KR20210005922A - 형질 세포 고갈을 위한 항-bcma car-t-세포 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 제어된 형질 세포 고갈을 위한, 예컨대 형질 세포와 연관된 다양한 질환 및 상태의 치료를 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2018년 4월 27일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/663,974, 및 2018년 11월 29일에 출원된 미국 특허 가출원 번호 62/773,058에 대해 우선권을 주장하며, 이들의 각각의 개시내용은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되었고, 그 전문이 본원에 참조로 포함되는 서열 목록을 함유한다. 2019년 4월 26일에 생성된 ASCII 사본은 052984-515001WO_SL_ST25.txt로 명명되며, 크기가 295,038 바이트이다.
분야
본 개시내용은 개체에서의 제어된 형질 세포 고갈을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 조성물은 T 세포의 생존 및/또는 증식을 제어하는 것을 허용하는 생리학적으로 기능적인 합성 화학적-유도된 신호전달 복합체 (CISC)를 생성하기 위한 일반적 구조를 포함한다. 또한, 예컨대 다양한 질환 및 상태의 치료를 위한 이러한 조성물을 사용하는 방법이 제공된다.
키메라 항원 수용체 (CAR)는 입양 세포성 면역요법에 사용하기 위해 T 세포를 유전적으로 조작하는데 사용되는 조작된 수용체이다 (문헌 [Pule, M. et al. (2003). Cytother., 5(3):211-226]; [Restifo, N. P. et al. (2012). Nat. Rev. Immunol. 12(4):269-281] 참조). 항원 결합은 CAR의 세포내 절편 상의 신호전달 도메인을 자극함으로써, 신호전달 경로를 활성화시킨다. CAR-기반 입양 세포성 면역요법은 통상적인 치료의 표준 치료에 난치성인 종양을 갖는 암 환자를 치료하는데 사용되었다 (문헌 [Grupp, S. A. et al. (2013). N. Engl. J. Med. 368(16):1509-1518]; [Kalos, M. et al. (2011). Sci. Transl. Med. 3(95):95ra73] 참조).
CAR-기반 입양 세포성 면역요법은 또한 질환 또는 상태에 관여하는 숙주 세포를 표적화하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 항체-생산 형질 세포에 대해 특이적인 CAR T 세포는 잠재적으로 유해 항체-매개된 면역 반응을 특징으로 하는 질환 또는 상태, 예컨대 자가면역 또는 기관 이식 거부를 치료하는데 사용될 수 있다. 그러나, 개체에서 형질 세포를 표적화하는 통상적인 CAR T 세포의 투여는 개체에서 형질 세포의 비제어된 고갈을 발생시킬 것이며, 이는 중증 유해 효과, 예컨대 병원성 감염에 반응하는 불능을 발생시킬 수 있다. 유해 항체 생산을 특징으로 하는 질환 및 상태에 대한 실행가능한 치료를 허용하는 형질 세포의 고갈을 제어하는 것을 허용하는 새로운 조성물 및 방법에 대한 필요가 남아 있다.
조작된 T 세포의 제어된 생존 및/또는 증식을 허용하는 화학적-유도된 신호전달 복합체 (CISC)를 포함하는, 형질 세포에 대해 세포독성인 조작된 T 세포, 조작된 T 세포를 제조하고 사용하는 방법, 및 상기 방법에 유용한 조성물이 본원에 기재된다.
한 측면에서, a) 비-기능적 T 세포 수용체 알파 불변 (TRAC) 도메인을 코딩하도록 변형된 내인성 T 세포 수용체 알파 (TRA) 유전자; 및 b) B-세포 성숙 항원 (BCMA)을 인식할 수 있는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 T 세포가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 조작된 T 세포의 생존 및/또는 증식은 조작된 T 세포와 접촉하는 리간드의 양을 조정함으로써 제어될 수 있다.
일부 실시양태에서, BCMA를 인식할 수 있는 CAR은 세포외 BCMA 인식 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포외 BCMA 인식 도메인은 BCMA에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 모이어티이다.
일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 서열식별번호(SEQ ID NO): 55로부터의 중쇄 상보성-결정 영역 (HC-CDR)1, HC-CDR2, HC-CDR3, 경쇄 상보성-결정 영역 (LC-CDR)1, LC-CDR2, 및 LC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 scFv이다.
일부 실시양태에서, CAR 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인을 포함하고/거나, CAR 공동-자극성 도메인은 4-1BB 및/또는 CD28 공동-자극성 도메인을 포함하고/거나, CAR 세포질 신호전달 도메인은 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, b) BCMA를 인식할 수 있는 CAR을 코딩하는 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나, 또는 b) BCMA를 인식할 수 있는 CAR을 코딩하는 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, CISC의 폴리펩티드 구성성분은 i) 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 제1 CISC 구성성분; 및 ii) 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 제2 CISC 구성성분을 포함하며; 여기서 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분은, 발현되는 경우에, 이들이 리간드의 존재 하에서 이량체화하여 신호전달-적격 CISC를 생성하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분의 신호전달 도메인은 IL-2 수용체 서브유닛 감마 (IL2Rγ) 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, IL2Rγ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 50의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, FKBP 도메인은 서열식별번호: 47의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 47의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분의 신호전달 도메인은 IL-2 수용체 서브유닛 베타 (IL2Rβ) 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, IL2Rβ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 51의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 51의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, FRB는 서열식별번호: 48의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 48의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 및 제2 CISC 구성성분의 막횡단 도메인은 독립적으로 IL-2 수용체 막횡단 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 1) 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 1종 이상의 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되고, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 1종 이상의 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나; 또는 2) 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 1종 이상의 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되고, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 1종 이상의 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 리간드는 라파마이신 또는 라파마이신 유사체 (라파로그)이다.
일부 실시양태에서, 라파로그는 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 리간드는 0.05 nM 내지 100 nM의 양으로 존재하거나 또는 제공된다.
일부 실시양태에서, 세포는 d) 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 코딩하는 1종 이상의 핵산을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 수용체 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인을 포함하고/거나, 키메라 수용체 공동-자극성 도메인은 4-1BB 공동-자극성 도메인을 포함하고/거나, 키메라 수용체 세포질 신호전달 도메인은 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 서열식별번호: 65의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 65의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, d) 키메라 수용체를 코딩하는 1종 이상의 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나, 또는 d) 키메라 수용체를 코딩하는 1종 이상의 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 세포는 g) 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 말단절단된 저-친화도 신경 성장 인자 수용체 (tLNGFR) 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, tLNGFR 폴리펩티드는 서열식별번호: 66의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나, 또는 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 세포는 e) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 타크롤리무스 (FK506) 및/또는 시클로스포린 A (CsA)에 대한 저항성을 부여한다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 돌연변이체 칼시뉴린 (CN) 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드는 타크롤리무스 (FK506) 및 시클로스포린 A (CsA)에 대한 저항성을 부여한다.
일부 실시양태에서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드는 CNb30 (서열식별번호: 67)이다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나, 또는 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 세포는 f) 포유동물 라파마이신의 표적 (mTOR) 키나제의 FKBP-라파마이신 결합 (FRB) 도메인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, FRB 도메인 폴리펩티드는 세포내 발현된다.
일부 실시양태에서, FRB 도메인 폴리펩티드는 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산 또는 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, FRB 도메인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나, 또는 FRB 도메인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다.
또 다른 측면에서, TRAC 도메인을 코딩하는 영역 내의 또는 그 부근의 내인성 TRA 유전자에서의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 가이드 RNA (gRNA)가 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, gRNA는 서열식별번호: 1-3 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 1-3 중 어느 하나와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 내인성 IL2RG 유전자 내의 또는 그 부근의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 가이드 RNA (gRNA)가 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
또 다른 측면에서, a) 제1 gRNA가 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 gRNA이고 제2 gRNA가 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 gRNA인 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA; 및 b) RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 (RGEN) 또는 RGEN을 코딩하는 핵산을 포함하는 시스템이 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 시스템은 c) i) B-세포 성숙 항원 (BCMA) 폴리펩티드를 인식할 수 있는 CAR; ii) 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인 또는 그의 부분 또는 그의 기능적 유도체를 포함하는 제1 CISC 구성성분; 및 iii) 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함하는 1종 이상의 공여자 주형을 추가로 포함하며, 여기서 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분은, T 세포에 의해 발현되는 경우에, 이들이 리간드의 존재 하에서 이량체화하여 T 세포의 생존 및/또는 증식을 촉진시킬 수 있는 신호전달 적격 CISC를 생성하도록 구성된다.
일부 실시양태에서, BCMA를 인식할 수 있는 CAR은 세포외 BCMA 인식 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포외 BCMA 인식 도메인은 BCMA에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 모이어티이다.
일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 서열식별번호: 55로부터의 중쇄 상보성-결정 영역 (HC-CDR)1, HC-CDR2, HC-CDR3, 경쇄 상보성-결정 영역 (LC-CDR)1, LC-CDR2, 및 LC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 scFv이다.
일부 실시양태에서, CAR 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인을 포함하고/거나, CAR 공동-자극성 도메인은 4-1BB 및/또는 CD28 공동-자극성 도메인을 포함하고/거나, CAR 세포질 신호전달 도메인은 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분의 신호전달 도메인은 IL-2 수용체 서브유닛 감마 (IL2Rγ) 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, IL2Rγ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 50의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, FKBP 도메인은 서열식별번호: 47의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 47의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분의 신호전달 도메인은 IL-2 수용체 서브유닛 베타 (IL2Rβ) 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, IL2Rβ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 51의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 51의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, FRB는 서열식별번호: 48의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 48의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 및 제2 CISC 구성성분의 막횡단 도메인은 독립적으로 IL-2 수용체 막횡단 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 리간드는 라파마이신 또는 라파로그이다.
일부 실시양태에서, 라파로그는 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, c) 1종 이상의 공여자 주형은 iv) 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체; v) 선택가능한 마커; vi) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 또는 vii) 포유동물 라파마이신의 표적 (mTOR) 키나제의 FKBP-라파마이신 결합 (FRB) 도메인 폴리펩티드 중 1종 이상을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 수용체 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인 폴리펩티드를 포함하고/거나, 키메라 수용체 공동-자극성 도메인은 4-1BB 공동-자극성 도메인을 포함하고/거나, 키메라 수용체 세포질 신호전달 도메인은 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 서열식별번호: 65의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 65의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 말단절단된 저-친화도 신경 성장 인자 수용체 (tLNGFR) 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, tLNGFR 폴리펩티드는 서열식별번호: 66의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 돌연변이체 칼시뉴린 (CN) 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드는 CNb30 (서열식별번호: 67)이다.
일부 실시양태에서, FRB 도메인 폴리펩티드는 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산 또는 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, RGEN은 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로 공지됨), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cpf1 엔도뉴클레아제, 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, RGEN은 Cas9이다.
일부 실시양태에서, RGEN을 코딩하는 핵산은 리보핵산 (RNA) 서열이다.
일부 실시양태에서, RGEN을 코딩하는 RNA 서열은 공유 결합을 통해 제1 gRNA 또는 제2 gRNA에 연결된다.
일부 실시양태에서, 시스템은 1종 이상의 공여자 주형 중 하나를 포함하는 아데노-연관된 바이러스 (AAV) 벡터를 포함한다.
일부 실시양태에서, AAV 벡터는 서열식별번호: 19-46 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 19-46 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 시스템은 제1 gRNA 및 제1 AAV 벡터 및 제2 gRNA 및 제2 AAV 벡터를 포함하며, 여기서 (A) 제1 gRNA는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 28, 31, 34, 및 37 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 28, 31, 34, 및 37 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (B) 제1 gRNA는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 29, 32, 35, 및 38 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 29, 32, 35, 및 38 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (C) 제1 gRNA는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 30, 33, 36, 및 39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 30, 33, 36, 및 39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 시스템은 하기를 포함한다: (A) 제1 gRNA는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (B) 제1 gRNA는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (C) 제1 gRNA는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 시스템은 하기를 포함한다: (A) 제1 gRNA는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 25의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 25의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (B) 제1 gRNA는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 26의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 26의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (C) 제1 gRNA는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 27의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 27의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 시스템은 RGEN 및 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA를 포함하는 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 포함한다.
일부 실시양태에서, RGEN은 각각 1:1 내지 20:1의 gRNA 대 RGEN의 몰비로 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA와 예비복합체화되어 RNP를 형성한다.
또 다른 측면에서, 서열식별번호: 19-46 중 어느 하나의 핵산 서열, 또는 서열식별번호: 19-46 중 어느 하나와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 벡터가 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 벡터는 아데노 연관된 바이러스 (AAV) 벡터이다.
또 다른 측면에서, 세포의 게놈을 편집하는 방법으로서, a) 제1 gRNA가 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 gRNA이고 제2 gRNA가 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 gRNA인 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA; b) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산; 및 c) i) BCMA 폴리펩티드를 인식할 수 있는 CAR; ii) 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인 또는 그의 부분 또는 그의 기능적 유도체를 포함하는 제1 CISC 구성성분; 및 iii) 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함하는 1종 이상의 공여자 주형을 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분은, T 세포에 의해 발현되는 경우에, 이들이 리간드의 존재 하에서 이량체화하여 T 세포의 생존 및/또는 증식을 촉진시킬 수 있는 신호전달 적격 CISC를 생성하도록 구성된 것인 방법이 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, BCMA를 인식할 수 있는 CAR은 세포외 BCMA 인식 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 세포외 BCMA 인식 도메인은 BCMA에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 모이어티이다.
일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 서열식별번호: 55로부터의 중쇄 상보성-결정 영역 (HC-CDR)1, HC-CDR2, HC-CDR3, 경쇄 상보성-결정 영역 (LC-CDR)1, LC-CDR2, 및 LC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함한다.
일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 scFv이다.
일부 실시양태에서, CAR 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인을 포함하고/거나, CAR 공동-자극성 도메인은 4-1BB 및/또는 CD28 공동-자극성 도메인을 포함하고/거나, CAR 세포질 신호전달 도메인은 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분의 신호전달 도메인은 IL-2 수용체 서브유닛 감마 (IL2Rγ) 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, IL2Rγ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 50의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, FKBP 도메인은 서열식별번호: 47의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 47의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분의 신호전달 도메인은 IL-2 수용체 서브유닛 베타 (IL2Rβ) 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, IL2Rβ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 51의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 51의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다.
일부 실시양태에서, FRB 도메인은 서열식별번호: 48의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 48의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 제1 및 제2 CISC 구성성분의 막횡단 도메인은 독립적으로 IL-2 수용체 막횡단 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 라파로그는 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, c) 1종 이상의 공여자 주형은 iv) 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체; v) 선택가능한 마커; vi) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 또는 vii) 포유동물 라파마이신의 표적 (mTOR) 키나제의 FKBP-라파마이신 결합 (FRB) 도메인 폴리펩티드 중 1종 이상을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 수용체 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인 폴리펩티드를 포함하고/거나, 키메라 수용체 공동-자극성 도메인은 4-1BB 공동-자극성 도메인을 포함하고/거나, 키메라 수용체 세포질 신호전달 도메인은 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함한다.
일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 서열식별번호: 65의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 65의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 말단절단된 저-친화도 신경 성장 인자 수용체 (tLNGFR) 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, tLNGFR 폴리펩티드는 서열식별번호: 66의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 돌연변이체 칼시뉴린 (CN) 폴리펩티드이다.
일부 실시양태에서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드는 CNb30 (서열식별번호: 67)이다.
일부 실시양태에서, FRB 도메인 폴리펩티드는 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산 또는 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 변이체를 포함한다.
또 다른 측면에서, 세포의 게놈을 편집하는 방법으로서, 제1 gRNA, 제2 gRNA, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 제1 벡터, 및 제2 벡터를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 (A) 제1 gRNA가 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터가 서열식별번호: 28, 31, 34, 및 37 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 28, 31, 34, 및 37 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 벡터가 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (B) 제1 gRNA가 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터가 서열식별번호: 29, 32, 35, 및 38 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 29, 32, 35, 및 38 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 벡터가 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (C) 제1 gRNA가 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터가 서열식별번호: 30, 33, 36, 및 39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 30, 33, 36, 및 39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 벡터가 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 방법이 본원에서 제공된다.
또 다른 측면에서, 세포의 게놈을 편집하는 방법으로서, 제1 gRNA, 제2 gRNA, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 제1 벡터, 및 제2 벡터를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 (A) 제1 gRNA가 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터가 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (B) 제1 gRNA가 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터가 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (C) 제1 gRNA가 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터가 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 방법이 본원에서 제공된다.
또 다른 측면에서, 세포의 게놈을 편집하는 방법으로서, 제1 gRNA, 제2 gRNA, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 제1 벡터, 및 제2 벡터를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 (A) 제1 gRNA가 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 25의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 25의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터가 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (B) 제1 gRNA가 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 26의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 26의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터가 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (C) 제1 gRNA가 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 27의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 27의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터가 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 방법이 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, RGEN은 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로 공지됨), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cpf1 엔도뉴클레아제, 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, RGEN은 Cas9이다.
일부 실시양태에서, RGEN을 코딩하는 핵산은 리보핵산 (RNA) 서열이다.
일부 실시양태에서, RGEN을 코딩하는 RNA 서열은 공유 결합을 통해 제1 gRNA 또는 제2 gRNA에 연결된다.
일부 실시양태에서, 공여자 주형은 AAV 벡터에 함유된다.
일부 실시양태에서, RGEN은, 세포에의 제공 전에, 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA와 예비복합체화되어 RNP 복합체를 형성한다.
일부 실시양태에서, RGEN은 각각 1:1 내지 20:1의 gRNA 대 RGEN의 몰비로 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA와 예비복합체화된다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 독립적으로 세포의 게놈 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRA 유전자 또는 유전자 조절 요소에, 그 내에, 또는 그 부근에 삽입되고/거나, 제2 공여자 주형은 IL2RG 유전자 또는 유전자 조절 요소에, 그 내에, 또는 그 부근에 삽입된다.
일부 실시양태에서, i) 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되고/거나, ii) 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나; 또는 i) 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되고/거나, ii) 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다.
일부 실시양태에서, 세포는 T 세포이다.
일부 실시양태에서, T 세포는 CD8+ 세포독성 T 림프구 또는 CD3+ pan T 세포이다.
일부 실시양태에서, T 세포는 다중 공여자로부터 유래된 T 세포의 풀의 구성원이다.
일부 실시양태에서, 다중 공여자는 인간 공여자이다.
일부 실시양태에서, 세포는 형질 세포에 대해 세포독성이다.
또 다른 측면에서, 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 방법에 의해 생산된 조작된 세포가 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 형질 세포에 대해 세포독성이다.
또 다른 측면에서, 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 조작된 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에서 제공된다.
또 다른 측면에서, 유해 항체 생산을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 질환 또는 상태를 치료하는 방법으로서, a) T 세포의 게놈을 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 방법에 따라 편집함으로써 조작된 T 세포를 생산하고; b) 조작된 T 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법이 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, T 세포는 대상체에 대해 자가유래이다.
일부 실시양태에서, T 세포는 대상체에 대해 동종이형이다.
일부 실시양태에서, T 세포는 다중 공여자로부터 유래된 T 세포의 풀을 포함한다.
일부 실시양태에서, 다중 공여자는 인간 공여자이다.
또 다른 측면에서, 유해 항체 생산을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 질환 또는 상태를 치료하는 방법으로서, 대상체에서의 T 세포의 게놈을 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 방법에 따라 편집하는 것을 포함하는 방법이 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, T 세포는 CD8+ 세포독성 T 세포 또는 CD3+ pan T 세포를 포함한다.
일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시양태에서, 방법은 라파마이신 또는 라파로그를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에서, 라파로그는 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 라파마이신 또는 라파로그는 0.05 nM 내지 100 nM의 농도로 투여된다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 이식편-대-숙주 질환 (GvHD), 항체-매개된 자가면역, 또는 경쇄 아밀로이드증이다.
일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 GvHD이고, 대상체는 이전에 동종이형 이식을 받았다.
또 다른 측면에서, 사용에 대한 지침서 및 a) 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 조작된 세포 및/또는 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 시스템의 1종 이상의 구성성분; 및/또는 b) 라파마이신 또는 라파로그를 포함하는 키트가 본원에서 제공된다.
일부 실시양태에서, 라파로그는 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또 다른 측면에서, 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 조작된 세포 또는 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 시스템의 1종 이상의 구성성분을 포함하는 조성물을 포함하는 시린지가 본원에서 제공된다.
또 다른 측면에서, 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 조작된 세포 또는 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 시스템의 1종 이상의 구성성분을 포함하는 조성물을 포함하는 카테터가 본원에서 제공된다.
또 다른 측면에서, 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환, 또는 유해 항체 생산을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료에 사용하기 위한 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 조작된 T 세포가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 자가면역 질환은 항체-매개된 자가면역 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 경쇄 아밀로이드증이다.
또 다른 측면에서, 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환, 또는 유해 항체 생산을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료용 의약의 제조에 사용하기 위한 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 조작된 T 세포가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 자가면역 질환은 항체-매개된 자가면역 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 경쇄 아밀로이드증이다.
또 다른 측면에서, 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환, 또는 유해 항체 생산을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료에 사용하기 위한 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 시스템이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 자가면역 질환은 항체-매개된 자가면역 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 경쇄 아밀로이드증이다.
또 다른 측면에서, 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환, 또는 유해 항체 생산을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료용 의약의 제조에 사용하기 위한 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 시스템이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 자가면역 질환은 항체-매개된 자가면역 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 경쇄 아밀로이드증이다.
또 다른 측면에서, 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환, 또는 유해 항체 생산을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료에 사용하기 위한 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 1종 이상의 gRNA, 1종 이상의 공여자 주형, 키트, 시린지, 및/또는 카테터가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 자가면역 질환은 항체-매개된 자가면역 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 경쇄 아밀로이드증이다.
또 다른 측면에서, 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환, 또는 유해 항체 생산을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료용 의약의 제조에 사용하기 위한 상기 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 1종 이상의 gRNA, 1종 이상의 공여자 주형, 키트, 시린지, 및/또는 카테터가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 자가면역 질환은 항체-매개된 자가면역 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 경쇄 아밀로이드증이다.
도 1은 공여자 주형 구축물 (일정한 비율로 제시되지 않음)에 존재하는 요소 및 그들의 상대적 위치를 도시하는, 공여자 주형 구축물 #1-#11에 대한 개략도를 제시한다. 5' HA: 5' 상동성 아암; 3' HA: 3' 상동성 아암; s pA: 합성 폴리A 신호; SV40 pA: SV40 폴리A 신호; pMSCV: 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 프로모터; CD8 sp: CD8 신호 펩티드; CD8 tm: CD8 막횡단 도메인; CD28: CD28 공동-자극성 도메인; 4-1BB: 4-1BB 공동-자극성 도메인; CD3z: CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인; WPRE3: 우드척 간염 바이러스 (WHP: Woodchuck Hepatitis Virus) 전사후 조절 요소 (WPRE: Posttranscriptional Regulatory Element) 3; CISCβ: FRB 도메인 및 IL2Rβ 도메인을 갖는 CISC 서브유닛; tCISCγ: FKBP 도메인 및 IL2Rγ 도메인의 단편을 갖는 CISC 서브유닛; β2M CR: β2-마이크로글로불린 키메라 수용체; FRB: 네이키드 FRB 도메인 폴리펩티드; P2A, T2A: 자기-절단 펩티드; ER: 세포질 세망 신호 서열; CNb30: 돌연변이체 칼시뉴린 폴리펩티드; tLNGFR: 말단절단된 저-친화도 신경 성장 인자 수용체.
조작된 T 세포가 조작된 T 세포의 제어된 생존 및/또는 증식을 허용하는 화학적-유도된 신호전달 복합체 (CISC)를 포함하는 것인 형질 세포에 대해 세포독성인 조작된 T 세포, 예컨대 BCMA-발현 세포에 대한 세포독성을 부여하는 항-BCMA 키메라 항원 수용체 (CAR)를 발현하는 조작된 T 세포, 조작된 T 세포를 제조하고 사용하는 방법, 및 상기 방법에 유용한 조성물이 본원에 기재된다.
본 출원인은 세포 게놈에서의 TRA 유전자 및/또는 IL2RG 유전자 내로의 항-BCMA CAR 및/또는 CISC를 코딩하는 이종 핵산 서열의 표적화된 통합을 위한 일련의 신규한 CRISPR/Cas 시스템을 개발하였으며, 여기서 CISC는 라파마이신 또는 라파마이신 유사체의 결합 시 편집된 세포에서 내인성 TCR 및/또는 IL2RG 발현을 기능적으로 억제하는 이종 핵산 서열의 통합을 이용하여 IL2R-유사 신호전달이 가능하다. TRA 또는 IL2RG를 표적화하는 스페이서 서열을 갖는 가이드 RNA (gRNA)를 온-타겟 및 오프-타겟 절단에 대해 분석하였으며, 이들을 예컨대 세포-기반 요법에서 하류 사용을 위한 후보로 만드는 바람직한 프로파일을 가짐을 밝혀내었다. 1차 인간 CD3+ T 세포는 항-BCMA CAR 및/또는 CISC을 발현하도록 성공적으로 편집되었으며, 편집된 세포는 내인성 TCR 및/또는 IL2RG의 감소된 발현을 나타내었다. 이들 발견은 본원에 기재된 CRISPR/Cas 시스템이 질환, 예를 들어, BCMA-발현 세포와 연관된 질환을 치료하는데 유용함을 지시한다.
정의
달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 언급된 모든 특허, 출원, 공개된 출원 및 다른 간행물은 달리 언급되지 않는다면 그 전문이 명백하게 참조로 포함된다. 본원의 용어에 대한 복수의 정의가 있는 경우에, 달리 언급되지 않는다면 이 섹션에서의 정의가 지배한다.
본원에 사용된 바와 같은 단수 형태는 하나 또는 하나 초과를 의미할 수 있다.
"약"은 본 명세서의 관점에서 읽힐 경우에 그의 분명하고 통상적인 의미를 가지며, 예를 들어, 측정가능한 값을 지칭하는 경우에 사용될 수 있고, 특정된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, ±5%, ±l%, 또는 ±0.1 %의 변이를 포함하는 것으로 의미될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "단백질 서열"은 단백질의 1차 구조인 아미노산의 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "상류"는 폴리뉴클레오티드 상의 위치의 위치 5', 및 폴리펩티드 상의 위치의 N-말단을 향한 위치를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 "하류"는 뉴클레오티드 상의 위치의 위치 3', 및 폴리펩티드 상의 위치의 C-말단을 향한 위치를 지칭한다. 따라서, 용어 "N-말단"은 폴리펩티드 상의 위치의 N-말단을 향한 폴리뉴클레오티드 상의 요소 또는 위치의 위치를 지칭한다.
"핵산" 또는 "핵산 분자"는 폴리뉴클레오티드, 예컨대 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 리보핵산 (RNA), 올리고뉴클레오티드, 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 생성된 단편, 및 라이게이션, 절단, 엔도뉴클레아제 작용, 및 엑소뉴클레아제 작용 중 임의의 것에 의해 생성된 단편을 지칭한다. 핵산 분자는 천연-발생 뉴클레오티드 (예컨대 DNA 및 RNA)인 단량체, 또는 천연-발생 뉴클레오티드의 유사체 (예를 들어, 천연-발생 뉴클레오티드의 거울상이성질체 형태), 또는 둘 다의 조합으로 구성될 수 있다. 변형된 뉴클레오티드는 당 모이어티에 및/또는 피리미딘 또는 퓨린 염기 모이어티에 변경을 가질 수 있다. 당 변형은 예를 들어, 1개 이상의 히드록실 기의 할로겐, 알킬 기, 아민 및 아지도 기로의 대체를 포함하거나, 당은 에테르 또는 에스테르로서 관능화될 수 있다. 더욱이, 전체 당 모이어티는 입체적으로 및 전자적으로 유사한 구조, 예컨대 아자-당 및 카르보시클릭 당 유사체로 대체될 수 있다. 염기 모이어티에서의 변형의 예로는 알킬화된 퓨린 및 피리미딘, 아실화된 퓨린 또는 피리미딘, 또는 다른 널리 공지된 헤테로시클릭 치환기를 들 수 있다. 핵산 단량체는 포스포디에스테르 결합 또는 이러한 연결의 유사체에 의해 연결될 수 있다. 포스포디에스테르 연결의 유사체는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로셀레노에이트, 포스포로디셀레노에이트, 포스포로아닐로티오에이트, 포스포르아닐리데이트, 포스포르아미데이트 등을 포함한다. 용어 "핵산 분자"는 또한 폴리아미드 백본에 부착된 천연-발생 또는 변형된 핵산 염기를 포함하는 소위 "펩티드 핵산"을 포함한다. 핵산은 단일-가닥 또는 이중-가닥일 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 제공된다. 일부 실시양태에서, 핵산은 RNA 또는 DNA이다.
"코딩하는" 또는 "코딩"은 본원에 사용되며, 다른 거대분자, 예컨대 아미노산의 한정된 서열의 합성을 위한 주형으로서 기능하는 폴리뉴클레오티드에서 뉴클레오티드의 특이적 서열, 예컨대 유전자, cDNA, 또는 mRNA의 특성을 지칭한다. 따라서, 유전자는, 그 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 번역이 세포 또는 다른 생물학적 시스템에서 단백질을 생산하는 경우에, 단백질을 코딩한다.
"폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열"은 서로의 축중성 버전이며, 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 모든 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질을 코딩하는 핵산이 제공된다.
"벡터", "발현 벡터", 또는 "구축물"은 세포에서 이종 핵산의 발현을 제공하는 조절 요소를 갖는 세포 내로 이종 핵산을 도입하는데 사용되는 핵산이다. 벡터는 플라스미드, 미니서클, 효모, 및 바이러스 게놈을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 일부 실시양태에서, 벡터는 플라스미드, 미니서클, 효모, 또는 바이러스 게놈이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일부 실시양태에서, 바이러스 벡터는 렌티바이러스이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 아데노-연관된 바이러스 (AAV) 벡터이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 박테리아 시스템, 예컨대 이. 콜라이 (E. coli)에서의 단백질 발현을 위한 것이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "발현", 또는 "단백질 발현"은 전사된 RNA 분자의 단백질 분자로의 번역을 지칭한다. 단백질 발현은 시간적, 공간적, 발달적, 또는 형태학적 질 뿐만 아니라 정량적 또는 정성적 지시를 특징으로 할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 또는 단백질들은 단백질이 리간드의 존재 하에서 이량체화를 위해 위치되도록 발현된다.
본원에 사용된 바와 같은 "융합 단백질" 또는 "키메라 단백질"은 원래 별개의 단백질 또는 단백질의 부분을 코딩하는 2개 이상의 유전자의 연결을 통해 생성된 단백질이다. 융합 단백질은 또한 2개 이상의 별개의 단백질로부터의 특이적 단백질 도메인으로 구성될 수 있다. 이 융합 유전자의 번역은 각각의 원래 단백질로부터 유래된 기능적 특성을 갖는 단일 또는 다중 폴리펩티드를 발생시킬 수 있다. 재조합 융합 단백질은 생물학적 연구 또는 치료에 사용하기 위해 재조합 DNA 기술에 의해 인공적으로 생성될 수 있다. 융합 단백질을 생성하는 이러한 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 일부 융합 단백질은 전체 펩티드를 조합하며, 따라서 원래 단백질의 모든 도메인, 특히 기능적 도메인을 함유할 수 있다. 그러나, 다른 융합 단백질, 특히 비-천연 발생인 것들은 단지 코딩 서열의 부분을 조합하며, 따라서 그들을 형성한 모 유전자의 원래 기능을 유지하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "조절 요소"는 유전자 조절 활성을 갖는 DNA 분자, 예를 들어, 작동적으로 연결된 전사가능한 DNA 분자의 전사 및/또는 번역에 영향을 미치는 능력을 갖는 것을 지칭한다. 조절 요소, 예컨대 프로모터, 리더, 인트론, 및 전사 종결 영역은 유전자 조절 활성을 가지며, 살아 있는 세포에서 유전자의 전체적인 발현에서 필수적인 역할을 하는 DNA 분자이다. 따라서, 식물에서 기능하는 단리된 조절 요소, 예컨대 프로모터는 유전 공학의 방법을 통해 식물 표현형을 변형시키는데 유용하다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "작동적으로 연결된"은 제2 분자에 연결된 제1 분자를 지칭하며, 여기서 분자는 제1 분자가 제2 분자의 기능에 영향을 미치도록 배열된다. 2개의 분자는 단일 인접한 분자의 일부일 수 있으며, 인접할 수 있다. 예를 들어, 프로모터는, 프로모터가 세포에서 관심의 전사가능한 DNA 분자의 전사를 조정하는 경우에, 전사가능한 DNA 분자에 작동적으로 연결된다.
"프로모터"는 특이적 유전자의 전사를 개시하는 DNA의 영역이다. 프로모터는 유전자의 전사 시작 부위 부근에, 동일한 가닥 상에 및 DNA 상의 상류 (센스 가닥의 5'-영역)에 위치할 수 있다. 프로모터는 조건적, 유도성 또는 구성적 프로모터일 수 있다. 프로모터는 박테리아, 포유동물 또는 곤충 세포 단백질 발현에 대해 특이적일 수 있다. 융합 단백질을 코딩하는 핵산이 제공되는 일부 실시양태에서, 핵산은 프로모터 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 박테리아, 포유동물 또는 곤충 세포 단백질 발현에 대해 특이적이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 조건적, 유도성 또는 구성적 프로모터이다. 다른 실시양태에서, 프로모터는 MND 프로모터이다.
본원에 사용된 바와 같은 "이량체성 화학적-유도된 신호전달 복합체", "이량체성 CISC", 또는 "이량체"는 함께 연결되는 융합 단백질 복합체일 수 있거나 그렇지 않을 수 있는 CISC의 2개의 구성성분을 지칭한다. "이량체화"는 2개의 별개의 실체를 단일 실체로 함께 연결하는 프로세스를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 리간드 또는 작용제는 이량체화를 자극한다. 일부 실시양태에서, 이량체화는 동종이량체화, 또는 2개의 동일한 실체, 예컨대 2개의 동일한 CISC 구성성분의 연결을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이량체화는 2개의 상이한 실체, 예컨대 2개의 상이하고 별개의 CISC 구성성분의 연결의 이종이량체화를 지칭한다. 일부 실시양태에서, CISC 구성성분의 이량체화는 세포성 신호전달 경로를 발생시킨다. 일부 실시양태에서, CISC 구성성분의 이량체화는 세포 또는 세포의 집단의 선택적 확장을 허용한다. 추가의 CISC 시스템은 CISC 지베렐린 CISC 이량체화 시스템, 또는 SLF-TMP CISC 이량체화 시스템을 포함할 수 있다. 다른 화학적 유도성 이량체화 (CID) 시스템 및 구성성분 부분은 사용될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "화학적-유도된 신호전달 복합체" 또는 "CISC"는 리간드-유도된 이량체화의 직접적인 결과로서 세포의 내부 내로 신호를 개시하는 조작된 복합체를 지칭한다. CISC는 동종이량체 (2개의 동일한 구성성분의 이량체화) 또는 이종이량체 (2개의 별개의 구성성분의 이량체화)일 수 있다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 용어 "동종이량체"는 동일한 아미노산 서열을 갖는 본원에 기재된 2개의 단백질 구성성분의 이량체를 지칭한다. 용어 "이종이량체"는 비-동일한 아미노산 서열을 갖는 본원에 기재된 2개의 단백질 구성성분의 이량체를 지칭한다.
CISC는 본원에 보다 상세히 기재된 바와 같은 합성 복합체일 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "합성"은 천연이 아니거나, 자연에서 발견되지 않는 본원에 기재된 바와 같은 복합체, 단백질, 이량체, 또는 조성물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, IL2R-CISC는 인터류킨-2 수용체 구성성분을 포함하는 신호전달 복합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, IL2/15-CISC는 인터류킨-2 및 인터류킨-15에 의해 공유된 수용체 신호전달 서브유닛을 포함하는 신호전달 복합체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, IL7-CISC는 인터류킨-7 수용체 구성성분을 포함하는 신호전달 복합체를 지칭한다. 따라서, CISC는 주어진 CISC의 구성성분을 구성하는 구성성분 부분에 따라 용어화될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 화학적-유도된 신호전달 복합체의 구성성분 부분이 CISC 내로의 혼입에 유용한 천연 또는 합성 구성성분으로 구성될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 본원에서 제공된 예는 제한적인 것으로 의도되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 "시토카인 수용체"는 시토카인을 인식하고 그에 결합하는 수용체 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 시토카인 수용체는 시토카인 수용체 아미노산 및/또는 핵산 서열에 대한 치환, 결실, 및/또는 부가를 갖는 것들을 포함하는 변형된 시토카인 수용체 분자 (예를 들어, "변이체 시토카인 수용체")를 포괄한다. 따라서, 상기 용어는 야생형, 뿐만 아니라, 재조합, 합성적으로-생산된, 및 변이체 시토카인 수용체를 포괄하는 것으로 의도된다. 일부 실시양태에서, 시토카인 수용체는 세포외 결합 도메인, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인을 포함하는 융합 단백질이다. 일부 실시양태에서, 수용체의 구성성분 (즉, 수용체의 도메인)은 천연 또는 합성이다. 일부 실시양태에서, 도메인은 인간 유래된 도메인이다.
본원에 사용된 바와 같은 "FKBP"는 FK506 결합 단백질 도메인이다. FKBP는 프롤릴 이소머라제 활성을 갖는 단백질의 패밀리를 지칭하며, 아미노산 서열에서는 아니지만 기능에서 시클로필린과 관련된다. FKBP는 효모부터 인간까지 많은 진핵생물에서 확인되었으며, 프롤린 잔기를 함유하는 단백질에 대한 단백질 폴딩 샤페론으로서 기능한다. 시클로필린과 함께, FKBP는 이뮤노필린 패밀리에 속한다. 용어 FKBP는 예를 들어, FKBP12 뿐만 아니라, 그의 동족체 및 그의 기능적 단백질 단편을 포함하여, 유전자 AIP; AIPL1; FKBP1A; FKBP1B; FKBP2; FKBP3; FKBP5; FKBP6; FKBP7; FKBP8; FKBP9; FKBP9L; FKBP10; FKBP11; FKBP14; FKBP15; FKBP52; 및/또는 LOC541473에 의해 코딩되는 단백질을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "FRB"는 FKBP 라파마이신 결합 도메인이다. FRB 도메인은 FKBP 단백질 및 라파마이신 또는 그의 라파로그와 3부분 복합체를 형성하도록 구성된 폴리펩티드 영역 (단백질 "도메인")이다. FRB 도메인은 인간 및 다른 종으로부터의 mTOR 단백질 (또한 문헌에서 FRAP, RAPT 1, 또는 RAFT로 지칭됨); Tor1 및/또는 Tor2를 포함하는 효모 단백질; 및 칸디다 (Candida) FRAP 동족체를 포함하는 다수의 천연 발생 단백질에 존재한다. FKBP 및 FRB 둘 다는 포유동물 라파마이신의 표적 (mTOR) 신호전달에서의 주요한 구성요소이다.
"네이키드 FKBP 라파마이신 결합 도메인 폴리펩티드" 또는 "네이키드 FRB 도메인 폴리펩티드" (이는 또한 "FKBP 라파마이신 결합 도메인 폴리펩티드" 또는 "FRB 도메인 폴리펩티드"로 지칭될 수 있음)는 단백질의 아미노산의 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%가 FRB 도메인의 아미노산인 FRB 도메인 또는 단백질의 아미노산만을 포함하는 폴리펩티드를 지칭한다. FRB 도메인은 12 kDa 가용성 단백질로서 발현될 수 있다 (Chen, J. et al. (1995). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 92(11):4947-4951). FRB 도메인은 구상 단백질에서의 통상적인 구조적 모티프인 4개의 나선 번들을 형성한다. 그의 전체적인 치수는 30 Å x 45 Å x 30 Å이며, 모든 4개의 나선은 시토크롬 b562 폴드와 유사한 짧은 언더핸드 연결을 갖는다 (Choi, J. et al. (1996). Science, 273(5272):239-242). 일부 실시양태에서, 네이키드 FRB 도메인은 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 접근법에 사용되는 면역조정성 이미드 약물은 탈리도미드를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 탈리도미드는 이뮤노프린 (Immunoprin), 탈로미드 (Thalomid), 탈리덱스 (Talidex), 탈리저 (Talizer), 뉴로세딘 (Neurosedyn), α-(N-프탈이미도)글루타르이미드, 2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)-2,3-디히드로-1H-이소인돌-1,3-디온); 포말리도미드를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 포말리도미드는 포말리스트 (Pomalyst), 임노비드 (Imnovid), (RS)-4-아미노-2-(2,6-디옥소피페리딘-3-일)이소인돌-1,3-디온); 레날리도미드를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 레날리도미드는 레브리미드 (Revlimid), (RS)-3-(4-아미노-1-옥소-1,3-디히드로-2H-이소인돌-2-일)피페리딘-2,6-디온); 또는 아프레밀라스트를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 아프레밀라스트는 오테즐라 (Otezla), CC-10004, N-{2-[(1S)-1-(3-에톡시-4-메톡시페닐)-2-(메틸술포닐)에틸]-1,3-디옥소-2,3-디히드로-1H-이소인돌-4-일}아세트아미드); 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포외 결합 도메인"은 세포의 외부이며, 특이적 원자 또는 분자에 결합하도록 구성된 복합체의 도메인을 지칭한다. 일부 실시양태에서, CISC의 세포외 결합 도메인은 FKBP 도메인 또는 그의 부분이다. 일부 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 FRB 도메인 또는 그의 부분이다. 일부 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 리간드 또는 작용제에 결합함으로써, 2개의 CISC 구성성분의 이량체화를 자극하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 시토카인 수용체 조정제에 결합하도록 구성된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "시토카인 수용체 조정제"는 시토카인 수용체의 하류 표적의 인산화, 시토카인 수용체와 연관된 신호 전달 경로의 활성화, 및/또는 특정 단백질, 예컨대 시토카인의 발현을 조정하는 작용제를 지칭한다. 이러한 작용제는 시토카인 수용체의 하류 표적의 인산화, 시토카인 수용체와 연관된 신호 전달 경로의 활성화, 및/또는 특정 단백질, 예컨대 시토카인의 발현을 직접적으로 또는 간접적으로 조정할 수 있다. 따라서, 시토카인 수용체 조정제의 예로는 시토카인 수용체 또는 그의 단편에 면역특이적으로 결합하는 시토카인, 시토카인의 단편, 융합 단백질 및/또는 항체 또는 그의 결합 부분을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 시토카인 수용체 조정제의 예로는 시토카인 또는 그의 단편에 면역특이적으로 결합하는 펩티드, 폴리펩티드 (예를 들어, 가용성 시토카인 수용체), 융합 단백질 및/또는 항체 또는 그의 결합 부분을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "활성화시키다"는 관심의 단백질의 적어도 1종의 생물학적 활성의 증가를 지칭한다. 유사하게, 용어 "활성화"는 증가된 활성의 상태인 관심의 단백질의 상태를 지칭한다. 용어 "활성화가능한"은 신호, 작용제, 리간드, 화합물, 또는 자극의 존재 하에서 활성화되는 관심의 단백질의 능력을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 이량체는 신호, 작용제, 리간드, 화합물, 또는 자극의 존재 하에서 활성화되며, 신호전달 적격 이량체가 된다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "신호전달 적격"은 하류 신호전달 경로를 개시하거나 지속할 수 있도록 하는 이량체의 능력 또는 구성을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "힌지 도메인"은 세포외 결합 도메인을 막횡단 도메인에 연결하며, 세포외 결합 도메인에 유연성을 부여할 수 있는 도메인을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 세포외 도메인을 형질막에 가깝게 위치시켜 항체 또는 그의 결합 단편에 의한 인식을 위한 잠재성을 최소화한다. 일부 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 힌지 도메인에 대해 N-말단에 위치한다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인은 천연 또는 합성일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "막횡단 도메인" 또는 "TM 도메인"은 막에서, 예컨대 세포막에서 안정한 도메인을 지칭한다. 용어 "막횡단 스팬", "통합 단백질", 및 "통합 도메인"은 또한 본원에 사용된다. 일부 실시양태에서, 힌지 도메인 및 세포외 도메인은 막횡단 도메인에 대해 N-말단에 위치한다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 천연 또는 합성 도메인이다. 일부 실시양태에서, 막횡단 도메인은 IL-2 수용체 막횡단 도메인이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "신호전달 도메인"은 세포, 예컨대 포유동물 세포 내부의 신호전달 캐스케이드에 관여하는 융합 단백질 또는 CISC 구성성분의 도메인을 지칭한다. 신호전달 도메인은 예를 들어 TCR/CD3 복합체의 CD3 제타 쇄에 의해 제공되는 1차 신호 외에도, 활성화, 증식, 분화, 및/또는 시토카인 분비를 포함하나 이에 제한되지는 않는 세포성 반응, 예컨대 T-세포 반응을 매개하는 신호를 세포, 예컨대 T-세포에 제공하는 신호전달 모이어티를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 신호전달 도메인은 막횡단 도메인, 힌지 도메인, 및 세포외 도메인에 대해 N-말단이다. 일부 실시양태에서, 신호전달 도메인은 합성 또는 천연 도메인이다. 일부 실시양태에서, 신호전달 도메인은 연쇄된 세포질 신호전달 도메인이다. 일부 실시양태에서, 신호전달 도메인은 시토카인 신호전달 도메인이다. 일부 실시양태에서, 신호전달 도메인은 항원 신호전달 도메인이다. 일부 실시양태에서, 신호전달 도메인은 인터류킨-2 수용체 서브유닛 감마 (IL2Rγ 또는 IL2RG) 도메인이다. 일부 실시양태에서, 신호전달 도메인은 인터류킨-2 수용체 서브유닛 베타 (IL2Rβ 또는 IL2RB) 도메인이다. 일부 실시양태에서, 세포외 결합 도메인에의 작용제 또는 리간드의 결합은 CISC 구성성분의 이량체화의 결과로서 신호전달 경로의 활성화에 의해 신호전달 도메인을 통한 신호 전달을 유발한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "신호 전달"은 세포외 도메인에 결합하는 리간드 또는 작용제에 의한 신호전달 경로의 활성화를 지칭한다. 신호의 활성화는 CISC 이량체화를 발생시키는, 리간드 또는 작용제에의 세포외 도메인의 결합의 결과이다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "IL2RB" 또는 "IL2Rβ"는 인터류킨-2 수용체 서브유닛 베타를 지칭한다. 유사하게, 용어 "IL2RG" 또는 IL2Rγ"는 인터류킨-2 수용체 서브유닛 감마를 지칭하고, 용어 "IL2RA" 또는 "IL2Rα"는 인터류킨-2 수용체 서브유닛 알파를 지칭한다. IL-2 수용체는 3가지 형태, 또는 쇄, 즉, 알파, 베타, 및 감마를 가지며, 이는 또한 다른 시토카인에 대한 수용체에 대한 서브유닛이다. IL2Rβ 및 IL2Rγ는 유형 I 시토카인 수용체 패밀리의 구성원이다. 본원에 사용된 바와 같은 "IL2R"은 T 세포-매개된 면역 반응에 관여하는 인터류킨-2 수용체를 지칭한다. IL2R은 수용체-매개된 세포내이입 및 인터류킨 2로부터의 분열촉진성 신호의 전달에 관여한다. 유사하게, 용어 "IL-2/15R"은 IL-2 및 IL-15에 의해 공유된 수용체 신호전달 서브유닛을 지칭하며, 서브유닛 알파 (IL2/15Ra 또는 IL2/15Rα), 베타 (IL2/15Rb 또는 IL2/15Rβ, 또는 감마 (IL2/15Rg 또는 IL2/15Rγ)를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 화학적-유도된 신호전달 복합체는 2개의 구성성분을 포함하는 이종이량체화 활성화된 신호전달 복합체이다. 일부 실시양태에서, 제1 구성성분은 이종이량체화 쌍의 한 부분인 세포외 결합 도메인, 임의적 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 1개 이상의 연쇄된 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 구성성분은 이종이량체화 쌍의 다른 부분인 세포외 결합 도메인, 임의적 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 1개 이상의 연쇄된 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 2가지 별개의 변형 사건이 있다. 일부 실시양태에서, 2개의 CISC 구성성분은 세포, 예컨대 포유동물 세포에서 발현된다. 일부 실시양태에서, 세포, 예컨대 포유동물 세포, 또는 세포의 집단, 예컨대 포유동물 세포의 집단은 이종이량체화를 유발하는 리간드 또는 작용제와 접촉됨으로써 신호를 개시한다. 일부 실시양태에서, 동종이량체화 쌍은 이량체화하며, 그에 의해 단일 CISC 구성성분은 세포, 예컨대 포유동물 세포에서 발현되고, CISC 구성성분은 동종이량체화하여 신호를 개시한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "리간드" 또는 "작용제"는 바람직한 생물학적 효과를 갖는 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 세포외 결합 도메인에 의해 인식되고, 그에 의해 결합되어, 리간드 및 2개의 결합 CISC 구성성분을 포함하는 3부분 복합체를 형성한다. 리간드는 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, 번역후 변형된 단백질, 항체, 그의 결합 부분을 포함하나 이에 제한되지는 않는 단백질성 분자; 소분자 (1000 달톤 미만), 무기 또는 유기 화합물; 및 이중-가닥 또는 단일-가닥 DNA, 또는 이중-가닥 또는 단일-가닥 RNA (예를 들어, 안티센스, RNAi 등), 압타머, 뿐만 아니라, 3중 나선 핵산 분자를 포함하나 이에 제한되지는 않는 핵산 분자를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 리간드는 임의의 공지된 유기체 (동물 (예를 들어, 포유동물 (인간 및 비-인간 포유동물)), 식물, 박테리아, 진균, 및 원생생물, 또는 바이러스를 포함하나 이에 제한되지는 않음)로부터 또는 합성 분자의 라이브러리로부터 유래되거나 얻어질 수 있다. 일부 실시양태에서, 리간드는 단백질, 항체 또는 그의 부분, 소분자, 또는 약물이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 라파마이신 또는 라파마이신 유사체 (라파로그)이다. 일부 실시양태에서, 라파로그는 라파마이신에 비해 하기 변형 중 1종 이상을 갖는 라파마이신의 변이체를 포함한다: C7, C42 및/또는 C29에서의 탈메틸화, 메톡시의 제거 또는 대체; C13, C43 및/또는 C28에서의 히드록시의 제거, 유도체화 또는 대체; C14, C24 및/또는 C30에서의 케톤의 환원, 제거 또는 유도체화; 6-원 피페콜레이트 고리의 5-원 프롤릴 고리로의 대체; 및 시클로헥실 고리 상의 대안적 치환 또는 시클로헥실 고리의 치환된 시클로펜틸 고리로의 대체. 따라서, 일부 실시양태에서, 라파로그는 에베롤리무스, 메릴리무스, 노볼리무스, 피메크롤리무스, 리다포롤리무스, 타크롤리무스, 템시롤리무스, 우미롤리무스, 조타롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP23573, 또는 AP1903, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합이다. 일부 실시양태에서, 리간드는 IMID-부류 약물 (예를 들어 탈리도미드, 포말리도미드, 레날리도미드 또는 관련된 유사체)이다.
