JP7399866B2 - ＣＡＲＴｙｒｉｎ組成物とその利用方法 - Google Patents

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Description

関連する出願
本出願は、2018年3月7日に出願されたアメリカ合衆国仮出願第62/639,978号と、2018年10月12日に出願されたアメリカ合衆国仮出願第62/745,151号と、2018年12月20日に出願されたアメリカ合衆国仮出願第62/783,140号の優先権の恩恵を主張するものであり、そのそれぞれの内容の全体が参照によって本明細書に組み込まれている。

参照による配列リストの組み込み
「POTH-033_001WO_SequenceListing_ST25_R.txt」という名称のファイルは2019年3月7日に作成されたものであり、サイズが6 kBであって、その内容の全体が参照によって本明細書に組み込まれている。
本開示は分子生物学に向けられたものであり、より具体的には、キメラ抗原受容体と、1つ以上のCARTyrinを含有するトランスポゾンのほか、これらを製造する方法と利用する方法に向けられている。
伝統的な抗体配列またはその断片を用いずに免疫細胞の特異性を方向づける方法の必要性が本分野で長い間感じられてきたが、その必要性は満たされていない。本開示により、優れたキメラ抗原受容体が提供される。
本開示により、（a）少なくとも1つのセンチリンを含む抗原認識領域を含むエクトドメインと；（b）膜貫通ドメインと；（c）少なくとも1つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）が提供される。本明細書全体を通じ、センチリンを含むCARをCARTyrinと呼ぶ。いくつかの実施態様では、抗原認識領域は、二重特異性CARTyrinまたはタンデムCARTyrinを生成させるため2つのセンチリンを含むことができる。いくつかの実施態様では、抗原認識領域は、三重特異性CARTyrinを生成させるため3つのセンチリンを含むことができる。いくつかの実施態様では、エクトドメインはシグナルペプチドをさらに含むことができる。その代わりに、またはそれに加えて、いくつかの実施態様では、エクトドメインは、抗原認識領域と膜貫通ドメインの間にヒンジをさらに含むことができる。いくつかの実施態様では、エクトドメインはシグナルペプチドをさらに含むことができる。その代わりに、またはそれに加えて、いくつかの実施態様では、エクトドメインは、抗原認識領域と膜貫通ドメインの間にヒンジをさらに含むことができる。
本開示により、（a）前立腺特異的膜抗原（PSMA）の配列に特異的に結合する少なくとも1つのセンチリンを含む抗原認識領域を含むエクトドメインと；（b）膜貫通ドメインと；（c）少なくとも1つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含むキメラ抗原受容体（CAR）が提供される。本明細書全体を通じ、センチリンを含むCARをCARTyrinと呼ぶ。いくつかの実施態様では、抗原認識領域は、二重特異性CARTyrinまたはタンデムCARTyrinを生成させるため2つのセンチリンを含むことができる。いくつかの実施態様では、二重特異性CARTyrinまたはタンデムCARTyrinを生成させるため抗原認識領域が2つのセンチリンを含むことができる実施態様を含め、これら2つのセンチリンの一方または両方がPSMAの配列に特異的に結合する。いくつかの実施態様では、第1のセンチリンはPSMAの第1の配列に特異的に結合することができ、第2のセンチリンはPSMAの第2の配列に特異的に結合することができる。いくつかの実施態様では、PSMAの第1の配列とPSMAの第2の配列は同じである。いくつかの実施態様では、PSMAの第1の配列とPSMAの第2の配列は同じでない。いくつかの実施態様では、抗原認識領域は、三重特異性CARTyrinを生成させるため3つのセンチリンを含むことができる。いくつかの実施態様では、三重特異性CARTyrinまたはタンデムCARTyrinを生成させるため抗原認識領域が3つのセンチリンを含むことができる実施態様を含め、これら3つのセンチリンのうちの1つ、または2つ、または3つがPSMAの配列に特異的に結合する。いくつかの実施態様では、第1のセンチリンはPSMAの第1の配列に特異的に結合することができ、第2のセンチリンはPSMAの第2の配列に特異的に結合することができ、第3のセンチリンはPSMAの第3の配列に特異的に結合することができる。いくつかの実施態様では、エクトドメインはシグナルペプチドをさらに含むことができる。いくつかの実施態様では、PSMAの第1の配列、第2の配列、第3の配列のうちの2つ以上は同じである。いくつかの実施態様では、PSMAの第1の配列、第2の配列、第3の配列のうちの2つ以上は同じでない。いくつかの実施態様では、PSMAの第1の配列、PSMAの第2の配列、PSMAの第3の配列は同じでない。その代わりに、またはそれに加えて、いくつかの実施態様では、エクトドメインは、抗原認識領域と膜貫通ドメインの間にヒンジをさらに含むことができる。いくつかの実施態様では、エクトドメインはシグナルペプチドをさらに含むことができる。その代わりに、またはそれに加えて、いくつかの実施態様では、エクトドメインは、抗原認識領域と膜貫通ドメインの間にヒンジをさらに含むことができる。本明細書では、「抗PSMA CARTyrin」という用語は、PSMAの配列に特異的に結合する少なくとも1つのセンチリンを含むCARTyrinを意味する。
本開示の抗PSMA CARTyrinのいくつかの実施態様では、センチリンは、MLPAPKNLVVSRVTEDSARLSWDIDEQRDWFESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVYHVYRSNPLSAIFTT（配列番号18000）（「PSMA5センチリン」）のアミノ酸配列、またはATGCTGCCTGCACCAAAGAACCTGGTGGTGTCTCGGGTGACCGAGGACTCTGCCAGACTGAGCTGGGACATCGATGAGCAGAGGGATTGGTTCGAGAGCTTTCTGATCCAGTATCAGGAGTCCGAGAAAGTGGGCGAGGCCATCGTGCTGACAGTGCCTGGCAGCGAGCGGTCCTATGACCTGACCGGCCTGAAGCCAGGCACAGAGTACACCGTGTCCATCTACGGCGTGTATCACGTGTACAGGTCCAATCCTCTGTCTGCCATCTTCACCACA（配列番号18001）（「PSMA5センチリン」）の核酸配列を含むか、このアミノ酸配列またはこの核酸配列からなる。
本開示の抗PSMA CARTyrinのいくつかの実施態様では、少なくとも1つのPSMA特異的センチリンは、MLPAPKNLVVSRVTEDSARLSWDIDEQRDWFESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVYHVYRSNPLSAIFTT（配列番号18000）のアミノ酸配列と少なくとも70％一致するアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、少なくとも1つのPSMA特異的センチリンは、MLPAPKNLVVSRVTEDSARLSWDIDEQRDWFESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVYHVYRSNPLSAIFTT（配列番号18000）のアミノ酸配列と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含んでいる。
本開示の抗PSMA CARTyrinのいくつかの実施態様では、センチリンは、MLPAPKNLVVSRVTEDSARLSWAIDEQRDWFESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVYHVYRSNPLSAIFTT（配列番号18002）（「PSMA8センチリン」）のアミノ酸配列、またはATGCTGCCTGCACCAAAGAACCTGGTGGTGTCTCGGGTGACCGAGGACTCTGCCAGACTGAGCTGGGCCATCGACGAGCAGAGGGATTGGTTCGAGAGCTTTCTGATCCAGTATCAGGAGTCCGAGAAAGTGGGCGAGGCCATCGTGCTGACAGTGCCTGGCAGCGAGCGGTCCTATGATCTGACCGGCCTGAAGCCAGGCACAGAGTACACCGTGTCCATCTACGGCGTGTATCACGTGTACAGGTCCAATCCTCTGTCTGCCATCTTCACCACA（配列番号18003）（「PSMA8センチリン」）の核酸配列を含むか、このアミノ酸配列またはこの核酸配列からなる。
本開示の抗PSMA CARTyrinのいくつかの実施態様では、少なくとも1つのPSMA特異的センチリンは、MLPAPKNLVVSRVTEDSARLSWAIDEQRDWFESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVYHVYRSNPLSAIFTT（配列番号18002）と少なくとも70％一致するアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、少なくとも1つのPSMA特異的センチリンは、MLPAPKNLVVSRVTEDSARLSWAIDEQRDWFESFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVYHVYRSNPLSAIFTT（配列番号18002）と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含んでいる。
本開示のCARTyrinのいくつかの実施態様では、シグナルペプチドは、ヒトのCD2シグナルペプチド、CD3δシグナルペプチド、CD3εシグナルペプチド、CD3γシグナルペプチド、CD3ζシグナルペプチド、CD4シグナルペプチド、CD8αシグナルペプチド、CD19シグナルペプチド、CD28シグナルペプチド、4-1BBシグナルペプチド、GM-CSFRシグナルペプチドのいずれかをコードする配列を含むことができる。本開示のCARTyrinのいくつかの実施態様では、シグナルペプチドは、ヒトCD8αシグナルペプチドをコードする配列を含むことができる。ヒトCD8αシグナルペプチドは、MALPVTALLLPLALLLHAARP（配列番号18004）を含むアミノ酸配列を含むことができる。ヒトCD8αシグナルペプチドは、MALPVTALLLPLALLLHAARP（配列番号18004）を含むアミノ酸配列、またはMALPVTALLLPLALLLHAARP（配列番号18004）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。ヒトCD8αシグナルペプチドは、atggcactgccagtcaccgccctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgcagctagacca（配列番号18005）を含む核酸配列によってコードすることができる。
本開示のCARTyrinのいくつかの実施態様では、膜貫通ドメインは、ヒトのCD2膜貫通ドメイン、CD3δ膜貫通ドメイン、CD3ε膜貫通ドメイン、CD3γ膜貫通ドメイン、CD3ζ膜貫通ドメイン、CD4膜貫通ドメイン、CD8α膜貫通ドメイン、CD19膜貫通ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、4-1BB膜貫通ドメイン、GM-CSFR膜貫通ドメインのいずれかをコードする配列を含むことができる。本開示のCARTyrinのいくつかの実施態様では、膜貫通ドメインは、ヒトCD8α膜貫通ドメインをコードする配列を含むことができる。CD8α膜貫通ドメインは、IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC（配列番号18006）を含むアミノ酸配列、またはIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC（配列番号18006）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。CD8α膜貫通ドメインは、atctacatttgggcaccactggccgggacctgtggagtgctgctgctgagcctggtcatcacactgtactgc（配列番号18007）を含む核酸配列によってコードすることができる。
本開示のCARTyrinのいくつかの実施態様では、エンドドメインはヒトCD3ζエンドドメインを含むことができる。
本開示のCARTyrinのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの共刺激ドメインは、ヒトの4-1BB細胞内セグメント、CD28細胞内セグメント、CD40細胞内セグメント、ICOS細胞内セグメント、MyD88細胞内セグメント、OX-40細胞内セグメントのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。本開示のCARTyrinのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの共刺激ドメインは、CD28共刺激ドメインおよび／または4-1BB共刺激ドメインを含むことができる。CD3ζ共刺激ドメインは、RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号18008）を含むアミノ酸配列、またはRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号18009）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。CD3ζ共刺激ドメインは、cgcgtgaagtttagtcgatcagcagatgccccagcttacaaacagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccgccgagaggaatatgacgtgctggataagcggagaggacgcgaccccgaaatgggaggcaagcccaggcgcaaaaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaaaatggcagaagcctattctgagatcggcatgaagggggagcgacggagaggcaaagggcacgatgggctgtaccagggactgagcaccgccacaaaggacacctatgatgctctgcatatgcaggcactgcctccaagg（配列番号18010）を含む核酸配列によってコードすることができる。4-1BB共刺激ドメインは、KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL（配列番号18011）を含むアミノ酸配列、またはKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL（配列番号18012）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。4-1BB共刺激ドメインは、aagagaggcaggaagaaactgctgtatattttcaaacagcccttcatgcgccccgtgcagactacccaggaggaagacgggtgctcctgtcgattccctgaggaagaggaaggcgggtgtgagctg（配列番号18013）を含む核酸配列によってコードすることができる。4-1BB共刺激ドメインは、膜貫通ドメインとCD28共刺激ドメインの間に位置することができる。
本開示のCARTyrinのいくつかの実施態様では、ヒンジは、ヒトのCD8α配列、および／またはIgG4配列、および／またはCD4配列に由来する配列を含むことができる。本開示のCARTyrinのいくつかの実施態様では、ヒンジは、ヒトCD8α配列に由来する配列を含むことができる。ヒンジは、TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD（配列番号18014）を含むヒトCD8αアミノ酸配列、またはTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD（配列番号18015）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。ヒトCD8αヒンジアミノ酸配列は、ACCACAACCCCTGCCCCCAGACCTCCCACACCCGCCCCTACCATCGCGAGTCAGCCCCTGAGTCTGAGACCTGAGGCCTGCAGGCCAGCTGCAGGAGGAGCTGTGCACACCAGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGAC（配列番号18016）またはACCACAACCCCTGCCCCCAGACCTCCCACACCCGCCCCTACCATCGCGAGTCAGCCCCTGAGTCTGAGACCTGAGGCCTGCAGGCCAGCTGCAGGAGGAGCTGTGCACACCAGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGAC（配列番号18017）を含む核酸配列によってコードすることができる。
本開示のセンチリンは、少なくとも1つのフィブロネクチンIII型（FN3）ドメインを含むことができる。本開示のセンチリンは抗原に特異的に結合することができる。本開示の好ましいセンチリンは、PSMAの配列に特異的に結合する。少なくとも1つのフィブロネクチンIII型（FN3）ドメインは、ヒトタンパク質に由来するものが可能である、そのヒトタンパク質としてテネイシン-Cが可能である。コンセンサス配列は、LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT（配列番号18018）またはMLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT（配列番号18019）を含むことができる。コンセンサス配列は、（a）このコンセンサス配列の13位～16位のアミノ酸残基TEDS（配列番号18020）を含むか、これらアミノ酸残基からなるA-Bループの中；または（b）このコンセンサス配列の13位～16位のアミノ酸残基TEDS（配列番号18020）を含むか、これらアミノ酸残基からなるA-Bループの中；または（b）このコンセンサス配列の22位～28位のアミノ酸残基TAPDAAF（配列番号18021）を含むか、これらアミノ酸残基からなるB-Cループの中；または（c）このコンセンサス配列の38位～43位のアミノ酸残基SEKVGE（配列番号18022）を含むか、これらアミノ酸残基からなるC-Dループの中；または（d）このコンセンサス配列の51位～54位のアミノ酸残基GSER（配列番号18023）を含むか、これらアミノ酸残基からなるD-Eループの中；または（e）このコンセンサス配列の60位～64位のアミノ酸残基GLKPG（配列番号18024）を含むか、これらアミノ酸残基からなるE-Fループの中；または（f）このコンセンサス配列の75位～81位のアミノ酸残基KGGHRSN（配列番号18025）を含むか、これらアミノ酸残基からなるF-Gループの中；または（g）（a）～（f）の任意の組み合わせの中の1つ以上の位置で修飾することができる。本開示のセンチリンは、少なくとも5個のフィブロネクチンIII型（FN3）ドメイン、または少なくとも10個のフィブロネクチンIII型（FN3）ドメイン、または少なくとも15個のフィブロネクチンIII型（FN3）ドメインのコンセンサス配列を含むことができる。本開示のセンチリンおよび／またはCARTyrinは、抗原と、10－9M以下のKD、10－10M以下のKD、10－11M以下のKD、10－12M以下のKD、10－13M以下のKD、10－14M以下のKD、10－15M以下のKDから選択された少なくとも1つの親和性で結合することができる。KDは、表面プラズモン共鳴によって求めることができる。
本開示により、本開示のCARTyrinと、医薬として許容可能な少なくとも1つの担体を含む組成物が提供される。
本開示により、本開示のCARTyrinを含むトランスポゾンが提供される。
本開示のトランスポゾンは、このトランスポゾンを発現する細胞の同定、および／または富化、および／または単離のための選択遺伝子を含むことができる。代表的な選択遺伝子は、細胞の生存と残存に不可欠な任意の遺伝子産物（例えば転写産物、タンパク質、酵素）をコードしている。代表的な選択遺伝子は、この選択遺伝子によってコードされる遺伝子産物が不在であるときに細胞が感受性である（または細胞にとって致死的である可能性がある）薬曝露に対する耐性を付与するのに不可欠な任意の遺伝子産物（例えば転写産物、タンパク質、酵素）をコードしている。代表的な選択遺伝子は、この選択遺伝子が不在のときに細胞の生存および／または残存に不可欠な1つ以上の栄養素が欠けた細胞培地の中での生存および／または残存に不可欠な任意の遺伝子産物（例えば転写産物、タンパク質、酵素）をコードしている。代表的な選択遺伝子の非限定的な例に含まれるのは、neo（ネオマイシンに対する耐性を与える）、TYMS（チミジル酸シンテターゼをコードしている）、MGMT（O(6)-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼをコードしている）、多剤耐性遺伝子（MDR1）、ALDH1（アルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリー、メンバーA1をコードしている）、FRANCF、RAD51C（RAD51パラログCをコードしている）、GCS（グルコシルセラミドシンターゼをコードしている）、NKX2.2（NK2ホメオボックス2をコードしている）である。
本開示のトランスポゾンは、（a）リガンド結合領域と、（b）リンカーと、（c）アポトーシス促進ポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、非ヒト配列は制限部位を含んでいる。いくつかの実施態様では、リガンド結合領域は、多量体リガンド結合領域を含むことができる。本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、「iC9安全スイッチ」と呼ぶこともできる。いくつかの実施態様では、本開示のトランスポゾンは、（a）リガンド結合領域と、（b）リンカーと、（c）カスパーゼポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性カスパーゼポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、本開示のトランスポゾンは、（a）リガンド結合領域と、（b）リンカーと、（c）カスパーゼポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性カスパーゼポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、本開示のトランスポゾンは、（a）リガンド結合領域と、（b）リンカーと、（c）切断型カスパーゼ9ポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性カスパーゼポリペプチドを含むことができる。本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、または誘導性カスパーゼポリペプチド、または切断型カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、リガンド結合領域は、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含むリガンド結合領域のアミノ酸配列は、この配列の36位に修飾を含むことができる。修飾として、36位のフェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換（F36V）が可能である。いくつかの実施態様では、FKBP12ポリペプチドは、GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE（配列番号18026）を含むアミノ酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、FKBP12ポリペプチドは、GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGATGTGGAACTGCTGAAGCTGGAG（配列番号18027）を含む核酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、リガンド結合領域に対して特異的な誘導剤は、36位にフェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換（F36V）を有するFK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含むことができる。誘導剤には、AP20187および／またはAP1903が含まれる（両方とも合成薬）。
本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、または誘導性カスパーゼポリペプチド、または切断型カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、リンカー領域は、GGGGS（配列番号18028）を含むアミノ酸、またはGGAGGAGGAGGATCC（配列番号18029）を含む核酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、リンカーをコードする核酸配列は制限部位を含んでいない。
本開示の切断型カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、切断型カスパーゼ9ポリペプチドは、配列の87位にアルギニン（R）を含まないアミノ酸配列によってコードされている。その代わりに、またはそれに加えて、本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、または誘導性カスパーゼポリペプチド、または切断型カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、切断型カスパーゼ9ポリペプチドは、配列の282位にアラニン（A）を含まないアミノ酸配列によってコードされている。本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、または誘導性カスパーゼポリペプチド、または切断型カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、切断型カスパーゼ9ポリペプチドは、GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS（配列番号18030）を含むアミノ酸配列、またはGGATTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC（配列番号18031）を含む核酸配列によってコードされている。
本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチド（その中に切断型カスパーゼ9ポリペプチドが含まれる）のいくつかの実施態様では、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS（配列番号18032）を含むアミノ酸配列、またはggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagacttgcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgcaacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgtggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagcaacaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagctggagggaggaggaggatccggatttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatgccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaacttctgcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggagaaggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtcccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctgtcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagccaaaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagcaccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggagggactgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtcttacagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagacactggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtggcaaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaagaaactgttctttaagacttcc（配列番号18033）を含む核酸配列によってコードされている。
本開示のトランスポゾンは、例えば本開示の1つ以上のセンチリンまたはCARTyrinと本開示の選択遺伝子の間に位置する少なくとも1つの自己切断ペプチドを含むことができる。本開示のトランスポゾンは、例えば本開示の1つ以上のセンチリンまたはCARTyrinと本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの間に位置する少なくとも1つの自己切断ペプチドを含むことができる。本開示のトランスポゾンは少なくとも2つの自己切断ペプチドを含むことができ、第1の自己切断ペプチドは、例えば本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの上流またはすぐ上流に位置し、第2の自己切断ペプチドは、例えば本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの下流またはすぐ下流に位置する。
少なくとも1つの自己切断ペプチドは、例えばT2Aペプチド、GSG-T2Aペプチド、E2Aペプチド、GSG-E2Aペプチド、F2Aペプチド、GSG-F2Aペプチド、P2Aペプチド、GSG-P2Aペプチドのいずれかを含むことができる。T2Aペプチドは、EGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18034）を含むアミノ酸配列、またはEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18035）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。GSG-T2Aペプチドは、GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18036）を含むアミノ酸配列、またはGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18037）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。GSG-T2Aペプチドは、ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca（配列番号18038）を含む核酸配列を含むことができる。E2Aペプチドは、QCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18039）を含むアミノ酸配列、またはQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18040）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。GSG-E2Aペプチドは、GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18041）を含むアミノ酸配列、またはGSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18042）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。F2Aペプチドは、VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18043）を含むアミノ酸配列、またはVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18044）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。GSG-F2Aペプチドは、GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18045）を含むアミノ酸配列、またはGSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18046）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。P2Aペプチドは、ATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18047）を含むアミノ酸配列、またはATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18048）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。GSG-P2Aペプチドは、GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18049）を含むアミノ酸配列、またはGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18050）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。
本開示のトランスポゾンは、第1と第2の自己切断ペプチドを含むことができ、第1の自己切断ペプチドは、例えば本開示の1つ以上のセンチリンまたはCARTyrinの上流に位置し、第2の自己切断ペプチドは、例えば本開示の1つ以上のセンチリンまたはCARTyrinの下流に位置する。第1および／または第2の自己切断ペプチドは、例えばT2Aペプチド、 GSG-T2Aペプチド、E2Aペプチド、GSG-E2Aペプチド、F2Aペプチド、GSG-F2Aペプチド、P2Aペプチド、GSG-P2Aペプチドのいずれかを含むことができる。T2Aペプチドは、EGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18034）を含むアミノ酸配列、またはEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18035）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。GSG-T2Aペプチドは、GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18036）を含むアミノ酸配列、またはGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18037）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。GSG-T2Aペプチドは、ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca（配列番号18038）を含む核酸配列を含むことができる。E2Aペプチドは、QCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18039）を含むアミノ酸配列、またはQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18040）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。GSG-E2Aペプチドは、GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18041）を含むアミノ酸配列、またはGSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18042）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。F2Aペプチドは、VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18043）を含むアミノ酸配列、またはVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18044）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。GSG-F2Aペプチドは、GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18045）を含むアミノ酸配列、またはGSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18046）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。P2Aペプチドは、ATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18047）を含むアミノ酸配列、またはATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18048）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。GSG-P2Aペプチドは、GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18049）を含むアミノ酸配列、またはGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18050）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。
本開示のトランスポゾンのいくつかの実施態様では、本開示のCARを含むトランスポゾンを含め、トランスポゾンは、キメラ刺激受容体（CSR）をコードする配列をさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、CSRは、（a）活性化要素を含むエクトドメインと；（b）膜貫通ドメインと；（c）少なくとも1つのシグナル伝達ドメインを含むエンドドメインを含み、（a）と（b）と（c）の組み合わせは天然には生じない。いくつかの実施態様では、（a）の活性化要素は、第1のタンパク質から単離されるか、第1のタンパク質に由来する。いくつかの実施態様では、（c）の少なくとも1つのシグナル伝達ドメインは、第2のタンパク質から単離されるか、第2のタンパク質に由来する。いくつかの実施態様では、第1のタンパク質と第2のタンパク質は同じでない。いくつかの実施態様では、活性化要素は、ヒト膜貫通受容体の構成要素、ヒト細胞表面受容体、T細胞受容体（TCR）、TCR複合体の構成要素、TCR共受容体の構成要素、TCR共刺激タンパク質の構成要素、TCR抑制タンパク質の構成要素、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体のうちの1つ以上を含んでいる。いくつかの実施態様では、活性化要素は、T細胞受容体（TCR）の構成要素、TCR複合体の構成要素、TCR共受容体の構成要素、TCR共刺激タンパク質の構成要素、TCR抑制タンパク質の構成要素、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体のうちの1つ以上の一部であってこの活性化要素のアゴニストが結合する部分を含んでいる。いくつかの実施態様では、活性化要素は、CD2タンパク質を含むか、その一部であってアゴニストが結合する部分を含んでいる。いくつかの実施態様では、シグナル伝達ドメインは、ヒトシグナル伝達ドメインの構成要素、T細胞受容体（TCR）、TCR複合体の構成要素、TCR共受容体の構成要素、TCR共刺激タンパク質の構成要素、TCR抑制タンパク質の構成要素、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体のうちの1つ以上を含んでいる。いくつかの実施態様では、シグナル伝達ドメインはCD3タンパク質を含んでいる。いくつかの実施態様では、CD3タンパク質はCD3ζタンパク質を含んでいる。いくつかの実施態様では、エンドドメインは細胞質ドメインをさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、細胞質ドメインは、第3のタンパク質から単離されるか、第3のタンパク質に由来する。いくつかの実施態様では、第1のタンパク質と第3のタンパク質は同じである。いくつかの実施態様では、エクトドメインはシグナルペプチドをさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、シグナルペプチドは第4のタンパク質に由来する。いくつかの実施態様では、第1のタンパク質と第4のタンパク質は同じである。いくつかの実施態様では、膜貫通ドメインは、第5のタンパク質から単離されるか、第5のタンパク質に由来する。いくつかの実施態様では、第1のタンパク質と第5のタンパク質は同じである。いくつかの実施態様では、活性化要素は天然に存在する分子に結合しない。いくつかの実施態様では、活性化要素が天然に存在する分子に結合したとき、CSRはシグナルを伝達しない。いくつかの実施態様では、エクトドメインは修飾を含んでいる。いくつかの実施態様では、修飾は、第1のタンパク質の野生型配列と比べたとき、活性化要素をコードする配列の変異または切断を含んでいる。いくつかの実施態様では、活性化要素は、天然に存在しない分子に結合する。いくつかの実施態様では、活性化要素が天然に存在しない分子に結合したとき、CSRは選択的にシグナルを伝達する。
本開示のトランスポゾンのいくつかの実施態様では、トランスポゾンはpiggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンである。
本開示のトランスポゾンのいくつかの実施態様では、トランスポゾンはTcBusterトランスポゾンである。
本開示のトランスポゾンのいくつかの実施態様では、トランスポゾンはＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである。
本開示のトランスポゾンのいくつかの実施態様では、トランスポゾンはHelraiserトランスポゾンである。
本開示のトランスポゾンのいくつかの実施態様では、トランスポゾンはTol2トランスポゾンである。
本開示により、本開示のトランスポゾンを含む組成物が提供される。いくつかの実施態様では、組成物は、トランスポザーゼ酵素をコードする配列を含むプラスミドをさらに含むことができる。トランスポザーゼ酵素をコードする配列としてmRNA配列が可能である。
本開示により、本開示のCARを含む組成物が提供される。いくつかの実施態様では、組成物は、本開示のCSR、またはこのCSRをコードする配列をさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、CSRをコードする配列はDNAを含んでいる。いくつかの実施態様では、CSRをコードする配列はRNAを含んでいる。いくつかの実施態様では、CSRをコードする配列はメッセンジャーRNA（mRNA）を含んでいる。いくつかの実施態様では、CSR、またはこのCSRをコードする配列は、本開示の細胞に導入されたとき、その細胞によって安定に組み込まれる。いくつかの実施態様では、CSR、またはこのCSRをコードする配列は、本開示の細胞に導入されたとき、その細胞によって安定に組み込まれない。いくつかの実施態様では、CSR、またはこのCSRをコードする配列は、本開示の細胞に導入されたとき、その細胞によって安定に発現される。いくつかの実施態様では、CSR、またはこのCSRをコードする配列は、本開示の細胞に導入されたとき、その細胞によって一過性に発現される。いくつかの実施態様では、CSR、またはこのCSRをコードする配列は、本開示の細胞に導入されたとき、RNAまたはmRNAを含んでいて、このCSR、またはこのCSRをコードする配列が、その細胞によって一過性に発現される。
本開示により、本開示のCARを含む細胞が提供される。いくつかの実施態様では、細胞は、本開示のCSR、またはこのCSRをコードする配列をさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、CSRをコードする配列はDNAを含んでいる。いくつかの実施態様では、CSRをコードする配列はRNAを含んでいる。いくつかの実施態様では、CSRをコードする配列はメッセンジャーRNA（mRNA）を含んでいる。いくつかの実施態様では、CSR、またはこのCSRをコードする配列は、細胞の1つのゲノム遺伝子座または複数のゲノム遺伝子座に安定に組み込まれる。いくつかの実施態様では、CSR、またはこのCSRをコードする配列は、細胞の1つのゲノム遺伝子座または複数のゲノム遺伝子座に安定に組み込まれない。いくつかの実施態様では、CSR、またはこのCSRをコードする配列は、細胞によって安定に発現される。いくつかの実施態様では、CSR、またはこのCSRをコードする配列は、細胞によって一過性に発現される。いくつかの実施態様では、CSR、またはこのCSRをコードする配列はRNAまたはmRNAを含んでいて、このCSR、またはこのCSRをコードする配列は、細胞によって一過性に発現される。
本開示のトランスポゾンは、piggyBacトランスポゾンを含むことができる。この方法のいくつかの実施態様では、トランスポゾンは、2つのシス調節インシュレータエレメントが隣接したキメラ抗原受容体をコードする配列を有するプラスミドDNAトランスポゾンである。いくつかの実施態様では、トランスポゾンは、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンである。
本開示のトランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼまたは適合性のある酵素を含むことができる。本開示のトランスポザーゼ酵素は、piggyBac様トランスポザーゼまたは適合性のある酵素を含むことができる。いくつかの実施態様では、特にトランスポゾンがpiggyBacトランスポゾンである実施態様では、トランスポザーゼは、piggyBac（商標）トランスポザーゼまたはSuper piggyBac（商標）（SPB）トランスポザーゼである。いくつかの実施態様では、特にトランスポザーゼがSuper piggyBac（商標）（SPB）トランスポザーゼである実施態様では、トランスポザーゼをコードする配列はmRNA配列である。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素はpiggyBac（商標）（PB）トランスポザーゼ酵素である。piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14487）と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることができる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、配列：
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14487）の30位、165位、282位、538位のうちの1つ以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなるpiggyBac（商標）（PB）トランスポザーゼ酵素である。
いくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の配列の30位、165位、282位、538位のうちの2つ以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなるpiggyBac（商標）（PB）トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の配列の30位、165位、282位、538位のうちの3つ以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなるpiggyBac（商標）（PB）トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の配列の30位、165位、282位、538位のそれぞれにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなるpiggyBac（商標）（PB）トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、配列番号14487の配列の30位のアミノ酸置換は、イソロイシン（I）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487の配列の165位のアミノ酸置換は、グリシン（G）からセリン（S）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487の配列の282位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487の配列の538位のアミノ酸置換は、アスパラギン（N）からリシン（K）への置換である。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、Super piggyBac（商標）（sPBo）トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、本開示のSuper piggyBac（商標）（sPBo）トランスポザーゼ酵素は、30位のアミノ酸置換がイソロイシン（I）からバリン（V）への置換であり、165位のアミノ酸置換がグリシン（G）からセリン（S）への置換であり、282位の置換がメチオニン（M）からバリン（V）への置換であり、538位のアミノ酸置換がアスパラギン（N）からリシン（K）への置換である配列番号14487のアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることが可能である。いくつかの実施態様では、Super piggyBac（商標）（sPBo）トランスポザーゼ酵素は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14484）と少なくとも70％、80％、90％、95％、99％、またはこれらの数値の間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることが可能である。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポゾンはTcBusterトランスポゾンであり、トランスポザーゼ酵素はTcBusterトランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、TcBusterトランスポザーゼ酵素は、高活性なTcBusterトランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、TcBusterトランスポザーゼ酵素は、
MMLNWLKSGK LESQSQEQSS CYLENSNCLP PTLDSTDIIG EENKAGTTSR KKRKYDEDYL
NFGFTWTGDK DEPNGLCVIC EQVVNNSSLN PAKLKRHLDT KHPTLKGKSE YFKRKCNELN
QKKHTFERYV RDDNKNLLKA SYLVSLRIAK QGEAYTIAEK LIKPCTKDLT TCVFGEKFAS
KVDLVPLSDT TISRRIEDMS YFCEAVLVNR LENAKCGFTL QMDESTDVAG LAILLVFVRY
IHESSFEEDM LFCKALPTQT TGEEIFNLLN AYFEKHSIPW NLCYHICTDG AKAMVGVIKG
VIARIKKLVP DIKASHCCLH RHALAVKRIP NALHEVLNDA VKMINFIKSR PLNARVFALL
CDDLGSLHKN LLLHTEVRWL SRGKVLTRFW ELRDEIRIFF NEREFAGKLN DTSWLQNLAY
IADIFSYLNE VNLSLQGPNS TIFKVNSRIN SIKSKLKLWE ECITKNNTEC FANLNDFLET
SNTALDPNLK SNILEHLNGL KNTFLEYFPP TCNNISWVEN PFNECGNVDT LPIKEREQLI
DIRTDTTLKS SFVPDGIGPF WIKLMDEFPE ISKRAVKELM PFVTTYLCEK SFSVYVATKT
KYRNRLDAED DMRLQLTTIH PDIDNLCNNK QAQKSH（配列番号17900）と少なくとも75％一致する配列を含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポゾンはＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンであり、トランスポザーゼ酵素はＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ酵素は配列番号14485を含んでいる。いくつかの実施態様では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ酵素は、高活性なＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ（SB100X）である。いくつかの実施態様では、高活性なＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ（SB100X）は配列番号14486を含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポゾンはHelraiserトランスポゾンであり、その中のトランスポザーゼ酵素はHelraiserトランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、Helraiserトランスポザーゼ酵素は配列番号14501を含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポゾンはTol2トランスポゾンであり、その中のトランスポザーゼ酵素はTol2トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、Tol2トランスポザーゼ酵素は配列番号14502を含んでいる。
本開示により、本開示のCARTyrinを含むベクターが提供される。いくつかの実施態様では、ベクターはウイルスベクターである。ベクターとして組み換えベクターが可能である。
本開示のウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせから単離された配列か、これらに由来する配列を含むことができる。ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）から単離された配列、またはAAVに由来する配列を含むことができる。ウイルスベクターは、組み換えAAV（rAAV）を含むことができる。本開示の代表的なアデノ随伴ウイルスと組み換えアデノ随伴ウイルスは、本開示のセンチリンまたはCARTyrinをコードする配列の隣にシスで位置する2つ以上の逆方向末端反復（ITR）を含んでいる。本開示の代表的なアデノ随伴ウイルスと組み換えアデノ随伴ウイルスの非限定的な例に含まれるのは、あらゆる血清型（例えばAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9）である。本開示の代表的なアデノ随伴ウイルスと組み換えアデノ随伴ウイルスの非限定的な例に含まれるのは、自己相補的AAV（scAAV）と、1つの血清型のゲノムとそれとは別の血清型のカプシドを含むAAVハイブリッド（例えばAAV2/5、AAV-DJ、AAV-DJ8）である。本開示の代表的なアデノ随伴ウイルスと組み換えアデノ随伴ウイルスの非限定的な例に含まれるのは、rAAV-LK03である。
本開示のウイルスベクターは選択遺伝子を含むことができる。選択遺伝子は、細胞の生存または残存に不可欠な遺伝子産物をコードすることができる。選択遺伝子は、選択的細胞培地条件に曝露されるとき、細胞の生存または残存に不可欠な遺伝子産物をコードすることができる。選択的細胞培地条件は、細胞の生存または残存にとって有害な化合物を含んでいる可能性があり、遺伝子産物がその化合物に対する耐性を与える。本開示の代表的な選択遺伝子の非限定的な例に含めることができるのは、neo（ネオマイシンに対する耐性を与える）、TYMS（チミジル酸シンテターゼをコードしている）、MGMT（O(6)-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼをコードしている）、多剤耐性遺伝子（MDR1）、ALDH1（アルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリー、メンバーA1をコードしている）、FRANCF、RAD51C（RAD51パラログCをコードしている）、GCS（グルコシルセラミドシンターゼをコードしている）、NKX2.2（NK2ホメオボックス2をコードしている）、またはこれらの任意の組み合わせである。
本開示のウイルスベクターは、（a）リガンド結合領域と、（b）リンカーと、（c）アポトーシス促進ポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、非ヒト配列は制限部位を含んでいる。いくつかの実施態様では、リガンド結合領域として、多量体リガンド結合領域が可能である。本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、「iC9安全スイッチ」と呼ぶこともできる。いくつかの実施態様では、本開示のウイルスベクターは、（a）リガンド結合領域と、（b）リンカーと、（c）カスパーゼポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、本開示のウイルスベクターは、（a）リガンド結合領域と、（b）リンカーと、（c）カスパーゼポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、本開示のウイルスベクターは、（a）リガンド結合領域と、（b）リンカーと、（c）切断型カスパーゼ9ポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むことができる。本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、または誘導性カスパーゼポリペプチド、または切断型カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、リガンド結合領域は、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含むリガンド結合領域のアミノ酸配列は、この配列の36位に修飾を含むことができる。修飾として、36位のフェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換（F36V）が可能である。いくつかの実施態様では、FKBP12ポリペプチドは、GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE（配列番号18026）を含むアミノ酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、FKBP12ポリペプチドは、GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG（配列番号18027）を含む核酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、リガンド結合領域に対して特異的な誘導剤は、36位にフェニルアラニン（F）の代わりにバリン（V）（F36V）を有するFK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含むことができる。誘導剤には、AP20187および／またはAP1903が含まれる（両方とも合成薬である）。
本開示の誘導性アポローシス促進ポリペプチド、または誘導性カスパーゼポリペプチド、または切断カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、リンカー領域は、GGG
GS（配列番号18028）を含むアミノ酸、またはGGAGGAGGAGGATCC（配列番号18029）を含む核酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、リンカーをコードする核酸配列は制限部位を含まない。
本開示の切断型カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、切断カスパーゼ9ポリペプチドは、配列の87位にアルギニン（R）を含まないアミノ酸配列によってコードされている。その代わりに、またはそれに加えて、本開示の誘導性アポローシス促進ポリペプチド、または誘導性カスパーゼポリペプチド、または切断カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、切断カスパーゼ9ポリペプチドは、配列の282位にアラニン（A）を含まないアミノ酸配列によってコードされている。本開示の誘導性アポローシス促進ポリペプチド、または誘導性カスパーゼポリペプチド、または切断カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、切断カスパーゼ9ポリペプチドは、GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS（配列番号18030）を含むアミノ酸配列、またはGGATTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC（配列番号18031）を含む核酸配列によってコードされている。
誘導性アポローシス促進ポリペプチド（その中に切断型カスパーゼ9ポリペプチドが含まれる）のいくつかの実施態様では、誘導性アポローシス促進ポリペプチドは、GVQVETI
SPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS（配列番号18032）を含むアミノ酸配列、またはggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagacttgcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgcaacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgtggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagcaacaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagctggagggaggaggaggatccggatttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatgccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaacttctgcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggagaaggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtcccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctgtcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagccaaaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagcaccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggagggactgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtcttacagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagacactggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtggcaaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaagaaactgttctttaagacttcc（配列番号18033）を含む核酸配列によってコードされている。
本開示のウイルスベクターは、少なくとも1つの自己切断ペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、ベクターは少なくとも1つの自己切断ペプチドを含むことができ、1つの自己切断ペプチドはCARtyrinと選択遺伝子の間に位置している。いくつかの実施態様では、ベクターは少なくとも1つの自己切断ペプチドを含むことができ、第1の自己切断ペプチドはCARtyrinの上流に位置し、第2の自己切断ペプチドはCARtyrinの下流に位置している。本開示のウイルスベクターは、例えば本開示のCARtyrin、CAR、CARのうちの1つ以上と本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの間に位置する少なくとも1つの自己切断ペプチドを含むことができる。本開示のウイルスベクターは少なくとも2つの自己切断ペプチドを含むことができ、第1の自己切断ペプチドは、例えば本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの上流またはすぐ上流に位置し、第2の自己切断ペプチドは、例えば本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの下流またはすぐ下流に位置する。自己切断ペプチドは、例えばT2Aペプチド、 GSG-T2Aペプチド、E2Aペプチド、GSG-E2Aペプチド、F2Aペプチド、GSG-F2Aペプチド、P2Aペプチド、GSG-P2Aペプチドのいずれかを含むことができる。T2Aペプチドは、EGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18034）を含むアミノ酸配列、またはEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18035）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。GSG-T2Aペプチドは、GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18036）を含むアミノ酸配列、またはGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18037）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。GSG-T2Aペプチドは、ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca（配列番号18038）を含む核酸配列を含むことができる。E2Aペプチドは、QCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18039）を含むアミノ酸配列、またはQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18040）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。GSG-E2Aペプチドは、GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18041）を含むアミノ酸配列、またはGSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18042）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。F2Aペプチドは、VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18043）を含むアミノ酸配列、またはVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18044）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。GSG-F2Aペプチドは、GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18045）を含むアミノ酸配列、またはGSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18046）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。P2Aペプチドは、ATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18047）を含むアミノ酸配列、またはATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18048）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。GSG-P2Aペプチドは、GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18049）を含むアミノ酸配列、またはGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18050）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。
本開示により、本開示のCARtyrinを含むベクターが提供される。いくつかの実施態様では、ベクターはナノ粒子である。本開示の代表的なナノ粒子ベクターの非限定的な例に含まれるのは、核酸（例えばRNA、DNA、合成ヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、またはこれらの任意の組み合わせ）、アミノ酸（L-アミノ酸、D-アミノ酸、合成アミノ酸、改変されたアミノ酸、またはこれらの任意の組み合わせ）、ポリマー（例えばポリマーソーム）、ミセル、脂質（例えばリポソーム）、有機分子（例えば炭素原子、炭素シート、炭素ファイバー、炭素チューブ）、無機分子（例えばリン酸カルシウム、金）、またはこれらの任意の組み合わせである。ナノ粒子ベクターは細胞膜を通じて受動的または能動的に輸送することができる。
本開示のナノ粒子ベクターは選択遺伝子を含むことができる。選択遺伝子は、細胞の生存と残存に不可欠な遺伝子産物をコードすることができる。選択遺伝子は、選択的細胞培地条件に曝露されるとき、細胞の生存と残存に不可欠な遺伝子産物をコードすることができる。選択的細胞培地条件は、細胞の生存または残存にとって有害な化合物を含んでいる可能性があり、遺伝子産物がその化合物に対する耐性を与える。本開示の代表的な選択遺伝子の非限定的な例に含めることができるのは、neo（ネオマイシンに対する耐性を与える）、TYMS（チミジル酸シンテターゼをコードしている）、MGMT（O(6)-メチルグアニン-DNAメチルトランスフェラーゼをコードしている）、多剤耐性遺伝子（MDR1）、ALDH1（アルデヒドデヒドロゲナーゼ1ファミリー、メンバーA1をコードしている）、FRANCF、RAD51C（RAD51パラログCをコードしている）、GCS（グルコシルセラミドシンターゼをコードしている）、NKX2.2（NK2ホメオボックス2をコードしている）、またはこれらの任意の組み合わせである。
本開示のナノ粒子ベクターは、（a）リガンド結合領域と、（b）リンカーと、（c）アポトーシス促進ポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、非ヒト配列は制限部位を含んでいる。いくつかの実施態様では、リガンド結合領域として、多量体リガンド結合領域が可能である。本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、「iC9安全スイッチ」と呼ぶこともできる。いくつかの実施態様では、本開示のナノ粒子ベクターは、（a）リガンド結合領域と、（b）リンカーと、（c）カスパーゼポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、本開示のナノ粒子ベクターは、（a）リガンド結合領域と、（b）リンカーと、（c）カスパーゼポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、本開示のナノ粒子ベクターは、（a）リガンド結合領域と、（b）リンカーと、（c）切断型カスパーゼ9ポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むことができる。本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、または誘導性カスパーゼポリペプチド、または切断型カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、リガンド結合領域は、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含むリガンド結合領域のアミノ酸配列は、この配列の36位に修飾を含むことができる。修飾として、36位のフェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換（F36V）が可能である。いくつかの実施態様では、FKBP12ポリペプチドは、GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE（配列番号18026）を含むアミノ酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、FKBP12ポリペプチドは、GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGAT GTGGAACTGCTGAAGCTGGAG（配列番号18027）を含む核酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、リガンド結合領域に対して特異的な誘導剤は、36位にフェニルアラニン（F）の代わりにバリン（V）（F36V）を有するFK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含むことができる。誘導剤には、AP20187および／またはAP1903が含まれる（両方とも合成薬である）。
本開示の誘導性アポローシス促進ポリペプチド、または誘導性カスパーゼポリペプチド、または切断カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、リンカー領域は、GGGGS（配列番号18028）を含むアミノ酸、またはGGAGGAGGAGGATCC（配列番号18029）を含む核酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、リンカーをコードする核酸配列は制限部位を含んでいない。
本開示の切断型カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、切断カスパーゼ9ポリペプチドは、配列の87位にアルギニン（R）を含まないアミノ酸配列によってコードされている。その代わりに、またはそれに加えて、本開示の誘導性アポローシス促進ポリペプチド、または誘導性カスパーゼポリペプチド、または切断カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、切断カスパーゼ9ポリペプチドは、配列の282位にアラニン（A）を含まないアミノ酸配列によってコードされている。本開示の誘導性アポローシス促進ポリペプチド、または誘導性カスパーゼポリペプチド、または切断カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、切断カスパーゼ9ポリペプチドは、GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS（配列番号18030）を含むアミノ酸配列、またはTTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC（配列番号18031）を含む核酸配列によってコードされている。
誘導性アポローシス促進ポリペプチド（その中に切断型カスパーゼ9ポリペプチドが含まれる）のいくつかの実施態様では、誘導性アポローシス促進ポリペプチドは、GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS（配列番号18032）を含むアミノ酸配列、またはggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagacttgcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgcaacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgtggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagcaacaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagctggagggaggaggaggatccggatttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatgccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaacttctgcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggagaaggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtcccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctgtcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagccaaaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagcaccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggagggactgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtcttacagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagacactggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtggcaaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaagaaactgttctttaagacttcc（配列番号18033）を含む核酸配列によってコードされている。
本開示のナノ粒子ベクターは、少なくとも1つの自己切断ペプチドを含むことができる。いくつかの実施態様では、ナノ粒子ベクターは少なくとも1つの自己切断ペプチドを含むことができ、1つの自己切断ペプチドは、CARTyrinとナノ粒子の間に位置する。いくつかの実施態様では、ナノ粒子ベクターは少なくとも1つの自己切断ペプチドを含むことができ、第1の自己切断ペプチドはCARTyrinの上流に位置し、第2の自己切断ペプチドはCARTyrinの下流に位置する。いくつかの実施態様では、ナノ粒子ベクターは少なくとも1つの自己切断ペプチドを含むことができ、第1の自己切断ペプチドはCARTyrinとナノ粒子の間に位置し、第2の自己切断ペプチドはCARTyrinの下流に位置する。いくつかの実施態様では、ナノ粒子ベクターは少なくとも1つの自己切断ペプチドを含むことができ、第1の自己切断ペプチドはCARTyrinとナノ粒子の間に位置し、第2の自己切断ペプチドはCARTyrinの下流、例えばCARTyrinと選択遺伝子の間に位置する。
本開示のナノ粒子ベクターは、例えば本開示の1つ以上のセンチリンまたはCARTyrinと本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの間に位置する少なくとも1つの自己切断ペプチドを含むことができる。本開示のナノ粒子ベクターは少なくとも2つの自己切断ペプチドを含むことができ、第1の自己切断ペプチドは、例えば本開示の誘導性アポローシス促進ポリペプチドの上流またはすぐ上流に位置し、第2の自己切断ペプチドは、例えば本開示の誘導性アポローシス促進ポリペプチドの下流またはすぐ下流に位置する。自己切断ペプチドは、例えばT2Aペプチド、GSG-T2Aペプチド、E2Aペプチド、GSG-E2Aペプチド、F2Aペプチド、GSG-F2Aペプチド、P2Aペプチド、GSG-P2Aペプチドのいずれかを含むことができる。T2Aペプチドは、EGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18034）を含むアミノ酸配列、またはEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18034）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。GSG-T2Aペプチドは、GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18036）を含むアミノ酸配列、またはGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号18036）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。GSG-T2Aペプチドは、ggatctggagagggaaggggaagcctgctgacctgtggagacgtggaggaaaacccaggacca（配列番号18038）を含む核酸配列を含むことができる。E2Aペプチドは、QCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18039）を含むアミノ酸配列、またはQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18039）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。GSG-E2Aペプチドは、GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18041）を含むアミノ酸配列、またはGSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号18041）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。F2Aペプチドは、VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18043）を含むアミノ酸配列、またはVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18043）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。GSG-F2Aペプチドは、GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18045）を含むアミノ酸配列、またはGSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号18045）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。P2Aペプチドは、ATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18047）を含むアミノ酸配列、またはATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18047）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。GSG-P2Aペプチドは、GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18050）を含むアミノ酸配列、またはGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号18050）を含むアミノ酸配列と少なくとも70％、または80％、または90％、または95％、または99％が一致する配列を含むことができる。
本開示により、本開示のベクターを含む組成物が提供される。本開示により、本開示のCARTyrinを含む細胞が提供される。本開示により、本開示のトランスポゾンを含む細胞が提供される。いくつかの実施態様では、本開示のCARTyrin、トランスポゾン、ベクターのいずれかを含む細胞は、細胞の表面にCARTyrinを発現することができる。細胞として任意のタイプの細胞が可能である。細胞は免疫細胞であることが好ましい。免疫細胞として、T細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナチュラルキラー（NK）様細胞、サイトカイン誘導キラー（CIK）細胞、造血前駆細胞、末梢血（PB）由来T細胞、臍帯血（UCB）由来T細胞のいずれかが可能である。免疫細胞はT細胞であることが好ましい。T細胞として、初期記憶細胞、幹様T細胞、TSCM様細胞、TSCM、TCMのいずれかが可能である。T細胞としてTSCMが可能である。細胞として人工抗原提示細胞が可能であり、場合によってはそれを、本開示の改変された免疫細胞またはT細胞の刺激と増殖に用いることができる。細胞として腫瘍細胞が可能であり、場合によってはそれを、人工抗原提示細胞または改変された抗原提示細胞として用いることができる。
養子療法に使用できる本開示の改変された細胞は、自己由来または同種他家由来のものが可能である。
本開示により、細胞の表面にCARTyrinを発現させる方法として、（a）細胞集団を取得し；（b）この細胞集団を、本開示のCARTyrinを含むか、このCARTyrinをコードする配列を含む組成物に、このCARTyrinが細胞集団の中の少なくとも1個の細胞の細胞膜を通過して移動するのに十分な条件下で接触させることにより、改変された細胞集団を生成させ；（c）この改変された細胞集団を、CARTyrinの組み込みに適した条件下で培養し；（d）細胞表面にCARTyrinを発現する改変された細胞集団からの少なくとも1個の細胞を増殖させること、および／または選択することを含む方法が提供される。
CARTyrinを発現させるこの方法のいくつかの実施態様では、細胞集団は、白血球、および／またはCD4+白血球とCD8+白血球を含むことができる。細胞集団は、CD4+白血球とCD8+白血球を最適な比率で含むことができる。CD8+白血球に対するCD4+白血球の最適な比率が生体内で天然に生じることはない。細胞集団は腫瘍細胞を含むことができる。
CARTyrinを発現させるこの方法のいくつかの実施態様では、トランスポゾンまたはベクターは、CARTyrinを含むか、このCARTyrinをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、トランスポゾンは、抗PSMA CARTyrinを含むか、この抗PSMA CARTyrinをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、トランスポゾンはpiggyBacトランスポゾンを含んでいる。いくつかの実施態様では、トランスポゾンは、トランスポザーゼ酵素をコードする配列を含むプラスミドを含む組成物をさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼがpiggyBacトランスポザーゼである実施態様を含め、トランスポザーゼ酵素はmRNA配列である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼは、配列番号18017を含むアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼは高活性バリアントであり、この高活性バリアントは、配列番号18017の30位、165位、282位、538位のうちの1つ以上にアミノ酸置換を含んでいる。いくつかの実施態様では、配列番号18017の30位におけるアミノ酸置換は、イソロイシン（I）からバリン（V）への置換である（I130V）。いくつかの実施態様では、配列番号18017の165位のアミノ酸置換は、グリシン（G）からセリン（S）への置換である（G165S）。いくつかの実施態様では、配列番号18017の配列の282位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からバリン（V）への置換である（M282V）。いくつかの実施態様では、配列番号18017の538位のアミノ酸置換は、アスパラギン（N）からリシン（K）への置換である（N538K）。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼはSuper piggyBac（sPBo）トランスポザーゼである。いくつかの実施態様では、Super piggyBac（sPBo）トランスポザーゼは、配列番号14484を含むアミノ酸配列を含んでいる。
本開示により、本開示のCARTyrinを含むか、CARTyrinをコードする配列を含むベクターが提供される。いくつかの実施態様では、ベクターは、本開示の抗PSMA CARTyrinを含むか、抗PSMA CARTyrinをコードする配列を含んでいる。
CARTyrinを発現させるこの方法のいくつかの実施態様では、CARTyrinをコードする配列が細胞集団の中の少なくとも1個の細胞の細胞膜を通過して移動するのに十分な条件は、ヌクレオフェクションを含んでいる。
CARTyrinを発現させるこの方法のいくつかの実施態様では、CARTyrinをコードする配列が細胞集団の中の少なくとも1個の細胞の細胞膜を通過して移動するのに十分な条件は、特定の電圧の1つ以上の電気パルスの印加、バッファ、1つ以上の補助因子のうちの少なくとも1つを含んでいる。いくつかの実施態様では、バッファは、PBS、HBSS、OptiMEM、BTXpress、Amaxa Nucleofector、ヒトT細胞ヌクレオフェクションバッファのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施態様では、1つ以上の補助因子は、（a）組み換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキンのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせ；（b）塩、ミネラル、代謝産物のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせ；（c）細胞培地；（d）細胞のDNA感知、代謝、分化、シグナル伝達、1つ以上のアポトーシス経路のいずれか、またはこれらの組み合わせの阻害剤；（e）1つ以上の核酸を修飾または安定化する試薬を含むことができる。組み換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、またはこれらの任意の組み合わせは、IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-ガンマ、IL-1アルファ/IL-1F1、IL-1ベータ/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/Fヘテロダイマー、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32ベータ、IL-32ガンマ、IL-33、LAP（TGF-ベータ1）、リンホトキシン-アルファ／TNF-ベータ、TGF-ベータ、TNF-アルファ、TRANCE/ TNFSF11/RANKLのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。塩、ミネラル、代謝産物、またはこれらの任意の組み合わせは、HEPES、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、MEM非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、FBS/FCS、ヒト血清、血清代替物、抗生物質、pH調整剤、アール塩、2-メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組み換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Nucleofector PLUSサプリメント、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、ラクトビオン酸ナトリウム、マニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、CINa、グルコース、Ca(NO3)2、トリス／HCl、K2HPO4、KH2PO4、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロキサマー188、ポロキサマー181、ポロキサマー407、ポリビニルピロリドン、Pop313、クラウン-5のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。細胞培地は、PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培地、CTS OpTimizer T細胞増殖SFM、TexMACS培地、PRIME-XV T細胞増殖培地、ImmunoCult-XF T細胞増殖培地のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。細胞のDNA感知、代謝、分化、シグナル伝達、1つ以上のアポトーシス経路のいずれか、またはこれらの組み合わせの阻害剤は、TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型インターフェロン、炎症促進性サイトカイン、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNAポリメラーゼIII、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、カスパーゼ1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3Aのいずれかの阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3β（GSK-3β）の阻害剤（例えばTWS119）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK、またはこれらの任意の組み合わせを含んでいる。1つ以上の核酸を修飾または安定化する試薬は、pH調整剤、DNA結合タンパク質、脂質、リン脂質、CaPO4、NLS配列を含むか含まない実効中性電荷DNA結合ペプチド、TREX1酵素のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせを含んでいる。
CARTyrinを発現させるこの方法のいくつかの実施態様では、本開示のCARTyrin、またはこのCARTyrinをコードする配列の組み込みに適した条件は、バッファと1つ以上の補助因子のうちの少なくとも1つを含んでいる。いくつかの実施態様では、本開示のトランスポゾンまたはベクターは、本開示のCARTyrinを含むか、このCARTyrinをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、バッファは、PBS、HBSS、OptiMEM、BTXpress、Amaxa Nucleofector、ヒトT細胞ヌクレオフェクションバッファのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。いくつかの実施態様では、1つ以上の補助因子は、（a）組み換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキンのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせ；（b）塩、ミネラル、代謝産物のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせ；（c）細胞培地；（d）細胞のDNA感知、代謝、分化、シグナル伝達、1つ以上のアポトーシス経路のいずれか、またはこれらの組み合わせの阻害剤；（e）1つ以上の核酸を修飾または安定化する試薬を含むことができる。組み換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、またはこれらの任意の組み合わせは、IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-ガンマ、IL-1アルファ/IL-1F1、IL-1ベータ/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/Fヘテロダイマー、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32ベータ、IL-32ガンマ、IL-33、LAP（TGF-ベータ1）、リンホトキシン-アルファ／TNF-ベータ、TGF-ベータ、TNF-アルファ、TRANCE/TNFSF11/RANKLのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。塩、ミネラル、代謝産物、またはこれらの任意の組み合わせは、HEPES、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、MEM非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、FBS/FCS、ヒト血清、血清代替物、抗生物質、pH調整剤、アール塩、2-メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組み換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Nucleofector PLUSサプリメント、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、ラクトビオン酸ナトリウム、マニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、CINa、グルコース、Ca(NO3)2、トリス／HCl、K2HPO4、KH2PO4、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロキサマー188、ポロキサマー181、ポロキサマー407、ポリビニルピロリドン、Pop313、クラウン-5のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。細胞培地は、PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培地、CTS OpTimizer T細胞増殖SFM、TexMACS培地、PRIME-XV T細胞増殖培地、ImmunoCult-XF T細胞増殖培地のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。細胞のDNA感知、代謝、分化、シグナル伝達、1つ以上のアポトーシス経路のいずれか、またはこれらの組み合わせの阻害剤は、TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型インターフェロン、炎症促進性サイトカイン、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNAポリメラーゼIII、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、カスパーゼ1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3Aのいずれかの阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3β（GSK-3β）の阻害剤（例えばTWS119）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMK、またはこれらの任意の組み合わせを含んでいる。1つ以上の核酸を修飾または安定化する試薬は、pH調整剤、DNA結合タンパク質、脂質、リン脂質、CaPO4、NLS配列を含むか含まない実効中性電荷DNA結合ペプチド、TREX1酵素のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせを含んでいる。
CARTyrinを発現させるこの方法のいくつかの実施態様では、増殖工程と選択工程は逐次的に実施する。増殖は選択の前に実施することができる。増殖は選択の後に実施することができ、場合によってはさらなる（第2の）選択を増殖の後に実施することができる。
CARTyrinを発現させるこの方法のいくつかの実施態様では、増殖工程と選択工程を同時に実施することができる。
CARTyrinを発現させるこの方法のいくつかの実施態様では、増殖は、改変された細胞集団の少なくとも1個の細胞を抗原と接触させ、CARTyrinを通じてその少なくとも1個の細胞を刺激することにより、増殖された細胞集団を生成させることを含むことができる。抗原は、基質の表面に提示することができる。基質は任意の形を持つことができ、その非限定的な例に含まれるのは、表面、ウエル、1個または複数個のビーズ、マトリックスである。基質は、常磁性成分または磁性成分をさらに含むことができる。CARTyrinを発現させるこの方法のいくつかの実施態様では、抗原は基質の表面に提示することができ、この場合に基質は磁性ビーズであり、改変され増殖された細胞集団から磁石を用いて磁性ビーズを除去または分離することができる。抗原は、細胞または人工抗原提示細胞の表面に提示することができる。本開示の人工抗原提示細胞の非限定的な例に含まれるのは、腫瘍細胞と幹細胞である。
CARTyrinを発現させるこの方法のいくつかの実施態様では、トランスポゾンまたはベクターは選択遺伝子を含み、選択工程は、改変された細胞集団の少なくとも1個の細胞を、選択遺伝子が耐性を与える化合物と接触させることにより、選択遺伝子を発現している細胞を選択から生き残ったと同定するとともに、選択遺伝子を発現できない細胞を選択工程から生き残れなかったと同定することを含んでいる。
CARTyrinを発現させるこの方法のいくつかの実施態様では、発現工程および／または選択工程は、10～14日（端点を含む）の期間にわたって進行することができる。
本開示により、本開示の方法の改変されて増殖されて選択された細胞集団を含む組成物が提供される。
本開示により、がんの治療を必要とする対象でがんを治療する方法として、その対象に本開示の組成物を投与することを含む方法が提供され、CARTyrinが腫瘍細胞上の抗原に特異的に結合する。いくつかの実施態様では、腫瘍細胞として悪性腫瘍細胞が可能である。本開示の改変された細胞または細胞集団を含む組成物を対象に投与することを含むいくつかの実施態様では、細胞または細胞集団として自己由来のものが可能である。本開示の改変された細胞または細胞集団を含む組成物を対象に投与することを含むいくつかの実施態様では、細胞または細胞集団として同種他家由来のものが可能である。
本開示により、がんの治療を必要とする対象でがんを治療する方法として、その対象に本開示の組成物を投与することを含む方法が提供され、抗PSMA CARTyrinが、腫瘍細胞上または腫瘍細胞の血管系の構成要素上のPSMA抗原に特異的に結合する。いくつかの実施態様では、腫瘍細胞として前立腺細胞が可能である。いくつかの実施態様では、腫瘍細胞として悪性腫瘍細胞が可能である。本開示の改変された細胞または細胞集団を含む組成物を対象に投与することを含むいくつかの実施態様では、細胞または細胞集団として自己由来のものが可能である。本開示の改変された細胞または細胞集団を含む組成物を対象に投与することを含むいくつかの実施態様では、細胞または細胞集団として同種他家由来のものが可能である。
本開示の細胞療法を改変する方法を利用して、例えば回復の徴候、および／または疾患の重症度／進行の低下の徴候、および／または疾患の寛解／終了の徴候、および／または有害事象の発生に応じて治療を終了させたり減らしたりすることができる。疾患の徴候または症状が再び現われたり、重症度および／または有害事象の増加が解決されたりした場合には、誘導剤を抑制することによって本開示の細胞療法を再開することができる。

