggtgggacgt agctgagctg 180

cagctgaatc acacaggacc tcagcaggac cccaggctat actggcaggg gggcccagca 240

ctgggccgct ccttcctgca tggaccagag ctggacaagg ggcagctacg tatccatcgt 300

gatggcatct acatggtaca catccaggtg acgctggcca tctgctcctc cacgacggcc 360

tccaggcacc accccaccac cctggccgtg ggaatctgct ctcccgcctc ccgtagcatc 420

agcctgctgc gtctcagctt ccaccaaggt tgtaccattg cctcccagcg cctgacgccc 480

ctggcccgag gggacacact ctgcaccaac ctcactggga cacttttgcc ttcccgaaac 540

actgatgaga ccttctttgg agtgcagtgg gtgcgcccc 579

<210> 7

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sgRNA-19 17个核苷酸指导序列

<400> 7

gcuggaugca caccacg 17

<210> 8

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sgRNA-17 17个核苷酸指导序列

<400> 8

gugcggcgca ggcccua 17

<210> 9

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sgRNA-8 17个核苷酸指导序列

<400> 9

cgcaggacgc acccaua 17

<210> 10

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sgRNA-7 17个核苷酸指导序列

<400> 10

cauccagcgc uucgcac 17

<210> 11

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sgRNA-13 17个核苷酸指导序列

<400> 11

gaucgccgcg gcgaugc 17

<210> 12

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sgRNA-18 17个核苷酸指导序列

<400> 12

accccaagug acucgag 17

<210> 13

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sgRNA-4 17个核苷酸指导序列

<400> 13

cuacguaucc aucguga 17

<210> 14

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sgRNA-6 17个核苷酸指导序列

<400> 14

uuggucccau uggucgc 17

<210> 15

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sgRNA-24 17个核苷酸指导序列

<400> 15

ggcugcuuug gucccau 17

<210> 16

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Lenti-For

<400> 16

tcaagcctca gacagtggtt c 21

<210> 17

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> Lenti-Rev

<400> 17

cctcataaag agacagcaac cagg 24

<210> 18

<211> 370

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CD70-CAR-01氨基酸序列

<400> 18

Met Ala Arg Pro His Pro Trp Trp Leu Cys Val Leu Gly Thr Leu Val

1 5 10 15

Gly Leu Ser Ala Thr Pro Ala Pro Lys Ser Cys Pro Glu Arg His Tyr

20 25 30

Trp Ala Gln Gly Lys Leu Cys Cys Gln Met Cys Glu Pro Gly Thr Phe

35 40 45

Leu Val Lys Asp Cys Asp Gln His Arg Lys Ala Ala Gln Cys Asp Pro

50 55 60

Cys Ile Pro Gly Val Ser Phe Ser Pro Asp His His Thr Arg Pro His

65 70 75 80

Cys Glu Ser Cys Arg His Cys Asn Ser Gly Leu Leu Val Arg Asn Cys

85 90 95

Thr Ile Thr Ala Asn Ala Glu Cys Ala Cys Arg Asn Gly Trp Gln Cys

100 105 110

Arg Asp Lys Glu Cys Thr Glu Cys Asp Pro Leu Pro Asn Pro Ser Leu

115 120 125

Thr Ala Arg Ser Ser Gln Ala Leu Ser Pro His Pro Gln Pro Thr His

130 135 140

Leu Pro Tyr Val Ser Glu Met Leu Glu Ala Arg Thr Ala Gly His Met

145 150 155 160

Gln Thr Leu Ala Asp Phe Arg Gln Leu Pro Ala Arg Thr Leu Ser Thr

165 170 175

His Trp Pro Pro Gln Arg Ser Leu Cys Ser Ser Asp Phe Ile Arg Ile

180 185 190

Leu Val Ile Phe Ser Gly Met Phe Leu Val Phe Thr Leu Ala Gly Ala

195 200 205

Leu Phe Leu Arg Phe Ser Val Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu

210 215 220

Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu

225 230 235 240

Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys

245 250 255

Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln

260 265 270

Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu

275 280 285

Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly

290 295 300

Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu

305 310 315 320

Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly

325 330 335

Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser

340 345 350

Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro

355 360 365

Pro Arg

370

<210> 19

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 克隆41D12重链可变区

<400> 19

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Asp Ile Asn Asn Glu Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ala Gly Tyr Ser Asn His Val Pro Ile Phe Asp Ser Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 20