따라서, 일부 실시양태에서, 신호전달 복합체의 화학적 유도를 위해 본원에 기재된 접근법에 사용되는 리간드 또는 작용제는 라파마이신을 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 라파마이신은 시롤리무스 (Sirolimus), 라파뮨 (Rapamune), (3S,6R,7E,9R,10R,12R,14S,15E,17E,19E,21S,23S,26R,27R,34aS)-9,10,12,13,14,21,22,23,24,25,26,27,32,33,34,34a-헥사데카히드로-9,27-디히드록시-3-[(1R)-2-[(1S,3R,4R)-4-히드록시-3-메톡시시클로헥실]-1-메틸에틸]-10,21-디메톡시-6,8,12,14,20,26-헥사메틸-23,27-에폭시-3H-피리도[2,1-c][1,4] 옥사아자시클로헨트리아콘틴-1,5,11,28,29 (4H,6H,31H)-펜톤); 에베롤리무스를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 에베롤리무스는 RAD001, 조르트레스 (Zortress), 세르티칸 (Certican), 아피니토르 (Afinitor), 보투비아 (Votubia), 42-O-(2-히드록시에틸)라파마이신, (1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-1,18-디히드록시-12-[(2R)-1-[(1S,3R,4R)-4-(2-히드록시에톡시)-3-메톡시시클로헥실]프로판-2-일]-19,30-디메톡시-15,17,21,23,29,35-헥사메틸-11,36-디옥사-4-아자트리시클로[30.3.1.04,9]헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-2,3,10,14,20-펜톤); 메릴리무스를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 메릴리무스는 SAR943, 42-O-(테트라히드로푸란-3-일)라파마이신 (메릴리무스-1); 42-O-(옥세탄-3-일)라파마이신 (메릴리무스-2), 42-O-(테트라히드로피란-3-일)라파마이신 (메릴리무스-3), 42-O-(4-메틸, 테트라히드로푸란-3-일)라파마이신, 42-O-(2,5,5-트리메틸, 테트라히드로푸란-3-일) 라파마이신, 42-O-(2,5-디에틸-2-메틸, 테트라히드로푸란-3-일)라파마이신, 42-O-(2H-피란-3-일, 테트라히드로-6-메톡시-2-메틸)라파마이신, 또는 42-O-(2H-피란-3-일, 테트라히드로-2,2-디메틸-6-페닐)라파마이신); 노볼리무스를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 노볼리무스는 16-O-데메틸 라파마이신); 피메크롤리무스를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 피메크롤리무스는 엘리델 (Elidel), (3S,4R,5S,8R,9E,12S,14S,15R,16S,18R,19R,26aS)-3-((E)-2-((1R,3R,4S)-4-클로로-3 메톡시시클로헥실)-1-메틸비닐)-8-에틸 5,6,8,11,12,13,14,15,16,17,18,19,24,26,26a헥사데카히드로-5,19-에폭시-3H-피리도(2,1-c)(1,4)옥사아자시클로트리코신-1,17,20,21(4H,23H)-테트론 33-에피-클로로-33-데스옥시아스코미신); 리다포롤리무스를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 리다포롤리무스는 AP23573, MK-8669, 데포롤리무스, (1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28E,30S,32S,35R)-12-((1R)-2-((1S,3R,4R)-4-((디메틸포스피노일)옥시)-3-메톡시시클로헥실)-1-메틸에틸)-1,18-디히드록시-19,30-디메톡시15,17,21,23,29,35-헥사메틸-11,36-디옥사-4-아자트리시클로(30.3.1.04,9)헥사트리아콘타-16,24,26,28-테트라엔-2,3,10,14,20-펜톤); 타크롤리무스를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 타크롤리무스는 FK-506, 푸지마이신, 프로그라프 (Prograf), 아드바그라프 (Advagraf), 프로토픽, 3S-[3R*[E(1S*,3S*,4S*)],4S*,5R*,8S*,9E,12R*,14R*,15S*,16R*,18S*,19S*,26aR*5,6,8,11,12,13,14,15,16,17,18,19,24,25,26,26a-헥사데카히드로-5,19-디히드록시-3-[2-(4-히드록시-3-메톡시시클로헥실)-1-메틸에테닐]-14,16-디메톡시-4,10,12,18-테트라메틸-8-(2-프로페닐)-15,19-에폭시-3H-피리도[2,1-c] [1,4] 옥사아자시클로트리코신-1,7,20,21(4H,23H)-테트론, 모노히드레이트); 템시롤리무스를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 템시롤리무스는 CCI-779, CCL-779, 토리셀 (Torisel), (1R,2R,4S)-4-{(2R)-2-[(3S,6R,7E,9R,10R,12R,14S,15E,17E,19E,21S,23S,26R,27R,34aS)-9,27-디히드록시-10,21-디메톡시-6,8,12,14,20,26-헥사메틸-1,5,11,28,29-펜타옥소-1,4,5,6,9,10,11,12,13,14,21,22,23,24,25,26,27,28,29,31,32,33,34,34a-테트라코사히드로-3H-23,27-에폭시피리도[2,1-c][1,4]옥사자시클로헨트리아콘틴-3-일]프로필}-2-메톡시시클로헥실 3-히드록시-2-(히드록시메틸)-2-메틸프로파노에이트); 우미롤리무스를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 우미롤리무스는 비올리무스 (Biolimus), 비올리무스 A9, BA9, TRM-986, 42-O-(2-에톡시에틸)라파마이신); 조타롤리무스를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 조타롤리무스는 ABT-578, (42S)-42-데옥시-42-(1H-테트라졸-1-일)-라파마이신); C20-메탈릴라파마이신을 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). C20-메탈릴라파마이신은 C20-마라프); C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신을 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신은 C16-iRap); AP21967을 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). AP21967은 C-16-(S)-7-메틸인돌라파마이신); 나트륨 미코페놀산을 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 나트륨 미코페놀산은 셀셉트 (CellCept), 미포르틱 (Myfortic), (4E)-6-(4-히드록시-6-메톡시-7-메틸-3-옥소-1,3-디히드로-2-벤조푸란-5-일)-4-메틸헥스-4-엔산); 베니디핀 히드로클로라이드를 포함할 수 있다 (유사체, 유도체를 포함하고, 그의 제약상 허용되는 염을 포함함). 베니디핀 히드로클로라이드는 베니디피눔 (Benidipinum), 코니엘 (Coniel)); 또는 AP1903을 포함할 수 있다 (유사체, 유도체, 및 그의 제약상 허용되는 염을 포함함. AP1903은 리미두시드 (Rimiducid), [(1R)-3-(3,4-디메톡시페닐)-1-[3-[2-[2-[[2-[3-[(1R)-3-(3,4-디메톡시페닐)-1-[(2S)-1-[(2S)-2-(3,4,5-트리메톡시페닐)부타노일]피페리딘-2-카르보닐]옥시프로필]페녹시]아세틸]아미노]에틸아미노]-2-옥소에톡시]페닐]프로필] (2S)-1-[(2S)-2-(3,4,5-트리메톡시페닐)부타노일]피페리딘-2-카르복실레이트); 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "지베렐린"은 플라스티드에서 테르페노이드 경로에 의해 합성된 후, 그들이 그들의 생물학적-활성 형태에 도달할 때까지 세포질 세망 및 시토졸에서 변형되는 디테르페노이드 산의 합성 또는 천연 발생 형태를 지칭한다. 지베렐린은 지베렐린 1 (GA1), GA2, GA3 . . . GA136, 및 그의 유사체 및 유도체를 비롯한, 예를 들어, 엔트-지베렐란 골격으로부터 유래되거나, 또는 엔트-카우렌을 통해 합성된 지베렐린을 비롯한 천연 지베렐린 또는 그의 유사체일 수 있다. 일부 실시양태에서, 지베렐린 또는 그의 유사체 또는 유도체는 CISC 이량체화에 이용된다.
본원에 사용된 바와 같은 "SLF-TMP" 또는 "트리메토프림에 연결된 FKBP의 합성 리간드"는 CISC 이량체화를 위한 이량체화제를 지칭한다. 일부 실시양태에서, SLF 모이어티는 제1 CISC 구성성분에 결합하고, TMP 모이어티는 제2 CISC 구성성분에 결합하여 CISC 이량체화를 유발한다. 일부 실시양태에서, SLF는 예를 들어, FKBP에 결합할 수 있고, TMP는 이. 콜라이 디히드로폴레이트 리덕타제 (eDHFR)에 결합할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "동시 결합"은 CISC 구성성분 및 리간드 구성성분을 포함하는 다구성성분 복합체를 형성하고, 후속 신호 활성화를 발생시키는, 동시에 또는, 일부의 경우에, 실질적으로 동시에 2개 이상의 CISC 구성성분에 의한 리간드의 결합을 지칭한다. 동시 결합은 CISC 구성성분이 단일 리간드에 공간적으로 결합하도록 구성되고, 또한 둘 다의 CISC 구성성분이 동일한 리간드 상의 상이한 모이어티에를 비롯한 동일한 리간드에 결합하도록 구성되는 것을 요구한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "선택적 확장"은 확장되는 바람직한 세포, 예컨대 포유동물 세포, 또는 바람직한 세포의 집단, 예컨대 포유동물 세포의 집단의 능력을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 선택적 확장은 2가지 유전적 변형 사건을 겪은 세포, 예컨대 포유동물 세포의 순수한 집단의 생성 또는 확장을 지칭한다. 이량체화 CISC의 한 구성성분은 하나의 변형의 일부이고, 다른 구성성분은 다른 변형이다. 따라서, 이종이량체화 CISC의 한 구성성분은 각각의 유전적 변형과 연관된다. 리간드에의 세포의 노출은 단지 둘 다의 바람직한 변형을 갖는 세포, 예컨대 포유동물 세포의 선택적 확장을 허용한다. 따라서, 일부 실시양태에서, 단지 리간드와 접촉하는 반응을 할 수 있을 세포, 예컨대 포유동물 세포는 이종이량체화 CISC의 둘 다의 구성성분을 발현하는 것들이다.
본원에 사용된 바와 같은 "숙주 세포"는 핵산 구축물 또는 벡터로의 형질전환, 형질감염, 또는 형질도입에 감수성인 임의의 세포 유형, 예컨대 포유동물 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포, 예컨대 포유동물 세포는 T 세포 또는 T 조절성 세포 (Treg)이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포, 예컨대 포유동물 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 CD3+, CD8+, 또는 CD4+ 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포, 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 실시양태에서, 숙주 세포는 나이브 CD4+ T 세포, 중심 기억 CD4+ T 세포, 이펙터 기억 CD4+ T 세포, 및 벌크 CD4+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 CD4+ T 헬퍼 림프구 세포이다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "세포의 집단"은 1개 초과의 세포를 포함하는 세포, 예컨대 포유동물 세포의 군을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 세포, 예컨대 포유동물 세포가 제조되며, 여기서 세포는 본원에 기재된 바와 같은 단백질 서열 또는 본원에 기재된 바와 같은 단백질 서열을 코딩하는 발현 벡터를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "형질전환된" 또는 "형질감염된"은 외래 폴리뉴클레오티드 분자, 예컨대 구축물이 도입된 세포, 예컨대 포유동물 세포, 조직, 기관, 또는 유기체를 지칭한다. 도입된 폴리뉴클레오티드 분자는 도입된 폴리뉴클레오티드 분자가 후속 자손에 의해 유전되도록 수용자 세포, 예컨대 포유동물 세포, 조직, 기관, 또는 유기체의 게놈 DNA 내로 통합될 수 있다. "트랜스제닉" 또는 "형질감염된" 세포, 예컨대 포유동물 세포, 또는 유기체는 또한 세포 또는 유기체의 자손 및 교배에서 이러한 트랜스제닉 유기체를 모체로서 채용하는 육종 프로그램으로부터 생산되고, 외래 폴리뉴클레오티드 분자의 존재로부터 발생되는 변경된 표현형을 나타내는 자손을 포함한다. 용어 "트랜스제닉"은 1개 이상의 이종 폴리핵산 분자를 함유하는 박테리아, 진균, 또는 식물을 지칭한다. "형질도입"은 세포, 예컨대 포유동물 세포 내로의 바이러스-매개된 유전자 전달을 지칭한다.
용어 "조작된 세포"는 세포가 "직접적으로" 조작되었는지 (예를 들어, 세포가 원래 또는 야생형 상태로부터 물리적으로 변경됨), 또는 그렇게 변형된 세포로부터 전해졌는지 여부와 무관하게, 본 발명의 구축물(들)을 포함하는 세포를 지칭한다. 따라서, "조작된 세포"는 직접적으로 변형된 세포 및 그들의 자손을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "대상체"는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 동물을 지칭한다. "동물"은 냉혈 및 온혈 척추동물 및 무척추동물, 예컨대 어류, 패류, 파충류, 및 특히, 포유동물을 포함한다. "포유동물"은 제한 없이, 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 개, 고양이, 양, 염소, 소, 말, 영장류, 예컨대 원숭이, 침팬지, 및 유인원, 및 특히, 인간을 포함한다. 일부 대안에서, 대상체는 인간이다.
일부 실시양태에서, 이량체화를 유도하는데 사용되는 리간드의 유효량은 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 nM 또는 상기 언급된 값 중 임의의 2개에 의해 한정되는 범위 내의 농도의 양이다.
본원에 기재된 바와 같은 "마커 서열"은 단백질 또는 관심의 단백질을 갖는 세포, 예컨대 포유동물 세포를 선택하거나 추적하는데 사용되는 단백질을 코딩한다. 본원에 기재된 실시양태에서, 제공된 융합 단백질은 실험, 예컨대 유동 세포계측법에서 선택될 수 있는 마커 서열을 포함할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "키메라 수용체" 또는 "키메라 항원 수용체"는 질환 또는 장애와 연관된 분자에 결합하며, 스페이서 도메인을 통해 T-세포 또는 다른 수용체의 1개 이상의 세포내 신호전달 도메인, 예컨대 공동자극성 도메인에 연결된 항체의 리간드 결합 도메인 또는 다른 단백질 서열을 포함하는 합성적으로 디자인된 수용체를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 세포, 예컨대 포유동물 세포가 제조되며, 여기서 세포는 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하고, 세포는 키메라 항원 수용체를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "세포독성 T 림프구" (CTL)는 그의 표면 상에 CD8을 발현하는 T 림프구 (예를 들어, CD8+ T-세포)를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 이러한 세포는 항원-경험된 "기억" T-세포 (TM 세포)이다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질 분비를 위한 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포는 세포독성 T 림프구이다. 본원에 사용된 바와 같은 "중심 기억" T-세포 (또는 "TCM")는 그의 표면 상에 CD62L, CCR-7 및/또는 CD45RO를 발현하고, 나이브 세포에 비해 CD45RA를 발현하지 않거나 그의 감소된 발현을 갖는 항원 경험된 CTL을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질 분비를 위한 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포는 중심 기억 T-세포 (TCM)이다. 일부 실시양태에서, 중심 기억 세포는 CD62L, CCR7, CD28, CD127, CD45RO, 및/또는 CD95의 발현에 대해 양성이며, 나이브 세포에 비해 CD54RA의 감소된 발현을 가질 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "이펙터 기억" T-세포 (또는 "TEM")는 중심 기억 세포에 비해 그의 표면 상에 CD62L을 발현하지 않거나 그의 감소된 발현을 갖고, 나이브 세포에 비해 CD45RA를 발현하지 않거나 그의 감소된 발현을 갖는 항원 경험된 T-세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질 분비를 위한 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포는 이펙터 기억 T-세포이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 기억 세포는 나이브 세포 또는 중심 기억 세포에 비해 CD62L 및/또는 CCR7의 발현에 대해 음성이며, CD28 및/또는 CD45RA의 가변적 발현을 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "나이브 T-세포"는 중심 또는 이펙터 기억 세포에 비해, CD62L 및/또는 CD45RA를 발현하고, CD45RO-를 발현하지 않는 비-항원 경험된 T 림프구를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질 분비를 위한 세포, 예컨대 포유동물 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포, 예컨대 포유동물 세포는 나이브 T-세포이다. 일부 실시양태에서, 나이브 CD8+ T 림프구는 CD62L, CCR7, CD28, CD127, 및/또는 CD45RA를 포함하는 나이브 T-세포의 표현형적 마커의 발현을 특징으로 한다.
본원에 사용된 바와 같은 "이펙터" T-세포는 중심 기억 또는 나이브 T-세포에 비해, CD62L, CCR7, 및/또는 CD28을 발현하지 않거나 그의 감소된 발현을 갖고, 그란자임 B 및/또는 퍼포린에 대해 양성인 항원 경험된 세포독성 T 림프구 세포를 지칭한다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질 분비를 위한 세포, 예컨대 포유동물 세포가 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포, 예컨대 포유동물 세포는 이펙터 T-세포이다. 일부 실시양태에서, 세포, 예컨대 포유동물 세포는 중심 기억 또는 나이브 T-세포에 비해, CD62L, CCR7, 및/또는 CD28을 발현하지 않거나 그의 감소된 발현을 갖고, 그란자임 B 및/또는 퍼포린에 대해 양성이다.
본원에 사용된 바와 같은 "에피토프"는 항체, T-세포, 및/또는 B-세포를 포함하는 면역계에 의해 인식되는 항원 또는 분자의 일부를 지칭한다. 에피토프는 통상적으로 적어도 7개의 아미노산을 가지며, 선형 또는 입체형태적 에피토프일 수 있다. 일부 실시양태에서, 융합 단백질을 발현하는 세포, 예컨대 포유동물 세포가 제공되며, 여기서 세포는 키메라 항원 수용체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 항원 수용체는 암 세포 상의 에피토프를 인식할 수 있는 scFv를 포함한다. 본원에 개시된 다양한 폴리펩티드 또는 핵산을 기재하는데 사용되는 경우에 "단리하는", 또는 "정제하는"은 그의 천연 환경의 구성성분으로부터 확인되고 분리되고/거나 회수된 폴리펩티드 또는 핵산을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 단리된 폴리펩티드 또는 핵산은 그것이 천연적으로 회합되는 모든 구성성분과의 회합이 없다. 그의 천연 환경의 오염물 구성성분은 전형적으로 폴리펩티드 또는 핵산을 위한 진단 또는 치료 용도를 방해할 물질이며, 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 실시양태 중 어느 하나의 핵산 또는 본원에 기재된 실시양태 중 어느 하나의 발현 벡터를 박테리아 세포, 포유동물 세포 또는 곤충 세포에 전달하고, 세포를 배양물에서 성장시키고, 융합 단백질의 발현을 유도하고, 치료를 위한 융합 단백질을 정제하는 것을 포함하는 방법이 제공된다.
본원에서 확인된 CISC 서열에 관하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 서열을 정렬하고, 필요에 따라 갭을 도입하여 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성한 후, 및 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않고, 세포외 결합 도메인, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및/또는 신호전달 도메인의 각각에 대한 참조 서열에서의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율로서 정의된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 관련 기술분야의 기술 내인 다양한 방식으로, 예를 들어, 공개적으로 이용가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 또는 멕얼라인 (Megalign) (DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 비교되고 있는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는데 필요한 임의의 일고리듬을 포함하는, 정렬을 측정하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 예를 들어, WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 (Altschul, S. F. et al. (1996). Methods in Enzymol., 266:460-480)을 사용하여 생성된 % 아미노산 서열 동일성 값은 몇몇 검색 파라미터를 사용하며, 이들의 대부분은 디폴트 값으로 설정된다. 디폴트 값으로 설정되지 않은 것들 (예를 들어, 조정가능한 파라미터)은 하기 값으로 설정된다: 중첩 간격=1, 중첩 분율=0.125, 워드 역치 (T) =11 및 점수화 행렬=BLOSUM62. CISC의 일부 실시양태에서, CISC는 세포외 결합 도메인, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인을 포함하며, 여기서 각각의 도메인은 천연, 합성, 또는 천연 도메인의 돌연변이되거나 말단절단된 형태 (예컨대 ILRβ 신호전달 도메인의 말단절단된 형태)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 임의의 주어진 도메인의 돌연변이되거나 말단절단된 형태는 100%, 95%, 90%, 85% 서열 동일성, 또는 본원에서 제공된 서열에 제시된 서열에 대해 상기 언급된 백분율 중 임의의 2개에 의해 한정되는 범위 내인 퍼센트 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같은 "CISC 변이체 폴리펩티드 서열" 또는 "CISC 변이체 아미노산 서열"은 본원에서 제공된 단백질 서열, 또는 그의 특이적으로 유도된 단편, 예컨대 세포외 결합 도메인, 힌지 도메인, 막횡단 도메인 및/또는 신호전달 도메인에 대한 단백질 서열과 적어도 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 아미노산 서열 동일성 (또는 상기 언급된 백분율 중 임의의 2개에 의해 한정되는 범위 내의 백분율 아미노산 서열 동일성)을 갖는 하기 정의된 바와 같은 단백질 서열을 지칭한다. 통상적으로, CISC 변이체 폴리펩티드 또는 그의 단편은 아미노산 서열 또는 그의 유도된 단편과 적어도 80% 아미노산 서열 동일성, 적어도 81% 아미노산 서열 동일성, 적어도 82% 아미노산 서열 동일성, 적어도 83% 아미노산 서열 동일성, 적어도 84% 아미노산 서열 동일성, 적어도 85% 아미노산 서열 동일성, 적어도 86% 아미노산 서열 동일성, 적어도 87% 아미노산 서열 동일성, 적어도 88% 아미노산 서열 동일성, 적어도 89% 아미노산 서열 동일성, 적어도 90% 아미노산 서열 동일성, 적어도 91% 아미노산 서열 동일성, 적어도 92% 아미노산 서열 동일성, 적어도 93% 아미노산 서열 동일성, 적어도 94% 아미노산 서열 동일성, 적어도 95% 아미노산 서열 동일성, 적어도 96% 아미노산 서열 동일성, 적어도 97% 아미노산 서열 동일성, 적어도 98% 아미노산 서열 동일성, 또는 적어도 99% 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다. 변이체는 천연 단백질 서열을 포함하지 않는다.
본원에 사용된 바와 같은 "T-세포" 또는 "T 림프구"는 제한 없이 원숭이, 개, 영장류, 및 인간을 비롯한 임의의 포유동물 종으로부터의 것일 수 있다. 일부 실시양태에서, T-세포는 수용자 대상체와 동종이형 (동일한 종, 그러나 상이한 공여자로부터)이고; 일부 실시양태에서, T-세포는 자가유래 (공여자 및 수용자가 동일함)이고; 일부 실시양태에서, T-세포는 동계 (공여자 및 수용자가 상이하지만, 동일한 트윈임)이다.
본원에 사용된 바와 같은 "RNA-가이드된 엔도뉴클레아제", "RGEN", "Cas 엔도뉴클레아제", 또는 "Cas 뉴클레아제"는 예를 들어, CRISPR (군집화된 규칙적으로 간격화된 짧은 회문구조 반복부) 적응성 면역계와 연관된 RNA-가이드된 DNA 엔도뉴클레아제 효소를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 본원에서, "RGEN" 또는 "Cas 엔도뉴클레아제"는 천연-발생 및 재조합 Cas 엔도뉴클레아제 둘 다를 지칭한다.
이 명세서에 사용된 바와 같이, 전이적 어구에서 또는 청구범위의 본문에서, 용어 "포함하다" 및 "포함하는"은 개방-말단 의미를 갖는 것으로 해석되어야 한다. 즉, 상기 용어는 어구 "적어도 갖는" 또는 "적어도 포함하는"과 동의어적으로 해석되어야 한다. 프로세스의 맥락에서 사용되는 경우에, 용어 "포함하는"은 프로세스가 적어도 나열된 단계를 포함하지만, 추가의 단계를 포함할 수 있음을 의미한다. 화합물, 조성물 또는 장치의 맥락에서 사용되는 경우에, 용어 "포함하는"은 화합물, 조성물 또는 장치가 적어도 나열된 특색 또는 구성성분을 포함하지만, 또한 추가의 특색 또는 구성성분을 포함할 수 있음을 의미한다.
제어된 형질 세포 고갈을 위한 시스템
한 측면에서, 개체에서 형질 세포의 제어된 고갈을 위한 조작된 세포 (예를 들어, 조작된 T 세포)를 생성하기 위한 시스템이 본원에서 제공된다. 시스템은 a) i) 형질 세포에 대한 세포독성을 세포에 부여할 수 있는 항-형질 세포 구축물, 및 ii) 이량체화 활성화가능한 화학적-유도된 신호전달 복합체 (CISC)의 폴리펩티드 구성성분 (여기서 신호전달-적격 CISC는 세포의 생존 및/또는 증식을 촉진시키는 신호전달 경로에서 자극성 신호를 생성할 수 있음)을 코딩하는 세포 (예를 들어, T 세포)의 게놈 내로의 통합을 위한 핵산, 및 b) 항-형질 세포 구축물 및 CISC를 발현하는 조작된 세포를 생산하기 위한 세포의 게놈 내로 핵산을 통합하기 위한 게놈 편집 요소를 포함한다. CISC는 조작된 세포와 접촉하는 CISC 이량체화에 요구되는 리간드의 양을 조정함으로써 조작된 세포의 생존 및/또는 증식을 제어하는 것을 허용한다. 일부 실시양태에서, CISC는 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분을 포함하며, 여기서 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분은, 조작된 세포에 의해 발현되는 경우에, 이들이 리간드의 존재 하에서 이량체화하여 신호전달-적격 CISC를 생성하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 리간드의 부재 하에서 생존하고/거나 증식할 수 없다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 세포의 생존 및/또는 증식에 관여하는 내인성 신호전달 경로에 있어서 결함성이며, 신호전달-적격 CISC는 조작된 세포가 생존하고/거나 증식할 수 있도록 결함성 내인성 신호전달 경로를 보충할 수 있다.
항-형질 세포 구축물
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 항-형질 세포 구축물을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-형질 세포 구축물은 항-형질 세포 키메라 항원 수용체 (CAR)이다. 항-형질 세포 CAR은 형질 세포의 표면 상에 존재하는 항원을 인식한다. 일부 실시양태에서, 항-형질 세포 CAR은 형질 세포의 표면 상에 선택적으로 발현되는 항원을 인식한다. 일부 실시양태에서, 형질 세포는 비-악성 형질 세포이다. 일부 실시양태에서, 항-형질 세포 CAR은 CD27 (종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리, 구성원 7, TNFRSF7), CD126 (인터류킨-6 수용체, IL6R), CD138 (신데칸 1), CD269 (B-세포 성숙 항원, BCMA), 또는 CD319 (SLAM 패밀리 구성원 7, SLAMF7)를 인식한다. 일부 실시양태에서, 항-형질 세포 CAR은 항-BCMA CAR이다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR은 야생형 BCMA를 인식한다. BCMA에 대해 특이적인 항체 모이어티는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 항-BCMA CAR은 이들 항-BCMA 항체 모이어티 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR은 항-BCMA 항체 C11D5.3으로부터 유래된 항체 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR은 항-BCMA 항체 C11D5.3으로부터 유래된 중쇄 및 경쇄 CDR3을 포함하는 항-BCMA scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR은 항-BCMA scFv를 포함하며, 여기서 항-BCMA scFv CDR의 각각은 항-BCMA 항체 C11D5.3으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA scFv는 서열식별번호: 55의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 55의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 항-BCMA CAR을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR은 세포외 BCMA 인식 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 BCMA 인식 도메인은 BCMA에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 항-BCMA scFv이다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA scFv는 중쇄 상보성-결정 영역 (HC-CDR)1, HC-CDR2, 및 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH), 및 경쇄 상보성-결정 영역 (LC-CDR)1, LC-CDR2, 및 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하며, 여기서 CDR의 일부는 항-BCMA 항체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, HC-CDR3 및 LC-CD3은 항-BCMA 항체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, HC-CDR1, HC-CDR2, HC-CDR3, LC-CDR1, LC-CDR2, 및 LC-CDR3은 항-BCMA 항체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 C11D5.3이다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA scFv는 서열식별번호: 55의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 55의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8 막횡단 도메인은 서열식별번호: 56의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 56의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR 공동-자극성 도메인은 4-1BB 및/또는 CD28 공동-자극성 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD28 공동-자극성 도메인은 서열식별번호: 57의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 57의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 공동-자극성 막횡단 도메인은 서열식별번호: 58의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 58의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR 세포질 신호전달 도메인은 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 59의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 59의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR은 서열식별번호: 60 또는 61의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 60 또는 61의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
CISC
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분을 포함하는 이량체성 CISC를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 제1 막횡단 도메인, 및 제1 신호전달 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 제1 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분은 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 제2 막횡단 도메인, 및 제2 신호전달 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분은 제2 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 CISC 구성성분은, 발현되는 경우에, 이들이 리간드의 존재 하에서 이량체화하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함하고, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함하고, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 라파마이신 또는 라파로그이다. 일부 실시양태에서, 제1 신호전달 도메인은 IL2Rγ로부터 유래된 신호전달 도메인이고/거나, 제1 막횡단 도메인은 IL2Rγ로부터 유래된 막횡단 도메인이고, 제2 신호전달 도메인은 IL2Rβ로부터 유래된 신호전달 도메인이고/거나, 제2 막횡단 도메인은 IL2Rβ로부터 유래된 막횡단 도메인이다. 일부 실시양태에서, 제2 신호전달 도메인은 IL2Rγ로부터 유래된 신호전달 도메인이고/거나, 제2 막횡단 도메인은 IL2Rγ로부터 유래된 막횡단 도메인이고, 제1 신호전달 도메인은 IL2Rβ로부터 유래된 신호전달 도메인이고/거나, 제1 막횡단 도메인은 IL2Rβ로부터 유래된 막횡단 도메인이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분을 포함하는 이량체성 CISC를 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 CISC는 IL2Rγ 및 IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 신호전달 도메인을 비롯한 IL2Rγ의 부분을 포함하고, 제2 CISC 구성성분은 신호전달 도메인을 비롯한 IL2Rβ의 부분을 포함하거나, 제2 CISC 구성성분은 신호전달 도메인을 비롯한 IL2Rγ의 부분을 포함하고, 제1 CISC 구성성분은 신호전달 도메인을 비롯한 IL2Rβ의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 서열식별번호: 50의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 IL2Rγ의 부분을 포함하고, 제2 CISC 구성성분은 서열식별번호: 51의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 51의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 IL2Rβ의 부분을 포함하거나, 제2 CISC 구성성분은 서열식별번호: 50의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 IL2Rγ의 부분을 포함하고, 제1 CISC 구성성분은 서열식별번호: 51의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 51의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 IL2Rβ의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함하고, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함하고, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, FKBP 도메인은 서열식별번호: 47의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 47의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, FRB는 서열식별번호: 48의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 48의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 CISC 구성성분은 라파마이신 또는 라파로그의 존재 하에서 이량체화하여 신호전달 적격 CISC를 형성한다. 일부 실시양태에서, 라파로그는 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
다른 실시양태에서, IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 CISC 구성성분은 말단절단된 세포내 IL2Rβ 도메인을 포함한다. 말단절단된 IL2Rβ 도메인은 IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 CISC 구성성분과의 이종이량체화 시 하류 IL2 신호전달을 활성화시키는 능력을 보유한다. 일부 실시양태에서, 말단절단된 IL2Rβ는 서열식별번호: 76에 제시된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 서열식별번호: 76의 말단절단된 IL2Rβ 도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 N-말단 아미노산 중 임의의 것을 결여한다. 일부 실시양태에서, 말단절단된 세포내 IL2Rβ 도메인을 포함하는 CISC 구성성분은 서열식별번호: 77의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 CISC 구성성분 중 임의의 것에 따르면, CISC 구성성분은 말단절단된 세포내 IL2Rβ 도메인을 포함하는 CISC 구성성분으로 치환될 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 CISC 구성성분은 서열식별번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 CISC 구성성분으로 치환된다.
항-세포독성 T 세포 구축물
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 항-세포독성 T 세포 구축물을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-세포독성 T 세포 구축물은 구축물을 발현하는 편집된 세포에 편집된 세포를 외래물로서 인식하는 세포독성 T 세포에 대한 세포독성을 부여할 수 있는 반면, 편집된 T 세포는 편집된 세포를 외래물로서 인식하지 않는 세포독성 T 세포에 대해 비-세포독성이다. 일부 실시양태에서, 항-세포독성 T 세포 구축물은 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체이다. 일부 실시양태에서, 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인은 서열식별번호: 62의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 62의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 CD8 막횡단 도메인은 서열식별번호: 63의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 63의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 공동-자극성 도메인은 4-1BB 공동-자극성 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 4-1BB 공동-자극성 도메인은 서열식별번호: 64의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 64의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포질 신호전달 도메인은 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 59의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 59의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 서열식별번호: 65의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 65의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
선택가능한 마커
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 선택가능한 마커를 발현하는 편집된 세포에 선택적 조건에서, 예컨대 독소의 존재 하에서 또는 영양소의 부재 하에서 생존하는 능력을 부여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 선택가능한 마커를 발현하는 세포의 선택을 허용하는 표면 마커이다. 일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 말단절단된 저-친화도 신경 성장 인자 수용체 (tLNGFR) 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, tLNGFR 폴리펩티드는 서열식별번호: 66의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 66의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
칼시뉴린 억제제 저항성
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드를 발현하는 편집된 세포에 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 타크롤리무스 (FK506) 및/또는 시클로스포린 A (CsA)에 대한 저항성을 부여한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 돌연변이체 칼시뉴린 (CN) 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드는 타크롤리무스 (FK506) 및 시클로스포린 A (CsA)에 대한 저항성을 부여한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드는 CNb30 (서열식별번호: 67)이다.
라파마이신 저항성
유용한 반면, 라파마이신에 노출된 CISC-발현 세포는 라파로그 AP21967을 사용하여 달성되는 증식의 양에 비해 더 적은 증식을 겪는 것으로 관찰되었다. 포유동물 라파마이신의 표적 (mTOR)은 인간에서 MTOR 유전자에 의해 코딩되는 키나제이다. mTOR은 단백질 키나제의 포스파티딜이노시톨 3-키나제-관련된 키나제 패밀리의 구성원이다. 이 단백질은 동화작용적 프로세스, 예컨대 지질 합성 및 mRNA 번역을 지배하는 기질을 인산화함으로써, 뿐만 아니라 이화작용적 프로세스, 예컨대 자가포식을 지연시킴으로써 세포 성장을 자극하는 성장 조절제이다. 이론에 구애되지는 않지만, mTOR의 FRB 도메인에의 라파마이신/FKBP 복합체의 결합은 mTOR-매개된 세포내 신호전달을 차단하거나 감소시켜 감소된 mRNA 번역 및 세포 성장을 발생시키는 것으로 믿어진다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 폴리펩티드를 발현하는 편집된 세포에 라파마이신에 대한 저항성을 부여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 포유동물 라파마이신의 표적 (mTOR) 키나제의 FKBP-라파마이신 결합 (FRB) 도메인 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
게놈 편집 요소
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 본원에 기재된 항-형질 세포 구축물 및 CISC를 발현하는 조작된 세포를 생산하는 세포의 게놈 내로 핵산을 통합하기 위한 게놈-편집 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 게놈 편집 요소는 본원에 기재된 다양한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 내인성 TRA 유전자 및/또는 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입할 수 있다. 일부 실시양태에서, 게놈 편집 요소는 a) 내인성 TRA 유전자를 표적화하는 제1 gRNA 및/또는 내인성 IL2RG 유전자를 표적화하는 제2 gRNA; 및 b) RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 (RGEN) 또는 RGEN을 코딩하는 핵산을 포함하는 CRISPR 시스템을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 gRNA는 TRAC 도메인을 코딩하는 영역 내의 또는 그 부근의 내인성 TRA 유전자를 표적화한다. gRNA 표적 부위는 그 표적 부위에서의 통합이 전형적으로 플랭킹 또는 인접한 서열에서 TRAC 도메인 발현 및/또는 기능을 방해할 수 있는 경우에 TRAC 도메인을 코딩하는 영역 "부근에" 있다. 일부 실시양태에서, 제1 gRNA는 서열식별번호: 1-3 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 1-3 중 어느 하나와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, RGEN은 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로 공지됨), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cpf1 엔도뉴클레아제, 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 a) 내인성 TRA 유전자를 표적화하는 제1 gRNA 및/또는 내인성 IL2RG 유전자를 표적화하는 제2 gRNA; 및 b) RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 (RGEN) 또는 RGEN을 코딩하는 핵산을 포함하는 게놈-편집 요소를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 gRNA는 TRAC 도메인을 코딩하는 영역 내의 또는 그 부근의 내인성 TRA 유전자를 표적화한다. 일부 실시양태에서, 제1 gRNA는 서열식별번호: 1-3 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 1-3 중 어느 하나와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, RGEN은 Cas9이다. 일부 실시양태에서, RGEN을 코딩하는 핵산은 리보핵산 (RNA) 서열이다. 일부 실시양태에서, RGEN을 코딩하는 RNA 서열은 공유 결합을 통해 제1 gRNA 또는 제2 gRNA에 연결된다. 일부 실시양태에서, 시스템은 본원에 기재된 항-형질 세포 구축물 및 CISC를 코딩하는 핵산을 포함하는 1종 이상의 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-형질 세포 구축물은 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 항-BCMA CAR이다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 항-세포독성 T 세포 구축물, 선택가능한 마커, 칼시뉴린 억제제 저항성을 부여하는 폴리펩티드, 및 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드 중 1종 이상을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-세포독성 T 세포 구축물은 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체이다. 일부 실시양태에서, 시스템은 내인성 TRA 유전자 내로의 삽입을 위한 제1 공여자 주형 및/또는 내인성 IL2RG 유전자 내로의 삽입을 위한 제2 공여자 주형을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함하는 1종 이상의 공여자 주형을 포함한다: i) 항-형질 세포 구축물; ii) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; iii) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; iv) 선택가능한 마커; v) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 및 vi) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형 및 제2 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성되고, 제2 공여자 주형은 제2 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함하고, 제2 공여자 주형은 제2 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 항-형질 세포 구축물을 코딩하는 핵산 및 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 코딩 카세트는 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 제1 내인성 유전자의 서열에 연결되고, 제1 내인성 유전자의 서열에 연결된 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제1 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 세포에서의 TRAC 도메인은 세포가 기능적 천연 (비변형된) T 세포 수용체를 발현할 수 없는 경우에 비-기능적이다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제2 프로모터의 제어 하에 있도록, 제2 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제2 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제2 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제2 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 제1 공여자 주형에 대한 예시적인 구성은 도 1, 공여자 주형 구축물 #4-#7에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 28-39 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 101-104 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRA 유전자에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 제1 공여자 주형에 대한 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 80 및 81, 서열식별번호: 82 및 83, 또는 서열식별번호: 84 및 85의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 들 수 있다. 제2 공여자 주형에 대한 예시적인 구성은 도 1, 공여자 주형 구축물 #8에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 40-43 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 105의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 IL2RG 유전자에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 제2 공여자 주형에 대한 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 86 및 87, 서열식별번호: 88 및 89, 또는 서열식별번호: 90 및 91의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 들 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이고/거나, 제2 공여자 주형은 제2 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 28-39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 28-39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 101-104 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 101-104 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 40-43 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40-43 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 105의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 105의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 공여자 주형 중 임의의 것에 따르면, 공여자 주형은 항-형질 세포 구축물을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-형질 세포 구축물은 항-BCMA CAR이다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR은 세포외 BCMA 인식 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 BCMA 인식 도메인은 BCMA에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 항-BCMA scFv이다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA scFv는 중쇄 상보성-결정 영역 (HC-CDR)1, HC-CDR2, 및 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH), 및 경쇄 상보성-결정 영역 (LC-CDR)1, LC-CDR2, 및 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하며, 여기서 CDR의 일부는 항-BCMA 항체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, HC-CDR3 및 LC-CD3은 항-BCMA 항체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, HC-CDR1, HC-CDR2, HC-CDR3, LC-CDR1, LC-CDR2, 및 LC-CDR3은 항-BCMA 항체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 C11D5.3이다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA scFv는 서열식별번호: 55의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 55의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8 막횡단 도메인은 서열식별번호: 56의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 56의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR 공동-자극성 도메인은 4-1BB 및/또는 CD28 공동-자극성 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD28 공동-자극성 도메인은 서열식별번호: 57의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 57의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 공동-자극성 막횡단 도메인은 서열식별번호: 58의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 58의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR 세포질 신호전달 도메인은 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 59의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 59의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR은 서열식별번호: 60 또는 61의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 60 또는 61의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 공여자 주형 중 임의의 것에 따르면, 공여자 주형은 IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분의 제1 세포외 결합 도메인은 FRB 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 서열식별번호: 54의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 54의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 공여자 주형 중 임의의 것에 따르면, 공여자 주형은 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 FRB 도메인 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, FRB 도메인 폴리펩티드는 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 공여자 주형 중 임의의 것에 따르면, 공여자 주형은 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 tLNGFR 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, tLNGFR 폴리펩티드는 서열식별번호: 66의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 66의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 공여자 주형 중 임의의 것에 따르면, 공여자 주형은 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 돌연변이체 CN 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드는 CNb30 (서열식별번호: 67)이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 공여자 주형 중 임의의 것에 따르면, 공여자 주형은 IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분의 제2 세포외 결합 도메인은 FKBP 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분은 서열식별번호: 53의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 공여자 주형은 서열식별번호: 52의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 52의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 제2 CISC 구성성분의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 공여자 주형 중 임의의 것에 따르면, 공여자 주형은 MSCV 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, MSCV 프로모터는 서열식별번호: 75의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 75의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 공여자 주형 중 임의의 것에 따르면, 공여자 주형은 MND 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, MND 프로모터는 서열식별번호: 74의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 74의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 공여자 주형 중 임의의 것에 따르면, 공여자 주형은 인접한 시스템 구성성분-코딩 핵산 사이에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 공여자 주형은 각각의 인접한 시스템 구성성분-코딩 핵산 사이에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 공여자 주형은 5'에서 3'로의 순서로, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산, 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산, 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산, 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 2A 자기-절단 펩티드는 독립적으로 T2A 자기-절단 펩티드 또는 P2A 자기-절단 펩티드이다. 일부 실시양태에서, T2A 자기-절단 펩티드는 서열식별번호: 72의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 72의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, P2A 자기-절단 펩티드는 서열식별번호: 73의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 73의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함하는 1종 이상의 공여자 주형을 포함한다: i) 항-형질 세포 구축물; ii) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; iii) 항-세포독성 T 세포 구축물; iv) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; v) 선택가능한 마커; vi) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 및 vii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형 및 제2 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성되고, 제2 공여자 주형은 제2 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함하고, 제2 공여자 주형은 제2 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 항-형질 세포 구축물을 코딩하는 핵산 및 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 코딩 카세트는 항-세포독성 T 세포 구축물을 코딩하는 핵산, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 제1 내인성 유전자의 서열에 연결되고, 제1 내인성 유전자의 서열에 연결된 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제1 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제2 프로모터의 제어 하에 있도록, 제2 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제2 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제2 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제2 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 제1 공여자 주형에 대한 예시적인 구성은 도 1, 공여자 주형 구축물 #4-#7에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 28-39 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 101-104 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRA 유전자에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 제1 공여자 주형에 대한 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 80 및 81, 서열식별번호: 82 및 83, 또는 서열식별번호: 84 및 85의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 들 수 있다. 제2 공여자 주형에 대한 예시적인 구성은 도 1, 공여자 주형 구축물 #9에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 44로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 106의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 IL2RG 유전자에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 제2 공여자 주형에 대한 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 86 및 87, 서열식별번호: 88 및 89, 또는 서열식별번호: 90 및 91의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 들 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이고/거나, 제2 공여자 주형은 제2 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 28-39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 28-39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 101-104 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 101-104 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 44의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 44의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 106의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 106의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 공여자 주형 중 임의의 것에 따르면, 공여자 주형은 항-세포독성 T 세포 구축물을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-세포독성 T 세포 구축물은 구축물을 발현하는 편집된 T 세포에 편집된 T 세포를 외래물로서 인식하는 세포독성 T 세포에 대한 세포독성을 부여할 수 있는 반면, 편집된 T 세포는 편집된 T 세포를 외래물로서 인식하지 않는 세포독성 T 세포에 대해 비-세포독성이다. 일부 실시양태에서, 항-세포독성 T 세포 구축물은 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체이다. 일부 실시양태에서, 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인은 서열식별번호: 62의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 62의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 CD8 막횡단 도메인은 서열식별번호: 63의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 63의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 공동-자극성 도메인은 4-1BB 공동-자극성 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 4-1BB 공동-자극성 도메인은 서열식별번호: 64의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 64의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포질 신호전달 도메인은 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 59의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 59의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 서열식별번호: 65의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 65의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함하는 1종 이상의 공여자 주형을 포함한다: i) 항-형질 세포 구축물; ii) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; iii) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; iv) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 및 v) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형 및 제2 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성되고, 제2 공여자 주형은 제2 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함하고, 제2 공여자 주형은 제2 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 항-형질 세포 구축물을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 코딩 카세트는 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 항-형질 세포 구축물을 코딩하는 핵산의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 서열의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 제1 내인성 유전자의 서열에 연결되고, 제1 내인성 유전자의 서열에 연결된 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제1 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제2 프로모터의 제어 하에 있도록, 제2 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제2 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제2 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제2 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 제1 공여자 주형에 대한 예시적인 구성은 도 1, 공여자 주형 구축물 #1 및 #2에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 19-24 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 98-99 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRA 유전자에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 제1 공여자 주형에 대한 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 80 및 81, 서열식별번호: 82 및 83, 또는 서열식별번호: 84 및 85의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 들 수 있다. 제2 공여자 주형에 대한 예시적인 구성은 도 1, 공여자 주형 구축물 #10에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 45로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 107의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 IL2RG 유전자에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 제2 공여자 주형에 대한 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 86 및 87, 서열식별번호: 88 및 89, 또는 서열식별번호: 90 및 91의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 들 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이고/거나, 제2 공여자 주형은 제2 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 19-24 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 19-24 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 98-99 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 98-99 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 107의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 107의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함하는 1종 이상의 공여자 주형을 포함한다: i) 항-형질 세포 구축물; ii) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; iii) 항-세포독성 T 세포 구축물; iv) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; v) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 및 vi) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형 및 제2 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성되고, 제2 공여자 주형은 제2 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함하고, 제2 공여자 주형은 제2 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 항-형질 세포 구축물을 코딩하는 핵산 및 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 코딩 카세트는 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 제1 내인성 유전자의 서열에 연결되고, 제1 내인성 유전자의 서열에 연결된 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제1 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제2 프로모터의 제어 하에 있도록, 제2 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제2 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제2 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제2 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 제1 공여자 주형에 대한 예시적인 구성은 도 1, 공여자 주형 구축물 #3에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 25-27 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 100의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRA 유전자에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 제1 공여자 주형에 대한 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 80 및 81, 서열식별번호: 82 및 83, 또는 서열식별번호: 84 및 85의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 들 수 있다. 제2 공여자 주형에 대한 예시적인 구성은 도 1, 공여자 주형 구축물 #11에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 46으로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 108의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 IL2RG 유전자에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 제2 공여자 주형에 대한 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 86 및 87, 서열식별번호: 88 및 89, 또는 서열식별번호: 90 및 91의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 들 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이고/거나, 제2 공여자 주형은 제2 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 25-27 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 25-27 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 100의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 100의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 108의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 108의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 1종 이상의 공여자 주형 및 1종 이상의 gRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형 및 제2 공여자 주형을 포함하고, 1종 이상의 gRNA는 제1 gRNA 및 제2 gRNA를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이고/거나, 제2 공여자 주형은 제2 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 28, 31, 34, 및 37 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 28, 31, 34, 및 37 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 gRNA는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 29, 32, 35, 및 38 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 29, 32, 35, 및 38 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 gRNA는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 30, 33, 36, 및 39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 30, 33, 36, 및 39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 gRNA는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 gRNA는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 gRNA는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 gRNA는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 25의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 25의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 gRNA는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 26의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 26의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 gRNA는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 27의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 27의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 gRNA는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 공여자 주형을 포함하는 본원에 기재된 시스템 중 임의의 것에 따르면, 공여자 주형은 코딩 카세트를 포함하고, 공여자 주형은 코딩 카세트가 상동성 지정된 복구 (HDR)에 의해 시스템에서의 gRNA에 의해 표적화된 게놈 로커스 내로 통합될 수 있도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 코딩 카세트는 표적화된 게놈 로커스에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 둘 다의 측 상에 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, 상동성 아암은 시스템에서의 gRNA에 대한 표적 부위를 포함하는 표적화된 게놈 로커스에서의 서열에 상응한다. 일부 실시양태에서, 상동성 아암 중 하나 또는 둘 다는 시스템에서의 gRNA에 대한 표적 부위에 상응하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상동성 아암은 게놈 로커스 내로의 코딩 카세트의 통합이 gRNA에 대한 게놈 표적 부위를 제거하거나, 다르게는 그것이 더 이상 gRNA에 대한 표적이 아니도록 게놈 표적 부위를 변형시키도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 표적 부위에 상응하는 상동성 아암에서의 서열은, 그것이 gRNA에 대한 표적이 아니도록, 표적 부위의 PAM 서열의 변화를 포함한다. 일부 실시양태에서, 게놈 로커스 내로의 코딩 서열의 통합이 게놈 로커스에서의 표적 부위를 중단시키도록, 상동성 아암 중 하나는 표적 부위의 부분에 상응하는 서열을 포함하고, 다른 상동성 아암은 표적 부위의 나머지에 상응하는 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 상동성 아암은 길이로 적어도 또는 적어도 약 0.2 kb (예컨대 적어도 또는 적어도 약 0.3 kb, 0.4 kb, 0.5 kb, 0.6 kb, 0.7 kb, 0.8 kb, 0.9 kb, 1 kb 중 임의의 것 또는 그 이상)이다. 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 19-46 중 어느 하나의 서열을 갖는 공여자 주형으로부터의 상동성 아암을 들 수 있다. 일부 실시양태에서, 공여자 주형은 아데노 연관된 바이러스 (AAV) 벡터에서 코딩된다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV6 벡터이다.
일부 실시양태에서, 공여자 주형을 포함하는 본원에 기재된 시스템 중 임의의 것에 따르면, 공여자 주형은 코딩 카세트를 포함하고, 공여자 주형은 코딩 카세트가 비-상동성 말단 연결 (NHEJ)에 의해 시스템에서의 gRNA에 의해 표적화된 게놈 로커스 내로 통합될 수 있도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 코딩 카세트는 gRNA 표적 부위에 의해 하나 또는 둘 다의 측 상에 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, 코딩 카세트는 gRNA 표적 부위에 의해 둘 다의 측 상에 플랭킹된다. 일부 실시양태에서, gRNA 표적 부위는 시스템에서의 gRNA에 대한 표적 부위이다. 일부 실시양태에서, 공여자 주형의 gRNA 표적 부위는 시스템에서의 gRNA에 대한 세포 게놈 gRNA 표적 부위의 역 상보체이다. 일부 실시양태에서, 공여자 주형은 아데노 연관된 바이러스 (AAV) 벡터에서 코딩된다. 일부 실시양태에서, AAV 벡터는 AAV6 벡터이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 시스템은 RGEN 및 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA를 포함하는 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 포함한다. 일부 실시양태에서, RGEN은 각각 1:1 내지 20:1의 gRNA 대 RGEN의 몰비로 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA와 예비복합체화되어 RNP를 형성한다.