図面の簡単な説明
本特許または本出願のファイルは、少なくとも1枚のカラー図面を含んでいる。カラー図面を伴う公開された本特許または本出願のコピーは、請求して必要な手数料を支払うことによって特許商標庁から提供される。
図1は、7738塩基対のpiggyBac CARTyrin P-PSMA-101プラスミドを示す模式図であり、EF1αプロモータと、安全スイッチ（iC9）と、PSMA CARTyrinと、選択遺伝子カセットを含んでいる。
図2は、PSMA CARTyrin（CD8αシグナルペプチド、抗PSMAセンチリン、CD8αスペーサ、CD8α膜貫通配列、4-1BB共刺激ドメイン、CD3ζ共刺激ドメインを含む）を含むP-PSMA-101トランスポゾンを含むpiggyBac CARTyrinを示す模式図である。
図3Aは、本開示のP-PSMA5-101コンストラクトのアミノ酸配列の模式図である。
図3Bは、本開示のP-PSMA5-101コンストラクトの核酸配列の模式図である。
図3Cは、本開示のP-PSMA5-101コンストラクトの核酸配列の模式図である。
図4Aは、本開示のP-PSMA8-101コンストラクトのアミノ酸配列の模式図である。
図4Bは、本開示のP-PSMA8-101コンストラクトの核酸配列の模式図である。
図4Cは、本開示のP-PSMA8-101コンストラクトの核酸配列の模式図である。
図5は、本開示のCARTyrinの構造を示す模式図と、センチリンと抗体の特徴を対比させた表である。
図6A～図6Eは、PSMA CARTyrinの一過性発現と機能を示している。インビトロアッセイを実施し、P-PSMA5-101とP-PSMA8-101の生成に用いるリードPSMA CARTyrinの発現と機能を調べた。PSMA CARTyrinをコードするmRNAを前日の晩に一過性にトランスフェクトした初代ヒトT細胞の表面でPSMA CARTyrinが検出された（図6A）。簡単に述べると、以前に活性化させた後に凍結させた汎T細胞を解凍してT細胞培地の中に一晩静置し、次の晩に、細胞に10μgのPSMA CARTyrin mRNAを電気穿孔した後、翌朝に、FACSによる表面発現分析を、標識のための可溶性組み換えヒトPSMAタンパク質（rPSMA）を用いて実施した。これらT細胞のインビトロでの機能を調べるため、細胞を一群のPSMA発現細胞とともに4時間培養した後、標的細胞の殺傷をCD107aの発現によって測定した。CD107aは、脱顆粒のマーカーかつT細胞殺傷の代替物である。PSMAの表面発現を、PSMA（K562.PSMA）とLNCaP（PSMAを内在性発現するヒト前立腺がん細胞系）を安定に発現するように操作したK562細胞の表面で評価した（図6B）。PSMA CARTyrinを発現しているT細胞は、PSMAを発現しているすべての細胞系（LNCaP、K562.PSMA）に対して脱顆粒が可能であったが、PSMA細胞系（K562、PC-3）に対してはバックグラウンドを超える脱顆粒はほとんどないか、まったくなかった（図6C）。PSMAをコードする決められた量のmRNAをPSMA細胞系（K562）の中に入れてPSMAの表面発現のレベルを制御した（図6D）。PSMA CARTyrin+ 細胞は、さまざまな量のPSMAを表面に発現しているK562細胞と比べて強い細胞傷害機能を示した（図6E）。これらのデータは、PSMA CARTyrinが、T細胞の表面で発現できることと、PSMA+ 細胞標的に対する細胞傷害機能を促進することを示している。 同上。 同上。 同上。 同上。
図7A～図7Fは、piggyBacを用いて作製したP-PSMA-101の表現型と機能を示している。リードPSMA CERTyrinの生体内評価をサポートするため、piggyBac DNA改変系を用いてP-PSMA-101を構成した。PSMA CERTyrinは、代表的な1人のドナーからの初代ヒトT細胞がP-PSMA5-101プラスミドまたはP-PSMA8-101プラスミドを用いて転移されたものの表面では検出されたが、P-BCMA-101プラスミド対照を用いて転移された細胞の表面では検出されなかった（図7A）。両方の場合に、大半のCD8+ CAR-T細胞が、染色とFACS分析の後に、T幹細胞記憶（Tscm）表現型に一般に関連するマーカーであるCD45RAとCD62Lの発現に関して二重に陽性であった（図7B）。さらに、（CD8+またはCD4+に関してゲートされた）これらの細胞は、FACS分析によると、活性化および／または機能的T細胞疲弊に関連する分子であるPD-1、Tim-3、Lag-3の発現レベルが低いかゼロであった（図7C）。次に、これらCAR-T細胞のエフェクタ機能を、PSMA発現細胞とともに培養した後にインビトロで評価した。（3人の独立なドナーからの）CAR-T細胞をこれらのコグネイト標的抗原の存在下で培養したとき、培地の中でのIFNγの分泌を標準的なELISAによって24時間後に測定して検出した。P-BCMA-101は、表面にBCMAを発現するように操作したK562細胞（K562.BCMA）の存在下でだけIFN-γを分泌したのに対し、P-PSMA-101は、表面にPSMAを発現する腫瘍細胞系（LNCaPとK562.PSMA）の存在下でだけIFN-γを分泌した（図7D）。それに加え、P-PSMA-101は、標準的な殺傷アッセイによって測定したとき、LNCaPに対する強い細胞傷害機能を示したのに対し、P-BCMA-101は、ほとんど殺傷能力を示さなかった；2人の独立なドナーからのデータ（図7E）。いくつかの腫瘍細胞系とともに培養したときの細胞増殖能力を96時間後に評価した。P-PSMA-101は、PSMA+ LNCaPと22Rv1に対して強い増殖能力を示し、P-BCMA-101はBCMA+ H929に対して増殖したのに対し、CAR-T細胞は、PSMA-BCMA細胞系であるK562に対してもDU145に対しても増殖しなかった（図7F）。これらのデータは、P-PSMA-101が、PSMA CARTyrinを表面に発現したことと、PSMA+細胞標的に対するインビトロでの細胞系障害機能と増殖能力を示したことを示している。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図8A～図8Fは、マウス異種移植片モデルを用いたP-PSMA-101の臨床前評価を示している。図8Aは、処理スケジュールの模式図である。NSGマウスに皮下（SC）注射したルシフェラーゼ発現LNCaP細胞系（LNCaP.Luc）を利用するマウス異種移植片モデルを用いてP-PSMA8-101の生体内抗腫瘍効果を評価した。これらの生体内研究では、P-PSMA8-101プラスミドのPB送達とPoseida作製法を利用してすべてのCAR-T細胞を生成させた。マウスの腋窩にLNCaP（n＝25、低いLNZaP「生着」率を考慮）を注射し、腫瘍が確立したとき（キャリパー測定によって100～300 mm3、移植してから17日後）に処理した。静脈内注射による超低用量（1×106）、「ストレス」用量（5×106）、標準用量（10×106）のP-PSMA-101を含む数回の投与でマウスを処理した。図8Bは、抗腫瘍活性の生存曲線のグラフである。図8Cは、血液中でのP-PSMA8-101 CD8+ T細胞の増殖と検出を示す棒グラフである。図8Dは、キャリパー測定による腫瘍体積の評価を示す一連の折れ線グラフである。図8Eは、BLIによるLNCaP腫瘍の生物発光を示す折れ線グラフである。図8Fは、図8Eにおいて定量されたマウスにおけるLNCaP腫瘍の生物発光の代表的な写真を示している。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図9A～図9Gは、マウス異種移植片モデルを用いた、「ストレス」用量としてのリードP-PSMA5-101候補とリードP-PSMA8-101候補の臨床前評価を示している。図9Aは、マウス異種移植片モデルを用いて「ストレス」用量のP-PSMA-101候補を臨床前評価するための研究のスケジュールを示す模式図である。NSGマウスに皮下（SC）注射したルシフェラーゼ発現LNCaP細胞系（LNCaP.Luc）を利用するマウス異種移植片モデルを用い、全CAR-T細胞が「ストレス」用量（4×106）であるP-PSMA5-101とP-PSMA8-101の生体内抗腫瘍効果を評価した。これらの生体内研究では、P-PSMA5-101プラスミドまたはP-PSMA8-101プラスミドのPB送達とPoseida作製法を利用してすべてのCAR-T細胞を生成させた。マウスの腋窩にLNCaPを注射し、腫瘍が確立したとき（キャリパー測定によって100～300 mm3）に処理した。静脈内注射による「ストレス」用量（4×106）のP-PSMA-101を用いてマウスを処理し、効果に関するPSMA5 CARとPSMA8 CARの間の可能なあらゆる差を探り出した。抗腫瘍活性は、生存率、血液中でのCD8+ T細胞の増殖と検出、キャリパー測定によって評価した腫瘍体積、LNCaP腫瘍の生物発光によって評価した。「ストレス」用量のP-PSMA5-101とP-PSMA8-101は、NSGマウスにおいて確立されたLNCaP.Luc固形腫瘍に対し、T細胞（CARなし）対照マウスと比べて有意な増強された抗腫瘍効果と生存率を示した。具体的には、T細胞（CARなし）対照マウスでは生き残ることがなく、P-BCMA-101で処理した群では25％が生き残り、P-PSMA5-101で処理した群では75％が生き残り、「ストレス」用量のP-PSMA8-101で処理した群では100％が生き残った。末梢血では、P-PSMA5-101とP-PSMA8-101が増殖してエフェクタCARTyrin+ T細胞の分化を生じさせると同時に、腫瘍負荷が減少してキャリパーの検出限界と生物発光イメージングの限界よりも下になった。これらの細胞はその後収縮したが、それでも末梢血の中で存続した。図9Bは、抗腫瘍活性の生存曲線のグラフである。図9Cは、血液中でのP-PSMA5-101 CD8+ T細胞とP-PSMA8-101 CD8+ T細胞の増殖と検出を示す棒グラフである。図9Dは、キャリパー測定による腫瘍体積の評価を示す一連の折れ線グラフである。左側のグラフは、右側の一連のグラフに示した腫瘍体積のデータの平均を示している。図9Eは、BLIによるLNCaP腫瘍の生物発光を示す折れ線グラフである。図9Fは、図9Eにおいて定量されたLNCaP腫瘍マウスの生物発光の代表的な写真を示している。図9Gは一連のフローサイトメトリーのプロットであり、P-PSMA-101（TSCM/TCM）がCARTyrin+であるTCM、TEM、Teffを生じさせて固形腫瘍を攻撃することを示している。固形腫瘍が除去された後、P-PSMA-101 TSCMの集団が存続する。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。 同上。
図10は一連のフローサイトメトリーのプロットであり、治療剤（CARTyrin）だけを発現するか、piggyBac（PB）トランスポザーゼによって細胞の中に導入された（iC9コンストラクト（「安全スイッチ」としても知られる）によってコードされる）本開示の誘導性カスパーゼポリペプチドとの組み合わせを発現するように改変された細胞において、ヌクレオフェクションの12日後に、細胞が、増加する用量の誘導剤（AP1903）の関数として、生きている細胞の領域（ゲートされた右下の象限）からアポトーシス細胞による集団の領域（左上の象限）へと大量に移動することを示している。 同上。 同上。 同上。
図11は一連のフローサイトメトリーのプロットであり、治療剤（CARTyrin）だけを発現するか、piggyBac（PB）トランスポザーゼによって細胞の中に導入された（iC9コンストラクト（「安全スイッチ」としても知られる）によってコードされる）本開示の誘導性カスパーゼポリペプチドとの組み合わせを発現するように改変された細胞において、ヌクレオフェクションの19日後に、細胞が、増加する用量の誘導剤（AP1903）の関数として、生きている細胞の領域（ゲートされた右下の象限）からアポトーシス細胞による集団の領域（左上の象限）へと大量に移動することを示している。 同上。 同上。 同上。
図12は、図10（左側のグラフ）または図11（右側のグラフ）において集団を形成した結果の定量化を示す一対のグラフである。具体的には、これらのグラフは、12日目（図10と左側のグラフ）または19日目（図11と右側のグラフ）に、iC9安全スイッチが、改変されたそれぞれの細胞のタイプについて、iC9スイッチの誘導剤（AP1903）の濃度の関数として細胞生存率に影響を及ぼすことを示している。
図13は、武装T細胞上として使用できると考えられるさまざまな標的チェックポイントシグナル伝達タンパク質のノックアウト効率を示す棒グラフである。Cas-CLOVERを用いて、休止状態にある初代ヒト汎T細胞の中のチェックポイント受容体（PD-1、TGFBR2、LAG-3、TIM-3、CTLA-4）をノックアウトした。ノックアウト率をy軸に示してある。遺伝子編集の結果として、フローサイトメトリーによって測定すると、細胞表面でのタンパク質の発現が30～70％失われた。
図14は、野生型受容体、ヌル受容体、スイッチ受容体の模式図と、これら受容体が初代T細胞において抑制性または刺激性の細胞内シグナル伝達に及ぼす効果である。T細胞上に内在性発現した野生型抑制性受容体がこのT細胞の内在性リガンドに結合すると抑制性シグナルが伝達される。この抑制性シグナルは、一部がT細胞エフェクタ機能を低下させる。しかしチェックポイント受容体タンパク質（例えばPD1（上図）またはTGFBRII（下図））の細胞内ドメイン（ICD）の変異（変異ヌル）または欠失（切断型ヌル）は、コグネイトリガンドが結合するとき、そのシグナル伝達能力を低下または消失させる。したがって、改変されたT細胞の表面で、操作された変異型ヌル受容体または切断型ヌル受容体が発現すると、遊離した内在性リガンドの結合について、内在性発現した野生型受容体と競合し、内在性発現した野生型受容体による抑制性シグナルの送達が効果的に低下または消失する。具体的には、変異型ヌル受容体または切断型ヌル受容体によるあらゆる結合は、内在性リガンドが野生型受容体と結合するのを阻止し、改変されたT細胞に有効に送達されるチェックポイントシグナル伝達の全体レベルを低下させることで、改変されたT細胞のチェックポイント抑制と機能疲弊を減らす、または阻止する。スイッチ受容体は、野生型ICDを共刺激性分子（D3z、CD28、4-1BBなど）または異なる抑制性分子（CTLA4、PD1、Lag3など）からのICDと置き換えることによって生成する。前者の場合には、改変されたスイッチ受容体が内在性リガンドに結合すると、正のシグナルがT細胞に送達されることで、改変されたT細胞の刺激増強を助け、標的腫瘍細胞の殺傷を増強できる可能性がある。後者の場合には、改変されたスイッチ受容体が内在性リガンドに結合すると、負のシグナルがT細胞に送達されることで、改変されたT細胞の刺激が消失し、標的腫瘍細胞の殺傷が減少する可能性がある。シグナルペプチド（紫色の矢印）、細胞外ドメイン（ECD）（明るい緑色）、膜貫通ドメイン（黄色）、細胞内シグナル伝達ドメイン（ICD）（オレンジ色）、置換ICD（緑色）が、受容体のダイヤグラムに表示されている。「*」は変異したICDを示す。「+」はチェックポイントシグナルの存在を示す。「-」はチェックポイントシグナルの不在を示す。
図15Aは、改変されたT細胞の表面における受容体の発現増大を助けることのできる特別な変化を有するヌル受容体の設計の一例を示す模式図である。PD1ヌル受容体とTGFBRIIヌル受容体について例示されており、PD1（上図）とTGFBRII（下図）に関して切断型ヌル受容体のシグナルペプチドドメイン（SP）、膜貫通ドメイン（TM）、細胞外ドメイン（ECD）が示されている。上の4つの分子の第1は野生型PD-1受容体であり、野生型PD-1のSPとTMをコードしている。PD1ヌル受容体に関しては、PD-1の野生型SPドメインまたはTMドメイン（緑色；明るい緑色）をヒトT細胞 CD8a受容体（赤色）のSPドメインまたはTMドメインで置換することが示されている。第2の分子は、CD8a SPと天然PD-1 TMをコードしており、第3の分子は、野生型PD-1 SPと代替CD8a TMをコードしており、第4の分子は、代替CD8a のSPとTMの両方をコードしている。同様に、TGFβRIIのヌル受容体に関しては、野生型TGFBRII SP（ピンク色）をヒトT細胞CD8a受容体のSPドメイン（赤色）で置換する。コンストラクトの名称と、各コンストラクトタンパク質のアミノ酸の長さ（aa）が、ダイヤグラムの左側に掲載されている。
図15Bは、フローサイトメトリーによって求めた、改変された初代ヒトT細胞の表面でのPD1ヌル受容体とTGFBRIIヌル受容体の発現を示す一連のヒストグラムである。図15Aからの6つの切断型ヌルコンストラクトそれぞれを初代ヒトT細胞の表面で発現させた。T細胞は、抗PD1抗体（上；青色のヒストグラム）、または抗TGFβRII抗体（下；青色のヒストグラム）、またはアイソタイプ対照抗体、または二次抗体だけ（灰色のヒストグラム）で染色した。PD-1またはTGFβRIIの発現に関して陽性に染色される細胞をゲートし（ゲートの上に頻度を示す）、平均蛍光強度（MFI）値を各陽性ヒストグラムの上方に示してある。ヌル受容体コンストラクトの名称が各プロットの上方に示されている。両方のヌル受容体遺伝子戦略で、野生型SPを代替CD8aで置き換えるとうまく発現した。02.8aSP-PD-1と02.8aSP-TGFβRIIは、T細胞の表面における発現が最高レベルになった。02.8aSP-PD-1ヌル受容体はMFIが43,680を示し、これは内在性T細胞PD-1の発現の177倍であり、野生型PD-1ヌル受容体の2.8倍である。02.8aSP-TGFβRIIヌル受容体はMFIが13,809を示し、これは内在性T細胞TGFβRIIの発現の102倍であり、野生型TGFβRIIヌル受容体の1.8倍である。PD1とTGFβRIIの両方に関して野生型SPを代替CD8a SPで置き換えると、ヌル受容体またはスイッチ受容体の表面発現が増大する。これは、内在性リガンドの結合時と隔離時にチェックポイント抑制の低下または阻止をそれぞれ最大化するのに役立つ可能性がある。
図16A～図16Bは、T細胞の中で発現させるためのNF-KB誘導性ベクターを示す一対の模式図である。2つのT細胞活性化NF-KB誘導性ベクターを開発した。一方は、順方向（A）の遺伝子発現系（GES）を持ち、他方は相補的な方向（B）であり、両方とも構成的EF1aプロモータの前にある。これらベクターは、T2A配列によって隔てられたCAR分子とDHFR選択遺伝子の発現も直接指示する。条件的NF-KB誘導系と、EF1aに指示される遺伝子の両方が、電気穿孔（EP）を利用してT細胞の中に恒久的に挿入することのできるPiggyBacトランスポゾンの一部である。このT細胞は、ゲノムの中に組み込まれると、膜表面でCARを、細胞内でDHFRを構成的に発現させるのに対し、NF-KB誘導性遺伝子であるGFPは、T細胞が活性化されたときだけ、最高レベルで発現することになる。 同上。
図17は、活性化されたT細胞におけるGFPのNF-KB誘導性発現を示す一対のグラフである。順方向（pNFKB-GFP順）または逆方向（pNFKB-GFP逆）でGFPの発現を駆動するNF-KB誘導性発現系の不在（GESなし対照）下または存在下にて、EF1aプロモータの制御下で抗BCMA CARとDHFR突然変異タンパク質遺伝子を発現するpiggyBacベクターをT細胞にヌクレオフェクトした。細胞がほぼ完全に休止する（19日目）まで、細胞をメトトレキサート選択の存在下で培養し、GFPの発現を5日目と19日目に評価した。5日目、すべてのT細胞が増殖していて強く刺激されており、NF-KB誘導性発現カセットを有する細胞は、強いNFκB活性のために高レベルのGFPを生じさせた。GESなし対照細胞は、検出可能なレベルのGFPを発現しなかった。19日目までにGES T細胞はほぼ完全に休止しており、GFPの発現は5日目よりも有意に少なかった（約1/8のMFI）。というのもNFκB活性がより低いからである。GFPの発現は19日目にまだ観察される。それは、GFPタンパク質の半減期が長いこと（約30時間）、または例えばTCR、CAR、サイトカイン受容体、増殖因子受容体シグナルのいずれかを通じたNFκB活性の基礎レベルが原因である可能性がある。
図18は、GFPのNF-KB誘導性発現が、BCMA+腫瘍細胞の存在下で抗BCMA CARを媒介として活性化されることを示す一連のグラフである。T細胞には、改変をしない（モックT細胞）か、順方向（pNFKB-GFP順）または逆方向（pNFKB-GFP逆）でGFPの発現を駆動するNF-KB誘導性発現系の不在下（GESなし対照）または存在下で、EF1プロモータの制御下で抗BCMA CARとDHFR突然変異タンパク質遺伝子を発現するpiggyBacベクターをヌクレオフェクトした。すべての細胞を、細胞がほぼ完全に休止するまで、メトトレキサート選択あり、またはなし（モックT細胞）で22日間培養した。次に細胞を、BCMA-（K562）、BMCA+（RPMI 8226）、陽性対照である抗CD3抗CD28活性化試薬（CD3/28刺激）いずれかの不在下（刺激なし）または存在下で3日間刺激した。GFPの発現は、GESなし対照、またはモックT細胞を用いると、どの条件下でも検出できなかった。しかしpNFKB-GFP順転移細胞とpNFKB-GFP逆転移細胞は、BCMA-K562細胞とともに培養したとき、刺激なし対照を超えるGFP発現をほとんど示さなかったが、その両方とも、BCMA+腫瘍細胞の存在下、または陽性対照条件下では遺伝子発現の劇的な上方調節を示した。BCMA+腫瘍細胞とともに培養したpNFKB-GFP順転移細胞とpNFKB-GFP逆転移細胞の間でGFP発現の差はほとんど観察されなかった。
図19は、誘導性遺伝子の発現レベルを、抗BCMA CARTyrinの後に選択遺伝子（その両方ともヒトEF1aプロモータの制御下にある）をコードするpiggyBacベクターがプロモータT細胞にヌクレオフェクトされる前の反応エレメントの数によって調節できることを実証する一連のグラフである。さらに、ベクターは、切断型CD19タンパク質（dCD19）の発現を駆動する条件的NF-KB誘導性遺伝子発現系を追加してコードしていて、0個から5個まで変化する数のNFKB反応エレメント（RE）を含み、GESなしである（GESなし）か、電気穿孔パルスを受けるがpiggyBac核酸は受けない（モック）のいずれかであった。データは、逆（反対）方向／向きのGESだけについて示してある。すべての細胞は、18日間培養し、メトトレキサート添加を利用したpiggyBac改変T細胞に関する選択を含んでいた。次に、抗CD3抗CD28ビーズ活性化試薬を用いて細胞を3日間刺激し、表面でのdCD19の発現をFACSによって0日目、3日目、18日目に評価し、データを、FACSヒストグラムと、標的タンパク質染色のMFIとして示した。各FACSヒストグラムのx軸は対数スケールで示されている（0、103、104、105）。各FACSヒストグラムにプロットされているサンプルは、上から下に向かって、NFKB-A08-DHFR_Rev002.fcs、NFKB-A08_DHFR_Rev-RE4X_12.fcs、NFKB-A08_DHFR_Rev-RE3X_011.fcs、NFKB-A08_DHFR_Rev-RE2X_010.fcs、NFKB-A08_DHFR_Rev-RE1X_009.fcs、NFKB-A08_DHFR_Rev-RE0X_008.fcs、NFKB-A08_DHFR_v5_013.fcs、NFKB-A08_DHFR_MOCK_014.fcsである。表面でのdCD19の発現が、GESをコードするベクターを用いて転移されたすべてのT細胞において0日目に低レベルで検出された。刺激してから3日目、dCD19発現の劇的な上方調節が、GESを発現するすべてのT細胞で観察され、REの数が多いT細胞ほど表面発現の増加倍率が大きかった。したがって表面でのdCD19の発現は、GESの中にコードされているREの数に直接比例していた。GESを含まないT細胞の表面、すなわちGESなし対照とモック対照の表面では、dCD19は検出されなかった。 同上。 同上。
図20は、Csy4-T2A-Clo051-G4Sリンカー-dCas9コンストラクトマップ（実施態様2）の模式図である。
図21は、pRT1-Clo051-dCas9二重NLSコンストラクトマップ（実施態様1）の模式図である。
図22は、前立腺がん骨転移マウス異種移植片モデルにおいてリードP-PSMA-101候補を臨床前評価する研究のスケジュールを示す模式図である。ヒトPSMAタンパク質（PC3.lucGFP.hPSMA）を発現するように操作されたルシフェラーゼ発現PC3細胞系を用いたマウス異種移植片モデルを利用してP-PSMA5-101とP-PSMA8-101の生体内抗腫瘍効果を2つの異なる用量、すなわち「ストレス」用量である4×106全CAR-T細胞と、標準用量である12×106全CAR-T細胞で評価した。陰性対照として、T細胞だけ（CARを発現しない；用量12×106）、またはP-BCMA-101 T細胞（無関係である抗BCMA CARを発現する；用量12×106）も含めた。これらの生体内研究では、P-PSMA5-101プラスミドまたはP-PSMA8-101プラスミドのPB送達とPoseida作製法を利用してすべてのCAR-T細胞を生成させた。マウスの脛骨周辺にPc3.lucGFP.hPSMAを注射し、4日後にCAR-T細胞で処理した（腫瘍を負荷したすべてのマウスが生物発光イメージングによって検出できる腫瘍を持っており、生物発光の範囲は全光束で1～5×106（p/秒/m2）であった）。
図23は、「ストレス」用量または標準用量でのP-PSMA5-101とP-PSMA8-101の用量効果を示すグラフであり、T細胞だけ（CARなし）またはP-BCMA-101で処理した対照マウスと比べたとき、NSGマウスで確立されたIT PC3.lucGFP.hPSMA固形腫瘍に対して抗腫瘍効果を示すことを実証している。
図24は、本開示のpiggyBac P-PSMA-101ナノトランスポゾンを示す模式図である。
図25は、P-PSMA-101 piggyBacプラスミド（薄い灰色の棒）またはP-PSMA-101 piggyBacナノトランスポゾン（濃い灰色の棒）をSuper piggyBacトランスポザーゼ酵素と組み合わせて電気穿孔（EP）で送達すると、PSMA CARTyrinの表面発現によって測定したとき、（EPの5日後に）ヒト汎T細胞において大きな転移効率になったことを示すグラフである（転移率（％））。
図26は、抗PSMA CARナノトランスポゾン（NT）を用いて生成させたヒトCAR-T細胞が、標的腫瘍細胞を殺傷できたことを示す一連のグラフである。完全長piggyBacプラスミド（FP）またはpiggyBacナノトランスポゾン（NT）を用いて生成させる抗PSMA CAR T細胞を、標準的なPoseida法を利用して生成させた。エフェクタ：標的の比が表示された値であるときの、CAR-T細胞によってPSMAを発現するように改変されたK562細胞（K562.PSMA）の殺傷。これらのデータは、すべてのCAR-T細胞が、FPを利用して生成させたかNTを利用して生成させたかに関係なく、抗原に依存したやり方で標的腫瘍細胞を殺傷できたことを示している。これは、2人の異なる正常なドナーからのヒト汎T細胞から生成させたCAR-T細胞に当てはまった。
図27は、抗PSMA CARナノトランスポゾン（NT）を用いて生成させたヒトCAR-T細胞は、表現型の組成が似ていることを示す一連のグラフである。完全長piggyBacプラスミド（FP）またはpiggyBacナノトランスポゾン（NT）を用いて生成させる抗PSMA CAR T細胞を、標準的なPoseida法を利用して生成させた。記憶T細胞マーカーと活性化／疲弊マーカーの表現型分析を実施した（データは示さない）。これらのデータは、すべてのCAR-T細胞が、FPを利用して生成させたかNTを利用して生成させたかに関係なく、CD45RA+CD62L+（Tscm）細胞、CD45RA-CD62L+（Tcm）細胞、CD45RA-CD62L-（Tem）細胞、CD45RA+CD62L-（Teff）細胞と同様の表現型組成を示したことを示している。それに加え、CCR7（CD197）、CD127、CD27、LAG3、TIM3、CXCR3、PD-1、CD25の発現が同等なレベルで観察された（データは示さない）。これは、2人の異なる正常なドナーからのヒト汎T細胞から生成させたCAR-T細胞に当てはまった。
図28は、抗PSMA CARナノトランスポゾン（NT）を用いて生成させたヒトCAR-T細胞は、組み込まれたコピー数が似ていることを示す一連のグラフである。完全長piggyBacプラスミド（FP）またはpiggyBacナノトランスポゾン（NT）を用いて生成させる抗PSMA CAR T細胞を、標準的なPoseida法を利用して作製した。組み込まれたトランスポゾンの平均コピー数は、定量PCRによって測定した。これらのデータは、2人の異なるドナーにおいて、すべてのCAR-T細胞が、FPを利用して生成させたかNTを利用して生成させたかに関係なく、同様の組み込まれたコピー数を示したことを示している。
図29Aは、マウス異種移植片モデルを利用し、「ストレス」用量を完全長プラスミド（FLP）によって送達したときとナノトランスポゾン（NT）によって送達したときのP-PSMA-101トランスポゾンの臨床前評価を示す模式図である。完全長プラスミド（FLP）またはナノトランスポゾン（NT）によって2人の異なる正常なドナーからの全CAR-T細胞を2つの異なる「ストレス」用量（2.5×106または4×106）で送達するときのP-PSMA-101トランスポゾンの生体内抗腫瘍効果を、NSGマウスに皮下（SC）注射したルシフェラーゼ発現LNCaP細胞系（LNCaP.luc）を用いるマウス異種移植片モデルを利用して評価した。FLP送達またはNT送達によるP-PSMA-101トランスポゾンのpiggyBac（PB）送達を利用して全CAR-T細胞を生成させた。マウスの腋窩にLNCaPを注射し、腫瘍が確立したとき（キャリパー測定によって100～200 mm3）に処理した。FLPまたはNTによるトランスポゾン送達の間の効果の可能な機能的違いを検出する分解能をより大きくするため、静脈内注射により、2つの異なる「ストレス」用量（2.5×106または4×106）のP-PSMA-101 CAR-Tでマウスを処理した。
図29Bは、図29Aに記載されているようにして処理したマウスの腫瘍体積の評価を示す一連のグラフである。キャリパー測定による腫瘍体積の評価が、エラー棒付きの群平均（上）および個々のマウス（下）として、対照マウス（黒色）、ドナー#1 FLPマウス（赤色）、ドナー#1 NTマウス（青色）、ドナー#2 FLPマウス（オレンジ色）、ドナー#2 NTマウス（緑色）について示されている。y軸は、キャリパー測定によって評価した腫瘍体積（mm3）を示している。x軸は、T細胞で処理した後の日数を示している。「ストレス」用量のP-PSMA-101トランスポゾンは、NTによって送達されると、キャリパー測定によって測定したとき、確立されたSC LNCaP.luc固形腫瘍に対してFLPマウスおよび対照マウスと比べて増強された抗腫瘍効果を示した。
図30は、T細胞受容体（TCR）と、共受容体であるCD28とCD2を示す模式図である。
図31は、アゴニストmAb（抗CD3、抗CD28、抗CD2）の結合を通じて一次と二次の共刺激がT細胞に送達されることを示す模式図である。十分なT細胞活性化は、免疫応答を追加する共刺激受容体による二次シグナルと組み合わさったTCRエンゲージメントに決定的に依存する。一次と二次の共刺激は、アゴニストmAb（例えば抗CD3、抗CD28、抗CD2、これらmAbが結合したビーズ、これらmAbの多量体複合体など）を提示する試薬を用いた表面受容体の処理とエンゲージメントを通じてT細胞に送達することができる。
図32は、TCRの不在下では、キメラ刺激受容体（CRS）が発現することで刺激が増強されることを示す模式図である。一過性に発現するか安定に発現する表面発現CSRの存在下では、アゴニストmAbを提示する試薬でT細胞を処理すると、増強された一次と二次の共刺激シグナルが送達される。より十分なT細胞活性化は、CSRを媒介とした刺激シグナルを通じて実現されるため、T細胞の活性化と増殖が増強される。
図33Aは、本開示の代表的なCSR CD28zの一例を示す模式図である。
図33Bは、図33Aに示されているCSR CD28zをコードするアミノ酸配列である。
図33Cは、図33Aに示されているCSR CD28zをコードするヌクレオチド配列である。
図34Aは、本開示の代表的なCSR CD2zの一例を示す模式図である。
図34Bは、図34Aに示されているCSR CD2zをコードするアミノ酸配列である。
図34Cは、図34Aに示されているCSR CD2zをコードするヌクレオチド配列である。
図35は、CSR がT細胞の表面に発現していても、外来性刺激の不在下では細胞を活性化させないことを示す一連のグラフである。正常な血液ドナーからの汎T細胞を標準的なT細胞培地の中で抗CD3／抗CD28ビーズを用いて刺激した後、静置した。次いでこれらの細胞に、CD28 CSR、CD2 CSR、野生型CD19対照のいずれかをコードするmRNAを10μg電気穿孔した（BTX ECM 830電気穿孔装置、500Vで700マイクロ秒間）。2日後、電気穿孔された細胞をフローサイトメトリーによって調べて各分子の表面発現を探し、データを積み上げヒストグラムとして示してある。それに加え、モックを電気穿孔された対照細胞よりも細胞活性化が大きいことの可能な1つの指標として、細胞のサイズ（FSC-A）とCD69の発現を評価した。表面でのCD28、CD2、CD19の発現増加が、CD28z CSR、CD2z CSR、CD19をそれぞれ電気穿孔されたT細胞で検出された。外来性刺激がないと、T細胞の表面におけるこれら分子の発現が細胞を本質的に活性化することはなかった。
図36は、CSRを送達するとCAR-T細胞の増殖が増強されることを示すグラフである。CSRを、mRNAによって一過性に、またはpiggyBac（商標）によって安定に、CAR-Tに送達した。piggyBac（商標）DNA改変系と標準的なPoseida法を利用して、正常なドナーの血液から単離された汎T細胞を遺伝子改変した。細胞に、一回の反応で、Super piggyBacトランスポザーゼ酵素（SPB）をコードするmRNAと、BCMA CARをコードするトランスポゾンと、選択遺伝子に加え、CSR（CD28zまたはCD2z；その結果として一過性発現になる）をコードする追加のmRNA、またはCD19 mRNA対照をともに電気穿孔するか、BCMA CARと選択遺伝子とCSR（CD28zまたはCD2z；その結果として安定な発現になる）をコードするトランスポゾンを電気穿孔した。その後、細胞をアゴニストmAbである抗CD2、抗CD3、抗CD28で刺激し、19日間の培養期間に遺伝子改変がなされた細胞をあとで選択した。最初の培養期間の終了時にすべてのT細胞がCARを発現していた。これは、遺伝子改変がなされた細胞がうまく選択されたことを示す（データは示さず）。棒は、ウエルの中の生きている全CAR-T細胞を表わしており、数字は、CSRまたはCD19 mRNA対照の不在下で生成したCAR-T細胞を超える増殖倍数を示す。CD2z CSRまたはCD28z CSRを一過性に、または安定に発現するサンプルでは、CAR-T細胞の増殖の程度がより大きい。
図37は、CSRの発現がCAR-T細胞の細胞傷害性に有意な影響を与えないことを示す一連の棒グラフである。CSRを、mRNAによって一過性に、またはpiggyBac（商標）によって安定に、CAR-Tに送達した。piggyBac（商標）DNA改変系と標準的なPoseida法を利用して、正常なドナーの血液から単離された汎T細胞を遺伝子改変した。細胞に、一回の反応で、Super piggyBacトランスポザーゼ酵素（SPB）をコードするmRNAと、BCMA CARをコードするトランスポゾンと、選択遺伝子に加え、CSR（CD28zまたはCD2z；その結果として一過性発現になる）をコードする追加のmRNAをともに電気穿孔するか、BCMA CARをコードするトランスポゾンと、選択遺伝子と、CSR（CD28zまたはCD2z；その結果として安定な発現になる）を電気穿孔した。その後、細胞をアゴニストmAbである抗CD2、抗CD3、抗CD28で刺激し、19日間の培養期間に遺伝子改変がなされた細胞をあとで選択した。最初の培養期間の終了時にすべてのT細胞がCARを発現していた。これは、遺伝子改変がなされた細胞がうまく選択されたことを示す（データは示さず）。CAR-T細胞の殺傷能力を評価するため、細胞を、操作したK562-BCMA-ルシフェラーゼ（eK562-Luc.BCMA）または陰性対照系K562-ルシフェラーゼ（eK562-Luc）とともに、E：T比を10：1、または3：1、または1：1にして48時間培養した。ルシフェラーゼのシグナルを測定して細胞傷害性を求めた。左側の棒グラフにはeK562-Lucの殺傷が示されているのに対し、右側の棒グラフにはeK562-Luc.BCMAの殺傷が示されている。すべてのCAR+ T細胞が抗BCMA特異的CARを発現し、インビトロでBCMA+ 標的細胞に対して似たような細胞傷害性を示した。まとめると、この活性は、一過性のCSR共発現、または安定なCSR共発現による有意な影響を受けなかった。
本開示により、少なくとも1つのセンチリンを含むキメラ抗原受容体（CAR）（CARTyrin）が提供される。本開示のキメラ抗原受容体は、2つ以上のセンチリンを含むことができる。例えば二重特異性CARTyrinは、2つの異なる抗原に特異的に結合する2つのセンチリンを含むことができる。好ましい実施態様では、本開示のCARTyrinは、PSMAの配列に特異的に結合する少なくとも1つのセンチリンを含んでいるため、PSMA特異的センチリンと呼ばれる。少なくとも1つのPSMA特異的センチリンを含む本開示のCARTyrinを本明細書では、PSMAの配列に特異的に結合する抗PSMA CARTyrinと呼ぶ。
本開示のセンチリンは抗原に特異的に結合する。抗原に特異的に結合する1つ以上のセンチリンを含む本開示のキメラ抗原受容体は、細胞（例えば細胞傷害性免疫細胞）の特異性を特定の抗原に向けるのに用いることができる。
本開示のセンチリンは、LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT（配列番号18018）を含むコンセンサス配列を含むことができる。
本開示のキメラ抗原受容体は、ヒトのCD2シグナルペプチド、CD3δシグナルペプチド、CD3εシグナルペプチド、CD3γシグナルペプチド、CD3ζシグナルペプチド、CD4シグナルペプチド、CD8αシグナルペプチド、CD19シグナルペプチド、CD28シグナルペプチド、4-1BBシグナルペプチド、GM-CSFRシグナルペプチドのいずれかを含むことができる。本開示のヒンジ／スペーサドメインは、ヒトのCD8α、および／またはIgG4、および／またはCD4のヒンジ／スペーサ／ストークを含むことができる。本開示の細胞内ドメインまたはエンドドメインは、ヒトCD3ζの細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができ、ヒトの4-1BB細胞内セグメント、CD28細胞内セグメント、CD40細胞内セグメント、ICOS細胞内セグメント、MyD88細胞内セグメント、OX-40細胞内セグメントのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせをさらに含むことができる。代表的な膜貫通ドメインの非限定的な例に含まれるのは、ヒトのCD2膜貫通ドメイン、CD3δ膜貫通ドメイン、CD3ε膜貫通ドメイン、CD3γ膜貫通ドメイン、CD3ζ膜貫通ドメイン、CD4膜貫通ドメイン、CD8α膜貫通ドメイン、CD19膜貫通ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、4-1BB膜貫通ドメイン、GM-CSFR膜貫通ドメインである。
本開示により、本開示のCARTyrinを導入することによって1つ以上の抗原に対して特異的にされた遺伝子改変細胞（T細胞、NK細胞、造血前駆細胞、末梢血（PB）由来T細胞（G-CSFが動員する末梢血からのT細胞を含む）、臍帯血（UCB）由来T細胞など）が提供される。本開示の細胞は、本開示のCARTyrinをコードするトランスポゾンと、本開示のトランスポザーゼをコードする配列（本開示のトランスポザーゼをコードする配列はmRNA配列であることが好ましい）を含むプラスミドの電気泳動転写によって改変することができる。