<211> 111

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 克隆41D12轻链可变区

<400> 20

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Lys Ser Gly Ser Val Thr Ser Asp

20 25 30

Asn Phe Pro Thr Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Thr Arg His Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Leu Phe Ile Ser Asn

85 90 95

Pro Ser Val Glu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

<210> 21

<211> 506

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CD70-CAR-02氨基酸序列

<400> 21

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

20 25 30

Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

35 40 45

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

50 55 60

Ser Val Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

65 70 75 80

Glu Trp Val Ser Asp Ile Asn Asn Glu Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala

85 90 95

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

100 105 110

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

115 120 125

Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Ala Gly Tyr Ser Asn His Val Pro Ile Phe

130 135 140

Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val

165 170 175

Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu

180 185 190

Thr Cys Gly Leu Lys Ser Gly Ser Val Thr Ser Asp Asn Phe Pro Thr

195 200 205

Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asn

210 215 220

Thr Asn Thr Arg His Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile

225 230 235 240

Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Asp Asp

245 250 255

Glu Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Leu Phe Ile Ser Asn Pro Ser Val Glu

260 265 270

Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly Thr Thr Thr Pro Ala

275 280 285

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

290 295 300

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

305 310 315 320

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala

325 330 335

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

340 345 350

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

355 360 365

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

370 375 380

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

385 390 395 400

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

405 410 415

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

420 425 430

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

435 440 445

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

450 455 460

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

465 470 475 480

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

485 490 495

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

500 505

<210> 22

<211> 506

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CD70-CAR-03氨基酸序列

<400> 22

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys

20 25 30

Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser

35 40 45

Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Lys Ser Gly Ser Val

50 55 60

Thr Ser Asp Asn Phe Pro Thr Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala

65 70 75 80

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Thr Arg His Ser Gly Val Pro

85 90 95

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile

100 105 110

Thr Gly Ala Gln Ala Asp Asp Glu Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Leu Phe

115 120 125

Ile Ser Asn Pro Ser Val Glu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val

130 135 140

Leu Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

145 150 155 160

Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

165 170 175

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val

180 185 190

Tyr Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

195 200 205

Val Ser Asp Ile Asn Asn Glu Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

210 215 220

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu

225 230 235 240

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

245 250 255

Cys Ala Arg Asp Ala Gly Tyr Ser Asn His Val Pro Ile Phe Asp Ser

260 265 270

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala

275 280 285

Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser

290 295 300

Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr

305 310 315 320

Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala

325 330 335

Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys

340 345 350

Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met

355 360 365

Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe

370 375 380

Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg

385 390 395 400

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

405 410 415

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

420 425 430

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

435 440 445

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

450 455 460

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

465 470 475 480

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

485 490 495

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

500 505

<210> 23

<211> 193

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CD70氨基酸序列

<400> 23

Met Pro Glu Glu Gly Ser Gly Cys Ser Val Arg Arg Arg Pro Tyr Gly

1 5 10 15

Cys Val Leu Arg Ala Ala Leu Val Pro Leu Val Ala Gly Leu Val Ile

20 25 30

Cys Leu Val Val Cys Ile Gln Arg Phe Ala Gln Ala Gln Gln Gln Leu

35 40 45

Pro Leu Glu Ser Leu Gly Trp Asp Val Ala Glu Leu Gln Leu Asn His

50 55 60

Thr Gly Pro Gln Gln Asp Pro Arg Leu Tyr Trp Gln Gly Gly Pro Ala

65 70 75 80

Leu Gly Arg Ser Phe Leu His Gly Pro Glu Leu Asp Lys Gly Gln Leu

85 90 95

Arg Ile His Arg Asp Gly Ile Tyr Met Val His Ile Gln Val Thr Leu

100 105 110

Ala Ile Cys Ser Ser Thr Thr Ala Ser Arg His His Pro Thr Thr Leu

115 120 125

Ala Val Gly Ile Cys Ser Pro Ala Ser Arg Ser Ile Ser Leu Leu Arg

130 135 140

Leu Ser Phe His Gln Gly Cys Thr Ile Ala Ser Gln Arg Leu Thr Pro

145 150 155 160

Leu Ala Arg Gly Asp Thr Leu Cys Thr Asn Leu Thr Gly Thr Leu Leu

165 170 175

Pro Ser Arg Asn Thr Asp Glu Thr Phe Phe Gly Val Gln Trp Val Arg

180 185 190

Pro

<210> 24

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> CD8a信号肽

<400> 24

Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

His Ala Ala Arg Pro

20

<210> 25

<211> 14

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 连接肽-Flag-连接肽

<400> 25

Gly Gly Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 26

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 重链可变区-(GGGGS)3-轻链可变区

<400> 26

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Asp Ile Asn Asn Glu Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Ala Gly Tyr Ser Asn His Val Pro Ile Phe Asp Ser Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu

130 135 140

Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly

145 150 155 160

Leu Lys Ser Gly Ser Val Thr Ser Asp Asn Phe Pro Thr Trp Tyr Gln

165 170 175

Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Thr

180 185 190

Arg His Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn

195 200 205

Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Asp Asp Glu Ala Glu

210 215 220

Tyr Phe Cys Ala Leu Phe Ile Ser Asn Pro Ser Val Glu Phe Gly Gly

225 230 235 240

Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly

245

<210> 27

<211> 248

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 轻链可变区-(GGGGS)3-重链可变区

<400> 27

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Leu Lys Ser Gly Ser Val Thr Ser Asp

20 25 30

Asn Phe Pro Thr Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Asn Thr Asn Thr Arg His Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Ile Leu Gly Asn Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Ala Asp Asp Glu Ala Glu Tyr Phe Cys Ala Leu Phe Ile Ser Asn

85 90 95

Pro Ser Val Glu Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu Gly Gly

100 105 110

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val

115 120 125

Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu

130 135 140

Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Val Tyr Tyr Met

145 150 155 160

Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Asp

165 170 175

Ile Asn Asn Glu Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

180 185 190

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Ser Leu Tyr Leu Gln

195 200 205

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

210 215 220

Asp Ala Gly Tyr Ser Asn His Val Pro Ile Phe Asp Ser Trp Gly Gln

225 230 235 240

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

245

<210> 28

<211> 22

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> TRAC 指导序列

<400> 28

gagucucuca gcugguacac gg 22

<210> 29

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sgRNA-24、sgRNA-6、sgRNA-4、 sgRNA-18、sgRNA-13、sgRNA-7、 sgRNA-8、sgRNA-17、sgRNA-19 17个核苷酸指导序列通式

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n = c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n = c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> n = c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> n = a、c、g或u

<400> 29

nnnnnnnnnn nnnnnnn 17

<210> 30

<211> 17

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sgRNA-19、sgRNA-17、sgRNA-8、 sgRNA-7、sgRNA-13、sgRNA-18、 sgRNA-4 17个核苷酸指导序列通式

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n = a、c或g

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n = a、c或g

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n = c或g

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n = c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n = c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n = a、c或g

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> n = c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> n = a、c或g

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> n = a、c或g

<400> 30

nnnnnnnnnn nnnnnnn 17

<210> 31

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sgRNA-66 指导序列

<400> 31

ugcgucucag cuuccacca 19

<210> 32

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sgRNA-15 指导序列

<400> 32

cauguagaug ccaucacga 19

<210> 33

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> B2M sgRNA-1 指导序列

<400> 33

cucacgcugg auagccucc 19

<210> 34

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> B2M sgRNA-2 指导序列

<400> 34

aguagcgcga gcacagcua 19

<210> 35

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> B2M sgRNA-3 指导序列

<400> 35

gccacggagc gagacaucu 19

<210> 36

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> B2M sgRNA-4 指导序列

<400> 36

aaguugacuu acugaagaa 19

<210> 37

<211> 90

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 骨架序列1

<400> 37

guuuuagagc uaugcuggaa acagcauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac 60

uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu 90

<210> 38

<211> 80

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 骨架序列2

<400> 38

guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60

ggcaccgagu cggugcuuuu 80

<210> 39

<211> 82

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 骨架序列3

<400> 39

guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60

ggcaccgagu cggugcuuuu uu 82

<210> 40

<211> 50

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 骨架序列4

<400> 40

guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuuuuuuu 50

<210> 41

<211> 56

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 骨架序列5

<400> 41

guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucauu uuuuuu 56

<210> 42

<211> 69

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 骨架序列6

<400> 42

guuuuagagc uagaaauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac uugaaaaagu 60