조작된 세포
일부 측면에서, i) 조작된 세포에 본원에 제시되고 기재된 바와 같은 형질 세포에 대한 세포독성을 부여할 수 있는 항-형질 세포 구축물, 및 ii) 본원에 제시되고 기재된 바와 같은 이량체화 활성화가능한 화학적-유도된 신호전달 복합체 (CISC)의 폴리펩티드 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 신호전달-적격 CISC가 조작된 세포의 생존 및/또는 증식을 촉진시키는 신호전달 경로에서 자극성 신호를 생성할 수 있는 것인 조작된 세포, 예컨대 조작된 포유동물 세포 (예를 들어, T 세포)가 본원에서 제공된다. CISC는 조작된 세포와 접촉하는 CISC 이량체화에 요구되는 리간드의 양을 조정함으로써 조작된 세포의 생존 및/또는 증식을 제어하는 것을 허용한다. 일부 실시양태에서, CISC는 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분을 포함하며, 여기서 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분은, 조작된 세포에 의해 발현되는 경우에, 이들이 리간드의 존재 하에서 이량체화하여 신호전달-적격 CISC를 생성하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 리간드의 부재 하에서 생존하고/거나 증식할 수 없다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 세포의 생존 및/또는 증식에 관여하는 내인성 신호전달 경로에 있어서 결함성이며, 신호전달-적격 CISC는 조작된 세포가 생존하고/거나 증식할 수 있도록 결함성 내인성 신호전달 경로를 보충할 수 있다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 조작된 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 본원에 기재된 바와 같은 항-형질 세포 CAR, 예컨대, 예를 들어, 항-BCMA CAR을 포함하는 조작된 T 세포는 그의 표적 항원의 존재 하에서, 또는 그와의 접촉 후에 탈과립화된다. 일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 개체에서 형질 세포 신생물 종양, 예컨대, 예를 들어, 다발성 골수종의 부위에 국재화한다. 일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 신체에서 형질 세포 거주의 부위에, 예를 들어, 골수 및 장에 국재화한다. 일부 실시양태에서, 조작된 T 세포는 인간이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포는 항-형질 세포 구축물을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-형질 세포 구축물은 항-형질 세포 키메라 항원 수용체 (CAR)이다. 항-형질 세포 CAR은 형질 세포의 표면 상에 존재하는 항원을 인식한다. 일부 실시양태에서, 항-형질 세포 CAR은 형질 세포의 표면 상에 선택적을 발현되는 항원을 인식한다. 일부 실시양태에서, 형질 세포는 비-악성 형질 세포이다. 일부 실시양태에서, 항-형질 세포 CAR은 CD27 (종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리, 구성원 7, TNFRSF7), CD126 (인터류킨-6 수용체, IL6R), CD138 (신데칸 1), CD269 (B-세포 성숙 항원, BCMA), 또는 CD319 (SLAM 패밀리 구성원 7, SLAMF7)를 인식한다. 일부 실시양태에서, 항-형질 세포 CAR은 항-BCMA CAR이다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR은 야생형 BCMA를 인식한다. BCMA에 대해 특이적인 항체 모이어티는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 항-BCMA CAR은 이들 항-BCMA 항체 모이어티 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR은 항-BCMA 항체 C11D5.3으로부터 유래된 항체 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR은 항-BCMA 항체 C11D5.3으로부터 유래된 중쇄 및 경쇄 CDR3을 포함하는 항-BCMA scFv를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR은 항-BCMA scFv를 포함하며, 여기서 각각의 항-BCMA scFv CDR은 항-BCMA 항체 C11D5.3으로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA scFv는 서열식별번호: 55의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 55의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포는 항-BCMA CAR을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR은 세포외 BCMA 인식 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 BCMA 인식 도메인은 BCMA에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 모이어티이다. 일부 실시양태에서, 항체 모이어티는 항-BCMA scFv이다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA scFv는 중쇄 상보성-결정 영역 (HC-CDR)1, HC-CDR2, 및 HC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH), 및 경쇄 상보성-결정 영역 (LC-CDR)1, LC-CDR2, 및 LC-CDR3을 포함하는 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하며, 여기서 CDR의 일부는 항-BCMA 항체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, HC-CDR3 및 LC-CD3은 항-BCMA 항체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, HC-CDR1, HC-CDR2, HC-CDR3, LC-CDR1, LC-CDR2, 및 LC-CDR3은 항-BCMA 항체로부터 유래된다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA 항체는 C11D5.3이다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA scFv는 서열식별번호: 55의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 55의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD8 막횡단 도메인은 서열식별번호: 56의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 56의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR 공동-자극성 도메인은 4-1BB 및/또는 CD28 공동-자극성 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD28 공동-자극성 도메인은 서열식별번호: 57의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 57의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 4-1BB 공동-자극성 막횡단 도메인은 서열식별번호: 58의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 58의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR 세포질 신호전달 도메인은 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 59의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 59의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR은 서열식별번호: 60 또는 61의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 60 또는 61의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것에 따르면, 항-형질 세포 구축물을 코딩하는 외인성 핵산은 조작된 세포의 게놈 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 내인성 TRA 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. TRAC 도메인은 생성된 세포가 기능적 천연 (비변형된) T 세포 수용체를 발현할 수 없는 경우에 비-기능적이다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 항-형질 세포 구축물의 발현이 1종 이상의 내인성 IL2RG 조절 요소의 제어 하에 있도록 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은, 조작된 세포에서의 항-형질 세포 구축물의 발현이 프로모터의 제어 하에 있도록, 항-형질 세포 구축물을 코딩하는 외인성 핵산의 부분에 작동적으로 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 제어 영역 결실된, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된 (MND) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, MND 프로모터는 서열식별번호: 74의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 74의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포는 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분을 포함하는 이량체성 CISC를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 제1 막횡단 도메인, 및 제1 신호전달 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 제1 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분은 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 제2 막횡단 도메인, 및 제2 신호전달 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분은 제2 힌지 도메인을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 CISC 구성성분은, 발현되는 경우에, 이들이 리간드의 존재 하에서 이량체화하도록 구성될 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함하고, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함하고, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 라파마이신 또는 라파로그이다. 일부 실시양태에서, 제1 신호전달 도메인은 IL2Rγ로부터 유래된 신호전달 도메인이고/거나, 제1 막횡단 도메인은 IL2Rγ로부터 유래된 막횡단 도메인이고, 제2 신호전달 도메인은 IL2Rβ로부터 유래된 신호전달 도메인이고/거나, 제2 막횡단 도메인은 IL2Rβ로부터 유래된 막횡단 도메인이다. 일부 실시양태에서, 제2 신호전달 도메인은 IL2Rγ로부터 유래된 신호전달 도메인이고/거나, 제2 막횡단 도메인은 IL2Rγ로부터 유래된 막횡단 도메인이고, 제1 신호전달 도메인은 IL2Rβ로부터 유래된 신호전달 도메인이고/거나, 제1 막횡단 도메인은 IL2Rβ로부터 유래된 막횡단 도메인이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포는 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분을 포함하는 이량체성 CISC를 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 CISC는 IL2Rγ 및 IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 신호전달 도메인을 비롯한 IL2Rγ의 부분을 포함하고, 제2 CISC 구성성분은 신호전달 도메인을 비롯한 IL2Rβ의 부분을 포함하거나, 제2 CISC 구성성분은 신호전달 도메인을 비롯한 IL2Rγ의 부분을 포함하고, 제1 CISC 구성성분은 신호전달 도메인을 비롯한 IL2Rβ의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 서열식별번호: 50의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 IL2Rγ의 부분을 포함하고, 제2 CISC 구성성분은 서열식별번호: 51의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 51의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 IL2Rβ의 부분을 포함하거나, 제2 CISC 구성성분은 서열식별번호: 50의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 IL2Rγ의 부분을 포함하고, 제1 CISC 구성성분은 서열식별번호: 51의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 51의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 IL2Rβ의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함하고, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함하고, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분은 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, FKBP 도메인은 서열식별번호: 47의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 47의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, FRB는 서열식별번호: 48의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 48의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 및 제2 CISC 구성성분은 라파마이신 또는 라파로그의 존재 하에서 이량체화하여 신호전달 적격 CISC를 형성한다. 일부 실시양태에서, 라파로그는 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것에 따르면, 제1 CISC 구성성분 또는 그의 부분을 코딩하는 제1 외인성 핵산은 조작된 세포의 게놈 내로 삽입되고/거나, 제2 CISC 구성성분 또는 그의 부분을 코딩하는 제2 외인성 핵산은 조작된 세포의 게놈 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산은 내인성 TRA 유전자 내로 삽입되고/거나, 제2 외인성 핵산은 내인성 TRA 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되고/거나, 제2 외인성 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되고/거나, 제2 외인성 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, IL2Rγ의 부분을 포함하는 CISC 구성성분을 코딩하는 외인성 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, IL2Rγ의 부분을 포함하는 CISC 구성성분을 코딩하는 외인성 핵산은, CISC 구성성분의 발현이 1종 이상의 내인성 IL2RG 조절 요소의 제어 하에 있도록, 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, IL2Rγ의 부분을 포함하는 CISC 구성성분의 N-말단 단편을 코딩하는 외인성 핵산은, i) CISC 구성성분의 발현이 1종 이상의 내인성 IL2RG 조절 요소의 제어 하에 있고, ii) CISC 구성성분의 N-말단 단편을 코딩하는 외인성 핵산이 내인성 IL2RG 유전자와 인 프레임으로 삽입되고, CISC 구성성분의 나머지 C-말단 부분은 내인성 IL2RG 유전자의 코딩 서열의 C-말단 부분에 의해 코딩되도록 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산은, 조작된 세포에서의 제1 CISC 구성성분의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 CISC 구성성분 또는 그의 부분을 코딩하는 외인성 핵산의 부분에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 외인성 핵산은, 조작된 세포에서의 제2 CISC 구성성분의 발현이 제2 프로모터의 제어 하에 있도록, 제2 CISC 구성성분 또는 그의 부분을 코딩하는 외인성 핵산의 부분에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분 또는 그의 부분 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 부분을 코딩하는 단일 외인성 핵산은 조작된 세포의 게놈 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 단일 외인성 핵산은, 조작된 세포에서의 제1 및 제2 CISC 구성성분의 발현이 단일 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 부분을 코딩하는 외인성 핵산의 부분에 작동적으로 연결된 단일 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1, 제2, 및/또는 단일 프로모터는 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 제어 영역 결실된, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된 (MND) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, MND 프로모터는 서열식별번호: 74의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 74의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 조작된 세포는 T 세포, 또는 T 세포로 분화할 수 있는 전구체 세포이다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 CD3+, CD8+, 및/또는 CD4+ T 림프구이다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이며, 이는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포, 또는 벌크 CD8+ T 세포를 포함할 수 있다.
림프구 (T 림프구)는 공지된 기법에 따라 수집되고, 공지된 기법, 예컨대 항체에의 친화성 결합, 예컨대 유동 세포계측법 및/또는 면역자성 선택에 의해 풍부화되거나 고갈될 수 있다. 풍부화 및/또는 고갈 단계 후, 바람직한 T 림프구의 시험관내 확장이 공지된 기법 또는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것인 그의 변형에 따라 수행될 수 있다. 일부 실시양태에서, T 세포는 환자로부터 얻어진 자가유래 T 세포이다.
예를 들어, 바람직한 T 세포 집단 또는 하위집단은 초기 T 림프구 집단을 시험관내에서 배양 배지에 첨가한 후, 배양 배지에 공급자 세포, 예컨대 비-분열 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)를 (예를 들어, 세포의 생성된 집단이 확장되는 초기 집단에서의 각각의 T 림프구에 대해 적어도 5, 10, 20, 또는 40개 이상의 PBMC 공급자 세포를 함유하도록) 첨가하고; 배양물을 (예를 들어 T 세포의 수를 확장시키는데 충분한 시간 동안) 인큐베이션함으로써 확장될 수 있다. 비-분열 공급자 세포는 감마-조사된 PBMC 공급자 세포를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, PBMC는 세포 분열을 방지하기 위해 3000 내지 3600 rads의 범위의 감마 선으로 조사된다. 일부 실시양태에서, PBMC는 세포 분열을 방지하기 위해 3000, 3100, 3200, 3300, 3400, 3500 또는 3600 rads 또는 열거된 값 중 임의의 것의 임의의 2개의 종점 사이의 rads의 임의의 값의 감마 선으로 조사된다. 배양 배지에의 T 세포 및 공급자 세포의 첨가의 순서는 바람직할 경우에 반전될 수 있다. 배양물은 일반적으로 T 림프구의 성장에 적합한 온도 등의 조건 하에서 인큐베이션될 수 있다. 인간 T 림프구의 성장을 위해, 예를 들어, 온도는 일반적으로 적어도 25℃, 적어도 30℃, 또는 적어도 37℃일 것이다. 일부 실시양태에서, 인간 T 림프구의 성장을 위한 온도는 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 37℃, 또는 열거된 값 중 임의의 것의 임의의 2개의 종점 사이의 임의의 다른 온도이다.
T 림프구의 단리 후, 세포독성 및 헬퍼 T 림프구 둘 다는 확장 전에 또는 후에 나이브, 기억, 및 이펙터 T 세포 하위집단으로 분류될 수 있다.
CD8+ 세포는 관련 기술분야에 공지된 방법을 사용함으로써 얻어질 수 있다. 일부 실시양태에서, CD8+ 세포는 CD8+ 세포의 그들 유형의 각각과 연관된 세포 표면 항원을 확인함으로써 나이브, 중심 기억, 및 이펙터 기억 세포로 더 분류된다. 일부 실시양태에서, 기억 T 세포는 CD8+ 말초 혈액 림프구의 CD62L+ 및 CD62L- 하위세트 둘 다에 존재한다. PBMC는 항-CD8 및 항-CD62L 항체로 염색한 후에 CD62L-CD8+ 및 CD62L+CD8+ 분획으로 분류된다. 일부 실시양태에서, 중심 기억 TCM의 표현형적 마커의 발현은 CD45RO, CD62L, CCR7, CD28, CD3, 및/또는 CD127을 포함하며, 그란자임 B에 대해 음성이거나 낮다. 일부 실시양태에서, 중심 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+, 및/또는 CD8+ T 세포이다. 일부 실시양태에서, 이펙터 TE는 CD62L, CCR7, CD28, 및/또는 CD127에 대해 음성이고, 그란자임 B 및/또는 퍼포린에 대해 양성이다. 일부 실시양태에서, 나이브 CD8+ T 림프구는 CD62L, CCR7, CD28, CD3, CD127, 및/또는 CD45RA를 포함하는 나이브 T 세포의 표현형적 마커의 발현을 특징으로 한다.
세포, 예컨대 포유동물 세포, 또는 세포 집단, 예컨대 포유동물 세포의 집단이 확장을 위해 선택되는지 여부는 세포 또는 세포의 집단이 2가지 별개의 유전적 변형 사건을 겪었는지 여부에 의존한다. 세포, 예컨대 포유동물 세포, 또는 세포의 집단, 예컨대 포유동물 세포의 집단이 하나 이하의 유전적 변형 사건을 겪은 경우에, 리간드의 첨가는 이량체화를 발생시키지 않을 것이다. 그러나, 세포, 예컨대 포유동물 세포, 또는 세포의 집단, 예컨대 포유동물 세포의 집단이 2가지 유전적 변형 사건을 겪은 경우에, 리간드의 첨가는 CISC 구성성분의 이량체화, 및 후속 신호전달 캐스케이드를 발생시킬 것이다. 따라서, 세포, 예컨대 포유동물 세포, 또는 세포의 집단, 예컨대 포유동물 세포의 집단은 리간드와의 접촉에 대한 그의 반응에 기초하여 선택될 수 있다. 일부 실시양태에서, 리간드는 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 nM 또는 상기 언급된 값 중 임의의 2개에 의해 한정되는 범위 내의 농도의 양으로 첨가될 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포, 예컨대 포유동물 세포, 또는 세포의 집단, 예컨대 포유동물 세포의 집단은 신호전달 경로의 결과로서의 마커의 발현에 기초하여 이량체성 CISC에 대해 양성일 수 있다. 따라서, 이량체성 CISC에 대해 양성인 세포 집단은 표면 마커에 대한 특이적 항체 및 이소타입 매칭된 대조군 항체로의 염색을 사용한 유동 세포계측법에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포는 항-세포독성 T 세포 구축물을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-세포독성 T 세포 구축물은 조작된 세포에 조작된 세포를 외래물로서 인식하는 세포독성 T 세포에 대한 세포독성을 부여할 수 있으며, 여기서 편집된 T 세포는 조작된 세포를 외래물로서 인식하지 않는 세포독성 T 세포에 대해 비-세포독성이다. 일부 실시양태에서, 항-세포독성 T 세포 구축물은 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체이다. 일부 실시양태에서, 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인은 서열식별번호: 62의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 62의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 막횡단 도메인은 CD8 막횡단 도메인 폴리펩티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 CD8 막횡단 도메인은 서열식별번호: 63의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 63의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 공동-자극성 도메인은 4-1BB 공동-자극성 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 4-1BB 공동-자극성 도메인은 서열식별번호: 64의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 64의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 세포질 신호전달 도메인은 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인은 서열식별번호: 59의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 59의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 서열식별번호: 65의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 65의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 항-세포독성 T 세포 구축물을 코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것에 따르면, 항-세포독성 T 세포 구축물을 코딩하는 외인성 핵산은 조작된 세포의 게놈 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 내인성 TRA 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은, 항-세포독성 T 세포 구축물의 발현이 1종 이상의 내인성 IL2RG 조절 요소의 제어 하에 있도록, 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은, 조작된 세포에서의 항-세포독성 T 세포 구축물의 발현이 프로모터의 제어 하에 있도록, 항-세포독성 T 세포 구축물을 코딩하는 외인성 핵산의 부분에 작동적으로 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 제어 영역 결실된, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된 (MND) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, MND 프로모터는 서열식별번호: 74의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 74의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포는 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 조작된 세포에 선택적 조건에서, 예컨대 독소의 존재 하에서 또는 영양소의 부재 하에서 생존하는 능력을 부여할 수 있다. 일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 선택가능한 마커를 발현하는 세포의 선택을 허용하는 표면 마커이다. 일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 말단절단된 저-친화도 신경 성장 인자 수용체 (tLNGFR) 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, tLNGFR 폴리펩티드는 서열식별번호: 66의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 66의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것에 따르면, 선택가능한 마커를 코딩하는 외인성 핵산은 조작된 세포의 게놈 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 내인성 TRA 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은, 선택가능한 마커의 발현이 1종 이상의 내인성 IL2RG 조절 요소의 제어 하에 있도록, 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은, 조작된 세포에서의 선택가능한 마커의 발현이 프로모터의 제어 하에 있도록, 선택가능한 마커를 코딩하는 외인성 핵산의 부분에 작동적으로 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 제어 영역 결실된, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된 (MND) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, MND 프로모터는 서열식별번호: 74의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 74의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포는 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 타크롤리무스 (FK506) 및/또는 시클로스포린 A (CsA)에 대한 저항성을 부여한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 돌연변이체 칼시뉴린 (CN) 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드는 타크롤리무스 (FK506) 및 시클로스포린 A (CsA)에 대한 저항성을 부여한다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드는 CNb30 (서열식별번호: 67)이다.
일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것에 따르면, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 조작된 세포의 게놈 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 내인성 TRA 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은, 선택가능한 마커의 발현이 1종 이상의 내인성 IL2RG 조절 요소의 제어 하에 있도록, 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은, 조작된 세포에서의 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드의 발현이 프로모터의 제어 하에 있도록, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산의 부분에 작동적으로 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 제어 영역 결실된, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된 (MND) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, MND 프로모터는 서열식별번호: 74의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 74의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포는 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리펩티드는 포유동물 라파마이신의 표적 (mTOR) 키나제의 FKBP-라파마이신 결합 (FRB) 도메인 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것에 따르면, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산은 조작된 세포의 게놈 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 내인성 TRA 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은, 선택가능한 마커의 발현이 1종 이상의 내인성 IL2RG 조절 요소의 제어 하에 있도록, 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 외인성 핵산은, 조작된 세포에서의 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드의 발현이 프로모터의 제어 하에 있도록, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 핵산의 부분에 작동적으로 연결된 프로모터를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 골수증식성 육종 바이러스 인핸서, 음성 제어 영역 결실된, dl587rev 프라이머-결합 부위 치환된 (MND) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, MND 프로모터는 서열식별번호: 74의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 74의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것에 따르면, 조작된 세포는 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) 항-형질 세포 구축물; ii) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; iii) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; iv) 선택가능한 마커; v) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 및 vi) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 제1 코딩 카세트를 포함하는 핵산 및 제2 코딩 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 항-형질 세포 구축물을 코딩하는 핵산 및 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 코딩 카세트는 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 외인성 프로모터이고, 조작된 세포는 내인성 유전자에 삽입된 제1 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제1 외인성 핵산은 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 프로모터는 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터이고, 조작된 세포는 제1 내인성 유전자에 삽입된 제1 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제1 외인성 핵산은 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제2 프로모터의 제어 하에 있도록, 제2 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 외인성 프로모터이고, 조작된 세포는 제2 내인성 유전자에 삽입된 제2 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제2 외인성 핵산은 제2 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제2 외인성 핵산은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하고, 제2 외인성 핵산은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되도록 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편은 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트는 서열식별번호: 28-39 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트는 서열식별번호: 40-43 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하는 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것에 따르면, 폴리시스트론성 발현 카세트는 인접한 시스템 구성성분-코딩 핵산 사이에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 폴리시스트론성 발현 카세트는 각각의 인접한 시스템 구성성분-코딩 핵산 사이에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 폴리시스트론성 발현 카세트는 5'에서 3'로의 순서로, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산, 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산, 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산, 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 각각의 2A 자기-절단 펩티드는 독립적으로 T2A 자기-절단 펩티드 또는 P2A 자기-절단 펩티드이다. 일부 실시양태에서, T2A 자기-절단 펩티드는 서열식별번호: 72의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 72의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, P2A 자기-절단 펩티드는 서열식별번호: 73의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 73의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것에 따르면, 조작된 세포는 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) 항-형질 세포 구축물; ii) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; iii) 항-세포독성 T 세포 구축물; iv) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; v) 선택가능한 마커; vi) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 및 vii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 제1 코딩 카세트를 포함하는 핵산 및 제2 코딩 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 항-형질 세포 구축물을 코딩하는 핵산 및 제1 CISC 구성성분을 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 코딩 카세트는 항-세포독성 T 세포 구축물을 코딩하는 핵산, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 외인성 프로모터이고, 조작된 세포는 내인성 유전자에 삽입된 제1 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제1 외인성 핵산은 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 프로모터는 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터이고, 조작된 세포는 제1 내인성 유전자에 삽입된 제1 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제1 외인성 핵산은 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제2 프로모터의 제어 하에 있도록, 제2 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 외인성 프로모터이고, 조작된 세포는 제2 내인성 유전자에 삽입된 제2 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제2 외인성 핵산은 제2 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제2 외인성 핵산은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하고, 제2 외인성 핵산은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되도록 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편은 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트는 서열식별번호: 28-39 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트는 서열식별번호: 44로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것에 따르면, 조작된 세포는 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) 항-형질 세포 구축물; ii) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; iii) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; iv) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 및 v) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 제1 코딩 카세트를 포함하는 핵산 및 제2 코딩 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 항-형질 세포 구축물을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 코딩 카세트는 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 외인성 프로모터이고, 조작된 세포는 내인성 유전자에 삽입된 제1 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제1 외인성 핵산은 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 프로모터는 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터이고, 조작된 세포는 제1 내인성 유전자에 삽입된 제1 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제1 외인성 핵산은 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제2 프로모터의 제어 하에 있도록, 제2 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 외인성 프로모터이고, 조작된 세포는 제2 내인성 유전자에 삽입된 제2 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제2 외인성 핵산은 제2 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제2 외인성 핵산은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하고, 제2 외인성 핵산은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되도록 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편은 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트는 서열식별번호: 19-24 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트는 서열식별번호: 45로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 조작된 세포 중 임의의 것에 따르면, 조작된 세포는 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) 항-형질 세포 구축물; ii) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; iii) 항-세포독성 T 세포 구축물; iv) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; v) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 및 vi) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 제1 코딩 카세트를 포함하는 핵산 및 제2 코딩 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 항-형질 세포 구축물을 코딩하는 핵산 및 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 코딩 카세트는 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 외인성 프로모터이고, 조작된 세포는 내인성 유전자에 삽입된 제1 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제1 외인성 핵산은 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 프로모터는 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 제1 내인성 유전자의 내인성 프로모터이고, 조작된 세포는 제1 내인성 유전자에 삽입된 제1 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제1 외인성 핵산은 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 외인성 핵산의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제2 프로모터의 제어 하에 있도록, 제2 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 외인성 프로모터이고, 조작된 세포는 제2 내인성 유전자에 삽입된 제2 외인성 핵산을 포함하며, 여기서 제2 외인성 핵산은 제2 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제2 외인성 핵산은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하고, 제2 외인성 핵산은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되도록 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편은 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트는 서열식별번호: 25-27 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트는 서열식별번호: 46으로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다.
게놈을 편집하는 방법
일부 실시양태에서, 세포 게놈을 편집하는 방법으로서, 특히, 세포 게놈을 i) 형질 세포에 대한 세포독성을 세포에 부여할 수 있는 항-형질 세포 구축물, 및 ii) 이량체화 활성화가능한 화학적-유도된 신호전달 복합체 (CISC)의 폴리펩티드 구성성분의 발현을 허용하도록 편집하며, 여기서 신호전달-적격 CISC가 세포의 생존 및/또는 증식을 촉진시키는 신호전달 경로에서 자극성 신호를 생성할 수 있는 것인 방법이 본원에서 제공된다.
한 측면에서, 조작된 세포를 생산하기 위해 세포의 게놈을 편집하는 방법으로서, a) 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA, b) 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 및 c) i) 형질 세포에 대한 세포독성을 조작된 세포에 부여할 수 있는 항-형질 세포 구축물; 및 ii) 이량체화 활성화가능한 화학적-유도된 신호전달 복합체 (CISC)의 폴리펩티드 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 1종 이상의 공여자 주형을 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 신호전달-적격 CISC가 조작된 세포의 생존 및/또는 증식을 촉진시키는 신호전달 경로에서 자극성 신호를 생성할 수 있는 것인 벙봅이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, CISC는 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분을 포함하며, 여기서 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분은, 조작된 세포에 의해 발현되는 경우에, 이들이 리간드의 존재 하에서 이량체화하여 신호전달-적격 CISC를 생성하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 리간드의 부재 하에서 생존하고/거나 증식할 수 없다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 세포의 생존 및/또는 증식에 관여하는 내인성 신호전달 경로에 있어서 결함성이며, 신호전달-적격 CISC는 조작된 세포가 생존하고/거나 증식할 수 있도록 결함성 내인성 신호전달 경로를 보충할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분의 제1 세포외 결합 도메인은 FRB 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 서열식별번호: 54의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 54의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분은 IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분의 제2 세포외 결합 도메인은 FKBP 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분은 서열식별번호: 53의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 iii) 항-세포독성 T 세포 구축물; iv) 선택가능한 마커; v) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 또는 vii) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드 중 1종 이상을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-형질 세포 구축물은 항-BCMA CAR이다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR은 서열식별번호: 60 또는 61의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 60 또는 61의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분의 제1 세포외 결합 도메인은 FRB 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 서열식별번호: 54의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 54의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 FRB 도메인 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, FRB 도메인 폴리펩티드는 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 tLNGFR 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, tLNGFR 폴리펩티드는 서열식별번호: 66의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 66의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 돌연변이체 CN 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드는 CNb30 (서열식별번호: 67)이다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분의 제2 세포외 결합 도메인은 FKBP 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분은 서열식별번호: 53의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포, 예컨대 세포독성 T 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 T 세포 전구체, 예컨대 세포독성 T 세포로 분화할 수 있는 세포이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포의 게놈을 편집하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 1종 이상의 공여자 주형은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) 항-형질 세포 구축물; ii) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; iii) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; iv) 선택가능한 마커; v) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 및 vi) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형 및 제2 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성되고, 제2 공여자 주형은 제2 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함하고, 제2 공여자 주형은 제2 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 항-형질 세포 구축물을 코딩하는 핵산 및 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 코딩 카세트는 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 제1 내인성 유전자의 서열에 연결되고, 제1 내인성 유전자의 서열에 연결된 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제1 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제2 프로모터의 제어 하에 있도록, 제2 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제2 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제2 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제2 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 제1 공여자 주형에 대한 예시적인 구성은 도 1, 공여자 주형 구축물 #4-#7에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 28-39 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 101-104 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRA 유전자에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 제1 공여자 주형에 대한 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 80 및 81, 서열식별번호: 82 및 83, 또는 서열식별번호: 84 및 85의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 들 수 있다. 제2 공여자 주형에 대한 예시적인 구성은 도 1, 공여자 주형 구축물 #8에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 40-43 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 105의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 IL2RG 유전자에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 제2 공여자 주형에 대한 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 86 및 87, 서열식별번호: 88 및 89, 또는 서열식별번호: 90 및 91의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 들 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이고/거나, 제2 공여자 주형은 제2 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 28-39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 28-39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 101-104 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 101-104 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 40-43 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40-43 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 105의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 105의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포의 게놈을 편집하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 1종 이상의 공여자 주형은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) 항-형질 세포 구축물; ii) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; iii) 항-세포독성 T 세포 구축물; iv) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; v) 선택가능한 마커; vi) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 및 vii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형 및 제2 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성되고, 제2 공여자 주형은 제2 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함하고, 제2 공여자 주형은 제2 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 항-형질 세포 구축물을 코딩하는 핵산 및 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 코딩 카세트는 항-세포독성 T 세포 구축물을 코딩하는 핵산, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 제1 내인성 유전자의 서열에 연결되고, 제1 내인성 유전자의 서열에 연결된 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제1 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제2 프로모터의 제어 하에 있도록, 제2 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제2 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제2 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제2 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 제1 공여자 주형에 대한 예시적인 구성은 도 1, 공여자 주형 구축물 #4-#7에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 28-39 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 101-104 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRA 유전자에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 제1 공여자 주형에 대한 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 80 및 81, 서열식별번호: 82 및 83, 또는 서열식별번호: 84 및 85의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 들 수 있다. 제2 공여자 주형에 대한 예시적인 구성은 도 1, 공여자 주형 구축물 #9에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 44로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 106의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 IL2RG 유전자에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 제2 공여자 주형에 대한 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 86 및 87, 서열식별번호: 88 및 89, 또는 서열식별번호: 90 및 91의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 들 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이고/거나, 제2 공여자 주형은 제2 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 28-39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 28-39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 101-104 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 101-104 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 44의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 44의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 106의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 106의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포의 게놈을 편집하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 1종 이상의 공여자 주형은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) 항-형질 세포 구축물; ii) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; iii) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; iv) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 및 v) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형 및 제2 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성되고, 제2 공여자 주형은 제2 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함하고, 제2 공여자 주형은 제2 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 항-형질 세포 구축물을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 코딩 카세트는 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 항-형질 세포 구축물을 코딩하는 핵산의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 서열의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 제1 내인성 유전자의 서열에 연결되고, 제1 내인성 유전자의 서열에 연결된 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제1 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제2 프로모터의 제어 하에 있도록, 제2 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제2 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제2 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제2 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 제1 공여자 주형에 대한 예시적인 구성은 도 1, 공여자 주형 구축물 #1 및 #2에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 19-24 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 98-99 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRA 유전자에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 제1 공여자 주형에 대한 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 80 및 81, 서열식별번호: 82 및 83, 또는 서열식별번호: 84 및 85의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 들 수 있다. 제2 공여자 주형에 대한 예시적인 구성은 도 1, 공여자 주형 구축물 #10에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 45로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 107의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 IL2RG 유전자에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 제2 공여자 주형에 대한 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 86 및 87, 서열식별번호: 88 및 89, 또는 서열식별번호: 90 및 91의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 들 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이고/거나, 제2 공여자 주형은 제2 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 19-24 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 19-24 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 98-99 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 98-99 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 107의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 107의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포의 게놈을 편집하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 1종 이상의 공여자 주형은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) 항-형질 세포 구축물; ii) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; iii) 항-세포독성 T 세포 구축물; iv) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; v) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 및 vi) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형 및 제2 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성되고, 제2 공여자 주형은 제2 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함하고, 제2 공여자 주형은 제2 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 항-형질 세포 구축물을 코딩하는 핵산 및 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 코딩 카세트는 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 제1 내인성 유전자의 서열에 연결되고, 제1 내인성 유전자의 서열에 연결된 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제1 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제2 프로모터의 제어 하에 있도록, 제2 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제2 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제2 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제2 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 제1 공여자 주형에 대한 예시적인 구성은 도 1, 공여자 주형 구축물 #3에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 25-27 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 100의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRA 유전자에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 제1 공여자 주형에 대한 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 80 및 81, 서열식별번호: 82 및 83, 또는 서열식별번호: 84 및 85의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 들 수 있다. 제2 공여자 주형에 대한 예시적인 구성은 도 1, 공여자 주형 구축물 #11에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 46으로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 108의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 IL2RG 유전자에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 제2 공여자 주형에 대한 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 86 및 87, 서열식별번호: 88 및 89, 또는 서열식별번호: 90 및 91의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 들 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이고/거나, 제2 공여자 주형은 제2 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 25-27 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 25-27 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 100의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 100의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 108의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 108의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포의 게놈을 편집하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 방법은 제1 gRNA, 제2 gRNA, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 제1 벡터, 및 제2 벡터를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 (A) 제1 gRNA는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터는 서열식별번호: 28, 31, 34, 및 37 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 28, 31, 34, 및 37 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 벡터는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (B) 제1 gRNA는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터는 서열식별번호: 29, 32, 35, 및 38 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 29, 32, 35, 및 38 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 벡터는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (C) 제1 gRNA는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터는 서열식별번호: 30, 33, 36, 및 39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 30, 33, 36, 및 39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 벡터는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포의 게놈을 편집하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 방법은 제1 gRNA, 제2 gRNA, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 제1 벡터, 및 제2 벡터를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 (A) 제1 gRNA는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (B) 제1 gRNA는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (C) 제1 gRNA는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포의 게놈을 편집하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 방법은 제1 gRNA, 제2 gRNA, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 제1 벡터, 및 제2 벡터를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 (A) 제1 gRNA는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 25의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 25의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (B) 제1 gRNA는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 26의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 26의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (C) 제1 gRNA는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 27의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 27의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포의 게놈을 편집하는 방법 중 임의의 것에 따르면, RGEN은 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로 공지됨), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cpf1 엔도뉴클레아제, 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, RGEN은 Cas9이다. 일부 실시양태에서, RGEN을 코딩하는 핵산은 리보핵산 (RNA) 서열이다. 일부 실시양태에서, RGEN을 코딩하는 RNA 서열은 공유 결합을 통해 제1 gRNA 또는 제2 gRNA에 연결된다. 일부 실시양태에서, RGEN은, 세포에의 제공 전에, 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA와 예비복합체화되어 RNP 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, RGEN은 각각 1:1 내지 20:1의 gRNA 내지 RGEN의 몰비로 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA와 예비복합체화된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 세포의 게놈을 편집하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD8+ 세포독성 T 림프구 또는 CD3+ pan T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 다중 공여자로부터 유래된 T 세포의 풀의 구성원이다. 일부 실시양태에서, 다중 공여자는 인간 공여자이다. 일부 실시양태에서, 세포는 형질 세포에 대해 세포독성이다.
치료의 방법
일부 실시양태에서, 유해 항체 생산을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 질환 또는 상태를 치료하는 방법으로서, 1) T 세포의 게놈을 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 따라 편집함으로써 조작된 T 세포를 생산하고, 조작된 T 세포를 대상체에게 투여하거나; 또는 2) 대상체에서의 T 세포의 게놈을 본원에 기재된 방법 중 임의의 것에 따라 편집함으로써 대상체에서 조작된 T 세포를 생산하는 것을 포함하는 방법이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, a)의 T 세포는 대상체에 대해 자가유래이다. 일부 실시양태에서, a)의 T 세포는 대상체에 대해 동종이형이다. 일부 실시양태에서, a)의 T 세포는 다중 공여자로부터 유래된 T 세포의 풀을 포함한다. 일부 실시양태에서, 다중 공여자는 인간 공여자이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD8+ 세포독성 T 세포 또는 CD3+ pan T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 대상체는 인간이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 이식편-대-숙주 질환 (GvHD), 항체-매개된 자가면역, 형질 세포 신생물, 또는 경쇄 아밀로이드증이다. 일부 실시양태에서, 형질 세포 신생물은 형질 세포 골수종 (예를 들어, 다발성 골수종)이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 GvHD이고, 대상체는 이전에 기관 이식을 받았다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법 중 임의의 것에 따르면, T 세포의 게놈을 편집하여 조작된 T 세포를 생산하는 것은 a) 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA, b) 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 및 c) i) 형질 세포에 대한 세포독성을 조작된 세포에 부여할 수 있는 항-형질 세포 구축물; 및 ii) 이량체화 활성화가능한 화학적-유도된 신호전달 복합체 (CISC)의 폴리펩티드 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 1종 이상의 공여자 주형을 T 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 신호전달-적격 CISC는 조작된 세포의 생존 및/또는 증식을 촉진시키는 신호전달 경로에서 자극성 신호를 생성할 수 있다. 일부 실시양태에서, CISC는 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분을 포함하며, 여기서 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분은, 조작된 세포에 의해 발현되는 경우에, 이들이 리간드의 존재 하에서 이량체화하여 신호전달-적격 CISC를 생성하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 리간드의 부재 하에서 생존하고/거나 증식할 수 없다. 일부 실시양태에서, 조작된 세포는 세포의 생존 및/또는 증식에 관여하는 내인성 신호전달 경로에 있어서 결함성이며, 신호전달-적격 CISC는 조작된 세포가 생존하고/증식할 수 있도록 결함성 내인성 신호전달 경로를 보충할 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분의 제1 세포외 결합 도메인은 FRB 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 서열식별번호: 54의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 54의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분은 IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분의 제2 세포외 결합 도메인은 FKBP 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분은 서열식별번호: 53의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-형질 세포 구축물은 항-BCMA CAR이다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR은 서열식별번호: 60 또는 61의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 60 또는 61의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 iii) 항-세포독성 T 세포 구축물; iv) 선택가능한 마커; v) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 또는 vi) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드 중 1종 이상을 코딩하는 핵산을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 FRB 도메인 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, FRB 도메인 폴리펩티드는 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 tLNGFR 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, tLNGFR 폴리펩티드는 서열식별번호: 66의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 66의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 돌연변이체 CN 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드는 CNb30 (서열식별번호: 67)이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 1종 이상의 공여자 주형은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) 항-형질 세포 구축물; ii) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; iii) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; iv) 선택가능한 마커; v) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 및 vi) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형 및 제2 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성되고, 제2 공여자 주형은 제2 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함하고, 제2 공여자 주형은 제2 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 항-형질 세포 구축물을 코딩하는 핵산 및 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 코딩 카세트는 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 제1 내인성 유전자의 서열에 연결되고, 제1 내인성 유전자의 서열에 연결된 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제1 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제2 프로모터의 제어 하에 있도록, 제2 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제2 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제2 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제2 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 제1 공여자 주형에 대한 예시적인 구성은 도 1, 공여자 주형 구축물 #4-#7에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 28-39 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 101-104 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRA 유전자에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 제1 공여자 주형에 대한 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 80 및 81, 서열식별번호: 82 및 83, 또는 서열식별번호: 84 및 85의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 들 수 있다. 제2 공여자 주형에 대한 예시적인 구성은 도 1, 공여자 주형 구축물 #8에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 40-43 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 105의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 IL2RG 유전자에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 제2 공여자 주형에 대한 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 86 및 87, 서열식별번호: 88 및 89, 또는 서열식별번호: 90 및 91의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 들 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이고/거나, 제2 공여자 주형은 제2 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 28-39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 28-39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 101-104 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 101-104 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 40-43 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40-43 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 105의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 105의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 1종 이상의 공여자 주형은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) 항-형질 세포 구축물; ii) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; iii) 항-세포독성 T 세포 구축물; iv) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; v) 선택가능한 마커; vi) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 및 vii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형 및 제2 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성되고, 제2 공여자 주형은 제2 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함하고, 제2 공여자 주형은 제2 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 항-형질 세포 구축물을 코딩하는 핵산 및 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 코딩 카세트는 항-세포독성 T 세포 구축물을 코딩하는 핵산, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 제1 내인성 유전자의 서열에 연결되고, 제1 내인성 유전자의 서열에 연결된 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제1 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제2 프로모터의 제어 하에 있도록, 제2 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제2 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제2 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제2 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 제1 공여자 주형에 대한 예시적인 구성은 도 1, 공여자 주형 구축물 #4-#7에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 28-39 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 101-104 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRA 유전자에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 제1 공여자 주형에 대한 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 80 및 81, 서열식별번호: 82 및 83, 또는 서열식별번호: 84 및 85의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 들 수 있다. 제2 공여자 주형에 대한 예시적인 구성은 도 1, 공여자 주형 구축물 #9에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 44로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 106의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 IL2RG 유전자에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 제2 공여자 주형에 대한 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 86 및 87, 서열식별번호: 88 및 89, 또는 서열식별번호: 90 및 91의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 들 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이고/거나, 제2 공여자 주형은 제2 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 28-39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 28-39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 101-104 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 101-104 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 44의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 44의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 106의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 106의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 1종 이상의 공여자 주형은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) 항-형질 세포 구축물; ii) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; iii) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; iv) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 및 v) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형 및 제2 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성되고, 제2 공여자 주형은 제2 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함하고, 제2 공여자 주형은 제2 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 항-형질 세포 구축물을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 코딩 카세트는 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 항-형질 세포 구축물을 코딩하는 핵산의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 서열의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 제1 내인성 유전자의 서열에 연결되고, 제1 내인성 유전자의 서열에 연결된 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제1 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제2 프로모터의 제어 하에 있도록, 제2 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제2 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제2 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제2 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 제1 공여자 주형에 대한 예시적인 구성은 도 1, 공여자 주형 구축물 #1 및 #2에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 19-24 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 98-99 중 어느 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRA 유전자에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 제1 공여자 주형에 대한 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 80 및 81, 서열식별번호: 82 및 83, 또는 서열식별번호: 84 및 85의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 들 수 있다. 제2 공여자 주형에 대한 예시적인 구성은 도 1, 공여자 주형 구축물 #10에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 45로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 107의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 IL2RG 유전자에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 제2 공여자 주형에 대한 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 86 및 87, 서열식별번호: 88 및 89, 또는 서열식별번호: 90 및 91의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 들 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이고/거나, 제2 공여자 주형은 제2 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 19-24 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 19-24 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 98-99 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 98-99 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 107의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 107의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 1종 이상의 공여자 주형은 하기 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 포함한다: i) 항-형질 세포 구축물; ii) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; iii) 항-세포독성 T 세포 구축물; iv) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; v) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 및 vi) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 공여자 주형은 제1 공여자 주형 및 제2 공여자 주형을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자에 삽입되도록 구성되고, 제2 공여자 주형은 제2 내인성 유전자에 삽입되도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트를 포함하고, 제2 공여자 주형은 제2 코딩 카세트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 코딩 카세트는 항-형질 세포 구축물을 코딩하는 핵산 및 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 코딩 카세트는 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산, 및 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제1 프로모터의 제어 하에 있도록, 제1 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제1 프로모터를 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 상류에 합성 폴리A 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 프로모터는 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 코딩 카세트의 상류에 2A 자기-절단 펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 코딩하는 핵산을 포함하며, 여기서 제1 공여자 주형은 제1 내인성 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 제1 내인성 유전자의 서열에 연결되고, 제1 내인성 유전자의 서열에 연결된 제1 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제1 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 일부 실시양태에서, 제1 내인성 유전자는 내인성 TRA 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형의 삽입은 비-기능적 TRAC 도메인을 발생시킨다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은, 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 발현이 제2 프로모터의 제어 하에 있도록, 제2 코딩 카세트에 작동적으로 연결된 제2 프로모터를 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트 또는 그의 부분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 프로모터는 MND 프로모터이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이다. 일부 실시양태에서, 제2 내인성 유전자는 내인성 IL2RG 유전자이고, 제2 공여자 주형은 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편을 포함하는 핵산을 포함하는 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분을 포함하고, 제2 공여자 주형은 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 경우에, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결되고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산의 단편이 함께 제2 CISC 구성성분을 코딩하고, 내인성 IL2RG 유전자 서열에 연결된 제2 폴리시스트론성 발현 카세트의 부분이 함께 제2 폴리시스트론성 발현 카세트를 포함하도록 구성된다. 제1 공여자 주형에 대한 예시적인 구성은 도 1, 공여자 주형 구축물 #3에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 25-27 중 어느 하나로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 서열식별번호: 100의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 TRA 유전자에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 제1 공여자 주형에 대한 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 80 및 81, 서열식별번호: 82 및 83, 또는 서열식별번호: 84 및 85의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 들 수 있다. 제2 공여자 주형에 대한 예시적인 구성은 도 1, 공여자 주형 구축물 #11에 제시된다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 46으로부터의 인접한 뉴클레오티드의 서열을 포함한다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 서열식별번호: 108의 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 공여자 주형은 IL2RG 유전자에서의 서열에 상응하는 상동성 아암에 의해 플랭킹된다. 제2 공여자 주형에 대한 예시적인 상동성 아암으로는 서열식별번호: 86 및 87, 서열식별번호: 88 및 89, 또는 서열식별번호: 90 및 91의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 상동성 아암을 들 수 있다. 일부 실시양태에서, 제1 공여자 주형은 제1 AAV 벡터이고/거나, 제2 공여자 주형은 제2 AAV 벡터이다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 25-27 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 25-27 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 100의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 100의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 108의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 108의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 방법은 제1 gRNA, 제2 gRNA, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 제1 벡터, 및 제2 벡터를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 (A) 제1 gRNA는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터는 서열식별번호: 28, 31, 34, 및 37 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 28, 31, 34, 및 37 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 벡터는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (B) 제1 gRNA는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터는 서열식별번호: 29, 32, 35, 및 38 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 29, 32, 35, 및 38 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 벡터는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (C) 제1 gRNA는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터는 서열식별번호: 30, 33, 36, 및 39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 30, 33, 36, 및 39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 벡터는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 방법은 제1 gRNA, 제2 gRNA, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 제1 벡터, 및 제2 벡터를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 (A) 제1 gRNA는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (B) 제1 gRNA는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (C) 제1 gRNA는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 방법은 제1 gRNA, 제2 gRNA, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 제1 벡터, 및 제2 벡터를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서 (A) 제1 gRNA는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 25의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 25의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (B) 제1 gRNA는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 26의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 26의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나; (C) 제1 gRNA는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터는 서열식별번호: 27의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 27의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법 중 임의의 것에 따르면, RGEN은 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로 공지됨), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cpf1 엔도뉴클레아제, 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, RGEN은 Cas9이다. 일부 실시양태에서, RGEN을 코딩하는 핵산은 리보핵산 (RNA) 서열이다. 일부 실시양태에서, RGEN을 코딩하는 RNA 서열은 공유 결합을 통해 제1 gRNA 또는 제2 gRNA에 연결된다. 일부 실시양태에서, RGEN은, 세포에의 제공 전에, 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA와 예비복합체화되어 RNP 복합체를 형성한다. 일부 실시양태에서, RGEN은 각각 1:1 내지 20:1의 gRNA 대 RGEN의 몰비로 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA와 예비복합체화된다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법 중 임의의 것에 따르면, 세포는 T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 CD8+ 세포독성 T 림프구 또는 CD3+ pan T 세포이다. 일부 실시양태에서, T 세포는 다중 공여자로부터 유래된 T 세포의 풀의 구성원이다. 일부 실시양태에서, 다중 공여자는 인간 공여자이다. 일부 실시양태에서, 세포는 형질 세포에 대해 세포독성이다.
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 질환 또는 상태를 치료하는 방법은 라파마이신 또는 라파로그를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 라파로그는 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 실시양태에서, 라파마이신 또는 라파로그는 0.05 nM 내지 100 nM의 농도로 투여된다.
또 다른 측면에서, 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환, 또는 유해 항체 생산을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 조작된 T 세포가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 자가면역 질환은 항체-매개된 자가면역 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 경쇄 아밀로이드증이다.
또 다른 측면에서, 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환, 또는 유해 항체 생산을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료용 의약의 제조에 사용하기 위한 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 조작된 T 세포가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 자가면역 질환은 항체-매개된 자가면역 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 경쇄 아밀로이드증이다.
또 다른 측면에서, 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환, 또는 유해 항체 생산을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 시스템이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 자가면역 질환은 항체-매개된 자가면역 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 경쇄 아밀로이드증이다.
또 다른 측면에서, 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환, 또는 유해 항체 생산을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료용 의약의 제조에 사용하기 위한 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 시스템이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 자가면역 질환은 항체-매개된 자가면역 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 경쇄 아밀로이드증이다.
또 다른 측면에서, 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환, 또는 유해 항체 생산을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료에 사용하기 위한 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 1종 이상의 gRNA, 1종 이상의 공여자 주형, 키트, 시린지, 및/또는 카테터가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 자가면역 질환은 항체-매개된 자가면역 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 경쇄 아밀로이드증이다.
또 다른 측면에서, 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환, 또는 유해 항체 생산을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료용 의약의 제조에 사용하기 위한 본원에 기재된 실시양태 중 임의의 것에 따른 1종 이상의 gRNA, 1종 이상의 공여자 주형, 키트, 시린지, 및/또는 카테터가 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 자가면역 질환은 항체-매개된 자가면역 질환이다. 일부 실시양태에서, 질환 또는 상태는 경쇄 아밀로이드증이다.
조성물
이 개시내용에 제시된 바와 같이 제조된 유전적으로 변형된 세포, 예컨대 포유동물 세포를 포함하는 조성물이 본원에서 제공된다. 일부 실시양태에서, 세포, 예컨대 포유동물 세포는 본원의 실시양태에 기재된 바와 같은 단백질 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 세포외 결합 도메인, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인을 포함하는 CISC를 갖는 T 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, CISC는 IL2R-CISC이다. 다른 실시양태에서, 조성물은 세포외 결합 도메인, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인을 포함하는 CISC를 갖는 CD8+ T 세포를 포함하는 세포, 예컨대 포유동물 세포 제제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, CISC 구성성분은 리간드 (예를 들어, 라파마이신 또는 라파로그)의 존재 하에서 이량체화하며, 이는 동시에 또는 순차적으로 일어날 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 집단의 각각은 서로 또는 다른 세포 유형과 조합되어 조성물을 제공할 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물의 세포는 CD8+ 세포이다. CD8+ 세포는 T 세포독성 림프구 세포, 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및/또는 벌크 CD8+ T 세포일 수 있다. 일부 실시양태에서, CD8+ 세포독성 T 림프구 세포는 중심 기억 T 세포이며, 여기서 중심 기억 T 세포는 CD45RO+, CD62L+, 및/또는 CD8+ T 세포를 포함한다. 추가의 다른 실시양태에서, CD8+ 세포독성 T 림프구 세포는 중심 기억 T 세포이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 T 세포 전구체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 조혈 줄기 세포를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 숙주 세포 (여기서 숙주 세포는 나이브 CD8+ T 세포, 중심 기억 CD8+ T 세포, 이펙터 기억 CD8+ T 세포 및 벌크 CD8+ T 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 CD8+ T 세포독성 림프구 세포임), 및 제2 숙주 세포 (여기서 제2 숙주 세포는 전구체 T 세포임)를 포함한다. 일부 실시양태에서, 전구체 T 세포는 조혈 줄기 세포이다.
일부 조성물에서, 세포는 NK 세포이다.
일부 실시양태에서, 세포는 CD8+이다. 일부 실시양태에서, 세포는 나이브 CD8+ T-세포, 중심 기억 CD8+ T-세포, 이펙터 기억 CD8+ T-세포 및 벌크 CD8+ T-세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 전구체 T-세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 조혈 줄기 세포 또는 NK 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 키메라 항원 수용체를 추가로 포함한다.