細胞組成物のさらなる改変
本開示により、（a）活性化要素を含むエクトドメインと；（b）膜貫通ドメインまたは細胞膜付着領域を含み、（a）と（b）の組み合わせが天然には生じないキメラ刺激受容体（CSR）が提供される。いくつかの実施態様では、このCSRは環境の構成要素に結合し、受容体の完全長バージョンまたは膜貫通バージョンと競合することによって細胞におけるシグナル伝達の帰結を変化させ、環境の構成要素が活性化要素に結合することから生じる細胞内シグナルを減少させる。
本開示により、（a）活性化要素を含むエクトドメインと；（b）膜貫通ドメインと；（c）少なくとも1つのシグナル伝達ドメインを含むエンドドメインを含み、（a）と（b）と（c）の組み合わせが天然には生じないキメラ刺激受容体（CSR）が提供される。
本開示のCSRのいくつかの実施態様では、（a）の活性化要素は、第1のタンパク質から単離されるか、第1のタンパク質に由来する。いくつかの実施態様では、（c）のシグナル伝達ドメインは、第2のタンパク質から単離されるか、第2のタンパク質に由来する。いくつかの実施態様では、第1のタンパク質と第2のタンパク質は同じでない。
本開示のCSRのいくつかの実施態様では、CSRはスイッチ受容体であり、シグナルを抑制するか、第1のタンパク質の野生型の完全長バージョンまたは膜貫通バージョンによって伝達されると考えられるのとは質的に異なるシグナルを伝達することで、活性化要素の結合を細胞外に移す。CSRスイッチ受容体は細胞外ドメインと細胞内ドメインに対してキメラであるため、細胞外活性化要素が結合することの帰結を、天然に生じるシナリオから、天然には生じない操作されたシナリオに切り換える。
本開示のCSRのいくつかの実施態様では、活性化要素は、ヒト膜貫通受容体の構成要素、ヒト細胞表面受容体、T細胞受容体（TCR）、TCR複合体の構成要素、TCR共受容体の構成要素、TCR共刺激タンパク質の構成要素、TCR抑制タンパク質の構成要素、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体のうちの1つ以上を含んでいる。いくつかの実施態様では、活性化要素は、ヒト膜貫通受容体の構成要素、ヒト細胞表面受容体、T細胞受容体（TCR）、TCR複合体の構成要素、TCR共受容体の構成要素、TCR共刺激タンパク質の構成要素、TCR抑制タンパク質の構成要素、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体のうちの1つ以上の一部であって活性化要素のアゴニストが結合する部分を含んでいる。
本開示のCSRのいくつかの実施態様では、アゴニストは、小さな有機分子、小さな無機分子、核酸、アミノ酸、抗体またはその断片、抗体模倣体、アプタマー、足場タンパク質、リガンド、受容体、天然に存在する生体分子、天然に存在しない分子（有機または無機）のうちの1つ以上を含んでいる。
本開示のCSRのいくつかの実施態様では、活性化要素は、CD2タンパク質を含むか、その一部であってアゴニストが結合する部分を含んでいる。
本開示のCSRのいくつかの実施態様では、シグナル伝達ドメインは、ヒトシグナル伝達ドメインの構成要素、T細胞受容体（TCR）、TCR複合体の構成要素、TCR共受容体の構成要素、TCR共刺激タンパク質の構成要素、TCR抑制タンパク質の構成要素、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体のうちの1つ以上を含んでいる。いくつかの実施態様では、シグナル伝達ドメインはCD3タンパク質を含んでいる。いくつかの実施態様では、CD3タンパク質はCD3ζタンパク質を含んでいる。
本開示のCSRのいくつかの実施態様では、エンドドメインは細胞質ドメインをさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、細胞質ドメインをコードする配列は、共刺激タンパク質をコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、細胞質ドメインは、第3のタンパク質から単離されるか、第3のタンパク質に由来する。いくつかの実施態様では、第1のタンパク質と第3のタンパク質は同じである。
本開示のCSRのいくつかの実施態様では、エクトドメインはシグナルペプチドをさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、シグナルペプチドは第4のタンパク質に由来する。いくつかの実施態様では、第1のタンパク質と第4のタンパク質は同じである。
本開示のCSRのいくつかの実施態様では、膜貫通ドメインは、第5のタンパク質から単離されるか、第5のタンパク質に由来する。いくつかの実施態様では、第1のタンパク質と第5のタンパク質は同じである。
本開示のCSRのいくつかの実施態様では、CSRは、CD2タンパク質から単離されるかCD2タンパク質に由来する配列を持つシグナルペプチドと、CD2タンパク質、またはその一部であってアゴニストが結合する部分から単離されるか、CD2タンパク質、またはその一部であってアゴニストが結合する部分に由来する配列を含む活性化要素を含むエクトドメインと；CD2タンパク質から単離されるかCD2タンパク質に由来する配列を含む膜貫通ドメインと；CD2タンパク質から単離されるかCD2タンパク質に由来する配列を含む細胞質ドメインと、CDζ3タンパク質から単離されるかCDζ3タンパク質に由来する配列を含むシグナル伝達ドメインを含むエンドドメインを含んでいる。
本開示のCSRのいくつかの実施態様では、活性化要素は天然に存在する分子に結合しない。
本開示のCSRのいくつかの実施態様では、活性化要素が天然に存在する分子に結合したとき、CSRはシグナルを伝達しない。いくつかの実施態様では、エクトドメインは修飾を含んでいる。いくつかの実施態様では、修飾は、第1のタンパク質の野生型配列と比べたとき、活性化要素をコードする配列の変異または切断を含んでいる。
本開示のCSRのいくつかの実施態様では、活性化要素は天然に存在しない分子に結合する。
本開示のCSRのいくつかの実施態様では、活性化要素が天然に存在しない分子に結合したとき、CSRは選択的にシグナルを伝達する。
本開示により、本開示のCSRをコードする核酸配列が提供される。
本開示により、本開示のCSRをコードする核酸配列を含むベクターが提供される。
本開示により、本開示のCSRをコードする核酸配列を含むベクターが提供される。
本開示により、本開示のCSRをコードする核酸配列を含むトランスポゾンが提供される。
本開示により、本開示のCSRを含む細胞が提供される。
本開示により、本開示のCSRをコードする核酸配列を含む細胞が提供される。
本開示により、本開示のCSRをコードする核酸配列を含むベクターを含む細胞が提供される。
本開示により、本開示のCSRをコードする核酸配列を含むトランスポゾンを含む細胞が提供される。
本開示により、本開示のCSRを含む組成物が提供される。
本開示により、本開示のCSRをコードする核酸配列を含む組成物が提供される。
本開示により、本開示のCSRをコードする核酸配列を含むベクターを含む組成物が提供される。
本開示により、本開示のCSRをコードする核酸配列を含むトランスポゾンを含む組成物が提供される。
本開示により、本開示の細胞（本開示のCSRをコードする配列を含む細胞、および／または本開示のCSRを発現する細胞が含まれる）を含む組成物が提供される。本開示により、本開示の複数の細胞（本開示のCSRをコードする配列を含む細胞、および／または本開示のCSRを発現する細胞が含まれる）を含む組成物が提供される。
本開示により、（a）本開示のCSRをコードする配列と（b）誘導性アポトーシス促進ポリペプチドをコードする配列を含む改変された細胞が提供され、この細胞はT細胞である。
本開示により、（a）本開示のCSRをコードする配列と（b）誘導性アポトーシス促進ポリペプチドをコードする配列を含む改変された細胞が提供される。本開示の改変された細胞のいくつかの実施態様では、改変された細胞は、天然に存在しない抗原受容体をコードする配列、および／または治療用ポリペプチドをコードする配列をさらに含んでいる。
本開示の改変された細胞のいくつかの実施態様では、改変された細胞が、天然に存在しない抗原受容体をコードする配列を含む実施態様を含め、天然に存在しない抗原受容体は、キメラ抗原受容体（CAR）を含んでいる。いくつかの実施態様では、CARは、（a）抗原認識領域を含むエクトドメインと、（b）膜貫通ドメインと、（c）少なくとも1つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、CARの（a）のエクトドメインは、シグナルペプチドをさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、CARの（a）のエクトドメインは、抗原認識領域と膜貫通ドメインの間にヒンジをさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、エンドドメインは、ヒトCD3ζエンドドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、少なくとも1つの共刺激ドメインは、ヒトの4-1BB細胞内セグメント、CD28細胞内セグメント、CD40細胞内セグメント、ICOS細胞内セグメント、MyD88細胞内セグメント、OX-40細胞内セグメントのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせを含んでいる。いくつかの実施態様では、少なくとも1つの共刺激ドメインは、ヒトのCD28共刺激ドメインおよび／または4-1BB共刺激ドメインを含んでいる。
本開示の改変された細胞のいくつかの実施態様では、トランスポゾン、またはベクター、またはドナー配列、またはドナープラスミドは、CSRをコードする配列、および／または誘導性アポトーシス促進ポリペプチドをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、トランスポゾン、またはベクター、またはドナー配列、またはドナープラスミドは、天然に存在しない抗原受容体をコードする配列、または治療用タンパク質をコードする配列をさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、トランスポゾン、またはベクター、またはドナー配列、またはドナープラスミドは、選択マーカーをコードする配列をさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、トランスポゾンは、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンである。
本開示の改変された細胞のいくつかの実施態様では、CSRをコードする配列は細胞の中で一過性に発現し、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドをコードする配列は細胞の中で安定に発現する。いくつかの実施態様では、天然に存在しない抗原受容体をコードする配列、または治療用タンパク質をコードする配列は、細胞の中で安定に発現する。いくつかの実施態様では、第1のトランスポゾン、または第1のベクター、または第1のドナー配列、または第1のドナープラスミドは、CSRをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、第2のトランスポゾン、または第2のベクター、または第2のドナー配列、または第2のドナープラスミドは、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドをコードする配列、天然に存在しない抗原受容体をコードする配列、治療用タンパク質をコードする配列のうちの1つ以上を含んでいる。いくつかの実施態様では、第1のトランスポゾン、または第1のベクター、または第1のドナー配列、または第1のドナープラスミドは、第1の選択マーカーをコードする配列をさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、第2のトランスポゾン、または第2のベクター、または第2のドナー配列、または第2のドナープラスミドは、第2の選択マーカーをコードする配列をさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、第1の選択マーカーと第2の選択マーカーは同じでない。
本開示の改変された細胞のいくつかの実施態様では、選択マーカーは細胞表面マーカーである。いくつかの実施態様では、細胞表面マーカーは、細胞がこのマーカーまたは検出可能なタグによって分類されるときに細胞同士を識別する。いくつかの実施態様では、検出可能なタグは蛍光タグまたは磁性タグである。
本開示の改変された細胞のいくつかの実施態様では、選択マーカーは、分裂している細胞の中で活性だが分裂していない細胞の中では活性でないタンパク質を含んでいる。いくつかの実施態様では、選択マーカーは代謝マーカーを含んでいる。いくつかの実施態様では、選択マーカーは、ジヒドロ葉酸（DHFR）突然変異酵素を含んでいる。いくつかの実施態様では、DHFR突然変異酵素は、
1 MVGSLNCIVA VSQNMGIGKN GDFPWPPLRN ESRYFQRMTT TSSVEGKQNL
61 VIMGKKTWFS IPEKNRPLKG RINLVLSREL KEPPQGAHFL SRSLDDALKL
121 TEQPELANKV DMVWIVGGSS VYKEAMNHPG HLKLFVTRIM QDFESDTFFP
181 EIDLEKYKLL PEYPGVLSDV QEEKGIKYKF EVYEKND（配列番号17012）のアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなる。いくつかの実施態様では、DHFR突然変異酵素のアミノ酸配列は、80位、113位、153位のうちの1つ以上に変異をさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、DHFR突然変異酵素のアミノ酸配列は、80位におけるフェニルアラニン（F）またはロイシン（L）の置換、113位におけるロイシン（L）またはバリン（V）の置換、153位におけるバリン（V）またはアスパラギン酸（D）の置換のうちの1つ以上を含んでいる。
キメラ刺激受容体（CSR）
本開示により、標準的な活性化／刺激試薬（アゴニスト抗CD3 mAbが含まれる）を用いて刺激したとき、CD3z一次刺激をT細胞（に、したがって内在性CD3ζ）に送達するキメラ刺激受容体（CSR）が提供される。
本開示のキメラ刺激受容体（CSR）はCD3ζ刺激を提供してT細胞の活性化と増殖を増強する。いくつかの実施態様では、本開示のCSRは、細胞外のアゴニストmAbエピトープと、細胞内のCD3ζ刺激ドメインを含み、機能的には、CSRを発現するように改変された同種他家T細胞において、表面での抗CD28または抗CD2の結合イベントをCD3zシグナル伝達イベントに変換する。いくつかの実施態様では、CSRは、野生型のCD28タンパク質またはCD2タンパク質と、CD3z細胞内刺激ドメインを含んでいて、CD28z CSRとCD2z CSRをそれぞれ生成させる。好ましい実施態様では、CD28z CSRおよび／またはCD2z CSRは、天然に存在しない抗原受容体および／または治療用タンパク質をさらに発現する。好ましい実施態様では、天然に存在しない抗原受容体はキメラ抗原受容体を含んでいる。
いくつかの実施態様では、CD28z CSRは、MLRLLLALNLFPSIQVTGNKILVKQSPMLVAYDNAVNLSCKYSYNLFSREFRASLHKGLDSAVEVCVVYGNYSQQLQVYSKTGFNCDGKLGNESVTFYLQNLYVNQTDIYFCKIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号17910）を含むアミノ酸配列によってコードされている。
いくつかの実施態様では、CD28z CSRは、atgctgagactgctgctggccctgaatctgttccccagcatccaagtgaccggcaacaagatcctggtcaagcagagccctatgctggtggcctacgacaacgccgtgaacctgagctgcaagtacagctacaacctgttcagcagagagttccgggccagcctgcacaaaggactggattctgctgtggaagtgtgcgtggtgtacggcaactacagccagcagctgcaggtctacagcaagaccggcttcaactgcgacggcaagctgggcaatgagagcgtgaccttctacctgcaaaacctgtacgtgaaccagaccgacatctatttctgcaagatcgaagtgatgtacccgcctccttacctggacaacgagaagtccaacggcaccatcatccacgtgaagggcaagcacctgtgtccttctccactgttccccggacctagcaagcctttctgggtgctcgttgttgttggcggcgtgctggcctgttatagcctgctggttacagtggccttcatcatcttttgggtccgaagcaagcggagccggctgctgcacagcgactacatgaacatgacccctagacggcccggaccaaccagaaagcactaccagccttacgctcctcctagagacttcgccgcctaccggtccagagtgaagttctccagatccgccgatgctcccgcctataagcagggccagaaccagctgtacaacgagctgaacctggggagaagagaagagtacgatgtgctggacaagcggagaggcagagatcctgagatgggcggcaagcccagacggaagaatcctcaagagggcctgtacaatgaactgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggaatgaagggcgagcgcagaagaggcaagggacacgatggactgtaccagggcctgagcaccgccaccaaggatacctatgatgccctgcacatgcaggccctgcctccaaga（配列番号17911）を含む核酸配列によってコードされている。
いくつかの実施態様では、CD2z CSRは、MSFPCKFVASFLLIFNVSSKGAVSKEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIYDTKGKNVLEKIFDLKIQERVSKPKISWTCINTTLTCEVMNGTDPELNLYQDGKHLKLSQRVITHKWTTSLSAKFKCTAGNKVSKESSVEPVSCPEKGLDIYLIIGICGGGSLLMVFVALLVFYITKRKKQRSRRNDEELETRAHRVATEERGRKPHQIPASTPQNPATSQHPPPPPGHRSQAPSHRPPPPGHRVQHQPQKRPPAPSGTQVHQQKGPPLPRPRVQPKPPHGAAENSLSPSSNRVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号17912）を含むアミノ酸配列によってコードされている。
いくつかの実施態様では、CD2z CSRは、atgagcttcccttgcaagttcgtggccagcttcctgctgatcttcaacgtgtcctctaagggcgccgtgtccaaagagatcacaaacgccctggaaacctggggagccctcggccaggatattaacctggacatccccagcttccagatgagcgacgacatcgatgacatcaagtgggagaaaaccagcgacaagaagaagatcgcccagttccggaaagagaaagagacattcaaagagaaggacacctacaagctgttcaagaacggcaccctgaagatcaagcacctgaaaaccgacgaccaggacatctataaggtgtccatctacgacaccaagggcaagaacgtgctggaaaagatcttcgacctcaagatccaagagcgggtgtccaagcctaagatcagctggacctgcatcaacaccacactgacctgcgaagtgatgaacggcacagaccccgagctgaacctgtaccaggatggcaaacacctgaagctgagccagcgcgtgatcacccacaagtggacaacaagcctgagcgccaagttcaagtgcaccgccggaaacaaagtgtctaaagagtccagcgtcgagcccgtgtcttgccctgaaaaaggactggacatctacctgatcatcggcatctgtggcggcggaagcctgctgatggtgtttgtggctctgctggtgttctacatcaccaagcggaagaagcagcggagcagacggaacgacgaggaactggaaacacgggcccatagagtggccaccgaggaaagaggcagaaagccccaccagattccagccagcacaccccagaatcctgccacctctcaacaccctccacctccacctggacacagatctcaggccccatctcacagacctccaccacctggtcatcgggtgcagcaccagcctcagaaaagacctcctgctcctagcggcacacaggtgcaccagcaaaaaggacctccactgcctcggcctagagtgcagcctaaacctcctcatggcgccgctgagaacagcctgtctccaagcagcaacagagtgaagttcagccgcagcgccgatgctcctgcctataagcagggacagaaccagctgtacaacgagctgaatctggggcgcagagaagagtacgatgtgctggacaagcggagaggcagagatcctgagatgggcggcaagcccagacggaagaatcctcaagagggcctgtataatgagctgcagaaagacaagatggccgaggcctacagcgagatcggaatgaagggcgagcgcagaagaggcaagggacacgatggactgtatcagggcctgagcaccgccaccaaggatacctatgatgccctgcacatgcaggccctgcctccaaga（配列番号17913）を含む核酸配列によってコードされている。
本開示のCSRを含む／発現する本開示の改変されたT細胞は、本開示のCSRを含まない／発現しない細胞と比べてT細胞の増殖を改善する。
免疫細胞と免疫前駆細胞
いくつかの実施態様では、本開示の免疫細胞は、リンパ球前駆細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、Tリンパ球（T細胞）、幹記憶T細胞（Tscm細胞）、セントラル記憶T細胞（Tcm）、幹細胞様T細胞、Bリンパ球（B細胞）、骨髄前駆細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、マクロファージ、血小板、赤血球、赤血球細胞（RBC）、巨核球、破骨細胞のいずれかを含んでいる。
いくつかの実施態様では、免疫前駆細胞は、1つ以上のタイプの免疫細胞に分化することのできる任意の細胞を含んでいる。いくつかの実施態様では、免疫前駆細胞は、自己複製して免疫細胞へと発達することのできる多能性幹細胞を含んでいる。いくつかの実施態様では、免疫前駆細胞は、造血幹細胞（HSC）またはその子孫を含んでいる。いくつかの実施態様では、免疫前駆細胞は、免疫細胞へと発達することのできる前駆細胞を含んでいる。いくつかの実施態様では、免疫前駆細胞は造血前駆細胞（HPC）を含んでいる。
造血幹細胞（HSC）
造血幹細胞（HSC）は、多能性の自己複製細胞である。リンパ球系列と骨髄細胞系列から分化したあらゆる血液細胞はHSCから生じる。HSCは、成体の骨髄、末梢血、動員された末梢血、腹膜透析排液、臍帯血に見いだすことができる。
本開示のHSCは、初代幹細胞または培養された幹細胞から単離すること、またはこれら幹細胞に由来することができる。本開示のHSCは、胚性幹細胞、多能性幹細胞、複能性幹細胞、生体幹細胞、人工多能性幹細胞（iPSC）のいずれかから単離すること、またはこれら細胞に由来することができる。
本開示の免疫前駆細胞は、HSCまたはHSC子孫細胞を含むことができる。本開示の代表的なHSC子孫細胞の非限定的な例に含まれるのは、多能性幹細胞、リンパ球前駆細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、Tリンパ球（T細胞）、Bリンパ球（B細胞）、骨髄前駆細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、マクロファージである。
本開示の方法によって生成したHSCは、成体幹細胞から単離されるか成体幹細胞から導出されている間、そして単一の細胞系列にコミットしている間、胚性幹細胞の特徴を共有する「原始的な」幹細胞の特徴を保持することができる。例えば本開示の方法によって生成した「原始的な」HSCは、分化後にその「幹性」を保持していて分化しない。その結果、養子細胞療法として、本開示の方法によって生成した「原始的な」HSCは、その数を補充するだけでなく、生体内で増殖もする。本開示の方法によって生成した「原始的な」HSCは、単一用量として投与されたときに治療に有効である可能性がある。いくつかの実施態様では、本開示の原始的HSCはCD34+である。いくつかの実施態様では、本開示の原始的HSCは、CD34+とCD38-である。いくつかの実施態様では、本開示の原始的HSCは、CD34+とCD38-とCD90+である。いくつかの実施態様では、本開示の原始的HSCは、CD34+とCD38-とCD90+とCD45RA-である。いくつかの実施態様では、本開示の原始的HSCは、CD34+とCD38-とCD90+とCD45RA-とCD49f+である。いくつかの実施態様では、本開示の原始的HSCは、CD34+とCD38-とCD90+とCD45RA-とCD49f+である。
本開示のいくつかの実施態様では、原始的HSC、および／またHSC、および／またはHSC子孫細胞を本開示の方法に従って改変して外来配列（例えばキメラ抗原受容体または治療用タンパク質）を発現させることができる。本開示のいくつかの実施態様では、改変された原始的HSC、および／または改変されたHSC、および／または改変されたHSC子孫細胞をさらに分化させて改変された免疫細胞を生成させることができる。改変された免疫細胞の非限定的な例に含まれるのは、本開示の改変されたT細胞、および／または改変されたナチュラルキラー細胞、および／または改変されたB細胞である。
T細胞
本開示の改変されたT細胞として、改変された造血幹細胞と前駆細胞（HSPC）、または改変されたHSCに由来するものが可能である。
伝統的な生物製剤および化学療法剤とは異なり、本開示の改変されたT細胞は、抗原を認識すると迅速に複製する能力を有することにより、治療を繰り返す必要性を回避できる可能性がある。それを実現するため、いくつかの実施態様では、本開示の改変されたT細胞は、初期応答を駆動するだけでなく、患者の体内で、可能性のある再発を阻止する生存可能な記憶T細胞の安定な集団として生き残りもする。あるいはいくつかの実施態様では、望まない場合には、本開示の改変されたT細胞は患者の体内で生き残らない。
抗原とは独立な（持続性）シグナル伝達を通じたT細胞の疲弊を引き起こすことがない抗原受容体分子と、初期記憶T細胞（特に幹細胞記憶T細胞（TSCM）または幹細胞様T細胞）を含む改変されたT細胞産物の開発に集中的に取り組まれてきた。本開示の幹細胞様改変T細胞は、セントラル記憶（TCM）T細胞またはTCM様細胞、エフェクタ記憶T細胞（TEM）、エフェクタT細胞（TE）を誘導するにあたって最大の自己複製能力と多能性能力を示すことで、腫瘍根絶と、改変されたT細胞の長期にわたる移植がよりよくなされる。ナイーブT細胞（TN）＞TSCM＞TCM＞TEM＞TE＞TTEという分化の直線的経路が、これら細胞を生成させるのに責任がある可能性がある。そうなっていることで、TNはTSCMを直接生成させる親前駆細胞であり、それが今度はTCMを直接生成させ、以下同様である。本開示のT細胞の組成物は、TSCM細胞が最も豊富な各親T細胞サブセットの1つ以上を含むことができる（例えばTSCM＞TCM＞TEM＞TE＞TTE）。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、免疫細胞前駆体が分化し、初期記憶T細胞、幹細胞様T細胞、ナイーブT細胞（TN）、TSCM、TCM、TEM、TE、TTEのいずれかになるか、なることができる。いくつかの実施態様では、免疫細胞前駆体は、本開示の原始的HSC、HSC、HSC子孫細胞のいずれかである。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、免疫細胞は、初期記憶T細胞、幹細胞様T細胞、ナイーブT細胞（TN）、TSCM、TCM、TEM、TE、TTEのいずれかである。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、免疫細胞は初期記憶T細胞である。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、免疫細胞は幹細胞様T細胞である。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、免疫細胞はTSCMである。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、免疫細胞はTCMである。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、方法は、複数のT細胞を改変する、および／または方法は、複数の改変されたT細胞を生成させることで、これら複数の改変されたT細胞の少なくとも2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの数値の間の任意の割合が、初期記憶T細胞の1つ以上の細胞表面マーカーを発現する。いくつかの実施態様では、複数の改変された初期記憶T細胞は、少なくとも1つの改変された幹細胞様T細胞を含んでいる。いくつかの実施態様では、複数の改変された初期記憶T細胞は、少なくとも1つの改変されたTSCMを含んでいる。いくつかの実施態様では、複数の改変された初期記憶T細胞は、少なくとも1つの改変されたTCMを含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、方法は、複数のT細胞を改変する、および／または方法は、複数の改変されたT細胞を生成させることで、これら複数の改変されたT細胞の少なくとも2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの数値の間の任意の割合が、幹細胞様T細胞の1つ以上の細胞表面マーカーを発現する。いくつかの実施態様では、複数の改変された幹細胞様T細胞は、少なくとも1つの改変されたTSCMを含んでいる。いくつかの実施態様では、複数の改変された幹細胞様T細胞は、少なくとも1つの改変されたTCMを含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、方法は、複数のT細胞を改変する、および／または方法は、複数の改変されたT細胞を生成させることで、これら複数の改変されたT細胞の少なくとも2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの数値の間の任意の割合が、幹記憶T細胞（TSCM）の1つ以上の細胞表面マーカーを発現する。いくつかの実施態様では、細胞表面マーカーは、CD62LとCD45RAを含んでいる。いくつかの実施態様では、細胞表面マーカーは、CD62L、CD45RA、CD28、CCR7、CD127、CD45RO、CD95、CD95、IL-2Rβのうちの1つ以上を含んでいる。いくつかの実施態様では、細胞表面マーカーは、CD45RA、CD95、IL-2Rβ、CCR7、CD62Lのうちの1つ以上を含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、方法は、複数のT細胞を改変する、および／または方法は、複数の改変されたT細胞を生成させることで、これら複数の改変されたT細胞の少なくとも2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの数値の間の任意の割合が、セントラル記憶T細胞（TCM）の1つ以上の細胞表面マーカーを発現する。いくつかの実施態様では、細胞表面マーカーは、CD45RO、CD95、IL-2Rβ、CCR7、CD62Lのうちの1つ以上を含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、方法は、複数のT細胞を改変する、および／または方法は、複数の改変されたT細胞を生成させることで、これら複数の改変されたT細胞の少なくとも2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの数値の間の任意の割合が、ナイーブT細胞（TN）の1つ以上の細胞表面マーカーを発現する。いくつかの実施態様では、細胞表面マーカーは、CD45RA、CCR7、CD62Lのうちの1つ以上を含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、方法は、複数のT細胞を改変する、および／または方法は、複数の改変されたT細胞を生成させることで、これら複数の改変されたT細胞の少なくとも2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの数値の間の任意の割合が、エフェクタT細胞（改変されたTEFF）の1つ以上の細胞表面マーカーを発現する。いくつかの実施態様では、細胞表面マーカーは、CD45RA、CD95、IL-2Rβのうちの1つ以上を含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、方法は、複数のT細胞を改変する、および／または方法は、複数の改変されたT細胞を生成させることで、これら複数の改変されたT細胞の少なくとも2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの数値の間の任意の割合が、幹細胞様T細胞、または幹記憶T細胞（TSCM）、またはセントラル記憶T細胞（TCM）の1つ以上の細胞表面マーカーを発現する。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、バッファは、免疫細胞またはその前駆体を含んでいる。バッファは、免疫細胞またはその前駆体（T細胞が含まれる）の細胞生存率のレベルおよび／または幹様表現型を維持、または増強する。いくつかの実施態様では、バッファは、ヌクレオフェクション前の初代ヒトT細胞の細胞生存率のレベルおよび／または幹様表現型を維持、または増強する。いくつかの実施態様では、バッファは、ヌクレオフェクションの間の初代ヒトT細胞の細胞生存率のレベルおよび／または幹細胞様表現型を維持、または増強する。いくつかの実施態様では、バッファは、バッファは、ヌクレオフェクション後の初代ヒトT細胞の細胞生存率のレベルおよび／または幹様表現型を維持、または増強する。いくつかの実施態様では、バッファは、KCl、MgCl2、ClNa、グルコース、Ca(NO3)2のうちの1つ以上を任意の絶対量または相対量または濃度で含んでおり、場合によっては、バッファは、HEPES、トリス／HCl、リン酸塩バッファからなるグループから選択されたサプリメントをさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、バッファは、5 mMのKClと、15 mMのMgCl2と、90 mMのClNaと、10 mMのグルコースと、0.4 mMのCa(NO3)2を含んでいる。いくつかの実施態様では、バッファは、5 mMのKClと、15 mMのMgCl2と、90 mMのClNaと、10 mMのグルコースと、0.4 mMのCa(NO3)2を含んでいることに加え、20 mMのHEPESと75 mMのトリス／HClを含むサプリメントを含んでいる。いくつかの実施態様では、バッファは、5 mMのKCl、15 mMのMgCl2、90 mMのClNa、10 mMのグルコース、0.4 mMのCa(NO3)2を含んでいることに加え、40 mMのNa2HPO4/NaH2PO4（pH 7.2）を含むサプリメントを含んでいる。いくつかの実施態様では、初代T細胞を含む組成物は、100μlのバッファと、5×106～25×106個の細胞を含んでいる。いくつかの実施態様では、組成物は、導入工程の間、バッファまたは他の媒体1ミリリットル当たり、拡張された比率の250×106個の初代T細胞を含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、方法は、本開示の免疫細胞（本開示のT細胞を含む）とT細胞増殖組成物を接触させることを含んでいる。本開示の方法のいくつかの実施態様では、本開示のトランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼを本開示の免疫細胞に導入する工程は、免疫細胞とT細胞増殖組成物を接触させることをさらに含むことができる。いくつかの実施態様では、方法の導入工程が電気穿孔工程またはヌクレオフェクション工程を含む実施態様を含め、電気穿孔工程またはヌクレオフェクション工程は、本開示のT細胞増殖組成物と接触している免疫細胞を用いて実施することができる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、リンと；オクタン酸、パルミチン酸、リノレン酸、オレイン酸のうちの1つ以上と；ステロールと；アルカンを含むか、これらから主になるか、これらからなる。
本開示の改変されたT細胞を生成させる方法のいくつかの実施態様では、増殖サプリメントは、1つ以上のサイトカインを含んでいる。この1つ以上のサイトカインは、任意のサイトカインを含むことができ、その非限定的な例に含まれるのはリンホカインである。代表的なリンホカインの非限定的な例に含まれるのは、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-3（IL-3）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-5（IL-5）、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-15（IL-15）、インターロイキン-21（IL-21）、顆粒球-マクロファージコロニー-刺激因子（GM-CSF）、インターフェロン-γ（INFγ）である。この1つ以上のサイトカインは、IL-2を含むことができる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、ヒト血清アルブミン、組み換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、2-メルカプトエタノール、増殖サプリメントを含んでいる。この方法のいくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、オクタン酸、ニコチンアミド、2,4,7,9-テトラメチル-5-デシン-4,7-ジオール（TMDD）、アジピン酸ジイソプロピル（DIPA）、n-ブチル-ベンゼンスルホンアミド、1,2-ベンゼンジカルボン酸、ビス(2-メチルプロピル)エステル、パルミチン酸、リノレン酸、オレイン酸、ステアリン酸ヒドラジド、オレアミド、ステロール、アルカンのうちの1つ以上をさらに含んでいる。この方法のいくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、オクタン酸、パルミチン酸、リノレン酸、オレイン酸、ステロールのうちの1つ以上をさらに含んでいる。この方法のいくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、0.9 mg/kg～90 mg/kg（端点を含む）の濃度のオクタン酸；0.2 mg/kg～20 mg/kg（端点を含む）の濃度のパルミチン酸；0.2 mg/kg～20 mg/kg（端点を含む）の濃度のリノレン酸；0.2 mg/kg～20 mg/kg（端点を含む）の濃度のオレイン酸；0.1 mg/kg～10 mg/kg（端点を含む）の濃度のステロールのうちの1つ以上をさらに含んでいる。この方法のいくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、約9 mg/kgの濃度のオクタン酸、約2 mg/kgの濃度のパルミチン酸、約2 mg/kgの濃度のリノレン酸、約2 mg/kgの濃度のオレイン酸、約1 mg/kgの濃度のステロールのうちの1つ以上をさらに含んでいる。この方法のいくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、6.4マイクロモル/kg～640 マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のオクタン酸、0.7マイクロモル/kg～70マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のパルミチン酸、0.75マイクロモル/kg～75マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のリノレン酸、0.75マイクロモル/kg～75マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のオレイン酸、0.25マイクロモル/kg～25マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のステロールのうちの1つ以上をさらに含んでいる。この方法のいくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、約64マイクロモル/kgの濃度のオクタン酸、約7マイクロモル/kgの濃度のパルミチン酸、約7.5マイクロモル/kgの濃度のリノレン酸、約7.5マイクロモル/kgの濃度のオレイン酸、約2.5マイクロモル/kgの濃度のステロールのうちの1つ以上をさらに含んでいる。
いくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、複数の増殖された改変T細胞を生成させるため、ヒト血清アルブミン、組み換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、2-メルカプトエタノール、増殖サプリメントのうちの1つ以上を含んでいて、これら複数の改変T細胞の少なくとも2％が、初期記憶T細胞、および／または幹細胞様T細胞、および／または幹記憶T細胞（TSCM）、および／またはセントラル記憶T細胞（TCM）の1つ以上の細胞表面マーカーを発現する。いくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、オクタン酸、ニコチンアミド、2,4,7,9-テトラメチル-5-デシン-4,7-ジオール（TMDD）、アジピン酸ジイソプロピル（DIPA）、n-ブチル-ベンゼンスルホンアミド、1,2-ベンゼンジカルボン酸、ビス(2-メチルプロピル)エステル、パルミチン酸、リノレン酸、オレイン酸、ステアリン酸ヒドラジド、オレアミド、ステロール、アルカンのうちの1つ以上を含んでいるか、さらに含んでいる。いくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、オクタン酸、パルミチン酸、リノレン酸、オレイン酸、ステロール（例えばコレステロール）のうちの1つ以上を含んでいる。いくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、0.9 mg/kg～90 mg/kg（端点を含む）の濃度のオクタン酸、0.2 mg/kg～20 mg/kg（端点を含む）の濃度のパルミチン酸、0.2 mg/kg～20 mg/kg（端点を含む）の濃度のリノレン酸、0.2 mg/kg～20 mg/kg（端点を含む）の濃度のオレイン酸、0.1 mg/kg～10 mg/kg（端点を含む）の濃度のステロールのうちの1つ以上を含んでいる（mg/kg＝100万当たりの部）。いくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、約9 mg/kgの濃度のオクタン酸、約2 mg/kgの濃度のパルミチン酸、約2 mg/kgの濃度のリノレン酸、約2 mg/kgの濃度のオレイン酸、約1 mg/kgの濃度のステロールのうちの1つ以上を含んでいる（mg/kg＝100万当たりの部）。いくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、9.19 mg/kgの濃度のオクタン酸、1.86 mg/kgの濃度のパルミチン酸、約2.12 mg/kgの濃度のリノレン酸、約2.13 mg/kgの濃度のオレイン酸、約1.01 mg/kgの濃度のステロールのうちの1つ以上を含んでいる（mg/kg＝100万当たりの部）。いくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、9.19 mg/kgの濃度のオクタン酸、1.86 mg/kgの濃度のパルミチン酸、2.12 mg/kgの濃度のリノレン酸、約2.13 mg/kgの濃度のオレイン酸、1.01 mg/kgの濃度のステロールを含んでいる（mg/kg＝100万当たりの部）。いくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、6.4マイクロモル/kg～640 マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のオクタン酸、0.7マイクロモル/kg～70マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のパルミチン酸、0.75マイクロモル/kg～75マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のリノレン酸、0.75マイクロモル/kg～75マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のオレイン酸、0.25マイクロモル/kg～25マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のステロールのうちの1つ以上を含んでいる。いくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、約64マイクロモル/kgの濃度のオクタン酸、約7マイクロモル/kgの濃度のパルミチン酸、約7.5マイクロモル/kgの濃度のリノレン酸、約7.5マイクロモル/kgの濃度のオレイン酸、約2.5マイクロモル/kgの濃度のステロールのうちの1つ以上を含んでいる。いくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、約63.75マイクロモル/kgの濃度のオクタン酸、約7.27マイクロモル/kgの濃度のパルミチン酸、約7.57マイクロモル/kgの濃度のリノレン酸、約7.56マイクロモル/kgの濃度のオレイン酸、約2.61マイクロモル/kgの濃度のステロールのうちの1つ以上を含んでいる。いくつかの実施態様では、T細胞増殖組成物は、約63.75マイクロモル/kgの濃度のオクタン酸、約7.27マイクロモル/kgの濃度のパルミチン酸、約7.57マイクロモル/kgの濃度のリノレン酸、約7.56マイクロモル/kgの濃度のオレイン酸、約2.61マイクロモル/kgの濃度のステロールを含んでいる。
本明細書では、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、37℃のヒト血清アルブミン、組み換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、2-メルカプトエタノール、増殖サプリメントのうちの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる。その代わりに、またはそれに加えて、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、リン、オクタン脂肪酸、パルミチン脂肪酸、リノレン脂肪酸、オレイン酸のうちの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる。いくつかの実施態様では、培地は、例えばイスコーブ改変ダルベッコ培地（（IMDM）；ThermoFisher Scientific社でカタログ番号12440053として入手できる）に見いだすことのできるよりも10倍多い量のリンを含んでいる。
本明細書では、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、37℃のヒト血清アルブミン、組み換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、2-メルカプトエタノール、イスコーブのMDM、増殖サプリメントのうちの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる。その代わりに、またはそれに加えて、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、以下の元素、すなわちホウ素、ナトリウム、マグネシウム、リン、カリウム、カルシウムのうちの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる。いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、対応する平均濃度で存在する以下の元素、すなわち3.7 mg/lのホウ素、3000 mg/lのナトリウム、18 mg/lのマグネシウム、29 mg/lのリン、15 mg/lのカリウム、4 mg/lのカルシウムのうちの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる。
本明細書では、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、37℃のヒト血清アルブミン、組み換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、2-メルカプトエタノール、増殖サプリメントのうちの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる。その代わりに、またはそれに加えて、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、下記の成分のうちの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる：オクタン酸（CAS番号124-07-2）、ニコチンアミド（CAS No. 98-92-0）、2,4,7,9-テトラメチル-5-デシン-4,7-ジオール（TMDD）（CAS番号126-86-3）、アジピン酸ジイソプロピル（DIPA）（CAS番号6938-94-9）、n-ブチル-ベンゼンスルホンアミド（CAS番号3622-84-2）、1,2-ベンゼンジカルボン酸、ビス(2-メチルプロピル)エステル（CAS番号84-69-5）、パルミチン酸（CAS番号57-10-3）、リノレン酸（CAS番号60-33-3）、オレイン酸（CAS番号112-80-1）、ステアリン酸ヒドラジド（CAS番号4130-54-5）、オレアミド（CAS番号3322-62-1）、ステロール（例えばコレステロール）（CAS番号57-88-5）、アルカン（例えばノナデカン）（CAS番号629-92-5）。いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、下記の成分のうちの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる：オクタン酸（CAS番号124-07-2）、ニコチンアミド（CAS番号98-92-0）、2,4,7,9-テトラメチル-5-デシン-4,7-ジオール（TMDD）（CAS番号126-86-3）、アジピン酸ジイソプロピル（DIPA）（CAS番号6938-94-9）、n-ブチル-ベンゼンスルホンアミド（CAS番号3622-84-2）、1,2-ベンゼンジカルボン酸、ビス(2-メチルプロピル)エステル（CAS番号84-69-5）、パルミチン酸（CAS番号57-10-3）、リノレン酸（CAS番号60-33-3）、オレイン酸（CAS番号112-80-1）、ステアリン酸ヒドラジド（CAS番号4130-54-5）、オレアミド（CAS番号3322-62-1）、ステロール（例えばコレステロール）（CAS番号57-88-5）、アルカン（例えばノナデカン）（CAS番号629-92-5）、フェノールレッド（CAS番号143-74-8）。いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、下記の成分のうちの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる：オクタン酸（CAS番号124-07-2）、ニコチンアミド（CAS番号98-92-0）、2,4,7,9-テトラメチル-5-デシン-4,7-ジオール（TMDD）（CAS番号126-86-3）、アジピン酸ジイソプロピル（DIPA）（CAS番号6938-94-9）、n-ブチル-ベンゼンスルホンアミド（CAS番号3622-84-2）、1,2-ベンゼンジカルボン酸、ビス(2-メチルプロピル)エステル（CAS番号84-69-5）、パルミチン酸（CAS番号57-10-3）、リノレン酸（CAS番号60-33-3）、オレイン酸（CAS番号112-80-1）、ステアリン酸ヒドラジド（CAS番号4130-54-5）、オレアミド（CAS番号3322-62-1）、フェノールレッド（CAS番号143-74-8）、ラノリンアルコール。
いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、37℃のヒト血清アルブミン、組み換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、2-メルカプトエタノール、増殖サプリメントのうちの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる。その代わりに、またはそれに加えて、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、以下のイオン、すなわちナトリウムイオン、アンモニウムイオン、カリウムイオン、マグネシウムイオン、カルシウムイオン、塩化物イオン、硫酸塩イオン、リン酸塩イオンのうちの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる。
本明細書では、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、37℃のヒト血清アルブミン、組み換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、2-メルカプトエタノール、増殖サプリメントのうちの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる。その代わりに、またはそれに加えて、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、下記の遊離アミノ酸のうちの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる：ヒスチジン、アスパラギン、セリン、グルタミン、アルギニン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トレオニン、アラニン、プロリン、システイン、リシン、チロシン、メチオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、トリプトファン。いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、下記の遊離アミノ酸のうちの1つ以上を対応する平均モル％で含む培地と交換可能に用いることができる：ヒスチジン（約1％）、アスパラギン（約0.5％）、セリン（約1.5％）、グルタミン（約67％）、アルギニン（約1.5％）、グリシン（約1.5％）、アスパラギン酸（約1％）、グルタミン酸（約2％）、トレオニン（約2％）、アラニン（約1％）、プロリン（約1.5％）、システイン（約1.5％）、リシン（約3％）、チロシン（約1.5％）、メチオニン（約1％）、バリン（約3.5％）、イソロイシン（約3％）、ロイシン（約3.5％）、フェニルアラニン（約1.5％）、トリプトファン（約0.5％）。いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、下記の遊離アミノ酸のうちの1つ以上を対応する平均モル％で含む培地と交換可能に用いることができる：ヒスチジン（約0.78％）、アスパラギン（約0.4％）、セリン（約1.6％）、グルタミン（約67.01％）、アルギニン（約1.67％）、グリシン（約1.72％）、アスパラギン酸（約1.00％）、グルタミン酸（約1.93％）、トレオニン（約2.38％）、アラニン（約1.11％）、プロリン（約1.49％）、システイン（約1.65％）、リシン（約2.84％）、チロシン（約1.62％）、メチオニン（約0.85％）、バリン（約3.45％）、イソロイシン（約3.14％）、ロイシン（約3.3％）、フェニルアラニン（約1.64％）、トリプトファン（約0.37％）。
本明細書では、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、37℃のヒト血清アルブミン、組み換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、2-メルカプトエタノール、イスコーブのMDM、増殖サプリメントのうちの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる。その代わりに、またはそれに加えて、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、リン、オクタン脂肪酸、パルミチン脂肪酸、リノレン脂肪酸、オレイン酸のうちの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる。いくつかの実施態様では、培地は、例えばイスコーブの改変ダルベッコ培地（IMDM）（ThermoFisher Scientific社からカタログ番号12440053として入手できる）に見いだすことのできるよりも10倍多い量のリンを含んでいる。
いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、オクタン酸、パルミチン酸、リノレン酸、オレイン酸、ステロール（例えばコレステロール）のうちの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる。いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、0.9 mg/kg～90 mg/kg（端点を含む）の濃度のオクタン酸、0.2 mg/kg～20 mg/kg（端点を含む）の濃度のパルミチン酸、0.2 mg/kg～20 mg/kg（端点を含む）の濃度のリノレン酸、0.2 mg/kg～20 mg/kg（端点を含む）の濃度のオレイン酸、0.1 mg/kg～10 mg/kg（端点を含む）の濃度のステロールのうちの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる（mg/kg＝100万当たりの部）。いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、約9 mg/kgの濃度のオクタン酸、約2 mg/kgの濃度のパルミチン酸、約2 mg/kgの濃度のリノレン酸、約2 mg/kgの濃度のオレイン酸、約1 mg/kgの濃度のステロールのうちの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる（mg/kg＝100万当たりの部）。いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、9.19 mg/kgの濃度のオクタン酸、1.86 mg/kgの濃度のパルミチン酸、約2.12 mg/kgの濃度のリノレン酸、約2.13 mg/kgの濃度のオレイン酸、約1.01 mg/kgの濃度のステロールのうちの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる（mg/kg＝100万当たりの部）。いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、9.19 mg/kgの濃度のオクタン酸、1.86 mg/kgの濃度のパルミチン酸、2.12 mg/kgの濃度のリノレン酸、約2.13 mg/kgの濃度のオレイン酸、1.01 mg/kgの濃度のステロールのうちの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる（mg/kg＝100万当たりの部）。いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、6.4マイクロモル/kg～640 マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のオクタン酸；0.7マイクロモル/kg～70マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のパルミチン酸；0.75マイクロモル/kg～75マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のリノレン酸；0.75マイクロモル/kg～75マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のオレイン酸；0.25マイクロモル/kg～25マイクロモル/kg（端点を含む）の濃度のステロールのうちの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる。いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、約64マイクロモル/kgの濃度のオクタン酸、約7マイクロモル/kgの濃度のパルミチン酸、約7.5マイクロモル/kgの濃度のリノレン酸、約7.5マイクロモル/kgの濃度のオレイン酸、約2.5マイクロモル/kgの濃度のステロールのうちの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる。
いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、約63.75マイクロモル/kgの濃度のオクタン酸、約7.27マイクロモル/kgの濃度のパルミチン酸、約7.57マイクロモル/kgの濃度のリノレン酸、約7.56マイクロモル/kgの濃度のオレイン酸、約2.61マイクロモル/kgの濃度のステロールのうちの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる。いくつかの実施態様では、「補足されたT細胞増殖組成物」または「T細胞増殖組成物」という用語は、約63.75マイクロモル/kgの濃度のオクタン酸、約7.27マイクロモル/kgの濃度のパルミチン酸、約7.57マイクロモル/kgの濃度のリノレン酸、7.56マイクロモル/kgの濃度のオレイン酸、2.61マイクロモル/kgの濃度のステロールのうちの1つ以上を含む培地と交換可能に用いることができる。
本開示の改変されたT細胞（例えば幹細胞様T細胞、および／またはTSCM、および／またはTCM）を生成させる方法のいくつかの実施態様では、方法は、改変されたT細胞とP13K-Akt-mTOR経路の阻害剤を接触させることを含んでいる。本開示の改変されたT細胞（本開示の改変された幹細胞様T細胞、および／またはTSCM、および／またはTCMが含まれる）は、本開示の方法の中の任意の工程において、PI3K経路の構成要素の1つ以上の阻害剤を含む増殖培地とともにインキュベートすること、または培養すること、または増殖させること、または保管すること、または組み合わせることができる。PI3K経路の構成要素の代表的な阻害剤の非限定的な例に含まれるのは、GSK3βの阻害剤であるTWS119（GSK 3B阻害剤XIIとしても知られる；CAS番号601514-19-6であり、化学式C18H14N4O2を持つ）などである。PI3K経路の構成要素の代表的な阻害剤の非限定的な例に含まれるのは、bb007（BLUEBIRDBIO（商標））である。PI3K経路の構成要素の追加の代表的な阻害剤の非限定的な例に含まれるのは、アロステリックAkt阻害剤VIII（Akti-1/2とも呼ばれ、化合物番号 10196499を持つ）、ATP競合性阻害剤（プロテインキナーゼ B（Akt）のATP結合ポケットを標的とするオルソステリック阻害剤）、イソキノリン-5-スルホンアミド（H-8、H-89、NL-71-101）、アゼパン誘導体（(－)-バラノールに由来する一連の構造体）、アミノフラザン（GSK690693）、複素環（7-アザインドール、6-フェニルプリン誘導体、ピロロ[2,3-d]ピリミジン誘導体、CCT128930、3-アミノピロリジン、アニリノトリアゾール誘導体、スピロインドリン誘導体、AZD5363、イパタセルチブ（GDC-0068、RG7440）、A-674563、A-443654）、フェニルピラゾール誘導体（AT7867、AT13148）、チオフェンカルボキサミド誘導体（アフレセルチブ（GSK2110183）、2-ピリミジル-5-アミドチオフェン誘導体（DC120）、ウプロセルチブ（GSK2141795））、アロステリック阻害剤（オルソステリック阻害剤よりも優れていて、より大きな特異性、副作用の減少、より少ない毒性を提供する）、2,3-ジフェニルキノキサリン類似体（2,3-ジフェニルキノキサリン誘導体、トリアゾロ[3,4-f][1,6]ナフチリジン-3(2H)-オン誘導体（MK-2206））、アルキルリン脂質（エデルホシン (1-O-オクタデシル-2-O-メチル-rac-グリセロ-3-ホスホコリン、ET-18-OCH3）、イルモホシン（BM 41.440）、ミルテホシン（ヘキサデシルホスホコリン、HePC）、ペリホシン（D-21266）、エルシルホスホコリン（ErPC）、エルホシン（ErPC3、エルシルホスホホモコリン）、インドール-3-カルビノール類似体（インドール-3-カルビノール、3-クロロアセチルインドール、ジインドリルメタン、6-メトキシ-5,7-ジヒドロインドロ[2,3-b]カルバゾール-2,10-ジカルボン酸ジエチル（SR13668）、OSU-A9）、スルホンアミド誘導体（PH-316とPHT-427）、チオウレア誘導体（PIT-1、PIT-2、DM-PIT-1、N-[(1-メチル-1H-ピラゾル-4-イル)カルボニル]-N'-(3-ブロモフェニルブロモフェニル)-チオウレア）、プリン誘導体（トリシリビン（TCN、NSC 154020）、トリシリビン一リン酸活性類似体（TCN-P）、4-アミノ-ピリド[2,3-d]ピリミジン誘導体API-1、3-フェニル-3H-イミダゾ[4,5-b]ピリジン誘導体、ARQ 092）、BAY 1125976、3-メチル-キサンチン、キノリン-4-カルボキサミドと2-[4-(シクロヘキサ-1,3-ジエン-1-イル)-1H-ピラゾル-3-イル]フェノール、3-オキソ-ティルカル（tirucallic）酸、3α-アセトキシ-ティルカル酸と3β-アセトキシ-ティルカル酸、アセトキシ-ティルカル酸、不可逆的阻害剤（抗生物質、ラクトキノマイシン、フレノリシンB、カラフンギン、メデルマイシン、Boc-Phe-ビニルケトン、4-ヒドロキシノネナール（4-HNE）、1,6-ナフチリジノン誘導体、イミダゾ-1,2-ピリジン誘導体）である。
本開示の改変されたT細胞（例えば幹細胞様T細胞、および／またはTSCM、および／またはTCM）を生成させる方法のいくつかの実施態様では、方法は、改変されたT細胞と、T細胞エフェクタ分化の阻害剤を接触させることを含んでいる。T細胞エフェクタ分化の代表的な阻害剤の非限定的な例に含まれるのは、BET阻害剤（例えばJQ1というヒエノトリアゾロジアゼピン）および／またはBETファミリーのタンパク質（例えばBRD2、BRD3、BRD4、BRDT）の阻害剤である。
本開示の改変されたT細胞（例えば幹細胞様T細胞、および／またはTSCM、および／またはTCM）を生成させる方法のいくつかの実施態様では、方法は、改変されたT細胞と、核-細胞質アセチル-CoAを減少させる薬剤を接触させることを含んでいる。核-細胞質アセチル-CoAを減少させる薬剤の非限定的な例に含まれるのは、2-ヒドロキシ-クエン酸塩（2-HC）と、Acss1の発現を増大させる薬剤である。
本開示の改変されたT細胞（例えば幹細胞様T細胞、および／またはTSCM、および／またはTCM）を生成させる方法のいくつかの実施態様では、方法は、改変されたT細胞と、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）阻害剤を含む組成物を接触させることを含んでいる。いくつかの実施態様では、HDAC阻害剤を含む組成物は、バルプロ酸、フェニル酪酸ナトリウム（NaPB）のいずれか、またはこれらの組み合わせを含むか、これらからなる。いくつかの実施態様では、HDAC阻害剤を含む組成物は、バルプロ酸を含むか、バルプロ酸からなる。いくつかの実施態様では、HDAC阻害剤を含む組成物は、フェニル酪酸ナトリウム（NaPB）を含むか、NaPBからなる。
本開示の改変されたT細胞（例えば幹細胞様T細胞、および／またはTSCM、および／またはTCM）を生成させる方法のいくつかの実施態様では、活性化サプリメントは、1つ以上のサイトカインを含むことができる。この1つ以上のサイトカインは、任意のサイトカインを含むことができ、その非限定的な例に含まれるのはリンホカインである。代表的なリンホカインの非限定的な例に含まれるのは、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-3（IL-3）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-5（IL-5）、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-15（IL-15）、インターロイキン-21（IL-21）、顆粒球-マクロファージコロニー-刺激因子（GM-CSF）、インターフェロン-γ（INFγ）である。この1つ以上のサイトカインは、IL-2を含むことができる。
本開示の改変されたT細胞（例えば幹細胞様T細胞、および／またはTSCM、および／またはTCM）を生成させる方法のいくつかの実施態様では、活性化サプリメントは、1つ以上のアクチベータ複合体を含むことができる。アクチベータ複合体の非限定的な代表例は、CD3、CD28、CD2のうちの1つ以上に結合する単量体抗体複合体、または二量体抗体複合体、または三量体抗体複合体、または四量体抗体複合体を含むことができる。いくつかの実施態様では、活性化サプリメントは、ヒト抗体、ヒト化抗体、組み換え抗体、キメラ抗体のいずれかを含むアクチベータ複合体を含むか、このアクチベータ複合体からなる。いくつかの実施態様では、活性化サプリメントは、CD3とCD28に結合するアクチベータ複合体を含むか、このアクチベータ複合体からなる。いくつかの実施態様では、活性化サプリメントは、CD3とCD28とCD2に結合するアクチベータ複合体を含むか、このアクチベータ複合体からなる。
ナチュラルキラー（NK）細胞
いくつかの実施態様では、本開示の改変された免疫細胞または免疫前駆細胞は、ナチュラルキラー（NK）細胞である。いくつかの実施態様では、NK細胞は、リンパ球前駆細胞から分化する細胞傷害性リンパ球である。
本開示の改変されたNK細胞は、改変された造血幹細胞・前駆細胞（HSPC）、または改変されたHSCに由来するものが可能である。
いくつかの実施態様では、非活性化NK細胞は、（CD14/CD19/CD56+細胞を含む）CD3枯渇白血球除去に由来する
いくつかの実施態様では、NK細胞は、Lonza 4DヌクレオフェクタまたはBTX ECM 830（500V、700マイクロ秒のパルス長、0.2 mmの電極ギャップ、1パルス）を用いて電気穿孔される。すべてのLonza 4Dヌクレオフェクタプログラムが、本開示の方法の範囲に入るとして考慮される。
いくつかの実施態様では、電気穿孔ごとにキュベット内の100μlのP3バッファの中で5×106個の細胞を電気穿孔した。しかし体積当たりの細胞のこの比率は、市場の製造方法のスケールに拡張することができる。
いくつかの実施態様では、NK細胞は、追加の細胞系とともに培養することによって刺激した。いくつかの実施態様では、追加の細胞系は、人工抗原提示細胞（aAPC）を含んでいる。いくつかの実施態様では、刺激は、電気穿孔の1日後、2日後、3日後、4日後、5日後、6日後、7日後のいずれかになされる。いくつかの実施態様では、刺激は、電気穿孔の2日後になされる。
いくつかの実施態様では、NK細胞はCD56を発現する。
B細胞
いくつかの実施態様では、本開示の改変された免疫細胞または免疫前駆細胞は、B細胞である。B細胞は、細胞表面にB細胞受容体を発現するタイプのリンパ球である。B細胞受容体は特定の抗原に結合する。
本開示の改変されたB細胞は、改変された造血幹細胞・前駆細胞（HSPC）、または改変されたHSCに由来するものが可能である。
いくつかの実施態様では、HSPCは本開示の方法を利用して改変された後、ヒトのIL-3、Flt3L、TPO、SCF、G-CSFの存在下で、少なくとも3日間、または少なくとも4日間、または少なくとも5日間、または少なくとも6日間、または少なくとも7日間にわたってB細胞への分化を開始する。いくつかの実施態様では、HSPCは本開示の方法を利用して改変された後、ヒトのIL-3、Flt3L、TPO、SCF、G-CSFの存在下で5日間にわたってB細胞への分化を開始する。
いくつかの実施態様では、プライミングの後、改変されたHPSC細胞はフィーダ細胞の層に移され、2週間ごとに供給されるとともに、週に1回、新鮮なフィーダ層に移される。いくつかの実施態様では、フィーダ細胞はMS-5フィーダ細胞である。
いくつかの実施態様では、改変されたHPSC細胞をMS-5フィーダ細胞とともに少なくとも7日間、または14日間、または21日間、または28日間、または30日間、または33日間、または35日間、または42日間、または48日間にわたって培養する。いくつかの実施態様では、改変されたHPSC細胞をMS-5フィーダ細胞とともに33日間にわたって培養した。