guuuuuuuu 69

<210> 43

<211> 92

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 骨架序列7

<400> 43

guuuuagagc uaugcuggaa acagcauagc aaguuaaaau aaggcuaguc cguuaucaac 60

uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 92

<210> 44

<211> 92

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 骨架序列8

<400> 44

guuucagagc uaugcuggaa acagcauagc aaguugaaau aaggcuaguc cguuaucaac 60

uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 92

<210> 45

<211> 84

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 骨架序列9

<400> 45

guuuuagagc uaugaaaaua gcaaguuaaa auaaggcuag uccguuauca acuugaaaaa 60

guggcaccga gucggugcuu uuuu 84

<210> 46

<211> 88

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 骨架序列10

<400> 46

guuuuagagc uaugcgaaag cauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu aucaacuuga 60

aaaaguggca ccgagucggu gcuuuuuu 88

<210> 47

<211> 98

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 骨架序列11

<400> 47

guuuuagagc uaugcuguuu gaaaaaacag cauagcaagu uaaaauaagg cuaguccguu 60

aucaacuuga aaaaguggca ccgagucggu gcuuuuuu 98

<210> 48

<211> 102

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> 骨架序列12

<400> 48

guuuuagagc uaugcuguuu uggaaacaaa acagcauagc aaguuaaaau aaggcuaguc 60

cguuaucaac uugaaaaagu ggcaccgagu cggugcuuuu uu 102

<210> 49

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sgRNA-19 19个核苷酸指导序列

<400> 49

gcgcuggaug cacaccacg 19

<210> 50

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sgRNA-17 19个核苷酸指导序列

<400> 50

cggugcggcg caggcccua 19

<210> 51

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sgRNA-8 19个核苷酸指导序列

<400> 51

cccgcaggac gcacccaua 19

<210> 52

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sgRNA-7 19个核苷酸指导序列

<400> 52

ugcauccagc gcuucgcac 19

<210> 53

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sgRNA-13 19个核苷酸指导序列

<400> 53

gugaucgccg cggcgaugc 19

<210> 54

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sgRNA-18 19个核苷酸指导序列

<400> 54

ucaccccaag ugacucgag 19

<210> 55

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sgRNA-4 19个核苷酸指导序列

<400> 55

agcuacguau ccaucguga 19

<210> 56

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sgRNA-6 19个核苷酸指导序列

<400> 56

cuuugguccc auuggucgc 19

<210> 57

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sgRNA-24 19个核苷酸指导序列

<400> 57

cgggcugcuu uggucccau 19

<210> 58

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sgRNA-19; sgRNA-17; sgRNA-8; sgRNA-7; sgRNA-13 ; sgRNA-18; sgRNA-4;sgRNA-6; sgRNA-24 19个核苷酸指导序列通式

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n = c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n = c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n = c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n = c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> n = a、c、g或u

<400> 58

nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 19

<210> 59

<211> 19

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<220>

<223> sgRNA-19; sgRNA-17; sgRNA-8; sgRNA-7; sgRNA-13; sgRNA-18; sgRNA-4 19个核苷酸指导序列通式

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(1)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (2)..(2)

<223> n = c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (3)..(3)

<223> n = a、c或g

<220>

<221> misc_feature

<222> (4)..(4)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (5)..(5)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (6)..(6)

<223> n = a、c或g

<220>

<221> misc_feature

<222> (7)..(7)

<223> n = c或g

<220>

<221> misc_feature

<222> (8)..(8)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (9)..(9)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (10)..(10)

<223> n = c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (11)..(11)

<223> n = c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(12)

<223> n = a、c或g

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(13)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(14)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(15)

<223> n = c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(16)

<223> n = a、c或g

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> n = a、c、g或u

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> n = a、c或g

<400> 59

nnnnnnnnnn nnnnnnnnn 19

Claims

1.制备经修饰的免疫细胞的方法，其包括以下步骤：向免疫细胞施用靶向编码CD70的核酸分子的指导RNA，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO: 49-51中任一项所示的核苷酸序列；

其还包括以下步骤：使所述经修饰的免疫细胞包括嵌合抗原受体（CAR）；其中所述嵌合抗原受体（CAR）靶向肿瘤特异性抗原CD70。

2.根据权利要求1所述的方法，其包括向免疫细胞施用Cas蛋白。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述免疫细胞包括T细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、B细胞、淋巴细胞和/或白细胞。