또한, 본원에서 제공되고 기재된 세포, 발현 벡터, 및 단백질 서열을 포함하는 키트 및 시스템이 본원에서 제공된다. 따라서, 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같은 단백질 서열; 본원에 기재된 바와 같은 발현 벡터; 및/또는 본원에 기재된 바와 같은 세포 중 1종 이상을 포함하는 키트가 본원에서 제공된다. 또한, 본원에 기재된 바와 같은 세포를 포함하며, 여기서 세포가 본원에 기재된 바와 같은 단백질 서열을 코딩하는 핵산을 포함하는 본원에 기재된 바와 같은 발현 벡터를 포함하는 것인 세포의 내부 내로 신호를 선택적으로 활성화시키기 위한 시스템이 제공된다.
이량체성 CISC 구성성분을 발현하는 세포를 제조하는 방법
본원에 기재된 일부 실시양태에서, 단백질 서열 또는 발현 벡터를 약물 조절된 시토카인 신호전달에 및/또는 이량체성 CISC 구성성분을 발현하는 세포의 선택적 확장에 사용되는 숙주 세포, 예컨대 포유동물 세포, 예를 들어, 림프구 내로 도입하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 이량체성 CISC는 리간드와의 접촉 시 세포, 예컨대 포유동물 세포의 내부에 신호를 전달하기 위한 도입된 CISC 구성성분을 갖는 세포에서 시토카인 신호전달을 허용할 수 있다. 또한, 세포, 예컨대 포유동물 세포의 선택적 확장은 단지 본원에 기재된 바와 같이 2가지 특이적 유전적 변형 사건을 겪은 그러한 세포에 대해 선택하도록 제어될 수 있다. 이들 세포의 제조는 본 개시내용에 기초하여 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것인 공지된 기법에 따라 수행될 수 있다.
일부 실시양태에서, CISC-함유 세포, 예컨대 포유동물 세포를 제조하는 방법이 제공되며, 여기서 세포는 이량체성 CISC를 발현한다. 방법은 본원에 기재된 실시양태 또는 실시양태 중 임의의 것에 따른 단백질 서열 또는 본원에 기재된 실시양태 또는 실시양태의 발현 벡터를 세포, 예컨대 포유동물 세포에 전달하고, 세포, 예컨대 포유동물 세포에 전달하는 것을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 단백질 서열은 제1 및 제2 서열을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 서열은 제1 세포외 결합 도메인, 힌지 도메인, 특정된 길이의 링커 (여기서 길이는 임의로 최적화됨), 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 제2 서열은 제2 세포외 결합 도메인, 힌지 도메인, 특정된 길이의 링커 (여기서 길이는 임의로 최적화됨), 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분을 코딩한다. 일부 실시양태에서, 스페이서는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개 아미노산 길이 또는 상기 언급된 길이 중 임의의 2개에 의해 한정되는 범위 내의 길이이다. 일부 실시양태에서, 신호전달 도메인은 인터류킨-2 신호전달 도메인, 예컨대 IL2RB 또는 IL2RG 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 세포외 결합 도메인은 FKBP 또는 FRB 또는 그의 부분을 포함하는, 라파마이신 또는 라파로그에 결합하는 결합 도메인이다. 일부 실시양태에서, 세포는 CD8+ 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 나이브 CD8+ T-세포, 중심 기억 CD8+ T-세포, 이펙터 기억 CD8+ T-세포 및 벌크 CD8+ T-세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 CD8+ T 세포독성 림프구 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 전구체 T-세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 실시양태에서, 세포는 NK 세포이다.
세포의 내부에서 신호를 활성화시키는 방법
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 세포, 예컨대 포유동물 세포의 내부에서 신호를 활성화시키는 단계를 채용한다. 방법은 본원에 기재된 바와 같은 세포, 예컨대 포유동물 세포를 제공하는 것을 포함할 수 있으며, 여기서 세포는 본원에 제시된 바와 같은 단백질 서열 또는 본원에 제시된 바와 같은 발현 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 이량체성 CISC를 코딩하는 단백질 서열을 발현하는 것, 또는 본원에 기재된 바와 같은 벡터의 발현을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포, 예컨대 포유동물 세포를 제1 및 제2 CISC 구성성분이 이량체화하는 것을 유발하고, 세포의 내부 내로 신호를 전달하는 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 라파마이신 또는 라파로그이다. 일부 실시양태에서, 이량체화를 유도하기 위한 리간드의 유효량은 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 nM 또는 상기 언급된 값 중 임의의 2개에 의해 한정되는 범위 내의 농도의 양으로 제공된다.
일부 실시양태에서, 이들 접근법에 사용되는 리간드는 예를 들어, 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP23573, 또는 AP1903, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합을 포함하는 라파마이신 또는 라파로그이다. 추가의 유용한 라파로그는 예를 들어, 라파마이신에 비해 하기 변형 중 1종 이상을 갖는 라파마이신의 변이체를 포함할 수 있다: C7, C42 및/또는 C29에서 탈메틸화, 메톡시의 제거 또는 대체; C13, C43 및/또는 C28에서 히드록시의 제거, 유도체화 또는 대체; C14, C24 및/또는 C30에서 케톤의 환원, 제거 또는 유도체화; 6-원 피페콜레이트 고리의 5-원 프롤릴 고리로의 대체; 및/또는 시클로헥실 고리 상의 대안적 치환 또는 시클로헥실 고리의 치환된 시클로펜틸 고리로의 대체. 추가의 유용한 라파로그는 노볼리무스, 피메크롤리무스, 리다포롤리무스, 타크롤리무스, 템시롤리무스, 우미롤리무스, 또는 조타롤리무스, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포, 예컨대 포유동물 세포의 내부에서 신호를 검출하는 것은 신호전달 경로의 결과인 마커를 검출하는 방법에 의해 달성될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 신호는 웨스턴 블롯, 유동 세포계측법, 또는 다른 단백질 검출 및 정량화 방법의 프로세스를 통해 세포, 예컨대 포유동물 세포에서 Akt 또는 다른 신호전달 마커의 수준을 결정함으로써 검출될 수 있다. 검출을 위한 마커는 예를 들어, JAK, Akt, STAT, NF-κ, MAPK, PI3K, JNK, ERK, 또는 Ras, 또는 세포성 신호전달 사건의 지표인 다른 세포성 신호전달 마커를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 신호의 전달은 시토카인 신호전달에 영향을 미친다. 일부 실시양태에서, 신호의 전달은 IL2R 신호전달에 영향을 미친다. 일부 실시양태에서, 신호의 전달은 시토카인 수용체의 하류 표적의 인산화에 영향을 미친다. 일부 실시양태에서, 신호를 활성화시키는 방법은 CISC-발현 세포, 예컨대 포유동물 세포에서의 증식, 및 비-CISC 발현 세포에서의 수반되는 항-증식을 유도한다.
세포성 신호전달이 일어나기 위해, 시토카인 수용체는 이량체화하거나 이종이량체화해야 할 뿐만 아니라, 이들은 입체형태적 변화가 일어나기 위해 적절한 구성이어야 한다 (Kim, M. J. et al. (2007). J. Biol. Chem., 282(19):14253-14261). 따라서, 신호전달 도메인의 정확한 입체형태적 위치화와 함께 이량체화는 적절한 신호전달을 위한 바람직한 프로세스인데, 이는 수용체 이량체화 또는 이종이량체화 단독이 수용체 활성화를 유도하는데 불충분하기 때문이다. 본원에 기재된 화학적-유도된 신호전달 복합체는 일반적으로 하류 신호전달 사건이 일어나기 위한 정확한 배향에 있다.
세포 집단의 선택적 확장의 방법
일부 실시양태에서, 본원에 기재된 방법은 세포, 예컨대 포유동물 세포의 집단을 선택적으로 확장시키는 단계를 채용한다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 세포, 예컨대 포유동물 세포를 제공하는 것을 포함하며, 여기서 세포는 본원에 제시된 바와 같은 단백질 서열 또는 본원에 제시된 바와 같은 발현 벡터를 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 본원에 기재된 바와 같은 이량체성 CISC를 코딩하는 단백질 서열을 발현하는 것, 또는 본원에 기재된 바와 같은 벡터의 발현을 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 방법은 세포, 예컨대 포유동물 세포를 제1 및 제2 CISC 구성성분이 이량체화하는 것을 유발하고, 세포의 내부 내로 신호를 전달하는 리간드와 접촉시키는 것을 포함한다. 일부 실시양태에서, 리간드는 라파마이신 또는 라파로그이다. 일부 실시양태에서 이량체화를 유도하기 위한 제공되는 리간드의 유효량은 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.07, 0.08, 0.09, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 또는 100 nM 또는 상기 언급된 값 중 임의의 2개에 의해 한정되는 범위 내의 농도의 양이다. 일부 실시양태에서, 리간드가 라파로그인 경우에, 이량체화를 유도하기 위해 제공되는 리간드의 유효량은 100 nM, 200 nM, 300 nM, 400 nM, 500 nM, 600 nM, 700 nM, 800 nM, 900 nM, 1000 nM 이상, 또는 상기 언급된 값 중 임의의 2개에 의해 한정되는 범위 내의 농도의 양이다.
일부 실시양태에서, 사용되는 리간드는 예를 들어, 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, 또는 AP23573, AP1903, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합을 포함하는 라파마이신 또는 라파로그이다. 추가의 유용한 라파로그는 예를 들어, 라파마이신에 비해 하기 변형 중 1종 이상을 갖는 라파마이신의 변이체를 포함할 수 있다: C7, C42 및/또는 C29에서 탈메틸화, 메톡시의 제거 또는 대체; C13, C43 및/또는 C28에서 히드록시의 제거, 유도체화 또는 대체; C14, C24 및/또는 C30에서 케톤의 환원, 제거 또는 유도체화; 6-원 피페콜레이트 고리의 5-원 프롤릴 고리로의 대체; 및/또는 시클로헥실 고리 상의 대안적 치환 또는 시클로헥실 고리의 치환된 시클로펜틸 고리로의 대체. 추가의 유용한 라파로그는 노볼리무스, 피메크롤리무스, 리다포롤리무스, 타크롤리무스, 템시롤리무스, 우미롤리무스, 또는 조타롤리무스, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 세포, 예컨대 포유동물 세포의 집단의 선택적 확장은 단지 2가지 별개의 유전적 변형 사건이 일어난 경우에 일어난다. 하나의 유전적 변형 사건은 이량체성 화학적-유도된 신호전달 복합체의 하나의 구성성분이고, 다른 유전적 변형 사건은 이량체성 화학적-유도된 신호전달 복합체의 다른 구성성분이다. 둘 다의 사건이 세포의 집단, 예컨대 포유동물 세포의 집단 내에서 일어나는 경우에, 화학적-유도된 신호전달 복합체 구성성분은 리간드의 존재 하에서 이량체화하여 활성 화학적-유도된 신호전달 복합체 및 세포의 내부 내로의 신호의 생성을 발생시킨다.
핵산
게놈-표적화 핵산 또는 가이드 RNA
본 개시내용은 표적 핵산 내의 특이적 표적 서열에 연관된 폴리펩티드 (예를 들어, 부위-지정된 폴리펩티드 또는 DNA 엔도뉴클레아제)의 활성을 지정할 수 있는 게놈-표적화 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 게놈-표적화 핵산은 RNA이다. 게놈-표적화 RNA는 본원에서 "가이드 RNA" 또는 "gRNA"로 지칭된다. 가이드 RNA는 적어도 관심의 표적 핵산 서열 및 CRISPR 반복부 서열에 혼성화하는 스페이서 서열을 갖는다. 유형 II 시스템에서, gRNA는 또한 tracrRNA 서열로 지칭되는 제2 RNA를 갖는다. 유형 II 가이드 RNA (gRNA)에서, CRISPR 반복부 서열 및 tracrRNA 서열은 서로 혼성화하여 듀플렉스를 형성한다. 유형 V 가이드 RNA (gRNA)에서, crRNA는 듀플렉스를 형성한다. 둘 다의 시스템에서, 듀플렉스는 가이드 RNA 및 부위-지정 폴리펩티드가 복합체를 형성하도록 부위-지정된 폴리펩티드에 결합한다. 게놈-표적화 핵산은 부위-지정된 폴리펩티드와의 그의 회합에 의해 복합체에 대한 표적 특이성을 제공한다. 따라서, 게놈-표적화 핵산은 부위-지정된 폴리펩티드의 활성을 지정한다.
일부 실시양태에서, 게놈-표적화 핵산은 이중-분자 가이드 RNA이다. 일부 실시양태에서, 게놈-표적화 핵산은 단일-분자 가이드 RNA이다. 이중-분자 가이드 RNA는 RNA의 2개의 가닥을 갖는다. 제1 가닥은 5'에서 3' 방향으로, 임의적 스페이서 연장 서열, 스페이서 서열 및 최소 CRISPR 반복부 서열을 갖는다. 제2 가닥은 최소 tracrRNA 서열 (최소 CRISPR 반복부 서열에 상보적임), 3' tracrRNA 서열 및 임의적 tracrRNA 연장 서열을 갖는다. 유형 II 시스템에서 단일-분자 가이드 RNA (sgRNA)는 5'에서 3' 방향으로, 임의적 스페이서 연장 서열, 스페이서 서열, 최소 CRISPR 반복부 서열, 단일-분자 가이드 링커, 최소 tracrRNA 서열, 3' tracrRNA 서열 및 임의적 tracrRNA 연장 서열을 갖는다. 임의적 tracrRNA 연장은 가이드 RNA에 대한 추가의 기능성 (예를 들어, 안정성)에 기여하는 요소를 가질 수 있다. 단일-분자 가이드 링커는 최소 CRISPR 반복부 및 최소 tracrRNA 서열을 연결하여 헤어핀 구조를 형성한다. 임의적 tracrRNA 연장은 1개 이상의 헤어핀을 갖는다. 유형 V 시스템에서 단일-분자 가이드 RNA (sgRNA)는 5'에서 3' 방향으로 최소 CRISPR 반복부 서열 및 스페이서 서열을 갖는다.
예시적인 게놈-표적화 핵산은 WO 2018/002719에 기재되어 있다.
공여자 DNA 또는 공여자 주형
부위-지정된 폴리펩티드, 예컨대 DNA 엔도뉴클레아제는 핵산, 예를 들어, 게놈 DNA에서 이중-가닥 파단 또는 단일-가닥 파단을 도입할 수 있다. 이중-가닥 파단은 세포의 내인성 DNA-복구 경로 (예를 들어, 상동성-의존성 복구 (HDR) 또는 비-상동성 말단 연결 또는 대안적 비-상동성 말단 연결 (A-NHEJ) 또는 미세상동성-매개된 말단 연결 (MMEJ)을 자극할 수 있다. NHEJ는 상동성 주형에 대한 필요 없이 절단된 표적 핵산을 복구할 수 있다. 이는 때때로 절단의 부위에서 표적 핵산에서 작은 결실 또는 삽입 (indel)을 발생시킬 수 있으며, 유전자 발현의 파괴 또는 변경을 발생시킬 수 있다. 상동성 재조합 (HR)으로도 공지된 HDR은 상동성 복구 주형, 또는 공여자가 이용가능한 경우에 일어날 수 있다.
상동성 공여자 주형은 표적 핵산 절단 부위에 플랭킹된 서열에 상동성인 서열을 갖는다. 자매 염색분체는 일반적으로 복구 주형으로서 세포에 의해 사용된다. 그러나, 게놈 편집의 목적을 위해, 복구 주형은 종종 외인성 핵산, 예컨대 플라스미드, 듀플렉스 올리고뉴클레오티드, 단일-가닥 올리고뉴클레오티드, 이중-가닥 올리고뉴클레오티드, 또는 바이러스 핵산으로서 공급된다. 외인성 공여자 주형으로, 추가의 또는 변경된 핵산 서열이 또한 표적 로커스 내로 혼입되게 되도록, 상동성의 플랭킹 영역 사이에 추가의 핵산 서열 (예컨대 트랜스진) 또는 변형 (예컨대 단일 또는 다중 염기 변화 또는 결실)을 도입하는 것이 통상적이다. MMEJ는 작은 결실 및 삽입이 절단 부위에서 일어날 수 있다는 점에서 NHEJ와 유사한 유전적 결과를 발생시킨다. MMEJ는 절단 부위에 플랭킹된 소수의 염기 쌍의 상동성 서열을 사용하여 선호하는 말단-연결 DNA 복구 결과를 유도한다. 일부 예에서, 뉴클레아제 표적 영역에서 잠재적 미세상동성의 분석에 기초하여 가능한 복구 결과를 예측하는 것이 가능할 수 있다.
따라서, 일부의 경우에, 상동성 재조합은 표적 핵산 절단 부위 내로 외인성 폴리뉴클레오티드 서열을 삽입하는데 사용된다. 외인성 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에서 공여자 폴리뉴클레오티드 (또는 공여자 또는 공여자 서열 또는 폴리뉴클레오티드 공여자 주형)로 용어화된다. 일부 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드, 공여자 폴리뉴클레오티드의 부분, 공여자 폴리뉴클레오티드의 카피, 또는 공여자 폴리뉴클레오티드의 카피의 부분은 표적 핵산 절단 부위 내로 삽입된다. 일부 실시양태에서, 공여자 폴리뉴클레오티드는 외인성 폴리뉴클레오티드 서열, 즉, 표적 핵산 절단 부위에서 천연적으로 발생하지 않는 서열이다.
외인성 DNA 분자가 이중-가닥 파단이 일어나는 세포의 핵 내부에 충분한 농도로 공급되는 경우에, 외인성 DNA는 NHEJ 복구 프로세스 동안 이중-가닥 파단에서 삽입되고, 따라서 게놈에의 영구 첨가가 될 수 있다. 이들 외인성 DNA 분자는 일부 실시양태에서 공여자 주형으로 지칭된다. 공여자 주형이 임의로 관련 조절 서열, 예컨대 프로모터, 인핸서, 폴리A 서열 및/또는 스플라이스 억셉터 서열과 함께 본원에 기재된 1종 이상의 시스템 구성성분에 대한 코딩 서열을 함유하는 경우에, 1종 이상의 시스템 구성성분은 게놈에서의 통합된 핵산으로부터 발현되어 세포의 생명을 위한 영구적 발현을 발생시킬 수 있다. 더욱이, 공여자 DNA 주형의 통합된 핵산은 세포가 분열하는 경우에 딸 세포에 전달될 수 있다.
이중-가닥 파단의 양 측에서 DNA 서열에 상동성을 갖는 플랭킹 DNA 서열 (상동성 아암으로 지칭됨)을 함유하는 충분한 농도의 공여자 DNA 주형의 존재 하에서, 공여자 DNA 주형은 HDR 경로를 통해 통합될 수 있다. 상동성 아암은 공여자 주형 및 이중-가닥 파단의 양 측의 서열 사이에 상동성 재조합을 위한 기질로서 작용한다. 이는 이중-가닥 파단의 양 측의 서열이 비변형된 게놈에서의 그것으로부터 변경되지 않는 공여자 주형의 오류 무함유 삽입을 발생시킬 수 있다.
HDR에 의한 편집을 위한 공급된 공여자는 현저하게 다양하지만, 일반적으로 게놈 DNA에 대한 어닐링을 허용하는 작은 또는 큰 플랭킹 상동성 아암을 갖는 의도된 서열을 함유한다. 도입된 유전적 변화에 플랭킹된 상동성 영역은 30 bp 이하, 또는 프로모터, cDNA 등을 함유할 수 있는 다중-킬로베이스 카세트만큼 클 수 있다. 단일-가닥 및 이중-가닥 올리고뉴클레오티드 공여자 둘 다가 사용될 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드는 크기에 있어서 100 nt 미만에서 많은 kb 초과로 다양하지만, 보다 긴 ssDNA는 또한 생성되고 사용될 수 있다. PCR 앰플리콘, 플라스미드, 및 미니-서클을 비롯한 이중-가닥 공여자는 종종 사용된다. 일반적으로, AAV 벡터는 공여자 주형의 전달의 매우 효과적인 수단이지만, 개별적 공여자에 대한 패키징 한계는 5kb 미만인 것으로 밝혀졌다. 공여자의 활성 전사는 HDR을 3배 증가시켰으며, 이는 프로모터의 포함이 전환을 증가시킬 수 있음을 지시한다. 반대로, 공여자의 CpG 메틸화는 유전자 발현 및 HDR을 감소시킬 수 있다.
일부 실시양태에서, 공여자 DNA는 뉴클레아제로, 또는 독립적으로 다양한 상이한 방법에 의해, 예를 들어 형질감염, 나노입자, 미세-주사, 또는 바이러스 형질도입에 의해 공급될 수 있다. 다양한 테더링 선택안은 일부 실시양태에서 HDR에 대한 공여자의 이용가능성을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 예로는 공여자를 뉴클레아제에 부착시키는 것, 인근에 결합하는 DNA 결합 단백질에 부착시키는 것, 또는 DNA 말단 결합 또는 복구에 관여하는 단백질에 부착시키는 것을 들 수 있다.
NHEJ 또는 HDR에 의한 게놈 편집 외에도, NHEJ 경로 및 HR 둘 다를 사용하는 부위-특이적 유전자 삽입이 수행될 수 있다. 조합 접근법은 가능하게는 인트론/엑손 경계를 비롯한 특정 상황에서 적용가능할 수 있다. NHEJ는 인트론에서 라이게이션에 효과적인 것으로 입증된 반면, 오류-무함유 HDR은 코딩 영역에 보다 적합할 수 있다.
실시양태에서, 게놈 내로 삽입되도록 의도되는 외인성 서열은 본원에 기재된 1종 이상의 시스템 구성성분을 포함한다. 일부 실시양태에서, 외인성 서열은 i) 항-형질 세포 구축물; ii) IL2Rβ 신호전달 도메인을 포함하는 제1 CISC 구성성분; iii) 항-세포독성 T 세포 구축물; iv) 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; v) 선택가능한 마커; vi) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 및 vii) IL2Rγ 신호전달 도메인을 포함하는 제2 CISC 구성성분 또는 그의 단편 중 1종 이상을 코딩하는 핵산을 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-형질 세포 구축물은 항-BCMA CAR이다. 일부 실시양태에서, 항-BCMA CAR은 서열식별번호: 60 또는 61의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 60 또는 61의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분의 제1 세포외 결합 도메인은 FRB 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제1 CISC 구성성분은 서열식별번호: 54의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 54의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-세포독성 T 세포 구축물은 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체이다. 일부 실시양태에서, 키메라 수용체는 서열식별번호: 65의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 65의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 라파마이신에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 FRB 도메인 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, FRB 도메인 폴리펩티드는 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 선택가능한 마커는 tLNGFR 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, tLNGFR 폴리펩티드는 서열식별번호: 66의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 66의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다. 일부 실시양태에서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드는 돌연변이체 CN 폴리펩티드이다. 일부 실시양태에서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드는 CNb30 (서열식별번호: 67)이다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분의 제2 세포외 결합 도메인은 FKBP 도메인을 포함한다. 일부 실시양태에서, 제2 CISC 구성성분은 서열식별번호: 53의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 53의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함한다.
부위-지정된 폴리펩티드 또는 DNA 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산
일부 실시양태에서, 게놈 편집의 방법 및 조성물은 따라서 부위-지정된 폴리펩티드 또는 DNA 엔도뉴클레아제를 코딩하는 핵산 서열을 사용할 수 있다. 부위-지정된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열은 DNA 또는 RNA일 수 있다. 부위-지정된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열이 RNA인 경우에, 이는 gRNA 서열에 공유 연결되거나, 별개의 서열로서 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 부위-지정된 폴리펩티드 또는 DNA 엔도뉴클레아제의 펩티드 서열은 그의 핵산 서열 대신 사용될 수 있다.
벡터
또 다른 측면에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 게놈-표적화 핵산, 본 개시내용의 부위-지정된 폴리펩티드, 및/또는 본 개시내용의 방법의 실시양태를 수행하는데 필요한 임의의 핵산 또는 단백질성 분자를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산을 제공한다. 일부 실시양태에서, 이러한 핵산은 벡터 (예를 들어, 재조합 발현 벡터)이다.
고려되는 발현 벡터는 우두 바이러스, 폴리오바이러스, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, SV40, 단순 포진 바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 레트로바이러스 (예를 들어, 뮤린 백혈병 바이러스, 비장 괴사 바이러스, 및 레트로바이러스, 예컨대 라우스 육종 바이러스, 하비 육종 바이러스, 조류 백혈증 바이러스, 렌티바이러스, 인간 면역결핍 바이러스, 골수증식성 육종 바이러스, 및 유방 종양 바이러스로부터 유래된 벡터)에 기초한 바이러스 벡터 및 다른 재조합 벡터를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 진핵생물 표적 세포에 대해 고려되는 다른 벡터는 벡터 pXT1, pSG5, pSVK3, pBPV, pMSG, 및 pSVLSV40 (파마시아 (Pharmacia))을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 진핵생물 표적 세포에 대해 고려되는 추가의 벡터는 벡터 pCTx-1, pCTx-2, 및 pCTx-3을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 다른 벡터는 이들이 숙주 세포와 혼화성인 한 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 벡터는 1종 이상의 전사 및/또는 번역 제어 요소를 갖는다. 이용되는 숙주/벡터 시스템에 따라, 구성적 및 유도성 프로모터, 전사 인핸서 요소, 전사 종결자 등을 비롯한 다수의 적합한 전사 및 번역 제어 요소 중 임의의 것이 발현 벡터에 사용될 수 있다. 일부 실시양태에서, 벡터는 바이러스 서열 또는 CRISPR 기구의 구성성분 또는 다른 요소를 불활성화시키는 자기-불활성화 벡터이다.
적합한 진핵생물 프로모터 (즉, 진핵생물 세포에서 기능적인 프로모터)의 비-제한적 예로는 시토메갈로바이러스 (CMV) 극초기, 단순 포진 바이러스 (HSV) 티미딘 키나제, 초기 및 후기 SV40, 레트로바이러스로부터의 긴 말단 반복부 (LTR), 인간 신장 인자-1 프로모터 (EF1), 닭 베타-액틴 프로모터 (CAG)에 융합된 시토메갈로바이러스 (CMV) 인핸서를 갖는 하이브리드 구축물, 뮤린 줄기 세포 바이러스 프로모터 (MSCV), 포스포글리세레이트 키나제-1 로커스 프로모터 (PGK), 및 마우스 메탈로티오네인-I로부터의 것들을 들 수 있다.
Cas 엔도뉴클레아제와 관련되어 사용되는 가이드 RNA를 비롯한 작은 RNA를 발현하기 위해, 다양한 프로모터, 예컨대 예를 들어 U6 및 H1을 비롯한 RNA 폴리머라제 III 프로모터가 유리할 수 있다. 이러한 프로모터의 설명 및 그의 사용을 향상시키기 위한 파라미터는 관련 기술분야에 공지되어 있으며, 추가의 정보 및 접근법은 규칙적으로 기재되고 있다; 예를 들어, 문헌 [Ma, H. et al. (2014). Mol. Ther. - Nucleic Acids 3:e161, doi:10.1038/mtna.2014.12]을 참조한다.
발현 벡터는 또한 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위 및 전사 종결자를 함유할 수 있다. 발현 벡터는 또한 발현을 증폭시키기 위한 적절한 서열을 포함할 수 있다. 발현 벡터는 또한 부위-지정된 폴리펩티드에 융합되어 융합 단백질을 발생시키는 비-천연 태그 (예를 들어, 히스티딘 태그, 헤마글루티닌 태그, 녹색 형광 단백질 등)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터 (예를 들어, 열 충격 프로모터, 테트라시클린-조절된 프로모터, 스테로이드-조절된 프로모터, 금속-조절된 프로모터, 에스트로겐 수용체-조절된 프로모터 등)이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 구성적 프로모터 (예를 들어, CMV 프로모터, UBC 프로모터)이다. 일부 실시양태에서, 프로모터는 공간적으로 제한된 및/또는 시간적으로 제한된 프로모터 (예를 들어, 조직 특이적 프로모터, 세포 유형 특이적 프로모터 등)이다. 일부 실시양태에서, 벡터는 유전자가 그것이 게놈 내로 삽입된 후 게놈에 존재하는 내인성 프로모터 하에서 발현되려고 하는 경우에, 숙주 세포에서 발현되는 적어도 1종의 유전자에 대한 프로모터를 갖지 않는다.
부위-지정된 폴리펩티드 또는 DNA 엔도뉴클레아제
NHEJ 및/또는 HDR로 인한 표적 DNA의 변형은 예를 들어, 돌연변이, 결실, 변경, 통합, 유전자 교정, 유전자 대체, 유전자 태그부착, 트랜스진 삽입, 뉴클레오티드 결실, 유전자 파괴, 전위 및/또는 유전자 돌연변이를 발생시킬 수 있다. 비-천연 핵산을 게놈 DNA 내로 통합시키는 프로세스는 게놈 편집의 예이다.
부위-지정된 폴리펩티드는 DNA를 절단하기 위해 게놈 편집에 사용되는 뉴클레아제이다. 부위-지정된 폴리펩티드는 1종 이상의 폴리펩티드, 또는 폴리펩티드를 코딩하는 1종 이상의 핵산 중 어느 하나로서 세포 또는 환자에게 투여될 수 있다.
CRISPR/Cas 또는 CRISPR/Cpf1 시스템의 맥락에서, 부위-지정된 폴리펩티드는 가이드 RNA에 결합할 수 있고, 이는 다시, 폴리펩티드가 지정되는 표적 DNA에서의 부위를 특정한다. 본원의 CRISPR/Cas 또는 CRISPR/Cpf1 시스템의 실시양태에서, 부위-지정된 폴리펩티드는 엔도뉴클레아제, 예컨대 DNA 엔도뉴클레아제이다. 이러한 RNA-가이드된 부위-지정된 폴리펩티드는 또한 본원에서 RNA-가이드된 엔도뉴클레아제, 또는 RGEN으로 지칭된다.
예시적인 부위-지정된 폴리펩티드는 WO 2018/002719에 기재되어 있다.
표적 서열 선택
일부 실시양태에서, 특정 참조 로커스에 비한 5' 경계 및/또는 3' 경계의 위치의 이동은 유전자 편집의 특정 적용을 용이하게 하거나 향상시키는데 사용되며, 이는 본원에 추가로 기재되고 예시되는 바와 같이, 부분적으로 편집을 위해 선택되는 엔도뉴클레아제 시스템에 의존한다.
이러한 표적 서열 선택의 제1, 비-제한적 측면에서, 많은 엔도뉴클레아제 시스템은 절단을 위한 잠재적 표적 부위의 초기 선택을 가이드하는 규칙 또는 기준, 예컨대 CRISPR 유형 II 또는 유형 V 엔도뉴클레아제의 경우에 DNA 절단 부위에 인접한 특정 위치에서 PAM 서열 모티프의 요구를 갖는다.
표적 서열 선택 또는 최적화의 또 다른, 비-제한적 측면에서, 표적 서열 및 유전자 편집 엔도뉴클레아제의 특정 조합에 대한 "오프-타겟" 활성의 빈도 (즉, 선택된 표적 서열 이외의 부위에서 일어나는 DSB의 빈도)는 온-타겟 활성의 빈도에 비해 평가된다. 일부의 경우에, 바람직한 로커스에서 정확하게 편집된 세포는 다른 세포에 비해 선택적 이점을 가질 수 있다. 선택적 이점의 예시적인, 그러나 비-제한적 예로는 복제의 향상된 속도, 지속성, 특정 조건에 대한 저항성, 환자 내로의 도입 후에 생체내에서 성공적인 이식 또는 지속성의 향상된 비율, 및 이러한 세포의 유지 또는 증가된 수 또는 생존율과 연관된 다른 속성과 같은 속성의 획득을 들 수 있다. 다른 경우에, 바람직한 로커스에서 정확하게 편집된 세포는 정확하게 편집된 세포를 확인하거나, 분류하거나, 다르게는 그에 대해 선택하는데 사용되는 1종 이상의 스크리닝 방법에 의해 양성적으로 선택될 수 있다. 선택적 이점 및 지정된 선택 방법 둘 다는 교정과 연관된 표현형을 이용할 수 있다. 일부 실시양태에서, 세포는 세포의 의도된 집단을 선택하거나 정제하는데 사용되는 새로운 표현형을 생성하는 제2 변형을 생성하기 위해 2회 이상 편집될 수 있다. 이러한 제2 변형은 선택가능한 또는 스크리닝가능한 마커에 대한 제2 gRNA를 첨가함으로써 생성될 수 있다. 일부의 경우에, 세포는 cDNA를 함유하는 DNA 단편 및 또한 선택가능한 마커를 사용하여 바람직한 로커스에서 정확하게 편집될 수 있다.
실시양태에서, 임의의 선택적 이점이 적용가능하든지, 임의의 지정된 선택이 특정 경우에 적용되어야 하든지, 표적 서열 선택은 또한 적용의 유효성을 향상시키고/거나 바람직한 표적 이외의 부위에서 비바람직한 변경을 위한 잠재성을 감소시키기 위해 오프-타겟 빈도의 고려에 의해 가이드된다. 본원에 및 관련 기술분야에서 추가로 기재되고 예시된 바와 같이, 오프-타겟 활성의 발생은 표적 부위 및 다양한 오프-타겟 부위 사이의 유사성 및 차이점, 뿐만 아니라 사용되는 특정 엔도뉴클레아제를 비롯한 다수의 인자에 의해 영향을 받는다. 오프-타겟 활성의 예측을 보조하는 생물정보학 도구는 이용가능하며, 빈번히 이러한 도구는 또한 오프-타겟 활성의 가장 가능성 있는 부위를 확인하는데 사용될 수 있으며, 이는 그 후 오프-타겟 대 온-타겟 활성의 상대 빈도를 평가하는 실험적 환경에서 평가됨으로써, 보다 높은 상대 온-타겟 활성을 갖는 서열의 선택을 허용할 수 있다. 이러한 기법의 예시적인 예는 본원에서 제공되며, 다른 것들은 관련 기술분야에 공지되어 있다.
표적 서열 선택의 또 다른 측면은 상동성 재조합 사건에 관한 것이다. 상동성의 영역을 공유하는 서열은 개재 서열의 결실을 발생시키는 상동성 재조합 사건에 대한 초점으로서 기능할 수 있다. 이러한 재조합 사건은 염색체 및 다른 DNA 서열의 복제의 정상적인 과정 동안, 및 또한 DNA 서열이 합성되고 있는 다른 시간에, 예컨대 이중-가닥 파단 (DSB)의 복구의 경우에 일어나며, 이는 정상적인 세포 복제 주기 동안 규칙적 기초로 일어나지만, 또한 다양한 사건 (예컨대 UV 광 및 DNA 파단의 다른 유도제)의 발생 또는 특정 작용제 (예컨대 다양한 화학적 유도제)의 존재에 의해 향상될 수 있다. 많은 이러한 유도제는 DSB가 게놈에서 무분별하게 일어나는 것을 유발하며, DSB는 정상적인 세포에서 규칙적으로 유도되고 복구되고 있다. 복구 동안, 원래 서열은 완전한 충실도로 재구축될 수 있지만, 일부의 경우에, 작은 삽입 또는 결실 ("indel"로 지칭됨)은 DSB 부위에 도입된다.
DSB는 또한 본원에 기재된 엔도뉴클레아제 시스템의 경우에서와 같이, 특정 위치에서 특이적으로 유도될 수 있으며, 이는 선택된 염색체 위치에서 지정된 또는 우선적 유전자 변형 사건을 유발하는데 사용될 수 있다. 상동성 서열이 DNA 복구 (뿐만 아니라 복제)의 맥락에서 재조합되는 경향성은 다수의 환경에서 이용될 수 있으며, 유전자 편집 시스템, 예컨대 상동성 지정된 복구가 "공여자" 폴리뉴클레오티드의 사용을 통해 제공된 관심의 서열을 바람직한 염색체 위치 내로 삽입하는데 사용되는 CRISPR의 하나의 적용에 대한 기초이다.
10개만큼 적은 염기 쌍 이하를 가질 수 있는 "미세상동성"의 작은 영역일 수 있는 특정 서열 사이의 상동성의 영역은 또한 바람직한 결실을 유발하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 단일 DSB는 인근의 서열과 미세상동성을 나타내는 부위에 도입된다. 이러한 DSB의 복구의 정상적인 과정 동안, 높은 빈도로 일어나는 결과는 DSB 및 수반되는 세포성 복구 프로세스에 의해 용이화되는 재조합의 결과로서의 개재 서열의 결실이다.
그러나, 일부 상황에서, 상동성의 영역 내의 표적 서열을 선택하는 것은 또한 유전자 융합 (결실이 코딩 영역에 있는 경우)을 비롯한 훨씬 더 큰 결실을 발생시킬 수 있으며, 이는 특정 상황을 고려하면 바람직할 수 있거나 바람직할 수 없다.
본원에서 제공된 실시예는 본원에 기재된 1종 이상의 시스템 구성성분을 삽입하도록 디자인된 DSB의 생성을 위한 다양한 표적 영역의 선택, 뿐만 아니라 온-타겟 사건에 비해 오프-타겟 사건을 최소화하도록 디자인된 이러한 영역 내의 특이적 표적 서열의 선택을 추가로 예시한다.
표적화된 통합
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법은 본원에 기재된 1종 이상의 시스템 구성성분을 코딩하는 핵산을 표적 세포 (예를 들어, T 세포)의 게놈에서의 특이적 위치에서 통합하는 것이며, 이는 "표적화된 통합"으로 지칭된다. 일부 실시양태에서, 표적화된 통합은 게놈 DNA에서 이중-가닥 파단을 생성하는 서열 특이적 뉴클레아제를 사용함으로써 가능하게 된다.
일부 실시양태에서 사용되는 CRISPR-Cas 시스템은 다수의 게놈 표적이 급속하게 스크리닝되어 최적 CRISPR-Cas 디자인을 확인할 수 있다는 이점을 갖는다. CRISPR-Cas 시스템은 연관된 Cas 뉴클레아제 (예를 들어 Cas9 뉴클레아제)를 DNA에서의 특이적 서열에 표적화하는 단일 가이드 RNA (sgRNA)로 지칭되는 RNA 분자를 사용한다. 이 표적화는 sgRNA 및 sgRNA의 대략 20 bp 표적화 서열 내의 게놈의 서열 사이의 왓슨-크릭 기재 쌍형성에 의해 일어난다. 표적 부위에서 결합되면, Cas 뉴클레아제는 게놈 DNA의 둘 다의 가닥을 절단하여 이중-가닥 파단을 생성한다. 특이적 DNA 서열을 표적화하는 sgRNA를 디자인하기 위한 유일한 요건은 표적 서열이 게놈 서열에 상보적인 sgRNA 서열의 3' 말단에 프로토스페이서 인접한 모티프 (PAM) 서열을 함유해야 한다는 것이다. 스트렙토코쿠스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes)로부터의 Cas9 뉴클레아제의 경우에, PAM 서열은 NRG (여기서 R은 A 또는 G이고, N은 임의의 염기임), 또는 보다 제한된 PAM 서열 NGG이다. 따라서, 게놈의 임의의 영역을 표적화하는 sgRNA 분자는 모든 PAM 모티프에 인접한 20 bp 서열을 위치시킴으로써 인 실리코 디자인될 수 있다. PAM 모티프는 진핵생물의 게놈에서 평균 바로 15 bp 상에서 일어난다. 그러나, 인 실리코 방법에 의해 디자인된 sgRNA는 상이한 효율로 세포에서 이중-가닥 파단을 생성할 것이며, 인 실리코 방법을 사용하여 일련의 sgRNA 분자의 커팅 효율을 예측하는 것은 가능하지 않다. sgRNA는 시험관내에서 급속하게 합성될 수 있기 때문에, 이는 가장 효율적인 커팅을 발생시키는 sgRNA를 확인하기 위해 주어진 게놈 영역에서 모든 잠재적 sgRNA 서열의 급속한 스크리닝을 가능하게 한다. 일반적으로 주어진 게놈 영역 내의 일련의 sgRNA가 세포에서 시험되는 경우에, 0 내지 90%의 절단 효율의 범위가 관찰된다. 인 실리코 알고리듬 뿐만 아니라 실험실 실험은 또한 임의의 주어진 sgRNA의 오프-타겟 잠재성을 결정하는데 사용될 수 있다. sgRNA의 20 bp 인식 서열에 대한 완벽한 매치는 주로 대부분의 진핵생물 게놈에서 단지 1회 일어날 것이지만, sgRNA에 대한 1개 이상의 염기 쌍 미스매치를 갖는 게놈에서의 다수의 추가의 부위가 있을 것이다. 이들 부위는 종종 미스매치의 수 또는 위치에 기초하여 예측가능하지 않는 가변적 빈도로 절단될 수 있다. 인 실리코 합성에 의해 확인되지 않은 추가의 오프-타겟 부위에서의 절단은 또한 일어날 수 있다. 따라서, 관련된 세포 유형에서 다수의 sgRNA를 스크리닝하여 가장 바람직한 오프-타겟 프로파일을 갖는 sgRNA를 확인하는 것은 치료 용도를 위한 최적 sgRNA를 선택하는 중요한 구성성분이다. 바람직한 오프 타겟 프로파일은 실제 오프-타겟 부위의 수 및 이들 부위에서의 커팅의 빈도, 뿐만 아니라 이들 부위의 게놈에서의 위치를 고려할 것이다. 예를 들어, 기능적으로 중요한 유전자, 특히 종양유전자 또는 항-종양유전자에 가까운 또는 그 내의 오프-타겟 부위는 공지된 기능을 갖지 않는 유전자간 영역에서의 부위보다 덜 바람직한 것으로 간주될 것이다. 따라서, 최적 sgRNA의 확인은 유기체의 게놈 서열의 인 실리코 분석에 의해 간단히 예측될 수 없지만, 실험적 시험을 요구한다. 인 실리코 분석은 시험하는 가이드의 수를 좁히는데 도움이 될 수 있지만, 이는 높은 온 타겟 커팅을 갖는 가이드를 예측하거나 낮은 바람직한 오프-타겟 커팅을 갖는 가이드를 예측할 수 없다. Cas 효소에 의한 절단을 촉진시키는 주어진 sgRNA의 능력은 그 영역에서 염색질 구조에 의해 결정될 수 있는 게놈 DNA에서의 그 특이적 부위의 접근성과 관련될 수 있다. 조용한 분화된 세포에서의 게놈 DNA의 대다수는 매우 응축된 이질염색질에 존재하지만, 활성적으로 전사된 영역은 큰 분자, 예컨대 Cas 단백질과 같은 단백질에 보다 접근가능한 것으로 공지된 보다 개방된 염색질 상태로 존재한다. 심지어 활성적으로 전사된 유전자 내에서, DNA의 일부 특이적 영역은 결합된 전사 인자 또는 다른 조절성 단백질의 존재 또는 부재로 인해 다른 것들보다 더 접근가능하다. 게놈에서의 또는 특이적 게놈 로커스 또는 게놈 로커스의 영역 내의 부위를 예측하는 것은 가능하지 않으며, 따라서 관련된 세포 유형에서 실험적으로 결정될 필요가 있을 것이다. 일부 부위가 삽입을 위한 잠재적 부위로서 선택되면, 예를 들어 실험적 시험과 함께 또는 없이 소수의 뉴클레오티드를 선택된 부위로부터 상류 또는 하류로 이동시킴으로써 이러한 부위에 일부 변이를 첨가하는 것이 가능할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본원에 개시된 방법에 사용될 수 있는 gRNA는 서열식별번호: 1-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1-18 중 어느 하나와 적어도 약 85% 뉴클레오티드 서열 동일성을 갖는 그의 임의의 유도체를 포함하는 스페이서를 포함한다.
핵산 변형
일부 실시양태에서, 세포 내로 도입된 폴리뉴클레오티드는 본원에 추가로 기재되고 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 예를 들어, 활성, 안정성 또는 특이성을 향상시키거나, 전달을 변경시키거나, 숙주 세포에서의 선천 면역 반응을 감소시키거나, 다른 향상을 위해 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있는 1종 이상의 변형을 갖는다.
특정 실시양태에서, 변형된 폴리뉴클레오티드는 본원에 기재된 CRISPR/Cas 시스템 (예컨대 CRISPR/Cas9/Cpf1 시스템)에 사용되며, 이 경우에 가이드 RNA (단일-분자 가이드 또는 이중-분자 가이드 중 어느 하나) 및/또는 세포 내로 도입된 Cas 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제를 코딩하는 DNA 또는 RNA는 하기 기재되고 예시된 바와 같이 변형될 수 있다. 이러한 변형된 폴리뉴클레오티드는 임의의 1종 이상의 게놈 로커스를 편집하기 위한 CRISPR/Cas 시스템에 사용될 수 있다.
이러한 용도의 비-제한적 예시의 목적을 위한 CRISPR/Cas 시스템을 사용하여, 가이드 RNA의 변형은 단일-분자 가이드 또는 이중-분자일 수 있는 가이드 RNA, 및 Cas 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제를 갖는 CRISPR/Cas 게놈 편집 복합체의 형성 또는 안정성을 향상시키는데 사용될 수 있다. 가이드 RNA의 변형은 또한 또는 대안적으로 예를 들어, 온-타겟 활성을 향상시키는데 사용될 수 있는 게놈에서의 표적 서열을 갖는 게놈 편집 복합체 사이의 상호작용의 개시, 안정성 또는 동역학을 향상시키는데 사용될 수 있다. 가이드 RNA의 변형은 또한 또는 대안적으로 특이성, 예를 들어, 다른 (오프-타겟) 부위에서의 효과에 비해 온-타겟 부위에서의 게놈 편집의 상대 비율을 향상시키는데 사용될 수 있다.
변형은 또한 또는 대안적으로 예를 들어, 세포에 존재하는 리보뉴클레아제 (RNase)에 의한 분해에 대한 그의 저항성을 증가시킴으로써, 세포에서의 그의 반감기가 증가되는 것을 유발함으로써, 가이드 RNA의 안정성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 가이드 RNA 반감기를 향상시키는 변형은 Cas 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제가 엔도뉴클레아제를 생성하기 위해 변역될 필요가 있는 RNA를 통해 편집되는 세포 내로 도입되는 실시양태에서 특히 유용할 수 있는데, 이는 엔도뉴클레아제를 코딩하는 RNA와 동시에 도입되는 가이드 RNA의 반감기를 증가시키는 것이 가이드 RNA 및 코딩된 Cas 또는 Cpf1 엔도뉴클레아제가 세포에 공존하는 시간을 증가시키는데 사용될 수 있기 때문이다.
변형은 또한 또는 대안적으로 세포 내로 도입된 RNA가 선천 면역 반응을 유발할 가능성 또는 정도를 감소시키는데 사용될 수 있다. 하기 및 관련 기술분야에 기재된 바와 같이, 작은-간섭 RNA (siRNA)를 비롯한 RNA 간섭 (RNAi)의 맥락에서 널리 특징규명된 이러한 반응은 RNA의 감소된 반감기 및/또는 시토카인 또는 면역 반응와 연관된 다른 인자의 유발과 연관되는 경향이 있다.
제한 없이, RNA의 안정성을 향상시키는 변형 (예컨대 세포에 존재하는 RNAse에 의한 그의 분해를 증가시킴으로써), 생성된 산물 (즉, 엔도뉴클레아제)의 번역을 향상시키는 변형, 및/또는 세포 내로 도입된 RNA가 선천 면역 반응을 유발할 가능성 또는 정도를 감소시키는 변형을 비롯한 1종 이상의 유형의 변형은 또한 세포 내로 도입된 엔도뉴클레아제를 코딩하는 RNA에 이루어질 수 있다.
변형, 예컨대 상기 및 다른 것들의 조합은 마찬가지로 사용될 수 있다. CRISPR/Cas 시스템의 경우에, 예를 들어, 1종 이상의 유형의 변형은 가이드 RNA (상기 예시된 것들을 포함함)에 이루어질 수 있고/거나, 1종 이상의 유형의 변형은 Cas 엔도뉴클레아제를 코딩하는 RNA (상기 예시된 것들을 포함함)에 이루어질 수 있다.
예시적인 변형된 핵산은 WO 2018/002719에 기재되어 있다.
전달
일부 실시양태에서, 본원에서 제공된 방법에 사용되는 임의의 핵산 분자, 예를 들어 본 개시내용의 게놈-표적화 핵산 및/또는 부위-지정된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 세포에의 전달을 위해 전달 비히클의 표면 내로 또는 상에 패키징된다. 고려되는 전달 비히클은 나노구, 리포솜, 양자 점, 나노입자, 폴리에틸렌 글리콜 입자, 히드로겔, 및 미셀을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 관련 기술분야에 기재된 바와 같이, 다양한 표적화 모이어티는 이러한 비히클과 바람직한 세포 유형 또는 위치의 우선적 상호작용을 향상시키는데 사용될 수 있다.
세포 내로의 본 개시내용의 복합체, 폴리펩티드, 및 핵산의 도입은 바이러스 또는 박테리오파지 감염, 형질감염, 접합, 원형질체 융합, 리포펙션, 전기천공, 뉴클레오펙션, 인산칼슘 침전, 폴리에틸렌이민 (PEI)-매개된 형질감염, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 리포솜-매개된 형질감염, 입자 총 기술, 인산칼슘 침전, 직접 미세-주사, 나노입자-매개된 핵산 전달 등에 의해 일어날 수 있다.
예시적인 전달 방법 및 시약은 WO 2018/002719에 기재되어 있다.
본 개시내용은 구체적인 대안을 참조로 상기 기재되었다. 그러나, 상기 기재된 것과는 다른 대안은 본 개시내용의 범주 내에서 동등하게 가능하다. 상기 기재된 것들과는 상이한 방법 단계는 본 개시내용의 범주 내에서 제공될 수 있다. 본원에 기재된 상이한 특색 및 단계는 기재된 것들과는 다른 조합으로 조합될 수 있다.
본원에서 복수 및/또는 단수 용어의 사용에 관하여, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 맥락 및/또는 적용에 적절한 바와 같이 복수로부터 단수로 및/또는 단수로부터 복수로 번역할 수 있다. 다양한 단수/복수 치환은 명확성을 위해 본원에 명백하게 제시될 수 있다.
일반적으로, 본원에, 및 특히 첨부된 청구범위 (예를 들어, 첨부된 청구범위의 본문)에 사용된 용어는 일반적으로 "개방된" 용어로서 의도됨 (예를 들어, 용어 "포함하는"은 "포함하나 이에 제한되지는 않는"으로 해석되어야 하고, 용어 "갖는"은 "적어도 갖는"으로 해석되어야 하고, 용어 "포함하다"는 "포함하나 이제 제한되지는 않는다"로 해석되어야 하는 등)은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것이다.
또한, 본 개시내용의 특색 또는 측면이 마쿠쉬 군의 관점에서 기재되는 경우에, 관련 기술분야의 통상의 기술자는 본 개시내용이 또한 그에 의해 마쿠쉬 군의 임의의 개별적 구성원 또는 구성원의 하위군의 관점에서 기재됨을 인식할 것이다.
제1 내지 제11 측면의 대안의 특색 중 임의의 것은 본원에서 확인된 모든 측면 및 대안에 적용가능하다. 더욱이, 제1 내지 제11 측면의 대안의 특색 중 임의의 것은 부분적으로 또는 전체적으로 본원에 기재된 다른 대안과 임의의 방식으로 독립적으로 조합가능하며, 예를 들어, 1개, 2개, 또는 3개 이상의 대안은 전체적으로 또는 부분적으로 조합가능할 수 있다. 또한, 제1 내지 제11 측면의 대안의 특색 중 임의의 것은 다른 측면 또는 대안에 대해 임의적이 될 수 있다. 다양한 예 대안 및 실행의 관점에서 상기 기재되었지만, 개별적 대안 중 하나 이상에서 기재된 다양한 특색, 측면 및 기능성은 이들이 기재된 특정 대안에 대한 그들의 적용가능성에 제한되지 않지만, 대신 이러한 대안이 기재되든지 그렇지 않든지 및 이러한 특색이 기재된 대안의 일부인 것으로 제시되든지 그렇지 않든지, 단독으로 또는 다양한 조합으로 본 출원의 다른 대안 중 하나 이상에 적용될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 본 출원의 폭 및 범주는 상기 기재된 예 대안 중 임의의 것에 의해 제한되지 않아야 한다.