転移系（トランスポジションシステム）
本開示の代表的なトランスポゾン／トランスポザーゼ系の非限定的な例に含まれるのは、piggyBacトランスポゾンとpiggyBacトランスポザーゼ、piggyBac様トランスポゾンとpiggyBac様トランスポザーゼ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ ＢｅａｕｔｙトランスポゾンとＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ、HelraiserトランスポゾンとHelraiserトランスポザーゼ、Tol2トランスポゾンとTol2トランスポザーゼである。
piggyBacトランスポザーゼは、トランスポゾンの両端にあるトランスポゾン特異的逆方向末端反復配列（ITR）を認識し、これらITRの間にある内容をTTAA染色体部位の中に移動させる。piggyBacトランスポゾン系は、これらITRの間に含めることのできる興味ある遺伝子に関するペイロードの制限がない。いくつかの実施態様では、特にトランスポゾンがpiggyBacトランスポゾンである実施態様では、トランスポザーゼは、piggyBac（商標）トランスポザーゼまたはSuper piggyBac（商標）（SPB）トランスポザーゼである。いくつかの実施態様では、特にトランスポザーゼがSuper piggyBac（商標）（SPB）トランスポザーゼである実施態様では、トランスポザーゼをコードする配列はmRNA配列である。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素はPiggyBac（商標）（PB）トランスポザーゼ酵素である。piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14487）と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの数値の間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることができる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、配列：
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14487）の30位、165位、282位、538位のうちの1つ以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなるpiggyBac（商標）（PB）トランスポザーゼ酵素である。
いくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の配列の30位、165位、282位、538位のうちの1つ以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなるpiggyBac（商標）（PB）トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の配列の30位、165位、282位、538位のうちの3つ以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなるpiggyBac（商標）（PB）トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の配列の30位、165位、282位、538位のそれぞれにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなるpiggyBac（商標）（PB）トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、配列番号14487の配列の30位のアミノ酸置換は、イソロイシン（I）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487の配列の165位のアミノ酸置換は、グリシン（G）からセリン（S）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487の配列の282位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487の配列の538位のアミノ酸置換は、アスパラギン（N）からリシン（K）への置換である。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素はSuper piggyBac（商標）（SPB）トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、本開示のSuper piggyBac（商標）（SPB）トランスポザーゼ酵素は、30位のアミノ酸置換がイソロイシン（I）からバリン（V）への置換であり、165位のアミノ酸置換がグリシン（G）からセリン（S）への置換であり、282位の置換がメチオニン（M）からバリン（V）への置換であり、538位のアミノ酸置換がアスパラギン（N）からリシン（K）への置換である配列番号14487のアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることが可能である。いくつかの実施態様では、Super piggyBac（商標）（SPB）トランスポザーゼ酵素は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14484）と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの数値の間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることができる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼが30位、および／または165位、および／または282位、および／または538位に上記の変異を含む実施態様を含め、piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素またはSuper piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487または配列番号14484の3位、46位、82位、103位、119位、125位、177位、180位、185位、187位、200位、207位、209位、226位、235位、240位、241位、243位、258位、296位、298位、311位、315位、319位、327位、328位、340位、421位、436位、456位、470位、486位、503位、552位、570位、591位のうちの1つ以上にアミノ酸置換をさらに含むことができる。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼが30位、および／または165位、および／または282位、および／または538位に上記の変異を含む実施態様を含め、piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素またはSuper piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487または配列番号14484の46位、119位、125位、177位、180位、185位、187位、200位、207位、209位、226位、235位、240位、241位、243位、296位、298位、311位、315位、319位、327位、328位、340位、421位、436位、456位、470位、485位、503位、552位、570位のうちの1つ以上にアミノ酸置換をさらに含むことができる。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の3位のアミノ酸置換は、セリン（S）からアスパラギン（N）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の46位のアミノ酸置換は、アラニン（A）からセリン（S）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の46位のアミノ酸置換は、アラニン（A）からトレオニン（T）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の82位のアミノ酸置換は、イソロイシン（I）からトリプトファン（W）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の103位のアミノ酸置換は、セリン（S）からプロリン（P）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の119位のアミノ酸置換は、アルギニン（R）からプロリン（P）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の125位のアミノ酸置換は、システイン（C）からアラニン（A）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の125位のアミノ酸置換は、システイン（C）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の177位のアミノ酸置換は、チロシン（Y）からリシン（K）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の177位のアミノ酸置換は、チロシン（Y）からヒスチジン（H）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の180位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（F）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の180位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（F）からイソロイシン（I）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の180位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の185位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の187位のアミノ酸置換は、アラニン（A）からグリシン（G）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の200位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（F）からトリプトファン（W）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の207位のアミノ酸置換は、バリン（V）からプロリン（P）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の209位のアミノ酸置換は、バリン（V）からフェニルアラニン（F）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の226位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からフェニルアラニン（F）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の235位のアミノ酸置換は、ロイシン（L）からアルギニン（R）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の240位のアミノ酸置換は、バリン（V）からリシン（K）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の241位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（F）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の243位のアミノ酸置換は、プロリン（P）からリシン（K）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の258位のアミノ酸置換は、アスパラギン（N）からセリン（S）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の296位のアミノ酸置換は、ロイシン（L）からトリプトファン（W）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の296位のアミノ酸置換は、ロイシン（L）からチロシン（Y）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の296位のアミノ酸置換は、ロイシン（L）からフェニルアラニン（F）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の298位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の298位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からアラニン（A）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の298位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の311位のアミノ酸置換は、プロリン（P）からイソロイシン（I）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の311位のアミノ酸置換は、プロリン（P）からバリンへの置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の315位のアミノ酸置換は、アルギニン（R）からリシン（K）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の319位のアミノ酸置換は、トレオニン（T）からグリシン（G）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の327位のアミノ酸置換は、チロシン（Y）からアルギニン（R）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の328位のアミノ酸置換は、チロシン（Y）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の340位のアミノ酸置換は、システイン（C）からグリシン（G）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の340位のアミノ酸置換は、システイン（C）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の421位のアミノ酸置換は、アスパラギン酸（D）からヒスチジン（H）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の436位のアミノ酸置換は、バリン（V）からイソロイシン（I）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の456位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からチロシン（Y）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の470位のアミノ酸置換は、ロイシン（L）からフェニルアラニン（F）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の485位のアミノ酸置換は、セリン（S）からリシン（K）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の503位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の503位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からイソロイシン（I）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の552位のアミノ酸置換は、バリン（V）からリシン（K）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の570位のアミノ酸置換は、アラニン（A）からトレオニン（T）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の591位のアミノ酸置換は、グルタミン（Q）からプロリン（P）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の591位のアミノ酸置換は、グルタミン（Q）からアルギニン（R）への置換である。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼが30位、および／または165位、および／または282位、および／または538位に上記の変異を含む実施態様を含め、piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素はアミノ酸置換を含むこと、またはSuper piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素はアミノ酸置換をさらに含むことが、配列番号14487または配列番号14484の103位、194位、372位、375位、450位、509位、570位のうちの1つ以上において可能である。本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼが30位、および／または165位、および／または282位、および／または538位に上記の変異を含む実施態様を含め、piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素はアミノ酸置換を含むこと、またはSuper piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素はアミノ酸置換をさらに含むことが、配列番号14487または配列番号14484の103位、194位、372位、375位、450位、509位、570位のうちの2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれよりも多い位置において可能である。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼが30位、および／または165位、および／または282位、および／または538位に上記の変異を含む実施態様を含め、piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素はアミノ酸置換を含むこと、またはSuper piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素はアミノ酸置換をさらに含むことが、配列番号14487または配列番号14484の103位、194位、372位、375位、450位、509位、570位において可能である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の103位のアミノ酸置換は、セリン（S）からプロリン（P）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の194位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の372位のアミノ酸置換は、アルギニン（R）からアラニン（A）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の375位のアミノ酸置換は、リシン（K）からアラニン（A）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の450位のアミノ酸置換は、アスパラギン酸（D）からアスパラギン（N）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の509位のアミノ酸置換は、セリン（S）からグリシン（G）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の570位のアミノ酸置換は、アスパラギン（N）からセリン（S）への置換である。いくつかの実施態様では、piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の194位にメチオニン（M）からバリン（V）への置換を含むことができる。いくつかの実施態様では、piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素が配列番号14487の194位にメチオニン（M）からバリン（V）への置換を含むことができる実施態様を含め、piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487または配列番号14484の372位、375位、450位にアミノ酸置換をさらに含むことができる。いくつかの実施態様では、piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の194位にメチオニン（M）からバリン（V）への置換を、配列番号14487の372位にアルギニン（R）からアラニン（A）への置換を、配列番号14487の375位にリシン（K）からアラニン（A）への置換を含むことができる。いくつかの実施態様では、piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の194位にメチオニン（M）からバリン（V）への置換を、配列番号14487の372位にアルギニン（R）からアラニン（A）への置換を、配列番号14487の375位にリシン（K）からアラニン（A）への置換を、配列番号14487の450位にアスパラギン酸（D）からアスパラギン（N）への置換を含むことができる。
Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンを、ITRを認識するＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼによって標的ゲノムの中に転移させ、これらITRの間にある内容をTA染色体部位の中に移動させる。さまざまな実施態様では、SBトランスポゾンを媒介とする遺伝子輸送、または多数の同様のトランスポゾンの任意のものを用いた遺伝子輸送を、本開示の組成物と方法で利用することができる。
いくつかの実施態様では、特にトランスポゾンがＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである実施態様では、トランスポザーゼは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ、または高活性なＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ（SB100X）である。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ酵素は、
1 MGKSKEISQD LRKKIVDLHK SGSSLGAISK RLKVPRSSVQ TIVRKYKHHG TTQPSYRSGR
61 RRVLSPRDER TLVRKVQINP RTTAKDLVKM LEETGTKVSI STVKRVLYRH NLKGRSARKK
121 PLLQNRHKKA RLRFATAHGD KDRTFWRNVL WSDETKIELF GHNDHRYVWR KKGEACKPKN
181 TIPTVKHGGG SIMLWGCFAA GGTGALHKID GIMRKENYVD ILKQHLKTSV RKLKLGRKWV
241 FQMDNDPKHT SKVVAKWLKD NKVKVLEWPS QSPDLNPIEN LWAELKKRVR ARRPTNLTQL
301 HQLCQEEWAK IHPTYCGKLV EGYPKRLTQV KQFKGNATKY（配列番号14485）と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの数値の間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、高活性なＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙ（SB100X）トランスポザーゼ酵素は、
1 MGKSKEISQD LRKRIVDLHK SGSSLGAISK RLAVPRSSVQ TIVRKYKHHG TTQPSYRSGR
61 RRVLSPRDER TLVRKVQINP RTTAKDLVKM LEETGTKVSI STVKRVLYRH NLKGHSARKK
121 PLLQNRHKKA RLRFATAHGD KDRTFWRNVL WSDETKIELF GHNDHRYVWR KKGEACKPKN
181 TIPTVKHGGG SIMLWGCFAA GGTGALHKID GIMDAVQYVD ILKQHLKTSV RKLKLGRKWV
241 FQHDNDPKHT SKVVAKWLKD NKVKVLEWPS QSPDLNPIEN LWAELKKRVR ARRPTNLTQL
301 HQLCQEEWAK IHPNYCGKLV EGYPKRLTQV KQFKGNATKY（配列番号14486）と少なくとも75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの数値の間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含んでいる。
Helraiserトランスポゾンは、Helitronトランスポザーゼによって転移される。Helitronトランスポザーゼは、Helraiserトランスポゾン（コウモリのゲノムに由来し、約3000万年～3600万年前に活性であった古いエレメント）を動員する。本開示の代表的なHelraiserトランスポゾンの一例はHelibat1であり、これは、
1 TCCTATATAA TAAAAGAGAA ACATGCAAAT TGACCATCCC TCCGCTACGC TCAAGCCACG
61 CCCACCAGCC AATCAGAAGT GACTATGCAA ATTAACCCAA CAAAGATGGC AGTTAAATTT
121 GCATACGCAG GTGTCAAGCG CCCCAGGAGG CAACGGCGGC CGCGGGCTCC CAGGACCTTC
181 GCTGGCCCCG GGAGGCGAGG CCGGCCGCGC CTAGCCACAC CCGCGGGCTC CCGGGACCTT
241 CGCCAGCAGA GAGCAGAGCG GGAGAGCGGG CGGAGAGCGG GAGGTTTGGA GGACTTGGCA
301 GAGCAGGAGG CCGCTGGACA TAGAGCAGAG CGAGAGAGAG GGTGGCTTGG AGGGCGTGGC
361 TCCCTCTGTC ACCCCAGCTT CCTCATCACA GCTGTGGAAA CTGACAGCAG GGAGGAGGAA
421 GTCCCACCCC CACAGAATCA GCCAGAATCA GCCGTTGGTC AGACAGCTCT CAGCGGCCTG
481 ACAGCCAGGA CTCTCATTCA CCTGCATCTC AGACCGTGAC AGTAGAGAGG TGGGACTATG
541 TCTAAAGAAC AACTGTTGAT ACAACGTAGC TCTGCAGCCG AAAGATGCCG GCGTTATCGA
601 CAGAAAATGT CTGCAGAGCA ACGTGCGTCT GATCTTGAAA GAAGGCGGCG CCTGCAACAG
661 AATGTATCTG AAGAGCAGCT ACTGGAAAAA CGTCGCTCTG AAGCCGAAAA ACAGCGGCGT
721 CATCGACAGA AAATGTCTAA AGACCAACGT GCCTTTGAAG TTGAAAGAAG GCGGTGGCGA
781 CGACAGAATA TGTCTAGAGA ACAGTCATCA ACAAGTACTA CCAATACCGG TAGGAACTGC
841 CTTCTCAGCA AAAATGGAGT ACATGAGGAT GCAATTCTCG AACATAGTTG TGGTGGAATG
901 ACTGTTCGAT GTGAATTTTG CCTATCACTA AATTTCTCTG ATGAAAAACC ATCCGATGGG
961 AAATTTACTC GATGTTGTAG CAAAGGGAAA GTCTGTCCAA ATGATATACA TTTTCCAGAT
1021 TACCCGGCAT ATTTAAAAAG ATTAATGACA AACGAAGATT CTGACAGTAA AAATTTCATG
1081 GAAAATATTC GTTCCATAAA TAGTTCTTTT GCTTTTGCTT CCATGGGTGC AAATATTGCA
1141 TCGCCATCAG GATATGGGCC ATACTGTTTT AGAATACACG GACAAGTTTA TCACCGTACT
1201 GGAACTTTAC ATCCTTCGGA TGGTGTTTCT CGGAAGTTTG CTCAACTCTA TATTTTGGAT
1261 ACAGCCGAAG CTACAAGTAA AAGATTAGCA ATGCCAGAAA ACCAGGGCTG CTCAGAAAGA
1321 CTCATGATCA ACATCAACAA CCTCATGCAT GAAATAAATG AATTAACAAA ATCGTACAAG
1381 ATGCTACATG AGGTAGAAAA GGAAGCCCAA TCTGAAGCAG CAGCAAAAGG TATTGCTCCC
1441 ACAGAAGTAA CAATGGCGAT TAAATACGAT CGTAACAGTG ACCCAGGTAG ATATAATTCT
1501 CCCCGTGTAA CCGAGGTTGC TGTCATATTC AGAAACGAAG ATGGAGAACC TCCTTTTGAA
1561 AGGGACTTGC TCATTCATTG TAAACCAGAT CCCAATAATC CAAATGCCAC TAAAATGAAA
1621 CAAATCAGTA TCCTGTTTCC TACATTAGAT GCAATGACAT ATCCTATTCT TTTTCCACAT
1681 GGTGAAAAAG GCTGGGGAAC AGATATTGCA TTAAGACTCA GAGACAACAG TGTAATCGAC
1741 AATAATACTA GACAAAATGT AAGGACACGA GTCACACAAA TGCAGTATTA TGGATTTCAT
1801 CTCTCTGTGC GGGACACGTT CAATCCTATT TTAAATGCAG GAAAATTAAC TCAACAGTTT
1861 ATTGTGGATT CATATTCAAA AATGGAGGCC AATCGGATAA ATTTCATCAA AGCAAACCAA
1921 TCTAAGTTGA GAGTTGAAAA ATATAGTGGT TTGATGGATT ATCTCAAATC TAGATCTGAA
1981 AATGACAATG TGCCGATTGG TAAAATGATA ATACTTCCAT CATCTTTTGA GGGTAGTCCC
2041 AGAAATATGC AGCAGCGATA TCAGGATGCT ATGGCAATTG TAACGAAGTA TGGCAAGCCC
2101 GATTTATTCA TAACCATGAC ATGCAACCCC AAATGGGCAG ATATTACAAA CAATTTACAA
2161 CGCTGGCAAA AAGTTGAAAA CAGACCTGAC TTGGTAGCCA GAGTTTTTAA TATTAAGCTG
2221 AATGCTCTTT TAAATGATAT ATGTAAATTC CATTTATTTG GCAAAGTAAT AGCTAAAATT
2281 CATGTCATTG AATTTCAGAA ACGCGGACTG CCTCACGCTC ACATATTATT GATATTAGAT
2341 AGTGAGTCCA AATTACGTTC AGAAGATGAC ATTGACCGTA TAGTTAAGGC AGAAATTCCA
2401 GATGAAGACC AGTGTCCTCG ACTTTTTCAA ATTGTAAAAT CAAATATGGT ACATGGACCA
2461 TGTGGAATAC AAAATCCAAA TAGTCCATGT ATGGAAAATG GAAAATGTTC AAAGGGATAT
2521 CCAAAAGAAT TTCAAAATGC GACCATTGGA AATATTGATG GATATCCCAA ATACAAACGA
2581 AGATCTGGTA GCACCATGTC TATTGGAAAT AAAGTTGTCG ATAACACTTG GATTGTCCCT
2641 TATAACCCGT ATTTGTGCCT TAAATATAAC TGTCATATAA ATGTTGAAGT CTGTGCATCA
2701 ATTAAAAGTG TCAAATATTT ATTTAAATAC ATCTATAAAG GGCACGATTG TGCAAATATT
2761 CAAATTTCTG AAAAAAATAT TATCAATCAT GACGAAGTAC AGGACTTCAT TGACTCCAGG
2821 TATGTGAGCG CTCCTGAGGC TGTTTGGAGA CTTTTTGCAA TGCGAATGCA TGACCAATCT
2881 CATGCAATCA CAAGATTAGC TATTCATTTG CCAAATGATC AGAATTTGTA TTTTCATACC
2941 GATGATTTTG CTGAAGTTTT AGATAGGGCT AAAAGGCATA ACTCGACTTT GATGGCTTGG
3001 TTCTTATTGA ATAGAGAAGA TTCTGATGCA CGTAATTATT ATTATTGGGA GATTCCACAG
3061 CATTATGTGT TTAATAATTC TTTGTGGACA AAACGCCGAA AGGGTGGGAA TAAAGTATTA
3121 GGTAGACTGT TCACTGTGAG CTTTAGAGAA CCAGAACGAT ATTACCTTAG ACTTTTGCTT
3181 CTGCATGTAA AAGGTGCGAT AAGTTTTGAG GATCTGCGAA CTGTAGGAGG TGTAACTTAT
3241 GATACATTTC ATGAAGCTGC TAAACACCGA GGATTATTAC TTGATGACAC TATCTGGAAA
3301 GATACGATTG ACGATGCAAT CATCCTTAAT ATGCCCAAAC AACTACGGCA ACTTTTTGCA
3361 TATATATGTG TGTTTGGATG TCCTTCTGCT GCAGACAAAT TATGGGATGA GAATAAATCT
3421 CATTTTATTG AAGATTTCTG TTGGAAATTA CACCGAAGAG AAGGTGCCTG TGTGAACTGT
3481 GAAATGCATG CCCTTAACGA AATTCAGGAG GTATTCACAT TGCATGGAAT GAAATGTTCA
3541 CATTTCAAAC TTCCGGACTA TCCTTTATTA ATGAATGCAA ATACATGTGA TCAATTGTAC
3601 GAGCAACAAC AGGCAGAGGT TTTGATAAAT TCTCTGAATG ATGAACAGTT GGCAGCCTTT
3661 CAGACTATAA CTTCAGCCAT CGAAGATCAA ACTGTACACC CCAAATGCTT TTTCTTGGAT
3721 GGTCCAGGTG GTAGTGGAAA AACATATCTG TATAAAGTTT TAACACATTA TATTAGAGGT
3781 CGTGGTGGTA CTGTTTTACC CACAGCATCT ACAGGAATTG CTGCAAATTT ACTTCTTGGT
3841 GGAAGAACCT TTCATTCCCA ATATAAATTA CCAATTCCAT TAAATGAAAC TTCAATTTCT
3901 AGACTCGATA TAAAGAGTGA AGTTGCTAAA ACCATTAAAA AGGCCCAACT TCTCATTATT
3961 GATGAATGCA CCATGGCATC CAGTCATGCT ATAAACGCCA TAGATAGATT ACTAAGAGAA
4021 ATTATGAATT TGAATGTTGC ATTTGGTGGG AAAGTTCTCC TTCTCGGAGG GGATTTTCGA
4081 CAATGTCTCA GTATTGTACC ACATGCTATG CGATCGGCCA TAGTACAAAC GAGTTTAAAG
4141 TACTGTAATG TTTGGGGATG TTTCAGAAAG TTGTCTCTTA AAACAAATAT GAGATCAGAG
4201 GATTCTGCTT ATAGTGAATG GTTAGTAAAA CTTGGAGATG GCAAACTTGA TAGCAGTTTT
4261 CATTTAGGAA TGGATATTAT TGAAATCCCC CATGAAATGA TTTGTAACGG ATCTATTATT
4321 GAAGCTACCT TTGGAAATAG TATATCTATA GATAATATTA AAAATATATC TAAACGTGCA
4381 ATTCTTTGTC CAAAAAATGA GCATGTTCAA AAATTAAATG AAGAAATTTT GGATATACTT
4441 GATGGAGATT TTCACACATA TTTGAGTGAT GATTCCATTG ATTCAACAGA TGATGCTGAA
4501 AAGGAAAATT TTCCCATCGA ATTTCTTAAT AGTATTACTC CTTCGGGAAT GCCGTGTCAT
4561 AAATTAAAAT TGAAAGTGGG TGCAATCATC ATGCTATTGA GAAATCTTAA TAGTAAATGG
4621 GGTCTTTGTA ATGGTACTAG ATTTATTATC AAAAGATTAC GACCTAACAT TATCGAAGCT
4681 GAAGTATTAA CAGGATCTGC AGAGGGAGAG GTTGTTCTGA TTCCAAGAAT TGATTTGTCC
4741 CCATCTGACA CTGGCCTCCC ATTTAAATTA ATTCGAAGAC AGTTTCCCGT GATGCCAGCA
4801 TTTGCGATGA CTATTAATAA ATCACAAGGA CAAACTCTAG ACAGAGTAGG AATATTCCTA
4861 CCTGAACCCG TTTTCGCACA TGGTCAGTTA TATGTTGCTT TCTCTCGAGT TCGAAGAGCA
4921 TGTGACGTTA AAGTTAAAGT TGTAAATACT TCATCACAAG GGAAATTAGT CAAGCACTCT
4981 GAAAGTGTTT TTACTCTTAA TGTGGTATAC AGGGAGATAT TAGAATAAGT TTAATCACTT
5041 TATCAGTCAT TGTTTGCATC AATGTTGTTT TTATATCATG TTTTTGTTGT TTTTATATCA
5101 TGTCTTTGTT GTTGTTATAT CATGTTGTTA TTGTTTATTT ATTAATAAAT TTATGTATTA
5161 TTTTCATATA CATTTTACTC ATTTCCTTTC ATCTCTCACA CTTCTATTAT AGAGAAAGGG
5221 CAAATAGCAA TATTAAAATA TTTCCTCTAA TTAATTCCCT TTCAATGTGC ACGAATTTCG
5281 TGCACCGGGC CACTAG（配列番号18061）を含む核酸配列を含んでいる。
Helitronトランスポザーゼは、他のトランスポザーゼとは異なってRNアーゼ-H様触媒ドメインを含んでいないが、その代わりに、複製開始ドメイン（Rep）とDNAヘリカーゼドメインからなるRepHelモチーフを含んでいる。Repドメインは、HUHスーパーファミリーのヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインである。
本開示の代表的なHelitronトランスポザーゼの一例は、
1 MSKEQLLIQR SSAAERCRRY RQKMSAEQRA SDLERRRRLQ QNVSEEQLLE KRRSEAEKQR
61 RHRQKMSKDQ RAFEVERRRW RRQNMSREQS STSTTNTGRN CLLSKNGVHE DAILEHSCGG
121 MTVRCEFCLS LNFSDEKPSD GKFTRCCSKG KVCPNDIHFP DYPAYLKRLM TNEDSDSKNF
181 MENIRSINSS FAFASMGANI ASPSGYGPYC FRIHGQVYHR TGTLHPSDGV SRKFAQLYIL
241 DTAEATSKRL AMPENQGCSE RLMININNLM HEINELTKSY KMLHEVEKEA QSEAAAKGIA
301 PTEVTMAIKY DRNSDPGRYN SPRVTEVAVI FRNEDGEPPF ERDLLIHCKP DPNNPNATKM
361 KQISILFPTL DAMTYPILFP HGEKGWGTDI ALRLRDNSVI DNNTRQNVRT RVTQMQYYGF
421 HLSVRDTFNP ILNAGKLTQQ FIVDSYSKME ANRINFIKAN QSKLRVEKYS GLMDYLKSRS
481 ENDNVPIGKM IILPSSFEGS PRNMQQRYQD AMAIVTKYGK PDLFITMTCN PKWADITNNL
541 QRWQKVENRP DLVARVFNIK LNALLNDICK FHLFGKVIAK IHVIEFQKRG LPHAHILLIL
601 DSESKLRSED DIDRIVKAEI PDEDQCPRLF QIVKSNMVHG PCGIQNPNSP CMENGKCSKG
661 YPKEFQNATI GNIDGYPKYK RRSGSTMSIG NKVVDNTWIV PYNPYLCLKY NCHINVEVCA
721 SIKSVKYLFK YIYKGHDCAN IQISEKNIIN HDEVQDFIDS RYVSAPEAVW RLFAMRMHDQ
781 SHAITRLAIH LPNDQNLYFH TDDFAEVLDR AKRHNSTLMA WFLLNREDSD ARNYYYWEIP
841 QHYVFNNSLW TKRRKGGNKV LGRLFTVSFR EPERYYLRLL LLHVKGAISF EDLRTVGGVT
901 YDTFHEAAKH RGLLLDDTIW KDTIDDAIIL NMPKQLRQLF AYICVFGCPS AADKLWDENK
961 SHFIEDFCWK LHRREGACVN CEMHALNEIQ EVFTLHGMKC SHFKLPDYPL LMNANTCDQL
1021 YEQQQAEVLI NSLNDEQLAA FQTITSAIED QTVHPKCFFL DGPGGSGKTY LYKVLTHYIR
1081 GRGGTVLPTA STGIAANLLL GGRTFHSQYK LPIPLNETSI SRLDIKSEVA KTIKKAQLLI
1141 IDECTMASSH AINAIDRLLR EIMNLNVAFG GKVLLLGGDF RQCLSIVPHA MRSAIVQTSL
1201 KYCNVWGCFR KLSLKTNMRS EDSAYSEWLV KLGDGKLDSS FHLGMDIIEI PHEMICNGSI
1261 IEATFGNSIS IDNIKNISKR AILCPKNEHV QKLNEEILDI LDGDFHTYLS DDSIDSTDDA
1321 EKENFPIEFL NSITPSGMPC HKLKLKVGAI IMLLRNLNSK WGLCNGTRFI IKRLRPNIIE
1381 AEVLTGSAEG EVVLIPRIDL SPSDTGLPFK LIRRQFPVMP AFAMTINKSQ GQTLDRVGIF
1441 LPEPVFAHGQ LYVAFSRVRR ACDVKVKVVN TSSQGKLVKH SESVFTLNVV YREILE（配列番号14501）を含むアミノ酸配列を含んでいる。
Helitron転移では、トランスポゾンの3'末端に近いヘアピンがターミネータとして機能する。しかしこのヘアピンはトランスポザーゼが迂回することができ、その結果として隣接している配列の形質導入が起こる。それに加え、Helraiser転移により、共有結合によって閉じた円形中間体が生成する。さらに、Helitron転移は標的部位の重複が欠けている可能性がある。Helraiser配列では、トランスポザーゼに、LTSおよびRTSと名づけられた5'末端配列と3'末端配列が隣接している。これら配列は、保存された5’-TC/CTAG-3’モチーフで終わっている。ヘアピン終結構造を形成する能力を持つ19 bpの回文配列がRTSの11ヌクレオチド上流に位置しており、配列GTGCACGAATTTCGTGCACCGGGCCACTAG（配列番号14500）からなる。
Tol2トランスポゾンは、メダカのゲノムから単離すること、またはメダカのゲノムに由来することができ、hATファミリーのトランスポゾンに似ている可能性がある。本開示の代表的なTol2トランスポゾンは、約4.7キロ塩基を含む配列によってコードされており、Tol2トランスポザーゼをコードする遺伝子を含んでいる。この遺伝子は4つのエキソンを含んでいる。本開示の代表的なTol2トランスポザーゼの一例は、以下の
1 MEEVCDSSAA ASSTVQNQPQ DQEHPWPYLR EFFSLSGVNK DSFKMKCVLC LPLNKEISAF
61 KSSPSNLRKH IERMHPNYLK NYSKLTAQKR KIGTSTHASS SKQLKVDSVF PVKHVSPVTV
121 NKAILRYIIQ GLHPFSTVDL PSFKELISTL QPGISVITRP TLRSKIAEAA LIMKQKVTAA
181 MSEVEWIATT TDCWTARRKS FIGVTAHWIN PGSLERHSAA LACKRLMGSH TFEVLASAMN
241 DIHSEYEIRD KVVCTTTDSG SNFMKAFRVF GVENNDIETE ARRCESDDTD SEGCGEGSDG
301 VEFQDASRVL DQDDGFEFQL PKHQKCACHL LNLVSSVDAQ KALSNEHYKK LYRSVFGKCQ
361 ALWNKSSRSA LAAEAVESES RLQLLRPNQT RWNSTFMAVD RILQICKEAG EGALRNICTS
421 LEVPMFNPAE MLFLTEWANT MRPVAKVLDI LQAETNTQLG WLLPSVHQLS LKLQRLHHSL
481 RYCDPLVDAL QQGIQTRFKH MFEDPEIIAA AILLPKFRTS WTNDETIIKR GMDYIRVHLE
541 PLDHKKELAN SSSDDEDFFA SLKPTTHEAS KELDGYLACV SDTRESLLTF PAICSLSIKT
601 NTPLPASAAC ERLFSTAGLL FSPKRARLDT NNFENQLLLK LNLRFYNFE（配列番号14502）を含むアミノ酸配列を含んでいる。
本開示の代表的なTol2トランスポゾンの一例は、逆方向反復と、亜末端配列と、Tol2トランスポザーゼを含んでおり、以下の
1 CAGAGGTGTA AAGTACTTGA GTAATTTTAC TTGATTACTG TACTTAAGTA TTATTTTTGG
61 GGATTTTTAC TTTACTTGAG TACAATTAAA AATCAATACT TTTACTTTTA CTTAATTACA
121 TTTTTTTAGA AAAAAAAGTA CTTTTTACTC CTTACAATTT TATTTACAGT CAAAAAGTAC
181 TTATTTTTTG GAGATCACTT CATTCTATTT TCCCTTGCTA TTACCAAACC AATTGAATTG
241 CGCTGATGCC CAGTTTAATT TAAATGTTAT TTATTCTGCC TATGAAAATC GTTTTCACAT
301 TATATGAAAT TGGTCAGACA TGTTCATTGG TCCTTTGGAA GTGACGTCAT GTCACATCTA
361 TTACCACAAT GCACAGCACC TTGACCTGGA AATTAGGGAA ATTATAACAG TCAATCAGTG
421 GAAGAAAATG GAGGAAGTAT GTGATTCATC AGCAGCTGCG AGCAGCACAG TCCAAAATCA
481 GCCACAGGAT CAAGAGCACC CGTGGCCGTA TCTTCGCGAA TTCTTTTCTT TAAGTGGTGT
541 AAATAAAGAT TCATTCAAGA TGAAATGTGT CCTCTGTCTC CCGCTTAATA AAGAAATATC
601 GGCCTTCAAA AGTTCGCCAT CAAACCTAAG GAAGCATATT GAGGTAAGTA CATTAAGTAT
661 TTTGTTTTAC TGATAGTTTT TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT TTTTTGGGTG TGCATGTTTT
721 GACGTTGATG GCGCGCCTTT TATATGTGTA GTAGGCCTAT TTTCACTAAT GCATGCGATT
781 GACAATATAA GGCTCACGTA ATAAAATGCT AAAATGCATT TGTAATTGGT AACGTTAGGT
841 CCACGGGAAA TTTGGCGCCT ATTGCAGCTT TGAATAATCA TTATCATTCC GTGCTCTCAT
901 TGTGTTTGAA TTCATGCAAA ACACAAGAAA ACCAAGCGAG AAATTTTTTT CCAAACATGT
961 TGTATTGTCA AAACGGTAAC ACTTTACAAT GAGGTTGATT AGTTCATGTA TTAACTAACA
1021 TTAAATAACC ATGAGCAATA CATTTGTTAC TGTATCTGTT AATCTTTGTT AACGTTAGTT
1081 AATAGAAATA CAGATGTTCA TTGTTTGTTC ATGTTAGTTC ACAGTGCATT AACTAATGTT
1141 AACAAGATAT AAAGTATTAG TAAATGTTGA AATTAACATG TATACGTGCA GTTCATTATT
1201 AGTTCATGTT AACTAATGTA GTTAACTAAC GAACCTTATT GTAAAAGTGT TACCATCAAA
1261 ACTAATGTAA TGAAATCAAT TCACCCTGTC ATGTCAGCCT TACAGTCCTG TGTTTTTGTC
1321 AATATAATCA GAAATAAAAT TAATGTTTGA TTGTCACTAA ATGCTACTGT ATTTCTAAAA
1381 TCAACAAGTA TTTAACATTA TAAAGTGTGC AATTGGCTGC AAATGTCAGT TTTATTAAAG
1441 GGTTAGTTCA CCCAAAAATG AAAATAATGT CATTAATGAC TCGCCCTCAT GTCGTTCCAA
1501 GCCCGTAAGA CCTCCGTTCA TCTTCAGAAC ACAGTTTAAG ATATTTTAGA TTTAGTCCGA
1561 GAGCTTTCTG TGCCTCCATT GAGAATGTAT GTACGGTATA CTGTCCATGT CCAGAAAGGT
1621 AATAAAAACA TCAAAGTAGT CCATGTGACA TCAGTGGGTT AGTTAGAATT TTTTGAAGCA
1681 TCGAATACAT TTTGGTCCAA AAATAACAAA ACCTACGACT TTATTCGGCA TTGTATTCTC
1741 TTCCGGGTCT GTTGTCAATC CGCGTTCACG ACTTCGCAGT GACGCTACAA TGCTGAATAA
1801 AGTCGTAGGT TTTGTTATTT TTGGACCAAA ATGTATTTTC GATGCTTCAA ATAATTCTAC
1861 CTAACCCACT GATGTCACAT GGACTACTTT GATGTTTTTA TTACCTTTCT GGACATGGAC
1921 AGTATACCGT ACATACATTT TCAGTGGAGG GACAGAAAGC TCTCGGACTA AATCTAAAAT
1981 ATCTTAAACT GTGTTCCGAA GATGAACGGA GGTGTTACGG GCTTGGAACG ACATGAGGGT
2041 GAGTCATTAA TGACATCTTT TCATTTTTGG GTGAACTAAC CCTTTAATGC TGTAATCAGA
2101 GAGTGTATGT GTAATTGTTA CATTTATTGC ATACAATATA AATATTTATT TGTTGTTTTT
2161 ACAGAGAATG CACCCAAATT ACCTCAAAAA CTACTCTAAA TTGACAGCAC AGAAGAGAAA
2221 GATCGGGACC TCCACCCATG CTTCCAGCAG TAAGCAACTG AAAGTTGACT CAGTTTTCCC
2281 AGTCAAACAT GTGTCTCCAG TCACTGTGAA CAAAGCTATA TTAAGGTACA TCATTCAAGG
2341 ACTTCATCCT TTCAGCACTG TTGATCTGCC ATCATTTAAA GAGCTGATTA GTACACTGCA
2401 GCCTGGCATT TCTGTCATTA CAAGGCCTAC TTTACGCTCC AAGATAGCTG AAGCTGCTCT
2461 GATCATGAAA CAGAAAGTGA CTGCTGCCAT GAGTGAAGTT GAATGGATTG CAACCACAAC
2521 GGATTGTTGG ACTGCACGTA GAAAGTCATT CATTGGTGTA ACTGCTCACT GGATCAACCC
2581 TGGAAGTCTT GAAAGACATT CCGCTGCACT TGCCTGCAAA AGATTAATGG GCTCTCATAC
2641 TTTTGAGGTA CTGGCCAGTG CCATGAATGA TATCCACTCA GAGTATGAAA TACGTGACAA
2701 GGTTGTTTGC ACAACCACAG ACAGTGGTTC CAACTTTATG AAGGCTTTCA GAGTTTTTGG
2761 TGTGGAAAAC AATGATATCG AGACTGAGGC AAGAAGGTGT GAAAGTGATG ACACTGATTC
2821 TGAAGGCTGT GGTGAGGGAA GTGATGGTGT GGAATTCCAA GATGCCTCAC GAGTCCTGGA
2881 CCAAGACGAT GGCTTCGAAT TCCAGCTACC AAAACATCAA AAGTGTGCCT GTCACTTACT
2941 TAACCTAGTC TCAAGCGTTG ATGCCCAAAA AGCTCTCTCA AATGAACACT ACAAGAAACT
3001 CTACAGATCT GTCTTTGGCA AATGCCAAGC TTTATGGAAT AAAAGCAGCC GATCGGCTCT
3061 AGCAGCTGAA GCTGTTGAAT CAGAAAGCCG GCTTCAGCTT TTAAGGCCAA ACCAAACGCG
3121 GTGGAATTCA ACTTTTATGG CTGTTGACAG AATTCTTCAA ATTTGCAAAG AAGCAGGAGA
3181 AGGCGCACTT CGGAATATAT GCACCTCTCT TGAGGTTCCA ATGTAAGTGT TTTTCCCCTC
3241 TATCGATGTA AACAAATGTG GGTTGTTTTT GTTTAATACT CTTTGATTAT GCTGATTTCT
3301 CCTGTAGGTT TAATCCAGCA GAAATGCTGT TCTTGACAGA GTGGGCCAAC ACAATGCGTC
3361 CAGTTGCAAA AGTACTCGAC ATCTTGCAAG CGGAAACGAA TACACAGCTG GGGTGGCTGC
3421 TGCCTAGTGT CCATCAGTTA AGCTTGAAAC TTCAGCGACT CCACCATTCT CTCAGGTACT
3481 GTGACCCACT TGTGGATGCC CTACAACAAG GAATCCAAAC ACGATTCAAG CATATGTTTG
3541 AAGATCCTGA GATCATAGCA GCTGCCATCC TTCTCCCTAA ATTTCGGACC TCTTGGACAA
3601 ATGATGAAAC CATCATAAAA CGAGGTAAAT GAATGCAAGC AACATACACT TGACGAATTC
3661 TAATCTGGGC AACCTTTGAG CCATACCAAA ATTATTCTTT TATTTATTTA TTTTTGCACT
3721 TTTTAGGAAT GTTATATCCC ATCTTTGGCT GTGATCTCAA TATGAATATT GATGTAAAGT
3781 ATTCTTGCAG CAGGTTGTAG TTATCCCTCA GTGTTTCTTG AAACCAAACT CATATGTATC
3841 ATATGTGGTT TGGAAATGCA GTTAGATTTT ATGCTAAAAT AAGGGATTTG CATGATTTTA
3901 GATGTAGATG ACTGCACGTA AATGTAGTTA ATGACAAAAT CCATAAAATT TGTTCCCAGT
3961 CAGAAGCCCC TCAACCAAAC TTTTCTTTGT GTCTGCTCAC TGTGCTTGTA GGCATGGACT
4021 ACATCAGAGT GCATCTGGAG CCTTTGGACC ACAAGAAGGA ATTGGCCAAC AGTTCATCTG
4081 ATGATGAAGA TTTTTTCGCT TCTTTGAAAC CGACAACACA TGAAGCCAGC AAAGAGTTGG
4141 ATGGATATCT GGCCTGTGTT TCAGACACCA GGGAGTCTCT GCTCACGTTT CCTGCTATTT
4201 GCAGCCTCTC TATCAAGACT AATACACCTC TTCCCGCATC GGCTGCCTGT GAGAGGCTTT
4261 TCAGCACTGC AGGATTGCTT TTCAGCCCCA AAAGAGCTAG GCTTGACACT AACAATTTTG
4321 AGAATCAGCT TCTACTGAAG TTAAATCTGA GGTTTTACAA CTTTGAGTAG CGTGTACTGG
4381 CATTAGATTG TCTGTCTTAT AGTTTGATAA TTAAATACAA ACAGTTCTAA AGCAGGATAA
4441 AACCTTGTAT GCATTTCATT TAATGTTTTT TGAGATTAAA AGCTTAAACA AGAATCTCTA
4501 GTTTTCTTTC TTGCTTTTAC TTTTACTTCC TTAATACTCA AGTACAATTT TAATGGAGTA
4561 CTTTTTTACT TTTACTCAAG TAAGATTCTA GCCAGATACT TTTACTTTTA ATTGAGTAAA
4621 ATTTTCCCTA AGTACTTGTA CTTTCACTTG AGTAAAATTT TTGAGTACTT TTTACACCTC
4681 TG（配列番号18062）を含む核酸配列によってコードされている。
本開示の代表的なトランスポゾン／トランスポザーゼ系の非限定的な例に含まれるのは、piggyBacトランスポゾンとpiggyBac トランスポザーゼ、piggyBac様トランスポゾンとpiggyBac様トランスポザーゼである。
piggyBacトランスポザーゼとpiggyBac様トランスポザーゼは、トランスポゾンの両端にあるトランスポゾン特異的逆方向末端反復配列（ITR）を認識し、これらITR相互の間にある内容をTTAA染色体部位またはTTAT染色体部位の中に移動させる。piggyBacトランスポゾン系またはpiggyBac様トランスポゾン系は、これらITRの間に含めることのできる興味ある遺伝子に関するペイロードの制限がない。
いくつかの実施態様では、特にトランスポゾンがpiggyBacトランスポゾンである実施態様では、トランスポザーゼは、piggyBac（商標）トランスポザーゼ、Super piggyBac（商標）（SPB）トランスポザーゼである。いくつかの実施態様では、特にトランスポザーゼがpiggyBac（商標）トランスポザーゼ、Super piggyBac（商標）（SPB）トランスポザーゼである実施態様では、トランスポザーゼをコードする配列はmRNA配列である。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14487）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることができる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、配列：
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14487）の30位、165位、282位、538位のうちの1つ以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなるpiggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。
いくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の配列の30位、165位、282位、538位のうちの2つ以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなるpiggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の配列の30位、165位、282位、538位のうちの3つ以上にアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなるpiggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の配列の30位、165位、282位、538位のそれぞれにアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなるpiggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、配列番号14487の配列の30位のアミノ酸置換は、イソロイシン（I）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487の配列の165位のアミノ酸置換は、グリシン（G）からセリン（S）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487の配列の282位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487の配列の538位のアミノ酸置換は、アスパラギン（N）からリシン（K）への置換である。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、Super piggyBac（商標）（SPB）トランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、本開示のSuper piggyBac（商標）（SPB）トランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の配列において30位のアミノ酸置換がイソロイシン（I）からバリン（V）への置換であり、165位のアミノ酸置換がグリシン（G）からセリン（S）への置換であり、282位のアミノ酸置換がメチオニン（M）からバリン（V）への置換であり、538位のアミノ酸置換がアスパラギン（N）からリシン（K）への置換であるアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることができる。いくつかの実施態様では、Super piggyBac（商標）（SPB）トランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14484）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることができる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼが30位、および／または165位、および／または282位、および／または538位に上記の変異を含む実施態様を含め、piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素、またはSuper piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素、またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487または配列番号14484の3位、46位、82位、103位、119位、125位、177位、180位、185位、187位、200位、207位、209位、226位、235位、240位、241位、243位、258位、296位、298位、311位、315位、319位、327位、328位、340位、421位、436位、456位、470位、486位、503位、552位、570位、591位のうちの1つ以上にアミノ酸置換をさらに含むことができる。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼが30位、および／または165位、および／または282位、および／または538位に上記の変異を含む実施態様を含め、piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素、またはSuper piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素、またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487または配列番号14484の46位、119位、125位、177位、180位、185位、187位、200位、207位、209位、226位、235位、240位、241位、243位、296位、298位、311位、315位、319位、327位、328位、340位、421位、436位、456位、470位、485位、503位、552位、570位のうちの1つ以上にアミノ酸置換をさらに含むことができる。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の3位のアミノ酸置換は、セリン（S）からアスパラギン（N）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の46位のアミノ酸置換は、アラニン（A）からセリン（S）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の46位のアミノ酸置換は、アラニン（A）からトレオニン（T）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の82位のアミノ酸置換は、イソロイシン（I）からトリプトファン（W）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の103位のアミノ酸置換は、セリン（S）からプロリン（P）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の119位のアミノ酸置換は、アルギニン（R）からプロリン（P）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の125位のアミノ酸置換は、システイン（C）からアラニン（A）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の125位のアミノ酸置換は、システイン（C）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の177位のアミノ酸置換は、チロシン（Y）からリシン（K）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の177位のアミノ酸置換は、チロシン（Y）からヒスチジン（H）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の180位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（F）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の180位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（F）からイソロイシン（I）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の180位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の185位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の187位のアミノ酸置換は、アラニン（A）からグリシン（G）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の200位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（F）からトリプトファン（W）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の207位のアミノ酸置換は、バリン（V）からプロリン（P）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の209位のアミノ酸置換は、バリン（V）からフェニルアラニン（F）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の226位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からフェニルアラニン（F）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の235位のアミノ酸置換は、ロイシン（L）からアルギニン（R）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の240位のアミノ酸置換は、バリン（V）からリシン（K）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の241位のアミノ酸置換は、フェニルアラニン（F）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の243位のアミノ酸置換は、プロリン（P）からリシン（K）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の258位のアミノ酸置換は、アスパラギン（N）からセリン（S）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の296位のアミノ酸置換は、ロイシン（L）からトリプトファン（W）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の296位のアミノ酸置換は、ロイシン（L）からチロシン（Y）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の296位のアミノ酸置換は、ロイシン（L）からフェニルアラニン（F）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の298位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の298位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からアラニン（A）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の298位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の311位のアミノ酸置換は、プロリン（P）からイソロイシン（I）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の311位のアミノ酸置換は、プロリン（P）からバリンへの置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の315位のアミノ酸置換は、アルギニン（R）からリシン（K）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の319位のアミノ酸置換は、トレオニン（T）からグリシン（G）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の327位のアミノ酸置換は、チロシン（Y）からアルギニン（R）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の328位のアミノ酸置換は、チロシン（Y）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の340位のアミノ酸置換は、システイン（C）からグリシン（G）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の340位のアミノ酸置換は、システイン（C）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の421位のアミノ酸置換は、アスパラギン酸（D）からヒスチジン（H）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の436位のアミノ酸置換は、バリン（V）からイソロイシン（I）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の456位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からチロシン（Y）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の470位のアミノ酸置換は、ロイシン（L）からフェニルアラニン（F）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の485位のアミノ酸置換は、セリン（S）からリシン（K）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の503位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からロイシン（L）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の503位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からイソロイシン（I）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の552位のアミノ酸置換は、バリン（V）からリシン（K）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の570位のアミノ酸置換は、アラニン（A）からトレオニン（T）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の591位のアミノ酸置換は、グルタミン（Q）からプロリン（P）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の591位のアミノ酸置換は、グルタミン（Q）からアルギニン（R）への置換である。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼが30位、および／または165位、および／または282位、および／または538位に上記の変異を含む実施態様を含め、piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素はアミノ酸置換を含むこと、またはSuper piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素はアミノ酸置換をさらに含むことが、配列番号14487または配列番号14484の103位、194位、372位、375位、450位、509位、570位のうちの1つ以上において可能である。本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼが30位、および／または165位、および／または282位、および／または538位に上記の変異を含む実施態様を含め、piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素はアミノ酸置換を含むこと、またはSuper piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素はアミノ酸置換をさらに含むことが、配列番号14487または配列番号14484の103位、194位、372位、375位、450位、509位、570位のうちの2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、またはそれよりも多い位置において可能である。本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼが30位、および／または165位、および／または282位、および／または538位に上記の変異を含む実施態様を含め、piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素はアミノ酸置換を含むこと、またはSuper piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素はアミノ酸置換をさらに含むことが、配列番号14487または配列番号14484の103位、194位、372位、375位、450位、509位、570位において可能である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の103位のアミノ酸置換は、セリン（S）からプロリン（P）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の194位のアミノ酸置換は、メチオニン（M）からバリン（V）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の372位のアミノ酸置換は、アルギニン（R）からアラニン（A）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の375位のアミノ酸置換は、リシン（K）からアラニン（A）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の450位のアミノ酸置換は、アスパラギン酸（D）からアスパラギン（N）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の509位のアミノ酸置換は、セリン（S）からグリシン（G）への置換である。いくつかの実施態様では、配列番号14487または配列番号14484の570位のアミノ酸置換は、アスパラギン（N）からセリン（S）への置換である。いくつかの実施態様では、piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の194位にメチオニン（M）からバリン（V）への置換を含むことができる。いくつかの実施態様では、piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素が配列番号14487の194位にメチオニン（M）からバリン（V）への置換を含むことができる実施態様を含め、piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487または配列番号14484の372位、375位、450位にアミノ酸置換をさらに含むことができる。いくつかの実施態様では、piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の194位にメチオニン（M）からバリン（V）への置換を、配列番号14487の372位にアルギニン（R）からアラニン（A）への置換を、配列番号14487の375位にリシン（K）からアラニン（A）への置換を含むことができる。いくつかの実施態様では、piggyBac（商標）トランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、配列番号14487の194位にメチオニン（M）からバリン（V）への置換を、配列番号14487の372位にアルギニン（R）からアラニン（A）への置換を、配列番号14487の375位にリシン（K）からアラニン（A）への置換を、配列番号14487の450位にアスパラギン酸（D）からアスパラギン（N）への置換を含むことができる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、昆虫から単離されるか、昆虫に由来する。いくつかの実施態様では、昆虫は、Trichoplusia ni（イラクサギンウワバ）（GenBank登録番号AAA87375；配列番号16796）、Argyrogramma agnata（ミツモンキンウワバ）（GenBank登録番号GU477713；配列番号14534、配列番号16797）、Anopheles gambiae（ハマダラカ）（GenBank登録番号XP_312615（配列番号16798）； GenBank登録番号XP_320414（配列番号16799）；GenBank登録番号XP_310729（配列番号16800））、Aphis gossypii（ワタアブラムシ）（GenBank登録番号GU329918；配列番号16801、配列番号16802）、Acyrthosiphon pisum（エンドウヒゲナガアブラムシ）（GenBank登録番号XP_001948139；配列番号16803）、Agrotis ipsilon（タマナヤガ）（GenBank登録番号GU477714；配列番号14537、配列番号16804）、Bombyx mori（カイコ）（GenBank登録番号BAD11135；配列番号14505）、Chilo suppressalis（ニカメイガ）（GenBank登録番号JX294476；配列番号16805、配列番号16806）、Drosophila melanogaster（ショウジョウバエ）（GenBank登録番号AAL39784；配列番号16807）、Helicoverpa armigera（オオタバコガ）（GenBank登録番号ABS18391；配列番号14525）、Heliothis virescens（ニセアメリカタバコガ）（GenBank登録番号ABD76335；配列番号16808）、Macdunnoughia crassisigna（オオキクギンウワバ）（GenBank登録番号EU287451；配列番号16809、配列番号16810）、Pectinophora gossypiella（ワタアカミムシ）（GenBank登録番号GU270322；配列番号14530、配列番号16811）、Tribolium castaneum（コクヌストモドキ）（GenBank登録番号XP_001814566；配列番号16812）、Ctenoplusia agnata（ミツモンキンウワバ）（Argyrogramma agnataとも呼ばれる）、Messour bouvieri（アリ）、Megachile rotundata（モンキヌゲハキリバチ）、Bombus impatiens（マルハナバチ）、Mamestra brassicae（ヨトウガ）、Mayetiola destructor（ヘシアンバエ）、Apis mellifera（セイヨウミツバチ）のいずれかである。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、昆虫から単離されるか、昆虫に由来する。いくつかの実施態様では、昆虫はTrichoplusia ni（AAA87375）である。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、昆虫から単離されるか、昆虫に由来する。いくつかの実施態様では、昆虫はBombyx mori（BAD11135）である。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、甲殻類から単離されるか、甲殻類に由来する。いくつかの実施態様では、甲殻類はDaphnia pulicaria（オオビワミジンコ）（AAM76342、配列番号16813）である。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、脊椎動物から単離されるか、脊椎動物に由来する。いくつかの実施態様では、脊椎動物は、Xenopus tropicalis（ネッタイツメガエル）（GenBank登録番号BAF82026；配列番号14518）、Homo sapiens（ホモ・サピエンス）（GenBank登録番号NP_689808；配列番号16814）、Mus musculus（マウス）（GenBank登録番号NP_741958；配列番号16815）、Macaca fascicularis（カニクイザル）（GenBank登録番号AB179012；配列番号16816、配列番号16817）、Rattus norvegicus（ラット）（GenBank登録番号XP_220453；配列番号16818）、Myotis lucifugus（トビイロホオヒゲコウモリ）のいずれかである。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、尾索類から単離されるか、尾索類に由来する。いくつかの実施態様では、尾索類はCiona intestinalis（カタユウレイボヤ）（GenBank登録番号XP_002123602；配列番号16819）である。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、トランスポゾンを染色体部位内の配列5’-TTAT-3’の位置に挿入する（TTAT標的配列）。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、トランスポゾンを染色体部位内の配列5’-TTAA-3’の位置に挿入する（TTAA標的配列）。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac 様トランスポゾンの標的配列は、5’-CTAA-3’、5’-TTAG-3’、5’-ATAA-3’、5’-TCAA-3’、5’AGTT-3’、5’-ATTA-3’、5’-GTTA-3’、5’-TTGA-3’、5’-TTTA-3’、5’-TTAC-3’、5’-ACTA-3’、5’-AGGG-3’、5’-CTAG-3’、5’-TGAA-3’、5’-AGGT-3’、5’-ATCA-3’、5’-CTCC-3’、5’-TAAA-3’、5’-TCTC-3’、5’TGAA-3’、5’-AAAT-3’、5’-AATC-3’、5’-ACAA-3’、5’-ACAT-3’、5’-ACTC-3’、5’-AGTG-3’、5’-ATAG-3’、5’-CAAA-3’、5’-CACA-3’、5’-CATA-3’、5’-CCAG-3’、5’-CCCA-3’、5’-CGTA-3’、5’-GTCC-3’、5’-TAAG-3’、5’-TCTA-3’、5’-TGAG-3’、5’-TGTT-3’、5’-TTCA-3’5’-TTCT-3’、5’-TTTT-3’を含むか、これら配列からなる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac 様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac 様トランスポザーゼ酵素は、Bombyx moriから単離されるか、Bombyx moriに由来する。piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac 様トランスポザーゼ酵素は、
1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE
61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE
121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD MLQEILTHTN SSIRHRQTKT AAENSSAETS
181 FYMQETTLCE LKALIALLYL AGLIKSNRQS LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLQNN
241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ CCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY
301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FDVVNLEVYA GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR
361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL
421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELSANYNVSR
481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRANKN VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI
541 PTYLRQRIEK QLGEPSPRHV NVPGRYVRCQ DCPYKKDRKT KHSCNACAKP ICMEHAKFLC
601 ENCAELDSSL（配列番号14504）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることができる。
piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素またはPiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE
61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE
121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD MLQEILTHTN SSIRHRQTKT AAENSSAETS
181 FYMQETTLCE LKALIALLYL AGLIKSNRQS LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLQNN
241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ CCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY
301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FYVVNLEVYA GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR
361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL
421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR
481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI
541 PTYLRQRIEK QLGEPSPRHV NVPGRYVRCQ DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC
601 ENCAELDSSL（配列番号14505）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることができる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac 様トランスポザーゼは核局在シグナルに融合される。いくつかの実施態様では、核局在シグナルに融合したpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac 様トランスポザーゼは、
1 atggcaccca aaaagaaacg taaagtgatg gacattgaaa gacaggaaga aagaatcagg
61 gcgatgctcg aagaagaact gagcgactac tccgacgaat cgtcatcaga ggatgaaacc
121 gaccactgta gcgagcatga ggttaactac gacaccgagg aggagagaat cgactctgtg
181 gatgtgccct ccaactcacg ccaagaagag gccaatgcaa ttatcgcaaa cgaatcggac
241 agcgatccag acgatgatct gccactgtcc ctcgtgcgcc agcgggccag cgcttcgaga
301 caagtgtcag gtccattcta cacttcgaag gacggcacta agtggtacaa gaattgccag
361 cgacctaacg tcagactccg ctccgagaat atcgtgaccg aacaggctca ggtcaagaat
421 atcgcccgcg acgcctcgac tgagtacgag tgttggaata tcttcgtgac ttcggacatg
481 ctgcaagaaa ttctgacgca caccaacagc tcgattaggc atcgccagac caagactgca
541 gcggagaact catcggccga aacctccttc tatatgcaag agactactct gtgcgaactg
601 aaggcgctga ttgcactgct gtacttggcc ggcctcatca aatcaaatag gcagagcctc
661 aaagatctct ggagaacgga tggaactgga gtggatatct ttcggacgac tatgagcttg
721 cagcggttcc agtttctgca aaacaatatc agattcgacg acaagtccac ccgggacgaa
781 aggaaacaga ctgacaacat ggctgcgttc cggtcaatat tcgatcagtt tgtgcagtgc
841 tgccaaaacg cttatagccc atcggaattc ctgaccatcg acgaaatgct tctctccttc
901 cgggggcgct gcctgttccg agtgtacatc ccgaacaagc cggctaaata cggaatcaaa
961 atcctggccc tggtggacgc caagaatttc tacgtcgtga atctcgaagt gtacgcagga
1021 aagcaaccgt cgggaccgta cgctgtttcg aaccgcccgt ttgaagtcgt cgagcggctt
1081 attcagccgg tggccagatc ccaccgcaat gttaccttcg acaattggtt caccggctac
1141 gagctgatgc ttcaccttct gaacgagtac cggctcacta gcgtggggac tgtcaggaag
1201 aacaagcggc agatcccaga atccttcatc cgcaccgacc gccagcctaa ctcgtccgtg
1261 ttcggatttc aaaaggatat cacgcttgtc tcgtacgccc ccaagaaaaa caaggtcgtg
1321 gtcgtgatga gcaccatgca tcacgacaac agcatcgacg agtcaaccgg agaaaagcaa
1381 aagcccgaga tgatcacctt ctacaattca actaaggccg gcgtcgacgt cgtggatgaa
1441 ctgtgcgcga actataacgt gtcccggaac tctaagcggt ggcctatgac tctcttctac
1501 ggagtgctga atatggccgc aatcaacgcg tgcatcatct accgcaccaa caagaacgtg
1561 accatcaagc gcaccgagtt catcagatcg ctgggtttga gcatgatcta cgagcacctc
1621 cattcacgga acaagaagaa gaatatccct acttacctga ggcagcgtat cgagaagcag
1681 ttgggagaac caagcccgcg ccacgtgaac gtgccggggc gctacgtgcg gtgccaagat
1741 tgcccgtaca aaaaggaccg caaaaccaaa agatcgtgta acgcgtgcgc caaacctatc
1801 tgcatggagc atgccaaatt tctgtgtgaa aattgtgctg aactcgattc ctccctg（配列番号14629）を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac 様トランスポザーゼは高活性である。高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac 様トランスポザーゼは、その出所となる天然に存在するバリアントよりも活性なトランスポザーゼである。いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac 様トランスポザーゼは、Bombyx moriから単離されるか、Bombyx moriに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac 様トランスポザーゼは、配列14505の高活性バリアントである。いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac 様トランスポザーゼは、
1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE
61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS RQMSGPHYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE
121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD MLQEILTHTN SSIRWRQTKT AAENSSASTS
181 FYMQETTLCE LKALIGLLYI AGLIKSNRQS LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLQNN
241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ SCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY
301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FYVKNLEVYA GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR
361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL
421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR
481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI
541 PTYLRQRIEK QLGEPSPRHV NVPGRYVRCQ DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC
601 ENCAELDSHL（配列番号14576）と少なくとも90％一致する配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac 様トランスポザーゼは配列番号14576を含んでいる。いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac 様トランスポザーゼは、
1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE
61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE
121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD MLQEILTHTN SSIRWRQTKT AAENSSAETS
181 FYMQETTLCE LKALIGLLYI AGLIKSNRQS LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLLNN
241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ SCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY
301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FYVHNLEVYA GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR
361 NVTFDNWFTG YEVMLHLLNE YRLTSVGTVR KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL
421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR
481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI
541 PTYLRQRIEK QLGEPSPRHV NVPGRYVRCQ DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC
601 ENCAHLDS（配列番号14630）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac 様トランスポザーゼは、
1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE
61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE
121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD MLQEILTHTN SSIRWRQTKT AAENSSASTS
181 FYMQETTLCE LKALIGLLYI AGLIKSNRQS LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLLNN
241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ SCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY
301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FYVKNLEVYA GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR
361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL
421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR
481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI
541 PTYLRQRIAM QLGEPSPRHV NVPGRYVRCQ DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC
601 ENCAELDSSL（配列番号14631）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac 様トランスポザーゼは、
1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE
61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE
121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD MLQEILTHTN SSIRWRQTKT AAENSSAETS
181 FYMQETTLCE LKALIGLLYI AGLIKSNRQS LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLLNN
241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ SCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY
301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FYVKNLEVYA GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR
361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR KNKTQIPENF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL
421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELQANYNVSR
481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI
541 PTYLRQRIEK QLGEPSPRHV NVPGRYVRCQ DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC
601 ENCAELDSSL（配列番号14632）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac 様トランスポザーゼは、
1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE
61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE
121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD MLQEILTHTN SSIRWRQTKT AAENSSAETS
181 FYMQETTLCE LKALIGLLYI AGLIKSNRQS LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLQNN
241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ SCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY
301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FYVKNLEVYA GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR
361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL
421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR
481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI
541 PTYLRQRIEK QLGEPSPRHV NVPGRYVRCQ DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC
601 ENCAELDSSL（配列番号14633）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac 様トランスポザーゼは、
1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE
61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE
121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD MLQEILTHTN SSIRHRQTKT AAENSSAETS
181 FYMQETTLCE LKALIALLYL AGLIKSNRQS LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLQNN
241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ CCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY
301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN DYVVNLEVYA GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR
361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL
421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR
481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI
541 PTYLRQRIEK QLGEPSSRHV NVKGRYVRCQ DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC
601 ENCAELDSSL（配列番号14634）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac 様トランスポザーゼは、配列14505のトランスポザーゼよりも活性である。いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac 様トランスポザーゼは、配列14505と少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、またはこれらの数値の間の任意の割合が一致する。
いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac 様トランスポザーゼは、（配列番号14505と比べて）92位、93位、96位、97位、165位、178位、189位、196位、200位、201位、211位、215位、235位、238位、246位、253位、258位、261位、263位、271位、303位、321位、324位、330位、373位、389位、399位、402位、403位、404位、448位、473位、484位、507位、523位、527位、528位、543位、549位、550位、557位、601位、605位、607位、609位、610位から選択された位置、またはこれらの組み合わせの位置にアミノ酸置換を含んでいる。いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、Q92A、V93L、V93M、P96G、F97H、F97C、H165E、H165W、E178S、E178H、C189P、A196G、L200I、A201Q、L211A、W215Y、G219S、Q235Y、Q235G、Q238L、K246I、K253V、M258V、F261L、S263K、C271S、N303R、F321W、F321D、V324K、V324H、A330V、L373C、L373V、V389L、S399N、R402K、T403L、D404Q、D404S、D404M、N441R、G448W、E449A、V469T、C473Q、R484K T507C、G523A、I527M、Y528K Y543I、E549A、K550M、P557S、E601V、E605H、E605W、D607H、S609H、L610Iのいずれかのアミノ酸置換、またはこれらの任意の組み合わせを含んでいる。いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、Q92A、V93L、V93M、P96G、F97H、F97C、H165E、H165W、E178S、E178H、C189P、A196G、L200I、A201Q、L211A、W215Y、G219S、Q235Y、Q235G、Q238L、K246I、K253V、M258V、F261L、S263K、C271S、N303R、F321W、F321D、V324K、V324H、A330V、L373C、L373V、V389L、S399N、R402K、T403L、D404Q、D404S、D404M、N441R、G448W、E449A、V469T、C473Q、R484K T507C、G523A、I527M、Y528K Y543I、E549A、K550M、P557S、E601V、E605H、E605W、D607H、S609H、L610Iのアミノ酸置換を含んでいる。
いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac 様トランスポザーゼは、野生型ではないアミノ酸の1つ以上の置換を含んでおり、野生型アミノ酸に代わるその1つ以上の置換は、（配列番号14505と比べて）E4X、A12X、M13X、L14X、E15X、D20X、E24X、S25X、S26X、S27X、D32X、H33X、E36X、E44X、E45X、E46X、I48X、D49X、R58X、A62X、N63X、A64X、I65X、I66X、N68X、E69X、D71X、S72X、D76X、P79X、R84X、Q85X、A87X、S88X、Q92X、V93X、S94X、G95X、P96X、F97X、Y98X、T99X、I145X、S149X、D150X、L152X、E154X、T157X、N160X、S161X、S162X、H165X、R166X、T168X、K169X、T170X、A171X、E173X、S175X、S176X、E178X、T179X、M183X、Q184X、T186X、T187X、L188X、C189X、L194X、I195X、A196X、L198X、L200X、A201X、L203X、I204X、K205X、A206X、N207X、Q209X、S210X、L211X、K212X、D213X、L214X、W215X、R216X、T217X、G219X、V222X、D223X、I224X、T227X、M229X、Q235X、L237X、Q238X、N239X、N240X、P302X、N303X、P305X、A306X、K307X、Y308X、I310X、K311X、I312X、L313X、A314X、L315X、V316X,D317X、A318X、K319X、N320X、F321X、Y322X、V323X、V324X、L326X、E327X、V328X、A330X、Q333X、P334X、S335X、G336X、P337X、A339X、V340X、S341X、N342X、R343X、P344X、F345X、E346X、V347X、E349X、I352X、Q353X、V355X、A356X、R357X、N361X、D365X、W367X、T369X、G370X、L373X、M374X、L375X、H376X、N379X、E380X、R382X、V386X、V389X、N392X、R394X、Q395X、S399X、F400X、I401X、R402XT403X、D404X、R405X、Q406X、P407X、N408X、S409X、S410X、V411X、F412X、F414X、Q415X、I418X、T419X、L420X、N428XV432X、M434X、D440X、N441X、S442X、I443X、D444X、E445X、G448X、E449X、Q451X、K452X、M455X、I456X、T457X、F458X、S461X、A464X、V466X、Q468X、V469X、E471X、L472X、C473X、A474X、K483X、W485X、T488X、L489X、Y491X、G492X、V493X、M496X、I499X、C502X、I503X、T507X、K509X、N510X、V511X、T512X、I513X、R515X、E517X、S521X、G523X、L524X、S525X、I527X、Y528X、E529X、H532X、S533X、N535X、K536X、K537X、N539X、I540X、T542X、Y543X、Q546X、E549X、K550X、Q551X、G553X、E554X、P555X、S556X、P557X、R558X、H559X、V560X、N561X、V562X、P563X、G564X、R565X、Y566X、V567X、Q570X、D571X、P573X、Y574X、K576X、K581X、S583X、A586X、A588X、E594X、F598X、L599X、E601X、N602X、C603X、A604X、E605X、L606X、D607X、S608X、S609X、L610Xのいずれかの置換を含んでいる。高活性なアミノ酸置換のリストは、アメリカ合衆国特許第10,041,077号に見いだすことができる（その内容の全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac 様トランスポザーゼは、組み込みが不足している。いくつかの実施態様では、組み込みが不足したpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac 様トランスポザーゼは、対応するトランスポゾンを切除できるが切除されたトランスポゾンを対応する野生型トランスポザーゼよりも低頻度で組み込むトランスポザーゼである。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac 様トランスポザーゼは、配列番号14505の組み込み不足バリアントである。
いくつかの実施態様では、切除能力のある組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac 様トランスポザーゼは、野生型ではないアミノ酸の1つ以上の置換を含んでおり、野生型アミノ酸に代わるその1つ以上のアミノ酸置換は、（配列番号14505と比べて）R9X、A12X、M13X、D20X、Y21K、D23X、E24X、S25X、S26X、S27X、E28X、E30X、D32X、H33X、E36X、H37X、A39X、Y41X、D42X、T43X、E44X、E45X、E46X、R47X、D49X、S50X、S55X、A62X、N63X、A64X、I66X、A67X、N68X、E69X、D70X、D71X、S72X、D73X、P74X、D75X、D76X、D77X、I78X、S81X,V83X、R84X、Q85X、A87X、S88X、A89X,S90X,R91X、 Q92X、V93X、S94X、G95X、P96X、F97X、Y98X、T99X、W012X、G103X、Y107X、K108X、L117X、I122X、Q128X、I312X、D135X、S137X、E139X、Y140X、 I145X、S149X、D150X、Q153X、E154X、T157X、S161X、S162X、R164X、H165X、R166X、Q167X、T168X、K169X、T170X、A171X、A172X、 E173X、R174X、S175X、S176X、A177X、E178X、T179X、S180X,Y182X、Q184X、E185X、T187X、L188X、C189X、L194X、I195X、A196X、L198X、L200X、A201X、L203X、I204X、K205X、N207X、Q209X、L211X、D213X、L214X、W215X、R216X、T217X、G219X、T220X、V222X、D223X、I224X、T227X、T228X、F234X、Q235X、L237X、Q238X、N239X、N240X、N303X、K304X、I310X、I312X、L313X、A314X、L315X、V316X,D317X、A318X、K319X、N320X、F321X、Y322X、V323X、V324X、N325X、L326X、E327X、V328X、A330X、G331X、K332X、Q333X、S335X、P337X、P344X、F345X、E349X、H359X、N361X、V362X、D365X、F368X、Y371X、E372X、L373X、H376X、E380X、R382X、R382X、V386X、G387X、T388X、V389X、K391X、N392X、R394X、Q395X、E398X、S399X、F400X、I401X、R402XT403X、D404X、R405X、Q406X、P407X、N408X、S409X、S410X、Q415X,K416X、A424X、K426X、N428X、V430X、V432X、V433X、M434X、D436X、D440X、N441X、S442X、I443X、D444X、E445X、S446X、T447X、G448X、E449X、K450X、Q451X、E454X、M455X、I456X、T457X、F458X、S461X、A464X、V466X、Q468X、V469X、C473X、A474X、N475X、N477X、K483X、R484X、P486X、T488X、L489X、G492X、V493X、M496X、I499X、I503X、Y505X、T507X、N510X、V511X、T512X、I513X、K514X、T516X、E517X、S521X、G523X、L524X、S525X、I527X、Y528X、L531X、H532X、S533X、N535X、I540X、T542X、Y543X、R545X、Q546X、E549X、L552X、G553X、E554X、P555X、S556X、P557X、R558X、H559X、V560X、N561X、V562X、P563X、G564X、V567X、Q570X、D571X、P573X、Y574X、K575X、K576X、N585X、A586X、M593X、K596X、E601X、N602X、A604X、E605X、L606X、D607X、S608X、S609X、L610Xのいずれかの置換を含んでいる。組み込み不足アミノ酸置換のリストは、アメリカ合衆国特許第10,041,077号に見いだすことができる（その内容の全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。
いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac 様トランスポザーゼは、
1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE
61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE
121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD MLQEILTHTN SSIRHRQTKT AAENSSAETS
181 FYMQETTLCE LKALIALLYL AGLIKSNRQS LKDLWRKDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLLNN
241 IRFDDISTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ CCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY
301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FYVVNLEVYA GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR
361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL
421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR
481 NSKKWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN VTIKRTEFIR SLGLSMMYEH LHSRNKKKNI
541 PTYLRQRIEK QLGEPVPRHV NVPGRYVRCQ DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC
601 ENCAELDSSL（配列番号14606）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac 様トランスポザーゼは、
1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE
61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE
121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD MLQEILTHTN SSIRHRQTKT AAENSSAETS
181 FYMQETTLCE LKALIGLLYL AGLIKSNRQS LKDLWRTDGT GVDIFRTTMS LQRFYFLQNN
241 IRFDDKSTLD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ SCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY
301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN FYVVNLEVYA GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR
361 NVTFDNWFTG YELMLHLLNE YRLTSVGTVR KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL
421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR
481 NSKRWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN VTIKRTEFIR SLGLSMIYEH LHSRNKKKNI
541 PTYLRQRIEK QLGEPSPRHV NYPGRYVRCQ DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC
601 VNCAELDSSL（配列番号14607）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac 様トランスポザーゼは、
1 MDIERQEERI RAMLEEELSD YSDESSSEDE TDHCSEHEVN YDTEEERIDS VDVPSNSRQE
61 EANAIIANES DSDPDDDLPL SLVRQRASAS RQVSGPFYTS KDGTKWYKNC QRPNVRLRSE
121 NIVTEQAQVK NIARDASTEY ECWNIFVTSD MLQEILTHTN SSIRHRQTKT AAENSSAETS
181 FYMQETTLCE LKALIALLYL AGLIKSNRQS LKDLWRKDGT GVDIFRTTMS LQRFQFLLNN
241 IRFDDKSTRD ERKQTDNMAA FRSIFDQFVQ CCQNAYSPSE FLTIDEMLLS FRGRCLFRVY
301 IPNKPAKYGI KILALVDAKN DYVVNLEVYA GKQPSGPYAV SNRPFEVVER LIQPVARSHR
361 NVTFDNWFTG YECMLHLLNE YRLTSVGTVR KNKRQIPESF IRTDRQPNSS VFGFQKDITL
421 VSYAPKKNKV VVVMSTMHHD NSIDESTGEK QKPEMITFYN STKAGVDVVD ELCANYNVSR
481 NSKKWPMTLF YGVLNMAAIN ACIIYRTNKN VTIKRTEFIR SLGLSMIKEH LHSRNKKKNI
541 PTYLRQRIEK QLGEPSPRHV NVPGRYVRCQ DCPYKKDRKT KRSCNACAKP ICMEHAKFLC
601 ENCAELDSSL（配列番号14608）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、組み込み不足のトランスポザーゼは、配列番号14608と少なくとも90％一致する配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、Bombyx moriから単離されるか、Bombyx moriに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac 様トランスポゾンは、
1 ttatcccggc gagcatgagg cagggtatct cataccctgg taaaatttta aagttgtgta
61 ttttataaaa ttttcgtctg acaacactag cgcgctcagt agctggaggc aggagcgtgc
121 gggaggggat agtggcgtga tcgcagtgtg gcacgggaca ccggcgagat attcgtgtgc
181 aaacctgttt cgggtatgtt ataccctgcc tcattgttga cgtatttttt ttatgtaatt
241 tttccgatta ttaatttcaa ctgttttatt ggtattttta tgttatccat tgttcttttt
301 ttatgattta ctgtatcggt tgtctttcgt tcctttagtt gagttttttt ttattatttt
361 cagtttttga tcaaa（配列番号14506）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tcatattttt agtttaaaaa aataattata tgttttataa tgaaaagaat ctcattatct
61 ttcagtatta ggttgattta tattccaaag aataatattt ttgttaaatt gttgattttt
121 gtaaacctct aaatgtttgt tgctaaaatt actgtgttta agaaaaagat taataaataa
181 taataatttc ataattaaaa acttctttca ttgaatgcca ttaaataaac cattatttta
241 caaaataaga tcaacataat tgagtaaata ataataagaa caatattata gtacaacaaa
301 atatgggtat gtcataccct gccacattct tgatgtaact ttttttcacc tcatgctcgc
361 cgggttat（配列番号14507）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttatcccggc gagcatgagg cagggtatct cataccctgg taaaatttta aagttgtgta
61 ttttataaaa ttttcgtctg acaacactag cgcgctcagt agctggaggc aggagcgtgc
121 gggaggggat agtggcgtga tcgcagtgtg gcacgggaca ccggcgagat attcgtgtgc
181 aaacctgttt cgggtatgtt ataccctgcc tcat（配列番号14508）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBac（商標）（PB）トランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 taaataataa taatttcata attaaaaact tctttcattg aatgccatta aataaaccat
61 tattttacaa aataagatca acataattga gtaaataata ataagaacaa tattatagta
121 caacaaaata tgggtatgtc ataccctgcc acattcttga tgtaactttt tttcacctca
181 tgctcgccgg gttat（配列番号14509）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14506に対応する5'配列と、配列番号14507に対応する3'配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンの一端は、配列番号14506と少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、またはこれらの数値の間の任意の割合が一致し、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンの他端は、配列番号14507と少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも98％、少なくとも99％、またはこれらの数値の間の任意の割合が一致する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14506と、配列番号14507または配列番号14509を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14508と、配列番号14507または配列番号14509を含んでいる。いくつかの実施態様では、5'トランスポゾン末端と3'トランスポゾン末端は、その端部で、5'-TTAT-3'標的挿入部位に隣接したCCCGGCGAGCATGAGG（配列番号14510）（その2つの末端において向きが逆転している）という16 bpの反復配列を共有している。いくつかの実施態様では、5'トランスポゾン末端は、5'-TTATCCCGGCGAGCATGAGG-3'（配列番号14511）を含む配列で始まり、3'トランスポゾン末端は、この配列の逆転相補配列5'-CCTCATGCTCGCCGGGTTAT-3'（配列番号14512）を含む配列で終わっている。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14506または配列番号14508の少なくとも14個、または16個、または18個、または20個、または30個、または40個の連続したヌクレオチドを含む1つの端部を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14507または配列番号14509の少なくとも14個、または16個、または18個、または20個、または30個、または40個の連続したヌクレオチドを含む1つの端部を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14506または配列番号14508と少なくとも90％一致する1つの端部を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14507または配列番号14509と少なくとも90％一致する1つの端部を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttaacccggc gagcatgagg cagggtatct cataccctgg taaaatttta aagttgtgta
61 ttttataaaa ttttcgtctg acaacactag cgcgctcagt agctggaggc aggagcgtgc
121 gggaggggat agtggcgtga tcgcagtgtg gcacgggaca ccggcgagat attcgtgtgc
181 aaacctgttt cgggtatgtt ataccctgcc tcattgttga cgtatttttt ttatgtaatt
241 tttccgatta ttaatttcaa ctgttttatt ggtattttta tgttatccat tgttcttttt
301 ttatgattta ctgtatcggt tgtctttcgt tcctttagtt gagttttttt ttattatttt
361 cagtttttga tcaaa（配列番号14515）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tcatattttt agtttaaaaa aataattata tgttttataa tgaaaagaat ctcattatct
61 ttcagtatta ggttgattta tattccaaag aataatattt ttgttaaatt gttgattttt
121 gtaaacctct aaatgtttgt tgctaaaatt actgtgttta agaaaaagat taataaataa
181 taataatttc ataattaaaa acttctttca ttgaatgcca ttaaataatt cattatttta
241 caaaataaga tcaacataat tgagtaaata ataataagaa caatattata gtacaacaaa
301 atatgggtat gtcataccct tttttttttt tttttttttt ttttttcggg tagagggccg
361 aacctcctac gaggtccccg cgcaaaaggg gcgcgcgggg tatgtgagac tcaacgatct
421 gcatggtgtt gtgagcagac cgcgggccca aggattttag agcccaccca ctaaacgact
481 cctctgcact cttacacccg acgtccgatc ccctccgagg tcagaacccg gatgaggtag
541 gggggctacc gcggtcaaca ctacaaccag acggcgcggc tcaccccaag gacgcccagc
601 cgacggagcc ttcgaggcga atcgaaggct ctgaaacgtc ggccgtctcg gtacggcagc
661 ccgtcgggcc gcccagacgg tgccgctggt gtcccggaat accccgctgg accagaacca
721 gcctgccggg tcgggacgcg atacaccgtc gaccggtcgc tctaatcact ccacggcagc
781 gcgctagagt gctggta（配列番号14516）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、CCCGGCGAGCATGAGG（配列番号14510）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14510のITR配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、TTATCCCGGCGAGCATGAGG（配列番号14511）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14511からの少なくとも16個の連続したヌクレオチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、CCTCATGCTCGCCGGGTTAT（配列番号14512）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14512からの少なくとも16個の連続したヌクレオチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14511からの少なくとも16個の連続したヌクレオチドを含む1つの端部と、配列番号14512からの少なくとも16個の連続したヌクレオチドを含む1つの端部を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14511と配列番号14512を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、TTAACCCGGCGAGCATGAGG（配列番号14513）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、CCTCATGCTCGCCGGGTTAA（配列番号14514）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14506と配列番号14507を含む端部を持つか、その一方または両方のバリアントで配列番号14506または配列番号14507と少なくとも90％一致する配列を有するものを含む端部を持つことができ、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14504または配列番号14505の配列を持つか、配列番号14504または配列番号14505と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致する配列を持つ。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、一対の逆方向反復の間に挿入された異種ポリヌクレオチドを含んでいて、このトランスポゾンは、配列番号14504または配列番号14505と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致するpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼによる転移が可能である。いくつかの実施態様では、トランスポゾンは2つのトランスポゾン端部を含んでいて、そのそれぞれは、これら2つのトランスポゾン端部の中に配列番号14510を逆向きに含んでいる。いくつかの実施態様では、それぞれの逆方向末端反復（ITR）は、配列番号14510と少なくとも90％一致している。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼにより、標的核酸内の配列5'-TTAT-3'の位置に挿入することができる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンの1つの端部は、配列番号14506からの少なくとも16個の連続したヌクレオチドを含み、トランスポゾンの他方の端部は、配列番号14507からの少なくとも16個の連続したヌクレオチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンの1つの端部は、配列番号14506からの少なくとも17個、または少なくとも18個、または少なくとも19個、または少なくとも20個、または少なくとも22個、または少なくとも25個、または少なくとも30個の連続したヌクレオチドを含み、他方のトランスポゾン端部は、配列番号14507からの少なくとも17個、または少なくとも18個、または少なくとも19個、または少なくとも20個、または少なくとも22個、または少なくとも25個、または少なくとも30個の連続したヌクレオチドを含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14506と配列番号14507に対応するトランスポゾン端部（それぞれの端部がITRを含む）を含み、5'-TTAT-3'に対応する標的配列を有する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、トランスポザーゼをコードする配列（例えば配列番号14505）も含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14506に対応する1つのトランスポゾン端部と、配列番号14516に対応する第2のトランスポゾン端部を含んでいる。配列番号14516は配列番号14507と非常によく似ているが、ITRの少し前に大きな挿入部を有する。これら2つのトランスポゾン端部のためのITR配列は同じ（両方とも配列番号14510と同じ）だが、異なる標的配列を有する。すなわち第2のトランスポゾンは、5'-TTAA-3'に対応する標的配列を有するため、ITR配列が変化しないことが、標的配列特異性を変化させるのに必要であることの証拠を提供する。piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼ（配列番号14504）は、5'-TTAA-3'標的部位と関係していて、5'-TTAT-3'関連トランスポザーゼ（配列番号14505）とは4つのアミノ酸だけが異なっている（D322Y、S473C、A507T、H582R）。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼ（配列番号14504）は、5'-TTAA-3'標的部位と関係しており、5'-TTAT-3'末端を有するトランスポゾン上にあって5'-TTAT-3'に関連するpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼ（配列番号14505）よりも活性が小さい。いくつかの実施態様では、5'-TTAA-3'標的部位を有するpiggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、5'-TTAA-3'標的部位を5'-TTAT-3'標的部位で置換することにより、5'-TTAT-3'標的部位を有するpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼに変換することができる。このようなトランスポゾンを、5'-TTAT-3'標的配列を認識するpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼ（配列番号14504など）とともに、または元々は5'-TTAA-3'トランスポゾンと関係していたトランスポザーゼのバリアントとともに用いることができる。いくつかの実施態様では、5'-TTAA-3' piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼと5'-TTAT-3' piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼの間の大きな類似性は、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼのアミノ酸配列のごく少数の変化が標的配列特異性を変化させることを実証している。いくつかの実施態様では、任意のpiggyBacトランスポゾン-トランスポザーゼ遺伝子輸送系またはpiggyBac様トランスポゾン-トランスポザーゼ遺伝子輸送系を改変して、その中の5'-TTAA-3'標的配列を5'-TTAT-3'標的配列で置換し、ITRは同じままにし、トランスポザーゼを、元のpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼにするか、低レベルの突然変異誘発を利用して変異をトランスポザーゼの中に導入したことによって生じたバリアントにする。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾン-トランスポザーゼ輸送系またはpiggyBac様トランスポゾン-トランスポザーゼ輸送系は、5'-TTAT-3'活性なpiggyBacトランスポゾン-トランスポザーゼ遺伝子輸送系またはpiggyBac様トランスポゾン-トランスポザーゼ遺伝子輸送系を改変して、その中の5'-TTAT-3'標的配列を5'-TTAA-3'標的配列で置換し、ITRは同じままにし、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼを元のトランスポザーゼまたはそのバリアントにすることによって形成できる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、Bombyx moriから単離されるか、Bombyx moriに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac 様トランスポゾンは、
1 cccggcgagc atgaggcagg gtatctcata ccctggtaaa attttaaagt tgtgtatttt
61 ataaaatttt cgtctgacaa cactagcgcg ctcagtagct ggaggcagga gcgtgcggga
121 ggggatagtg gcgtgatcgc agtgtggcac gggacaccgg cgagatattc gtgtgcaaac
181 ctgtttcggg tatgttatac cctgcctcat tgttgacgta t（配列番号14577）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tttaagaaaa agattaataa ataataataa tttcataatt aaaaacttct ttcattgaat
61 gccattaaat aaaccattat tttacaaaat aagatcaaca taattgagta aataataata
121 agaacaatat tatagtacaa caaaatatgg gtatgtcata ccctgccaca ttcttgatgt
181 aacttttttt cacctcatgc tcgccggg（配列番号14578）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、トランスポゾンは、配列番号14577からの少なくとも16個の連続した塩基と、配列番号14578からの少なくとも16個の連続した塩基と、CCCGGCGAGCATGAGG（配列番号14510）と少なくとも87％一致する逆方向末端反復を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 cccggcgagc atgaggcagg gtatctcata ccctggtaaa attttaaagt tgtgtatttt
61 ataaaatttt cgtctgacaa cactagcgcg ctcagtagct ggaggcagga gcgtgcggga
121 ggggatagtg gcgtgatcgc agtgtggcac gggacaccgg cgagatattc gtgtgcaaac
181 ctgtttcggg tatgttatac cctgcctcat tgttgacgta ttttttttat gtaatttttc
241 cgattattaa tttcaactgt tttattggta tttttatgtt atccattgtt ctttttttat
301 gatttactgt atcggttgtc tttcgttcct ttagttgagt ttttttttat tattttcagt
361 ttttgatcaa a（配列番号14595）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tcatattttt agtttaaaaa aataattata tgttttataa tgaaaagaat ctcattatct
61 ttcagtatta ggttgattta tattccaaag aataatattt ttgttaaatt gttgattttt
121 gtaaacctct aaatgtttgt tgctaaaatt actgtgttta agaaaaagat taataaataa
181 taataatttc ataattaaaa acttctttca ttgaatgcca ttaaataaac cattatttta
241 caaaataaga tcaacataat tgagtaaata ataataagaa caatattata gtacaacaaa
301 atatgggtat gtcataccct gccacattct tgatgtaact ttttttcacc tcatgctcgc
361 cggg（配列番号14596）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14595と配列番号14596を含んでいて、配列番号14505のpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼによって転移される。いくつかの実施態様では、配列番号14595と配列番号14596のITRは5'-TTAA-3'配列に隣接していない。いくつかの実施態様では、配列番号14595と配列番号14596のITRは5'-TTAT-3'配列に隣接している。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 cccggcgagc atgaggcagg gtatctcata ccctggtaaa attttaaagt tgtgtatttt
61 ataaaatttt cgtctgacaa cactagcgcg ctcagtagct ggaggcagga gcgtgcggga
121 ggggatagtg gcgtgatcgc agtgtggcac gggacaccgg cgagatattc gtgtgcaaac
181 ctgtttcggg tatgttatac cctgcctcat tgttgacgta ttttttttat gtaatttttc
241 cgattattaa tttcaactgt tttattggta tttttatgtt atccattgtt ctttttttat
301 g （配列番号14597）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 cagggtatct cataccctgg taaaatttta aagttgtgta ttttataaaa ttttcgtctg
61 acaacactag cgcgctcagt agctggaggc aggagcgtgc gggaggggat agtggcgtga
121 tcgcagtgtg gcacgggaca ccggcgagat attcgtgtgc aaacctgttt cgggtatgtt
181 ataccctgcc tcattgttga cgtatttttt ttatgtaatt tttccgatta ttaatttcaa
241 ctgttttatt ggtattttta tgttatccat tgttcttttt ttatg（配列番号14598）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 cagggtatct cataccctgg taaaatttta aagttgtgta ttttataaaa ttttcgtctg
61 acaacactag cgcgctcagt agctggaggc aggagcgtgc gggaggggat agtggcgtga
121 tcgcagtgtg gcacgggaca ccggcgagat attcgtgtgc aaacctgttt cgggtatgtt
181 ataccctgcc tcattgttga cgtat（配列番号14599）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンの5'末端は、配列番号14577、配列番号14595、配列番号14597～14599いずれかの配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンの5'末端の前に5'標的配列がある。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tcatattttt agtttaaaaa aataattata tgttttataa tgaaaagaat ctcattatct
61 ttcagtatta ggttgattta tattccaaag aataatattt ttgttaaatt gttgattttt
121 gtaaacctct aaatgtttgt tgctaaaatt actgtgttta agaaaaagat taataaataa
181 taataatttc ataattaaaa acttctttca ttgaatgcca ttaaataaac cattatttta
241 caaaataaga tcaacataat tgagtaaata ataataagaa caatattata gtacaacaaa
301 atatgggtat gtcataccct gccacattct tgatgtaact ttttttcacc tcatgctcgc
361 cggg（配列番号14600）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tttaagaaaa agattaataa ataataataa tttcataatt aaaaacttct ttcattgaat
61 gccattaaat aaaccattat tttacaaaat aagatcaaca taattgagta aataataata
121 agaacaatat tatagtacaa caaaatatgg gtatgtcata ccctgccaca ttcttgatgt
181 aacttttttt ca（配列番号14601）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 cccggcgagc atgaggcagg gtatctcata ccctggtaaa attttaaagt tgtgtatttt
61 ataaaatttt cgtctgacaa cactagcgcg ctcagtagct ggaggcagga gcgtgcggga
121 ggggatagtg gcgtgatcgc agtgtggcac gggacaccgg cgagatattc gtgtgcaaac
181 ctgtttcggg tatgttatac cctgcctcat tgttgacgta ttttttttat gtaatttttc
241 cgattattaa tttcaactgt tttattggta tttttatgtt atccattgtt ctttttttat
301 gatttactgt atcggttgtc tttcgttcct ttagttgagt ttttttttat tattttcagt
361 ttttgatcaa a（配列番号14602）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンの3'末端は、配列番号14578、配列番号14596、配列番号14600～14601いずれかの配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンの3'末端の後に3'標的配列が続く。いくつかの実施態様では、トランスポゾンは、配列番号14505のトランスポザーゼによって転移される。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンの5'末端と3'末端は、標的配列に隣接している反対方向の配列番号14510の16 bpの反復配列を共有している。いくつかの実施態様では、トランスポゾンの5'末端は配列番号14510で始まり、トランスポゾンの3'末端は配列番号14510の逆相補的配列である5’-CCTCATGCTCGCCGGG-3’（配列番号14603）で終わる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14510または配列番号14603と少なくとも93％、少なくとも87％、少なくとも81％、またはこれらの数値の間の任意の割合が一致するITRを含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、標的配列と、その後に続く、配列番号14577、14595、14597のいずれかから選択された配列を含むトランスポゾンの5'末端と、配列番号14578または14596を含むトランスポゾンの3'末端と、その後に続く標的配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14577と少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、またはこれらの数値の間の任意の割合が一致する配列を含む1つの端部と、配列番号14578と少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、またはこれらの数値の間の任意の割合が一致する配列を含む1つの端部を含んでいる。いくつかの実施態様では、1つのトランスポゾン端部は、配列番号14577からの少なくとも14個、または少なくとも16個、または少なくとも18個、または少なくとも20個の連続した塩基を含み、1つのトランスポゾン端部は、配列番号14578からの少なくとも14個、または少なくとも16個、または少なくとも18個、または少なくとも20個の連続した塩基を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは2つのトランスポゾン端部を含んでおり、それぞれのトランスポゾン端部は、配列番号14510と少なくとも81％、少なくとも87％、少なくとも93％、またはこれらの数値の間の任意の割合が一致する配列を、これら2つのトランスポゾン端部の中に逆向きに含んでいる。1つの端部は、配列番号14599からの少なくとも14個、または少なくとも16個、または少なくとも18個、または少なくとも20個の連続した塩基をさらに含むことができ、他方の端部は、配列番号14601からの少なくとも14個、または少なくとも16個、または少なくとも18個、または少なくとも20個の連続した塩基をさらに含むことができる。piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14505のトランスポザーゼによって転移することができ、このトランスポザーゼは場合によっては核局在シグナルに融合させることができる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14595と配列番号14596を含み、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14504または配列番号14505を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14597と配列番号14596を含み、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14504または配列番号14505を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14595と配列番号14578を含み、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14504または配列番号14505を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14602と配列番号14600を含み、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14504または配列番号14505を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、ATGAGGCAGGGTAT（配列番号14614）、ATACCCTGCCTCAT（配列番号14615）、GGCA
GGGTAT（配列番号14616）、ATACCCTGCC（配列番号14617）、TAAAATTTTA（配列番号14618）、ATTTTATAAAAT（配列番号14619）、TCATACCCTG（配列番号14620）、TAA
ATAATAATAA（配列番号14621）から選択された1つ、または2つ、または3つ、または4つ、または5つ、または6つ、または7つの配列を含む5'末端を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14617、配列番号14620、配列番号14621から選択された1つ、または2つ、または3つの配列を含む3'末端を含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、Xenopus tropicalisから単離されるか、Xenopus tropicalisに由来する。piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLPRY ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
181 SLESYWDTTT VLSIPVFSAT MSRNRYQLLL RFLHFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
241 SLSERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLDT
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RAWYKKVGIY LIQMALRNSY
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCFKPCF EIYHTQLHY（配列番号14517）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることができる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14517の高活性バリアントである。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14517の組み込み不足バリアントである。piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MAKRFYSAEE AAAHCMAPSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLPRY ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
181 SLESYWNTTT VLSIPVFSAT MSRNRYQLLL RFLHFNNNAT AVPPDQPDHD RLHKLRPLID
241 SLSERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLR FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLDT
361 PACGTINRTR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT SAWYKKVGIY LIQMALRNSY
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMLP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCFKPCF EIYHTQLHY（配列番号14518）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることができる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、Xenopus tropicalisから単離されるか、Xenopus tropicalisに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼである。いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、
1 MAKRFYSAEE AAAHCSASSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLTRG ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
181 SIESYWDTTT VLSIPVFGAT MSRNRYQLLL RFLHFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
241 SLSERFANVY TPCQNICIDE SLMLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSTGYTSYF
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLNT
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RHWYKKVGIY LIQMALRNSY
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPD SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCRKPCF EIYHTQLHY（配列番号14572）と少なくとも90％一致する配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼである。高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、その出所である天然に存在するバリアントよりも活性なトランスポザーゼである。いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14517のトランスポザーゼよりも活性である。いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、
1 MAKRFYSAEE AAAHCSASSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLTRG ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
181 SIESYWDTTT VLSIPVFGAT MSRNRYQLLL RFLHFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
241 SLSERFANVY TPCQNICIDE SLMLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSTGYTSYF
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLNT
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RHWYKKVGIY LIQMALRNSY
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPD SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCRKPCF EIYHTQLHY（配列番号14572）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、
1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLTRY ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
181 SLESYWDTTT VLSIPVFSAT MSRNRYQLLL RFLHFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
241 SLSERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLNT
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RHWYKKVGIY LIQMALRNSY
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCRKPCF EIYHTQLHY（配列番号14624）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、
1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLPRY ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
181 SLESYWDTTT VLKIPVFSAT MSRNRYQLLL RFLHFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
241 SLSERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLNT
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RHWYKKVGIY LIQMALRNSY
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCFKPCF EIYHTQLHY（配列番号14625）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、
1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EQTSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLTRY ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
181 SIESYWDTTT VLSIPVFGAT MSRNRYQLLL RFLHFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
241 SLSERFANVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLNT
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
421 QRVGRKPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RHWYKKVGIY LIQMALRNSY
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCRKPCF EIYHTQLHY（配列番号14627）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、
1 MAKRFYSAEE AAAHCSASSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLTRG ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
181 SLESYWDTTT VLSIPVFGAT MSRNRYQLLL RFLHFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
241 SLSERFANVY TPCQNICIDE SLMLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSTGYTSYF
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLNT
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RHWYKKVGIY LIQMALRNSY
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCRKPCF EIYHTQLHY（配列番号14628）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、
1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLTRY ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
181 SLESYWDTTT VLSIPVFGAT MSRNRYQLLL RFLHFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
241 SLSERFANVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLNT
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RHWYKKVGIY LIQMALRNSY
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCRKPCF EIYHTQLHY（配列番号16820）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、（配列番号14517と比べて）6位、7位、16位、19位、20位、21位、22位、23位、24位、26位、28位、31位、34位、67位、73位、76位、77位、88位、91位、141位、145位、146位、148位、150位、157位、162位、179位、182位、189位、192位、193位、196位、198位、200位、210位、212位、218位、248位、263位、270位、294位、297位、308位、310位、333位、336位、354位、357位、358位、359位、377位、423位、426位、428位、438位、447位、450位、462位、469位、472位、498位、502位、517位、520位、523位、533位、534位、576位、577位、582位、583位、587位のアミノ酸から選択された位置にアミノ酸置換を含んでいる。いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、（配列番号14517と比べて）Y6C、S7G、M16S、S19G、S20Q、S20G、S20D、E21D、E22Q、F23T、F23P、S24Y、S26V、S28Q、V31K、A34E、L67A、G73H、A76V、D77N、P88A、N91D、Yl41Q、Y141A、N145E、N145V、P146T、P146V、P146K、P148T、P148H、Y150G、Y150S、Y150C、H157Y、A162C、A179K、L182I、L182V、T189G、L192H、S193N、S193K、V196I、S198G、T200W、L210H、F212N、N218E、A248N、L263M、Q270L、S294T、T297M、S308R、L310R、L333M、Q336M、A354H、C357V、L358F、D359N、L377I、V 423H、P426K、K428R、S438A、T447G、T447A、L450V、A462H、A462Q、I469V、I472L、Q498M、L502V、E5171、P520D、P520G、N523S、I533E、D534A、F576R、F576E、K577I、I582R、Y583F、L587Y、L587Wのいずれかのアミノ酸置換、またはこれらの任意の組み合わせを含んでおり、その組み合わせには、これら変異の少なくとも1つ、または2つ、または3つ、または4つ、または5つ、または6つ、または7つ、または8つ、または9つ、または10個、またはすべてが含まれる。
いくつかの実施態様では、高活性なpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、野生型ではないアミノ酸の1つ以上の置換を含んでおり、野生型アミノ酸に代わるその1つ以上の置換は、（配列番号14517と比べて）A2X、K3X、R4X、F5X、Y6X、S7X、A11X、A13X、C15X、M16X、A17X、S18X、S19X、S20X、E21X、E22X、F23X、S24X、G25X、26X、D27X、S28X、E29X、E42X、E43X、S44X、C46X、S47X、S48X、S49X、T50X、V51X、S52X、A53X、L54X、E55X、E56X、P57X、M58X、E59X、E62X、D63X、V64X、D65X、D66X、L67X、E68X、D69X、Q70X、E71X、A72X、G73X、D74X、R75X、A76X、D77X、A78X、A79X、A80X、G81X、G82X、E83X、P84X、A85X、W86X、G87X、P88X、P89X、C90X、N91X、F92X、P93X、E95X、I96X、P97X、P98X、F99X、T100X、T101X、P103X、G104X、V105X、K106X、V107X、D108X、T109X、N111X、P114X、I115X、N116X、F117X、F118X、Q119X、M122X、T123X、E124X、A125X、I126X、L127X、Q128X、D129X、M130X、L132X、Y133X、V126X、Y127X、A138X、E139X、Q140X、Y141X、L142X、Q144X、N145X、P146X、L147X、P148X、Y150X、A151X、A155X、H157X、P158X 、I161X、A162X、V168X、T171X、L172X、A173X、M174X、I177X、A179X、L182X、D187X、T188X、T189X、T190X、L192X、S193X、I194X、P195X、V196X、S198X、A199X、T200X、S202X、L208X、L209X、L210X、R211X、F212X、F215X、N217X、N218X、A219X、T220X、A221X、V222X、P224X、D225X、Q226X、P227X、H229X、R231X、H233X、L235X、P237X、I239X、D240X、L242X、S243X、E244X、R244X、F246X、A247X、A248X、V249X、Y250X、T251X、P252X、C253X、Q254X、I256X、C257X、I258X、D259X、E260X、S261X、L262X、L263X、L264X、F265X、K266X、G267X、R268X、L269X、Q270X、F271X、R272X、Q273X、Y274X、I275X、P276X、S277X、K278X、R279X、A280X、R281X、Y282X、G283X、I284X、K285X、F286X、Y287X、K288X、L289X、C290X、E291X、S292X、S293X、S294X、G295X、Y296X、T297X、S298X、Y299X、F300X、E304X、L310X、P313X、G314X、P316X、P317X、D318X、L319X、T320X、V321X、K324X、E328X、I330X、S331X、P332X、L333X、L334X、G335X、Q336X、F338X、L340X、D343X、N344X、F345X、Y346X、S347X、L351X、F352X、A354X、L355X、Y356X、C357X、L358X、D359X、T360X、R422X、Y423X、G424X、P426X、K428X、N429X、K430X、P431X、L432X、S434X、K435X、E436X、S438X、K439X、Y440X、G443X、R446X、T447X、L450X、Q451X、N455X、T460X、R461X、A462X、K465X、V467X、G468X、I469X、Y470X、L471X、I472X、M474X、A475X、L476X、R477X、S479X、Y480X、V482X、Y483X、K484X、A485X、A486X、V487X、P488X、P490X、K491X、S493X、Y494X、Y495X、K496X、Y497T、Q498X、L499X、Q500X、I501X、L502X、P503X、A504X、L505X、L506X、F507X、G508X、G509X、V510X、E511X、E512X、Q513X、T514X、V515X、E517X、M518X、P519X、P520X、S521X、D522X、N523X、V524X、A525X、L527X、I528X、K530X、H531X、F532X、I533X、D534X、T535X、L536X、T539X、P540X、Q546X、K550X、R553X、K554X、R555X、G556X、I557X、R558X、R559X、D560X、T561X、Y564X、P566X、K567X、P569X、R570X、N571X、L574X、C575X、F576X、K577X、P578X、F580X、E581X、I582X、Y583X、T585X、Q586X、L587X、H588X、Y589Xのいずれかの置換を含んでいる。高活性アミノ酸置換のリストは、アメリカ合衆国特許第10,041,077号に見いだすことができる（その内容の全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、組み込み不足である。いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、対応するトランスポゾンを切除できるがその切除されたトランスポゾンを対応する天然に存在するトランスポザーゼよりも低頻度で組み込むトランスポザーゼである。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14517の組み込み不足バリアントである。いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14517と比べて不足している。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、切除に関して活性だが、組み込みが不足している。いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、
1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
61 DEDVDDLEDQ EAGDRVDAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNPLPRY ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
181 SLESYWDTTT VLSIPVFSAT MSRNRYQLLL KFLHFNNEAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
241 SLSERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLDT
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RAWYKKVGIY LIQMALRNSY
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCFKPCF EIYHTQLHYG RR（配列番号14605）の配列と少なくとも90％一致する配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、
1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQVPLPRY ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
181 SLESYWDTTT VLNIPVFSAT MSRNRYQLLL RFLEFNNEAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
241 SLSERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLDT
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RAWYKKVGIY LIQMALRNSY
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCFKPCF EIYHTQLHY（配列番号14604）の配列と少なくとも90％一致する配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、
1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQNVLPRY ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
181 SLESYWDTTT VLSIPVFSAT MSRNRYQLLL RFLHFNNDAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
241 SLTERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLDT
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RAWYKKVGIY LIQMALRNSY
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCFKPCF EIYHTQLHYG RR（配列番号14611）の配列と少なくとも90％一致する配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14611を含んでいる。いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、
1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAP GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQVPLPRY ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
181 SLESYWDTTT VLSIPVFSAT MSRNRYQLLL RFLHFNNEAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
241 SLSERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLDT
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RAWYKKVGIY LIQMALRNSY
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCFKPCF EIYHTQLHYG RR（配列番号14612）の配列と少なくとも90％一致する配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14612を含んでいる。いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、
1 MAKRFYSAEE AAAHCMASSS EEFSGSDSEY VPPASESDSS TEESWCSSST VSALEEPMEV
61 DEDVDDLEDQ EAGDRADAAA GGEPAWGPPC NFPPEIPPFT TVPGVKVDTS NFEPINFFQL
121 FMTEAILQDM VLYTNVYAEQ YLTQVPLPRY ARAHAWHPTD IAEMKRFVGL TLAMGLIKAN
181 SLESYWDTTT VLNIPVFSAT MSRNRYQLLL RFLEFNNNAT AVPPDQPGHD RLHKLRPLID
241 SLSERFAAVY TPCQNICIDE SLLLFKGRLQ FRQYIPSKRA RYGIKFYKLC ESSSGYTSYF
301 LIYEGKDSKL DPPGCPPDLT VSGKIVWELI SPLLGQGFHL YVDNFYSSIP LFTALYCLDT
361 PACGTINRNR KGLPRALLDK KLNRGETYAL RKNELLAIKF FDKKNVFMLT SIHDESVIRE
421 QRVGRPPKNK PLCSKEYSKY MGGVDRTDQL QHYYNATRKT RAWYKKVGIY LIQMALRNSY
481 IVYKAAVPGP KLSYYKYQLQ ILPALLFGGV EEQTVPEMPP SDNVARLIGK HFIDTLPPTP
541 GKQRPQKGCK VCRKRGIRRD TRYYCPKCPR NPGLCFKPCF EIYHTQLHYG RR（配列番号14613）の配列と少なくとも90％一致する配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14613を含んでいる。いくつかの実施態様では、組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼはアミノ酸置換を含んでおり、（配列番号14517と比べて）218位のAsnがGluまたはAspで置換されている（N218D またはN218E）。
いくつかの実施態様では、切除能力のある組み込み不足のpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、野生型ではないアミノ酸の1つ以上の置換を含んでおり、野生型アミノ酸に代わるその1つ以上の置換は、（配列番号14517と比べて）A2X、K3X、R4X、F5X、Y6X、S7X、A8X、E9X、E10X、A11X、A12X、A13X、H14X、C15X、M16X、A17X、S18X、S19X、S20X、E21X、E22X、F23X、S24X、G25X、26X、D27X、S28X、E29X、V31X、P32X、P33X、A34X、S35X、E36X、S37X、D38X、S39X、S40X、T41X、E42X、E43X、S44X、W45X、C46X、S47X、S48X、S49X、T50X、V51X、S52X、A53X、L54X、E55X、E56X、P57X、M58X、E59X、V60X、M122X、T123X、E124X、A125X、L127X、Q128X、D129X、L132X、Y133X、V126X、Y127X、E139X、Q140X、Y141X、L142X、T143X、Q144X、N145X、P146X、L147X、P148X、R149X、Y150X、A151X、H154X、H157X、P158X、T159X、D160X、I161X、A162X、E163X、M164X、K165X、R166X、F167X、V168X、G169X、L170X、T171X、L172X、A173X、M174X、G175X、L176X、I177X、K178X、A179X、N180X、S181X、L182X、S184X、Y185X、D187X、T188X、T189X、T190X、V191X、L192X、S193X、I194X、P195X、V196X、F197X、S198X、A199X、T200X、M201X、S202X、R203X、N204X、R205X、Y206X、Q207X、L208X、L209X、L210X、R211X、F212X、L213X、H241X、F215X、N216X、N217X、N218X、A219X、T220X、A221X、V222X、P223X、P224X、D225X、Q226X、P227X、G228X、H229X、D230X、R231X、H233X、K234X、L235X、R236X、L238X、I239X、D240X、L242X、S243X、E244X、R244X、F246X、A247X、A248X、V249X、Y250X、T251X、P252X、C253X、Q254X、N255X、I256X、C257X、I258X、D259X、E260X、S261X、L262X、L263X、L264X、F265X、K266X、G267X、R268X、L269X、Q270X、F271X、R272X、Q273X、Y274X、I275X、P276X、S277X、K278X、R279X、A280X、R281X、Y282X、G283X、I284X、K285X、F286X、Y287X、K288X、L289X、C290X、E291X、S292X、S293X、S294X、G295X、Y296X、T297X、S298X、Y299X、F300X、I302X、E304X、G305X,K306X、D307X、S308X、K309X、 L310X、D311X、P312X、P313X、G314X、C315X、P316X、P317X、D318X、L319X、T320X、V321X、S322X、G323X、K324X、I325X、V326X、W327X、E328X、L329X、I330X、S331X、P332X、L333X、L334X、G335X、Q336X、F338X、H339X、L340X、V342X、N344X、F345X、Y346X、S347X、S348X、I349X、L351X、T353X、A354X、Y356X、C357X、L358X、D359X、T360X、P361X、A362X、C363X、G364X、I366X、N367X、R368X、D369X、K371X、G372X、L373X、R375X、A376X、L377X、L378X、D379X、K380X、K381X、L382X、N383X、R384X、G385X、T387X、Y388X、A389X、L390X、K392X、N393X、E394X、A397X、K399X、F400X、F401X、D402X、N405X、L406X、L409X、R422X、Y423X、G424X、E425X、P426X、K428X、N429X、K430X、P431X、L432X、S434X、K435X、E436X、S438X、K439X、Y440X、G442X、G443X、V444X、R446X、T447X、L450X、Q451X、H452X、N455X、T457X、R458X、T460X、R461X、A462X、Y464X、K465X、V467X、G468X、I469X、L471X、I472X、Q473X、M474X、L476X、R477X、N478X、S479X、Y480X、V482X、Y483X、K484X、A485X、A486X、V487X、P488X、G489X、P490X、K491X、L492X、S493X、Y494X、Y495X、K496X、Q498X、L499X、Q500X、I501X、L502X、P503X、A504X、L505X、L506X、F507X、G508X、G509X、V510X、E511X、E512X、Q513X、T514X、V515X、E517X、M518X、P519X、P520X、S521X、D522X、N523X、V524X、A525X、L527X、I528X、G529X、K530X、F532X、I533X、D534X、T535X、L536X、P537X、P538X、T539X、P540X、G541X、F542X、Q543X、R544X、P545X、Q546X、K547X、G548X、C549X、K550X、V551X、C552X、R553X、K554X、R555X、G556X、I557X、R558X、R559X、D560X、T561X、R562X、Y563X、Y564X、C565X、P566X、K567X、C568X、P569X、R570X、N571X、P572X、G573X、L574X、C575X、F576X、K577X、P578X、C579X、F580X、E581X、I582X、Y583X、H584X、T585X、Q586X、L587X、H588X、Y589Xのいずれかの置換を含んでいる。切除能力のある組み込み不足のアミノ酸置換のリストは、アメリカ合衆国特許第10,041,077号に見いだすことができる（その内容の全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは核局在シグナルに融合される。いくつかの実施態様では、配列番号14517または配列番号14518が核局在シグナルに融合される。いくつかの実施態様では、核局在シグナルに融合されるpiggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼのアミノ酸置換は、
1 atggcaccca aaaagaaacg taaagtgatg gccaaaagat tttacagcgc cgaagaagca
61 gcagcacatt gcatggcatc gtcatccgaa gaattctcgg ggagcgattc cgaatatgtc
121 ccaccggcct cggaaagcga ttcgagcact gaggagtcgt ggtgttcctc ctcaactgtc
181 tcggctcttg aggagccgat ggaagtggat gaggatgtgg acgacttgga ggaccaggaa
241 gccggagaca gggccgacgc tgccgcggga ggggagccgg cgtggggacc tccatgcaat
301 tttcctcccg aaatcccacc gttcactact gtgccgggag tgaaggtcga cacgtccaac
361 ttcgaaccga tcaatttctt tcaactcttc atgactgaag cgatcctgca agatatggtg
421 ctctacacta atgtgtacgc cgagcagtac ctgactcaaa acccgctgcc tcgctacgcg
481 agagcgcatg cgtggcaccc gaccgatatc gcggagatga agcggttcgt gggactgacc
541 ctcgcaatgg gcctgatcaa ggccaacagc ctcgagtcat actgggatac cacgactgtg
601 cttagcattc cggtgttctc cgctaccatg tcccgtaacc gctaccaact cctgctgcgg
661 ttcctccact tcaacaacaa tgcgaccgct gtgccacctg accagccagg acacgacaga
721 ctccacaagc tgcggccatt gatcgactcg ctgagcgagc gattcgccgc ggtgtacacc
781 ccttgccaaa acatttgcat cgacgagtcg cttctgctgt ttaaaggccg gcttcagttc
841 cgccagtaca tcccatcgaa gcgcgctcgc tatggtatca aattctacaa actctgcgag
901 tcgtccagcg gctacacgtc atacttcttg atctacgagg ggaaggactc taagctggac
961 ccaccggggt gtccaccgga tcttactgtc tccggaaaaa tcgtgtggga actcatctca
1021 cctctcctcg gacaaggctt tcatctctac gtcgacaatt tctactcatc gatccctctg
1081 ttcaccgccc tctactgcct ggatactcca gcctgtggga ccattaacag aaaccggaag
1141 ggtctgccga gagcactgct ggataagaag ttgaacaggg gagagactta cgcgctgaga
1201 aagaacgaac tcctcgccat caaattcttc gacaagaaaa atgtgtttat gctcacctcc
1261 atccacgacg aatccgtcat ccgggagcag cgcgtgggca ggccgccgaa aaacaagccg
1321 ctgtgctcta aggaatactc caagtacatg gggggtgtcg accggaccga tcagctgcag
1381 cattactaca acgccactag aaagacccgg gcctggtaca agaaagtcgg catctacctg
1441 atccaaatgg cactgaggaa ttcgtatatt gtctacaagg ctgccgttcc gggcccgaaa
1501 ctgtcatact acaagtacca gcttcaaatc ctgccggcgc tgctgttcgg tggagtggaa
1561 gaacagactg tgcccgagat gccgccatcc gacaacgtgg cccggttgat cggaaagcac
1621 ttcattgata ccctgcctcc gacgcctgga aagcagcggc cacagaaggg atgcaaagtt
1681 tgccgcaagc gcggaatacg gcgcgatacc cgctactatt gcccgaagtg cccccgcaat
1741 cccggactgt gtttcaagcc ctgttttgaa atctaccaca cccagttgca ttac（配列番号14626）を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、Xenopus tropicalisから単離されるか、Xenopus tropicalisに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttaacctttt tactgccaat gacgcatggg atacgtcgtg gcagtaaaag ggcttaaatg
61 ccaacgacgc gtcccatacg ttgttggcat tttaagtctt ctctctgcag cggcagcatg
121 tgccgccgct gcagagagtt tctagcgatg acagcccctc tgggcaacga gccggggggg
181 ctgtc（配列番号14519）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tttgcatttt tagacattta gaagcctata tcttgttaca gaattggaat tacacaaaaa
61 ttctaccata ttttgaaagc ttaggttgtt ctgaaaaaaa caatatattg ttttcctggg
121 taaactaaaa gtcccctcga ggaaaggccc ctaaagtgaa acagtgcaaa acgttcaaaa
181 actgtctggc aatacaagtt ccactttgac caaaacggct ggcagtaaaa gggttaa（配列番号14520）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14519と配列番号14520を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttaacccttt gcctgccaat cacgcatggg atacgtcgtg gcagtaaaag ggcttaaatg
61 ccaacgacgc gtcccatacg ttgttggcat tttaagtctt ctctctgcag cggcagcatg
121 tgccgccgct gcagagagtt tctagcgatg acagcccctc tgggcaacga gccggggggg
181 ctgtc（配列番号14521）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tttgcatttt tagacattta gaagcctata tcttgttaca gaattggaat tacacaaaaa
61 ttctaccata ttttgaaagc ttaggttgtt ctgaaaaaaa caatatattg ttttcctggg
121 taaactaaaa gtcccctcga ggaaaggccc ctaaagtgaa acagtgcaaa acgttcaaaa
181 actgtctggc aatacaagtt ccactttggg acaaatcggc tggcagtgaa agggttaa（配列番号14522）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttaacctttt tactgccaat gacgcatggg atacgtcgtg gcagtaaaag ggcttaaatg
61 ccaacgacgc gtcccatacg ttgttggcat tttaattctt ctctctgcag cggcagcatg
121 tgccgccgct gcagagagtt tctagcgatg acagcccctc tgggcaacga gccggggggg
181 ctgtc（配列番号14523）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14520と、配列番号14519、配列番号14521、配列番号14523のいずれかとを含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14522と、配列番号14519、配列番号14521、配列番号14523のいずれかとを含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14519、配列番号14521、配列番号14523のいずれかからの少なくとも14個、または16個、または18個、または20個、または30個、または40個の連続したヌクレオチドを含む1つの端部を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14520または配列番号14522からの少なくとも14個、または16個、または18個、または20個、または30個、または40個の連続したヌクレオチドを含む1つの端部を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14519、配列番号14521、配列番号14523のいずれかと少なくとも90％一致する1つの端部を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14520または配列番号14522と少なくとも90％一致する1つの端部を含んでいる。一実施態様では、一方のトランスポゾン端部は配列番号14519と少なくとも90％一致し、他方のトランスポゾン端部は配列番号14520と少なくとも90％一致している。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、TTAACCTTTTTACTGCCA（配列番号14524）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、TTAACCCTTTGCCTGCCA（配列番号14526）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、TTAACCYTTTTACTGCCA（配列番号14527）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、TGGCAGTAAAAGGGTTAA（配列番号14529）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、TGGCAGTGAAAGGGTTAA（配列番号14531）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、TTAACCYTTTKMCTGCCA（配列番号14533）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンの1つの端部は、配列番号14524、配列番号14526、配列番号14527から選択された配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBac（商標）（PB）トランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンの1つの端部は、配列番号14529と配列番号14531から選択された配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンのそれぞれの逆方向末端反復は、CCYTTTKMCTGCCA（配列番号14563）のITR配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBac（商標）（PB）トランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンの各端部は、配列番号14563を逆向きに含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンの1つのITRは、配列番号14524、配列番号14526、配列番号14527から選択された配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンの1つのITRは、配列番号14529と配列番号14531から選択された配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、2つのトランスポゾン端部の中に配列番号14533を逆向きに含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14519と配列番号14520を含む端部を持つか、その一方または両方のバリアントで、配列番号14519または配列番号14520と少なくとも90％一致するものを含む端部を持つことができ、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14517の配列を持つか、配列番号14517または配列番号14518と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの数値の間の任意の割合が一致するバリアントの配列を持つ。いくつかの実施態様では、1つのpiggyBacトランスポゾン端部またはpiggyBac様トランスポゾン端部は、配列番号14519、配列番号14521、配列番号14523いずれかからの少なくとも14個の連続したヌクレオチドを含んでおり、他方のトランスポゾン端部は、配列番号14520または配列番号14522からの少なくとも14個の連続したヌクレオチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、1つのトランスポゾン端部は、配列番号14519、配列番号14521、配列番号14523いずれかからの少なくとも15個、または少なくとも16個、または少なくとも17個、または少なくとも18個、または少なくとも19個、または少なくとも20個、または少なくとも22個、または少なくとも25個、または少なくとも30個の連続したヌクレオチドを含み、他方のトランスポゾン端部は、配列番号14520または配列番号14522からの少なくとも15個、または少なくとも16個、または少なくとも17個、または少なくとも18個、または少なくとも19個、または少なくとも20個、または少なくとも22個、または少なくとも25個、または少なくとも30個の連続したヌクレオチドを含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14519に対応する5'配列と、配列番号14520に対応する3'配列を有する1つのトランスポゾン端部を認識する。それは、1つのDNA分子からのトランスポゾンの切除を、このDNAを、1つのトランスポゾンの5'末端にある5'TTAA-3'配列から第2のトランスポゾン末端の3'末端の5'-TTAA-3'まで（これらの間に位置する任意の異種DNAが含まれる）切断することによって実現し、切除されたこの配列を第2のDNA分子に挿入することになる。いくつかの実施態様では、5'トランスポゾン端部と3'トランスポゾン端部の切断型改変バージョンは、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼによって転移させることのできるトランスポゾンの一部としても機能するであろう。例えば5'トランスポゾン端部は、配列番号14521または配列番号14523に対応する配列で置き換えることができ、3'トランスポゾン端部は、配列番号14522に対応するより短い配列で置き換えることができる。いくつかの実施態様では、5'トランスポゾン端部と3'トランスポゾン端部は、その端部で、5'-TTAA-3'挿入部位（この配列は、これら2つの端部の中で逆向きである）を含む18 bpのほぼ完全な反復配列（5'-TTAACCYTTTKMCTGCCA：配列番号14533）を共有している。すなわち配列番号14519と配列番号14523では、5'トランスポゾン端部は配列5'-TTAACCTTTTTACTGCCA-3'（配列番号14524）で始まり、配列番号14521では、5'トランスポゾン端部は配列5'-TTAACCCTTTGCCTGCCA-3'（配列番号14526）で始まり；この配列のほぼ逆相補的配列を有する3'トランスポゾン端部は、配列番号14520では5' TGGCAGTAAAAGGGTTAA-3'（配列番号14529）で終わり、配列番号14522では5'-TGGCAGTGAAAGGGTTAA-3'（配列番号14531）で終わる。本発明の一実施態様は、2つのトランスポゾン端部（それぞれが、これら2つのトランスポゾン端部の中に配列番号14533を逆向きに含む）の間に挿入された異種ポリヌクレオチドを含むトランスポゾンである。いくつかの実施態様では、1つのトランスポゾン端部は、配列番号14524、配列番号14526、配列番号14527から選択された配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、1つのトランスポゾン端部は、配列番号14529と配列番号14531から選択された配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBac（商標）（PB）トランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、Xenopus tropicalisから単離されるか、Xenopus tropicalisに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ccctttgcct gccaatcacg catgggatac gtcgtggcag taaaagggct taaatgccaa
61 cgacgcgtcc catacgtt（配列番号14573）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 cctgggtaaa ctaaaagtcc cctcgaggaa aggcccctaa agtgaaacag tgcaaaacgt
61 tcaaaaactg tctggcaata caagttccac tttgggacaa atcggctggc agtgaaaggg（配列番号14574）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14573または配列番号14574からの少なくとも16個の連続した塩基と、CCYTTTBMCTGCCA（配列番号14575）という逆方向末端配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ccctttgcct gccaatcacg catgggatac gtcgtggcag taaaagggct taaatgccaa
61 cgacgcgtcc catacgttgt tggcatttta agtcttctct ctgcagcggc agcatgtgcc
121 gccgctgcag agagtttcta gcgatgacag cccctctggg caacgagccg ggggggctgt
181 c（配列番号14579）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 cctttttact gccaatgacg catgggatac gtcgtggcag taaaagggct taaatgccaa
61 cgacgcgtcc catacgttgt tggcatttta attcttctct ctgcagcggc agcatgtgcc
121 gccgctgcag agagtttcta gcgatgacag cccctctggg caacgagccg ggggggctgt
181 c（配列番号14580）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 cctttttact gccaatgacg catgggatac gtcgtggcag taaaagggct taaatgccaa
61 cgacgcgtcc catacgttgt tggcatttta agtcttctct ctgcagcggc agcatgtgcc
121 gccgctgcag agagtttcta gcgatgacag cccctctggg caacgagccg ggggggctgt
181 c（配列番号14581）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 cctttttact gccaatgacg catgggatac gtcgtggcag taaaagggct taaatgccaa
61 cgacgcgtcc catacgttgt tggcatttta agtcttctct ctgcagcggc agcatgtgcc
121 gccgctgcag agag（配列番号14582）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 cctttttact gccaatgacg catgggatac gtcgtggcag taaaagggct taaatgccaa
61 cgacgcgtcc catacgttgt tggcatttta agtctt（配列番号14583）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ccctttgcct gccaatcacg catgggatac gtcgtggcag taaaagggct taaatgccaa
61 cgacgcgtcc catacgttgt tggcatttta agtctt（配列番号14584）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttatcctttt tactgccaat gacgcatggg atacgtcgtg gcagtaaaag ggcttaaatg
61 ccaacgacgc gtcccatacg ttgttggcat tttaagtctt ctctctgcag cggcagcatg
121 tgccgccgct gcagagagtt tctagcgatg acagcccctc tgggcaacga gccggggggg
181 ctgtc（配列番号14585）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tttgcatttt tagacattta gaagcctata tcttgttaca gaattggaat tacacaaaaa
61 ttctaccata ttttgaaagc ttaggttgtt ctgaaaaaaa caatatattg ttttcctggg
121 taaactaaaa gtcccctcga ggaaaggccc ctaaagtgaa acagtgcaaa acgttcaaaa
181 actgtctggc aatacaagtt ccactttggg acaaatcggc tggcagtgaa aggg（配列番号14586）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14573と配列番号14579～14585から選択された5'トランスポゾン端部配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、5'トランスポゾン端部配列の前に5'標的配列がある。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tttgcatttt tagacattta gaagcctata tcttgttaca gaattggaat tacacaaaaa
61 ttctaccata ttttgaaagc ttaggttgtt ctgaaaaaaa caatatattg ttttcctggg
121 taaactaaaa gtcccctcga ggaaaggccc ctaaagtgaa acagtgcaaa acgttcaaaa
181 actgtctggc aatacaagtt ccactttgac caaaacggct ggcagtaaaa ggg（配列番号14587）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttgttctgaa aaaaacaata tattgttttc ctgggtaaac taaaagtccc ctcgaggaaa
61 ggcccctaaa gtgaaacagt gcaaaacgtt caaaaactgt ctggcaatac aagttccact
121 ttgaccaaaa cggctggcag taaaaggg（配列番号14588）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tttgcatttt tagacattta gaagcctata tcttgttaca gaattggaat tacacaaaaa
61 ttctaccata ttttgaaagc ttaggttgtt ctgaaaaaaa caatatattg ttttcctggg
121 taaactaaaa gtcccctcga ggaaaggccc ctaaagtgaa acagtgcaaa acgttcaaaa
181 actgtctggc aatacaagtt ccactttgac caaaacggct ggcagtaaaa gggttat（配列番号14589）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttgttctgaa aaaaacaata tattgttttc ctgggtaaac taaaagtccc ctcgaggaaa
61 ggcccctaaa gtgaaacagt gcaaaacgtt caaaaactgt ctggcaatac aagttccact
121 ttgggacaaa tcggctggca gtgaaaggg（配列番号14590）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14574と配列番号14587～14590から選択された3'トランスポゾン端部配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、3'トランスポゾン端部配列の後に3'標的配列がある。いくつかの実施態様では、5'トランスポゾン端部と3'トランスポゾン端部は、標的配列に隣接したこれら2つの端部の中に、14反復配列（配列番号14575）を逆向きで共有している。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、標的配列と、配列番号14582～14584と14573から選択された配列を含む5'標的配列を含むとともに、配列番号14588～14590と14574から選択された配列と、その後に続く3'標的配列を含む3'トランスポゾン端部を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンの5'トランスポゾン端部は、
1 atcacgcatg ggatacgtcg tggcagtaaa agggcttaaa tgccaacgac gcgtcccata
61 cgtt（配列番号14591）とITRを含んでいる。いくつかの実施態様では、5'トランスポゾン端部は、
1 atgacgcatg ggatacgtcg tggcagtaaa agggcttaaa tgccaacgac gcgtcccata
61 cgttgttggc attttaagtc tt（配列番号14592）とITRを含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンの3'トランスポゾン端部は、
1 cctgggtaaa ctaaaagtcc cctcgaggaa aggcccctaa agtgaaacag tgcaaaacgt
61 tcaaaaactg tctggcaata caagttccac tttgggacaa atcggc（配列番号14593）とITRを含んでいる。いくつかの実施態様では、3'トランスポゾン端部は、
1 ttgttctgaa aaaaacaata tattgttttc ctgggtaaac taaaagtccc ctcgaggaaa
61 ggcccctaaa gtgaaacagt gcaaaacgtt caaaaactgt ctggcaatac aagttccact
121 ttgaccaaaa cggc（配列番号14594）とITRを含んでいる。
いくつかの実施態様では、一方のトランスポゾン端部は、配列番号14573と少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、またはこれらの間の任意の割合が一致する配列を含み、他方のトランスポゾン端部は、配列番号14574と少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、またはこれらの間の任意の割合が一致する配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、1つのトランスポゾン端部は、配列番号14573からの少なくとも14個、または少なくとも16個、または少なくとも18個、または少なくとも20個、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドを含み、1つのトランスポゾン端部は、配列番号14574からの少なくとも14個、または少なくとも16個、または少なくとも18個、または少なくとも20個、または少なくとも25個の連続したヌクレオチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、一方のトランスポゾン端部は、配列番号14591からの少なくとも14個、または少なくとも16個、または少なくとも18個、または少なくとも20個の連続したヌクレオチドを含み、他方のトランスポゾン端部は、配列番号14593からの少なくとも14個、または少なくとも16個、または少なくとも18個、または少なくとも20個の連続したヌクレオチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、各トランスポゾン端部は、配列番号14575を逆向きに含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14573、配列番号14579、配列番号14581、配列番号14582、配列番号14583、配列番号14588から選択された配列と、配列番号14587、配列番号14588、配列番号14589、配列番号14586から選択された配列を含み、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14517または配列番号14518を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、CCCTTTGCCTGCCA（配列番号14622）というITR（5’ITR）とTGGCAGTGAAAGGG（配列番号14623）というITR（3’ITR）を標的配列に隣接して含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、Helicoverpa armigeraから単離されるか、Helicoverpa armigeraに由来する。piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MASRQRLNHD EIATILENDD DYSPLDSESE KEDCVVEDDV WSDNEDAIVD FVEDTSAQED
61 PDNNIASRES PNLEVTSLTS HRIITLPQRS IRGKNNHVWS TTKGRTTGRT SAINIIRTNR
121 GPTRMCRNIV DPLLCFQLFI TDEIIHEIVK WTNVEIIVKR QNLKDISASY RDTNTMEIWA
181 LVGILTLTAV MKDNHLSTDE LFDATFSGTR YVSVMSRERF EFLIRCIRMD DKTLRPTLRS
241 DDAFLPVRKI WEIFINQCRQ NHVPGSNLTV DEQLLGFRGR CPFRMYIPNK PDKYGIKFPM
301 MCAAATKYMI DAIPYLGKST KTNGLPLGEF YVKDLTKTVH GTNRNITCDN WFTSIPLAKN
361 MLQAPYNLTI VGTIRSNKRE MPEEIKNSRS RPVGSSMFCF DGPLTLVSYK PKPSKMVFLL
421 SSCDENAVIN ESNGKPDMIL FYNQTKGGVD SFDQMCKSMS ANRKTNRWPM AVFYGMLNMA
481 FVNSYIIYCH NKINKQEKPI SRKEFMKKLS IQLTTPWMQE RLQAPTLKRT LRDNITNVLK
541 NVVPASSENI SNEPEPKKRR YCGVCSYKKR RMTKAQCCKC KKAICGEHNI DVCQDCI（配列番号14525）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることができる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、Helicoverpa armigeraから単離されるか、Helicoverpa armigeraに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttaaccctag aagcccaatc tacgtaaatt tgacgtatac cgcggcgaaa tatctctgtc
61 tctttcatgt ttaccgtcgg atcgccgcta acttctgaac caactcagta gccattggga
121 cctcgcagga cacagttgcg tcatctcggt aagtgccgcc attttgttgt actctctatt
181 acaacacacg tcacgtcacg tcgttgcacg tcattttgac gtataattgg gctttgtgta
241 acttttgaat ttgtttcaaa ttttttatgt ttgtgattta tttgagttaa tcgtattgtt
301 tcgttacatt tttcatataa taataatatt ttcaggttga gtacaaa（配列番号14570）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 agactgtttt tttctaagag acttctaaaa tattattacg agttgattta attttatgaa
61 aacatttaaa actagttgat tttttttata attacataat tttaagaaaa agtgttagag
121 gcttgatttt tttgttgatt ttttctaaga tttgattaaa gtgccataat agtattaata
181 aagagtattt tttaacttaa aatgtatttt atttattaat taaaacttca attatgataa
241 ctcatgcaaa aatatagttc attaacagaa aaaaatagga aaactttgaa gttttgtttt
301 tacacgtcat ttttacgtat gattgggctt tatagctagt taaatatgat tgggcttcta
361 gggttaa（配列番号14528）の配列を含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、Pectinophora gossypiellaから単離されるか、Pectinophora gossypiellaに由来する。piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MDLRKQDEKI RQWLEQDIEE DSKGESDNSS SETEDIVEME VHKNTSSESE VSSESDYEPV
61 CPSKRQRTQI IESEESDNSE SIRPSRRQTS RVIDSDETDE DVMSSTPQNI PRNPNVIQPS
121 SRFLYGKNKH KWSSAAKPSS VRTSRRNIIH FIPGPKERAR EVSEPIDIFS LFISEDMLQQ
181 VVTFTNAEML IRKNKYKTET FTVSPTNLEE IRALLGLLFN AAAMKSNHLP TRMLFNTHRS
241 GTIFKACMSA ERLNFLIKCL RFDDKLTRNV RQRDDRFAPI RDLWQALISN FQKWYTPGSY
301 ITVDEQLVGF RGRCSFRMYI PNKPNKYGIK LVMAADVNSK YIVNAIPYLG KGTDPQNQPL
361 ATFFIKEITS TLHGTNRNIT MDNWFTSVPL ANELLMAPYN LTLVGTLRSN KREIPEKLKN
421 SKSRAIGTSM FCYDGDKTLV SYKAKSNKVV FILSTIHDQP DINQETGKPE MIHFYNSTKG
481 AVDTVDQMCS SISTNRKTQR WPLCVFYNML NLSIINAYVV YVYNNVRNNK KPMSRRDFVI
541 KLGDQLMEPW LRQRLQTVTL RRDIKVMIQD ILGESSDLEA PVPSVSNVRK IYYLCPSKAR
601 RMTKHRCIKC KQAICGPHNI DICSRCIE（配列番号14530）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることができる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、Pectinophora gossypiellaから単離されるか、Pectinophora gossypiellaに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttaaccctag ataactaaac attcgtccgc tcgacgacgc gctatgccgc gaaattgaag
61 tttacctatt attccgcgtc ccccgccccc gccgcttttt ctagcttcct gatttgcaaa
121 atagtgcatc gcgtgacacg ctcgaggtca cacgacaatt aggtcgaaag ttacaggaat
181 ttcgtcgtcc gctcgacgaa agtttagtaa ttacgtaagt ttggcaaagg taagtgaatg
241 aagtattttt ttataattat tttttaattc tttatagtga taacgtaagg tttatttaaa
301 tttattactt ttatagttat ttagccaatt gttataaatt ccttgttatt gctgaaaaat
361 ttgcctgttt tagtcaaaat ttattaactt ttcgatcgtt ttttag（配列番号14532）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tttcactaag taattttgtt cctatttagt agataagtaa cacataatta ttgtgatatt
61 caaaacttaa gaggtttaat aaataataat aaaaaaaaaa tggtttttat ttcgtagtct
121 gctcgacgaa tgtttagtta ttacgtaacc gtgaatatag tttagtagtc tagggttaa（配列番号14571）の配列を含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、Ctenoplusia agnataから単離されるか、Ctenoplusia agnataに由来する。piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MASRQHLYQD EIAAILENED DYSPHDTDSE MEDCVTQDDV RSDVEDEMVD NIGNGTSPAS
61 RHEDPETPDP SSEASNLEVT LSSHRIIILP QRSIREKNNH IWSTTKGQSS GRTAAINIVR
121 TNRGPTRMCR NIVDPLLCFQ LFIKEEIVEE IVKWTNVEMV QKRVNLKDIS ASYRDTNEME
181 IWAIISMLTL SAVMKDNHLS TDELFNVSYG TRYVSVMSRE RFEFLLRLLR MGDKLLRPNL
241 RQEDAFTPVR KIWEIFINQC RLNYVPGTNL TVDEQLLGFR GRCPFRMYIP NKPDKYGIKF
301 PMVCDAATKY MVDAIPYLGK STKTQGLPLG EFYVKELTQT VHGTNRNVTC DNWFTSVPLA
361 KSLLNSPYNL TLVGTIRSNK REIPEEVKNS RSRQVGSSMF CFDGPLTLVS YKPKPSKMVF
421 LLSSCNEDAV VNQSNGKPDM ILFYNQTKGG VDSFDQMCSS MSTNRKTNRW PMAVFYGMLN
481 MAFVNSYIIY CHNMLAKKEK PLSRKDFMKK LSTDLTTPSM QKRLEAPTLK RSLRDNITNV
541 LKIVPQAAID TSFDEPEPKK RRYCGFCSYK KKRMTKTQCF KCKKPVCGEH NIDVCQDCI（配列番号14534）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることができる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、Ctenoplusia agnataから単離されるか、Ctenoplusia agnataに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttaaccctag aagcccaatc tacgtcattc tgacgtgtat gtcgccgaaa atactctgtc
61 tctttctcct gcacgatcgg attgccgcga acgctcgatt caacccagtt ggcgccgaga
121 tctattggag gactgcggcg ttgattcggt aagtcccgcc attttgtcat agtaacagta
181 ttgcacgtca gcttgacgta tatttgggct ttgtgttatt tttgtaaatt ttcaacgtta
241 gtttattatt gcatcttttt gttacattac tggtttattt gcatgtatta ctcaaatatt
301 atttttattt tagcgtagaa aataca（配列番号14535）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 agactgtttt ttttgtattt gcattatata ttatattcta aagttgattt aattctaaga
61 aaaacattaa aataagtttc tttttgtaaa atttaattaa ttataagaaa aagtttaagt
121 tgatctcatt ttttataaaa atttgcaatg tttccaaagt tattattgta aaagaataaa
181 taaaagtaaa ctgagtttta attgatgttt tattatatca ttatactata tattacttaa
241 ataaaacaat aactgaatgt atttctaaaa ggaatcacta gaaaatatag tgatcaaaaa
301 tttacacgtc atttttgcgt atgattgggc tttataggtt ctaaaaatat gattgggcct
361 ctagggttaa（配列番号14536）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、CCCTAGAAGCCCAATC（配列番号14564）というITR配列を含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、Agrotis ipsilonから単離されるか、Agrotis ipsilonに由来する。piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MESRQRLNQD EIATILENDD DYSPLDSDSE AEDRVVEDDV WSDNEDAMID YVEDTSRQED
61 PDNNIASQES ANLEVTSLTS HRIISLPQRS ICGKNNHVWS TTKGRTTGRT SAINIIRTNR
121 GPTRMCRNIV DPLLCFQLFI TDEIIHEIVK WTNVEMIVKR QNLIDISASY RDTNTMEMWA
181 LVGILTLTAV MKDNHLSTDE LFDATFSGTR YVSVMSRERF EFLIRCMRMD DKTLRPTLRS
241 DDAFIPVRKL WEIFINQCRL NYVPGGNLTV DEQLLGFRGR CPFRMYIPNK PDKYGIRFPM
301 MCDAATKYMI DAIPYLGKST KTNGLPLGEF YVKELTKTVH GTNRNVTCDN WFTSIPLAKN
361 MLQAPYNLTI VGTIRSNKRE IPEEIKNSRS RPVGSSMFCF DGPLTLVSYK PKPSRMVFLL
421 SSCDENAVIN ESNGKPDMIL FYNQTKGGVD SFDQMCKSMS ANRKTNRWPM AVFYGMLNMA
481 FVNSYIIYCH NKINKQKKPI NRKEFMKNLS TDLTTPWMQE RLKAPTLKRT LRDNITNVLK
541 NVVPPSPANN SEEPGPKKRS YCGFCSYKKR RMTKTQFYKC KKAICGEHNI DVCQDCV（配列番号14537）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることができる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、Agrotis ipsilonから単離されるか、Agrotis ipsilonに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttaaccctag aagcccaatc tacgtaaatt tgacgtatac cgcggcgaaa tatatctgtc
61 tctttcacgt ttaccgtcgg attcccgcta acttcggaac caactcagta gccattgaga
121 actcccagga cacagttgcg tcatctcggt aagtgccgcc attttgttgt aatagacagg
181 ttgcacgtca ttttgacgta taattgggct ttgtgtaact tttgaaatta tttataattt
241 ttattgatgt gatttatttg agttaatcgt attgtttcgt tacatttttc atatgatatt
301 aatattttca gattgaatat aaa（配列番号14538）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 agactgtttt ttttaaaagg cttataaagt attactattg cgtgatttaa ttttataaaa
61 atatttaaaa ccagttgatt tttttaataa ttacctaatt ttaagaaaaa atgttagaag
121 cttgatattt ttgttgattt ttttctaaga tttgattaaa aggccataat tgtattaata
181 aagagtattt ttaacttcaa atttatttta tttattaatt aaaacttcaa ttatgataat
241 acatgcaaaa atatagttca tcaacagaaa aatataggaa aactctaata gttttatttt
301 tacacgtcat ttttacgtat gattgggctt tatagctagt caaatatgat tgggcttcta
361 gggttaa（配列番号14539）の配列を含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、Megachile rotundataから単離されるか、Megachile rotundataに由来する。piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MNGKDSLGEF YLDDLSDCLD CRSASSTDDE SDSSNIAIRK RCPIPLIYSD SEDEDMNNNV
61 EDNNHFVKES NRYHYQIVEK YKITSKTKKW KDVTVTEMKK FLGLIILMGQ VKKDVLYDYW
121 STDPSIETPF FSKVMSRNRF LQIMQSWHFY NNNDISPNSH RLVKIQPVID YFKEKFNNVY
181 KSDQQLSLDE CLIPWRGRLS IKTYNPAKIT KYGILVRVLS EARTGYVSNF CVYAADGKKI
241 EETVLSVIGP YKNMWHHVYQ DNYYNSVNIA KIFLKNKLRV CGTIRKNRSL PQILQTVKLS
301 RGQHQFLRNG HTLLEVWNNG KRNVNMISTI HSAQMAESRN RSRTSDCPIQ KPISIIDYNK
361 YMKGVDRADQ YLSYYSIFRK TKKWTKRVVM FFINCALFNS FKVYTTLNGQ KITYKNFLHK
421 AALSLIEDCG TEEQGTDLPN SEPTTTRTTS RVDHPGRLEN FGKHKLVNIV TSGQCKKPLR
481 QCRVCASKKK LSRTGFACKY CNVPLHKGDC FERYHSLKKY（配列番号14540）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることができる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、Megachile rotundataから単離されるか、Megachile rotundataに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttaaataatg cccactctag atgaacttaa cactttaccg accggccgtc gattattcga
61 cgtttgctcc ccagcgctta ccgaccggcc atcgattatt cgacgtttgc ttcccagcgc
121 ttaccgaccg gtcatcgact tttgatcttt ccgttagatt tggttaggtc agattgacaa
181 gtagcaagca tttcgcattc tttattcaaa taatcggtgc ttttttctaa gctttagccc
241 ttagaa（配列番号14541）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 acaacttctt ttttcaacaa atattgttat atggattatt tatttattta tttatttatg
61 gtatatttta tgtttattta tttatggtta ttatggtata ttttatgtaa ataataaact
121 gaaaacgatt gtaatagatg aaataaatat tgttttaaca ctaatataat taaagtaaaa
181 gattttaata aatttcgtta ccctacaata acacgaagcg tacaatttta ccagagttta
241 ttaa（配列番号14542）の配列を含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、Bombus impatiensから単離されるか、Bombus impatiensに由来する。piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MNEKNGIGEF YLDDLSDCPD SYSRSNSGDE SDGSDTIIRK RGSVLPPRYS DSEDDEINNV
61 EDNANNVENN DDIWSTNDEA IILEPFEGSP GLKIMPSSAE SVTDNVNLFF GDDFFEHLVR
121 ESNRYHYQVM EKYKIPSKAK KWTDITVPEM KKFLGLIVLM GQIKKDVLYD YWSTDPSIET
181 PFFSQVMSRN RFVQIMQSWH FCNNDNIPHD SHRLAKIQPV IDYFRRKFND VYKPCQQLSL
241 DESIIPWRGR LSIKTYNPAK ITKYGILVRV LSEAVTGYVC NFDVYAADGK KLEDTAVIEP
301 YKNIWHQIYQ DNYYNSVKMA RILLKNKVRV CGTIRKNRGL PRSLKTIQLS RGQYEFRRNH
361 QILLEVWNNG RRNVNMISTI HSAQLMESRS KSKRSDVPIQ KPNSIIDYNK YMKGVDRADQ
421 YLAYYSIFRK TKKWTKRVVM FFINCALFNS FRVYTILNGK NITYKNFLHK VAVSWIEDGE
481 TNCTEQDDNL PNSEPTRRAP RLDHPGRLSN YGKHKLINIV TSGRSLKPQR QCRVCAVQKK
541 RSRTCFVCKF CNVPLHKGDC FERYHTLKKY（配列番号14543）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることができる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、Bombus impatiensから単離されるか、Bombus impatiensに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttaatttttt aacattttac cgaccgatag ccgattaatc gggtttttgc cgctgacgct
61 taccgaccga taacctatta atcggctttt tgtcgtcgaa gcttaccaac ctatagccta
121 cctatagtta atcggttgcc atggcgataa acaatctttc tcattatatg agcagtaatt
181 tgttatttag tactaaggta ccttgctcag ttgcgtcagt tgcgttgctt tgtaagctcc
241 cacagtttta taccaattcg aaaaacttac cgttcgcg（配列番号14544）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 actatttcac atttgaacta aaaaccgttg taatagataa aataaatata atttagtatt
61 aatattatgg aaacaaaaga ttttattcaa tttaattatc ctatagtaac aaaaagcggc
121 caattttatc tgagcatacg aaaagcacag atactcccgc ccgacagtct aaaccgaaac
181 agagccggcg ccagggagaa tctgcgcctg agcagccggt cggacgtgcg tttgctgttg
241 aaccgctagt ggtcagtaaa ccagaaccag tcagtaagcc agtaactgat cagttaacta
301 gattgtatag ttcaaattga acttaatcta gtttttaagc gtttgaatgt tgtctaactt
361 cgttatatat tatattcttt ttaa（配列番号14545）の配列を含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、Mamestra brassicaeから単離されるか、Mamestra brassicaeに由来する。piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MFSFVPNKEQ TRTVLIFCFH LKTTAAESHR PLVEAFGEQV PTVKTCERWF QRFKSGDFDV
61 DDKEHGKPPK RYEDAELQAL LDEDDAQTQK QLAEQLEVSQ QAVSNRLREG GKIQKVGRWV
121 PHELNERQRE RRKNTCEILL SRYKRKSFLH RIVTGEEKWI FFVNPKRKKS YVDPGQPATS
181 TARPNRFGKK TRLCVWWDQS GVIYYELLKP GETVNTARYQ QQLINLNRAL QRKRPEYQKR
241 QHRVIFLHDN APSHTARAVR DTLETLNWEV LPHAAYSPDL APSDYHLFAS MGHALAEQRF
301 DSYESVEEWL DEWFAAKDDE FYWRGIHKLP ERWDNCVASD GKYFE（配列番号14546）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることができる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、Mamestra brassicaeから単離されるか、Mamestra brassicaeに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttattgggtt gcccaaaaag taattgcgga tttttcatat acctgtcttt taaacgtaca
61 tagggatcga actcagtaaa actttgacct tgtgaaataa caaacttgac tgtccaacca
121 ccatagtttg gcgcgaattg agcgtcataa ttgttttgac tttttgcagt caac（配列番号14547）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 atgatttttt ctttttaaac caattttaat tagttaattg atataaaaat ccgcaattac
61 tttttgggca acccaataa（配列番号14548）の配列を含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、Mayetiola destructorから単離されるか、Mayetiola destructorに由来する。piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MENFENWRKR RHLREVLLGH FFAKKTAAES HRLLVEVYGE HALAKTQCFE WFQRFKSGDF
61 DTEDKERPGQ PKKFEDEELE ALLDEDCCQT QEELAKSLGV TQQAISKRLK AAGYIQKQGN
121 WVPHELKPRD VERRFCMSEM LLQRHKKKSF LSRIITGDEK WIHYDNSKRK KSYVKRGGRA
181 KSTPKSNLHG AKVMLCIWWD QRGVLYYELL EPGQTITGDL YRTQLIRLKQ ALAEKRPEYA
241 KRHGAVIFHH DNARPHVALP VKNYLENSGW EVLPHPPYSP DLAPSDYHLF RSMQNDLAGK
301 RFTSEQGIRK WLDSFLAAKP AKFFEKGIHE LSERWEKVIA SDGQYFE（配列番号14549）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることができる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、Mayetiola destructorから単離されるか、Mayetiola destructorに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 taagacttcc aaaatttcca cccgaacttt accttccccg cgcattatgt ctctcttttc
61 accctctgat ccctggtatt gttgtcgagc acgatttata ttgggtgtac aacttaaaaa
121 ccggaattgg acgctagatg tccacactaa cgaatagtgt aaaagcacaa atttcatata
181 tacgtcattt tgaaggtaca tttgacagct atcaaaatca gtcaataaaa ctattctatc
241 tgtgtgcatc atattttttt attaact（配列番号14550）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tgcattcatt cattttgtta tcgaaataaa gcattaattt tcactaaaaa attccggttt
61 ttaagttgta cacccaatat catccttagt gacaattttc aaatggcttt cccattgagc
121 tgaaaccgtg gctctagtaa gaaaaacgcc caacccgtca tcatatgcct tttttttctc
181 aacatccg（配列番号14551）の配列を含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、Apis melliferaから単離されるか、Apis melliferaに由来する。piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MENQKEHYRH ILLFYFRKGK NASQAHKKLC AVYGDEALKE RQCQNWFDKF RSGDFSLKDE
61 KRSGRPVEVD DDLIKAIIDS DRHSTTREIA EKLHVSHTCI ENHLKQLGYV QKLDTWVPHE
121 LKEKHLTQRI NSCDLLKKRN ENDPFLKRLI TGDEKWVVYN NIKRKRSWSR PREPAQTTSK
181 AGIHRKKVLL SVWWDYKGIV YFELLPPNRT INSVVYIEQL TKLNNAVEEK RPELTNRKGV
241 VFHHDNARPH TSLVTRQKLL ELGWDVLPHP PYSPDLAPSD YFLFRSLQNS LNGKNFNNDD
301 DIKSYLIQFF ANKNQKFYER GIMMLPERWQ KVIDQNGQHI TE（配列番号14552）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることができる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、Apis melliferaから単離されるか、Apis melliferaに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttgggttggc aactaagtaa ttgcggattt cactcataga tggcttcagt tgaattttta
61 ggtttgctgg cgtagtccaa atgtaaaaca cattttgtta tttgatagtt ggcaattcag
121 ctgtcaatca gtaaaaaaag ttttttgatc ggttgcgtag ttttcgtttg gcgttcgttg
181 aaaa（配列番号14553）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 agttatttag ttccatgaaa aaattgtctt tgattttcta aaaaaaatcc gcaattactt
61 agttgccaat ccaa（配列番号14554）の配列を含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、Messor bouvieriから単離されるか、Messor bouvieriに由来する。piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MSSFVPENVH LRHALLFLFH QKKRAAESHR LLVETYGEHA PTIRTCETWF RQFKCGDFNV
61 QDKERPGRPK TFEDAELQEL LDEDSTQTQK QLAEKLNVSR VAICERLQAM GKIQKMGRWV
121 PHELNDRQME NRKIVSEMLL QRYERKSFLH RIVTGDEKWI YFENPKRKKS WLSPGEAGPS
181 TARPNRFGRK TMLCVWWDQI GVVYYELLKP GETVNTDRYR QQMINLNCAL IEKRPQYAQR
241 HDKVILQHDN APSHTAKPVK EMLKSLGWEV LSHPPYSPDL APSDYHLFAS MGHALAEQHF
301 ADFEEVKKWL DEWFSSKEKL FFWNGIHKLS ERWTKCIESN GQYFE（配列番号14555）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることができる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、Messor bouvieriから単離されるか、Messor bouvieriに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 agtcagaaat gacacctcga tcgacgacta atcgacgtct aatcgacgtc gattttatgt
61 caacatgtta ccaggtgtgt cggtaattcc tttccggttt ttccggcaga tgtcactagc
121 cataagtatg aaatgttatg atttgataca tatgtcattt tattctactg acattaacct
181 taaaactaca caagttacgt tccgccaaaa taacagcgtt atagatttat aattttttga
241 aa（配列番号14556）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ataaatttga actatccatt ctaagtaacg tgttttcttt aacgaaaaaa ccggaaaaga
61 attaccgaca ctcctggtat gtcaacatgt tattttcgac attgaatcgc gtcgattcga
121 agtcgatcga ggtgtcattt ctgact（配列番号14557）の配列を含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、トランスポザーゼ酵素は、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素である。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、Trichoplusia niから単離されるか、Trichoplusia niに由来する。piggyBac（PB）トランスポザーゼ酵素またはpiggyBac様トランスポザーゼ酵素は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14558）と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致するアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなることができる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、Trichoplusia niから単離されるか、Trichoplusia niに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ttaaccctag aaagatagtc tgcgtaaaat tgacgcatgc attcttgaaa tattgctctc
61 tctttctaaa tagcgcgaat ccgtcgctgt gcatttagga catctcagtc gccgcttgga
121 gctcccgtga ggcgtgcttg tcaatgcggt aagtgtcact gattttgaac tataacgacc
181 gcgtgagtca aaatgacgca tgattatctt ttacgtgact tttaagattt aactcatacg
241 ataattatat tgttatttca tgttctactt acgtgataac ttattatata tatattttct
301 tgttatagat atc（配列番号14559）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tttgttactt tatagaagaa attttgagtt tttgtttttt tttaataaat aaataaacat
61 aaataaattg tttgttgaat ttattattag tatgtaagtg taaatataat aaaacttaat
121 atctattcaa attaataaat aaacctcgat atacagaccg ataaaacaca tgcgtcaatt
181 ttacgcatga ttatctttaa cgtacgtcac aatatgatta tctttctagg gttaa（配列番号14560）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 ccctagaaag atagtctgcg taaaattgac gcatgcattc ttgaaatatt gctctctctt
61 tctaaatagc gcgaatccgt cgctgtgcat ttaggacatc tcagtcgccg cttggagctc
121 ccgtgaggcg tgcttgtcaa tgcggtaagt gtcactgatt ttgaactata acgaccgcgt
181 gagtcaaaat gacgcatgat tatcttttac gtgactttta agatttaact catacgataa
241 ttatattgtt atttcatgtt ctacttacgt gataacttat tatatatata ttttcttgtt
301 atagatatc（配列番号14561）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tttgttactt tatagaagaa attttgagtt tttgtttttt tttaataaat aaataaacat
61 aaataaattg tttgttgaat ttattattag tatgtaagtg taaatataat aaaacttaat
121 atctattcaa attaataaat aaacctcgat atacagaccg ataaaacaca tgcgtcaatt
181 ttacgcatga ttatctttaa cgtacgtcac aatatgatta tctttctagg g（配列番号14562）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tctaaatagc gcgaatccgt cgctgtgcat ttaggacatc tcagtcgccg cttggagctc
61 ccgtgaggcg tgcttgtcaa tgcggtaagt gtcactgatt ttgaactata acgaccgcgt
121 gagtcaaaat gacgcatgat tatcttttac gtgactttta agatttaact catacgataa
181 ttatattgtt atttcatgtt ctacttacgt gataacttat tatatatata ttttcttgtt
241 atagatatc（配列番号14609）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、
1 tttgttactt tatagaagaa attttgagtt tttgtttttt tttaataaat aaataaacat
61 aaataaattg tttgttgaat ttattattag tatgtaagtg taaatataat aaaacttaat
121 atctattcaa attaataaat aaacctcgat atacagaccg ataaaacaca tgcgtcaatt
181 ttacgcatga ttatctttaa cgtacgtcac aatatgatta tctttctagg g（配列番号14610）の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14561と配列番号14562を含み、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14558を含んでいる。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、配列番号14609と配列番号14610を含み、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼは、配列番号14558を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、Aphis gossypiiから単離されるか、Aphis gossypiiに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、CCTTCCAGCGGGCGCGC（配列番号14565）というITR配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、Chilo suppressalisから単離されるか、Chilo suppressalisに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、CCCAGATTAGCCT（配列番号14566）というITR配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、Heliothis virescensから単離されるか、Heliothis virescensに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、CCCTTAATTACTCG
CG（配列番号14567）というITR配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、Pectinophora gossypiellaから単離されるか、Pectinophora gossypiellaに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、CCCTAG
ATAACTAAAC（配列番号14568）というITR配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、Anopheles stephensiから単離されるか、Anopheles stephensiに由来する。いくつかの実施態様では、piggyBacトランスポゾンまたはpiggyBac様トランスポゾンは、CCCTAGAAAGATA（配列番号14569）というITR配列を含んでいる。
hATファミリーの中のDNAトランスポゾンは植物と動物に広く見られる。多数の活性なhATトランスポゾン系がこれまでに同定されていて機能的であることが見いだされており、その非限定的な例に含まれるのは、Hermesトランスポゾン、Acトランスポゾン、hoboトランスポゾン、Tol2トランスポゾンである。hATファミリーは2つのファミリーで構成されていて、それが、そのトランスポザーゼの一次配列に基づいてACサブファミリーとBusterサブファミリーに分類されている。hATファミリーのメンバーはクラスIIの転移可能なエレメントに属する。クラスII移動エレメントは、転移のカット・アンド・ペースト機構を利用する。hATエレメントは、似たトランスポザーゼと、短い末端逆方向反復と、ゲノム標識の8塩基対の重複を共有している。
本開示の組成物と方法は、TcBusterトランスポゾンおよび／またはTcBusterトランスポザーゼを含むことができる。
本開示の組成物と方法は、TcBusterトランスポゾンおよび／または高活性なTcBusterトランスポザーゼを含むことができる。高活性なTcBusterトランスポザーゼは、野生型TcBusterトランスポザーゼの切除および／または挿入頻度と比べて増加した切除および／または増加した挿入頻度を示す。高活性なTcBusterトランスポザーゼは、野生型TcBusterトランスポザーゼの転移頻度と比べて増加した転移頻度を示す
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、野生型TcBusterトランスポザーゼは、
1 MMLNWLKSGK LESQSQEQSS CYLENSNCLP PTLDSTDIIG EENKAGTTSR KKRKYDEDYL
61 NFGFTWTGDK DEPNGLCVIC EQVVNNSSLN PAKLKRHLDT KHPTLKGKSE YFKRKCNELN
121 QKKHTFERYV RDDNKNLLKA SYLVSLRIAK QGEAYTIAEK LIKPCTKDLT TCVFGEKFAS
181 KVDLVPLSDT TISRRIEDMS YFCEAVLVNR LENAKCGFTL QMDESTDVAG LAILLVFVRY
241 IHESSFEEDM LFCKALPTQT TGEEIFNLLN AYFEKHSIPW NLCYHICTDG AKAMVGVIKG
301 VIARIKKLVP DIKASHCCLH RHALAVKRIP NALHEVLNDA VKMINFIKSR PLNARVFALL
361 CDDLGSLHKN LLLHTEVRWL SRGKVLTRFW ELRDEIRIFF NEREFAGKLN DTSWLQNLAY
421 IADIFSYLNE VNLSLQGPNS TIFKVNSRIN SIKSKLKLWE ECITKNNTEC FANLNDFLET
481 SNTALDPNLK SNILEHLNGL KNTFLEYFPP TCNNISWVEN PFNECGNVDT LPIKEREQLI
541 DIRTDTTLKS SFVPDGIGPF WIKLMDEFPE ISKRAVKELM PFVTTYLCEK SFSVYVATKT
601 KYRNRLDAED DMRLQLTTIH PDIDNLCNNK QAQKSH（GenBank登録番号ABF20545と配列番号17900）のアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなる。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、TcBusterトランスポザーゼは、
1 MMLNWLKSGK LESQSQEQSS CYLENSNCLP PTLDSTDIIG EENKAGTTSR KKRKYDEDYL
61 NFGFTWTGDK DEPNGLCVIC EQVVNNSSLN PAKLKRHLDT KHPTLKGKSE YFKRKCNELN
121 QKKHTFERYV RDDNKNLLKA SYLVSLRIAK QGEAYTIAEK LIKPCTKDLT TCVFGEKFAS
181 KVDLVPLSDT TISRRIEDMS YFCEAVLVNR LENAKCGFTL QMDESTDVAG LAILLVFVRY
241 IHESSFEEDM LFCKALPTQT TGEEIFNLLN AYFEKHSIPW NLCYHICTDG AKAMVGVIKG
301 VIARIKKLVP DIKASHCCLH RHALAVKRIP NALHEVLNDA VKMINFIKSR PLNARVFALL
361 CDDLGSLHKN LLLHTEVRWL SRGKVLTRFW ELRDEIRIFF NEREFAGKLN DTSWLQNLAY
421 IADIFSYLNE VNLSLQGPNS TIFKVNSRIN SIKSKLKLWE ECITKNNTEC FANLNDFLET
481 SNTALDPNLK SNILEHLNGL KNTFLEYFPP TCNNISWVEN PFNECGNVDT LPIKEREQLI
541 DIRTDTTLKS SFVPDGIGPF WIKLMDEFPE ISKRAVKELM PFVTTYLCEK SFSVYVATKT
601 KYRNRLDAED DMRLQLTTIH PDIDNLCNNK QAQKSH（GenBank登録番号ABF20545と配列番号17900）のアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなる野生型TcBusterトランスポザーゼと少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致する配列を含むか、この配列からなることができる。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、野生型TcBusterトランスポザーゼは、
1 atgatgttga attggctgaa aagtggaaag cttgaaagtc aatcacagga acagagttcc
61 tgctaccttg agaactctaa ctgcctgcca ccaacgctcg attctacaga tattatcggt
121 gaagagaaca aagctggtac cacctctcgc aagaagcgga aatatgacga ggactatctg
181 aacttcggtt ttacatggac tggcgacaag gatgagccca acggactttg tgtgatttgc
241 gagcaggtag tcaacaattc ctcacttaac ccggccaaac tgaaacgcca tttggacaca
301 aagcatccga cgcttaaagg caagagcgaa tacttcaaaa gaaaatgtaa cgagctcaat
361 caaaagaagc atacttttga gcgatacgta agggacgata acaagaacct cctgaaagct
421 tcttatctcg tcagtttgag aatagctaaa cagggcgagg catataccat agcggagaag
481 ttgatcaagc cttgcaccaa ggatctgaca acttgcgtat ttggagaaaa attcgcgagc
541 aaagttgatc tcgtccccct gtccgacacg actatttcaa ggcgaatcga agacatgagt
601 tacttctgtg aagccgtgct ggtgaacagg ttgaaaaatg ctaaatgtgg gtttacgctg
661 cagatggacg agtcaacaga tgttgccggt cttgcaatcc tgcttgtgtt tgttaggtac
721 atacatgaaa gctcttttga ggaggatatg ttgttctgca aagcacttcc cactcagacg
781 acaggggagg agattttcaa tcttctcaat gcctatttcg aaaagcactc catcccatgg
841 aatctgtgtt accacatttg cacagacggt gccaaggcaa tggtaggagt tattaaagga
901 gtcatagcga gaataaaaaa actcgtccct gatataaaag ctagccactg ttgcctgcat
961 cgccacgctt tggctgtaaa gcgaataccg aatgcattgc acgaggtgct caatgacgct
1021 gttaaaatga tcaacttcat caagtctcgg ccgttgaatg cgcgcgtctt cgctttgctg
1081 tgtgacgatt tggggagcct gcataaaaat cttcttcttc ataccgaagt gaggtggctg
1141 tctagaggaa aggtgctgac ccgattttgg gaactgagag atgaaattag aattttcttc
1201 aacgaaaggg aatttgccgg gaaattgaac gacaccagtt ggttgcaaaa tttggcatat
1261 atagctgaca tattcagtta tctgaatgaa gttaatcttt ccctgcaagg gccgaatagc
1321 acaatcttca aggtaaatag ccgcattaac agtattaaat caaagttgaa gttgtgggaa
1381 gagtgtataa cgaaaaataa cactgagtgt tttgcgaacc tcaacgattt tttggaaact
1441 tcaaacactg cgttggatcc aaacctgaag tctaatattt tggaacatct caacggtctt
1501 aagaacacct ttctggagta ttttccacct acgtgtaata atatctcctg ggtggagaat
1561 cctttcaatg aatgcggtaa cgtcgataca ctcccaataa aagagaggga acaattgatt
1621 gacatacgga ctgatacgac attgaaatct tcattcgtgc ctgatggtat aggaccattc
1681 tggatcaaac tgatggacga atttccagaa attagcaaac gagctgtcaa agagctcatg
1741 ccatttgtaa ccacttacct ctgtgagaaa tcattttccg tctatgtagc cacaaaaaca
1801 aaatatcgaa atagacttga tgctgaagac gatatgcgac tccaacttac tactatccat
1861 ccagacattg acaacctttg taacaacaag caggctcaga aatcccactg a（GenBank登録番号DQ481197と配列番号17901）の配列を含むか、この配列からなる核酸配列によってコードされている。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、TcBusterトランスポザーゼは、
1 atgatgttga attggctgaa aagtggaaag cttgaaagtc aatcacagga acagagttcc
61 tgctaccttg agaactctaa ctgcctgcca ccaacgctcg attctacaga tattatcggt
121 gaagagaaca aagctggtac cacctctcgc aagaagcgga aatatgacga ggactatctg
181 aacttcggtt ttacatggac tggcgacaag gatgagccca acggactttg tgtgatttgc
241 gagcaggtag tcaacaattc ctcacttaac ccggccaaac tgaaacgcca tttggacaca
301 aagcatccga cgcttaaagg caagagcgaa tacttcaaaa gaaaatgtaa cgagctcaat
361 caaaagaagc atacttttga gcgatacgta agggacgata acaagaacct cctgaaagct
421 tcttatctcg tcagtttgag aatagctaaa cagggcgagg catataccat agcggagaag
481 ttgatcaagc cttgcaccaa ggatctgaca acttgcgtat ttggagaaaa attcgcgagc
541 aaagttgatc tcgtccccct gtccgacacg actatttcaa ggcgaatcga agacatgagt
601 tacttctgtg aagccgtgct ggtgaacagg ttgaaaaatg ctaaatgtgg gtttacgctg
661 cagatggacg agtcaacaga tgttgccggt cttgcaatcc tgcttgtgtt tgttaggtac
721 atacatgaaa gctcttttga ggaggatatg ttgttctgca aagcacttcc cactcagacg
781 acaggggagg agattttcaa tcttctcaat gcctatttcg aaaagcactc catcccatgg
841 aatctgtgtt accacatttg cacagacggt gccaaggcaa tggtaggagt tattaaagga
901 gtcatagcga gaataaaaaa actcgtccct gatataaaag ctagccactg ttgcctgcat
961 cgccacgctt tggctgtaaa gcgaataccg aatgcattgc acgaggtgct caatgacgct
1021 gttaaaatga tcaacttcat caagtctcgg ccgttgaatg cgcgcgtctt cgctttgctg
1081 tgtgacgatt tggggagcct gcataaaaat cttcttcttc ataccgaagt gaggtggctg
1141 tctagaggaa aggtgctgac ccgattttgg gaactgagag atgaaattag aattttcttc
1201 aacgaaaggg aatttgccgg gaaattgaac gacaccagtt ggttgcaaaa tttggcatat
1261 atagctgaca tattcagtta tctgaatgaa gttaatcttt ccctgcaagg gccgaatagc
1321 acaatcttca aggtaaatag ccgcattaac agtattaaat caaagttgaa gttgtgggaa
1381 gagtgtataa cgaaaaataa cactgagtgt tttgcgaacc tcaacgattt tttggaaact
1441 tcaaacactg cgttggatcc aaacctgaag tctaatattt tggaacatct caacggtctt
1501 aagaacacct ttctggagta ttttccacct acgtgtaata atatctcctg ggtggagaat
1561 cctttcaatg aatgcggtaa cgtcgataca ctcccaataa aagagaggga acaattgatt
1621 gacatacgga ctgatacgac attgaaatct tcattcgtgc ctgatggtat aggaccattc
1681 tggatcaaac tgatggacga atttccagaa attagcaaac gagctgtcaa agagctcatg
1741 ccatttgtaa ccacttacct ctgtgagaaa tcattttccg tctatgtagc cacaaaaaca
1801 aaatatcgaa atagacttga tgctgaagac gatatgcgac tccaacttac tactatccat
1861 ccagacattg acaacctttg taacaacaag caggctcaga aatcccactg a（GenBank登録番号DQ481197と配列番号17901）の配列を含むか、この配列からなる核酸配列によってコードされている野生型TcBusterトランスポザーゼと少なくとも20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致する配列を含むか、この配列からなることができる。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、TcBusterトランスポザーゼは、天然に存在するアミノ酸配列を含むか、天然に存在するアミノ酸配列からなる。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、TcBusterトランスポザーゼは、天然に存在しないアミノ酸配列を含むか、天然に存在しないアミノ酸配列からなる。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、TcBusterトランスポザーゼは、天然に存在する核酸配列を含むか、天然に存在する核酸配列からなる配列によってコードされている。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、TcBusterトランスポザーゼは、天然に存在しない核酸配列を含むか、天然に存在しない核酸配列からなる配列によってコードされている。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、変異TcBusterトランスポザーゼは、野生型TcBusterトランスポザーゼと比べて1つ以上の配列バリエーションを含んでいる。いくつかの実施態様では、野生型TcBusterトランスポザーゼは、配列番号17900のアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなる。いくつかの実施態様では、野生型TcBusterトランスポザーゼは、配列番号17901の核酸配列を含むかこの核酸配列からなる配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、置換、逆転、挿入、欠失、転移、フレームシフトのうちの1つ以上を含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、改変されたアミノ酸、合成アミノ酸、人工アミノ酸、天然に存在しないアミノ酸のいずれかを含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、改変された核酸、合成核酸、人工核酸、天然に存在しない核酸のいずれかを含んでいる。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、変異TcBusterトランスポザーゼは、野生型TcBusterトランスポザーゼと比べて1つ以上の配列バリエーションを含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、DNA結合・オリゴマー化ドメイン、挿入ドメイン、Zn-BEDドメインのうちの1つ以上の中にアミノ酸置換を含んでいる。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、変異TcBusterトランスポザーゼは、野生型TcBusterトランスポザーゼと比べて1つ以上の配列バリエーションを含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、野生型TcBusterトランスポザーゼと比べて実効電荷中性pHを増加させるアミノ酸置換を含んでいる。いくつかの実施態様では、野生型TcBusterトランスポザーゼは、配列番号17900のアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなる。いくつかの実施態様では、野生型TcBusterトランスポザーゼは、配列番号17901の核酸配列を含むかこの核酸配列からなる配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、配列番号17900の223位にアスパラギン酸（D）のアミノ酸置換（D223）、289位にアスパラギン酸（D）のアミノ酸置換（D289）、589位にアスパラギン酸（E）のアミノ酸置換（E589）を含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、配列番号17900の223位、および／または289位、および／または589位からアミノ酸5個以内、10個以内、15個以内、20個以内、25個以内、30個以内、35個以内、40個以内、45個以内、50個以内、55個以内、60個以内、65個以内、70個以内、75個以内、80個以内、85個以内、90個以内、95個以内、100個以内、またはこれらの数値の間の任意の個数以内にアミノ酸置換を含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、配列番号17900の223位、および／または289位、および／または589位からアミノ酸70個以内にアミノ酸置換を含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、配列番号17900の223位、および／または289位、および／または589位からアミノ酸80個以内のにアミノ酸置換を含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、アスパラギン酸（D）またはアスパラギン酸（E）から中性アミノ酸であるリシン（L）またはアルギニン（R）へのアミノ酸置換を含んでいる（例えば配列番号17900のD223L、D223R、D289L、D289R、E289L、E289R）。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、変異TcBusterトランスポザーゼは、野生型TcBusterトランスポザーゼと比べて1つ以上の配列バリエーションを含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、配列番号17900のQ82E、N85S、D99A、D132A、Q151S、Q151A、E153K、E153R、A154P、Y155H、E159A、T171K、T171R、K177E、D183K、D183R、D189A、T191E、S193K、S193R、Y201A、F202D、F202K、 C203I、C203V、Q221T、M222L、I223Q、E224G、S225W、D227A、R239H、E243A、E247K、P257K、P257R、Q258T、E263A、E263K、E263R、E274K、E274R、S278K、N281E、L282K、L282R、K292P、V297K、K299S、A303T、H322E、A332S、A358E、A358K、A358S、D376A、V377T、L380N、I398D、I398S、I398K、F400L、V431L、S447E、N450K、N450R、I452F、E469K、K469K、P510D、P510N、E517R、R536S、V553S、P554T、P559D、P559S、P559K、K573E、E578L、K590T、Y595L、V596A、T598I、K599A、Q615A、T618K、T618K、T618R、D622K、D622Rのうちの1つ以上を含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、配列番号17900の154位、155位、159位、171位、177位、183位、189位、191位、193位、201位、202位、203位、221位、223位、224位、225位、227位、239位、243位、247位、257位、258位、263位、274位、278位、281位、282位、292位、297位、299位、303位、322位、332位、358位、376位、377位、380位、398位、400位、431位、447位、450位、452位、469位、510位、517位、536位、553位、554位、559位、573位、578位、590位、595位、596位、598位、599位、615位、618位、622位からアミノ酸5個以内、10個以内、15個以内、20個以内、25個以内、30個以内、35個以内、40個以内、45個以内、50個以内、55個以内、60個以内、65個以内、70個以内、75個以内、80個以内、85個以内、90個以内、95個以内、100個以内、またはこれらの数値の間の任意の個数以内にアミノ酸置換を含んでいる。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、変異TcBusterトランスポザーゼは、野生型TcBusterトランスポザーゼと比べて1つ以上の配列バリエーションを含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、配列番号17900のE247K、V297K、A358K、S278K、E247R、E274R、V297R、A358R、S278R、T171R、D183R、S193R、P257K、E263R、L282K、T618K、D622R、E153K、N450K、T171K、D183K、S193K、P257R、E263K、L282R、T618R、D622K、E153R、N450Rのうちの1つ以上を含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、配列番号17900の153位、171位、183位、193位、247位、257位、263位、274位、278位、282位、297位、358位、450位、618位、622位からアミノ酸5個以内、10個以内、15個以内、20個以内、25個以内、30個以内、35個以内、40個以内、45個以内、50個以内、55個以内、60個以内、65個以内、70個以内、75個以内、80個以内、85個以内、90個以内、95個以内、100個以内、またはこれらの数値の間の任意の個数以内にアミノ酸置換を含んでいる。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、変異TcBusterトランスポザーゼは、野生型TcBusterトランスポザーゼと比べて1つ以上の配列バリエーションを含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、配列番号17900のV377T/ E469K、V377T/E469K/R536S、A332S、V553S/P554T、E517R、K299S、Q615A/T618K、S278K、A303T、P510D、P510N、N281S、N281E、K590T、Q258T、E247K、S447E、N85S、V297K、A358K、I452F、V377T/E469K/D189A、K573E/E578L、I452F/V377T/E469K/D189A、A358K/ V377T/E469K/D189A、K573E/E578L/V377T/E469K/D189A、T171R、D183R、S193R、P257K、E263R、L282K、T618K、D622R、E153K、N450K、T171K、D183K、S193K、P257R、E263K、L282R、T618R、D622K、E153R、N450R、E247K/E274K/V297K/A358Kのうちの1つ以上を含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、配列番号17900の85位、153位、171位、189位、193位、247位、257位、258位、263位、274位、278位、281位、282位、297位、299位、303位、332位、358位、377位、450位、469位、447位、452位、469位、510位、517位、536位、553位、554位、573位、578位、590位、615位、618位、622位からアミノ酸5個以内、10個以内、15個以内、20個以内、25個以内、30個以内、35個以内、40個以内、45個以内、50個以内、55個以内、60個以内、65個以内、70個以内、75個以内、80個以内、85個以内、90個以内、95個以内、100個以内、またはこれらの数値の間の任意の個数以内にアミノ酸置換を含んでいる。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、変異TcBusterトランスポザーゼは、野生型TcBusterトランスポザーゼと比べて1つ以上の配列バリエーションを含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、V377T/E469K、V377T/E469K/ R536S、V553S/P554T、Q615A/T618K、S278K、A303T、P510D、P510N、N281S、N281E、K590T、Q258T、E247K、S447E、N85S、V297K、A358K、I452F、V377T/E469K/D189A、K573E/E578Lのうちの1つ以上を含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、配列番号17900の85位、189位、247位、258位、278位、281位、297位、303位、358位、377位、447位、452位、469位、510位、536位、553位、554位、573位、578位、590位、615位、618位からアミノ酸5個以内、10個以内、15個以内、20個以内、25個以内、30個以内、35個以内、40個以内、45個以内、50個以内、55個以内、60個以内、65個以内、70個以内、75個以内、80個以内、85個以内、90個以内、95個以内、100個以内、またはこれらの数値の間の任意の個数以内にアミノ酸置換を含んでいる。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、変異TcBusterトランスポザーゼは、野生型TcBusterトランスポザーゼと比べて1つ以上の配列バリエーションを含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、配列番号17900のQ151S、Q151A、A154P、Q615A、V553S、Y155H、Y201A、F202D、F202K、C203I、C203V、F400L、I398D、I398S、I398K、V431L、P559D、P559S、P559K、M222Lのうちの1つ以上を含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、配列番号17900の151位、154位、615位、553位、155位、201位、202位、203位、400位、398位、431位、559位、222位からアミノ酸5個以内、10個以内、15個以内、20個以内、25個以内、30個以内、35個以内、40個以内、45個以内、50個以内、55個以内、60個以内、65個以内、70個以内、75個以内、80個以内、85個以内、90個以内、95個以内、100個以内、またはこれらの数値の間の任意の個数以内にアミノ酸置換を含んでいる。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、変異TcBusterトランスポザーゼは、野生型TcBusterトランスポザーゼと比べて1つ以上の配列バリエーションを含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、配列番号17900に従って番号付けをすると、V377T、E469K、D189Aのうちの1つ以上を含んでいる。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、変異TcBusterトランスポザーゼは、野生型TcBusterトランスポザーゼと比べて1つ以上の配列バリエーションを含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、配列番号17900に従って番号付けをすると、K573EとE578Lのうちの1つ以上を含んでいる。
いくつかの実施態様では、変異TcBusterトランスポザーゼは、配列番号17900に従って番号付けをすると、アミノ酸置換I452Kを含んでいる。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、変異TcBusterトランスポザーゼは、野生型TcBusterトランスポザーゼと比べて1つ以上の配列バリエーションを含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、配列番号17900に従って番号付けをすると、A358Kを含んでいる。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、変異TcBusterトランスポザーゼは、野生型TcBusterトランスポザーゼと比べて1つ以上の配列バリエーションを含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、配列番号17900に従って番号付けをすると、V297Kを含んでいる。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、変異TcBusterトランスポザーゼは、野生型TcBusterトランスポザーゼと比べて1つ以上の配列バリエーションを含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、配列番号17900に従って番号付けをすると、N85Sを含んでいる。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、変異TcBusterトランスポザーゼは、野生型TcBusterトランスポザーゼと比べて1つ以上の配列バリエーションを含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、配列番号17900に従って番号付けをすると、I452F、V377T、E469K、D189Aのうちの1つ以上を含んでいる。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、変異TcBusterトランスポザーゼは、野生型TcBusterトランスポザーゼと比べて1つ以上の配列バリエーションを含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、配列番号17900に従って番号付けをすると、A358K、V377T、E469K、D189Aのうちの1つ以上を含んでいる。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、変異TcBusterトランスポザーゼは、野生型TcBusterトランスポザーゼと比べて1つ以上の配列バリエーションを含んでいる。いくつかの実施態様では、1つ以上の配列バリエーションは、配列番号17900に従って番号付けをすると、V377T、E469K、D189A、K573E、E578Lのうちの1つ以上を含んでいる。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、TcBusterトランスポザーゼは、
1 Cagtgttctt caacctttgc catccggcgg aaccctttgt cgagatattt ttttttatgg
61 aacccttcat ttagtaatac acccagatga gattttaggg acagctgcgt tgacttgtta
121 cgaacaaggt gagcccgtgc tttggtctag ccaagggcat ggtaaagact atattcgcgg
181 cgttgtgaca atttaccgaa caactccgcg gccgggaagc cgatctcggc ttgaacgaat
241 tgttaggtgg cggtacttgg gtcgatatca aagtgcatca cttcttcccg tatgcccaac
301 tttgtataga gagccactgc gggatcgtca ccgtaatctg cttgcacgta gatcacataa
361 gcaccaagcg cgttggcctc atgcttgagg agattgatga gcgcggtggc aatgccctgc
421 ctccggtgct cgccggagac tgcgagatca tagatata（配列番号17902）の配列を含むか、この配列からなる5'逆方向反復を認識する。