4.根据权利要求1所述的方法，其还包括以下步骤：使所述经修饰的免疫细胞包括表达所述嵌合抗原受体（CAR）和/或T细胞受体（TCR）的核酸分子。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述嵌合抗原受体包含特异性结合所述肿瘤特异性抗原的抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包括单链抗体。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述抗原结合结构域包括靶向CD70的单链抗体。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述单链抗体为SEQ ID NO: 26-27中任一项所示的氨基酸序列。

8.根据权利要求1所述的方法，其中所述嵌合抗原受体包含跨膜结构域，其中所述跨膜结构域为源自选自下述蛋白的跨膜结构域：CD8、CD28、CD27、CD7、TRAC、TRBC、CD3ζ、CD4、4-1BB、OX40、ICOS、CTLA-4、PD-1、LAG-3、2B4和BTLA。

9.根据权利要求8所述的方法，其中所述嵌合抗原受体包含共刺激结构域，其中所述共刺激结构域为选自下述蛋白的共刺激结构域或其组合：CD137、CD28、OX40、ICOS、DAP10、2B4、CD27、CD30、CD40、CD40L、TIM1、CD226、DR3、SLAM、NKG2D、CD244、FceRIγ、BTLA、GITR、HVEM、CD2、NKG2C、LIGHT和DAP12。

10.根据权利要求1所述的方法，其中所述嵌合抗原受体包含胞内信号转导结构域，其中所述胞内信号转导结构域为源自选自下述蛋白的胞内信号转导结构域或其组合：CD3ζ、CD3δ、CD3γ、FceRIγ、FceRIβ、免疫球蛋白α、免疫球蛋白β、牛白血病病毒gp30、EB病毒LMP2A、猿免疫缺陷病毒PBj14Nef、卡波西肉瘤疱疹病毒、DAP-12和免疫受体酪氨酸激活基序（ITAM）。

11.根据权利要求1所述的方法，其中所述嵌合抗原受体包含铰链区，所述铰链区连接抗原结合结构域和跨膜结构域，且所述铰链区为源自选自下述蛋白的铰链区：CD8、CD28、IgG、4-1BB、CD4、CD27、CD7和PD-1。

12.根据权利要求1所述的方法，其中所述嵌合抗原受体为SEQ ID NO: 21-22中任一项所示的氨基酸序列。

13.根据权利要求4所述的方法，其中所述核酸分子为SEQ ID NO: 4-5中任一项所示的核苷酸序列。

14.根据权利要求1所述的方法，其依次包括以下的步骤：

a)使免疫细胞包括权利要求4所述的核酸分子；

b)向所述免疫细胞施用权利要求1所述的指导RNA。

15.根据权利要求1所述的方法，其还包括以下步骤：下调免疫细胞中T细胞受体α恒定区蛋白和/或T细胞受体ß恒定区蛋白的表达和/或活性。

16.根据权利要求1所述的方法，其还包括以下步骤：下调免疫细胞中MHC复合物的表达和/或活性。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述MHC复合物包括B2M。

18.根据权利要求15所述的方法，其中所述下调包括下调编码所述T细胞受体α恒定区蛋白、T细胞受体ß恒定区蛋白和/或MHC复合物的核酸分子的表达和/或活性；和/或，包括下调所述细胞受体α恒定区蛋白、T细胞受体ß恒定区蛋白和/或MHC复合物的表达和/或活性。

19.根据权利要求15所述的方法，其中所述下调包括向所述免疫细胞施用一种或多种选自下组的物质：反义RNA、siRNA、shRNA、CRISPR/Cas系统、RNA编辑系统ADAR、RNA指导的核酸内切酶、锌指蛋白酶、Mega-TAL核酸酶、TALENs和Meganucleases。

20.根据权利要求15所述的方法，其中所述下调包括向所述免疫细胞施用靶向所述核酸分子外显子部分的指导RNA。

21.根据权利要求15所述的方法，其中靶向编码所述细胞受体α恒定区蛋白的核酸分子的指导RNA包含SEQ ID NO: 28所示的核苷酸序列。

22.根据权利要求17所述的方法，其中靶向编码所述B2M的核酸分子的指导RNA包含SEQID NO.33-36中任一项所示的核苷酸序列。

23.CRISPR/Cas系统，其包括指导RNA和Cas蛋白，其中所述指导RNA包含SEQ ID NO:49-51中任一项所示的核苷酸序列。

24.根据权利要求23所述的系统，其中所述Cas蛋白包括Cas9蛋白。