본원에 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 본원에 참조로 포함된다. 참조로 포함된 간행물 및 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 함유된 본 개시내용과 상충되는 정도까지, 본 명세서는 임의의 이러한 상충되는 물질을 대신하고/거나 이에 우선하는 것으로 의도된다. 본원에 참조로 포함된 간행물 및 특허 또는 특허 출원이 본 명세서에 함유된 본 개시내용과 상충되는 정도까지, 본 명세서는 임의의 이러한 상충되는 물질을 대신하고/거나 이에 우선하는 것으로 의도된다.
본 개시내용의 하나 이상의 실시양태의 상세사항은 하기 첨부된 설명에 제시된다. 본원에 기재된 것들과 유사하거나 등가의 물질 및 방법은 본 개시내용의 실시 또는 시험에 사용될 수 있다. 본 개시내용의 다른 특색, 목적 및 이점은 설명으로부터 명백할 것이다. 설명에서, 단수 형태는 또한 맥락이 명백하게 달리 지시하지 않는다면 복수를 포함한다. 달리 정의되지 않는다면, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 이 개시내용이 속하는 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 상충되는 경우에, 본 설명이 지배할 것이다.
본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예시적 목적을 위한 것이며, 그의 관점에서 다양한 변형 또는 변화는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 시사될 것이고, 본 출원의 취지 및 이해범위 및 첨부된 청구범위의 범주 내에 포함되어야 함이 이해된다. 본원에 인용된 모든 간행물, 특허, 및 특허 출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참조로 포함된다.
본원에 제공된 본 개시내용의 일부 실시양태는 하기 비-제한적 실시예에 의해 추가로 예시된다.
실시예
물질 및 방법
시약
아데노-연관된 바이러스 (AAV)를 293 세포의 삼중 형질감염으로부터 생산하고, 아이오딕산올 구배 원심분리를 통해 정제하였다. 모든 AAV는 혈청형 2/6의 것이다. 단일-가이드 RNA (sgRNA)를 신테고 (Synthego)로부터 주문하고, 제조업자의 권고사항에 따라 사용하였다. sgRNA 서열의 표적-결합 부분은 하기와 같다: TRAC 1: 5'-ACAAAACTGTGCTAGACATG-3' (서열식별번호: 3); TRAC 2: 5'-AGAGCAACAGTGCTGTGGCC-3' (서열식별번호: 1); TRAC 3: 5'-TCTCTCAGCTGGTACACGGC-3' (서열식별번호: 2); IL2RG GC8: 5'-GGTTATCTCTGTTGGCTCCA-3' (서열식별번호: 11); IL2RG GC10: 5'-AAGGCTGATAATCAATCCCA-3' (서열식별번호: 13); 및 IL2RG GC12: 5'-CCACGGCTTCCAATGCAAAC-3' (서열식별번호: 15). Cas9 효소 (트루컷 (TrueCut) V2)를 써모 피셔 사이언티픽 (Thermo Fisher Scientific)으로부터 구입하였다. Cas9 및 sgRNA를 사용 전에 실온에서 적어도 10분 동안 포스페이트-완충 염수에서 복합체화하였다.
BCMA를 발현하는/발현하지 않는 세포주의 동종 쌍을 3가지 상이한 방식으로 생성하였다. 첫번째로, RPMI-8266 세포를 Cas9 및 BCMA의 코딩 영역에서 5'-tattaagctcagtcccaaac-3' (서열식별번호: 78) 서열을 표적화하는 sgRNA로 형질감염시켰다. 세포 풀을 PE-접합된 항-인간-BCMA 항체 (바이오레전드 (Biolegend) 357503)로 염색하고, 염색 없는 세포를 단리하였다. 두번째로, 통상적으로 BCMA-음성 K562 세포에서, BCMA 발현을 5'-ggggccactagggacaggat-3' (서열식별번호: 79)를 표적화하는 sgRNA를 사용한 AAVS1 로커스 내로의 SA-2A-BCMA-BGH 폴리A 구축물의 통합에 의해 저-수준 PPP1R12C (AAVS1) 프로모터의 제어 하에 두었다. 세포를 제한 희석에 의해 클로닝하고, BCMA 발현을 유동 세포계측법에 의해 확인하였다. 세번째로, K562 세포에서 BCMA 발현을 5'-ggggccactagggacaggat-3' (서열식별번호: 79)를 표적화하는 sgRNA를 사용한 AAVS1 로커스 내로의 MND-BCMA-BGH 폴리A 구축물의 통합에 의해 강한 MND 프로모터의 제어 하에 두었다. 세포를 제한 희석에 의해 클로닝하고, BCMA 발현을 유동 세포계측법에 의해 확인하였다. 2가지 클론을 단리하였다: 높은 BCMA 발현을 갖는 하나 및 매우 높은 BCMA 발현을 갖는 또 다른 것.
T 세포 배양
1차 인간 CD3+ T 세포를 개별적 전혈 류코팩으로부터 단리하였다. T 세포를 AIM-V 배지 플러스 5% 인간 AB 혈청 플러스 50 ng/mL IL-2에서 배양하였다. 세포를 항-CD3/CD28 자성 비드 (밀테니 바이오텍 (Miltenyi Biotec), 130-091-441)를 사용하여 자극하여 증식시켰다. 세포를 3일 동안 0.5e6개 세포/mL의 출발 농도로 1:1 비로 비드와 함께 인큐베이션하였다. 그 후, 비드를 제거하고, 세포를 형질감염 전에 1일 동안 분열하게 하였다.
T 세포 형질감염 및 감염
세포를 론자 (Lonza) 4D 뉴클레오펙터 및 프로그램 E0-115를 사용하여 60 pmol sgRNA 및 12 pmol Cas9로 이루어진 사전-복합체화된 RNP로 형질감염시켰다. 형질감염 후 1시간에, 세포를 1,000-100,000의 범위 (일반적으로 각각 50,000)의 MOI로 TRAC 유전자에 대해 BCMA-CAR/CISCβ 또는 TNP-CAR/CISCβ 표적화 구축물 및/또는 IL2RG 유전자에 대해 FRB/tLNGFR/CNb30/CISCγ 표적화 구축물을 함유하는 AAV2/6로 감염시켰다.
유동 세포계측법
유전자 편집 후 5일에, T 세포를 TRAC, IL2RG, CAR, 및 CISC의 발현에 대해 유동 세포계측법에 의해 분석하였다. TRAC 발현을 세포를 APC-접합된 마우스 항-인간 α/β TCR (클론 IP26; 바이오레전드-카탈로그# 306702)로 염색함으로써 프로빙하였다. IL2RG 발현을 마우스 항-인간 CD132 (BV421; 비디 바이오사이언시스 (BD Biosciences) 카탈로그# 566222)로 PE-접합된 것으로 모니터링하였다. BCMA CAR 발현을 비오티닐화된-BCMA (아크로 바이오시스템스 (Acro Biosystems) BC7-H82F0) 및 PE-접합된 스트렙타비딘 (비디 바이오사이언시스 카탈로그 # 554061)을 사용하여 검출하고; BCMA 및 TNP CAR 발현을 PE-접합된 염소 항-마우스-Fv F(ab)2 (잭슨 이뮤노리서치 (Jackson Immunoresearch) 115-066-072)를 사용하여 검출하였다. tLNGFR 발현을 APC-접합된 마우스 항-인간 CD271 (클론 REA844; 밀테니 바이오텍 130-112-791)로 모니터링하였다. CISC 발현을 주문-제작된 비오틴:라파마이신 접합체 및 PE-접합된 스트렙타비딘으로 가시화하였다. 모든 유동 세포계측법은 애튠 (Attune) NxT (써모피셔) 상에서 수행하였다.
세포독성 검정
5만 개의 표적 세포 (RPMI-8226 또는 RPMI-8226 BCMA-KO; K562 또는 K562 BCMA-낮음 또는 K562-BCMA 높음 또는 K562-BCMA 매우 높음)를 이플루오르 (eFluor) 670 (인비트로젠 (Invitrogen) #50-246-095)으로 표지하고, CAR T 세포와 함께 0.5:1, 1:1, 2:1, 4:1, 8:1의 이펙터:표적 비로 16시간 동안 인큐베이션하였다. 세포 풀을 DAPI (인비트로젠 #D3571)로 염색하여 죽은 세포를 검출하고, 부피 정규화를 위해 카운트브라이트 (Countbrite) 카운팅 비드 (인비트로젠 #C36950)와 혼합하고, 이플루오르 670-양성, DAPI-음성 및 이플루오르-양성, DAPI-양성 세포를 정량하였다. 퍼센트 생존율을 살아 있는 세포의 분율 x 100%로서 결정하고; 퍼센트 세포독성을 100% 마이너스 퍼센트 생존율로서 계산하였다.
IFN-γ ELISA
IFN-감마 ELISA 키트를 알앤디 시스템스 (R&D Systems)로부터 구입하고, 제조업자의 지시서에 따라 사용하였다. 배양 상청액을 16시간의 인큐베이션 후에 측정하였다.
마우스 이종이식 검정
500만개의 RPMI-8226 또는 RPMI-8226 BCMA-KO 세포를 NSG 마우스 내로 피하로 주사하였다. 2.5주의 종양 성장 후, BCMA CAR- 또는 TNP CAR-변형된 T 세포를 정맥내로 주사하고, 종양 크기를 캘리퍼스로 모니터링하였다.
CISC-매개된 세포 확장
TRAC 유전자 및 IL2RG 유전자 내로 통합된 CISC를 갖는 T 세포 풀을 AIM-V 배지 플러스 5% AB 혈청 플러스 IL-2가 없는 10 nM 라파마이신에서 성장시켰다.
실시예 1: gRNA의 특징규명
TRAC 유전자를 표적화하는 gRNA
표적화된 절단을 실행하는 TRAC 유전자에 대해 특이적인 gRNA의 능력을 평가하기 위해, 스페이서 TRAC 1 (서열식별번호: 3), TRAC 2 (서열식별번호: 1), 및 TRAC 3 (서열식별번호: 2)을 포함하는 gRNA를 신테고로부터 주문하고, 항-CD3/CD8/CD28 비드로의 3일의 활성화 후 전기천공에 의해 각각의 gRNA를 포함하는 Cas9/gRNA RNP로 형질감염된 1차 인간 CD8+ 또는 CD3+ T 세포에서 평가하였다. 형질감염 후 48시간에, 예측되는 절단 부위에 플랭킹된 PCR 프라이머를 사용하여 처리된 세포로부터 게놈 DNA를 증폭시키고, 이어서 PCR 산물을 생어 시퀀싱하는 TIDES 프로토콜 (Brinkman, E. K. et al. (2014). Nucleic Acids Res., 42(22):e168)을 사용하여 각각의 gRNA에 대한 온-타겟 부위에서의 절단 효율에 대해 세포를 분석하였다. 이중-가닥 파단이 세포의 게놈에서 생성되는 경우에, 세포는 이중-가닥 파단을 복구하려고 시도한다. 이 복구 프로세스는 오류 유발성이며, 이는 이중-가닥 파단의 부위에서 뉴클레오티드의 결실 또는 삽입을 발생시킬 수 있다. 완벽하게 복구된 파단은 Cas9 뉴클레아제에 의해 재-절단되는 반면, 뉴클레오티드의 삽입 또는 결실은 Cas9 절단을 방지할 것이기 때문에, 커팅 효율을 나타내는 삽입 및 결실의 축적이 있을 것이다. 그 후, 시퀀싱 크로마토그램 데이터를 예측되는 절단 부위에서 삽입되거나 결실된 염기의 빈도를 계산하는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 분석하였다. 삽입되거나 결실된 염기 (INDEL)의 빈도를 사용하여 전체 절단 빈도를 계산하였다. 세포를 편집 후 제2일에 INDEL 효율, 세포 생존율, 및 총 세포 카운트에 대해 분석하였으며, 이는 시험된 모든 3가지 gRNA에 대해 유사하였다 (표 1, 2회의 독립적 실험으로부터의 결과). gRNA는 CD8+ 및 CD3+ T 세포 둘 다에 대해 54% 내지 64%의 범위의 INDEL 효율을 발생시켰고, 세포 생존율은 77% 내지 89%의 범위였으며, 이는 이들 gRNA가 세포독성을 유도하지 않고 T 세포에서의 그들의 표적 부위에서 효율적으로 절단함을 지시한다.
표 1
세포를 편집 후 제7일에 유동 세포계측법에 의해 TCR 및 CD3 발현에 대해 추가로 분석하였다 (표 2). 각각의 gRNA는 CD8+ 및 CD3+ T 세포 둘 다에서 TCR 발현을 비처리된 대조군에 비해 약 90% 이상 감소시킬 수 있었다. TCR 발현에 의존하는 표면 CD3 발현은 또한 각각의 gRNA로 처리된 세포에서 감소되었다. 이들 결과는 INDEL 효율에 대한 결과를 뒷받침하며, gRNA로의 편집이 T 세포에서 TCR 발현을 억제하여, 편집된 세포에서 내인성 TCR을 통한 신호전달을 침묵시킬 수 있었음을 지시한다.
표 2
gRNA TRAC 1, TRAC 2 및 TRAC 3에 의해 매개된 TRAC 유전자에서의 공여자 주형의 표적화된 통합을 평가하기 위해, 1차 인간 CD3+ T 세포를 50,000의 감염의 다중도 (MOI)로의 통합을 위해 전기천공에 의해 각각의 gRNA를 포함하는 Cas9/gRNA RNP로 형질감염시키고, 바로 이어서 각각의 gRNA에 대해 특이적인 상동성 아암을 갖고, CISC 및 mCherry 마커를 코딩하는 공여자 주형 (서열식별번호: 94-96)을 운반하는 상응하는 AAV 벡터로 형질도입시켰다. 형질도입 후 48시간에, 세포를 mCherry 및 TCR 발현에 대해 유동 세포계측법을 사용하여 통합 효율에 대해 분석하였다. 표 3 (상이한 T 세포 로트로의 2회의 독립적 실험으로부터의 결과)에 제시된 바와 같이, 공여자 주형의 표적화된 통합은 시험된 3가지 gRNA의 각각에 대해 달성되었으며, TCR-/CISC+ 세포의 양은 약 12% 내지 약 18%의 범위였다.
표 3
IL2RG 로커스를 표적화하는 gRNA
표적화된 절단에 영향을 미치는 IL2RG 로커스에 대해 특이적인 gRNA의 능력을 평가하기 위해, IL2RG 유전자의 엑손 6을 표적화하는 스페이서 GC1 (서열식별번호: 4), GC2 (서열식별번호: 5), GC3 (서열식별번호: 6), GC4 (서열식별번호: 7), GC5 (서열식별번호: 8), GC6 (서열식별번호: 9), GC7 (서열식별번호: 10), GC8 (서열식별번호: 11), GC9 (서열식별번호: 12), GC10 (서열식별번호: 13), GC11 (서열식별번호: 14), GC12 (서열식별번호: 15), GC13 (서열식별번호: 16), GC14 (서열식별번호: 17), 및 GC15 (서열식별번호: 18)를 포함하는 15가지 gRNA를 신테고로부터 주문하고, 항-CD3/CD8/CD28 비드로의 3일의 활성화 후 전기천공에 의해 각각의 gRNA를 포함하는 Cas9/gRNA RNP로 형질감염된 1차 인간 CD3+ T 세포에서 평가하였다. 형질감염 후 48시간에, 세포를 상기 기재된 바와 같은 TIDES 프로토콜을 사용하여 각각의 gRNA에 대한 온-타겟 부위에서의 절단 효율에 대해 분석하였다. 세포를 편집 후 1일에 INDEL 효율에 대해 분석하였고, 이는 약 15% 내지 약 80%의 범위였으며, 이는 다수의 gRNA가 T 세포에서의 그들의 표적 부위에서 효율적으로 절단함을 지시한다 (표 4, 3회의 독립적 실험으로부터의 결과).
표 4
gRNA GC8, GC10, 및 GC12에 의해 매개된 ILR2G 로커스에서의 공여자 주형의 표적화된 통합을 평가하기 위해, 1차 인간 CD3+ T 세포를 50,000의 감염의 다중도 (MOI)로의 통합을 위해 전기천공 단독, 또는 바로 이어서 각각의 gRNA에 대해 특이적인 상동성 아암 (GC8에 대해 서열식별번호: 86 및 87의 상동성 아암; GC10에 대해 서열식별번호: 88 및 89의 상동성 아암; 및 GC12에 대해 서열식별번호: 90 및 91의 상동성 아암)을 갖고, CISC 및 tLNGFR 마커를 코딩하는 공여자 주형 (서열식별번호: 97)을 운반하는 상응하는 AAV 벡터로의 형질도입에 의해 각각의 gRNA를 포함하는 Cas9/gRNA RNP로 형질감염시켰다. 형질도입 후 48시간에, 세포를 tLNGFR에 대해 및 INDEL 효율에 대해 유동 세포계측법을 사용하여 통합 효율에 대해 분석하였다. 표 5 (상이한 T 세포 로트로의 2회의 독립적 실험으로부터의 결과)에 제시된 바와 같이, 공여자 주형의 표적화된 통합은 시험된 3가지 gRNA의 각각에 대해 달성되었으며, CISC+ 세포의 양 (tLNGFR 발현에 의해 지시된 바와 같음)은 약 11% 내지 약 29%의 범위였다.
표 5
오프-타겟 분석
인간 IL2RG-표적화 gRNA GC8, GC10, 및 GC12에 대한 오프-타겟 부위를 1차 인간 CD3+ 세포에서 가이드-seq (GUIDE-seq) 방법 (Tsai, S. Q. et al. (2015). Nat. Biotechnol., 33(2):187-197)을 사용하여 평가하였다. 가이드-seq는 절단 부위를 확인하는데 사용되는 경험적 방법이다. 가이드-seq는 염색체 DNA에서의 이중-가닥 파단의 부위에서 올리고뉴클레오티드의 자발적 포획에 의존한다. 간략하게, 가이드 RNA/Cas9 RNP 복합체 및 이중-가닥 올리고뉴클레오티드로의 세포의 형질감염 후, 게놈 DNA를 세포로부터 정제하고, 초음파처리하고, 일련의 어댑터 라이게이션을 수행하여 라이브러리를 생성한다. 올리고뉴클레오티드-함유 라이브러리를 고-처리량 DNA 시퀀싱으로 처리하고, 산출물을 디폴트 가이드-seq 소프트웨어를 사용하여 프로세싱하여 올리고뉴클레오티드 포획의 부위를 확인한다.
SpCas9 및 sgRNA를 함유하는 RNP의 형질감염이 없는 샘플을 병행하여 프로세싱하였다. RNP-함유 및 RNP-나이브 샘플 둘 다에서 발견되는 부위 (+/-1 kb)를 추가의 분석을 위해 배제하였다.
Y-어댑터를 커먼 어댑터 (Common Adaptor)를 8-mer 분자 지수를 함유하는 샘플 바코드 어댑터 (A01 - A16)의 각각에 어닐링함으로써 제조하였다. RNP 및 가이드-seq ODN으로 뉴클레오펙션된 CD3+ T 세포로부터 추출된 게놈 DNA를 큐빗 (Qubit) 형광계 (써모피셔 사이언티픽)를 사용하여 정량화하고, 모든 샘플을 120 μl 부피의 TE 완충제에서 400 ng으로 정규화하였다. 게놈 DNA를 코바리스 (Covaris) S220 초음파처리기에 대한 표준 작동 절차에 따라 200 bp의 평균 길이로 전단하였다. 평균 단편 길이를 확인하기 위해, 1 μl의 샘플을 테이프스테이션 (TapeStation) (애질런트 (Agilent)) 상에서 제조업자의 프로토콜에 따라 분석하였다. 전단된 DNA의 샘플을 AM퓨어 (AMPure) XP SPRI 비드를 제조업자의 프로토콜에 따라 사용하여 세정하고, 17 μl의 TE 완충제에서 용리하였다. 말단 복구 반응을 게놈 DNA 상에서 1.2 μl의 dNTP 믹스 (각각 5 mM dNTP), 3 μl의 10 x T4 DNA 리가제 완충제, 2.4 μl의 말단-복구 믹스 (End-Repair Mix), 2.4 μl의 10x 플래티넘 택 완충제 (Platinum Taq Buffer) (Mg2+ 무함유), 및 0.6 μl의 택 폴리머라제 (Taq Polymerase) (비-핫스타트) 및 14 μl 전단된 DNA 샘플 (이전의 단계로부터)을 튜브당 22.5 μl의 총 부피를 위해 혼합함으로써 수행하고, 써모사이클러에서 인큐베이션하였다 (12 ℃, 15분; 37 ℃, 15분; 72 ℃, 15분; 4 ℃ 유지). 여기에 1 μl 어닐링된 Y 어댑터 (10 μM) 및 2 μl T4 DNA 리가제를 첨가하고, 혼합물을 써모사이클러에서 인큐베이션하였다 (16 ℃, 30분; 22 ℃, 30분; 4 ℃ 유지). 샘플을 AM퓨어 XP SPRI 비드를 제조업자의 프로토콜에 따라 사용하여 세정하고, 23 μl의 TE 완충제에서 용리하였다. 1 μl의 샘플을 테이프스테이션 상에서 제조업자의 프로토콜에 따라 실행하여 단편에의 어댑터의 라이게이션을 확인하였다. 가이드-seq 라이브러리를 제조하기 위해, 14 μl 뉴클레아제-무함유 H2O, 3.6 μl 10 x 플래티넘 택 완충제, 0.7 μl dNTP 믹스 (각각 10 mM), 1.4 μl MgCl2, 50 mM, 0.36 μl 플래티넘 택 폴리머라제, 1.2 μl 센스 또는 안티센스 유전자 특이적 프라이머 (10 μM), 1.8 μl TMAC (0.5 M), 0.6 μl P5_1 (10 μM) 및 이전의 단계로부터의 10 μl의 샘플을 함유하는 반응물을 제조하였다. 이 믹스를 써모사이클러에서 인큐베이션하였다 (95 ℃, 5분, 그 후 95 ℃, 30초의 15 사이클; 2분 동안 70 ℃ (사이클당 마이너스 1 ℃); 72 ℃, 30초; 이어서 95 ℃, 30초의 10 사이클; 55 ℃, 1분; 72 ℃, 30초; 이어서 72 ℃, 5분). PCR 반응물을 AM퓨어 XP SPRI 비드를 제조업자 프로토콜에 따라 사용하여 세정하고, 15 μl의 TE 완충제에서 용리하였다. 1 μl의 샘플을 테이프스테이션 상에서 제조업자의 프로토콜에 따라 점검하여 샘플 진행을 추적하였다. 제2 PCR을 6.5 μl 뉴클레아제-무함유 H2O, 3.6 μl 10x 플래티넘 택 완충제 (Mg2+ 무함유), 0.7 μl dNTP 믹스 (각각 10 mM), 1.4 μl MgCl2 (50 mM), 0.4 μl 플래티넘 택 폴리머라제, 1.2 μl의 유전자 특이적 프라이머 (Gene Specific Primer) (GSP) 2 (센스: +, 또는 안티센스: -), 1.8 μl TMAC (0.5 M), 0.6 μl P5_2 (10 μM) 및 이전의 단계로부터의 15 μl의 PCR 산물을 혼합함으로써 수행하였다.
가이드-seq를 각각의 gRNA에 대해 다중 독립적 세포 샘플 복제물 (독립적 형질감염으로부터)에 대해 완결하였으며, 결과를 표 6 및 7에 제시한다. 이들 결과는 gRNA 스페이서 GC8, GC10, 및 GC12에 대한 일반적으로 바람직한 온-타겟/오프-타겟 프로파일을 입증한다.
표 6: CD3+ T 세포에서의 스페이서 GC8, GC10, 및 GC12로의 gRNA에 대한 가이드-seq 결과의 요약
표 7: 세포 샘플 복제물 중 적어도 2개에서의 가이드-seq에 의해 검출된 오프-타겟 부위의 상세사항
1. 위치는 게놈 레퍼런스 컨소시엄 휴먼 빌드 (Genome Reference Consortium Human Build) 38 (hg38)에서의 게놈 위치를 지칭한다. NCBI 게놈 데이터 뷰어 (Genome Data Viewer)를 사용하여 각각의 위치를 주해하였다 (www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/gdv).
오프-타겟 대 온-타겟 리드의 백분율은 gRNA가 그의 의도되는 표적에 대해 특이적인지 여부의 전체적인 제시를 제공하지만, 다른 인자는 관여될 수 있다. 예를 들어, 유기체의 생존에 요구되는 필수적인 유전자의 엑손에서의 후보 gRNA에 대한 오프-타겟 부위는 gRNA가 임상에서 사용하기에 비적합하게 할 수 있다. 한편, 비-코딩 또는 인트론성 영역에서의 오프-타겟 부위는 덜 문제를 제기할 수 있다. 치료 용도를 위해 의도되는 gRNA를 평가하는데 유용한 고려사항은 1) 오프-타겟 부위의 수, 2) 오프-타겟 부위의 위치, 3) 온-타겟 편집에 비해 오프-타겟 편집의 빈도, 및 4) gRNA 스페이서 서열에 대한 오프-타겟 부위의 상동성의 정도를 포함한다.
잠재적 오프-타겟 부위를 세포 샘플 복제물에서 실험을 재현함으로써 확인하였다. 따라서, 출원인은 IL2RG 엑손 6을 표적화하는 gRNA를 사용하여 편집된 세포에서 잠재적 오프-타겟 부위를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 다중 세포 샘플 복제물에서 검출된 오프-타겟 부위는 표 7에 보고된다. 가이드-seq에서 온-타겟 부위에 대한 각각의 오프-타겟 부위에 대한 리드 카운트의 비교는 각각의 sgRNA에 대한 오프-타겟 부위의 오프-타겟 빈도의 추정을 제공한다. 이들 데이터는 게놈 부위 및 오프-타겟 부위가 유전자의 코딩 영역 내에 놓여있는지 여부에 대한 정보와 함께 표 7에 요약된다. 프로토스페이서 인접한 모티프 (PAM)에 인접한 표적 서열에 상응하는 스페이서의 7개의 뉴클레오티드로 이루어진 스페이서 시드 서열은 쳉, 티. (Zheng, T.) 등에 의해 미스매치에 대해 민감성인 것으로 제시된 바 있다 (Zheng, T. et al. (2017). Sci. Rep., 7, 40638.). sgRNA 스페이서 시드 서열에 상응하는 미스매치를 갖는 예측되는 오프-타겟 부위는 효율적으로 편집되는 것으로 예상되지 않을 것이다. 이 시드 영역에서의 미스매치를 갖는 이러한 오프-타겟 부위는 거짓 양성일 가능성이 있다. 진정한 오프-타겟 빈도는 딥 시퀀싱 방법, 예컨대 앰플리콘 시퀀싱에 의해 확인될 수 있다 (문헌 [Medinger, R. et al. (2010). Mol. Ecol., 19(Suppl. 1):32-40] 참조).
인간 TRAC-표적화 gRNA 스페이서 TRAC 1 (서열식별번호: 3)에 대한 온-타겟 부위 및 잠재적 오프-타겟 부위를 1차 인간 CD3+ 세포에서 앰플리콘 시퀀싱을 사용하여 평가하였다. 한 쌍의 PCR 프라이머를 대략 중간에 위치한 잠재적 절단 부위를 갖는 관심의 영역의 약 200 bp를 증폭시키도록 디자인하였다. 바코드화된 앰플리콘을 RNP-처리된 및 모의-형질감염된 세포로부터 생성하고, 복합체화하고, 고-처리량 DNA 시퀀싱으로 처리하였다. 서열 리드를 탈복합체화하고, 쌍형성된-말단 리드를 정렬하고, 판다섹 (Pandaseq) 2.11 (Masella, A. P., et al. (2012). BMC bioinformatics, 13(1), 31)을 사용하여 병합하고, INDEL의 빈도를 바이오파이톤 (Biopython) 1.69 페어와이즈2 정렬기를 사용하는 주문 소프트웨어로 각각의 표적 부위에 대해 결정하였다. 각각의 표적 부위에 대해, 최소 10,000개의 서열 리드 및 평균 40,000개에 걸쳐 리드의 수집을 수행하였다. 표 8에 제시된 바와 같이, 온-타겟 부위에 대한 INDEL 빈도는 약 85%였다. 0.2% 초과의 INDEL 빈도를 갖는 3개의 잠재적 오프-타겟 부위를 확인하였지만, 이들은 시퀀싱 실행에서 잡음으로부터 발생된 것으로 보인다. 이들 결과는 gRNA 스페이서 TRAC 1에 대한 매우 바람직한 온-타겟/오프-타겟 프로파일을 지시한다.
표 8
전체적으로, CD3+ T 세포에서의 가이드-seq 및 앰플리콘 시퀀싱 분석으로부터의 결과는 스페이서 GC8, GC10, GC12, 및 TRAC 1을 갖는 gRNA가 추가의 용도를 위한, 예컨대 입양 세포 요법 또는 다른 세포-기반 요법에서 양호한 후보임을 입증하였다.
본원에 기재된 가이드-seq 및/또는 앰플리콘 시퀀싱 방법론을 사용한 인간 세포에서의 그들의 온-타겟/오프-타겟 프로파일에 대한 인간 TRAC 및 IL2RG 유전자에서의 표적 부위를 갖는 추가의 gRNA의 스크리닝은 항-BCMA CAR T 세포를 생성하는 목적을 위해 이들 유전자를 표적화하는데 사용될 수 있는 추가의 gRNA 분자를 확인하기 위한 접근법으로서 고려된다.
실시예 2:
TRAC
유전자에서의 표적화된 통합에 의한 항-BCMA CAR-발현 T 세포의 생성 및 특징규명
TRAC 유전자 내로 항-BCMA CAR을 코딩하는 발현 카세트의 표적화된 통합을 갖는 T 세포를 HDR에 의한 통합을 위해 디자인된 AAV 공여자 주형과 조합으로 TRAC-표적화 Cas9/sgRNA RNP를 사용하여 생성하였다. 일반적으로, HDR-매개된 통합을 위해 디자인된 공여자 주형은 통합 부위가 gRNA 표적 부위에 가깝도록, 예를 들어 10 bp 미만 떨어지도록 구성되어야 한다 (blog.addgene.org/crispr-101-homology-directed-repair). AAV 공여자 주형은 그 자신의 프로모터를 갖는 발현 카세트를 함유하였으며, RNP에서 sgRNA에 대한 표적 부위를 포함하는 상동성 아암에 의해 플랭킹되었다 (도 1, 공여자 주형 구축물 #1 및 #6).
1차 인간 CD3+ T 세포를 개별적 전혈 류코팩으로부터 단리하였다. 단리된 T 세포를 AIM-V 배지 플러스 5% 인간 AB 혈청 플러스 50 ng/mL IL-2에서 배양하였다. 세포를 항-CD3/CD28 자성 비드 (밀테니 바이오텍, 130-091-441)를 3일 동안 0.5e6개 세포/mL의 출발 농도로 1:1 비로 사용하여 자극하여 증식시켰다. 그 후, 비드를 제거하고, 세포를 형질감염 전에 1일 동안 분열하게 하였다.
TRAC 유전자를 표적화하는 Cas9/sgRNA RNP를 60 pmol TRAC 3 sgRNA (스페이서 서열: TCTCTCAGCTGGTACACGGC (서열식별번호: 2)) 및 12 pmol Cas9 (트루컷 V2, 써모 피셔 사이언티픽)를 포스페이트-완충 염수에서 적어도 10분 동안 실온에서 배합함으로써 제조하였다. 세포를 론자 4D 뉴클레오펙터 및 프로그램 E0-115를 사용하여 RNP로 형질감염시켰다. 형질감염 후 1시간에, 세포를 20,000의 MOI로 CD28 공동-자극성 도메인을 갖는 항-BCMA CAR (#1 TRAC 3, 서열식별번호: 20), 4-1BB 공동-자극성 도메인을 갖는 항-BCMA CAR (#6 TRAC 3, 서열식별번호: 35), CD28 공동-자극성 도메인을 갖는 항-TNP CAR (서열식별번호: 92), 또는 4-1BB 공동-자극성 도메인을 갖는 항-TNP CAR (서열식별번호: 93)의 발현을 위해 공여자 AAV2/6 벡터로 감염시켰다.
편집 후 5일에, 세포를 항-마우스 Fv-비오틴, 이어서 스트렙타비딘-PE로 염색하고, 유동 세포계측법에 의해 분석하였다. 표 9에 제시된 바와 같이, 항-BCMA CAR 공여자로 처리된 T 세포의 9% 내지 12%가 CAR 발현을 나타내었다. 이들 결과는 T 세포에서 TRAC 유전자 내로의 발현 카세트의 표적화된 통합이 통합된 카세트로부터의 CAR의 발현을 허용함을 입증한다.
표 9
실시예 3: TRAC 및 CAR 발현의 동시 분석
TCR 발현에 대한 TRAC 유전자 내로의 이종 서열의 표적화된 통합의 효과를 평가하기 위해, 실시예 2에서와 같이 처리된 T 세포를 처리 후 5일에 항-α/β TCR 항체 및 비오티닐화된 BCMA/스트렙타비딘-PE로 동시에 염색하고, 유동 세포계측법에 의해 분석하였다. T 세포의 대략 90%는 TRAC-표적화 Cas9/sgRNA RNP로 처리된 경우에 TCR 발현을 결여하였으며, TRAC-표적화 Cas9/sgRNA RNP 및 항-BCMA CAR AAV 공여자로 처리된 T 세포의 18% 내지 22%는 TCR-음성이고, 항-BCMA CAR을 발현하였다 (표 10). 이들 결과는 TRAC-표적화 Cas9/gRNA RNP를 사용하여 T 세포를 편집하는 것이 편집된 세포에서 TCR 발현을 넉아웃시키는데 유효하였음을 지시한다.
표 10
실시예 4: 형질감염 후 제12일까지의 CAR 지속성
항-BCMA CAR T 세포에서의 항-BCMA CAR 발현의 지속성을 평가하기 위해, 실시예 2에서와 같이 처리된 T 세포를 형질감염 후 제12일에 항-α/β TCR 항체 및 비오티닐화된 BCMA/스트렙타비딘-PE로 동시에 염색하고, 유동 세포계측법에 의해 분석하였다. 세포의 대략 90%는 TRAC-표적화 RNP로 처리된 경우에 TCR 발현을 결여하였으며, 항-BCMA CAR AAV 공여자로 처리된 T 세포의 22% 내지 30%는 TCR-음성이고, 항-BCMA CAR을 발현하였다 (표 11). 이들 결과는 항-BCMA CAR 발현이 편집된 T 세포에서 적어도 형질감염 후 제12일까지 지속함을 입증한다.
표 11
또 다른 실험에서, 실시예 2에서와 같이 처리된 T 세포를 형질감염 후 제12일에 각각의 CAR의 세포외 항체 모이어티를 인식하는 항-마우스 항체로 염색하고, 이어서 유동 세포계측법 분석에 의해 CAR 발현에 대해 평가하였다. α/β TCR 발현은 항-마우스 가변 쇄 CAR 검출 시약이 마우스 TCR 항체를 간섭하기 때문에 이 실험에서 평가되지 않았다. T 세포의 18% 내지 30%가 CAR을 발현하였다 (표 12).
표 12
실시예 5: 보다 많은 AAV는 보다 많은 CAR-양성 세포를 제공한다
항-BCMA CAR 발현에 대한 형질도입에 사용된 AAV 공여자의 양의 효과를 평가하기 위해, T 세포를 실시예 2에서와 같이, 그러나 25,000, 50,000, 또는 100,000 중 어느 하나의 MOI로 편집하였다. 세포를 편집 후 5일에 항-α/β TCR 항체 및 비오티닐화된 BCMA/스트렙타비딘-PE로 동시에 염색하고, 유동 세포계측법에 의해 분석하였다. 세포의 95% 초과는 TRAC-표적화 RNP로 처리된 경우에 TCR 발현을 결여하였고, T 세포의 20% 내지 60%는 항-BCMA CAR을 발현하였으며, 항-BCMA CAR+ 세포의 양은 AAV 공여자 MOI와 양성적으로 상관되었다 (표 13). 이들 결과는 공여자 통합 효율에 대한 AAV 공여자 MOI에 대한 용량-반응을 입증한다.
표 13
실시예 6: 항-BCMA CAR T 세포는 BCMA-발현 세포에 대해 세포독성이다
이 실시예는 BCMA-발현 세포에 대한 항-BCMA CAR T 세포의 세포독성을 입증한다. T 세포를 TRAC 3 또는 TRAC 1 sgRNA 중 어느 하나를 함유하는 RNP로 형질감염시킨 후, 50,000의 MOI로 상응하는 AAV 공여자 (α-BCMA/CD28/CD3z TRAC 1, 서열식별번호: 21; α-BCMA/CD28/CD3z TRAC 3, 서열식별번호: 20; 또는 α-BCMA/41BB/CD3z-CISCβ TRAC 1, 서열식별번호: 36)로 감염시켰다. 형질감염 후 14 (TRAC 1 sgRNA) 또는 22 (TRAC 3 sgRNA)일에, T 세포를 8:1의 이펙터:표적 비로 표적 세포로서 야생형 K562 세포 (비-BCMA-발현) 또는 K562 매우 높은-BCMA (K562 VH-BCMA) 세포 (BCMA-발현) 중 어느 하나로의 세포독성 검정에 사용하였다. K562 VH-BCMA 표적 세포 생존율 (DAPI 염색에 의해 결정된 바와 같음)은 항-BCMA CAR T 세포와의 공동-배양 후 93%에서 26%로 떨어진 반면, K562 표적 세포 생존율은 항-BCMA CAR T 세포와의 공동-배양 후 약 82%에서 잔류하였으며 (표 14), 이는 항-BCMA CAR T 세포가 BCMA-발현 세포에 대해 세포독성이고, 세포독성은 BCMA 발현에 의존함을 입증한다.
표 14
실시예 7: 세포독성은 BCMA에 결합하는 CAR을 요구한다
이 실시예는 BCMA-발현 세포에 대한 CAR T 세포의 세포독성이 BCMA에 대한 CAR 특이성에 의존함을 입증한다. T 세포를 TRAC 1 sgRNA를 함유하는 RNP로 형질감염시킨 후, 50,000의 MOI로 항-TNP CAR을 코딩하는 상응하는 AAV 공여자 (α-TNP/CD28/CD3ζ CAR TRAC 1, 서열식별번호: 92; 또는 α-TNP/41BB/CD3ζ CAR TRAC 1, 서열식별번호: 93) 또는 항-BCMA CAR을 코딩하는 상응하는 AAV 공여자 (α-BCMA/CD28/CD3z TRAC 1, 서열식별번호: 21; 또는 α-BCMA/41BB/CD3z-CISCβ TRAC 1, 서열식별번호: 36)로 감염시켰다. 형질감염 후 14일에, T 세포를 8:1의 이펙터:표적 비 (E:T)로 표적 세포로서 K562 매우 높은-BCMA (K562 VH-BCMA)로의 세포독성 검정에 사용하였다. 표적 세포 생존율은 항-BCMA CAR T 세포에의 노출 후에 93%에서 약 40%로 떨어진 반면, 항-TNP CAR T 세포에의 노출은 생존율을 단지 약 10% 감소시켰다 (표 15). 이들 결과는 항-BCMA CAR 특이성에 대한 항-BCMA CAR T 세포 세포독성의 의존성을 입증한다.
표 15
41BB 공동자극성 도메인을 갖는 항-BCMA CAR 구축물을 사용하여 CAR-특이적 세포독성을 추가로 입증하기 위한 추가의 실험을 수행하였다. TNP-특이적 또는 BCMA-특이적 CAR T 세포 중 어느 하나를 상기 기재된 바와 같이 다양한 CAR T:표적 세포 비 (2:1 내지 16:1)로 K562 VH-BCMA 세포와 공동-배양하였다. 공동-배양 후, 세포를 DAPI로 염색하고, DAPI-양성 및 DAPI-음성 세포의 빈도를 측정하였다. BCMA-특이적 CAR T 세포에의 노출은 배양물의 생존율이 대략 비율로 E:T 비로 감소하는 것을 유발하여 16:1 E:T 비에서 약 13%의 최하점에 도달하였으나, TNP-특이적 CAR T 세포는 그렇지 않았다 (표 16). CAR T 노출의 부재 하에서, 표적 세포는 95% 초과 생존성이었다 (제시되지 않음). 이들 결과는 BCMA-발현 표적 세포의 살해에 대한 CAR T 이펙터 세포의 BCMA 특이성의 요구를 추가로 입증한다.
표 16
1: 이펙터-대-표적 (E:T) 비
실시예 8: IL2RG 로커스 내로의 표적화된 통합
이 실시예는 유전자를 표적화하는 gRNA 및 혼화성 공여자 주형을 사용한 IL2RG 유전자 내로의 표적화된 통합을 입증한다. T 세포를 IL2RG 유전자의 엑손 6을 표적화하는 GC8, GC10, 또는 GC12 sgRNA를 함유하는 RNP로 형질감염시킨 후, 50,000의 MOI로 FRB/tLNGFR/CNb30/CISC-감마 공여자 AAV (서열식별번호: 40)로 감염시켰다. RNP 단독 및 AAV 단독으로의 조건은 대조군으로서 포함되었다. 세포를 항-IL2RG 및 항-LNGFR 항체로 동시에 염색하고, 형질감염 후 1.5일에 유동 세포계측법에 의해 분석하였다. 세포의 4, 5, 및 6 퍼센트는 각각 GC8, GC10, 및 GC12 sgRNA를 사용하는 경우에 tLNGFR 트랜스진을 발현하였다 (표 17). 모든 RNP-처리된 샘플에 대해, 세포의 85% 초과는 IL2RG 발현을 소실하였다.
표 17
또 다른 실험에서, T 세포를 GC8, GC10, 또는 GC12 sgRNA를 함유하는 RNP로 형질감염시킨 후, 예를 들어, 50,000의 MOI로, 통합된 트랜스진의 재절단을 방지하고, 정확한 상동성-의존성 DNA 복구를 촉진시키도록 돌연변이된 상응하는 sgRNA-특이적 FRB/tLNGFR/CNb30/CISC-감마 공여자 AAV (예를 들어, GC8, GC10, 또는 GC12 sgRNA에 대해 각각 서열식별번호: 41, 42, 또는 43)로 감염시켰다. 세포를 항-IL2RG 및 항-LNGFR 항체로 동시에 염색하고, tLNGFR 트랜스진 발현 및 IL2RG 발현에 대해 형질감염 후 (예를 들어, 형질감염 후 1.5일) 유동 세포계측법에 의해 분석하였다.
실시예 9:
TRAC
유전자 및
IL2RG
유전자 내로의 동시 TI
T 세포를 IL2RG-표적화 RNP (예를 들어, GC8, GC10, 또는 GC12 RNP)와 함께 TRAC-표적화 RNP (예를 들어, TRAC 3, TRAC 2, 또는 TRAC 1 RNP)로 형질감염시켰다. 형질감염 후 (예를 들어, 형질감염 후 30분), 세포를 TRAC 유전자에 대해 표적화된 항-BCMA CAR/CISC-b를 코딩하는 공여자 AAV (예를 들어, 서열식별번호: 28-39) 및 IL2RG 유전자에 대해 표적화된 FRB/tLNGFR/CNb30/CISC-감마를 코딩하는 공여자 AAV (예를 들어, 서열식별번호: 40-44)로 감염시켰다 (예를 들어, 둘 다 50,000의 MOI로). 세포를 라파마이신 또는 라파로그 (예를 들어, 1 nM 라파마이신)를 함유하는 배지 내로 회수하고, 라파마이신/라파로그-함유 배지에서 유지하였다. 세포를 형질감염 후 (예를 들어, 형질감염 후 5일) TRAC 발현, CAR 발현, IL2RG 발현, 및/또는 tLNGFR 발현에 대해 유동 세포계측법에 의해 검정하였다.
이중 표적화된 통합의 효율을 예시하기 위해 유동 세포계측법을 수행하였다. CD8+ T 세포를 CD3/CD28 비드로 3일 동안 자극하고, 비드를 제거한 후, 1일 후에 세포를 TRAC 1 RNP + BCMA CAR-CISCβ AAV 및 IL2RG GC12 RNP + FRB-tLNGFR-CNb30-CISCγ AAV로 처리하였다. 공여자 AAV는 25,000의 감염의 다중도로 사용되었고; TRAC 1 RNP는 30 pmol 가이드 RNA 및 6 pmol Cas9를 함유하였으며; IL2RG GC12 RNP는 60 pmol 가이드 RNA 및 12 pmol Cas9를 함유하였다. 세포를 1 nM 라파마이신을 함유하는 배지 내로 회수하고, 라파마이신-함유 배지에서 유지하였다. 처리 후 1, 3, 및 7일에, 세포를 tLNGFR의 존재에 대해 및 항-BCMA CAR의 존재에 대해 유동 세포계측법에 의해 분석하였다. 이들 실험에서, 단일 로커스 표적화의 효율은 약 20%의 범위인 반면, 이중-표적화 빈도 (예를 들어, 둘 다의 로커스에서의 동시 표적화된 통합)는 대략 8%였다 (표 18).
표 18
실시예 10: TRAC 및 IL2RG 내로의 동시 TI는 CISC-조절가능한 T 세포를 제공한다
실시예 9로부터의 변형된 세포 또는 상응하는 비변형된 세포를 라파마이신의 존재 하에서 예를 들어, 2주 동안 또는 적어도 100배 확장으로 확장시켰다. 이 확장 후, 세포를 임의로 IL-2 (예를 들어, 100 ng/mL IL-2)로 보충된 라파마이신-무함유 배지 내로 옮기고, 세포의 생존율을 모니터링하였다 (예를 들어, 7일 동안 매일 모니터링함).
실시예 11: TRAC 및 IL2RG 내로의 동시 TI는 시클로스포린-저항성 세포를 제공한다
실시예 9로부터의 변형된 세포 또는 상응하는 비변형된 세포를 시클로스포린A 및 라파마이신 (또는 라파로그)의 존재 하에서 성장시키고, 세포의 증식 및/또는 생존율을 모니터링하였다.
실시예 12: TRAC 및 IL2RG 내로의 동시 TI는 BCMA- 및 B2M-CAR-발현 세포를 제공한다
T 세포를 IL2RG-표적화 RNP (예를 들어, GC8, GC10, 또는 GC12 RNP)와 함께 TRAC-표적화 RNP (예를 들어, TRAC 3, TRAC 2, 또는 TRAC 1 RNP)로 형질감염시켰다. 형질감염 후 (예를 들어, 형질감염 후 30분), 세포를 TRAC에 대해 표적화된 항-BCMA CAR/CISC-b를 코딩하는 공여자 AAV (예를 들어, 서열식별번호: 28-39) 및 IL2RG에 대해 표적화된 B2M-CAR/FRB/CNb30/CISC-감마를 코딩하는 공여자 AAV (예를 들어, 서열식별번호: 44)로 감염시켰다 (예를 들어, 둘 다 50,000의 MOI로). 세포를 라파마이신 (예를 들어, 1 nM 라파마이신)을 함유하는 배지 내로 회수하고, 라파마이신-함유 배지에서 유지하였다. 세포를 형질감염 후 (예를 들어, 형질감염 후 5일) TRAC 발현, 항-BCMA CAR 발현, IL2RG 발현, 및/또는 B2M CAR 발현에 대해 유동 세포계측법에 의해 검정하였다.
실시예 13: BCMA/B2M CAR T 세포는 2가지 상이한 표적 세포 유형을 살해한다
실시예 12로부터의 변형된 세포 및 상응하는 비변형된 세포를 BCMA-발현 표적 세포 또는 변형된 세포가 유래되는 비관련된 T 세포 공여자로부터 유래된 T 림프구 표적 세포로 실시예 6 및 7에 기재된 바와 같은 세포독성 검정에 사용하였다.
실시예 14: BCMA CAR T 세포는 생체내에서 다발성 골수종 세포를 살해한다
실시예 5 및 실시예 9로부터의 변형된 세포를 확립된 이종이식 다발성 골수종 종양 (예를 들어, RPMI-8226 세포주 또는 RPMI-8226 세포의 BCMA-음성 풀로부터 유래됨)을 갖는 NSG 마우스 내로 정맥내로 주사하였다. 종양 크기를 모니터링하였다 (예를 들어, 주사 후 2주 동안 매일 모니터링함).
500만개의 RPMI-8226 세포를 NSG 마우스 내로 삽입하고, 종양을 형성하게 하였다. 19일의 종양 성장 후, 마우스를 PBS, 800만개의 TNP CAR T 세포, 또는 800만개의 BCMA CAR T 세포로 주사하였다. 비처리된 마우스, 항-TNP CAR T 세포로 처리된 마우스, 및 항-BCMA CAR T 세포로의 처리에 반응하여 종양의 퇴행을 갖는 마우스를 희생시키고, 종양을 분리하고, 생성된 세포 현탁액을 각각의 종양을 침윤한 CAR T 세포에 대한 마커로서 인간 CD45에 대해 유동 세포계측법에 의해 분석하였다 (CD45는 백혈구 마커이고, RPMI-8226 세포에서 발현되지 않음). 단지 항-BCMA CAR T 세포로 처리된 마우스만이 투여된 인간 T 세포의 종양 침윤을 나타내었으며, 대조군 마우스 및 항-TNP CAR T 세포로 처리된 마우스에 대해 각각 0.05% 및 0.19%에 비해, 종양으로부터의 세포의 12.00%는 hCD45+이었다. hCD45+ 세포의 이 집단을 인간 CD8 및 CAR 발현에 대해 유동 세포계측법에 의해 추가로 분석하였다. 표 19에 제시된 바와 같이, hCD45+ 종양 침윤 림프구 (TIL)의 약 96%는 CD8+이고, 14.66%는 CD8+ 및 CAR+이었다. 이들 결과는 투여된 림프구의 종양 침윤이 항-BCMA CAR T 세포 처리-특이적이었음을 입증한다. 고갈 마커, 예컨대 LAG3, TIM3, 및 PD1은 검출가능하지 않았다 (제시되지 않음).
표 19
실시예 15: CAR-특이적 및 항원-특이적 T 세포 탈과립화
CAR을 발현하도록 편집된 T 세포에서 탈과립화를 평가하기 위해, 항-TNP CAR T 세포 또는 항-BCMA CAR T 세포를 항-CD107a 항체 (CD107a는 세포독성 T 세포에서 탈과립화에 대한 마커임) 및 모넨신 (CD107a의 내재화를 회피하기 위해)의 존재 하에서 BCMA 단백질, K562 세포, 또는 K562 VH-BCMA 세포와 함께 18시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 세포를 CD107a 발현에 대해 유동 세포계측법에 의해 분석하였으며, 결과를 표 20에 제시한다. 항-BCMA CAR+ T 세포 + BCMA 단백질 조건에서 항-BCMA CAR+ T 세포의 백분율은 25%이고 (데이터는 제시되지 않음), 이 조건에서 탈과립화된 세포의 백분율은 22%였으며, 이는 BCMA 단백질로 처리된 항-BCMA CAR+ T 세포의 거의 전부가 탈과립화에 대해 활성화되었음을 시사한다. 대조적으로, 항-TNP CAR T 세포 + BCMA 단백질 조건에서 세포의 단지 0.24%만이 탈과립화되었다. 이들 결과는 항-BCMA CAR T 세포의 CAR-특이적, 항원-특이적 T 세포 탈과립화를 입증한다. K562 VH-BCMA 세포로는 보다 약한 자극이 관찰되었으며, 탈과립화는 여전히 표적-특이적 및 CAR-특이적이었다.