本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、TcBusterトランスポザーゼは、
1 gatatcaagc ttatcgatac cgtcgacctc gagatttctg aacgattcta ggttaggatc
61 aaacaaaata caatttattt taaaactgta agttaactta cctttgcttg tctaaaccaa
121 aaacaacaac aaaactacga ccacaagtac agttacatat ttttgaaaat taaggttaag
181 tgcagtgtaa gtcaactatg cgaatggata acatgtttca acatgaaact ccgattgacg
241 catgtgcatt ctgaagagcg gcgcggccga cgtctctcga attgaagcaa tgactcgcgg
301 aaccccgaaa gcctttgggt ggaaccctag ggttccgcgg aacacaggtt gaagaacact
361 g（配列番号17903）の配列を含むか、この配列からなる3'逆方向反復を認識する。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、TcBusterトランスポザーゼは、配列番号17902の配列を含むか、この配列からなる5'逆方向反復と、配列番号17903の配列を含むか、この配列からなる3'逆方向反復を認識する。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、TcBusterトランスポザーゼは、
1 Cctgcaggag tgttcttcaa cctttgccat ccggcggaac cctttgtcga gatatttttt
61 tttatggaac ccttcattta gtaatacacc cagatgagat tttagggaca gctgcgttga
121 cttgttacga acaaggtgag cccgtgcttt ggtaataaaa actctaaata agatttaaat
181 ttgcatttat ttaaacaaac tttaaacaaa aagataaata ttccaaataa aataatatat
241 aaaataaaaa ataaaaatta atgacttttt tgcgcttgct tattattgca caaattatca
301 atatcgggat ggatcgttgt ttttt（配列番号17904）の配列を含むか、この配列からなる5'逆方向反復を認識する。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、TcBusterトランスポザーゼは、
1 Gagccaattc agcatcatat ttctgaacga ttctaggtta ggatcaaaca aaatacaatt
61 tattttaaaa ctgtaagtta acttaccttt gcttgtctaa acctaaaaca acaacaaaac
121 tacgaccaca agtacagtta catatttttg aaaattaagg ttaagtgcag tgtaagtcaa
181 ctatgcgaat ggataacatg tttcaacatg aaactccgat tgacgcatgt gcattctgaa
241 gagcggcgcg gccgacgtct ctcgaattga agcaatgact cgcggaaccc cgaaagcctt
301 tgggtggaac cctagggttc cgcggaacac aggttgaaga acactg（配列番号17905）の配列を含むか、この配列からなる3'逆方向反復を認識する。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、TcBusterトランスポザーゼは、配列番号17904の配列を含むか、この配列からなる5'逆方向反復と、配列番号17905の配列を含むか、この配列からなる3'逆方向反復を認識する。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、TcBusterトランスポザーゼは、配列番号17902、17903、17904、17905のうちの1つ以上と少なくとも5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、またはこれらの間の任意の割合が一致する配列を含むか、この配列からなる逆方向反復を認識する。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、TcBusterトランスポザーゼは、少なくとも持つ配列を含むか、この配列からなる逆方向反復を認識する。本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、TcBusterトランスポザーゼは、配列番号17902、17903、17904、17905、またはこれらの任意の一部と90％～100％一致する少なくとも5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、97個、99個、またはこれらの間の任意の個数の連続したヌクレオチドを有する配列を含むか、この配列からなる逆方向反復を認識する。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、TcBusterトランスポザーゼは、配列番号17902、17903、17904、17905、またはこれらの任意の一部と90％～100％一致する少なくとも5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、97個、99個、またはこれらの間の任意の個数の不連続なヌクレオチドを有する配列を含むか、この配列からなる逆方向反復を認識する。
本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、TcBusterトランスポザーゼは、3'逆方向反復と5'逆方向反復を含んでいる。本開示の組成物と方法のいくつかの実施態様では、TcBusterトランスポザーゼは、配列番号17902、17903、17904、17905、またはこれらの任意の一部と90％～100％一致する少なくとも5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、97個、99個、またはこれらの間の任意の個数の不連続なヌクレオチドを有する配列を含む3'逆方向反復と5'逆方向反復を含むTcBusterトランスポゾンまたは、この配列からなる3'逆方向反復と5'逆方向反復を含むTcBusterトランスポゾンを認識する。