표 20
SEQUENCE LISTING
<110> Casebia Therapeutics Limited Liability Partnership
Cost, Gregory
<120> METHODS AND COMPOSITIONS OF PLASMA CELL DEPLETION
<130> 052984-515001WO
<150> 62/663,974
<151> 2018-04-27
<150> 62/773,058
<151> 2018-11-29
<160> 108
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC gRNA spacer, TRAC 2
<400> 1
agagcaacag tgctgtggcc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC gRNA spacer, TRAC 3
<400> 2
tctctcagct ggtacacggc 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC gRNA spacer, TRAC 1
<400> 3
acaaaactgt gctagacatg 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2Rg gRNA spacer, GC1
<400> 4
accagtgcct ggcatgtagt 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2Rg gRNA spacer, GC2
<400> 5
ccagtgcctg gcatgtagta 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2Rg gRNA spacer, GC3
<400> 6
cagtgcctgg catgtagtag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2Rg gRNA spacer, GC4
<400> 7
gtaggggcac aacaaatata 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2Rg gRNA spacer, GC5
<400> 8
gaatcctttc ctgtttgcat 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2Rg gRNA spacer, GC6
<400> 9
cctgtttgca ttggaagccg 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2Rg gRNA spacer, GC7
<400> 10
gaagccgtgg ttatctctgt 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2Rg gRNA spacer, GC8
<400> 11
ggttatctct gttggctcca 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2Rg gRNA spacer, GC9
<400> 12
gttatctctg ttggctccat 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2Rg gRNA spacer, GC10
<400> 13
aaggctgata atcaatccca 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2Rg gRNA spacer, GC11
<400> 14
ggagccaaca gagataacca 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2Rg gRNA spacer, GC12
<400> 15
ccacggcttc caatgcaaac 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2Rg gRNA spacer, GC13
<400> 16
gcttccaatg caaacaggaa 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2Rg gRNA spacer, GC14
<400> 17
tagaaaaaag aaaagcaaag 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2Rg gRNA spacer, GC15
<400> 18
ttgtgcccct actacatgcc 20
<210> 19
<211> 3469
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC AAV 1 TRAC 2 HA TRAC 2-C11D5.3-CD8-CD28-CD3z-HA TRAC 2
<400> 19
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgcc caagattgat agcttgtgcc tgtccctgag 180
tcccagtcca tcacgagcag ctggtttcta agatgctatt tcccgtataa agcatgagac 240
cgtgacttgc cagccccaca gagccccgcc cttgtccatc actggcatct ggactccagc 300
ctgggttggg gcaaagaggg aaatgagatc atgtcctaac cctgatcctc ttgtcccaca 360
gatatccaga accctgaccc tgccgtgtac cagctgagag actctaaatc cagtgacaag 420
tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct caaacaaatg tgtcacaaag taaggattct 480
gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta gacatgaggt ctatggactt caagagcaac 540
agtgctgtgt gaatgaatga ttaattaata aaagatcttt attttcatta gatctgtgtg 600
ttggtttttt gtgtgatcct cgagggaatg aaagacccca cctgtaggtt tggcaagcta 660
gcttaagtaa cgccattttg caaggcatgg aaaatacata actgagaata gagaagttca 720
gatcaaggtt aggaacagag agacagcaga atatgggcca aacaggatat ctgtggtaag 780
cagttcctgc cccggctcag ggccaagaac agatggtccc cagatgcggt cccgccctca 840
gcagtttcta gagaaccatc agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga aaatgaccct 900
gtgccttatt tgaactaacc aatcagttcg cttctcgctt ctgttcgcgc gcttctgctc 960
cccgagctca ataaaagagc ccacaacccc tcactcggcg cgcgccagtc cggtaccagt 1020
cgccaccatg gccctgcctg tgacagctct gctcctccct ctggccctgc tgctccatgc 1080
cgccagaccc gacatcgtgc tgacccagag cccccccagc ctggccatgt ctctgggcaa 1140
gagagccacc atcagctgcc gggccagcga gagcgtgacc atcctgggca gccacctgat 1200
ccactggtat cagcagaagc ccggccagcc ccccaccctg ctgatccagc tcgccagcaa 1260
tgtgcagacc ggcgtgcccg ccagattcag cggcagcggc agcagaaccg acttcaccct 1320
gaccatcgac cccgtggaag aggacgacgt ggccgtgtac tactgcctgc agagccggac 1380
catcccccgg acctttggcg gaggcaccaa actggaaatc aagggcagca ccagcggctc 1440
cggcaagcct ggctctggcg agggcagcac aaagggacag attcagctgg tgcagagcgg 1500
ccctgagctg aagaaacccg gcgagacagt gaagatcagc tgcaaggcct ccggctacac 1560
cttcaccgac tacagcatca actgggtgaa aagagcccct ggcaagggcc tgaagtggat 1620
gggctggatc aacaccgaga caagagagcc cgcctacgcc tacgacttcc ggggcagatt 1680
cgccttcagc ctggaaacca gcgccagcac cgcctacctg cagatcaaca acctgaagta 1740
cgaggacacc gccacctact tttgcgccct ggactacagc tacgccatgg actactgggg 1800
ccagggcacc agcgtgaccg tgtccagctt cgtgcccgtg ttcctgcccg ccaaacctac 1860
caccacccct gcccctagac ctcccacccc agccccaaca atcgccagcc agcctctgtc 1920
tctgcggccc gaagcctgta gacctgctgc cggcggagcc gtgcacacca gaggcctgga 1980
cttcgcctgc gacatctaca tctgggcccc tctggccggc acctgtggcg tgctgctgct 2040
gagcctggtg atcaccctgt actgcaacca ccggaacaga agcaagcgga gccggctgct 2100
gcacagcgac tacatgaaca tgaccccaag acggcctggc cccacccgga agcactacca 2160
gccttacgcc cctcccagag acttcgccgc ctaccggtcc agagtgaagt tcagcagatc 2220
cgccgacgcc cctgcctacc agcagggaca gaaccagctg tacaacgagc tgaacctggg 2280
cagacgggaa gagtacgacg tgctggacaa gcggagaggc cgggaccccg agatgggcgg 2340
aaagcccaga cggaagaacc cccaggaagg cctgtataac gaactgcaga aagacaagat 2400
ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg aggcgcggca agggccacga 2460
tggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc tacgacgccc tgcacatgca 2520
ggccctgccc cccagatgaa agcttgataa tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag 2580
attgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat 2640
gcctttgtat catgctattg cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc 2700
ctggttagtt cttgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg 2760
ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggaacttgtt tattgcagct tataatggtt 2820
acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta 2880
gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttacgccgg cgtgagcctg gagcaacaaa 2940
tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta ttccagaaga caccttcttc 3000
cccagcccag gtaagggcag ctttggtgcc ttcgcaggct gtttccttgc ttcaggaatg 3060
gccaggttct gcccagagct ctggtcaatg atgtctaaaa ctcctctgat tggtggtctc 3120
ggccttatcc attgccacca aaaccctctt tttactaaga aacagtgagc cttgttctgg 3180
cagtccagag aatgacacgg gaaaaaagca gatgaagaga aggtggcagg agagggcacg 3240
tggcccagcc tcagtctctc caactgagtt cctgcctgcc tgcctttgct cagactgttt 3300
gccccttact gctcttctag gcctccctag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc 3360
tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc 3420
tttgcccggg cggcctcagt gagcgagcga gcgcgcagct gcctgcagg 3469
<210> 20
<211> 3469
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC AAV 1 TRAC 3 HA TRAC 3-C11D5.3-CD8-CD28-CD3z-HA TRAC 3
<400> 20
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgcc ccatgcctgc ctttactctg ccagagttat 180
attgctgggg ttttgaagaa gatcctatta aataaaagaa taagcagtat tattaagtag 240
ccctgcattt caggtttcct tgagtggcag gccaggcctg gccgtgaacg ttcactgaaa 300
tcatggcctc ttggccaaga ttgatagctt gtgcctgtcc ctgagtccca gtccatcacg 360
agcagctggt ttctaagatg ctatttcccg tataaagcat gagaccgtga cttgccagcc 420
ccacagagcc ccgcccttgt ccatcactgg catctggact ccagcctggg ttggggcaaa 480
gagggaaatg agatcatgtc ctaaccctga tcctcttgtc ccacagatat ccagaaccct 540
gaccctgcct gaatgaatga ttaattaata aaagatcttt attttcatta gatctgtgtg 600
ttggtttttt gtgtgatcct cgagggaatg aaagacccca cctgtaggtt tggcaagcta 660
gcttaagtaa cgccattttg caaggcatgg aaaatacata actgagaata gagaagttca 720
gatcaaggtt aggaacagag agacagcaga atatgggcca aacaggatat ctgtggtaag 780
cagttcctgc cccggctcag ggccaagaac agatggtccc cagatgcggt cccgccctca 840
gcagtttcta gagaaccatc agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga aaatgaccct 900
gtgccttatt tgaactaacc aatcagttcg cttctcgctt ctgttcgcgc gcttctgctc 960
cccgagctca ataaaagagc ccacaacccc tcactcggcg cgcgccagtc cggtaccagt 1020
cgccaccatg gccctgcctg tgacagctct gctcctccct ctggccctgc tgctccatgc 1080
cgccagaccc gacatcgtgc tgacccagag cccccccagc ctggccatgt ctctgggcaa 1140
gagagccacc atcagctgcc gggccagcga gagcgtgacc atcctgggca gccacctgat 1200
ccactggtat cagcagaagc ccggccagcc ccccaccctg ctgatccagc tcgccagcaa 1260
tgtgcagacc ggcgtgcccg ccagattcag cggcagcggc agcagaaccg acttcaccct 1320
gaccatcgac cccgtggaag aggacgacgt ggccgtgtac tactgcctgc agagccggac 1380
catcccccgg acctttggcg gaggcaccaa actggaaatc aagggcagca ccagcggctc 1440
cggcaagcct ggctctggcg agggcagcac aaagggacag attcagctgg tgcagagcgg 1500
ccctgagctg aagaaacccg gcgagacagt gaagatcagc tgcaaggcct ccggctacac 1560
cttcaccgac tacagcatca actgggtgaa aagagcccct ggcaagggcc tgaagtggat 1620
gggctggatc aacaccgaga caagagagcc cgcctacgcc tacgacttcc ggggcagatt 1680
cgccttcagc ctggaaacca gcgccagcac cgcctacctg cagatcaaca acctgaagta 1740
cgaggacacc gccacctact tttgcgccct ggactacagc tacgccatgg actactgggg 1800
ccagggcacc agcgtgaccg tgtccagctt cgtgcccgtg ttcctgcccg ccaaacctac 1860
caccacccct gcccctagac ctcccacccc agccccaaca atcgccagcc agcctctgtc 1920
tctgcggccc gaagcctgta gacctgctgc cggcggagcc gtgcacacca gaggcctgga 1980
cttcgcctgc gacatctaca tctgggcccc tctggccggc acctgtggcg tgctgctgct 2040
gagcctggtg atcaccctgt actgcaacca ccggaacaga agcaagcgga gccggctgct 2100
gcacagcgac tacatgaaca tgaccccaag acggcctggc cccacccgga agcactacca 2160
gccttacgcc cctcccagag acttcgccgc ctaccggtcc agagtgaagt tcagcagatc 2220
cgccgacgcc cctgcctacc agcagggaca gaaccagctg tacaacgagc tgaacctggg 2280
cagacgggaa gagtacgacg tgctggacaa gcggagaggc cgggaccccg agatgggcgg 2340
aaagcccaga cggaagaacc cccaggaagg cctgtataac gaactgcaga aagacaagat 2400
ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg aggcgcggca agggccacga 2460
tggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc tacgacgccc tgcacatgca 2520
ggccctgccc cccagatgaa agcttgataa tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag 2580
attgactggt attcttaact atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat 2640
gcctttgtat catgctattg cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc 2700
ctggttagtt cttgccacgg cggaactcat cgccgcctgc cttgcccgct gctggacagg 2760
ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggaacttgtt tattgcagct tataatggtt 2820
acaaataaag caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta 2880
gttgtggttt gtccaaactc atcaatgtat cttacgccgg cgtgagtgta ccagctgaga 2940
gactctaaat ccagtgacaa gtctgtctgc ctattcaccg attttgattc tcaaacaaat 3000
gtgtcacaaa gtaaggattc tgatgtgtat atcacagaca aaactgtgct agacatgagg 3060
tctatggact tcaagagcaa cagtgctgtg gcctggagca acaaatctga ctttgcatgt 3120
gcaaacgcct tcaacaacag cattattcca gaagacacct tcttccccag cccaggtaag 3180
ggcagctttg gtgccttcgc aggctgtttc cttgcttcag gaatggccag gttctgccca 3240
gagctctggt caatgatgtc taaaactcct ctgattggtg gtctcggcct tatccattgc 3300
caccaaaacc ctctttttac taagacctag gaacccctag tgatggagtt ggccactccc 3360
tctctgcgcg ctcgctcgct cactgaggcc gggcgaccaa aggtcgcccg acgcccgggc 3420
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<210> 21
<211> 3469
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC AAV 1 TRAC 1 HA TRAC 1-C11D5.3-CD8-CD28-CD3z-HA TRAC 1
<400> 21
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<211> 3054
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC AAV 2 TRAC 2 HA TRAC 2-2A-C11D5.3-CD8-CD28-CD3z-HA TRAC 2
<400> 22
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<211> 3054
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC AAV 2 TRAC 3 HA TRAC 3-2A-C11D5.3-CD8-CD28-CD3z-HA TRAC 3
<400> 23
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<210> 24
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<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC AAV 2 TRAC 1 HA TRAC 1-2A-C11D5.3-CD8-CD28-CD3z-HA TRAC 1
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gagatcatgt cctaaccctg atcctcttgt cccacagata tccagaaccc tgaccctgcc 420
gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt gacaagtctg tctgcctatt caccgatttt 480
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catgccgcca gacccgacat cgtgctgacc cagagccccc ccagcctggc catgtctctg 720
ggcaagagag ccaccatcag ctgccgggcc agcgagagcg tgaccatcct gggcagccac 780
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ctggacttcg cctgcgacat ctacatctgg gcccctctgg ccggcacctg tggcgtgctg 1620
ctgctgagcc tggtgatcac cctgtactgc aaccaccgga acagaagcaa gcggagccgg 1680
ctgctgcaca gcgactacat gaacatgacc ccaagacggc ctggccccac ccggaagcac 1740
taccagcctt acgcccctcc cagagacttc gccgcctacc ggtccagagt gaagttcagc 1800
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aagatggccg aggcctacag cgagatcggc atgaagggcg agcggaggcg cggcaagggc 2040
cacgatggcc tgtaccaggg cctgagcacc gccaccaagg acacctacga cgccctgcac 2100
atgcaggccc tgccccccag atgaaagctt gataatcaac ctctggatta caaaatttgt 2160
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ttaatgcctt tgtatcatgc tattgcttcc cgtatggctt tcattttctc ctccttgtat 2280
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tggacttcaa gagcaacagt gctgtggcct ggagcaacaa atctgacttt gcatgtgcaa 2580
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<210> 25
<211> 3633
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC AAV 3 TRAC 2 HA TRAC 2-2A-C11D5.3-CD8-CD28-CD3z-CNb30-HA
TRAC 2
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cgtgacttgc cagccccaca gagccccgcc cttgtccatc actggcatct ggactccagc 300
ctgggttggg gcaaagaggg aaatgagatc atgtcctaac cctgatcctc ttgtcccaca 360
gatatccaga accctgaccc tgccgtgtac cagctgagag actctaaatc cagtgacaag 420
tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct caaacaaatg tgtcacaaag taaggattct 480
gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta gacatgaggt ctatggactt caagagcaac 540
agtgctgtgg gttccgggga gggccgaggg tcattgctga cgtgtggaga cgtggaggag 600
aatcctggcc ccatggccct gcctgtgaca gctctgctcc tccctctggc cctgctgctc 660
catgccgcca gacccgacat cgtgctgacc cagagccccc ccagcctggc catgtctctg 720
ggcaagagag ccaccatcag ctgccgggcc agcgagagcg tgaccatcct gggcagccac 780
ctgatccact ggtatcagca gaagcccggc cagcccccca ccctgctgat ccagctcgcc 840
agcaatgtgc agaccggcgt gcccgccaga ttcagcggca gcggcagcag aaccgacttc 900
accctgacca tcgaccccgt ggaagaggac gacgtggccg tgtactactg cctgcagagc 960
cggaccatcc cccggacctt tggcggaggc accaaactgg aaatcaaggg cagcaccagc 1020
ggctccggca agcctggctc tggcgagggc agcacaaagg gacagattca gctggtgcag 1080
agcggccctg agctgaagaa acccggcgag acagtgaaga tcagctgcaa ggcctccggc 1140
tacaccttca ccgactacag catcaactgg gtgaaaagag cccctggcaa gggcctgaag 1200
tggatgggct ggatcaacac cgagacaaga gagcccgcct acgcctacga cttccggggc 1260
agattcgcct tcagcctgga aaccagcgcc agcaccgcct acctgcagat caacaacctg 1320
aagtacgagg acaccgccac ctacttttgc gccctggact acagctacgc catggactac 1380
tggggccagg gcaccagcgt gaccgtgtcc agcttcgtgc ccgtgttcct gcccgccaaa 1440
cctaccacca cccctgcccc tagacctccc accccagccc caacaatcgc cagccagcct 1500
ctgtctctgc ggcccgaagc ctgtagacct gctgccggcg gagccgtgca caccagaggc 1560
ctggacttcg cctgcgacat ctacatctgg gcccctctgg ccggcacctg tggcgtgctg 1620
ctgctgagcc tggtgatcac cctgtactgc aaccaccgga acagaagcaa gcggagccgg 1680
ctgctgcaca gcgactacat gaacatgacc ccaagacggc ctggccccac ccggaagcac 1740
taccagcctt acgcccctcc cagagacttc gccgcctacc ggtccagagt gaagttcagc 1800
agatccgccg acgcccctgc ctaccagcag ggacagaacc agctgtacaa cgagctgaac 1860
ctgggcagac gggaagagta cgacgtgctg gacaagcgga gaggccggga ccccgagatg 1920
ggcggaaagc ccagacggaa gaacccccag gaaggcctgt ataacgaact gcagaaagac 1980
aagatggccg aggcctacag cgagatcggc atgaagggcg agcggaggcg cggcaagggc 2040
cacgatggcc tgtaccaggg cctgagcacc gccaccaagg acacctacga cgccctgcac 2100
atgcaggccc tgccccccag aggcagcggc gaaggcagag gatccctgct tacatgtggc 2160
gacgtggaag agaaccctgg ccccatgggc aacgaggcca gctaccctct ggagatgtgc 2220
tcccacttcg acgccgacga gatcaagcgg ctgggcaagc gcttcaagaa gctggacctg 2280
gacaacagcg gcagcctgag cgtggaggag tttatgtctc tgcccgagct gcagcagaac 2340
cccctggtgc agcgcgtgat cgacatcttc gacaccgacg gcaacggcga ggtggacttc 2400
aaggagttca tcgagggcgt gagccagttc agcgtgaagg gcgacaagga gcagaagctg 2460
cggttcgcct tccggatcta cgatatggat aaagatggct atatttctaa tggcgagctg 2520
ttccaggtgc tgaagatgat ggtgggcaac aataccaagc tggccgatac ccagctgcag 2580
cagatcgtgg acaagaccat catcaacgcc gacaaggacg gcgacggcag aatcagcttc 2640
gaggagttct gtgccgtggt gggaggcctg gatattcaca aaaaaatggt ggtggacgtg 2700
tgaaagcttg ataatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt 2760
aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct 2820
attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt agttcttgcc 2880
acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc 2940
actgacaatt ccgtggaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag 3000
catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa 3060
actcatcaat gtatcttacg ccggcgtgag cctggagcaa caaatctgac tttgcatgtg 3120
caaacgcctt caacaacagc attattccag aagacacctt cttccccagc ccaggtaagg 3180
gcagctttgg tgccttcgca ggctgtttcc ttgcttcagg aatggccagg ttctgcccag 3240
agctctggtc aatgatgtct aaaactcctc tgattggtgg tctcggcctt atccattgcc 3300
accaaaaccc tctttttact aagaaacagt gagccttgtt ctggcagtcc agagaatgac 3360
acgggaaaaa agcagatgaa gagaaggtgg caggagaggg cacgtggccc agcctcagtc 3420
tctccaactg agttcctgcc tgcctgcctt tgctcagact gtttgcccct tactgctctt 3480
ctaggcctcc ctaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct 3540
cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct 3600
cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc agg 3633
<210> 26
<211> 3633
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC AAV 3 TRAC 3 HA TRAC 3-2A-C11D5.3-CD8-CD28-CD3z-CNb30-HA
TRAC 3
<400> 26
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgcc ccatgcctgc ctttactctg ccagagttat 180
attgctgggg ttttgaagaa gatcctatta aataaaagaa taagcagtat tattaagtag 240
ccctgcattt caggtttcct tgagtggcag gccaggcctg gccgtgaacg ttcactgaaa 300
tcatggcctc ttggccaaga ttgatagctt gtgcctgtcc ctgagtccca gtccatcacg 360
agcagctggt ttctaagatg ctatttcccg tataaagcat gagaccgtga cttgccagcc 420
ccacagagcc ccgcccttgt ccatcactgg catctggact ccagcctggg ttggggcaaa 480
gagggaaatg agatcatgtc ctaaccctga tcctcttgtc ccacagatat ccagaaccct 540
gaccctgccg gttccgggga gggccgaggg tcattgctga cgtgtggaga cgtggaggag 600
aatcctggcc ccatggccct gcctgtgaca gctctgctcc tccctctggc cctgctgctc 660
catgccgcca gacccgacat cgtgctgacc cagagccccc ccagcctggc catgtctctg 720
ggcaagagag ccaccatcag ctgccgggcc agcgagagcg tgaccatcct gggcagccac 780
ctgatccact ggtatcagca gaagcccggc cagcccccca ccctgctgat ccagctcgcc 840
agcaatgtgc agaccggcgt gcccgccaga ttcagcggca gcggcagcag aaccgacttc 900
accctgacca tcgaccccgt ggaagaggac gacgtggccg tgtactactg cctgcagagc 960
cggaccatcc cccggacctt tggcggaggc accaaactgg aaatcaaggg cagcaccagc 1020
ggctccggca agcctggctc tggcgagggc agcacaaagg gacagattca gctggtgcag 1080
agcggccctg agctgaagaa acccggcgag acagtgaaga tcagctgcaa ggcctccggc 1140
tacaccttca ccgactacag catcaactgg gtgaaaagag cccctggcaa gggcctgaag 1200
tggatgggct ggatcaacac cgagacaaga gagcccgcct acgcctacga cttccggggc 1260
agattcgcct tcagcctgga aaccagcgcc agcaccgcct acctgcagat caacaacctg 1320
aagtacgagg acaccgccac ctacttttgc gccctggact acagctacgc catggactac 1380
tggggccagg gcaccagcgt gaccgtgtcc agcttcgtgc ccgtgttcct gcccgccaaa 1440
cctaccacca cccctgcccc tagacctccc accccagccc caacaatcgc cagccagcct 1500
ctgtctctgc ggcccgaagc ctgtagacct gctgccggcg gagccgtgca caccagaggc 1560
ctggacttcg cctgcgacat ctacatctgg gcccctctgg ccggcacctg tggcgtgctg 1620
ctgctgagcc tggtgatcac cctgtactgc aaccaccgga acagaagcaa gcggagccgg 1680
ctgctgcaca gcgactacat gaacatgacc ccaagacggc ctggccccac ccggaagcac 1740
taccagcctt acgcccctcc cagagacttc gccgcctacc ggtccagagt gaagttcagc 1800
agatccgccg acgcccctgc ctaccagcag ggacagaacc agctgtacaa cgagctgaac 1860
ctgggcagac gggaagagta cgacgtgctg gacaagcgga gaggccggga ccccgagatg 1920
ggcggaaagc ccagacggaa gaacccccag gaaggcctgt ataacgaact gcagaaagac 1980
aagatggccg aggcctacag cgagatcggc atgaagggcg agcggaggcg cggcaagggc 2040
cacgatggcc tgtaccaggg cctgagcacc gccaccaagg acacctacga cgccctgcac 2100
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aaggagttca tcgagggcgt gagccagttc agcgtgaagg gcgacaagga gcagaagctg 2460
cggttcgcct tccggatcta cgatatggat aaagatggct atatttctaa tggcgagctg 2520
ttccaggtgc tgaagatgat ggtgggcaac aataccaagc tggccgatac ccagctgcag 2580
cagatcgtgg acaagaccat catcaacgcc gacaaggacg gcgacggcag aatcagcttc 2640
gaggagttct gtgccgtggt gggaggcctg gatattcaca aaaaaatggt ggtggacgtg 2700
tgaaagcttg ataatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt 2760
aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct 2820
attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt agttcttgcc 2880
acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc 2940
actgacaatt ccgtggaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag 3000
catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa 3060
actcatcaat gtatcttacg ccggcgtgag tgtaccagct gagagactct aaatccagtg 3120
acaagtctgt ctgcctattc accgattttg attctcaaac aaatgtgtca caaagtaagg 3180
attctgatgt gtatatcaca gacaaaactg tgctagacat gaggtctatg gacttcaaga 3240
gcaacagtgc tgtggcctgg agcaacaaat ctgactttgc atgtgcaaac gccttcaaca 3300
acagcattat tccagaagac accttcttcc ccagcccagg taagggcagc tttggtgcct 3360
tcgcaggctg tttccttgct tcaggaatgg ccaggttctg cccagagctc tggtcaatga 3420
tgtctaaaac tcctctgatt ggtggtctcg gccttatcca ttgccaccaa aaccctcttt 3480
ttactaagac ctaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct 3540
cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct 3600
cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc agg 3633
<210> 27
<211> 3633
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC AAV 3 TRAC 1 HA TRAC 1-2A-C11D5.3-CD8-CD28-CD3z-CNb30-HA
TRAC 1
<400> 27
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgct ggccgtgaac gttcactgaa atcatggcct 180
cttggccaag attgatagct tgtgcctgtc cctgagtccc agtccatcac gagcagctgg 240
tttctaagat gctatttccc gtataaagca tgagaccgtg acttgccagc cccacagagc 300
cccgcccttg tccatcactg gcatctggac tccagcctgg gttggggcaa agagggaaat 360
gagatcatgt cctaaccctg atcctcttgt cccacagata tccagaaccc tgaccctgcc 420
gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt gacaagtctg tctgcctatt caccgatttt 480
gattctcaaa caaatgtgtc acaaagtaag gattctgatg tgtatatcac agacaaaact 540
gtgctagacg gttccgggga gggccgaggg tcattgctga cgtgtggaga cgtggaggag 600
aatcctggcc ccatggccct gcctgtgaca gctctgctcc tccctctggc cctgctgctc 660
catgccgcca gacccgacat cgtgctgacc cagagccccc ccagcctggc catgtctctg 720
ggcaagagag ccaccatcag ctgccgggcc agcgagagcg tgaccatcct gggcagccac 780
ctgatccact ggtatcagca gaagcccggc cagcccccca ccctgctgat ccagctcgcc 840
agcaatgtgc agaccggcgt gcccgccaga ttcagcggca gcggcagcag aaccgacttc 900
accctgacca tcgaccccgt ggaagaggac gacgtggccg tgtactactg cctgcagagc 960
cggaccatcc cccggacctt tggcggaggc accaaactgg aaatcaaggg cagcaccagc 1020
ggctccggca agcctggctc tggcgagggc agcacaaagg gacagattca gctggtgcag 1080
agcggccctg agctgaagaa acccggcgag acagtgaaga tcagctgcaa ggcctccggc 1140
tacaccttca ccgactacag catcaactgg gtgaaaagag cccctggcaa gggcctgaag 1200
tggatgggct ggatcaacac cgagacaaga gagcccgcct acgcctacga cttccggggc 1260
agattcgcct tcagcctgga aaccagcgcc agcaccgcct acctgcagat caacaacctg 1320
aagtacgagg acaccgccac ctacttttgc gccctggact acagctacgc catggactac 1380
tggggccagg gcaccagcgt gaccgtgtcc agcttcgtgc ccgtgttcct gcccgccaaa 1440
cctaccacca cccctgcccc tagacctccc accccagccc caacaatcgc cagccagcct 1500
ctgtctctgc ggcccgaagc ctgtagacct gctgccggcg gagccgtgca caccagaggc 1560
ctggacttcg cctgcgacat ctacatctgg gcccctctgg ccggcacctg tggcgtgctg 1620
ctgctgagcc tggtgatcac cctgtactgc aaccaccgga acagaagcaa gcggagccgg 1680
ctgctgcaca gcgactacat gaacatgacc ccaagacggc ctggccccac ccggaagcac 1740
taccagcctt acgcccctcc cagagacttc gccgcctacc ggtccagagt gaagttcagc 1800
agatccgccg acgcccctgc ctaccagcag ggacagaacc agctgtacaa cgagctgaac 1860
ctgggcagac gggaagagta cgacgtgctg gacaagcgga gaggccggga ccccgagatg 1920
ggcggaaagc ccagacggaa gaacccccag gaaggcctgt ataacgaact gcagaaagac 1980
aagatggccg aggcctacag cgagatcggc atgaagggcg agcggaggcg cggcaagggc 2040
cacgatggcc tgtaccaggg cctgagcacc gccaccaagg acacctacga cgccctgcac 2100
atgcaggccc tgccccccag aggcagcggc gaaggcagag gatccctgct tacatgtggc 2160
gacgtggaag agaaccctgg ccccatgggc aacgaggcca gctaccctct ggagatgtgc 2220
tcccacttcg acgccgacga gatcaagcgg ctgggcaagc gcttcaagaa gctggacctg 2280
gacaacagcg gcagcctgag cgtggaggag tttatgtctc tgcccgagct gcagcagaac 2340
cccctggtgc agcgcgtgat cgacatcttc gacaccgacg gcaacggcga ggtggacttc 2400
aaggagttca tcgagggcgt gagccagttc agcgtgaagg gcgacaagga gcagaagctg 2460
cggttcgcct tccggatcta cgatatggat aaagatggct atatttctaa tggcgagctg 2520
ttccaggtgc tgaagatgat ggtgggcaac aataccaagc tggccgatac ccagctgcag 2580
cagatcgtgg acaagaccat catcaacgcc gacaaggacg gcgacggcag aatcagcttc 2640
gaggagttct gtgccgtggt gggaggcctg gatattcaca aaaaaatggt ggtggacgtg 2700
tgaaagcttg ataatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt 2760
aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct 2820
attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt agttcttgcc 2880
acggcggaac tcatcgccgc ctgccttgcc cgctgctgga caggggctcg gctgttgggc 2940
actgacaatt ccgtggaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag 3000
catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa 3060
actcatcaat gtatcttacg ccggcgtgaa tgaggtctat ggacttcaag agcaacagtg 3120
ctgtggcctg gagcaacaaa tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta 3180
ttccagaaga caccttcttc cccagcccag gtaagggcag ctttggtgcc ttcgcaggct 3240
gtttccttgc ttcaggaatg gccaggttct gcccagagct ctggtcaatg atgtctaaaa 3300
ctcctctgat tggtggtctc ggccttatcc attgccacca aaaccctctt tttactaaga 3360
aacagtgagc cttgttctgg cagtccagag aatgacacgg gaaaaaagca gatgaagaga 3420
aggtggcagg agagggcacg tggcccagcc tcagtctctc caactgagtt cctgcctgcc 3480
tgcctttgcc ctaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct 3540
cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct 3600
cagtgagcga gcgagcgcgc agctgcctgc agg 3633
<210> 28
<211> 4840
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC AAV 4 TRAC 2 HA TRAC 2-C11D5.3-CD8-CD28-CD3z-P2A-CISCb-HA
TRAC 2
<400> 28
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgcc caagattgat agcttgtgcc tgtccctgag 180
tcccagtcca tcacgagcag ctggtttcta agatgctatt tcccgtataa agcatgagac 240
cgtgacttgc cagccccaca gagccccgcc cttgtccatc actggcatct ggactccagc 300
ctgggttggg gcaaagaggg aaatgagatc atgtcctaac cctgatcctc ttgtcccaca 360
gatatccaga accctgaccc tgccgtgtac cagctgagag actctaaatc cagtgacaag 420
tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct caaacaaatg tgtcacaaag taaggattct 480
gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta gacatgaggt ctatggactt caagagcaac 540
agtgctgtgt gaatgaatga ttaattaata aaagatcttt attttcatta gatctgtgtg 600
ttggtttttt gtgtgatcct cgagggaatg aaagacccca cctgtaggtt tggcaagcta 660
gcttaagtaa cgccattttg caaggcatgg aaaatacata actgagaata gagaagttca 720
gatcaaggtt aggaacagag agacagcaga atatgggcca aacaggatat ctgtggtaag 780
cagttcctgc cccggctcag ggccaagaac agatggtccc cagatgcggt cccgccctca 840
gcagtttcta gagaaccatc agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga aaatgaccct 900
gtgccttatt tgaactaacc aatcagttcg cttctcgctt ctgttcgcgc gcttctgctc 960
cccgagctca ataaaagagc ccacaacccc tcactcggcg cgcgccagtc cggtaccagt 1020
cgccaccatg gccctgcctg tgacagctct gctcctccct ctggccctgc tgctccatgc 1080
cgccagaccc gacatcgtgc tgacccagag cccccccagc ctggccatgt ctctgggcaa 1140
gagagccacc atcagctgcc gggccagcga gagcgtgacc atcctgggca gccacctgat 1200
ccactggtat cagcagaagc ccggccagcc ccccaccctg ctgatccagc tcgccagcaa 1260
tgtgcagacc ggcgtgcccg ccagattcag cggcagcggc agcagaaccg acttcaccct 1320
gaccatcgac cccgtggaag aggacgacgt ggccgtgtac tactgcctgc agagccggac 1380
catcccccgg acctttggcg gaggcaccaa actggaaatc aagggcagca ccagcggctc 1440
cggcaagcct ggctctggcg agggcagcac aaagggacag attcagctgg tgcagagcgg 1500
ccctgagctg aagaaacccg gcgagacagt gaagatcagc tgcaaggcct ccggctacac 1560
cttcaccgac tacagcatca actgggtgaa aagagcccct ggcaagggcc tgaagtggat 1620
gggctggatc aacaccgaga caagagagcc cgcctacgcc tacgacttcc ggggcagatt 1680
cgccttcagc ctggaaacca gcgccagcac cgcctacctg cagatcaaca acctgaagta 1740
cgaggacacc gccacctact tttgcgccct ggactacagc tacgccatgg actactgggg 1800
ccagggcacc agcgtgaccg tgtccagctt cgtgcccgtg ttcctgcccg ccaaacctac 1860
caccacccct gcccctagac ctcccacccc agccccaaca atcgccagcc agcctctgtc 1920
tctgcggccc gaagcctgta gacctgctgc cggcggagcc gtgcacacca gaggcctgga 1980
cttcgcctgc gacatctaca tctgggcccc tctggccggc acctgtggcg tgctgctgct 2040
gagcctggtg atcaccctgt actgcaacca ccggaacaga agcaagcgga gccggctgct 2100
gcacagcgac tacatgaaca tgaccccaag acggcctggc cccacccgga agcactacca 2160
gccttacgcc cctcccagag acttcgccgc ctaccggtcc agagtgaagt tcagcagatc 2220
cgccgacgcc cctgcctacc agcagggaca gaaccagctg tacaacgagc tgaacctggg 2280
cagacgggaa gagtacgacg tgctggacaa gcggagaggc cgggaccccg agatgggcgg 2340
aaagcccaga cggaagaacc cccaggaagg cctgtataac gaactgcaga aagacaagat 2400
ggccgaggcc tacagcgaga tcggcatgaa gggcgagcgg aggcgcggca agggccacga 2460
tggcctgtac cagggcctga gcaccgccac caaggacacc tacgacgccc tgcacatgca 2520
ggccctgccc cccagaggat ccggcgctac aaatttttca ctgctgaaac aggcgggtga 2580
tgtggaggag aaccctggac ccatgccact tggcctgctc tggctgggct tggcattgct 2640
cggcgcgctc cacgcccagg ctgaactgat ccgcgtggcc atattgtggc atgagatgtg 2700
gcatgaggga ttggaggagg cgagtaggct gtactttggg gaaaggaatg ttaaagggat 2760
gtttgaggtc cttgaacccc tccacgctat gatggaaaga ggacctcaaa cgcttaaaga 2820
gacgtcattc aatcaagcct atggacggga tcttatggaa gctcaagaat ggtgtcgaaa 2880
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<210> 29
<211> 4840
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC AAV 4 TRAC 3 HA TRAC 3-C11D5.3-CD8-CD28-CD3z-P2A-CISCb-HA
TRAC 3
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gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg 4840
<210> 30
<211> 4840
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC AAV 4 TRAC 1 HA TRAC 1-C11D5.3-CD8-CD28-CD3z-P2A-CISCb-HA
TRAC 1
<400> 30
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gcttaagtaa cgccattttg caaggcatgg aaaatacata actgagaata gagaagttca 720
gatcaaggtt aggaacagag agacagcaga atatgggcca aacaggatat ctgtggtaag 780
cagttcctgc cccggctcag ggccaagaac agatggtccc cagatgcggt cccgccctca 840
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cagctctaac cattcactca cttcttgttt caccaaccaa gggtattttt tcttccatct 3360
gcctgatgcc ttggagattg aggcttgtca ggtgtacttt acctatgacc cctatagtga 3420
ggaagaccct gacgaaggcg tagctggcgc ccccactggc tccagtccac agcctcttca 3480
gcctctgtca ggggaggacg acgcatattg tacgttcccc tcacgggacg accttctgct 3540
gttttcaccc tcactgctcg gcggaccctc cccgccaagc acggcacctg gggggagtgg 3600
ggcaggagaa gaaaggatgc ctcctagttt gcaggagcgg gttcctcgcg actgggatcc 3660
gcaacccctc ggaccaccca cccctggcgt acctgatctg gtcgacttcc aaccacctcc 3720
ggagcttgtc ctcagagagg ccggagagga agtcccagac gcggggccaa gagagggtgt 3780
gtcatttccc tggtcccgcc ctccgggaca gggtgagttt cgggcgctga atgcgaggct 3840
cccccttaat accgatgcgt acctgtcatt gcaggaactt cagggccagg atcctaccca 3900
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tattcttaac tatgttgctc cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta 4020
tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttagt 4080
tcttgccacg gcggaactca tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct 4140
gttgggcact gacaattccg tggaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa 4200
gcaatagcat cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt 4260
tgtccaaact catcaatgta tcttacgccg gcgtgaatga ggtctatgga cttcaagagc 4320
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gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg ctttgcccgg 4800
gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc tgcctgcagg 4840
<210> 31
<211> 4425
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC AAV 5 TRAC 2 HA TRAC 2-2A-C11D5.3-CD8-CD28-CD3z-CISCb-HA
TRAC 2
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gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta gacatgaggt ctatggactt caagagcaac 540
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catgccgcca gacccgacat cgtgctgacc cagagccccc ccagcctggc catgtctctg 720
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<210> 32
<211> 4425
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC AAV 5 TRAC 3 HA TRAC 3-2A-C11D5.3-CD8-CD28-CD3z-CISCb-HA
TRAC 3
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<210> 33
<211> 4425
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC AAV 5 TRAC 1 HA TRAC 1-2A-C11D5.3-CD8-CD28-CD3z-CISCb-HA
TRAC 1
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cctccggagc ttgtcctcag agaggccgga gaggaagtcc cagacgcggg gccaagagag 3360
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acccacctgg tgtgaaagct tgataatcaa cctctggatt acaaaatttg tgaaagattg 3540
actggtattc ttaactatgt tgctcctttt acgctatgtg gatacgctgc tttaatgcct 3600
ttgtatcatg ctattgcttc ccgtatggct ttcattttct cctccttgta taaatcctgg 3660
ttagttcttg ccacggcgga actcatcgcc gcctgccttg cccgctgctg gacaggggct 3720
cggctgttgg gcactgacaa ttccgtggaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa 3780
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ccttcgcagg ctgtttcctt gcttcaggaa tggccaggtt ctgcccagag ctctggtcaa 4080
tgatgtctaa aactcctctg attggtggtc tcggccttat ccattgccac caaaaccctc 4140
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<210> 34
<211> 4867
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC AAV 6 TRAC 2 HA TRAC 2-C11D5.3-CD8-41BB-CD3z-P2A-CISCb-HA
TRAC 2
<400> 34
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
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gcttaagtaa cgccattttg caaggcatgg aaaatacata actgagaata gagaagttca 720
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cgccaccatg gccctgcctg tgacagctct gctcctccct ctggccctgc tgctccatgc 1080
cgccagaccc gacatcgtgc tgacccagag cccccccagc ctggccatgt ctctgggcaa 1140
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tgtgcagacc ggcgtgcccg ccagattcag cggcagcggc agcagaaccg acttcaccct 1320
gaccatcgac cccgtggaag aggacgacgt ggccgtgtac tactgcctgc agagccggac 1380
catcccccgg acctttggcg gaggcaccaa actggaaatc aagggcagca ccagcggctc 1440
cggcaagcct ggctctggcg agggcagcac aaagggacag attcagctgg tgcagagcgg 1500
ccctgagctg aagaaacccg gcgagacagt gaagatcagc tgcaaggcct ccggctacac 1560
cttcaccgac tacagcatca actgggtgaa aagagcccct ggcaagggcc tgaagtggat 1620
gggctggatc aacaccgaga caagagagcc cgcctacgcc tacgacttcc ggggcagatt 1680
cgccttcagc ctggaaacca gcgccagcac cgcctacctg cagatcaaca acctgaagta 1740
cgaggacacc gccacctact tttgcgccct ggactacagc tacgccatgg actactgggg 1800
ccagggcacc agcgtgaccg tgtccagcgc cgccgccttc gtgcccgtgt tcctgcccgc 1860
caaacctacc accacccctg cccctagacc tcccacccca gccccaacaa tcgccagcca 1920
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ctgcagg 4867
<210> 35
<211> 4867
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC AAV 6 TRAC 3 HA TRAC 3-C11D5.3-CD8-41BB-CD3z-P2A-CISCb-HA
TRAC 3
<400> 35
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caaacctacc accacccctg cccctagacc tcccacccca gccccaacaa tcgccagcca 1920
gcctctgtct ctgcggcccg aagcctgtag acctgctgcc ggcggagccg tgcacaccag 1980
aggcctggac ttcgcctgcg acatctacat ctgggcccct ctggccggca cctgtggcgt 2040
gctgctgctg agcctggtga tcaccctgta ctgcaaccac cggaacagat tcagcgtcgt 2100
gaagcggggc agaaagaagc tgctgtacat cttcaagcag cccttcatgc ggcccgtgca 2160
gaccacacaa gaggaagatg gctgctcctg cagattccct gaggaagaag aaggcggctg 2220
cgagctgaga gtgaagttca gcagatccgc cgacgcccct gcctaccagc agggacagaa 2280
ccagctgtac aacgagctga acctgggcag acgggaagag tacgacgtgc tggacaagcg 2340
gagaggccgg gaccccgaga tgggcggaaa gcccagacgg aagaaccccc aggaaggcct 2400
gtataacgaa ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac agcgagatcg gcatgaaggg 2460
cgagcggagg cgcggcaagg gccacgatgg cctgtaccag ggcctgagca ccgccaccaa 2520
ggacacctac gacgccctgc acatgcaggc cctgcccccc agaggatccg gcgctacaaa 2580
tttttcactg ctgaaacagg cgggtgatgt ggaggagaac cctggaccca tgccacttgg 2640
cctgctctgg ctgggcttgg cattgctcgg cgcgctccac gcccaggctg aactgatccg 2700
cgtggccata ttgtggcatg agatgtggca tgagggattg gaggaggcga gtaggctgta 2760
ctttggggaa aggaatgtta aagggatgtt tgaggtcctt gaacccctcc acgctatgat 2820
ggaaagagga cctcaaacgc ttaaagagac gtcattcaat caagcctatg gacgggatct 2880
tatggaagct caagaatggt gtcgaaaata catgaaaagc gggaatgtta aggacctcac 2940
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tatcccatgg ttggggcact tgctcgttgg gctcagtggg gcgtttggat tcatcatcct 3060
cgtatatctg ttgattaatt gtcggaacac aggtccctgg cttaaaaaag ttttgaagtg 3120
taacaccccg gatccttcta aattttttag tcaacttagt tcagaacacg ggggcgatgt 3180
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ggataaggtt ccggagccgg cgtctctcag ctctaaccat tcactcactt cttgtttcac 3360
caaccaaggg tattttttct tccatctgcc tgatgccttg gagattgagg cttgtcaggt 3420
gtactttacc tatgacccct atagtgagga agaccctgac gaaggcgtag ctggcgcccc 3480
cactggctcc agtccacagc ctcttcagcc tctgtcaggg gaggacgacg catattgtac 3540
gttcccctca cgggacgacc ttctgctgtt ttcaccctca ctgctcggcg gaccctcccc 3600
gccaagcacg gcacctgggg ggagtggggc aggagaagaa aggatgcctc ctagtttgca 3660
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ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg 4020
tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt 4080
ctcctccttg tataaatcct ggttagttct tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct 4140
tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg aacttgttta 4200
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ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tacgccggcg 4320
tgagtgtacc agctgagaga ctctaaatcc agtgacaagt ctgtctgcct attcaccgat 4380
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atggccaggt tctgcccaga gctctggtca atgatgtcta aaactcctct gattggtggt 4680
ctcggcctta tccattgcca ccaaaaccct ctttttacta agacctagga acccctagtg 4740
atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag 4800
gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 4860
ctgcagg 4867
<210> 36
<211> 4867
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC AAV 6 TRAC 1 HA TRAC 1-C11D5.3-CD8-41BB-CD3z-P2A-CISCb-HA
TRAC 1
<400> 36
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cttggccaag attgatagct tgtgcctgtc cctgagtccc agtccatcac gagcagctgg 240
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gcttaagtaa cgccattttg caaggcatgg aaaatacata actgagaata gagaagttca 720
gatcaaggtt aggaacagag agacagcaga atatgggcca aacaggatat ctgtggtaag 780
cagttcctgc cccggctcag ggccaagaac agatggtccc cagatgcggt cccgccctca 840
gcagtttcta gagaaccatc agatgtttcc agggtgcccc aaggacctga aaatgaccct 900
gtgccttatt tgaactaacc aatcagttcg cttctcgctt ctgttcgcgc gcttctgctc 960
cccgagctca ataaaagagc ccacaacccc tcactcggcg cgcgccagtc cggtaccagt 1020
cgccaccatg gccctgcctg tgacagctct gctcctccct ctggccctgc tgctccatgc 1080
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gggctggatc aacaccgaga caagagagcc cgcctacgcc tacgacttcc ggggcagatt 1680
cgccttcagc ctggaaacca gcgccagcac cgcctacctg cagatcaaca acctgaagta 1740
cgaggacacc gccacctact tttgcgccct ggactacagc tacgccatgg actactgggg 1800
ccagggcacc agcgtgaccg tgtccagcgc cgccgccttc gtgcccgtgt tcctgcccgc 1860
caaacctacc accacccctg cccctagacc tcccacccca gccccaacaa tcgccagcca 1920
gcctctgtct ctgcggcccg aagcctgtag acctgctgcc ggcggagccg tgcacaccag 1980
aggcctggac ttcgcctgcg acatctacat ctgggcccct ctggccggca cctgtggcgt 2040
gctgctgctg agcctggtga tcaccctgta ctgcaaccac cggaacagat tcagcgtcgt 2100
gaagcggggc agaaagaagc tgctgtacat cttcaagcag cccttcatgc ggcccgtgca 2160
gaccacacaa gaggaagatg gctgctcctg cagattccct gaggaagaag aaggcggctg 2220
cgagctgaga gtgaagttca gcagatccgc cgacgcccct gcctaccagc agggacagaa 2280
ccagctgtac aacgagctga acctgggcag acgggaagag tacgacgtgc tggacaagcg 2340
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gtataacgaa ctgcagaaag acaagatggc cgaggcctac agcgagatcg gcatgaaggg 2460
cgagcggagg cgcggcaagg gccacgatgg cctgtaccag ggcctgagca ccgccaccaa 2520
ggacacctac gacgccctgc acatgcaggc cctgcccccc agaggatccg gcgctacaaa 2580
tttttcactg ctgaaacagg cgggtgatgt ggaggagaac cctggaccca tgccacttgg 2640
cctgctctgg ctgggcttgg cattgctcgg cgcgctccac gcccaggctg aactgatccg 2700
cgtggccata ttgtggcatg agatgtggca tgagggattg gaggaggcga gtaggctgta 2760
ctttggggaa aggaatgtta aagggatgtt tgaggtcctt gaacccctcc acgctatgat 2820
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tatggaagct caagaatggt gtcgaaaata catgaaaagc gggaatgtta aggacctcac 2940
gcaagcctgg gatctgtatt accatgtttt ccgacgcatt tctaaacaag gaaaagatac 3000
tatcccatgg ttggggcact tgctcgttgg gctcagtggg gcgtttggat tcatcatcct 3060
cgtatatctg ttgattaatt gtcggaacac aggtccctgg cttaaaaaag ttttgaagtg 3120
taacaccccg gatccttcta aattttttag tcaacttagt tcagaacacg ggggcgatgt 3180
tcaaaagtgg ctgagttccc cgtttcccag ttcaagtttc tcccctgggg gtctcgcccc 3240
cgagatatca cctcttgaag tgctcgagcg ggacaaagtt acacagcttc ttttgcaaca 3300
ggataaggtt ccggagccgg cgtctctcag ctctaaccat tcactcactt cttgtttcac 3360
caaccaaggg tattttttct tccatctgcc tgatgccttg gagattgagg cttgtcaggt 3420
gtactttacc tatgacccct atagtgagga agaccctgac gaaggcgtag ctggcgcccc 3480
cactggctcc agtccacagc ctcttcagcc tctgtcaggg gaggacgacg catattgtac 3540
gttcccctca cgggacgacc ttctgctgtt ttcaccctca ctgctcggcg gaccctcccc 3600
gccaagcacg gcacctgggg ggagtggggc aggagaagaa aggatgcctc ctagtttgca 3660
ggagcgggtt cctcgcgact gggatccgca acccctcgga ccacccaccc ctggcgtacc 3720
tgatctggtc gacttccaac cacctccgga gcttgtcctc agagaggccg gagaggaagt 3780
cccagacgcg gggccaagag agggtgtgtc atttccctgg tcccgccctc cgggacaggg 3840
tgagtttcgg gcgctgaatg cgaggctccc ccttaatacc gatgcgtacc tgtcattgca 3900
ggaacttcag ggccaggatc ctacccacct ggtgtgaaag cttgataatc aacctctgga 3960
ttacaaaatt tgtgaaagat tgactggtat tcttaactat gttgctcctt ttacgctatg 4020
tggatacgct gctttaatgc ctttgtatca tgctattgct tcccgtatgg ctttcatttt 4080
ctcctccttg tataaatcct ggttagttct tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct 4140
tgcccgctgc tggacagggg ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg aacttgttta 4200
ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat 4260
ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tacgccggcg 4320
tgaatgaggt ctatggactt caagagcaac agtgctgtgg cctggagcaa caaatctgac 4380
tttgcatgtg caaacgcctt caacaacagc attattccag aagacacctt cttccccagc 4440
ccaggtaagg gcagctttgg tgccttcgca ggctgtttcc ttgcttcagg aatggccagg 4500
ttctgcccag agctctggtc aatgatgtct aaaactcctc tgattggtgg tctcggcctt 4560
atccattgcc accaaaaccc tctttttact aagaaacagt gagccttgtt ctggcagtcc 4620
agagaatgac acgggaaaaa agcagatgaa gagaaggtgg caggagaggg cacgtggccc 4680
agcctcagtc tctccaactg agttcctgcc tgcctgcctt tgccctagga acccctagtg 4740
atggagttgg ccactccctc tctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgg gcgaccaaag 4800
gtcgcccgac gcccgggctt tgcccgggcg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagctgc 4860
ctgcagg 4867
<210> 37
<211> 4452
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC AAV 7 TRAC 2 HA TRAC
2-2A-C11D5.3-AAA-CD8-41BB-CD3z-P2A-CISCb-HA TRAC 2
<400> 37
cctgcaggca gctgcgcgct cgctcgctca ctgaggccgc ccgggcaaag cccgggcgtc 60
gggcgacctt tggtcgcccg gcctcagtga gcgagcgagc gcgcagagag ggagtggcca 120
actccatcac taggggttcc tgcggccgcc caagattgat agcttgtgcc tgtccctgag 180
tcccagtcca tcacgagcag ctggtttcta agatgctatt tcccgtataa agcatgagac 240
cgtgacttgc cagccccaca gagccccgcc cttgtccatc actggcatct ggactccagc 300
ctgggttggg gcaaagaggg aaatgagatc atgtcctaac cctgatcctc ttgtcccaca 360
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gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta gacatgaggt ctatggactt caagagcaac 540
agtgctgtgg gttccgggga gggccgaggg tcattgctga cgtgtggaga cgtggaggag 600
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<210> 38
<211> 4452
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
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3-2A-C11D5.3-AAA-CD8-41BB-CD3z-P2A-CISCb-HA TRAC 3
<400> 38
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<210> 39
<211> 4452
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC AAV 7 TRAC 1 HA TRAC
1-2A-C11D5.3-AAA-CD8-41BB-CD3z-P2A-CISCb-HA TRAC 1
<400> 39
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gatcttatgg aagctcaaga atggtgtcga aaatacatga aaagcgggaa tgttaaggac 2520
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gatactatcc catggttggg gcacttgctc gttgggctca gtggggcgtt tggattcatc 2640