転移に基づかない遺伝子改変法
本開示の方法のいくつかの実施態様では、本開示の改変されたHSCまたは改変されたHSC子孫細胞は、導入遺伝子を本開示のHSCまたはHSC子孫細胞に導入することによって生成させることができる。導入工程は、非転移送達系を通じた核酸配列および／またはゲノム編集コンストラクトの送達を含むことができる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、生体外、生体内、インビトロ、インサイチュいずれかでのHSCまたはHSC子孫細胞への核酸配列および／またはゲノム編集コンストラクトの導入は、局所的送達、吸着、吸収、電気穿孔、スピンフェクション、共培養、トランスフェクション、機械的送達、音波送達、振動送達、マグネトフェクション、ナノ粒子を媒介とした送達のうちの1つ以上を含んでいる。本開示の方法のいくつかの実施態様では、生体外、生体内、インビトロ、インサイチュいずれかでのHSCまたはHSC子孫細胞への核酸配列および／またはゲノム編集コンストラクトの導入は、リポソームトランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、FuGENEトランスフェクション、デンドリマーを媒介としたトランスフェクションを含んでいる。本開示の方法のいくつかの実施態様では、生体外、生体内、インビトロ、インサイチュいずれかでのHSCまたはHSC子孫細胞への核酸配列および／またはゲノム編集コンストラクトの機械的トランスフェクションによる導入は、細胞スクイージング、細胞ボンバードメント、遺伝子銃技術のいずれかを含んでいる。本開示の方法のいくつかの実施態様では、生体外、生体内、インビトロ、インサイチュいずれかでのHSCまたはHSC子孫細胞への核酸配列および／またはゲノム編集コンストラクトのナノ粒子を媒介としたトランスフェクションによる導入は、リポソーム送達、ミセルによる送達、ポリマーソームによる送達を含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、生体外、生体内、インビトロ、インサイチュいずれかでのHSCまたはHSC子孫細胞への核酸配列および／またはゲノム編集コンストラクトの導入は、非ウイルスベクターを含んでいる。いくつかの実施態様では、非ウイルスベクターは核酸を含んでいる。いくつかの実施態様では、非ウイルスベクターは、プラスミドDNA、直線状二本鎖DNA（dsDNA）、直線状一本鎖DNA（ssDNA）、DoggyBone（商標）DNA、ナノプラスミド、ミニサークルDNA、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ssODN）、DDNA オリゴヌクレオチド、一本鎖mRNA（ssRNA）、二本鎖mRNA（dsRNA）を含んでいる。いくつかの実施態様では、非ウイルスベクターは、本開示のトランスポゾンを含んでいる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、生体外、生体内、インビトロ、インサイチュいずれかでのHSCまたはHSC子孫細胞への核酸配列および／またはゲノム編集コンストラクトの導入は、ウイルスベクターを含んでいる。いくつかの実施態様では、ウイルスベクターは、非組み込み非染色体ベクターである。代表的な非組み込み非染色体ベクターの非限定的な例に含まれるのは、アデノ随伴ウイルス（AAV）、アデノウイルス、ヘルペスウイルスである。いくつかの実施態様では、ウイルスベクターは組み込み染色体ベクターである。組み込み染色体ベクターの非限定的な例に含まれるのは、アデノ随伴ベクター（AAV）、レンチウイルス、ガンマ-レトロウイルスである。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、生体外、生体内、インビトロ、インサイチュいずれかでのHSCまたはHSC子孫細胞への核酸配列および／またはゲノム編集コンストラクトの導入は、ベクターの組み合わせを含んでいる。ベクターの組み合わせの非限定的な代表例に含まれるのは、ウイルスベクターと非ウイルスベクター、複数の非ウイルスベクター、複数のウイルスベクターである。ベクターの組み合わせの代表的だが非限定的な例に含まれるのは、DNA由来のベクターとRNA由来のベクターの組み合わせ、RNAと逆転写酵素の組み合わせ、トランスポゾンとトランスポザーゼの組み合わせ、非ウイルスベクターとエンドヌクレアーゼの組み合わせ、ウイルスベクターとエンドヌクレアーゼの組み合わせである。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、生体外、生体内、インビトロ、インサイチュいずれかでのHSCまたはHSC子孫細胞への核酸配列および／またはゲノム編集コンストラクトの導入を含むゲノム改変により、核酸配列が安定に組み込まれるか、核酸配列が一過性に組み込まれるか、核酸配列の部位特異的組み込みが生じるか、核酸配列の偏った組み込みが生じる。いくつかの実施態様では、核酸配列は導入遺伝子である。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、生体外、生体内、インビトロ、インサイチュいずれかでのHSCまたはHSC子孫細胞への核酸配列および／またはゲノム編集コンストラクトの導入を含むゲノム改変により、核酸配列が安定に組み込まれる。いくつかの実施態様では、安定な染色体組み込みとして、ランダムな組み込み、部位特異的組み込み、偏った組み込みのいずれかが可能である。いくつかの実施態様では、部位特異的組み込みとして、支援なしの組み込み、または支援された組み込みが可能である。いくつかの実施態様では、支援された部位特異的組み込みは、部位指向性ヌクレアーゼの送達とともになされる。いくつかの実施態様では、部位指向性ヌクレアーゼは、ゲノム組み込みの部位の上流領域および下流領域とある割合が相同な5'ヌクレオチド配列延長部と3'ヌクレオチド配列延長部を有する導入遺伝子を含んでいる。いくつかの実施態様では、相同なヌクレオチド延長部を有する導入遺伝子により、相同組み換え、マイクロホモロジー媒介末端結合、非相同的末端結合のいずれかによるゲノム組み込みが可能になる。いくつかの実施態様では、部位特異的組み込みは、セーフハーバー部位で起こる。ゲノムのセーフハーバー部位は、新たな遺伝材料の組み込みを調節して、新たに挿入される遺伝エレメントが信頼性よく機能する（例えば治療に有効な発現レベルで発現する）ことと、宿主生物にリスクを生じさせる有害な変化を宿主のゲノムに引き起こさないことが保証されるようにすることができる。ゲノムの潜在的なセーフハーバーの非限定的な例に含まれるのは、ヒトアルブミン遺伝子のイントロン配列、アデノ随伴ウイルス部位1（AAVS1）、第19染色体上でAAVウイルスの組み込みが自然に起こる部位、ケモカイン（C-Cモチーフ）受容体5（CCR5）遺伝子の部位、マウスRosa26遺伝子座のヒトオルソログの部位である。
いくつかの実施態様では、部位特異的導入遺伝子組み込みは、標的遺伝子の発現を妨げる部位に起こる。いくつかの実施態様では、標的遺伝子の発現阻止は、イントロン、エキソン、プロモータ、遺伝エレメント、エンハンサ、サプレッサ、開始コドン、終止コドン、反応エレメントの位置での部位特異的組み込みによって起こる。いくつかの実施態様では、部位特異的組み込みの標的となる代表的な標的遺伝子の非限定的な例に含まれるのは、TRAC、TRAB、PDI、任意の免疫抑制遺伝子、アロ拒絶に関与する遺伝子である。
いくつかの実施態様では、部位特異的導入遺伝子組み込みは、標的遺伝子の発現が増大した部位で起こる。いくつかの実施態様では、標的遺伝子の発現増大は、イントロン、エキソン、プロモータ、遺伝エレメント、エンハンサ、サプレッサ、開始コドン、終止コドン、反応エレメントの位置での部位特異的組み込みによって起こる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、酵素を用いて宿主ゲノムで鎖の切断を作り出し、導入遺伝子の送達または組み込みを容易にすることができる。いくつかの実施態様では、酵素が一本鎖の切断を作り出す。いくつかの実施態様では、酵素が二本鎖の切断を作り出す。いくつかの実施態様では、切断を誘導する酵素の非限定的な例に含まれるのは、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、エンドヌクレアーゼ、CRISPR-Cas9、転写アクチベータ様エフェクタヌクレアーゼ（TALEN）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、Cas-CLOVER（商標）、CPF1である。いくつかの実施態様では、切断を誘導する酵素は、DNAにコードされて、mRNAにコードされて、タンパク質として、ガイドRNA（gRNA）との核タンパク質複合体として、細胞に送達することができる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、部位特異的導入遺伝子組み込みは、ベクターを媒介とした組み込み部位バイアスによって制御される。いくつかの実施態様では、ベクターを媒介とした組み込み部位バイアスは、選択されたレンチウイルスベクターによって制御される。いくつかの実施態様では、ベクターを媒介とした組み込み部位バイアスは、選択されたガンマ-レトロウイルスベクターによって制御される。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、部位特異的導入遺伝子組み込み部位は、不安定な染色体挿入である。いくつかの実施態様では、組み込まれた導入遺伝子は、沈黙した状態、除去された状態、切除された状態、さらに改変された状態のいずれかになることができる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、ゲノム改変は、導入遺伝子の不安定な組み込みである。いくつかの実施態様では、不安定な組み込みとして、一過性の非染色体組み込み、準安定な非染色体組み込み、準持続的な非染色体挿入、不安定な染色体挿入のいずれかが可能である。いくつかの実施態様では、一過性の非染色体挿入として、染色体外挿入、または細胞質挿入が可能である。
いくつかの実施態様では、導入遺伝子の一過性の非染色体挿入は染色体に組み込まれず、改変された遺伝材料が細胞分裂の間に複製されない。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、ゲノム改変は、導入遺伝子の準安定な、または持続的な非染色体組み込みである。いくつかの実施態様では、DNAベクターは、核マトリックスタンパク質に結合する足場／マトリックス付着領域（S-MAR）モジュールをコードしていて非ウイルスベクターをエピソーマル保持するため、分裂している細胞の核における自律的複製が可能になる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、ゲノム改変は、導入遺伝子の不安定な染色体組み込みである。いくつかの実施態様では、組み込まれた導入遺伝子は、沈黙した状態、除去された状態、切除された状態、さらに改変された状態のいずれかになることができる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、導入遺伝子の挿入によるゲノムの改変は、相同組み換え（HR）、マイクロホモロジー媒介末端結合（MMEJ）、非相同末端結合（NHEJ）、トランスポザーゼ酵素媒介修飾、インテグラーゼ酵素媒介修飾、エンドヌクレアーゼ酵素媒介修飾、組み換え酵素媒介修飾のいずれかによる宿主細胞指向性二本鎖切断修復（相同組み換え修復）を通じて起こることができる。いくつかの実施態様では、導入遺伝子の挿入によるゲノムの改変は、CRISPR-Cas9、TALEN、ZFN、Cas-CLOVER、cpf1を通じて起こることができる。
新たなヌクレアーゼ／核酸、または存在しているヌクレアーゼ／核酸の挿入が関与する遺伝子編集系では、切断酵素（例えばヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、トランスポザーゼ）に加えて挿入ツール（例えばDNA鋳型ベクター、転移可能エレメント（トランスポゾンまたはレトロトランスポゾン））を細胞に送達せねばならない。リコンビナーゼのためのそのような挿入ツールの例に含めることができるのはDNAベクターである。他の遺伝子編集系は、インテグラーゼを挿入ベクターとともに送達すること、トランスポザーゼをトランスポゾン／レトロトランスポゾンとともに送達すること、などを必要とする。いくつかの実施態様では、切断酵素として使用できるリコンビナーゼの一例は、CREリコンビナーゼである。さまざまな実施態様では、挿入ツールで使用できるインテグラーゼの例に含まれるのは、多数のウイルスのうちの任意のウイルスから取られたウイルスに基づく酵素であり、ウイルスの非限定的な例に含まれるのは、AAV、ガンマ-レトロウイルス、レンチウイルスである。挿入ツールで使用できるトランスポゾン／レトロトランスポゾンの非限定的な例に含まれるのは、piggyBacトランスポゾン、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン、L1レトロトランスポゾンである。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、導入遺伝子は生体内に送達される。本開示の方法のいくつかの実施態様では、生体内導入遺伝子送達は、局所的送達、吸着、吸収、電気穿孔、スピンフェクション、共培養、トランスフェクション、機械的送達、音波送達、振動送達、マグネトフェクション、ナノ粒子を媒介とした送達のいずれかによって実行できる。本開示の方法のいくつかの実施態様では、生体内導入遺伝子送達は、リポソームトランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、FuGENEトランスフェクション、デンドリマーを媒介としたトランスフェクションによって実行できる。本開示の方法のいくつかの実施態様では、生体内への機械的導入遺伝子送達は、細胞スクイージング、細胞ボンバードメント、遺伝子銃によって実行することができる。本開示の方法のいくつかの実施態様では、ナノ粒子を媒介とした生体内導入遺伝子送達は、リポソーム送達、ミセルによる送達、ポリマーソームによって実行することができる。さまざまな実施態様では、切断酵素として使用できるヌクレアーゼの非限定的な例に含まれるのは、Cas9、転写アクチベータ様エフェクタヌクレアーゼ（TALEN）、ジンクフィンガーヌクレアーゼである。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、非ウイルスベクターを用いて導入遺伝子を送達する。いくつかの実施態様では、非ウイルスベクターは核酸である。いくつかの実施態様では、核酸非ウイルスベクターは、プラスミドDNA、直線状二本鎖DNA（dsDNA）、直線状一本鎖DNA（ssDNA）、DoggyBone（商標）DNA、ナノプラスミド、ミニサークルDNA、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ssODN）、DDNA オリゴヌクレオチド、一本鎖mRNA（ssRNA）、二本鎖mRNA（dsRNA）である。いくつかの実施態様では、非ウイルスベクターはトランスポゾンである。いくつかの実施態様では、トランスポゾンはpiggyBac（商標）である。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、導入遺伝子の送達は、ウイルスベクターを通じて実行できる。いくつかの実施態様では、ウイルスベクターは、非組み込み非染色体ベクターである。非組み込み非染色体ベクターには、アデノ随伴ウイルス（AAV）、アデノウイルス、ヘルペスウイルスを含めることができる。いくつかの実施態様では、ウイルスベクターは、組み込み染色体ベクターである。組み込み染色体ベクターには、アデノ随伴ウイルス（AAV）、レンチウイルス、ガンマ-レトロウイルスを含めることができる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、導入遺伝子の送達は、ベクターの組み合わせによって実行できる。ベクターの組み合わせの代表的だが非限定的な例に含めることができるのは、ウイルスベクター＋非ウイルスベクター、2つ以上の非ウイルスベクター、2つ以上のウイルスベクターである。ベクターの組み合わせの代表的だが非限定的な例に含めることができるのは、DNA由来のベクター＋RNA由来のベクター、RNA＋逆転写酵素、トランスポゾン＋トランスポザーゼ、非ウイルスベクター＋エンドヌクレアーゼ、ウイルスベクター＋エンドヌクレアーゼである。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、ゲノム改変として、導入遺伝子の安定な組み込み、導入遺伝子の一過性の組み込み、導入遺伝子の部位特異的組み込み、導入遺伝子の偏った組み込みのいずれかが可能である。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、ゲノム改変として、導入遺伝子の安定な染色体組み込みが可能である。いくつかの実施態様では、安定な染色体組み込みとして、ランダムな組み込み、部位特異的組み込み、偏った組み込みのいずれかが可能である。いくつかの実施態様では、部位特異的組み込みとして、支援なしの組み込み、または支援された組み込みが可能である。いくつかの実施態様では、支援された部位特異的組み込みは、部位指向性ヌクレアーゼの送達とともになされる。いくつかの実施態様では、部位指向性ヌクレアーゼは、ゲノム組み込みの部位の上流領域および下流領域と相同な部分を含む5'ヌクレオチド配列延長部と3'ヌクレオチド配列延長部を有する導入遺伝子を含んでいる。いくつかの実施態様では、相同なヌクレオチド延長部を有する導入遺伝子により、相同組み換え、マイクロホモロジー媒介末端結合、非相同的末端結合のいずれかによるゲノム組み込みが可能になる。いくつかの実施態様では、部位特異的組み込みは、セーフハーバー部位で起こる。ゲノムのセーフハーバー部位は、新たな遺伝材料の組み込みを調節して、新たに挿入される遺伝エレメントが信頼性よく機能する（例えば治療に有効な発現レベルで発現する）ことと、宿主生物にリスクを生じさせる有害な変化を宿主のゲノムに引き起こさないことが保証されるようにすることができる。ゲノムの潜在的なセーフハーバーの非限定的な例に含まれるのは、ヒトアルブミン遺伝子のイントロン配列、アデノ随伴ウイルス部位1（AAVS1）、第19染色体上でAAVウイルスの組み込みが自然に起こる部位、ケモカイン（C-Cモチーフ）受容体5（CCR5）遺伝子の部位、マウスRosa26遺伝子座のヒトオルソログの部位である。
いくつかの実施態様では、部位特異的導入遺伝子組み込みは、標的遺伝子の発現を妨げる部位に起こる。いくつかの実施態様では、標的遺伝子の発現阻止は、イントロン、エキソン、プロモータ、遺伝エレメント、エンハンサ、サプレッサ、開始コドン、終止コドン、反応エレメントの位置での部位特異的組み込みによって起こる。いくつかの実施態様では、部位特異的組み込みの標的となる代表的な標的遺伝子の非限定的な例に含まれるのは、TRAC、TRAB、PDI、任意の免疫抑制遺伝子、アロ拒絶に関与する遺伝子である。
いくつかの実施態様では、部位特異的導入遺伝子組み込みは、標的遺伝子の発現が増大した部位で起こる。いくつかの実施態様では、標的遺伝子の発現増大は、イントロン、エキソン、プロモータ、遺伝エレメント、エンハンサ、サプレッサ、開始コドン、終止コドン、反応エレメントの位置での部位特異的組み込みによって起こる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、酵素を用いて宿主ゲノムに鎖の切断を作り出し、導入遺伝子の送達または組み込みを容易にすることができる。いくつかの実施態様では、酵素が一本鎖の切断を作り出す。いくつかの実施態様では、酵素が二本鎖の切断を作り出す。いくつかの実施態様では、切断を誘導する酵素の非限定的な例に含まれるのは、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、エンドヌクレアーゼ、CRISPR-Cas9、転写アクチベータ様エフェクタヌクレアーゼ（TALEN）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、Cas-CLOVER（商標）、cpf1である。いくつかの実施態様では、切断を誘導する酵素は、DNAにコードされて、mRNAにコードされて、タンパク質として、ガイドRNA（gRNA）との核タンパク質複合体として、細胞に送達することができる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、部位特異的導入遺伝子組み込みは、ベクターを媒介とした組み込み部位バイアスによって制御される。いくつかの実施態様では、ベクターを媒介とした組み込み部位バイアスは、選択されたレンチウイルスベクターによって制御される。いくつかの実施態様では、ベクターを媒介とした組み込み部位バイアスは、選択されたガンマ-レトロウイルスベクターによって制御される。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、部位特異的導入遺伝子組み込み部位は、不安定な染色体挿入である。いくつかの実施態様では、組み込まれた導入遺伝子は、沈黙した状態、除去された状態、切除された状態、さらに改変された状態のいずれかになることができる。本開示の方法のいくつかの実施態様では、ゲノム改変は、導入遺伝子の不安定な組み込みである。いくつかの実施態様では、不安定な組み込みとして、一過性の非染色体組み込み、準安定な非染色体組み込み、準持続的な非染色体挿入、不安定な染色体挿入のいずれかが可能である。いくつかの実施態様では、一過性の非染色体挿入として、染色体外挿入、または細胞質挿入が可能である。いくつかの実施態様では、導入遺伝子が一過性の非染色体挿入によって染色体に組み込まれることはなく、改変された遺伝材料が細胞分裂の間に複製されることはない。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、ゲノム改変は、導入遺伝子の準安定な非染色体組み込みまたは準持続的な非染色体組み込みである。いくつかの実施態様では、DNAベクターは、核マトリックスタンパク質に結合する足場／マトリックス付着領域（S-MAR）モジュールをコードしていて非ウイルスベクターをエピソーマル保持するため、分裂している細胞の核における自律的複製が可能になる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、ゲノム改変は、導入遺伝子の不安定な染色体組み込みである。いくつかの実施態様では、組み込まれた導入遺伝子は、沈黙した状態、除去された状態、切除された状態、さらに改変された状態のいずれかになることができる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、導入遺伝子の挿入によるゲノムの改変は、相同組み換え（HR）、マイクロホモロジー媒介末端結合（MMEJ）、非相同末端結合（NHEJ）、トランスポザーゼ酵素媒介修飾、インテグラーゼ酵素媒介修飾、エンドヌクレアーゼ酵素媒介修飾、組み換え酵素媒介修飾のいずれかによる宿主細胞指向性二本鎖切断修復（相同組み換え修復）を通じて起こることができる。いくつかの実施態様では、導入遺伝子挿入によるゲノムの改変は、CRISPR-Cas9、TALEN、ZFN、Cas-CLOVER、cpf1を通じて起こることができる。
本開示の方法のいくつかの実施態様では、生体内または生体外でゲノムが改変される細胞として、生殖系細胞または体細胞が可能である。いくつかの実施態様では、改変される細胞として、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、ラット細胞、マウス細胞、イヌ細胞が可能である。いくつかの実施態様では、改変される細胞は、分化した状態、未分化の状態、不死化状態のいずれかが可能である。いくつかの実施態様では、改変される未分化の細胞として幹細胞が可能である。いくつかの実施態様では、改変される細胞は、分化した状態、未分化の状態、不死化状態のいずれかが可能である。いくつかの実施態様では、改変される未分化の細胞として、人工多能性幹細胞が可能である。いくつかの実施態様では、改変される細胞として、T細胞、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、巨核球、破骨細胞のいずれかが可能である。いくつかの実施態様では、改変される細胞は、その細胞が休止している間に改変すること、活性化された状態で改変すること、休止中に改変すること、間期に改変すること、前期に改変すること、中期に改変すること、後期に改変すること、終期に改変することのいずれかが可能である。いくつかの実施態様では、改変される細胞として、新鮮なもの、低温保管されたもの、バルクのもの、下位集団に分類されたもの、全血からのもの、白血球除去からのもの、不死化された細胞系からのもののいずれかが可能である。