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ttgcaggagc gggttcctcg cgactgggat ccgcaacccc tcggaccacc cacccctggc 3300
gtacctgatc tggtcgactt ccaaccacct ccggagcttg tcctcagaga ggccggagag 3360
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cagggtgagt ttcgggcgct gaatgcgagg ctccccctta ataccgatgc gtacctgtca 3480
ttgcaggaac ttcagggcca ggatcctacc cacctggtgt gaaagcttga taatcaacct 3540
ctggattaca aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg 3600
ctatgtggat acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc 3660
attttctcct ccttgtataa atcctggtta gttcttgcca cggcggaact catcgccgcc 3720
tgccttgccc gctgctggac aggggctcgg ctgttgggca ctgacaattc cgtggaactt 3780
gtttattgca gcttataatg gttacaaata aagcaatagc atcacaaatt tcacaaataa 3840
agcatttttt tcactgcatt ctagttgtgg tttgtccaaa ctcatcaatg tatcttacgc 3900
cggcgtgaat gaggtctatg gacttcaaga gcaacagtgc tgtggcctgg agcaacaaat 3960
ctgactttgc atgtgcaaac gccttcaaca acagcattat tccagaagac accttcttcc 4020
ccagcccagg taagggcagc tttggtgcct tcgcaggctg tttccttgct tcaggaatgg 4080
ccaggttctg cccagagctc tggtcaatga tgtctaaaac tcctctgatt ggtggtctcg 4140
gccttatcca ttgccaccaa aaccctcttt ttactaagaa acagtgagcc ttgttctggc 4200
agtccagaga atgacacggg aaaaaagcag atgaagagaa ggtggcagga gagggcacgt 4260
ggcccagcct cagtctctcc aactgagttc ctgcctgcct gcctttgccc taggaacccc 4320
tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag gccgggcgac 4380
caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag cgagcgcgca 4440
gctgcctgca gg 4452
<210> 40
<211> 3718
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2RG AAV 8 HA-MND-nakedFRB-tLNGFR-CNb30-CISCg HA
<400> 40
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gccacatccc taaactcttg gattctgttt cctaagatgt aagatggagg taattgttcc 420
tgcctcacag gagctgttgt gaggattaaa cagagagtat gtctttagcg cggtgcctgg 480
caccagtgcc tggcatgtag taggggcaca acaaatataa ggtccacttt gcttttcttt 540
tttctatagt taattaagtg tgaacagaga aacaggagaa tatgggccaa acaggatatc 600
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cccagatgtc tgtgggccag agggccaagc tgaccatcag cccagactac gcctatggag 3900
caacaggcca cccaggaatc atcccacctc acgccaccct ggtgttcgat gtggagctgc 3960
tgaagctggg cgagggcagc aacaccagca aagagaatcc tttcctgttt gcattggaag 4020
ccgtggttat ctctgttggc tccatgggat tgattatcag ccttctctgt gtgtatttct 4080
ggctggaacg gtgagatttg gagaagccca gaaaaatgag gggaacggta gctgacaata 4140
gcagaggagg gttttgcagg gtctttagga gtaaaggatg agacagtaag taatgagaga 4200
ttacccaaga gggtttggtg atggaaggaa gccacaggca cagagaacac agaatcactt 4260
tatttcatat gggacaactg ggagaagggt gataaaaaag ctttaaccta tgtgctcctg 4320
ctccctcttt ctcccctgtc aggacgatgc cccgaattcc caccctgaag aacctagagg 4380
atcttgttac tgaataccac gggaactttt cggtgagaac gctgtcatca attgtctacc 4440
taggaacccc tagtgatgga gttggccact ccctctctgc gcgctcgctc gctcactgag 4500
gccgggcgac caaaggtcgc ccgacgcccg ggctttgccc gggcggcctc agtgagcgag 4560
cgagcgcgca gctgcctgca gg 4582
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Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe
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Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala
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1 5 10 15
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20 25 30
Met Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro
35 40 45
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50 55 60
Met Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val
65 70 75 80
Lys Asp Leu Thr Gln Ala Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg
85 90 95
Ile Ser Lys Gln
100
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Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu Ile Ile Ser Leu Leu Cys
20 25 30
Val Tyr Phe Trp Leu Glu Arg
35
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Val Val Ile Ser Val Gly Ser Met Gly Leu Ile Ile Ser Leu Leu Cys
20 25 30
Val Tyr Phe Trp Leu Glu Arg Thr Met Pro Arg Ile Pro Thr Leu Lys
35 40 45
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Glu Arg Leu Cys Leu Val Ser Glu Ile Pro Pro Lys Gly Gly Ala Leu
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<220>
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Gly Lys Asp Thr Ile Pro Trp Leu Gly His Leu Leu Val Gly Leu Ser
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Gly Ala Phe Gly Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu Ile Asn Cys Arg
20 25 30
Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys Asn Thr Pro Asp
35 40 45
Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His Gly Gly Asp Val
50 55 60
Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser Phe Ser Pro Gly
65 70 75 80
Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu Glu Arg Asp Lys
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100 105 110
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Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg Asp Asp Leu Leu
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Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu Gly Pro Pro Thr
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Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro Pro Glu Leu Val
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Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly Pro Arg Glu Gly
260 265 270
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Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala
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Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr
65 70 75 80
Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr
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Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Gly Glu Gly Ser Asn Thr
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Ser Lys Glu Asn Pro Phe Leu Phe Ala Leu Glu Ala Val Val Ile Ser
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130 135 140
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Val Gly Ser Met Gly Leu Ile Ile Ser Leu Leu Cys Val Tyr Phe Trp
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Tyr Thr Leu Lys Pro Glu Thr
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Met Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro
35 40 45
Gln Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu
50 55 60
Met Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val
65 70 75 80
Lys Asp Leu Thr Gln Ala Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg
85 90 95
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Val Gly Leu Ser Gly Ala Phe Gly Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu
115 120 125
Ile Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys
130 135 140
Asn Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His
145 150 155 160
Gly Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser
165 170 175
Phe Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu
180 185 190
Glu Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro
195 200 205
Glu Pro Ala Ser Leu Ser Ser Asn His Ser Leu Thr Ser Cys Phe Thr
210 215 220
Asn Gln Gly Tyr Phe Phe Phe His Leu Pro Asp Ala Leu Glu Ile Glu
225 230 235 240
Ala Cys Gln Val Tyr Phe Thr Tyr Asp Pro Tyr Ser Glu Glu Asp Pro
245 250 255
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260 265 270
Gln Pro Leu Ser Gly Glu Asp Asp Ala Tyr Cys Thr Phe Pro Ser Arg
275 280 285
Asp Asp Leu Leu Leu Phe Ser Pro Ser Leu Leu Gly Gly Pro Ser Pro
290 295 300
Pro Ser Thr Ala Pro Gly Gly Ser Gly Ala Gly Glu Glu Arg Met Pro
305 310 315 320
Pro Ser Leu Gln Glu Arg Val Pro Arg Asp Trp Asp Pro Gln Pro Leu
325 330 335
Gly Pro Pro Thr Pro Gly Val Pro Asp Leu Val Asp Phe Gln Pro Pro
340 345 350
Pro Glu Leu Val Leu Arg Glu Ala Gly Glu Glu Val Pro Asp Ala Gly
355 360 365
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Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
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Cys Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
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Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
50 55 60
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Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr
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Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser
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Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
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20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
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Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
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Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
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<223> Synthetic polypeptide
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20 25 30
Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly
130 135 140
Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp
145 150 155 160
Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp
165 170 175
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180 185 190
Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala
195 200 205
Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
210 215 220
Cys Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Ser Val Thr Val Ser Ser Phe Val Pro Val Phe Leu Pro Ala Lys Pro
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Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
260 265 270
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
275 280 285
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile
290 295 300
Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val
305 310 315 320
Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu
325 330 335
Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr
340 345 350
Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr
355 360 365
Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln
370 375 380
Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu
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Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly
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Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser
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Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro
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Pro Arg
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<223> Synthetic polypeptide
<220>
<221> misc_feature
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Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
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Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
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Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
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Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Ser Thr Ser Gly Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys
115 120 125
Gly Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly
130 135 140
Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp
145 150 155 160
Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp
165 170 175
Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala Tyr Asp
180 185 190
Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala
195 200 205
Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe
210 215 220
Cys Ala Leu Asp Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
225 230 235 240
Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Phe Val Pro Val Phe Leu Pro
245 250 255
Ala Lys Pro Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro
260 265 270
Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro
275 280 285
Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
290 295 300
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
305 310 315 320
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Asn His Arg Asn Arg Phe Ser Val
325 330 335
Val Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
340 345 350
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
355 360 365
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
370 375 380
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
385 390 395 400
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
405 410 415
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
420 425 430
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
435 440 445
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
450 455 460
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
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Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
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<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<220>
<221> misc_feature
<223> beta-2-microglobulin domain
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20 25 30
His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser
35 40 45
Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu
50 55 60
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65 70 75 80
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100 105 110
Val Lys Trp Asp Arg Asp Met
115
<210> 63
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<220>
<221> misc_feature
<223> CD8 transmembrane domain
<400> 63
Ser Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
1 5 10 15
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20 25
<210> 64
<211> 42
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<220>
<221> misc_feature
<223> 4-1BB co-stimulatory domain
<400> 64
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 65
<211> 299
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<220>
<221> misc_feature
<223> beta-2-microglobulin chimeric receptor
<400> 65
Met Ser Arg Ser Val Ala Leu Ala Val Leu Ala Leu Leu Ser Leu Ser
1 5 10 15
Gly Leu Glu Ala Ile Gln Arg Thr Pro Lys Ile Gln Val Tyr Ser Arg
20 25 30
His Pro Ala Glu Asn Gly Lys Ser Asn Phe Leu Asn Cys Tyr Val Ser
35 40 45
Gly Phe His Pro Ser Asp Ile Glu Val Asp Leu Leu Lys Asn Gly Glu
50 55 60
Arg Ile Glu Lys Val Glu His Ser Asp Leu Ser Phe Ser Lys Asp Trp
65 70 75 80
Ser Phe Tyr Leu Leu Tyr Tyr Thr Glu Phe Thr Pro Thr Glu Lys Asp
85 90 95
Glu Tyr Ala Cys Arg Val Asn His Val Thr Leu Ser Gln Pro Lys Ile
100 105 110
Val Lys Trp Asp Arg Asp Met Ser Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu
115 120 125
Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr
130 135 140
Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe
145 150 155 160
Met Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg
165 170 175
Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser
180 185 190
Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr
195 200 205
Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys
210 215 220
Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn
225 230 235 240
Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu
245 250 255
Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly
260 265 270
His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr
275 280 285
Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
290 295
<210> 66
<211> 274
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<220>
<221> misc_feature
<223> tLNGFR polypeptide
<400> 66
Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Gly Val Ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys
20 25 30
Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys Cys Lys Ala Cys Asn
35 40 45
Leu Gly Glu Gly Val Ala Gln Pro Cys Gly Ala Asn Gln Thr Val Cys
50 55 60
Glu Pro Cys Leu Asp Ser Val Thr Phe Ser Asp Val Val Ser Ala Thr
65 70 75 80
Glu Pro Cys Lys Pro Cys Thr Glu Cys Val Gly Leu Gln Ser Met Ser
85 90 95
Ala Pro Cys Val Glu Ala Asp Asp Ala Val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly
100 105 110
Tyr Tyr Gln Asp Glu Thr Thr Gly Arg Cys Glu Ala Cys Arg Val Cys
115 120 125
Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gln Asp Lys Gln Asn Thr
130 135 140
Val Cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr Ser Asp Glu Ala Asn His
145 150 155 160
Val Asp Pro Cys Leu Pro Cys Thr Val Cys Glu Asp Thr Glu Arg Gln
165 170 175
Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu Ile Pro
180 185 190
Gly Arg Trp Ile Thr Arg Ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr
195 200 205
Ala Pro Ser Thr Gln Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gln Asp Leu Ile
210 215 220
Ala Ser Thr Val Ala Gly Val Val Thr Thr Val Met Gly Ser Ser Gln
225 230 235 240
Pro Val Val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Leu Ile Pro Val Tyr Cys
245 250 255
Ser Ile Leu Ala Ala Val Val Val Gly Leu Val Ala Tyr Ile Ala Phe
260 265 270
Lys Arg
<210> 67
<211> 172
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<220>
<221> misc_feature
<223> CNb30 polypeptide
<400> 67
Met Gly Asn Glu Ala Ser Tyr Pro Leu Glu Met Cys Ser His Phe Asp
1 5 10 15
Ala Asp Glu Ile Lys Arg Leu Gly Lys Arg Phe Lys Lys Leu Asp Leu
20 25 30
Asp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Val Glu Glu Phe Met Ser Leu Pro Glu
35 40 45
Leu Gln Gln Asn Pro Leu Val Gln Arg Val Ile Asp Ile Phe Asp Thr
50 55 60
Asp Gly Asn Gly Glu Val Asp Phe Lys Glu Phe Ile Glu Gly Val Ser
65 70 75 80
Gln Phe Ser Val Lys Gly Asp Lys Glu Gln Lys Leu Arg Phe Ala Phe
85 90 95
Arg Ile Tyr Asp Met Asp Lys Asp Gly Tyr Ile Ser Asn Gly Glu Leu
100 105 110
Phe Gln Val Leu Lys Met Met Val Gly Asn Asn Thr Lys Leu Ala Asp
115 120 125
Thr Gln Leu Gln Gln Ile Val Asp Lys Thr Ile Ile Asn Ala Asp Lys
130 135 140
Asp Gly Asp Gly Arg Ile Ser Phe Glu Glu Phe Cys Ala Val Val Gly
145 150 155 160
Gly Leu Asp Ile His Lys Lys Met Val Val Asp Val
165 170
<210> 68
<211> 90
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<220>
<221> misc_feature
<223> naked FRB wild-type polypeptide
<400> 68
Met Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe
1 5 10 15
Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His
20 25 30
Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn
35 40 45
Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys
50 55 60
Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Thr Gln Ala Trp Asp Leu
65 70 75 80
Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys
85 90
<210> 69
<211> 90
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<220>
<221> misc_feature
<223> naked FRB mutant polypeptide
<400> 69
Met Glu Met Trp His Glu Gly Leu Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe
1 5 10 15
Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His
20 25 30
Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn
35 40 45
Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys
50 55 60
Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys Asp Leu Leu Gln Ala Trp Asp Leu
65 70 75 80
Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile Ser Lys
85 90
<210> 70
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<220>
<221> misc_feature
<223> CD8 signal
<400> 70
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 71
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<220>
<221> misc_feature
<223> ER signal
<400> 71
Met Pro Leu Gly Leu Leu Trp Leu Gly Leu Ala Leu Leu Gly Ala Leu
1 5 10 15
His Ala Gln Ala
20
<210> 72
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<220>
<221> misc_feature
<223> T2A
<400> 72
Gly Ser Gly Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu
1 5 10 15
Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 73
<211> 22
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<220>
<221> misc_feature
<223> P2A
<400> 73
Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val
1 5 10 15
Glu Glu Asn Pro Gly Pro
20
<210> 74
<211> 367
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> MND promoter
<400> 74
acgtaagctt gtgtgaacag agaaacagga gaatatgggc caaacaggat atctgtggta 60
agcagttcct gccccggctc agggccaaga acagttggaa cagcagaata tgggccaaac 120
aggatatctg tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggtccccag 180
atgcggtccc gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg gtgccccaag 240
gacctgaaat gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc tcgcttctgt 300
tcgcgcgctt ctgctccccg agctctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcaaag 360
cttacgt 367
<210> 75
<211> 373
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> MSCV promoter
<400> 75
aatgaaagac cccacctgta ggtttggcaa gctagcttaa gtaacgccat tttgcaaggc 60
atggaaaata cataactgag aatagagaag ttcagatcaa ggttaggaac agagagacag 120
cagaatatgg gccaaacagg atatctgtgg taagcagttc ctgccccggc tcagggccaa 180
gaacagatgg tccccagatg cggtcccgcc ctcagcagtt tctagagaac catcagatgt 240
ttccagggtg ccccaaggac ctgaaaatga ccctgtgcct tatttgaact aaccaatcag 300
ttcgcttctc gcttctgttc gcgcgcttct gctccccgag ctcaataaaa gagcccacaa 360
cccctcactc ggc 373
<210> 76
<211> 131
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<220>
<221> misc_feature
<223> truncated IL2Rbeta domain
<400> 76
Pro Ala Ala Leu Gly Lys Asp Thr Ile Pro Trp Leu Gly His Leu Leu
1 5 10 15
Val Gly Leu Ser Gly Ala Phe Gly Phe Ile Ile Leu Val Tyr Leu Leu
20 25 30
Ile Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu Lys Cys
35 40 45
Asn Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser Glu His
50 55 60
Gly Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser Ser Ser
65 70 75 80
Phe Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu Val Leu
85 90 95
Glu Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys Val Pro
100 105 110
Glu Pro Ala Ser Leu Ser Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser Leu Gln
115 120 125
Glu Leu Gln
130
<210> 77
<211> 245
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polypeptide
<220>
<221> misc_feature
<223> CISCb component, truncated
<400> 77
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Ile Leu Trp His Glu Met Trp His Glu Gly Leu
20 25 30
Glu Glu Ala Ser Arg Leu Tyr Phe Gly Glu Arg Asn Val Lys Gly Met
35 40 45
Phe Glu Val Leu Glu Pro Leu His Ala Met Met Glu Arg Gly Pro Gln
50 55 60
Thr Leu Lys Glu Thr Ser Phe Asn Gln Ala Tyr Gly Arg Asp Leu Met
65 70 75 80
Glu Ala Gln Glu Trp Cys Arg Lys Tyr Met Lys Ser Gly Asn Val Lys
85 90 95
Asp Leu Leu Gln Ala Trp Asp Leu Tyr Tyr His Val Phe Arg Arg Ile
100 105 110
Ser Lys Pro Ala Ala Leu Gly Lys Asp Thr Ile Pro Trp Leu Gly His
115 120 125
Leu Leu Val Gly Leu Ser Gly Ala Phe Gly Phe Ile Ile Leu Val Tyr
130 135 140
Leu Leu Ile Asn Cys Arg Asn Thr Gly Pro Trp Leu Lys Lys Val Leu
145 150 155 160
Lys Cys Asn Thr Pro Asp Pro Ser Lys Phe Phe Ser Gln Leu Ser Ser
165 170 175
Glu His Gly Gly Asp Val Gln Lys Trp Leu Ser Ser Pro Phe Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Phe Ser Pro Gly Gly Leu Ala Pro Glu Ile Ser Pro Leu Glu
195 200 205
Val Leu Glu Arg Asp Lys Val Thr Gln Leu Leu Leu Gln Gln Asp Lys
210 215 220
Val Pro Glu Pro Ala Ser Leu Ser Leu Asn Thr Asp Ala Tyr Leu Ser
225 230 235 240
Leu Gln Glu Leu Gln
245
<210> 78
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> BCMA target sequence
<400> 78
tattaagctc agtcccaaac 20
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> AAVS1 target sequence
<400> 79
ggggccacta gggacaggat 20
<210> 80
<211> 400
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC 1 5' homology arm
<400> 80
tggccgtgaa cgttcactga aatcatggcc tcttggccaa gattgatagc ttgtgcctgt 60
ccctgagtcc cagtccatca cgagcagctg gtttctaaga tgctatttcc cgtataaagc 120
atgagaccgt gacttgccag ccccacagag ccccgccctt gtccatcact ggcatctgga 180
ctccagcctg ggttggggca aagagggaaa tgagatcatg tcctaaccct gatcctcttg 240
tcccacagat atccagaacc ctgaccctgc cgtgtaccag ctgagagact ctaaatccag 300
tgacaagtct gtctgcctat tcaccgattt tgattctcaa acaaatgtgt cacaaagtaa 360
ggattctgat gtgtatatca cagacaaaac tgtgctagac 400
<210> 81
<211> 400
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC 1 3' homology arm
<400> 81
atgaggtcta tggacttcaa gagcaacagt gctgtggcct ggagcaacaa atctgacttt 60
gcatgtgcaa acgccttcaa caacagcatt attccagaag acaccttctt ccccagccca 120
ggtaagggca gctttggtgc cttcgcaggc tgtttccttg cttcaggaat ggccaggttc 180
tgcccagagc tctggtcaat gatgtctaaa actcctctga ttggtggtct cggccttatc 240
cattgccacc aaaaccctct ttttactaag aaacagtgag ccttgttctg gcagtccaga 300
gaatgacacg ggaaaaaagc agatgaagag aaggtggcag gagagggcac gtggcccagc 360
ctcagtctct ccaactgagt tcctgcctgc ctgcctttgc 400
<210> 82
<211> 400
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC 2 5' homology arm
<400> 82
ccaagattga tagcttgtgc ctgtccctga gtcccagtcc atcacgagca gctggtttct 60
aagatgctat ttcccgtata aagcatgaga ccgtgacttg ccagccccac agagccccgc 120
ccttgtccat cactggcatc tggactccag cctgggttgg ggcaaagagg gaaatgagat 180
catgtcctaa ccctgatcct cttgtcccac agatatccag aaccctgacc ctgccgtgta 240
ccagctgaga gactctaaat ccagtgacaa gtctgtctgc ctattcaccg attttgattc 300
tcaaacaaat gtgtcacaaa gtaaggattc tgatgtgtat atcacagaca aaactgtgct 360
agacatgagg tctatggact tcaagagcaa cagtgctgtg 400
<210> 83
<211> 400
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC 2 3' homology arm
<400> 83
gcctggagca acaaatctga ctttgcatgt gcaaacgcct tcaacaacag cattattcca 60
gaagacacct tcttccccag cccaggtaag ggcagctttg gtgccttcgc aggctgtttc 120
cttgcttcag gaatggccag gttctgccca gagctctggt caatgatgtc taaaactcct 180
ctgattggtg gtctcggcct tatccattgc caccaaaacc ctctttttac taagaaacag 240
tgagccttgt tctggcagtc cagagaatga cacgggaaaa aagcagatga agagaaggtg 300
gcaggagagg gcacgtggcc cagcctcagt ctctccaact gagttcctgc ctgcctgcct 360
ttgctcagac tgtttgcccc ttactgctct tctaggcctc 400
<210> 84
<211> 400
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC 3 5' homology arm
<400> 84
cccatgcctg cctttactct gccagagtta tattgctggg gttttgaaga agatcctatt 60
aaataaaaga ataagcagta ttattaagta gccctgcatt tcaggtttcc ttgagtggca 120
ggccaggcct ggccgtgaac gttcactgaa atcatggcct cttggccaag attgatagct 180
tgtgcctgtc cctgagtccc agtccatcac gagcagctgg tttctaagat gctatttccc 240
gtataaagca tgagaccgtg acttgccagc cccacagagc cccgcccttg tccatcactg 300
gcatctggac tccagcctgg gttggggcaa agagggaaat gagatcatgt cctaaccctg 360
atcctcttgt cccacagata tccagaaccc tgaccctgcc 400
<210> 85
<211> 400
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC 3 3' homology arm
<400> 85
gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt gacaagtctg tctgcctatt caccgatttt 60
gattctcaaa caaatgtgtc acaaagtaag gattctgatg tgtatatcac agacaaaact 120
gtgctagaca tgaggtctat ggacttcaag agcaacagtg ctgtggcctg gagcaacaaa 180
tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta ttccagaaga caccttcttc 240
cccagcccag gtaagggcag ctttggtgcc ttcgcaggct gtttccttgc ttcaggaatg 300
gccaggttct gcccagagct ctggtcaatg atgtctaaaa ctcctctgat tggtggtctc 360
ggccttatcc attgccacca aaaccctctt tttactaaga 400
<210> 86
<211> 400
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> GC8 5' homology arm
<400> 86
caacctctag aaatcaaggt ttttctgtgt agggttgggt tagcgtgttg ttagagtagg 60
ggagtggatt gagaaggagg ctgaggggta ctcaaggggg ctatagaatg tataggattt 120
ccctgaagca ttcctagaga gcctgcaagg tgaagatggc tttggaacca gctggatcta 180
ggctgtgcca catactacct ctttggcctt ggccacatcc ctaaactctt ggattctgtt 240
tcctaagatg taagatggag gtaattgttc ctgcctcaca ggagctgttg tgaggattaa 300
acagagagta tgtctttagc gcggtgcctg gcaccagtgc ctggcatgta gtaggggcac 360
aacaaatata aggtccactt tgcttttctt ttttctatag 400
<210> 87
<211> 436
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> GC8 3' homology arm
<400> 87
gaaaacccct ttttgttcgc tcttgaggct gtcgtgatta gcgtcggatc catgggattg 60
attatcagcc ttctctgtgt gtatttctgg ctggaacggt gagatttgga gaagcccaga 120
aaaatgaggg gaacggtagc tgacaatagc agaggagggt tttgcagggt ctttaggagt 180
aaaggatgag acagtaagta atgagagatt acccaagagg gtttggtgat ggaaggaagc 240
cacaggcaca gagaacacag aatcacttta tttcatatgg gacaactggg agaagggtga 300
taaaaaagct ttaacctatg tgctcctgct ccctctttct cccctgtcag gacgatgccc 360
cgaattccca ccctgaagaa cctagaggat cttgttactg aataccacgg gaacttttcg 420
gtgagaacgc tgtcat 436
<210> 88
<211> 400
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> GC10 5' homology arm
<400> 88
caacctctag aaatcaaggt ttttctgtgt agggttgggt tagcgtgttg ttagagtagg 60
ggagtggatt gagaaggagg ctgaggggta ctcaaggggg ctatagaatg tataggattt 120
ccctgaagca ttcctagaga gcctgcaagg tgaagatggc tttggaacca gctggatcta 180
ggctgtgcca catactacct ctttggcctt ggccacatcc ctaaactctt ggattctgtt 240
tcctaagatg taagatggag gtaattgttc ctgcctcaca ggagctgttg tgaggattaa 300
acagagagta tgtctttagc gcggtgcctg gcaccagtgc ctggcatgta gtaggggcac 360
aacaaatata aggtccactt tgcttttctt ttttctatag 400
<210> 89
<211> 436
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> GC10 3' homology arm
<400> 89
gaaaacccct ttttgttcgc tcttgaggct gtcgtgatta gcgtcggaag tatgggattg 60
attatcagcc ttctctgtgt gtatttctgg ctggaacggt gagatttgga gaagcccaga 120
aaaatgaggg gaacggtagc tgacaatagc agaggagggt tttgcagggt ctttaggagt 180
aaaggatgag acagtaagta atgagagatt acccaagagg gtttggtgat ggaaggaagc 240
cacaggcaca gagaacacag aatcacttta tttcatatgg gacaactggg agaagggtga 300
taaaaaagct ttaacctatg tgctcctgct ccctctttct cccctgtcag gacgatgccc 360
cgaattccca ccctgaagaa cctagaggat cttgttactg aataccacgg gaacttttcg 420
gtgagaacgc tgtcat 436
<210> 90
<211> 400
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> GC12 5' homology arm
<400> 90
caacctctag aaatcaaggt ttttctgtgt agggttgggt tagcgtgttg ttagagtagg 60
ggagtggatt gagaaggagg ctgaggggta ctcaaggggg ctatagaatg tataggattt 120
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<213> Artificial sequence
<220>
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<212> DNA
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<223> Synthetic polynucleotide
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<221> misc_feature
<223> AAV HA TRAC 1-TNP-AAA-CD8-CD28-CD3z-P2A-CISCb-HA TRAC 1
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<220>
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<220>
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<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC AAV TRAC 1 HA
AS-synpA-MND-Kozak-ER-FKBP-IL2RG-P2A-ER-FRB-IL2RB-P2A-mCherry-WPR
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<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2RG cassette CISC-tLNGFR
<400> 97
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gcctccaccg tggcgggtgt tgttactacg gttatgggct catcccagcc cgttgttacc 1140
cgaggaacta cagacaacct gattccggta tattgttcta tcttggcggc tgtagtagtt 1200
ggcttggtcg cgtacatcgc tttcaaaaga ggatccggcg ctacaaattt ttcactgctg 1260
aaacaggcgg gtgatgtgga ggagaaccct ggacccatgc cacttggcct gctctggctg 1320
ggcttggcat tgctcggcgc gctccacgcc caggctgaac tgatccgcgt ggccatattg 1380
tggcatgaga tgtggcatga gggattggag gaggcgagta ggctgtactt tggggaaagg 1440
aatgttaaag ggatgtttga ggtccttgaa cccctccacg ctatgatgga aagaggacct 1500
caaacgctta aagagacgtc attcaatcaa gcctatggac gggatcttat ggaagctcaa 1560
gaatggtgtc gaaaatacat gaaaagcggg aatgttaagg acctcacgca agcctgggat 1620
ctgtattacc atgttttccg acgcatttct aaacaaggaa aagatactat cccatggttg 1680
gggcacttgc tcgttgggct cagtggggcg tttggattca tcatcctcgt atatctgttg 1740
attaattgtc ggaacacagg tccctggctt aaaaaagttt tgaagtgtaa caccccggat 1800
ccttctaaat tttttagtca acttagttca gaacacgggg gcgatgttca aaagtggctg 1860
agttccccgt ttcccagttc aagtttctcc cctgggggtc tcgcccccga gatatcacct 1920
cttgaagtgc tcgagcggga caaagttaca cagcttcttt tgcaacagga taaggttccg 1980
gagccggcgt ctctcagctc taaccattca ctcacttctt gtttcaccaa ccaagggtat 2040
tttttcttcc atctgcctga tgccttggag attgaggctt gtcaggtgta ctttacctat 2100
gacccctata gtgaggaaga ccctgacgaa ggcgtagctg gcgcccccac tggctccagt 2160
ccacagcctc ttcagcctct gtcaggggag gacgacgcat attgtacgtt cccctcacgg 2220
gacgaccttc tgctgttttc accctcactg ctcggcggac cctccccgcc aagcacggca 2280
cctgggggga gtggggcagg agaagaaagg atgcctccta gtttgcagga gcgggttcct 2340
cgcgactggg atccgcaacc cctcggacca cccacccctg gcgtacctga tctggtcgac 2400
ttccaaccac ctccggagct tgtcctcaga gaggccggag aggaagtccc agacgcgggg 2460
ccaagagagg gtgtgtcatt tccctggtcc cgccctccgg gacagggtga gtttcgggcg 2520
ctgaatgcga ggctccccct taataccgat gcgtacctgt cattgcagga acttcagggc 2580
caggatccta cccacctggt gggatccggc gctacaaatt tttcactgct gaaacaggcg 2640
ggtgatgtgg aggagaaccc tggacccatg cctctgggcc tgctgtggct gggcctggcc 2700
ctgctgggcg ccctgcacgc ccaggccggc gtgcaggtgg agacaatctc cccaggcgac 2760
ggacgcacat tccctaagcg gggccagacc tgcgtggtgc actatacagg catgctggag 2820
gatggcaaga agtttgacag ctcccgggat agaaacaagc cattcaagtt tatgctgggc 2880
aagcaggaag tgatcagagg ctgggaggag ggcgtggccc agatgtctgt gggccagagg 2940
gccaagctga ccatcagccc agactacgcc tatggagcaa caggccaccc aggaatcatc 3000
ccacctcacg ccaccctggt gttcgatgtg gagctgctga agctgggcga gggcagcaac 3060
accagcaaa 3069
<210> 98
<211> 1509
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC 1 cassette: C11D5.3-CD8-CD28-CD3z
<400> 98
atggccctgc ctgtgacagc tctgctcctc cctctggccc tgctgctcca tgccgccaga 60
cccgacatcg tgctgaccca gagccccccc agcctggcca tgtctctggg caagagagcc 120
accatcagct gccgggccag cgagagcgtg accatcctgg gcagccacct gatccactgg 180
tatcagcaga agcccggcca gccccccacc ctgctgatcc agctcgccag caatgtgcag 240
accggcgtgc ccgccagatt cagcggcagc ggcagcagaa ccgacttcac cctgaccatc 300
gaccccgtgg aagaggacga cgtggccgtg tactactgcc tgcagagccg gaccatcccc 360
cggacctttg gcggaggcac caaactggaa atcaagggca gcaccagcgg ctccggcaag 420
cctggctctg gcgagggcag cacaaaggga cagattcagc tggtgcagag cggccctgag 480
ctgaagaaac ccggcgagac agtgaagatc agctgcaagg cctccggcta caccttcacc 540
gactacagca tcaactgggt gaaaagagcc cctggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg 600
atcaacaccg agacaagaga gcccgcctac gcctacgact tccggggcag attcgccttc 660
agcctggaaa ccagcgccag caccgcctac ctgcagatca acaacctgaa gtacgaggac 720
accgccacct acttttgcgc cctggactac agctacgcca tggactactg gggccagggc 780
accagcgtga ccgtgtccag cttcgtgccc gtgttcctgc ccgccaaacc taccaccacc 840
cctgccccta gacctcccac cccagcccca acaatcgcca gccagcctct gtctctgcgg 900
cccgaagcct gtagacctgc tgccggcgga gccgtgcaca ccagaggcct ggacttcgcc 960
tgcgacatct acatctgggc ccctctggcc ggcacctgtg gcgtgctgct gctgagcctg 1020
gtgatcaccc tgtactgcaa ccaccggaac agaagcaagc ggagccggct gctgcacagc 1080
gactacatga acatgacccc aagacggcct ggccccaccc ggaagcacta ccagccttac 1140
gcccctccca gagacttcgc cgcctaccgg tccagagtga agttcagcag atccgccgac 1200
gcccctgcct accagcaggg acagaaccag ctgtacaacg agctgaacct gggcagacgg 1260
gaagagtacg acgtgctgga caagcggaga ggccgggacc ccgagatggg cggaaagccc 1320
agacggaaga acccccagga aggcctgtat aacgaactgc agaaagacaa gatggccgag 1380
gcctacagcg agatcggcat gaagggcgag cggaggcgcg gcaagggcca cgatggcctg 1440
taccagggcc tgagcaccgc caccaaggac acctacgacg ccctgcacat gcaggccctg 1500
ccccccaga 1509
<210> 99
<211> 1572
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC 2 cassette 2A-C11D5.3-CD8-CD28-CD3z
<400> 99
ggttccgggg agggccgagg gtcattgctg acgtgtggag acgtggagga gaatcctggc 60
cccatggccc tgcctgtgac agctctgctc ctccctctgg ccctgctgct ccatgccgcc 120
agacccgaca tcgtgctgac ccagagcccc cccagcctgg ccatgtctct gggcaagaga 180
gccaccatca gctgccgggc cagcgagagc gtgaccatcc tgggcagcca cctgatccac 240
tggtatcagc agaagcccgg ccagcccccc accctgctga tccagctcgc cagcaatgtg 300
cagaccggcg tgcccgccag attcagcggc agcggcagca gaaccgactt caccctgacc 360
atcgaccccg tggaagagga cgacgtggcc gtgtactact gcctgcagag ccggaccatc 420
ccccggacct ttggcggagg caccaaactg gaaatcaagg gcagcaccag cggctccggc 480
aagcctggct ctggcgaggg cagcacaaag ggacagattc agctggtgca gagcggccct 540
gagctgaaga aacccggcga gacagtgaag atcagctgca aggcctccgg ctacaccttc 600
accgactaca gcatcaactg ggtgaaaaga gcccctggca agggcctgaa gtggatgggc 660
tggatcaaca ccgagacaag agagcccgcc tacgcctacg acttccgggg cagattcgcc 720
ttcagcctgg aaaccagcgc cagcaccgcc tacctgcaga tcaacaacct gaagtacgag 780
gacaccgcca cctacttttg cgccctggac tacagctacg ccatggacta ctggggccag 840
ggcaccagcg tgaccgtgtc cagcttcgtg cccgtgttcc tgcccgccaa acctaccacc 900
acccctgccc ctagacctcc caccccagcc ccaacaatcg ccagccagcc tctgtctctg 960
cggcccgaag cctgtagacc tgctgccggc ggagccgtgc acaccagagg cctggacttc 1020
gcctgcgaca tctacatctg ggcccctctg gccggcacct gtggcgtgct gctgctgagc 1080
ctggtgatca ccctgtactg caaccaccgg aacagaagca agcggagccg gctgctgcac 1140
agcgactaca tgaacatgac cccaagacgg cctggcccca cccggaagca ctaccagcct 1200
tacgcccctc ccagagactt cgccgcctac cggtccagag tgaagttcag cagatccgcc 1260
gacgcccctg cctaccagca gggacagaac cagctgtaca acgagctgaa cctgggcaga 1320
cgggaagagt acgacgtgct ggacaagcgg agaggccggg accccgagat gggcggaaag 1380
cccagacgga agaaccccca ggaaggcctg tataacgaac tgcagaaaga caagatggcc 1440
gaggcctaca gcgagatcgg catgaagggc gagcggaggc gcggcaaggg ccacgatggc 1500
ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag gacacctacg acgccctgca catgcaggcc 1560
ctgcccccca ga 1572
<210> 100
<211> 2151
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC 3 cassette 2A-C11D5.3-CD8-CD28-CD3z-CNb30
<400> 100
ggttccgggg agggccgagg gtcattgctg acgtgtggag acgtggagga gaatcctggc 60
cccatggccc tgcctgtgac agctctgctc ctccctctgg ccctgctgct ccatgccgcc 120
agacccgaca tcgtgctgac ccagagcccc cccagcctgg ccatgtctct gggcaagaga 180
gccaccatca gctgccgggc cagcgagagc gtgaccatcc tgggcagcca cctgatccac 240
tggtatcagc agaagcccgg ccagcccccc accctgctga tccagctcgc cagcaatgtg 300
cagaccggcg tgcccgccag attcagcggc agcggcagca gaaccgactt caccctgacc 360
atcgaccccg tggaagagga cgacgtggcc gtgtactact gcctgcagag ccggaccatc 420
ccccggacct ttggcggagg caccaaactg gaaatcaagg gcagcaccag cggctccggc 480
aagcctggct ctggcgaggg cagcacaaag ggacagattc agctggtgca gagcggccct 540
gagctgaaga aacccggcga gacagtgaag atcagctgca aggcctccgg ctacaccttc 600
accgactaca gcatcaactg ggtgaaaaga gcccctggca agggcctgaa gtggatgggc 660
tggatcaaca ccgagacaag agagcccgcc tacgcctacg acttccgggg cagattcgcc 720
ttcagcctgg aaaccagcgc cagcaccgcc tacctgcaga tcaacaacct gaagtacgag 780
gacaccgcca cctacttttg cgccctggac tacagctacg ccatggacta ctggggccag 840
ggcaccagcg tgaccgtgtc cagcttcgtg cccgtgttcc tgcccgccaa acctaccacc 900
acccctgccc ctagacctcc caccccagcc ccaacaatcg ccagccagcc tctgtctctg 960
cggcccgaag cctgtagacc tgctgccggc ggagccgtgc acaccagagg cctggacttc 1020
gcctgcgaca tctacatctg ggcccctctg gccggcacct gtggcgtgct gctgctgagc 1080
ctggtgatca ccctgtactg caaccaccgg aacagaagca agcggagccg gctgctgcac 1140
agcgactaca tgaacatgac cccaagacgg cctggcccca cccggaagca ctaccagcct 1200
tacgcccctc ccagagactt cgccgcctac cggtccagag tgaagttcag cagatccgcc 1260
gacgcccctg cctaccagca gggacagaac cagctgtaca acgagctgaa cctgggcaga 1320
cgggaagagt acgacgtgct ggacaagcgg agaggccggg accccgagat gggcggaaag 1380
cccagacgga agaaccccca ggaaggcctg tataacgaac tgcagaaaga caagatggcc 1440
gaggcctaca gcgagatcgg catgaagggc gagcggaggc gcggcaaggg ccacgatggc 1500
ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag gacacctacg acgccctgca catgcaggcc 1560
ctgcccccca gaggcagcgg cgaaggcaga ggatccctgc ttacatgtgg cgacgtggaa 1620
gagaaccctg gccccatggg caacgaggcc agctaccctc tggagatgtg ctcccacttc 1680
gacgccgacg agatcaagcg gctgggcaag cgcttcaaga agctggacct ggacaacagc 1740
ggcagcctga gcgtggagga gtttatgtct ctgcccgagc tgcagcagaa ccccctggtg 1800
cagcgcgtga tcgacatctt cgacaccgac ggcaacggcg aggtggactt caaggagttc 1860
atcgagggcg tgagccagtt cagcgtgaag ggcgacaagg agcagaagct gcggttcgcc 1920
ttccggatct acgatatgga taaagatggc tatatttcta atggcgagct gttccaggtg 1980
ctgaagatga tggtgggcaa caataccaag ctggccgata cccagctgca gcagatcgtg 2040
gacaagacca tcatcaacgc cgacaaggac ggcgacggca gaatcagctt cgaggagttc 2100
tgtgccgtgg tgggaggcct ggatattcac aaaaaaatgg tggtggacgt g 2151
<210> 101
<211> 2880
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC 4 cassette C11D5.3-CD8-CD28-CD3z-P2A-CISCb
<400> 101
atggccctgc ctgtgacagc tctgctcctc cctctggccc tgctgctcca tgccgccaga 60
cccgacatcg tgctgaccca gagccccccc agcctggcca tgtctctggg caagagagcc 120
accatcagct gccgggccag cgagagcgtg accatcctgg gcagccacct gatccactgg 180
tatcagcaga agcccggcca gccccccacc ctgctgatcc agctcgccag caatgtgcag 240
accggcgtgc ccgccagatt cagcggcagc ggcagcagaa ccgacttcac cctgaccatc 300
gaccccgtgg aagaggacga cgtggccgtg tactactgcc tgcagagccg gaccatcccc 360
cggacctttg gcggaggcac caaactggaa atcaagggca gcaccagcgg ctccggcaag 420
cctggctctg gcgagggcag cacaaaggga cagattcagc tggtgcagag cggccctgag 480
ctgaagaaac ccggcgagac agtgaagatc agctgcaagg cctccggcta caccttcacc 540
gactacagca tcaactgggt gaaaagagcc cctggcaagg gcctgaagtg gatgggctgg 600
atcaacaccg agacaagaga gcccgcctac gcctacgact tccggggcag attcgccttc 660
agcctggaaa ccagcgccag caccgcctac ctgcagatca acaacctgaa gtacgaggac 720
accgccacct acttttgcgc cctggactac agctacgcca tggactactg gggccagggc 780
accagcgtga ccgtgtccag cttcgtgccc gtgttcctgc ccgccaaacc taccaccacc 840
cctgccccta gacctcccac cccagcccca acaatcgcca gccagcctct gtctctgcgg 900
cccgaagcct gtagacctgc tgccggcgga gccgtgcaca ccagaggcct ggacttcgcc 960
tgcgacatct acatctgggc ccctctggcc ggcacctgtg gcgtgctgct gctgagcctg 1020
gtgatcaccc tgtactgcaa ccaccggaac agaagcaagc ggagccggct gctgcacagc 1080
gactacatga acatgacccc aagacggcct ggccccaccc ggaagcacta ccagccttac 1140
gcccctccca gagacttcgc cgcctaccgg tccagagtga agttcagcag atccgccgac 1200
gcccctgcct accagcaggg acagaaccag ctgtacaacg agctgaacct gggcagacgg 1260
gaagagtacg acgtgctgga caagcggaga ggccgggacc ccgagatggg cggaaagccc 1320
agacggaaga acccccagga aggcctgtat aacgaactgc agaaagacaa gatggccgag 1380
gcctacagcg agatcggcat gaagggcgag cggaggcgcg gcaagggcca cgatggcctg 1440
taccagggcc tgagcaccgc caccaaggac acctacgacg ccctgcacat gcaggccctg 1500
ccccccagag gatccggcgc tacaaatttt tcactgctga aacaggcggg tgatgtggag 1560
gagaaccctg gacccatgcc acttggcctg ctctggctgg gcttggcatt gctcggcgcg 1620
ctccacgccc aggctgaact gatccgcgtg gccatattgt ggcatgagat gtggcatgag 1680
ggattggagg aggcgagtag gctgtacttt ggggaaagga atgttaaagg gatgtttgag 1740
gtccttgaac ccctccacgc tatgatggaa agaggacctc aaacgcttaa agagacgtca 1800
ttcaatcaag cctatggacg ggatcttatg gaagctcaag aatggtgtcg aaaatacatg 1860
aaaagcggga atgttaagga cctcacgcaa gcctgggatc tgtattacca tgttttccga 1920
cgcatttcta aacaaggaaa agatactatc ccatggttgg ggcacttgct cgttgggctc 1980
agtggggcgt ttggattcat catcctcgta tatctgttga ttaattgtcg gaacacaggt 2040
ccctggctta aaaaagtttt gaagtgtaac accccggatc cttctaaatt ttttagtcaa 2100
cttagttcag aacacggggg cgatgttcaa aagtggctga gttccccgtt tcccagttca 2160
agtttctccc ctgggggtct cgcccccgag atatcacctc ttgaagtgct cgagcgggac 2220
aaagttacac agcttctttt gcaacaggat aaggttccgg agccggcgtc tctcagctct 2280
aaccattcac tcacttcttg tttcaccaac caagggtatt ttttcttcca tctgcctgat 2340
gccttggaga ttgaggcttg tcaggtgtac tttacctatg acccctatag tgaggaagac 2400
cctgacgaag gcgtagctgg cgcccccact ggctccagtc cacagcctct tcagcctctg 2460
tcaggggagg acgacgcata ttgtacgttc ccctcacggg acgaccttct gctgttttca 2520
ccctcactgc tcggcggacc ctccccgcca agcacggcac ctggggggag tggggcagga 2580
gaagaaagga tgcctcctag tttgcaggag cgggttcctc gcgactggga tccgcaaccc 2640
ctcggaccac ccacccctgg cgtacctgat ctggtcgact tccaaccacc tccggagctt 2700
gtcctcagag aggccggaga ggaagtccca gacgcggggc caagagaggg tgtgtcattt 2760
ccctggtccc gccctccggg acagggtgag tttcgggcgc tgaatgcgag gctccccctt 2820
aataccgatg cgtacctgtc attgcaggaa cttcagggcc aggatcctac ccacctggtg 2880
<210> 102
<211> 2943
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC 5 cassette 2A-C11D5.3-CD8-CD28-CD3z-CISCb
<400> 102
ggttccgggg agggccgagg gtcattgctg acgtgtggag acgtggagga gaatcctggc 60
cccatggccc tgcctgtgac agctctgctc ctccctctgg ccctgctgct ccatgccgcc 120
agacccgaca tcgtgctgac ccagagcccc cccagcctgg ccatgtctct gggcaagaga 180
gccaccatca gctgccgggc cagcgagagc gtgaccatcc tgggcagcca cctgatccac 240
tggtatcagc agaagcccgg ccagcccccc accctgctga tccagctcgc cagcaatgtg 300
cagaccggcg tgcccgccag attcagcggc agcggcagca gaaccgactt caccctgacc 360
atcgaccccg tggaagagga cgacgtggcc gtgtactact gcctgcagag ccggaccatc 420
ccccggacct ttggcggagg caccaaactg gaaatcaagg gcagcaccag cggctccggc 480
aagcctggct ctggcgaggg cagcacaaag ggacagattc agctggtgca gagcggccct 540
gagctgaaga aacccggcga gacagtgaag atcagctgca aggcctccgg ctacaccttc 600
accgactaca gcatcaactg ggtgaaaaga gcccctggca agggcctgaa gtggatgggc 660
tggatcaaca ccgagacaag agagcccgcc tacgcctacg acttccgggg cagattcgcc 720
ttcagcctgg aaaccagcgc cagcaccgcc tacctgcaga tcaacaacct gaagtacgag 780
gacaccgcca cctacttttg cgccctggac tacagctacg ccatggacta ctggggccag 840
ggcaccagcg tgaccgtgtc cagcttcgtg cccgtgttcc tgcccgccaa acctaccacc 900
acccctgccc ctagacctcc caccccagcc ccaacaatcg ccagccagcc tctgtctctg 960
cggcccgaag cctgtagacc tgctgccggc ggagccgtgc acaccagagg cctggacttc 1020
gcctgcgaca tctacatctg ggcccctctg gccggcacct gtggcgtgct gctgctgagc 1080
ctggtgatca ccctgtactg caaccaccgg aacagaagca agcggagccg gctgctgcac 1140
agcgactaca tgaacatgac cccaagacgg cctggcccca cccggaagca ctaccagcct 1200
tacgcccctc ccagagactt cgccgcctac cggtccagag tgaagttcag cagatccgcc 1260
gacgcccctg cctaccagca gggacagaac cagctgtaca acgagctgaa cctgggcaga 1320
cgggaagagt acgacgtgct ggacaagcgg agaggccggg accccgagat gggcggaaag 1380
cccagacgga agaaccccca ggaaggcctg tataacgaac tgcagaaaga caagatggcc 1440
gaggcctaca gcgagatcgg catgaagggc gagcggaggc gcggcaaggg ccacgatggc 1500
ctgtaccagg gcctgagcac cgccaccaag gacacctacg acgccctgca catgcaggcc 1560
ctgcccccca gaggatccgg cgctacaaat ttttcactgc tgaaacaggc gggtgatgtg 1620
gaggagaacc ctggacccat gccacttggc ctgctctggc tgggcttggc attgctcggc 1680
gcgctccacg cccaggctga actgatccgc gtggccatat tgtggcatga gatgtggcat 1740
gagggattgg aggaggcgag taggctgtac tttggggaaa ggaatgttaa agggatgttt 1800
gaggtccttg aacccctcca cgctatgatg gaaagaggac ctcaaacgct taaagagacg 1860
tcattcaatc aagcctatgg acgggatctt atggaagctc aagaatggtg tcgaaaatac 1920
atgaaaagcg ggaatgttaa ggacctcacg caagcctggg atctgtatta ccatgttttc 1980
cgacgcattt ctaaacaagg aaaagatact atcccatggt tggggcactt gctcgttggg 2040
ctcagtgggg cgtttggatt catcatcctc gtatatctgt tgattaattg tcggaacaca 2100
ggtccctggc ttaaaaaagt tttgaagtgt aacaccccgg atccttctaa attttttagt 2160
caacttagtt cagaacacgg gggcgatgtt caaaagtggc tgagttcccc gtttcccagt 2220
tcaagtttct cccctggggg tctcgccccc gagatatcac ctcttgaagt gctcgagcgg 2280
gacaaagtta cacagcttct tttgcaacag gataaggttc cggagccggc gtctctcagc 2340
tctaaccatt cactcacttc ttgtttcacc aaccaagggt attttttctt ccatctgcct 2400
gatgccttgg agattgaggc ttgtcaggtg tactttacct atgaccccta tagtgaggaa 2460
gaccctgacg aaggcgtagc tggcgccccc actggctcca gtccacagcc tcttcagcct 2520
ctgtcagggg aggacgacgc atattgtacg ttcccctcac gggacgacct tctgctgttt 2580
tcaccctcac tgctcggcgg accctccccg ccaagcacgg cacctggggg gagtggggca 2640
ggagaagaaa ggatgcctcc tagtttgcag gagcgggttc ctcgcgactg ggatccgcaa 2700
cccctcggac cacccacccc tggcgtacct gatctggtcg acttccaacc acctccggag 2760
cttgtcctca gagaggccgg agaggaagtc ccagacgcgg ggccaagaga gggtgtgtca 2820
tttccctggt cccgccctcc gggacagggt gagtttcggg cgctgaatgc gaggctcccc 2880
cttaataccg atgcgtacct gtcattgcag gaacttcagg gccaggatcc tacccacctg 2940
gtg 2943
<210> 103
<211> 2907
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC 6 cassette C11D5.3-CD8-41BB-CD3z-P2A-CISCb
<400> 103
atggccctgc ctgtgacagc tctgctcctc cctctggccc tgctgctcca tgccgccaga 60
cccgacatcg tgctgaccca gagccccccc agcctggcca tgtctctggg caagagagcc 120
accatcagct gccgggccag cgagagcgtg accatcctgg gcagccacct gatccactgg 180
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accggcgtgc ccgccagatt cagcggcagc ggcagcagaa ccgacttcac cctgaccatc 300
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ctgaagaaac ccggcgagac agtgaagatc agctgcaagg cctccggcta caccttcacc 540
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gacttcgcct gcgacatcta catctgggcc cctctggccg gcacctgtgg cgtgctgctg 1020
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ggcagaaaga agctgctgta catcttcaag cagcccttca tgcggcccgt gcagaccaca 1140
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<210> 104
<211> 2970
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> TRAC 7 cassette 2A-C11D5.3-AAA-CD8-41BB-CD3z-P2A-CISCb
<400> 104
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agacccgaca tcgtgctgac ccagagcccc cccagcctgg ccatgtctct gggcaagaga 180
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tggtatcagc agaagcccgg ccagcccccc accctgctga tccagctcgc cagcaatgtg 300
cagaccggcg tgcccgccag attcagcggc agcggcagca gaaccgactt caccctgacc 360
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ttcagcctgg aaaccagcgc cagcaccgcc tacctgcaga tcaacaacct gaagtacgag 780
gacaccgcca cctacttttg cgccctggac tacagctacg ccatggacta ctggggccag 840
ggcaccagcg tgaccgtgtc cagcgccgcc gccttcgtgc ccgtgttcct gcccgccaaa 900
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ctggacttcg cctgcgacat ctacatctgg gcccctctgg ccggcacctg tggcgtgctg 1080
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cggaggcgcg gcaagggcca cgatggcctg taccagggcc tgagcaccgc caccaaggac 1560
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tatctgttga ttaattgtcg gaacacaggt ccctggctta aaaaagtttt gaagtgtaac 2160
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atatcacctc ttgaagtgct cgagcgggac aaagttacac agcttctttt gcaacaggat 2340
aaggttccgg agccggcgtc tctcagctct aaccattcac tcacttcttg tttcaccaac 2400
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agcacggcac ctggggggag tggggcagga gaagaaagga tgcctcctag tttgcaggag 2700
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ctggtcgact tccaaccacc tccggagctt gtcctcagag aggccggaga ggaagtccca 2820
gacgcggggc caagagaggg tgtgtcattt ccctggtccc gccctccggg acagggtgag 2880
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<211> 2571
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2RG 8 cassette MND-nakedFRB-tLNGFR-CNb30-CISCg
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ctgctccccg agctctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cggtaccgcc 360
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cgcaatgtga agggcatgtt tgaagtcctc gaaccccttc atgccatgat ggaacgcgga 480
ccccagacct tgaaggagac aagttttaac caagcttacg gaagagacct gatggaagcc 540
caggaatggt gcaggaaata catgaaaagc gggaatgtga aggacttgct ccaagcgtgg 600
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ctgctgaaac aggccggcga cgtggaagag aaccctggac ccatgggtgc tggcgcaact 720
ggacgcgcta tggatggacc tcgcttgctg cttcttctgc ttctcggggt ctcattgggt 780
ggtgctaagg aagcatgccc aacgggactt tatacgcata gcggagagtg ttgcaaagct 840
tgtaacctgg gcgaaggcgt cgcgcaacct tgtggtgcaa atcaaaccgt ctgcgagcca 900
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tgctcccact tcgacgccga cgagatcaag cggctgggca agcgcttcaa gaagctggac 1680
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ttcaaggagt tcatcgaggg cgtgagccag ttcagcgtga agggcgacaa ggagcagaag 1860
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ctgttccagg tgctgaagat gatggtgggc aacaatacca agctggccga tacccagctg 1980
cagcagatcg tggacaagac catcatcaac gccgacaagg acggcgacgg cagaatcagc 2040
ttcgaggagt tctgtgccgt ggtgggaggc ctggatattc acaaaaaaat ggtggtggac 2100
gtgggatccg gcgctacaaa tttttcactg ctgaaacagg cgggtgacgt ggaggagaac 2160
cctggaccca tgcctctggg cctgctgtgg ctgggcctgg ccctgctggg cgccctgcac 2220
gcccaggccg gcgtgcaggt ggagacaatc tccccaggcg acggacgcac attccctaag 2280
cggggccaga cctgcgtggt gcactataca ggcatgctgg aggatggcaa gaagtttgac 2340
agctcccggg atagaaacaa gccattcaag tttatgctgg gcaagcagga agtgatcaga 2400
ggctgggagg agggcgtggc ccagatgtct gtgggccaga gggccaagct gaccatcagc 2460
ccagactacg cctatggagc aacaggccac ccaggaatca tcccacctca cgccaccctg 2520
gtgttcgatg tggagctgct gaagctgggc gagggcagca acaccagcaa a 2571
<210> 106
<211> 3531
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2RG 9 cassette MND-B2MCAR-nakedFRB-tLNGFR-CNb30-CISCg
<400> 106
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tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggtccccag atgcggtccc 180
gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg gtgccccaag gacctgaaat 240
gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc tcgcttctgt tcgcgcgctt 300
ctgctccccg agctctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cggtaccgcc 360
gccaccatga gcaggtcagt ggcgttggcg gttctggcgc ttttgagttt gagcggactg 420
gaagccatcc aacgaacgcc taagatccag gtatattcac gccacccggc ggaaaacggc 480
aaaagtaact tccttaattg ttatgtgtct ggcttccacc cgtctgatat tgaggtggac 540
ctccttaaaa acggtgaacg gatcgagaaa gtggagcatt ccgatcttag tttcagtaag 600
gattggagct tttaccttct ctattacact gagttcactc cgactgaaaa ggatgagtac 660
gcctgtcggg tcaaccacgt caccctgtct caaccaaaaa tagtcaaatg ggacagagat 720
atgtcagata tttacatatg ggcaccactt gcgggcacgt gtggcgtcct gcttctgagt 780
ctcgtcatta cgctttattg taaacggggt agaaaaaaac tcctttatat atttaaacag 840
ccatttatgc ggccagttca aacgacgcag gaagaagacg gctgtagttg cagatttcca 900
gaggaagagg aaggtggatg cgagcttcgg gtcaagttta gtaggtctgc agacgctccc 960
gcctatcaac agggtcagaa tcagctttat aacgaactca acctcggtcg ccgagaagag 1020
tacgacgtac tcgataaaag aaggggtaga gacccggaaa tggggggcaa accgcgccgc 1080
aaaaatccac aagaggggct ttataatgag cttcaaaaag acaaaatggc cgaagcatac 1140
agtgagattg ggatgaaagg tgaacgcaga agaggtaagg gtcacgacgg gctgtaccag 1200
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caggaatggt gcaggaaata catgaaaagc gggaatgtga aggacttgct ccaagcgtgg 1560
gacctgtact atcacgtctt taggcgcatt agtaagggca gcggcgccac aaatttcagc 1620
ctgctgaaac aggccggcga cgtggaagag aaccctggac ccatgggtgc tggcgcaact 1680
ggacgcgcta tggatggacc tcgcttgctg cttcttctgc ttctcggggt ctcattgggt 1740
ggtgctaagg aagcatgccc aacgggactt tatacgcata gcggagagtg ttgcaaagct 1800
tgtaacctgg gcgaaggcgt cgcgcaacct tgtggtgcaa atcaaaccgt ctgcgagcca 1860
tgtttggact ctgttacgtt tagtgacgta gtatctgcga cagagccatg caagccttgt 1920
acggaatgtg taggattgca gagcatgtct gccccttgtg tagaagccga cgatgcagtt 1980
tgcaggtgcg cgtatggcta ttaccaagac gaaacaaccg gacgatgtga agcttgccga 2040
gtttgtgaag cgggttccgg gcttgtattc tcatgtcagg ataagcagaa caccgtctgc 2100
gaagagtgcc ccgatggcac ctacagcgat gaagcgaacc atgtagaccc ctgcctgcct 2160
tgcaccgttt gtgaagacac ggaacgacag ttgcgggagt gtacccggtg ggcagacgcc 2220
gagtgcgaag agattccagg ccgctggatc acgcgaagta ccccgccaga aggttccgac 2280
agtactgcac caagcaccca agaaccagag gcgccccccg agcaggacct gattgcctcc 2340
accgtggcgg gtgttgttac tacggttatg ggctcatccc agcccgttgt tacccgagga 2400
actacagaca acctgattcc ggtatattgt tctatcttgg cggctgtagt agttggcttg 2460
gtcgcctaca tcgctttcaa aagaggttcc ggggagggcc gagggtcatt gctgacgtgt 2520
ggagacgtgg aggagaatcc tggccccatg ggcaacgagg ccagctaccc tctggagatg 2580
tgctcccact tcgacgccga cgagatcaag cggctgggca agcgcttcaa gaagctggac 2640
ctggacaaca gcggcagcct gagcgtggag gagtttatgt ctctgcccga gctgcagcag 2700
aaccccctgg tgcagcgcgt gatcgacatc ttcgacaccg acggcaacgg cgaggtggac 2760
ttcaaggagt tcatcgaggg cgtgagccag ttcagcgtga agggcgacaa ggagcagaag 2820
ctgcggttcg ccttccggat ctacgatatg gataaagatg gctatatttc taatggcgag 2880
ctgttccagg tgctgaagat gatggtgggc aacaatacca agctggccga tacccagctg 2940
cagcagatcg tggacaagac catcatcaac gccgacaagg acggcgacgg cagaatcagc 3000
ttcgaggagt tctgtgccgt ggtgggaggc ctggatattc acaaaaaaat ggtggtggac 3060
gtgggatccg gcgctacaaa tttttcactg ctgaaacagg cgggtgacgt ggaggagaac 3120
cctggaccca tgcctctggg cctgctgtgg ctgggcctgg ccctgctggg cgccctgcac 3180
gcccaggccg gcgtgcaggt ggagacaatc tccccaggcg acggacgcac attccctaag 3240
cggggccaga cctgcgtggt gcactataca ggcatgctgg aggatggcaa gaagtttgac 3300
agctcccggg atagaaacaa gccattcaag tttatgctgg gcaagcagga agtgatcaga 3360
ggctgggagg agggcgtggc ccagatgtct gtgggccaga gggccaagct gaccatcagc 3420
ccagactacg cctatggagc aacaggccac ccaggaatca tcccacctca cgccaccctg 3480
gtgttcgatg tggagctgct gaagctgggc gagggcagca acaccagcaa a 3531
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<211> 3054
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2RG 10 cassette MND-nakedFRB-CNb30-CISCb-CISCg
<400> 107
gtgtgaacag agaaacagga gaatatgggc caaacaggat atctgtggta agcagttcct 60
gccccggctc agggccaaga acagttggaa cagcagaata tgggccaaac aggatatctg 120
tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggtccccag atgcggtccc 180
gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg gtgccccaag gacctgaaat 240
gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc tcgcttctgt tcgcgcgctt 300
ctgctccccg agctctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cggtaccgcc 360
gccaccatgg agatgtggca tgagggtctg gaagaagcgt ctcgactgta ctttggtgag 420
cgcaatgtga agggcatgtt tgaagtcctc gaaccccttc atgccatgat ggaacgcgga 480
ccccagacct tgaaggagac aagttttaac caagcttacg gaagagacct gatggaagcc 540
caggaatggt gcaggaaata catgaaaagc gggaatgtga aggacttgct ccaagcgtgg 600
gacctgtact atcacgtctt taggcgcatt agtaagggca gcggcgccac aaatttcagc 660
ctgctgaaac aggccggcga cgtggaagag aaccctggac ccatgggcaa cgaggccagc 720
taccctctgg agatgtgctc ccacttcgac gccgacgaga tcaagcggct gggcaagcgc 780
ttcaagaagc tggacctgga caacagcggc agcctgagcg tggaggagtt tatgtctctg 840
cccgagctgc agcagaaccc cctggtgcag cgcgtgatcg acatcttcga caccgacggc 900
aacggcgagg tggacttcaa ggagttcatc gagggcgtga gccagttcag cgtgaagggc 960
gacaaggagc agaagctgcg gttcgccttc cggatctacg atatggataa agatggctat 1020
atttctaatg gcgagctgtt ccaggtgctg aagatgatgg tgggcaacaa taccaagctg 1080
gccgataccc agctgcagca gatcgtggac aagaccatca tcaacgccga caaggacggc 1140
gacggcagaa tcagcttcga ggagttctgt gccgtggtgg gaggcctgga tattcacaaa 1200
aaaatggtgg tggacgtggg cagcggcgaa ggcagaggat ccctgcttac atgtggcgac 1260
gtggaagaga accctggccc catgccactt ggcctgctct ggctgggctt ggcattgctc 1320
ggcgcgctcc acgcccaggc tgaactgatc cgcgtggcca tattgtggca cgagatgtgg 1380
cacgagggat tggaggaggc gagtaggctg tactttgggg aaaggaatgt taaagggatg 1440
tttgaggtcc ttgaacccct ccacgctatg atggaaagag gacctcaaac gcttaaagag 1500
acgtcattca atcaagccta tggacgggat cttatggaag ctcaagaatg gtgtcgaaaa 1560
tacatgaaaa gcgggaatgt taaggacctc acgcaagcct gggatctgta ttaccatgtt 1620
ttccgacgca tttctaaaca aggaaaagat actatcccat ggttggggca cttgctcgtt 1680
gggctcagtg gggcgtttgg attcatcatc ctcgtatatc tgttgattaa ttgtcggaac 1740
acaggtccct ggcttaaaaa agttttgaag tgtaacaccc cggatccttc taaatttttt 1800
agtcaactta gttcagaaca cgggggcgat gttcaaaagt ggctgagttc cccgtttccc 1860
agttcaagtt tctcccctgg gggtctcgcc cccgagatat cacctcttga agtgctcgag 1920
cgggacaaag ttacacagct tcttttgcaa caggataagg ttccggagcc ggcgtctctc 1980
agctctaacc attcactcac ttcttgtttc accaaccaag ggtatttttt cttccatctg 2040
cctgatgcct tggagattga ggcttgtcag gtgtacttta cctatgaccc ctatagtgag 2100
gaagaccctg acgaaggcgt agctggcgcc cccactggct ccagtccaca gcctcttcag 2160
cctctgtcag gggaggacga cgcatattgt acgttcccct cacgggacga ccttctgctg 2220
ttttcaccct cactgctcgg cggaccctcc ccgccaagca cggcacctgg ggggagtggg 2280
gcaggagaag aaaggatgcc tcctagtttg caggagcggg ttcctcgcga ctgggatccg 2340
caacccctcg gaccacccac ccctggcgta cctgatctgg tcgacttcca accacctccg 2400
gagcttgtcc tcagagaggc cggagaggaa gtcccagacg cggggccaag agagggtgtg 2460
tcatttccct ggtcccgccc tccgggacag ggtgagtttc gggcgctgaa tgcgaggctc 2520
ccccttaata ccgatgcgta cctgtcattg caggaacttc agggccagga tcctacccac 2580
ctggtgggat ccggcgctac aaatttttca ctgctgaaac aggcgggtga cgtggaggag 2640
aaccctggac ccatgcctct gggcctgctg tggctgggcc tggccctgct gggcgccctg 2700
cacgcccagg ccggcgtgca ggtggagaca atctccccag gcgacggacg cacattccct 2760
aagcggggcc agacctgcgt ggtgcactat acaggcatgc tggaggatgg caagaagttt 2820
gacagctccc gggatagaaa caagccattc aagtttatgc tgggcaagca ggaagtgatc 2880
agaggctggg aggagggcgt ggcccagatg tctgtgggcc agagggccaa gctgaccatc 2940
agcccagact acgcctatgg agcaacaggc cacccaggaa tcatcccacc tcacgccacc 3000
ctggtgttcg atgtggagct gctgaagctg ggcgagggca gcaacaccag caaa 3054
<210> 108
<211> 3435
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Synthetic polynucleotide
<220>
<221> misc_feature
<223> IL2RG 11 cassette MND-B2MCAR-nakedFRB-CISCb-CISCg
<400> 108
gtgtgaacag agaaacagga gaatatgggc caaacaggat atctgtggta agcagttcct 60
gccccggctc agggccaaga acagttggaa cagcagaata tgggccaaac aggatatctg 120
tggtaagcag ttcctgcccc ggctcagggc caagaacaga tggtccccag atgcggtccc 180
gccctcagca gtttctagag aaccatcaga tgtttccagg gtgccccaag gacctgaaat 240
gaccctgtgc cttatttgaa ctaaccaatc agttcgcttc tcgcttctgt tcgcgcgctt 300
ctgctccccg agctctatat aagcagagct cgtttagtga accgtcagat cggtaccgcc 360
gccaccatga gcaggtcagt ggcgttggcg gttctggcgc ttttgagttt gagcggactg 420
gaagccatcc aacgaacgcc taagatccag gtatattcac gccacccggc ggaaaacggc 480
aaaagtaact tccttaattg ttatgtgtct ggcttccacc cgtctgatat tgaggtggac 540
ctccttaaaa acggtgaacg gatcgagaaa gtggagcatt ccgatcttag tttcagtaag 600
gattggagct tttaccttct ctattacact gagttcactc cgactgaaaa ggatgagtac 660
gcctgtcggg tcaaccacgt caccctgtct caaccaaaaa tagtcaaatg ggacagagat 720
atgtcagata tttacatatg ggcaccactt gcgggcacgt gtggcgtcct gcttctgagt 780
ctcgtcatta cgctttattg taaacggggt agaaaaaaac tcctttatat atttaaacag 840
ccatttatgc ggccagttca aacgacgcag gaagaagacg gctgtagttg cagatttcca 900
gaggaagagg aaggtggatg cgagcttcgg gtcaagttta gtaggtctgc agacgctccc 960
gcctatcaac agggtcagaa tcagctttat aacgaactca acctcggtcg ccgagaagag 1020
tacgacgtac tcgataaaag aaggggtaga gacccggaaa tggggggcaa accgcgccgc 1080
aaaaatccac aagaggggct ttataatgag cttcaaaaag acaaaatggc cgaagcatac 1140
agtgagattg ggatgaaagg tgaacgcaga agaggtaagg gtcacgacgg gctgtaccag 1200
ggtttgtcaa ctgccacaaa ggatacttat gacgctctgc atatgcaagc tcttccccca 1260
cgcggcagcg gcgaaggcag aggatccctg cttacatgtg gcgacgtgga agagaaccct 1320
ggccccatgg agatgtggca tgagggtctg gaagaagcgt ctcgactgta ctttggtgag 1380
cgcaatgtga agggcatgtt tgaagtcctc gaaccccttc atgccatgat ggaacgcgga 1440
ccccagacct tgaaggagac aagttttaac caagcttacg gaagagacct gatggaagcc 1500
caggaatggt gcaggaaata catgaaaagc gggaatgtga aggacttgct ccaagcgtgg 1560
gacctgtact atcacgtctt taggcgcatt agtaagggca gcggcgccac aaatttcagc 1620
ctgctgaaac aggccggcga cgtggaagag aaccctggac ccatgccact tggcctgctc 1680
tggctgggct tggcattgct cggcgcgctc cacgcccagg ctgaactgat ccgcgtggcc 1740
atattgtggc acgagatgtg gcacgaggga ttggaggagg cgagtaggct gtactttggg 1800
gaaaggaatg ttaaagggat gtttgaggtc cttgaacccc tccacgctat gatggaaaga 1860
ggacctcaaa cgcttaaaga gacgtcattc aatcaagcct atggacggga tcttatggaa 1920
gctcaagaat ggtgtcgaaa atacatgaaa agcgggaatg ttaaggacct cacgcaagcc 1980
tgggatctgt attaccatgt tttccgacgc atttctaaac aaggaaaaga tactatccca 2040
tggttggggc acttgctcgt tgggctcagt ggggcgtttg gattcatcat cctcgtatat 2100
ctgttgatta attgtcggaa cacaggtccc tggcttaaaa aagttttgaa gtgtaacacc 2160
ccggatcctt ctaaattttt tagtcaactt agttcagaac acgggggcga tgttcaaaag 2220
tggctgagtt ccccgtttcc cagttcaagt ttctcccctg ggggtctcgc ccccgagata 2280
tcacctcttg aagtgctcga gcgggacaaa gttacacagc ttcttttgca acaggataag 2340
gttccggagc cggcgtctct cagctctaac cattcactca cttcttgttt caccaaccaa 2400
gggtattttt tcttccatct gcctgatgcc ttggagattg aggcttgtca ggtgtacttt 2460
acctatgacc cctatagtga ggaagaccct gacgaaggcg tagctggcgc ccccactggc 2520
tccagtccac agcctcttca gcctctgtca ggggaggacg acgcatattg tacgttcccc 2580
tcacgggacg accttctgct gttttcaccc tcactgctcg gcggaccctc cccgccaagc 2640
acggcacctg gggggagtgg ggcaggagaa gaaaggatgc ctcctagttt gcaggagcgg 2700
gttcctcgcg actgggatcc gcaacccctc ggaccaccca cccctggcgt acctgatctg 2760
gtcgacttcc aaccacctcc ggagcttgtc ctcagagagg ccggagagga agtcccagac 2820
gcggggccaa gagagggtgt gtcatttccc tggtcccgcc ctccgggaca gggtgagttt 2880
cgggcgctga atgcgaggct cccccttaat accgatgcgt acctgtcatt gcaggaactt 2940
cagggccagg atcctaccca cctggtggga tccggcgcta caaatttttc actgctgaaa 3000
caggcgggtg acgtggagga gaaccctgga cccatgcctc tgggcctgct gtggctgggc 3060
ctggccctgc tgggcgccct gcacgcccag gccggcgtgc aggtggagac aatctcccca 3120
ggcgacggac gcacattccc taagcggggc cagacctgcg tggtgcacta tacaggcatg 3180
ctggaggatg gcaagaagtt tgacagctcc cgggatagaa acaagccatt caagtttatg 3240
ctgggcaagc aggaagtgat cagaggctgg gaggagggcg tggcccagat gtctgtgggc 3300
cagagggcca agctgaccat cagcccagac tacgcctatg gagcaacagg ccacccagga 3360
atcatcccac ctcacgccac cctggtgttc gatgtggagc tgctgaagct gggcgagggc 3420
agcaacacca gcaaa 3435
Claims (145)
- a) 비-기능적 T 세포 수용체 알파 불변 (TRAC) 도메인을 코딩하도록 변형된 내인성 T 세포 수용체 알파 (TRA) 유전자; 및 b) B-세포 성숙 항원 (BCMA)을 인식할 수 있는 키메라 항원 수용체 (CAR)를 코딩하는 핵산을 포함하는 조작된 T 세포.
- 제1항에 있어서, BCMA를 인식할 수 있는 CAR이 세포외 BCMA 인식 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인 세포.
- 제2항에 있어서, 세포외 BCMA 인식 도메인이 BCMA에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 모이어티인 세포.
- 제3항에 있어서, 항체 모이어티가 서열식별번호: 55로부터의 중쇄 상보성-결정 영역 (HC-CDR)1, HC-CDR2, HC-CDR3, 경쇄 상보성-결정 영역 (LC-CDR)1, LC-CDR2, 및 LC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 것인 세포.
- 제3항 또는 제4항에 있어서, 항체 모이어티가 scFv인 세포.
- 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, CAR 막횡단 도메인이 CD8 막횡단 도메인을 포함하고/거나, CAR 공동-자극성 도메인이 4-1BB 및/또는 CD28 공동-자극성 도메인을 포함하고/거나, CAR 세포질 신호전달 도메인이 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인 세포.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, b) BCMA를 인식할 수 있는 CAR을 코딩하는 핵산이 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나, 또는 b) BCMA를 인식할 수 있는 CAR을 코딩하는 핵산이 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 것인 세포.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, c) 이량체화 활성화가능한 화학적-유도된 신호전달 복합체 (CISC)의 폴리펩티드 구성성분을 코딩하는 1종 이상의 핵산을 추가로 포함하며, 여기서 CISC의 폴리펩티드 구성성분은 하기를 포함하고:
i) 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 제1 CISC 구성성분; 및
ii) 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 제2 CISC 구성성분;
여기서 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분은, 발현되는 경우에, 이들이 리간드의 존재 하에서 이량체화하여 신호전달-적격 CISC를 생성하도록 구성된 것인
세포. - 제8항에 있어서, 제1 CISC 구성성분의 신호전달 도메인이 IL-2 수용체 서브유닛 감마 (IL2Rγ) 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인 세포.
- 제9항에 있어서, IL2Rγ 세포질 신호전달 도메인이 서열식별번호: 50의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 세포.
- 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분이 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 것인 세포.
- 제11항에 있어서, FKBP 도메인이 서열식별번호: 47의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 47의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 세포.
- 제8항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 CISC 구성성분의 신호전달 도메인이 IL-2 수용체 서브유닛 베타 (IL2Rβ) 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인 세포.
- 제13항에 있어서, IL2Rβ 세포질 신호전달 도메인이 서열식별번호: 51의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 51의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 세포.
- 제8항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분이 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 것인 세포.
- 제15항에 있어서, FRB가 서열식별번호: 48의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 48의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 세포.
- 제8항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 CISC 구성성분의 막횡단 도메인이 독립적으로 IL-2 수용체 막횡단 도메인을 포함하는 것인 세포.
- 제8항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 1) 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 1종 이상의 핵산이 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되고, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 1종 이상의 핵산이 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나; 또는 2) 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 1종 이상의 핵산이 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되고, 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 1종 이상의 핵산이 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 것인 세포.
- 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 라파마이신 또는 라파마이신 유사체 (라파로그)인 세포.
- 제19항에 있어서, 라파로그가 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 세포.
- 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 0.05 nM 내지 100 nM의 양으로 존재하거나 또는 제공되는 것인 세포.
- 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, d) 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체를 코딩하는 1종 이상의 핵산을 추가로 포함하는 세포.
- 제22항에 있어서, 키메라 수용체 막횡단 도메인이 CD8 막횡단 도메인을 포함하고/거나, 키메라 수용체 공동-자극성 도메인이 4-1BB 공동-자극성 도메인을 포함하고/거나, 키메라 수용체 세포질 신호전달 도메인이 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인 세포.
- 제23항에 있어서, 키메라 수용체가 서열식별번호: 65의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 65의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 세포.
- 제22항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, d) 키메라 수용체를 코딩하는 1종 이상의 핵산이 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나, 또는 d) 키메라 수용체를 코딩하는 1종 이상의 핵산이 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 것인 세포.
- 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, g) 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 세포.
- 제26항에 있어서, 선택가능한 마커가 말단절단된 저-친화도 신경 성장 인자 수용체 (tLNGFR) 폴리펩티드인 세포.
- 제27항에 있어서, tLNGFR 폴리펩티드가 서열식별번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 것인 세포.
- 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산이 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나, 또는 선택가능한 마커를 코딩하는 핵산이 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 것인 세포.
- 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, e) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 세포.
- 제30항에 있어서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드가 타크롤리무스 (FK506) 및/또는 시클로스포린 A (CsA)에 대한 저항성을 부여하는 것인 세포.
- 제30항 또는 제31항에 있어서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드가 돌연변이체 칼시뉴린 (CN) 폴리펩티드인 세포.
- 제32항에 있어서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드가 타크롤리무스 (FK506) 및 시클로스포린 A (CsA)에 대한 저항성을 부여하는 것인 세포.
- 제32항 또는 제33항에 있어서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드가 CNb30 (서열식별번호: 67)인 세포.
- 제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나, 또는 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 것인 세포.
- 제1항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, f) 포유동물 라파마이신의 표적 (mTOR) 키나제의 FKBP-라파마이신 결합 (FRB) 도메인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 세포.
- 제36항에 있어서, FRB 도메인 폴리펩티드가 세포내 발현되는 것인 세포.
- 제36항 또는 제37항에 있어서, FRB 도메인 폴리펩티드가 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산 또는 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 변이체를 포함하는 것인 세포.
- 제36항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, FRB 도메인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나, 또는 FRB 도메인 폴리펩티드를 코딩하는 핵산이 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 것인 세포.
- TRAC 도메인을 코딩하는 영역 내의 또는 그 부근의 내인성 TRA 유전자에서의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 가이드 RNA (gRNA).
- 제40항에 있어서, gRNA가 서열식별번호: 1-3 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 1-3 중 어느 하나와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 gRNA.
- 내인성 IL2RG 유전자 내의 또는 그 부근의 서열에 상보적인 서열을 포함하는 가이드 RNA (gRNA).
- 제42항에 있어서, gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 gRNA.
- a) 제1 gRNA가 제40항 또는 제41항의 gRNA이고 제2 gRNA가 제42항 또는 제43항의 gRNA인 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA; 및 b) RNA-가이드된 엔도뉴클레아제 (RGEN) 또는 RGEN을 코딩하는 핵산을 포함하는 시스템.
- 제44항에 있어서, c) 하기를 코딩하는 핵산을 포함하는 1종 이상의 공여자 주형을 추가로 포함하며:
i) B-세포 성숙 항원 (BCMA) 폴리펩티드를 인식할 수 있는 CAR;
ii) 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인 또는 그의 부분 또는 그의 기능적 유도체를 포함하는 제1 CISC 구성성분; 및
iii) 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 제2 CISC 구성성분,
여기서 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분은, T 세포에 의해 발현되는 경우에, 이들이 리간드의 존재 하에서 이량체화하여 T 세포의 생존 및/또는 증식을 촉진시킬 수 있는 신호전달 적격 CISC를 생성하도록 구성된 것인
시스템. - 제45항에 있어서, BCMA를 인식할 수 있는 CAR이 세포외 BCMA 인식 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인 시스템.
- 제46항에 있어서, 세포외 BCMA 인식 도메인이 BCMA에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 모이어티인 시스템.
- 제47항에 있어서, 항체 모이어티가 서열식별번호: 55로부터의 중쇄 상보성-결정 영역 (HC-CDR)1, HC-CDR2, HC-CDR3, 경쇄 상보성-결정 영역 (LC-CDR)1, LC-CDR2, 및 LC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 것인 시스템.
- 제47항 또는 제48항에 있어서, 항체 모이어티가 scFv인 시스템.
- 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, CAR 막횡단 도메인이 CD8 막횡단 도메인을 포함하고/거나, CAR 공동-자극성 도메인이 4-1BB 및/또는 CD28 공동-자극성 도메인을 포함하고/거나, CAR 세포질 신호전달 도메인이 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인 시스템.
- 제45항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 CISC 구성성분의 신호전달 도메인이 IL-2 수용체 서브유닛 감마 (IL2Rγ) 도메인을 포함하는 것인 시스템.
- 제51항에 있어서, IL2Rγ 세포질 신호전달 도메인이 서열식별번호: 50의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 시스템.
- 제45항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분이 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 것인 시스템.
- 제53항에 있어서, FKBP 도메인이 서열식별번호: 47의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 47의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 시스템.
- 제45항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 CISC 구성성분의 신호전달 도메인이 IL-2 수용체 서브유닛 베타 (IL2Rβ) 도메인을 포함하는 것인 시스템.
- 제55항에 있어서, IL2Rβ 세포질 신호전달 도메인이 서열식별번호: 51의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 51의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 시스템.
- 제45항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분이 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 것인 시스템.
- 제57항에 있어서, FRB가 서열식별번호: 48의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 48의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 시스템.
- 제45항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 CISC 구성성분의 막횡단 도메인이 독립적으로 IL-2 수용체 막횡단 도메인을 포함하는 것인 시스템.
- 제45항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 라파마이신 또는 라파로그인 시스템.
- 제60항에 있어서, 라파로그가 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
- 제45항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, c) 1종 이상의 공여자 주형이 하기 중 1종 이상을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 것인 시스템:
iv) 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체;
v) 선택가능한 마커;
vi) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 또는
vii) 포유동물 라파마이신의 표적 (mTOR) 키나제의 FKBP-라파마이신 결합 (FRB) 도메인 폴리펩티드. - 제62항에 있어서, 키메라 수용체 막횡단 도메인이 CD8 막횡단 도메인 폴리펩티드를 포함하고/거나, 키메라 수용체 공동-자극성 도메인이 4-1BB 공동-자극성 도메인을 포함하고/거나, 키메라 수용체 세포질 신호전달 도메인이 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인 시스템.
- 제63항에 있어서, 키메라 수용체가 서열식별번호: 65의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 65의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 시스템.
- 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 선택가능한 마커가 말단절단된 저-친화도 신경 성장 인자 수용체 (tLNGFR) 폴리펩티드인 시스템.
- 제65항에 있어서, tLNGFR 폴리펩티드가 서열식별번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 것인 시스템.
- 제62항 내지 제66항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드가 돌연변이체 칼시뉴린 (CN) 폴리펩티드인 시스템.
- 제67항에 있어서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드가 CNb30 (서열식별번호: 67)인 시스템.
- 제62항 내지 제68항 중 어느 한 항에 있어서, FRB 도메인 폴리펩티드가 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산 또는 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 변이체를 포함하는 것인 시스템.
- 제44항 내지 제69항 중 어느 한 항에 있어서, RGEN이 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로 공지됨), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cpf1 엔도뉴클레아제, 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 시스템.
- 제44항 내지 제70항 중 어느 한 항에 있어서, RGEN이 Cas9인 시스템.
- 제44항 내지 제71항 중 어느 한 항에 있어서, RGEN을 코딩하는 핵산이 리보핵산 (RNA) 서열인 시스템.
- 제72항에 있어서, RGEN을 코딩하는 RNA 서열이 공유 결합을 통해 제1 gRNA 또는 제2 gRNA에 연결되는 것인 시스템.
- 제45항 내지 제73항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 공여자 주형 중 하나를 포함하는 아데노-연관된 바이러스 (AAV) 벡터를 포함하는 시스템.
- 제74항에 있어서, AAV 벡터가 서열식별번호: 19-46 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 19-46 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 시스템.
- 제74항 또는 제75항에 있어서, 제1 gRNA 및 제1 AAV 벡터 및 제2 gRNA 및 제2 AAV 벡터를 포함하며, 여기서
(A) 제1 gRNA가 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 28, 31, 34, 및 37 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 28, 31, 34, 및 37 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터가 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나;
(B) 제1 gRNA가 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 29, 32, 35, 및 38 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 29, 32, 35, 및 38 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터가 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나;
(C) 제1 gRNA가 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 30, 33, 36, 및 39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 30, 33, 36, 및 39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터가 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인
시스템. - 제74항 또는 제75항에 있어서,
(A) 제1 gRNA가 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터가 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나;
(B) 제1 gRNA가 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터가 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나;
(C) 제1 gRNA가 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터가 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인
시스템. - 제74항 또는 제75항에 있어서,
(A) 제1 gRNA가 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 25의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 25의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터가 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나;
(B) 제1 gRNA가 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 26의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 26의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터가 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나;
(C) 제1 gRNA가 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 27의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 27의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터가 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인
시스템. - 제44항 내지 제78항 중 어느 한 항에 있어서, RGEN 및 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA를 포함하는 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 포함하는 시스템.
- 제79항에 있어서, RGEN이 각각 1:1 내지 20:1의 gRNA 대 RGEN의 몰비로 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA와 예비복합체화되어 RNP를 형성하는 것인 시스템.
- 서열식별번호: 19-46 중 어느 하나의 핵산 서열, 또는 서열식별번호: 19-46 중 어느 하나와 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 벡터.
- 제81항에 있어서, 벡터가 아데노 연관된 바이러스 (AAV) 벡터인 벡터.
- 세포의 게놈을 편집하는 방법으로서, 하기를 세포에 제공하는 것을 포함하며:
a) 제1 gRNA가 제40항 또는 제41항의 gRNA이고 제2 gRNA가 제42항 또는 제43항의 gRNA인 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA;
b) RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산; 및
c) 하기를 코딩하는 핵산을 포함하는 1종 이상의 공여자 주형:
i) BCMA 폴리펩티드를 인식할 수 있는 CAR;
ii) 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인 또는 그의 부분 또는 그의 기능적 유도체를 포함하는 제1 CISC 구성성분; 및
iii) 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분, 힌지 도메인, 막횡단 도메인, 및 신호전달 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 제2 CISC 구성성분,
여기서 제1 CISC 구성성분 및 제2 CISC 구성성분은, T 세포에 의해 발현되는 경우에, 이들이 리간드의 존재 하에서 이량체화하여 T 세포의 생존 및/또는 증식을 촉진시킬 수 있는 신호전달 적격 CISC를 생성하도록 구성된 것인
방법. - 제83항에 있어서, BCMA를 인식할 수 있는 CAR이 세포외 BCMA 인식 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 제84항에 있어서, 세포외 BCMA 인식 도메인이 BCMA에 특이적으로 결합할 수 있는 항체 모이어티인 방법.
- 제85항에 있어서, 항체 모이어티가 서열식별번호: 55로부터의 중쇄 상보성-결정 영역 (HC-CDR)1, HC-CDR2, HC-CDR3, 경쇄 상보성-결정 영역 (LC-CDR)1, LC-CDR2, 및 LC-CDR3을 포함하는 중쇄 가변 도메인 (VH) 및 경쇄 가변 도메인 (VL)을 포함하는 것인 방법.
- 제85항 또는 제86항에 있어서, 항체 모이어티가 scFv인 방법.
- 제84항 내지 제87항 중 어느 한 항에 있어서, CAR 막횡단 도메인이 CD8 막횡단 도메인을 포함하고/거나, CAR 공동-자극성 도메인이 4-1BB 및/또는 CD28 공동-자극성 도메인을 포함하고/거나, CAR 세포질 신호전달 도메인이 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 제83항 내지 제88항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 CISC 구성성분의 신호전달 도메인이 IL-2 수용체 서브유닛 감마 (IL2Rγ) 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 제89항에 있어서, IL2Rγ 세포질 신호전달 도메인이 서열식별번호: 50의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 50의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 방법.
- 제83항 내지 제90항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분이 FK506 결합 단백질 (FKBP) 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 것인 방법.
- 제91항에 있어서, FKBP 도메인이 서열식별번호: 47의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 47의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 방법.
- 제83항 내지 제92항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 CISC 구성성분의 신호전달 도메인이 IL-2 수용체 서브유닛 베타 (IL2Rβ) 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 제93항에 있어서, IL2Rβ 세포질 신호전달 도메인이 서열식별번호: 51의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 51의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 방법.
- 제83항 내지 제94항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 세포외 결합 도메인 또는 그의 부분이 FKBP 라파마이신 결합 (FRB) 도메인 또는 그의 부분을 포함하는 것인 방법.
- 제95항에 있어서, FRB 도메인이 서열식별번호: 48의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 48의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 방법.
- 제83항 내지 제96항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 CISC 구성성분의 막횡단 도메인이 독립적으로 IL-2 수용체 막횡단 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 제83항 내지 제97항 중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 라파마이신 또는 라파로그인 방법.
- 제98항에 있어서, 라파로그가 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제83항 내지 제99항 중 어느 한 항에 있어서, c) 1종 이상의 공여자 주형이 하기 중 1종 이상을 코딩하는 핵산을 추가로 포함하는 것인 방법:
iv) 세포외 β2-마이크로글로불린 도메인, 막횡단 도메인, 공동-자극성 도메인, 및 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 키메라 수용체;
v) 선택가능한 마커;
vi) 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드; 또는
vii) 포유동물 라파마이신의 표적 (mTOR) 키나제의 FKBP-라파마이신 결합 (FRB) 도메인 폴리펩티드. - 제100항에 있어서, 키메라 수용체 막횡단 도메인이 CD8 막횡단 도메인 폴리펩티드를 포함하고/거나, 키메라 수용체 공동-자극성 도메인이 4-1BB 공동-자극성 도메인을 포함하고/거나, 키메라 수용체 세포질 신호전달 도메인이 CD3-ζ 세포질 신호전달 도메인을 포함하는 것인 방법.
- 제101항에 있어서, 키메라 수용체가 서열식별번호: 65의 아미노산 서열 또는 서열식별번호: 65의 아미노산 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인 방법.
- 제100항 내지 제102항 중 어느 한 항에 있어서, 선택가능한 마커가 말단절단된 저-친화도 신경 성장 인자 수용체 (tLNGFR) 폴리펩티드인 방법.
- 제103항에 있어서, tLNGFR 폴리펩티드가 서열식별번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제100항 내지 제104항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 칼시뉴린 억제제에 대한 저항성을 부여하는 폴리펩티드가 돌연변이체 칼시뉴린 (CN) 폴리펩티드인 방법.
- 제105항에 있어서, 돌연변이체 CN 폴리펩티드가 CNb30 (서열식별번호: 67)인 방법.
- 제100항 내지 제106항 중 어느 한 항에 있어서, FRB 도메인 폴리펩티드가 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산 또는 서열식별번호: 68 또는 69의 아미노산과 적어도 90% 서열 상동성을 갖는 변이체를 포함하는 것인 방법.
- 세포의 게놈을 편집하는 방법으로서, 제1 gRNA, 제2 gRNA, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 제1 벡터, 및 제2 벡터를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서
(A) 제1 gRNA가 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터가 서열식별번호: 28, 31, 34, 및 37 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 28, 31, 34, 및 37 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 벡터가 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나;
(B) 제1 gRNA가 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터가 서열식별번호: 29, 32, 35, 및 38 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 29, 32, 35, 및 38 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 벡터가 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나;
(C) 제1 gRNA가 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 벡터가 서열식별번호: 30, 33, 36, 및 39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 30, 33, 36, 및 39 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 벡터가 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 40-44 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인
방법. - 세포의 게놈을 편집하는 방법으로서, 제1 gRNA, 제2 gRNA, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 제1 벡터, 및 제2 벡터를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서
(A) 제1 gRNA가 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 19 또는 22의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터가 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나;
(B) 제1 gRNA가 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 20 또는 23의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터가 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나;
(C) 제1 gRNA가 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 21 또는 24의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터가 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 45의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인
방법. - 세포의 게놈을 편집하는 방법으로서, 제1 gRNA, 제2 gRNA, RGEN 또는 RGEN을 코딩하는 핵산, 제1 벡터, 및 제2 벡터를 세포에 제공하는 것을 포함하며, 여기서
(A) 제1 gRNA가 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 1의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 25의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 25의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터가 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나;
(B) 제1 gRNA가 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 2의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 26의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 26의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터가 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하거나;
(C) 제1 gRNA가 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 3의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제1 AAV 벡터가 서열식별번호: 27의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 27의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 gRNA가 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열 및 서열식별번호: 4-18 중 어느 하나의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하고, 제2 AAV 벡터가 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 서열식별번호: 46의 폴리뉴클레오티드 서열과 적어도 85% 상동성을 갖는 그의 변이체를 포함하는 것인
방법. - 제83항 내지 제110항 중 어느 한 항에 있어서, RGEN이 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas6, Cas7, Cas8, Cas9 (또한 Csn1 및 Csx12로 공지됨), Cas100, Csy1, Csy2, Csy3, Cse1, Cse2, Csc1, Csc2, Csa5, Csn2, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csx17, Csx14, Csx10, Csx16, CsaX, Csx3, Csx1, Csx15, Csf1, Csf2, Csf3, Csf4, 및 Cpf1 엔도뉴클레아제, 또는 그의 기능적 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제83항 내지 제111항 중 어느 한 항에 있어서, RGEN이 Cas9인 방법.
- 제83항 내지 제112항 중 어느 한 항에 있어서, RGEN을 코딩하는 핵산이 리보핵산 (RNA) 서열인 방법.
- 제113항에 있어서, RGEN을 코딩하는 RNA 서열이 공유 결합을 통해 제1 gRNA 또는 제2 gRNA에 연결되는 것인 방법.
- 제83항 내지 제114항 중 어느 한 항에 있어서, 공여자 주형이 AAV 벡터에 함유되는 것인 방법.
- 제83항 내지 제115항 중 어느 한 항에 있어서, RGEN이, 세포에의 제공 전에, 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA와 예비복합체화되어 RNP 복합체를 형성하는 것인 방법.
- 제116항에 있어서, RGEN이 각각 1:1 내지 20:1의 gRNA 대 RGEN의 몰비로 제1 gRNA 및/또는 제2 gRNA와 예비복합체화되는 것인 방법.
- 제83항 내지 제117항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 공여자 주형이 독립적으로 세포의 게놈 내로 삽입되는 것인 방법.
- 제118항에 있어서, 제1 공여자 주형이 TRA 유전자 또는 유전자 조절 요소에, 그 내에, 또는 그 부근에 삽입되고/거나, 제2 공여자 주형이 IL2RG 유전자 또는 유전자 조절 요소에, 그 내에, 또는 그 부근에 삽입되는 것인 방법.
- 제118항 또는 제119항에 있어서, i) 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산이 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되고/거나, ii) 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산이 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되거나; 또는 i) 제1 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산이 TRAC 도메인을 코딩하는 내인성 TRA 유전자의 영역 내로 삽입되고/거나, ii) 제2 CISC 구성성분을 코딩하는 핵산이 내인성 IL2RG 유전자 내로 삽입되는 것인 방법.
- 제83항 내지 제120항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 T 세포인 방법.
- 제121항에 있어서, T 세포가 CD8+ 세포독성 T 림프구 또는 CD3+ pan T 세포인 방법.
- 제121항 또는 제122항에 있어서, T 세포가 다중 공여자로부터 유래된 T 세포의 풀의 구성원인 방법.
- 제123항에 있어서, 다중 공여자가 인간 공여자인 방법.
- 제83항 내지 제124항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 형질 세포에 대해 세포독성인 방법.
- 제83항 내지 제125항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 조작된 세포.
- 제1항 내지 제39항 및 제126항 중 어느 한 항에 있어서, 조작된 세포가 형질 세포에 대해 세포독성인 조작된 세포.
- 이식편 대 숙주 질환 (GvHD) 또는 자가면역 질환의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 질환을 치료하는 방법으로서, 제1항 내지 제39항 및 제126항 중 어느 한 항의 조작된 세포를 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
- 유해 항체 생산을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 질환 또는 상태를 치료하는 방법으로서,
a) T 세포의 게놈을 제83항 내지 제120항 중 어느 한 항의 방법에 따라 편집함으로써 조작된 T 세포를 생산하고;
b) 조작된 T 세포를 대상체에게 투여하는 것
을 포함하는 방법. - 제129항에 있어서, T 세포가 대상체에 대해 자가유래인 방법.
- 제120항에 있어서, T 세포가 대상체에 대해 동종이형인 방법.
- 제131항에 있어서, T 세포가 다중 공여자로부터 유래된 T 세포의 풀을 포함하는 것인 방법.
- 제132항에 있어서, 다중 공여자가 인간 공여자인 방법.
- 유해 항체 생산을 특징으로 하는 질환 또는 상태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 상기 질환 또는 상태를 치료하는 방법으로서, 대상체에서의 T 세포의 게놈을 제83항 내지 제120항 중 어느 한 항의 방법에 따라 편집하는 것을 포함하는 방법.
- 제129항 내지 제134항 중 어느 한 항에 있어서, T 세포가 CD8+ 세포독성 T 세포 또는 CD3+ pan T 세포를 포함하는 것인 방법.
- 제128항 내지 제135항 중 어느 한 항에 있어서, 대상체가 인간인 방법.
- 제128항 내지 제136항 중 어느 한 항에 있어서, 라파마이신 또는 라파로그를 대상체에게 투여하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제137항에 있어서, 라파로그가 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
- 제137항 또는 제138항에 있어서, 라파마이신 또는 라파로그가 0.05 nM 내지 100 nM의 농도로 투여되는 것인 방법.
- 제129항 내지 제139항 중 어느 한 항에 있어서, 질환 또는 상태가 이식편-대-숙주 질환 (GvHD), 항체-매개된 자가면역, 또는 경쇄 아밀로이드증인 방법.
- 제140항에 있어서, 질환 또는 상태가 GvHD이고, 대상체가 이전에 동종이형 이식을 받은 것인 방법.
- 사용에 대한 지침서 및 a) 제1항 내지 제39항 및 제126항 중 어느 한 항의 조작된 세포 및/또는 제44항 내지 제80항 중 어느 한 항의 시스템의 1종 이상의 구성성분; 및/또는 b) 라파마이신 또는 라파로그를 포함하는 키트.
- 제142항에 있어서, 라파로그가 에베롤리무스, CCI-779, C20-메탈릴라파마이신, C16-(S)-3-메틸인돌라파마이신, C16-iRap, AP21967, 나트륨 미코페놀산, 베니디핀 히드로클로라이드, AP1903, 또는 AP23573, 또는 이들의 대사물, 유도체, 및/또는 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 키트.
- 제1항 내지 제39항 및 제126항 중 어느 한 항의 조작된 세포 또는 제44항 내지 제80항 중 어느 한 항의 시스템의 1종 이상의 구성성분을 포함하는 조성물을 포함하는 시린지.
- 제1항 내지 제39항 및 제126항 중 어느 한 항의 조작된 세포 또는 제44항 내지 제80항 중 어느 한 항의 시스템의 1종 이상의 구성성분을 포함하는 조성물을 포함하는 카테터.
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