センチリン
本開示のセンチリンは、フィブロネクチンIII型（FN3）反復タンパク質、コード核酸または相補的な核酸、ベクター、宿主細胞、組成物、組み合わせ、製剤、装置、これらを作製する方法と利用する方法に由来するものが可能である。好ましい一実施態様では、センチリンは、ヒトテネイシン-C（今後は「テネイシン」と呼ぶ）からの多数のFN3ドメインのコンセンサス配列からなる。さらに好ましい一実施態様では、本発明の足場タンパク質は、15個のFN3ドメインのコンセンサス配列である。本開示のセンチリンは、さまざまな分子（例えば細胞の標的分子）に結合するように設計することができる。好ましい一実施態様では、本開示のセンチリンは、野生型の抗原および／またはバリアント形態の抗原のエピトープに結合するように設計することができる。
本開示のセンチリンは、追加の分子または部分（例えば抗体のFc領域、アルブミン結合ドメイン、半減期に影響を与える他の部分）を含むことができる。別の実施態様では、本開示のセンチリンは、センチリンをコードすることのできる核酸分子に結合することができる。
本開示により、多数のFN3ドメインのコンセンサス配列に基づく少なくとも1つのセンチリンを宿主細胞の中で発現させる少なくとも1つの方法として、本明細書に記載の宿主細胞を、少なくとも1つの足場タンパク質が検出可能な量および／または回収可能な量で発現する条件下で培養することを含む方法が提供される。
本開示により、（a）多数のFN3ドメインのコンセンサス配列および／または本明細書に記載のコード核酸に基づくセンチリンと、（b）適切な、および／または医薬として許容可能な担体または希釈剤を含む少なくとも1つの組成物が提供される。
本開示により、フィブロネクチンIII型（FN3）反復タンパク質（好ましくは多数のFN3ドメインのコンセンサス配列、より好ましくはヒトテネイシンからの多数のFN3ドメインのコンセンサス配列）に基づくセンチリンのライブラリを生成させる方法が提供される。ライブラリは、センチリンのさまざまな部分（例えばループ領域）の中の特定の位置にある分子内のアミノ酸を（変異によって）変えること、またはアミノ酸の数を変えることによってセンチリンを連続的に生成させることによって形成される。ライブラリは、単一のループのアミノ酸組成を変えることによって、またはセンチリン分子の多数のループまたは追加部分を同時に変えることによって生成させることができる。変化するループは、その変化に応じて長くなったり短くなったりする可能性がある。このようなライブラリは、各位置で可能なすべてのアミノ酸が含まれるように、またはアミノ酸の設計されたサブセットが含まれるように生成させることができる。ライブラリのメンバーは、提示（例えばインビトロでの提示、またはCIS提示（DNA提示、RNA提示、リボソーム提示など）、酵母提示、細菌提示、ファージ提示）によるスクリーニングに用いることができる。
本開示のセンチリンは、増強された生物物理学的特性（還元条件下での安定性、高濃度での溶解性）を提供する。本開示のセンチリンは、原核生物系（大腸菌など）、真核生物系（酵母など）、インビトロ転写／翻訳系（ウサギ網膜細胞ライセート系など）における発現と折り畳みが可能である。
本開示により、特定の標的に結合するセンチリン分子を生成させる方法として、その標的を用いて本発明のセンチリンライブラリをパンニングし、結合するセンチリンを検出することによる方法が提供される。他の関連する側面では、本開示は、望む活性を有する（例えば所定の親和性で標的タンパク質に結合できる）親和性成熟センチリンを生成させるのに使用できるスクリーニング法を含んでいる。親和性成熟は、さまざまな系（ファージ提示、インビトロ提示など）を用いて突然変異誘発と選択を何回も繰り返すことによって実現できる。このプロセスの間の突然変異誘発は、特定のセンチリン残基に対する部位指定突然変異誘発、および／またはエラーしやすいPCRに起因するランダムな突然変異誘発、および／またはDNAシャッフリング、および／またはこれらの技術の組み合わせの結果である可能性がある。
本開示により、フィブロネクチンIII型（FN3）反復タンパク質のコンセンサス配列に基づく単離された組み換えセンチリンおよび／または合成センチリン（その非限定的な例に、哺乳動物に由来するセンチリンが含まれる）のほか、コンセンサスFN3配列に基づくセンチリンをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドを含む組成物とコード核酸分子が提供される。本開示には、非限定的な例として、そのような核酸とセンチリンの作製方法と利用方法（診断用と治療用の組成物、方法、装置が含まれる）がさらに含まれる。
本開示のセンチリンは、従来の治療薬と比べてさまざまな利点を提供する。それは例えば、局所的投与、経口投与、血液－脳関門の通過が可能であること、大腸菌の中で発現させることができるため、哺乳動物細胞での発現と比べて供給源に応じてタンパク質の発現を増大させることが可能であること、操作して、多数の標的に、または同じ標的の多数のエピトープに結合する二重特異性分子またはタンデム分子にすることが可能であること、薬、ポリマー、プローブに結合させることが可能であること、高濃度の製剤にすることが可能であること、このような分子を疾患組織や腫瘍に効果的に浸透させることが可能であることである。
さらに、センチリンは、抗体の可変領域を模倣する折り畳みに関係する抗体の特性の多くを有する。この方向性により、抗体相補性決定領域（CDR）と同様、FN3ループを露出させることができる。FN3ループは細胞標的に結合できるはずであり、ループを変化させて（例えば親和性成熟させて）ある種の結合特性または関係する特性を改善することができる。
本開示のセンチリンの6つのループのうちの3つは、トポロジー的に抗体の相補性決定領域（CDR1～CDR3）、すなわち抗原結合領域に対応するのに対し、残る3つのループは、抗体CDRと同様に表面に露出する。これらのループは、配列番号18018の残基13～16、22～28、38～43、51～54、60～64、75～81の位置、またはほぼこれらの位置に広がっている。配列番号18018の残基22～28、51～54、75～81の位置、またはほぼこれらの位置にあるループ領域は、結合特異性と親和性が変化していることが好ましい。これらループ領域の1つ以上は、骨格部分としての配列を維持している他のループ領域および／または他の鎖とランダム化されてライブラリに追加され、強力に結合するものを、特定のタンパク質標的に対する大きな親和性を持つライブラリから選択することができる。ループ領域の1つ以上は、抗体CDRがタンパク質と相互作用するのと同様、標的タンパク質と相互作用することができる。
本開示のいくつかの実施態様では、PSMA特異的センチリンは、PSMAの配列に特異的に結合する能力を持つものを探すために設計する、および／または進化させる、および／または選択する。いくつかの実施態様では、PSMA特異的センチリンは、PSMAのエピトープに結合する抗PSMA抗体と同等の親和性でPSMAの配列に結合することができる。いくつかの実施態様では、PSMA特異的センチリンは、PSMAのエピトープに結合する抗PSMA抗体よりも強い親和性でPSMAの配列に結合することができる。いくつかの実施態様では、PSMA特異的センチリンは、抗体が結合することのできないPSMAの配列に結合することができる。例えばPSMAの配列は不連続であってもよく、二次構造を持っていてもよい。

CARTyrinの作製と生成
本開示の少なくとも1つのCARTyrinは、本分野で周知のように、場合によっては細胞系、混合された細胞系、不死化された細胞、不死化された細胞のクローン集団のいずれかによって生成させることができる。例えばAusubel他編『Current Protocols in Molecular Biology』、John Wiley & Sons, Inc.社、ニューヨーク、ニューヨーク州（1987年～2001年）；Sambrook他、『Molecular Cloning: A Laboratory Manual』、第2版、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州（1989年）；HarlowとLane、『Antibodies, a Laboratory Manual』、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州（1989年）；Colligan他編『Current Protocols in Immunology』、John Wiley & Sons, Inc.社、ニューヨーク（1994年～2001年）；Colligan他、『Current Protocols in Protein Science』、John Wiley & Sons社、ニューヨーク、ニューヨーク州（1997年～2001年）を参照されたい。
本分野で知られているように、CARTyrinからのアミノ酸を変化させ、および／または付加し、および／または欠失させて、免疫原性を低下させることや、結合親和性、オン-レート、オフ-レート、アビディティ、特異性、半減期、安定性、可溶性のいずれか、または適切な他の任意の特徴を低下させること、または増強すること、または変化させることができる。
場合によっては、抗原に対する高親和性と他の好ましい生物学的特性を保持した状態でCARTyrinを操作することができる。この目標を達成するため、CARTyrinを調製することが、場合によっては親配列と操作された配列の三次元モデルを用いて親配列と概念的な操作された産物を分析するプロセスにより可能である。三次元モデルは当業者に一般に利用可能であって馴染みがある。選択された候補配列の確実そうな三次元配座構造を図解表示し、可能な免疫原性を測定できるコンピュータプログラムを利用できる（例えばモンロヴィア、カリフォルニア州のXencor, Inc.社のImmunofilterプログラム）。これらの表示を検討することで、候補配列が機能する際の残基の確実と思われる役割を分析すること、すなわち候補センチリンまたは候補CARTyrinが対応する抗原に結合する能力に影響を与える残基を分析することができる。このようにして、親配列と参照配列から残基を選択して組み合わせ、望む特徴（標的抗原に対する親和性など）を実現することができる。その代わりに、またはそれに加えて、上記の手続き、他の適切な操作方法を利用することができる。

CARTyrinタンパク質のスクリーニング
似たタンパク質または断片への特異的結合に関するセンチリンまたはCARTyrinのスクリーニングは、例えばヌクレオチド（DNAまたはRNA）提示ライブラリまたはペプチド提示ライブラリ（例えばインビトロ提示）を用いて簡単に実現することができる。この方法は、ペプチドの大きなコレクションをスクリーニングして望む機能または構造を持つ個々のメンバーを探すことを含んでいる。提示されるヌクレオチド配列またはペプチド配列は、長さを3～5000個以上のヌクレオチドまたはアミノ酸にすること、頻繁には長さを5～100個のアミノ酸にすること、しばしば長さを8～25個のアミノ酸にすることができる。ペプチドライブラリを生成させるための直接的な化学合成法に加え、いくつかの組み換えDNA法がこれまでに記載されている。1つのタイプは、ペプチド配列をバクテリオファージまたは細胞の表面に提示することを含んでいる。それぞれのバクテリオファージまたは細胞は、提示される特定のペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含んでいる。本開示のセンチリンまたはCARTyrinは、広い範囲の親和性（KD）でヒトまたは他の哺乳動物のタンパク質に結合することができる。好ましい一実施態様では、本発明の少なくとも1つのセンチリンが場合によっては標的タンパク質に大きな親和性で結合することができ、例えばKDは約10-7 M以下であり、その値の非限定的な例は、0.1～9.9（またはその間の任意の範囲または値）×10－8、10－9、10－10、10－11、10－12、10－13、10－14、10－15、またはこれらの間の任意の範囲または値である。親和性は、当業者が実践しているように、表面プラズモン共鳴またはKinexa法によって求められる。
抗原に対するセンチリンまたはCARTyrinの親和性またはアビディティは、適切な任意の方法を利用して実験で求めることができる。（例えば『Fundamental Immunology』、Paul, W. E.編、Raven Press社：ニューヨーク、ニューヨーク州（1984年）の中のBerzofsky他、「Antibody-Antigen Interactions」；Kuby, Janis、『Immunology』、W.H. Freeman and Company社：ニューヨーク、ニューヨーク州（1992年）を参照されたい）。特定のセンチリン-抗原の親和性またはセンチリン-抗原相互作用の測定値は、異なる条件（例えば塩濃度、pH）で測定された場合には異なる可能性がある。したがって親和性と他の抗原結合パラメータ（例えばKD、Kon、Koff）の測定は、センチリンまたはCARTyrinと抗原の標準化された溶液と、標準化されたバッファ（本明細書に記載されているバッファなど）を用いてなされることが好ましい。
本開示のセンチリンまたはCARTyrinを用いて競合アッセイを実施し、どのタンパク質、どの抗体、他のどのアンタゴニストが標的タンパク質への結合に関して本発明のセンチリンまたはCARTyrinと競合するか、および／またはエピトープ領域を共有するかを明らかにすることができる。当業者によく知られているこれらアッセイは、タンパク質上の限られた数の結合部位に関するアンタゴニスト相互間またはリガンド相互間の競合を評価する。競合の前または後にタンパク質および／または抗体を固定化または不溶化し、標的タンパク質に結合したサンプルを結合しなかったサンプルから、例えばデカント操作（タンパク質／抗体はあらかじめ不溶化されていた）または遠心分離（タンパク質／抗体は競合反応の後に沈殿した）によって分離する。また、競合的結合は、標的タンパク質へのセンチリンまたはCARTyrinの結合の存在または不在によって機能が変わるかどうか（例えばセンチリンまたはCARTyrinが例えば標識の酵素活性を抑制するのか強化するのか）によって明らかにすることができる。本分野で周知のように、ELISAとそれ以外の機能的アッセイを利用することができる。

核酸分子
センチリンまたはCARTyrinをコードする本開示の核酸分子は、RNAの形態（例えばmRNA、hnRNA、tRNA、または他の任意の形態）またはDNAの形態（その非限定的な例に、クローニングによって得られた、または合成で生成された、またはこれらの任意の組み合わせによるcDNAとゲノムDNAが含まれる）が可能である。DNAとして、三本鎖、二本鎖、一本鎖、またはこれらの任意の組み合わせが可能である。DNAまたはRNAの少なくとも1本の鎖の任意の部分が、コード鎖（センス鎖としても知られる）になること、または非コード鎖（アンチセンス鎖とも呼ばれる）になることができる。
本開示の単離された核酸分子は、場合によっては1つ以上のイントロンを有するオープンリーディングフレーム（ORF）（例えば少なくとも1つのCARTyrinの少なくとも1つの特定の部分だが、それに限定されない）を含む核酸分子；CARTyrinのコード配列を含む核酸分子；上記のヌクレオチド配列とは実質的に異なるが、遺伝暗号の縮重が原因で本明細書に記載のCARTyrinおよび／または本分野で知られているCARTyrinを相変わらずコードしているヌクレオチド配列を含む核酸分子を含むことができる。もちろん、遺伝暗号は本分野で周知である。したがって当業者にとって、本発明の特定のCARTyrinをコードするそのような縮重核酸バリアントを生成させることは定型作業であると考えられる。例えばAusbel他、上記文献を参照されたい。そのような核酸バリアントは本発明に含まれる。
本明細書に示されているように、CARTyrinをコードする核酸を含む本開示の核酸分子の非限定的な例に含めることができるのは、それ自体がCARTyrin断片のアミノ酸配列をコードする核酸；CARTyrin全体またはその一部のコード配列；CARTyrin、または断片、または部分のコード配列と、追加配列（例えば少なくとも1つのシグナルリーダーまたは融合ペプチドのコード配列（上記の追加コード配列（例えば少なくとも1つのイントロン）を持つ場合と持たない場合がある）と、追加の非コード配列（その非限定的な例には非コード5'配列と非コード3'配列が含まれ、それは例えば、転写、mRNAプロセシング（例えばリボソームの結合とmRNAの安定性）において役割を果たす、転写されるが翻訳されない配列であり、スプライシングシグナルとポリアデニル化シグナルが含まれる））；追加アミノ酸（追加機能を提供するアミノ酸など）をコードする追加コード配列である。したがってCARTyrinをコードする配列をマーカー配列（CARTyrinの断片または部分を含む融合したCARTyrinの精製を容易にするペプチドをコードする配列など）に融合させることができる。

本明細書に記載のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするポリヌクレオチド
本開示により、選択的ハイブリダイゼーション条件において本明細書に開示されているポリヌクレオチドにハイブリダイズする単離された核酸が提供される。したがってこの実施態様のポリヌクレオチドは、そのようなポリヌクレオチドを含む核酸の単離、および／または検出、および／または定量に使用できる。例えば本発明のポリヌクレオチドを用いて寄託されたライブラリの中の部分クローンまたは完全長クローンを同定すること、または単離すること、または増幅することができる。いくつかの実施態様では、ポリヌクレオチドは、ヒトまたは哺乳動物の核酸ライブラリから単離されるか、ヒトまたは哺乳動物の核酸ライブラリからのcDNAと相補的なゲノム配列またはcDNA配列である。
好ましいのは、cDNAライブラリが完全長配列の少なくとも80％を含んでいることであり、完全長配列の少なくとも85％または90％を含むことが好ましく、完全長配列の少なくとも95％を含むことがより好ましい。cDNAライブラリを規格化して稀な配列の表示を増やすことができる。相補的配列に対する配列一致度が低い配列では低い厳しさ、または中程度の厳しさのハイブリダイゼーション条件が典型的に利用されるが、それに限定されない。一致度がより大きい配列では場合によっては中程度と高い厳しさの条件を利用することができる。低い厳しさの条件では、配列一致が約70％の配列の選択的なハイブリダイゼーションが可能であるため、オルソログ配列またはパラログ配列の同定に利用することができる。
場合によっては、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされるCARTyrinの少なくとも一部をコードすることになろう。本発明のポリヌクレオチドには、本発明のCARTyrinをコードするポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズさせるのに使用できる核酸配列が含まれる。例えばAusubel、上記文献；Colligan、上記文献を参照されたい（それぞれの全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。

核酸の構成
本開示の単離された核酸は、本分野で周知のように、（a）組み換え法、および／または（b）合成技術、および／または（c）精製技術、および／または（d）これらの組み合わせを利用して作製することができる。
核酸は、好都合なことに本発明のポリヌクレオチドに加えて複数の配列を含むことができる。例えば1つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含むマルチクローニング部位を核酸の中に挿入してポリヌクレオチドを単離しやすくすることができる。また、翻訳可能な配列を挿入して本開示の翻訳されたポリヌクレオチドを単離しやすくすることができる。例えばヘキサ-ヒスチジンマーカー配列は、本開示のタンパク質を精製するための便利な手段を提供する。本開示の核酸（コード配列は除外する）は、場合によっては、本開示のポリヌクレオチドのクローニングおよび／または発現のためのベクター、またはアダプタ、またはリンカーである。
追加配列をそのようなクローニングおよび／または発現のための配列に付加し、クローニングおよび／または発現におけるその機能を最適化すること、またはポリヌクレオチドを単離しやすくすること、または細胞へのポリヌクレオチドの導入を改善することができる。クローニングベクター、発現ベクター、アダプタ、リンカーの使用は、本分野で周知である。（例えばAusbel、上記文献；またはSambrook、上記文献を参照されたい）。

核酸を構成するための組み換え法
本開示の単離された核酸組成物（RNA、cDNA、ゲノムDNA、またはこれらの任意の組み合わせ）は、当業者に知られている任意の数のクローニング法を利用して生物供給源から得ることができる。いくつかの実施態様では、厳しい条件下で本発明のポリヌクレオチドに選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを用いてcDNAライブラリまたはゲノムDNAライブラリの中の望む配列を同定する。RNAの単離と、cDNAライブラリおよびゲノムライブラリの構築は当業者に周知である。（例えばAusbel、上記文献；またはSambrook、上記文献を参照されたい）。

核酸をスクリーニングする方法と単離する方法
cDNAライブラリまたはゲノムライブラリは、本開示のポリヌクレオチドの配列に基づくプローブを用いてスクリーニングすることができる。プローブをゲノムDNA配列またはcDNA配列とハイブリダイズさせるのに使用し、同じ生物または異なる生物の中の相同な遺伝子を単離することができる。当業者は、厳しさがさまざまな程度のハイブリダイゼーションをアッセイで利用できることと；ハイブリダイゼーション媒体または洗浄媒体を厳しくできることを知っているであろう。ハイブリダイゼーションの条件が厳しくなるほど、二本鎖の形成が起こるためのプローブと標的の間の相補性の程度は大きくなるはずである。厳しさの程度は、温度、イオン強度、pH、部分的変性溶媒（ホルムアミドなど）の存在のうちの1つ以上によって制御することができる。例えばハイブリダイゼーションの厳しさは、例えばホルムアミドの濃度を0％～50％の範囲内で操作することを通じて反応溶液の極性を変化させることによってうまく変化する。検出可能な結合に必要とされる相補性（配列一致）の程度は、ハイブリダイゼーション媒体および／または洗浄媒体の厳しさに応じて変化するであろう。相補性の程度は、100％、または70～100％、またはその間の任意の範囲または値が最適であろう。しかしプローブとプライマーの中のわずかな配列変化は、ハイブリダイゼーション媒体および／または洗浄媒体の厳しさを低下させることによって補償できることを理解すべきである。
RNAまたはDNAの増幅法は本分野で周知であり、本明細書に提示されている教示とガイドに基づき、特別な実験なしに本開示に従って利用することができる。
DNAまたはRNAを増幅する公知の方法の非限定的な例に含まれるのは、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）とそれに関連する増幅法（例えばMullisらに付与されたアメリカ合衆国特許第4,683,195号、第4,683,202号、第4,800,159号、第4,965,188号；Taborらに付与されたアメリカ合衆国特許第4,795,699号、第4,921,794 号；Innisに付与されたアメリカ合衆国特許第5,142,033号；Wilsonらに付与されたアメリカ合衆国特許第5,122,464号；Innisに付与されたアメリカ合衆国特許第5,091,310号；Gyllenstenらに付与されたアメリカ合衆国特許第5,066,584号；Gelfandらに付与されたアメリカ合衆国特許第4,889,818号；Silverらに付与されたアメリカ合衆国特許第4,994,370号；Biswasに付与されたアメリカ合衆国特許第4,766,067号；Ringoldに付与されたアメリカ合衆国特許第4,656,134号を参照されたい）と、二本鎖DNA合成のための鋳型として標的配列に対するアンチセンスRNAを用いるRNA媒介増幅（MalekらにNASBAの商号で付与されたアメリカ合衆国特許第5,130,238号）であり、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている。（例えばAusubel、上記文献；またはSambrook、上記文献を参照されたい）。
例えばポリメラーゼ連鎖反応（PCR）技術を利用して本開示のポリヌクレオチドとそれに関連する遺伝子の配列をゲノムDNAライブラリまたはcDNAライブラリから直接増幅することができる。PCRと他のインビトロ増幅法は、例えば発現されることになるタンパク質をコードする核酸配列をクローニングするのにも有用である可能性や、サンプル中の望むmRNAの存在を検出するためのプローブ、または核酸シークエンシングのためのプローブ、または他の目的のためのプローブとして用いる核酸を作製するのにも有用である可能性がある。当業者をインビトロ増幅法に精通した状態にするのに十分な技術の例は、Berger、上記文献、Sambrook、上記文献、Ausubel、上記文献のほか、Mullis他、アメリカ合衆国特許第4,683,202号（1987年）； Innis他編、『PCR Protocols A Guide to Methods and Applications』、Academic Press Inc.社、サン・ディエゴ、カリフォルニア州（1990年）に見いだされる。ゲノムPCR増幅のための市販のキットが本分野で知られている。例えばAdvantage-GC Genomic PCR Kit（Clontech社）を参照されたい。それに加えて、例えばT4遺伝子32タンパク質（Boehringer Mannheim社）を用いて長いPCR産物の収率を改善することができる。

核酸を構成するための合成法
本開示の単離された核酸は、公知の方法によって直接的な化学合成で調製することもできる（例えばAusbel他、上記文献を参照されたい）。化学合成によって一般に一本鎖オリゴヌクレオチドが生成し、その一本鎖を鋳型として使用して、その一本鎖を、相補的配列とのハイブリダイゼーションによって、またはDNAポリメラーゼを用いた重合によって二本鎖DNAに変換することができる。当業者は、DNAの化学合成が約100個以上の塩基からなる配列に限定されることはなく、より長い配列をより短い配列の連結によって取得できることを認識しているであろう。

組み換え発現カセット
本開示により、本開示の核酸を含む組み換え発現カセットがさらに提供される。本開示の核酸配列（例えば本開示のCARTyrinをコードするcDNAまたはゲノム配列）を用いて組み換えカセットを構成し、少なくとも1つの望む宿主細胞に導入することができる。組み換え発現カセットは、典型的には、予定する宿主細胞の中でポリヌクレオチドの転写を指示することになる転写開始調節配列に機能可能に連結された本開示のポリヌクレオチドを含むことになろう。異種プロモータと非異種（すなわち内在性）プロモータの両方を用いて本開示の核酸の発現を指示することができる。
いくつかの実施態様では、プロモータ、またはエンハンサ、または他のエレメントとして機能する単離された核酸を非異種形態の本開示のポリヌクレオチドの適切な位置（上流、または下流、またはイントロンの中）に導入し、本開示のポリヌクレオチドの発現を上方調節または下方調節することができる。例えば内在性プロモータは、変異、および／または欠失、および／または置換によって生体内またはインビトロで変化する可能性がある。

ナノトランスポゾン
本開示により、本開示により、（a）第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列と、第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列と、ITR内配列を含む、トランスポゾンインサートをコードする配列と；（b）複製起点をコードしていて1～450個のヌクレオチド（端点を含む）を有する配列と、選択マーカーをコードしていて1～200個のヌクレオチド（端点を含む）を有する配列を含む、骨格をコードする配列と；（c）ITR間配列を含むナノトランスポゾンが提供される。いくつかの実施態様では、（c）のITR間配列は、（b）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、（a）のITR内配列は、（b）の配列を含んでいる。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、骨格をコードする配列は、1～600個（端点を含む）のヌクレオチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、骨格をコードする配列は、1～50個の ヌクレオチド、50～100個のヌクレオチド、100～150個のヌクレオチド、150～200個のヌクレオチド200～250個のヌクレオチド、250～300個のヌクレオチド、300～350個のヌクレオチド、350～400個のヌクレオチド、400～450個のヌクレオチド、450～500個のヌクレオチド、500～550個のヌクレオチド、550～600個のヌクレオチドのいずれかからなる（それぞれの範囲は端点を含む）。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、ITR間配列は、1～1000個（端点を含む）のヌクレオチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、ITR間配列は、1～50個のヌクレオチド、50～100個のヌクレオチド、100～150個のヌクレオチド150～200個のヌクレオチド、200～250個のヌクレオチド250～300個のヌクレオチド、300～350個のヌクレオチド、350～400個のヌクレオチド、400～450個のヌクレオチド、450～500個のヌクレオチド、500～550個のヌクレオチド、550～600個のヌクレオチド、600～650個のヌクレオチド、650～700個のヌクレオチド、700～750個のヌクレオチド、750～800個のヌクレオチド、800～850個のヌクレオチド、850～900個のヌクレオチド、900～950個のヌクレオチド、950～1000個のヌクレオチドのいずれかからなる（それぞれの範囲は端点を含む）。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、本開示の短いナノトランスポゾン（SNT）を含め、ITR間配列は、1～200個（端点を含む）のヌクレオチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、ITR間配列は、1～10個のヌクレオチド、10～20個のヌクレオチド、20～30個のヌクレオチド、30～40個のヌクレオチド、40～50個のヌクレオチド、50～60個のヌクレオチド、60～70個のヌクレオチド、70～80個のヌクレオチド、80～90個のヌクレオチド、90～100個のヌクレオチドのいずれかからなる（それぞれの範囲は端点を含む）。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、1～200個（端点を含む）のヌクレオチドを有する選択マーカーは、スクロース選択マーカーをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、スクロース選択マーカーをコードする配列は、RNA-OUT配列をコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、RNA-OUT配列をコードする配列は、137塩基対（bp）を含むか、137 bpからなる。いくつかの実施態様では、1～200個（端点を含む）のヌクレオチドを有する選択マーカーは、蛍光マーカーをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、1～200個（端点を含む）のヌクレオチドを有する選択マーカーは、細胞表面マーカーをコードする配列を含んでいる。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、複製起点をコードしていて1～450個（端点を含む）のヌクレオチドを有する配列は、ミニ複製起点をコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、複製起点をコードしていて1～450個（端点を含む）のヌクレオチドを有する配列は、R6K複製起点をコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、R6K複製起点は、R6Kガンマ複製起点を含んでいる。いくつかの実施態様では、R6K複製起点は、R6Kミニ複製起点を含んでいる。いくつかの実施態様では、R6K複製起点は、R6Kガンマミニ複製起点を含んでいる。いくつかの実施態様では、R6Kガンマミニ複製起点は、281塩基対（bp）を含むか、281 bpからなる。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、骨格をコードする配列は、組み換え部位、切除部位、連結部位、またはこれらの組み合わせを含んでいない。いくつかの実施態様では、ナノトランスポゾンも、骨格をコードする配列も、組み換え部位の産物、切除部位の産物、連結部位の産物、またはこれらの組み合わせを含んでいない。いくつかの実施態様では、ナノトランスポゾンも、骨格をコードする配列も、組み換え部位、切除部位、連結部位、またはこれらの組み合わせに由来しない。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、組み換え部位は、組み換えイベントから得られる配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、組み換え部位は、組み換えイベントの産物である配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、組み換えイベントは、リコンビナーゼの活性（例えばリコンビナーゼ部位）を含んでいる。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、骨格をコードする配列は、外来DNAをコードする配列をさらに含んでいない。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、ITR間配列は、組み換え部位、切除部位、連結部位、またはこれらの組み合わせを含んでいない。いくつかの実施態様では、ITR間配列は、組み換えイベントの産物、切除イベントの産物、連結イベントの産物、またはこれらの組み合わせを含んでいない。いくつかの実施態様では、ITR間配列は、組み換えイベント、切除イベント、連結イベント、またはこれらの組み合わせに由来しない。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、ITR間配列は、外来DNAをコードする配列を含んでいる。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、ITR内配列は、インシュレータをコードする少なくとも1つの配列と、哺乳動物細胞の中で外来性配列を発現させることのできるプロモータをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、ITR内配列は、インシュレータをコードする第1の配列と、哺乳動物細胞の中で外来性配列を発現させることのできるプロモータをコードする配列と、インシュレータをコードする第2の配列を含んでいる。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、ITR内配列は、インシュレータをコードする第1の配列と、哺乳動物細胞の中で外来性配列を発現させることのできるプロモータをコードする配列と、ポリアデノシン（ポリA）配列と、インシュレータをコードする第2の配列を含んでいる。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、ITR内配列は、インシュレータをコードする第1の配列と、哺乳動物細胞の中で外来性配列を発現させることのできるプロモータをコードする配列と、少なくとも1つの外来性配列と、ポリアデノシン（ポリA）配列と、インシュレータをコードする第2の配列を含んでいる。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、哺乳動物細胞の中で外来性配列を発現させることのできるプロモータをコードする配列は、ヒト細胞の中で外来性配列を発現させることができる。いくつかの実施態様では、哺乳動物細胞の中で外来性配列を発現させることのできるプロモータをコードする配列は、構成的プロモータをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、哺乳動物細胞の中で外来性配列を発現させることのできるプロモータをコードする配列は、誘導性プロモータをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、ITR内配列は、哺乳動物細胞の中で外来性配列を発現させることのできる第1のプロモータをコードする第1の配列と、哺乳動物細胞の中で外来性配列を発現させることのできる第2のプロモータをコードする第2の配列を含んでいて、第1のプロモータは構成的プロモータであり、第2のプロモータは誘導性プロモータであり、第1のプロモータをコードする第1の配列と第2のプロモータをコードする第2の配列は、反対方向を向いている。いくつかの実施態様では、哺乳動物細胞の中で外来性配列を発現させることのできるプロモータをコードする配列は、細胞のタイプまたは組織のタイプに特異的なプロモータをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、哺乳動物細胞の中で外来性配列を発現させることのできるプロモータをコードする配列は、EF1aプロモータをコードする配列、CMVプロモータをコードする配列、MNDプロモータをコードする配列、SV40プロモータをコードする配列、PGK1プロモータをコードする配列、Ubcプロモータをコードする配列、CAGプロモータをコードする配列、H1プロモータをコードする配列、U6プロモータをコードする配列のいずれかを含んでいる。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、ポリアデノシン（ポリA）配列は、ウイルスのポリA配列から単離されるか、ウイルスのポリA配列に由来する。いくつかの実施態様では、ポリアデノシン（ポリA）配列は、（SV40）ポリA配列から単離されるか、（SV40）ポリA配列に由来する。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列は、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、誘導性カスパーゼポリペプチドは、（a）リガンド結合領域と、（b）リンカーと、（c）カスパーゼポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含んでいない。いくつかの実施態様では、誘導性カスパーゼポリペプチドは、（a）リガンド結合領域と、（b）リンカーと、（c）切断型カスパーゼ9ポリペプチドを含むが、非ヒト配列は含んでいない。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む実施態様を含め、リガンド結合領域は、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、リガンド結合領域のアミノ酸配列は、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドは、配列の36位に修飾を含んでいる。いくつかの実施態様では、修飾は、36位にフェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換（F36V）を含んでいる。いくつかの実施態様では、FKBP12ポリペプチドは、GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE（配列番号14635）を含むアミノ酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、FKBP12ポリペプチドは、GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGATGTGGAACTGCTGAAGCTGGAG（配列番号14636）を含む核酸配列によってコードされている。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む実施態様を含め、リンカー領域は、GGGGS（配列番号14637）を含むアミノ酸配列、またはGGAGGAGGAGGATCC（配列番号14638）を含む核酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、リンカーをコードする核酸配列は制限部位を含んでいない。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む実施態様を含め、切断型カスパーゼ9ポリペプチドは、配列の87位にアルギニン（R）を含まないアミノ酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、切断型カスパーゼ9ポリペプチドは、配列の282位にアラニン（A）を含まないアミノ酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、切断型カスパーゼ9ポリペプチドは、GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS（配列番号14639）を含むアミノ酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、切断型カスパーゼ9ポリペプチドは、GGATTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC（配列番号14640）を含む核酸配列によってコードされている。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む実施態様を含め、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS（配列番号14641）を含むアミノ酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、ggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagacttgcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgcaacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgtggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagcaacaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagctggagggaggaggaggatccggatttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatgccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaacttctgcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggagaaggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtcccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctgtcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagccaaaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagcaccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggagggactgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtcttacagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagacactggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtggcaaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaagaaactgttctttaagacttcc（配列番号14642）を含む核酸配列によってコードされている。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む実施態様を含め、外来性配列は、選択マーカーをコードする配列をさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、選択マーカーをコードする配列は、検出可能なマーカーをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、検出可能なマーカーは、蛍光マーカーまたは細胞表面マーカーを含んでいる。いくつかの実施態様では、選択マーカーをコードする配列は、分裂している細胞の中で活性であり分裂していない細胞の中では活性でないタンパク質をコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、選択マーカーをコードする配列は、代謝マーカーをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、選択マーカーをコードする配列は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）突然変異タンパク質酵素をコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、DHFR突然変異タンパク質酵素は、
1 MVGSLNCIVA VSQNMGIGKN GDFPWPPLRN ESRYFQRMTT TSSVEGKQNL
61 VIMGKKTWFS IPEKNRPLKG RINLVLSREL KEPPQGAHFL SRSLDDALKL
121 TEQPELANKV DMVWIVGGSS VYKEAMNHPG HLKLFVTRIM QDFESDTFFP
181 EIDLEKYKLL PEYPGVLSDV QEEKGIKYKF EVYEKND（配列番号17012）のアミノ酸配列を含むか、このアミノ酸配列からなる。いくつかの実施態様では、DHFR突然変異タンパク質酵素は、atggtcgggtctctgaattgtatcgtcgccgtgagtcagaacatgggcattgggaagaatggcgatttcccatggccacctctgcgcaacgagtcccgatactttcagcggatgacaactacctcctctgtggaagggaaacagaatctggtcatcatgggaaagaaaacttggttcagcattccagagaagaaccggcccctgaaaggcagaatcaatctggtgctgtcccgagaactgaaggagccaccacagggagctcactttctgagccggtccctggacgatgcactgaagctgacagaacagcctgagctggccaacaaagtcgatatggtgtggatcgtcgggggaagttcagtgtataaggaggccatgaatcaccccggccatctgaaactgttcgtcacacggatcatgcaggactttgagagcgatactttctttcctgaaattgacctggagaagtacaaactgctgcccgaatatcctggcgtgctgtccgatgtccaggaagagaaaggcatcaaatacaagttcgaggtctatgagaagaatgac（配列番号17095）の配列を含むか、この配列からなる核酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、DHFR突然変異タンパク質酵素のアミノ酸配列は、80位、113位、153位のうちの1つ以上に変異をさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、DHFR突然変異タンパク質酵素のアミノ酸配列は、80位におけるフェニルアラニン（F）またはロイシン（L）の置換、113位におけるロイシン（L）またはバリン（V）の置換、153位におけるバリン（V）またはアスパラギン酸（D）の置換のうちの1つ以上を含んでいる。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む実施態様、および／または外来性配列が選択マーカーをコードする配列を含む実施態様を含め、外来性配列は、天然に存在しない抗原受容体をコードする配列、および／または治療用ポリペプチドをコードする配列をさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、天然に存在しない抗原受容体は、T細胞受容体（TCR）を含んでいる。いくつかの実施態様では、TCRをコードする配列は、対応する野生型配列と比べて挿入、欠失、置換、逆転、転移、フレームシフトのうちの1つ以上を含んでいる。いくつかの実施態様では、TCRをコードする配列は、キメラ配列または組み換え配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、天然に存在しない抗原受容体は、キメラ抗原受容体（CAR）を含んでいる。いくつかの実施態様では、CARは、（a）抗原認識領域を含むエクトドメインと、（b）膜貫通ドメインと、（c）少なくとも1つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、CARの（a）のエクトドメインは、シグナルペプチドをさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、CARの（a）のエクトドメインは、抗原認識領域と膜貫通ドメインの間にヒンジをさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、エンドドメインは、ヒトCD3ζエンドドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、少なくとも1つの共刺激ドメインは、ヒトの4-1BB細胞内セグメント、CD28細胞内セグメント、CD40細胞内セグメント、ICOS細胞内セグメント、MyD88細胞内セグメント、OX-40細胞内セグメントのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせを含んでいる。いくつかの実施態様では、少なくとも1つの共刺激ドメインは、ヒトのCD28共刺激ドメインおよび／または4-1BB共刺激ドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、抗原認識領域は、scFv、VHH、VH、センチリンのうちの1つ以上を含んでいる。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む実施態様、および／または外来性配列が選択マーカーをコードする配列を含む実施態様を含め、外来性配列は、トランスポザーゼをコードする配列をさらに含んでいる。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、ITR内配列は、選択マーカーをコードする配列と、外来性配列と、誘導性カスパーゼポリペプチドをコードする配列と、自己切断ペプチドをコードする少なくとも1つの配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、自己切断ペプチドをコードする少なくとも1つの配列は、（a）選択マーカーをコードする配列と外来性配列の間、（b）選択マーカーをコードする配列と誘導性カスパーゼポリペプチドの間、（c）外来性配列と誘導性カスパーゼポリペプチドの間のうちの1つ以上に位置する。いくつかの実施態様では、自己切断ペプチドをコードする第1の配列は、選択マーカーをコードする配列と外来性配列の間に位置し、自己切断ペプチドをコードする第2の配列は、外来性配列と誘導性カスパーゼポリペプチドの間に位置する。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が、誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、選択マーカーをコードする配列、外来性配列のうちの1つ以上を含む実施態様を含め、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、または第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼによって認識される。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、または第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、piggyBacトランスポザーゼによって認識される。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、または第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、piggyBac様トランスポザーゼによって認識される。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、または第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、TTAA認識配列、TTAT認識配列、TTAX認識配列のいずれかを含んでいる。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、または第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、TTAA認識配列、TTAT認識配列、TTAX認識配列のいずれかと、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼから単離されるか、これらトランスポザーゼに由来する配列と少なくとも50％一致する配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、または第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、少なくとも2個のヌクレオチド（nt）、または3個のnt、または4個のnt、または5個のnt、または6個のnt、または7個のnt、または8個のnt、または9個のnt、または10個のnt、または11個のnt、または12個のnt、または13個のnt、または14個のnt、または15個のnt、または16個のnt、または17個のnt、または18個のnt、または19個のnt、または20個のntを含んでいる。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が、誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、選択マーカーをコードする配列、外来性配列のうちの1つ以上を含む実施態様を含め、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、または第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼによって認識される。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、または第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、CCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATG（配列番号17096）の配列を含むか、CCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATG（配列番号17096）の配列と少なくとも70％一致する配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、または第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、CCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGCGTAAAATTGACGCATG（配列番号17097）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、または第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、CCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATG（配列番号17096）の配列を含むとともに、CCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGCGTAAAATTGACGCATG（配列番号17097）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、または第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、CCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATG（配列番号17096）の配列を含むとともに、CCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGTGTAAAATTGACGCATG（配列番号17098）の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、または第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、CCCTAGAAAGATAGTCTGCGTAAAATTGACGCATG（配列番号17096）の配列を含むとともに、TTAACCCTAGAAAGATAATCATATTGTGACGTACGTTAAAGATAATCATGTGTAAAATTGACGCATGTGTTTTATCGGTCTGTATATCGAGGTTTATTTATTAATTTGAATAGATATTAAGTTTTATTATATTTACACTTACATACTAATAATAAATTCAACAAACAATTTATTTATGTTTATTTATTTATTAAAAAAAACAAAAACTCAAAATTTCTTCTATAAAGTAACAAAACTTTTA（配列番号17099）の配列を含んでいる。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が、誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、選択マーカーをコードする配列、外来性配列のうちの1つ以上を含む実施態様を含め、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、または第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、piggyBacトランスポザーゼまたはpiggyBac様トランスポザーゼによって認識される。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、または第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTGATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14487）のアミノ酸配列と少なくとも20％一致するアミノ酸配列を持つpiggyBacトランスポザーゼによって認識される。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、または第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEI SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
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181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RMYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPNEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14487）のアミノ酸配列を持つpiggyBacトランスポザーゼによって認識される。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、または第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14484）のアミノ酸配列と少なくとも20％一致するアミノ酸配列を持つpiggyBacトランスポザーゼによって認識される。いくつかの実施態様では、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、または第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、
1 MGSSLDDEHI LSALLQSDDE LVGEDSDSEV SDHVSEDDVQ SDTEEAFIDE VHEVQPTSSG
61 SEILDEQNVI EQPGSSLASN RILTLPQRTI RGKNKHCWST SKSTRRSRVS ALNIVRSQRG
121 PTRMCRNIYD PLLCFKLFFT DEIISEIVKW TNAEISLKRR ESMTSATFRD TNEDEIYAFF
181 GILVMTAVRK DNHMSTDDLF DRSLSMVYVS VMSRDRFDFL IRCLRMDDKS IRPTLRENDV
241 FTPVRKIWDL FIHQCIQNYT PGAHLTIDEQ LLGFRGRCPF RVYIPNKPSK YGIKILMMCD
301 SGTKYMINGM PYLGRGTQTN GVPLGEYYVK ELSKPVHGSC RNITCDNWFT SIPLAKNLLQ
361 EPYKLTIVGT VRSNKREIPE VLKNSRSRPV GTSMFCFDGP LTLVSYKPKP AKMVYLLSSC
421 DEDASINEST GKPQMVMYYN QTKGGVDTLD QMCSVMTCSR KTNRWPMALL YGMINIACIN
481 SFIIYSHNVS SKGEKVQSRK KFMRNLYMSL TSSFMRKRLE APTLKRYLRD NISNILPKEV
541 PGTSDDSTEE PVMKKRTYCT YCPSKIRRKA NASCKKCKKV ICREHNIDMC QSCF（配列番号14484）のアミノ酸配列を持つpiggyBacトランスポザーゼによって認識される。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が、誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、選択マーカーをコードする配列、外来性配列のうちの1つ以上を含む実施態様を含め、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、または第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼによって認識される。いくつかの実施態様では、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼは、高活性なＳｌｅｅｐｉｎｇ Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ（SB100X）である。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が、誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、選択マーカーをコードする配列、外来性配列のうちの1つ以上を含む実施態様を含め、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、または第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、Helitronトランスポザーゼによって認識される。
本開示のナノトランスポゾンのいくつかの実施態様では、少なくとも1つの外来性配列が、誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、選択マーカーをコードする配列、外来性配列のうちの1つ以上を含む実施態様を含め、第1の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列、または第2の逆方向末端反復（ITR）をコードする配列は、Tol2トランスポザーゼによって認識される。
本開示により、本開示のナノトランスポゾンを含む細胞が提供される。いくつかの実施態様では、細胞は、トランスポザーゼ組成物をさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼ組成物は、ナノトランスポゾンの第1のITRまたは第2のITRを認識することのできるトランスポザーゼ、またはこのトランスポザーゼをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、トランスポザーゼ組成物は、そのトランスポザーゼをコードする配列を含むナノトランスポゾンを含んでいる。いくつかの実施態様では、細胞は、外来性配列を含む第1のナノトランスポゾンと、トランスポザーゼをコードする配列を含む第2のナノトランスポゾンを含んでいる。いくつかの実施態様では、細胞は同種他家由来細胞である。
本開示により、本開示のナノトランスポゾンを含む組成物が提供される。
本開示により、本開示の細胞を含む組成物が提供される。いくつかの実施態様では、細胞は、本開示のナノトランスポゾンを含んでいる。いくつかの実施態様では、細胞は、さらに改変されることがない。いくつかの実施態様では、細胞は同種他家由来である。
本開示により、本開示の細胞を含む組成物が提供される。いくつかの実施態様では、細胞は、本開示のナノトランスポゾンを含んでいる。いくつかの実施態様では、細胞は、さらに改変されることがない。いくつかの実施態様では、細胞は自己由来である。
本開示により、本開示の複数の細胞を含む組成物が提供される。いくつかの実施態様では、複数の細胞の少なくとも1個の細胞が、本開示のナノトランスポゾンを含んでいる。いくつかの実施態様では、複数の細胞の一部が、本開示のナノトランスポゾンを含んでいる。いくつかの実施態様では、その部分は、複数の細胞の少なくとも1％、2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、またはこれらの数値の間の任意の割合を含んでいる。いくつかの実施態様では、複数の細胞のそれぞれの細胞が、本開示のナノトランスポゾンを含んでいる。いくつかの実施態様では、複数の細胞は、本開示の改変された細胞を含んでいない。いくつかの実施態様では、複数の細胞の少なくとも1個の細胞は、さらに改変されることがない。いくつかの実施態様では、複数の細胞のどれも、さらに改変されることはない。いくつかの実施態様では、複数の細胞は同種他家由来である。いくつかの実施態様では、同種他家由来の複数の細胞は、本開示の方法に従って生成される。いくつかの実施態様では、複数の細胞は自己由来である。いくつかの実施態様では、自己由来の複数の細胞は、本開示の方法に従って生成される。
本開示により、改変された細胞として、この細胞がT細胞であり、（a）本開示のナノトランスポゾンと；（b）誘導性アポトーシス促進ポリペプチドをコードする配列と；（c）T細胞受容体（TCR）をコードする内在性配列の修飾を含んでいて、この修飾によってTCRの発現または活性のレベルが低下するか消失する改変された細胞が提供される。いくつかの実施態様では、細胞は、（d）HLAクラスI組織適合性抗原であるアルファ鎖E（HLA-E）を含む天然に存在しない配列と、（e）ベータ-2-ミクログロブリン（B2M）をコードする内在性配列の修飾をさらに含んでいて、この修飾によって主要組織適合性複合体（MHC）クラスI（MHC-I）の発現または活性のレベルが低下するか消失する。
本開示により、（a）本開示のナノトランスポゾンと；（b）誘導性アポトーシス促進ポリペプチドをコードする配列と；（c）HLAクラスI組織適合性抗原であるアルファ鎖E（HLA-E）を含む天然に存在しない配列と、（e）ベータ-2-ミクログロブリン（B2M）をコードする内在性配列の修飾を含んでいて、この修飾によって主要組織適合性複合体（MHC）クラスI（MHC-I）の発現または活性のレベルが低下するか消失する改変された細胞が提供される。
本開示の改変された細胞のいくつかの実施態様では、HLA-Eを含む天然に存在しない配列は、B2Mシグナルペプチドをコードする配列をさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、HLA-Eを含む天然に存在しない配列は、リンカーをさらに含んでいて、このリンカーは、B2Mシグナルペプチドをコードする配列と、HLA-Eをコードする配列の間に位置する。いくつかの実施態様では、HLA-Eを含む天然に存在しない配列は、ペプチドをコードする配列と、B2Mシグナルペプチドをコードする配列をさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、HLA-Eを含む天然に存在しない配列は、B2Mシグナルペプチドをコードする配列とこのペプチドをコードする配列の間に位置する第1のリンカーと、B2Mシグナルペプチドをコードする配列とHLA-Eをコードする配列の間に位置する第2のリンカーを含んでいる。
本開示の細胞と、改変されていない細胞と、改変された細胞のいくつかの実施態様では、細胞は哺乳動物細胞である。
本開示の細胞と、改変されていない細胞と、改変された細胞のいくつかの実施態様では、細胞はヒト細胞である。
本開示の細胞と、改変されていない細胞と、改変された細胞のいくつかの実施態様では、細胞は幹細胞である。
本開示の細胞と、改変されていない細胞と、改変された細胞のいくつかの実施態様では、細胞は、分化した細胞である。
本開示の細胞と、改変されていない細胞と、改変された細胞のいくつかの実施態様では、細胞は体細胞である。
本開示の細胞と、改変されていない細胞と、改変された細胞のいくつかの実施態様では、細胞は、免疫細胞または免疫細胞前駆体である。いくつかの実施態様では、免疫細胞は、リンパ球前駆細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、サイトカイン誘導キラー（CIK）細胞、Tリンパ球（T細胞）、Bリンパ球（B細胞）、抗原提示細胞（APC）のいずれかである。いくつかの実施態様では、免疫細胞は、T細胞、初期記憶T細胞、幹細胞様T細胞、幹記憶T細胞（Tscm）、セントラル記憶T細胞（Tcm）のいずれかである。いくつかの実施態様では、免疫細胞前駆体は、造血幹細胞（HSC）である。いくつかの実施態様では、細胞は抗原提示細胞（APC）である。
本開示の細胞と、改変されていない細胞と、改変された細胞のいくつかの実施態様では、細胞は、遺伝子編集組成物をさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、遺伝子編集組成物は、DNA結合ドメインをコードする配列と、ヌクレアーゼタンパク質またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、遺伝子編集組成物は、ヌクレアーゼタンパク質をコードする配列、またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、ヌクレアーゼタンパク質をコードする配列、またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列は、DNA配列、またはRNA配列、またはこれらの組み合わせを含んでいる。いくつかの実施態様では、ヌクレアーゼまたはそのヌクレアーゼドメインは、CRISPR/Casタンパク質、転写アクチベータ様エフェクタヌクレアーゼ（TALEN）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、エンドヌクレアーゼのうちの1つ以上を含んでいる。いくつかの実施態様では、CRISPR/Casタンパク質は、ヌクレアーゼ不活性化Cas（dCas）タンパク質を含んでいる。
本開示の細胞と、改変されていない細胞と、改変された細胞のいくつかの実施態様では、細胞は、遺伝子編集組成物をさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、遺伝子編集組成物は、DNA結合ドメインをコードする配列と、ヌクレアーゼタンパク質またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、ヌクレアーゼタンパク質またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列は、ヌクレアーゼ不活性化Cas（dCas）タンパク質と、エンドヌクレアーゼを含んでいる。いくつかの実施態様では、エンドヌクレアーゼは、Clo051ヌクレアーゼまたはそのヌクレアーゼドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、遺伝子編集組成物は、融合タンパク質を含んでいる。いくつかの実施態様では、融合タンパク質は、ヌクレアーゼ不活性化Cas（dCas）タンパク質と、Clo051ヌクレアーゼまたはClo051ヌクレアーゼドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、遺伝子編集組成物は、ガイド配列をさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、ガイド配列はRNA配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、融合タンパク質は、アミノ酸配列：
MAPKKKRKVEGIKSNISLLKDELRGQISHISHEYLSLIDLAFDSKQNRLFEMKVLELLVNEYGFKGRHLGGSRKPDGIVYSTTLEDNFGIIVDTKAYSEGYSLPISQADEMERYVRENSNRDEEVNPNKWWENFSEEVKKYYFVFISGSFKGKFEEQLRRLSMTTGVNGSAVNVVNLLLGAEKIRSGEMTIEELERAMFNNSEFILKYGGGGSDKKYSIGLAIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIKKNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNEMAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYPTIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDNSDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLENLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSKDTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEITKAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKNGYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRKQRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRIPYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFIERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMRKPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEISGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLFEDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGIRDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVSGQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPENIVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVENTQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDAIVPQSFLKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNAKLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQILDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREINNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRKMIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETNGETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESILPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGKSKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLPKYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYEKLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLDKVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDRKRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGDGSPKKKRKVSS（配列番号17013）を含むか、このアミノ酸配列からなる。あるいは融合タンパク質は、
1 atggcaccaa agaagaaaag aaaagtggag ggcatcaagt caaacatcag cctgctgaaa
61 gacgaactgc ggggacagat tagtcacatc agtcacgagt acctgtcact gattgatctg
121 gccttcgaca gcaagcagaa tagactgttt gagatgaaag tgctggaact gctggtcaac
181 gagtatggct tcaagggcag acatctgggc gggtctagga aacctgacgg catcgtgtac
241 agtaccacac tggaagacaa cttcggaatc attgtcgata ccaaggctta ttccgagggc
301 tactctctgc caattagtca ggcagatgag atggaaaggt acgtgcgcga aaactcaaat
361 agggacgagg aagtcaaccc caataagtgg tgggagaatt tcagcgagga agtgaagaaa
421 tactacttcg tctttatctc aggcagcttc aaagggaagt ttgaggaaca gctgcggaga
481 ctgtccatga ctaccggggt gaacggatct gctgtcaacg tggtcaatct gctgctgggc
541 gcagaaaaga tcaggtccgg ggagatgaca attgaggaac tggaacgcgc catgttcaac
601 aattctgagt ttatcctgaa gtatggaggc gggggaagcg ataagaaata ctccatcgga
661 ctggccattg gcaccaattc cgtgggctgg gctgtcatca cagacgagta caaggtgcca
721 agcaagaagt tcaaggtcct ggggaacacc gatcgccaca gtatcaagaa aaatctgatt
781 ggagccctgc tgttcgactc aggcgagact gctgaagcaa cccgactgaa gcggactgct
841 aggcgccgat atacccggag aaaaaatcgg atctgctacc tgcaggaaat tttcagcaac
901 gagatggcca aggtggacga tagtttcttt caccgcctgg aggaatcatt cctggtggag
961 gaagataaga aacacgagcg gcatcccatc tttggcaaca ttgtggacga agtcgcttat
1021 cacgagaagt accctactat ctatcatctg aggaagaaac tggtggactc caccgataag
1081 gcagacctgc gcctgatcta tctggccctg gctcacatga tcaagttccg ggggcatttt
1141 ctgatcgagg gagatctgaa ccctgacaat tctgatgtgg acaagctgtt catccagctg
1201 gtccagacat acaatcagct gtttgaggaa aacccaatta atgcctcagg cgtggacgca
1261 aaggccatcc tgagcgccag actgtccaaa tctaggcgcc tggaaaacct gatcgctcag
1321 ctgccaggag agaagaaaaa cggcctgttt gggaatctga ttgcactgtc cctgggcctg
1381 acacccaact tcaagtctaa ttttgatctg gccgaggacg ctaagctgca gctgtccaaa
1441 gacacttatg acgatgacct ggataacctg ctggctcaga tcggcgatca gtacgcagac
1501 ctgttcctgg ccgctaagaa tctgagtgac gccatcctgc tgtcagatat tctgcgcgtg
1561 aacacagaga ttactaaggc cccactgagt gcttcaatga tcaaaagata tgacgagcac
1621 catcaggatc tgaccctgct gaaggctctg gtgaggcagc agctgcccga gaaatacaag
1681 gaaatcttct ttgatcagag caagaatgga tacgccggct atattgacgg cggggcttcc
1741 caggaggagt tctacaagtt catcaagccc attctggaaa agatggacgg caccgaggaa
1801 ctgctggtga agctgaatcg ggaggacctg ctgagaaaac agaggacatt tgataacgga
1861 agcatccctc accagattca tctgggcgaa ctgcacgcca tcctgcgacg gcaggaggac
1921 ttctacccat ttctgaagga taaccgcgag aaaatcgaaa agatcctgac cttcagaatc
1981 ccctactatg tggggcctct ggcacgggga aatagtagat ttgcctggat gacaagaaag
2041 tcagaggaaa ctatcacccc ctggaacttc gaggaagtgg tcgataaagg cgctagcgca
2101 cagtccttca ttgaaaggat gacaaatttt gacaagaacc tgccaaatga gaaggtgctg
2161 cccaaacaca gcctgctgta cgaatatttc acagtgtata acgagctgac taaagtgaag
2221 tacgtcaccg aagggatgcg caagcccgca ttcctgtccg gagagcagaa gaaagccatc
2281 gtggacctgc tgtttaagac aaatcggaaa gtgactgtca aacagctgaa ggaagactat
2341 ttcaagaaaa ttgagtgttt cgattcagtg gaaatcagcg gcgtcgagga caggtttaac
2401 gcctccctgg ggacctacca cgatctgctg aagatcatca aggataagga cttcctggac
2461 aacgaggaaa atgaggacat cctggaggac attgtgctga cactgactct gtttgaggat
2521 cgcgaaatga tcgaggaacg actgaagact tatgcccatc tgttcgatga caaagtgatg
2581 aagcagctga aaagaaggcg ctacaccgga tggggacgcc tgagccgaaa actgatcaat
2641 gggattagag acaagcagag cggaaaaact atcctggact ttctgaagtc cgatggcttc
2701 gccaacagga acttcatgca gctgattcac gatgactctc tgaccttcaa ggaggacatc
2761 cagaaagcac aggtgtctgg ccagggggac agtctgcacg agcatatcgc aaacctggcc
2821 ggcagccccg ccatcaagaa agggattctg cagaccgtga aggtggtgga cgaactggtc
2881 aaggtcatgg gacgacacaa acctgagaac atcgtgattg agatggcccg cgaaaatcag
2941 acaactcaga agggccagaa aaacagtcga gaacggatga agagaatcga ggaaggcatc
3001 aaggagctgg ggtcacagat cctgaaggag catcctgtgg aaaacactca gctgcagaat
3061 gagaaactgt atctgtacta tctgcagaat ggacgggata tgtacgtgga ccaggagctg
3121 gatattaaca gactgagtga ttatgacgtg gatgccatcg tccctcagag cttcctgaag
3181 gatgactcca ttgacaacaa ggtgctgacc aggtccgaca agaaccgcgg caaatcagat
3241 aatgtgccaa gcgaggaagt ggtcaagaaa atgaagaact actggaggca gctgctgaat
3301 gccaagctga tcacacagcg gaaatttgat aacctgacta aggcagaaag aggaggcctg
3361 tctgagctgg acaaggccgg cttcatcaag cggcagctgg tggagacaag acagatcact
3421 aagcacgtcg ctcagattct ggatagcaga atgaacacaa agtacgatga aaacgacaag
3481 ctgatcaggg aggtgaaagt cattactctg aaatccaagc tggtgtctga ctttagaaag
3541 gatttccagt tttataaagt cagggagatc aacaactacc accatgctca tgacgcatac
3601 ctgaacgcag tggtcgggac cgccctgatt aagaaatacc ccaagctgga gtccgagttc
3661 gtgtacggag actataaagt gtacgatgtc cggaagatga tcgccaaatc tgagcaggaa
3721 attggcaagg ccaccgctaa gtatttcttt tacagtaaca tcatgaattt ctttaagacc
3781 gaaatcacac tggcaaatgg ggagatcaga aaaaggcctc tgattgagac caacggggag
3841 acaggagaaa tcgtgtggga caagggaagg gattttgcta ccgtgcgcaa agtcctgtcc
3901 atgccccaag tgaatattgt caagaaaact gaagtgcaga ccgggggatt ctctaaggag
3961 agtattctgc ctaagcgaaa ctctgataaa ctgatcgccc ggaagaaaga ctgggacccc
4021 aagaagtatg gcgggttcga ctctccaaca gtggcttaca gtgtcctggt ggtcgcaaag
4081 gtggaaaagg ggaagtccaa gaaactgaag tctgtcaaag agctgctggg aatcactatt
4141 atggaacgca gctccttcga gaagaatcct atcgattttc tggaagccaa gggctataaa
4201 gaggtgaaga aagacctgat cattaagctg ccaaaatact cactgtttga gctggaaaac
4261 ggacgaaagc gaatgctggc aagcgccgga gaactgcaga agggcaatga gctggccctg
4321 ccctccaaat acgtgaactt cctgtatctg gctagccact acgagaaact gaaggggtcc
4381 cctgaggata acgaacagaa gcagctgttt gtggagcagc acaaacatta tctggacgag
4441 atcattgaac agatttcaga gttcagcaag agagtgatcc tggctgacgc aaatctggat
4501 aaagtcctga gcgcatacaa caagcaccga gacaaaccaa tccgggagca ggccgaaaat
4561 atcattcatc tgttcaccct gacaaacctg ggcgcccctg cagccttcaa gtattttgac
4621 accacaatcg atcggaagag atacacttct accaaagagg tgctggatgc taccctgatc
4681 caccagagta ttaccggcct gtatgagaca cgcatcgacc tgtcacagct gggaggcgat
4741 gggagcccca agaaaaagcg gaaggtgtct agttaa（配列番号17014）の配列を含むかこの配列からなる核酸を含むか、この核酸からなる。いくつかの実施態様では、融合タンパク質は、アミノ酸配列：
1 MPKKKRKVEG IKSNISLLKD ELRGQISHIS HEYLSLIDLA FDSKQNRLFE MKVLELLVNE
61 YGFKGRHLGG SRKPDGIVYS TTLEDNFGII VDTKAYSEGY SLPISQADEM ERYVRENSNR
121 DEEVNPNKWW ENFSEEVKKY YFVFISGSFK GKFEEQLRRL SMTTGVNGSA VNVVNLLLGA
181 EKIRSGEMTI EELERAMFNN SEFILKYGGG GSDKKYSIGL AIGTNSVGWA VITDEYKVPS
241 KKFKVLGNTD RHSIKKNLIG ALLFDSGETA EATRLKRTAR RRYTRRKNRI CYLQEIFSNE
301 MAKVDDSFFH RLEESFLVEE DKKHERHPIF GNIVDEVAYH EKYPTIYHLR KKLVDSTDKA
361 DLRLIYLALA HMIKFRGHFL IEGDLNPDNS DVDKLFIQLV QTYNQLFEEN PINASGVDAK
421 AILSARLSKS RRLENLIAQL PGEKKNGLFG NLIALSLGLT PNFKSNFDLA EDAKLQLSKD
481 TYDDDLDNLL AQIGDQYADL FLAAKNLSDA ILLSDILRVN TEITKAPLSA SMIKRYDEHH
541 QDLTLLKALV RQQLPEKYKE IFFDQSKNGY AGYIDGGASQ EEFYKFIKPI LEKMDGTEEL
601 LVKLNREDLL RKQRTFDNGS IPHQIHLGEL HAILRRQEDF YPFLKDNREK IEKILTFRIP
661 YYVGPLARGN SRFAWMTRKS EETITPWNFE EVVDKGASAQ SFIERMTNFD KNLPNEKVLP
721 KHSLLYEYFT VYNELTKVKY VTEGMRKPAF LSGEQKKAIV DLLFKTNRKV TVKQLKEDYF
781 KKIECFDSVE ISGVEDRFNA SLGTYHDLLK IIKDKDFLDN EENEDILEDI VLTLTLFEDR
841 EMIEERLKTY AHLFDDKVMK QLKRRRYTGW GRLSRKLING IRDKQSGKTI LDFLKSDGFA
901 NRNFMQLIHD DSLTFKEDIQ KAQVSGQGDS LHEHIANLAG SPAIKKGILQ TVKVVDELVK
961 VMGRHKPENI VIEMARENQT TQKGQKNSRE RMKRIEEGIK ELGSQILKEH PVENTQLQNE
1021 KLYLYYLQNG RDMYVDQELD INRLSDYDVD AIVPQSFLKD DSIDNKVLTR SDKNRGKSDN
1081 VPSEEVVKKM KNYWRQLLNA KLITQRKFDN LTKAERGGLS ELDKAGFIKR QLVETRQITK
1141 HVAQILDSRM NTKYDENDKL IREVKVITLK SKLVSDFRKD FQFYKVREIN NYHHAHDAYL
1201 NAVVGTALIK KYPKLESEFV YGDYKVYDVR KMIAKSEQEI GKATAKYFFY SNIMNFFKTE
1261 ITLANGEIRK RPLIETNGET GEIVWDKGRD FATVRKVLSM PQVNIVKKTE VQTGGFSKES
1321 ILPKRNSDKL IARKKDWDPK KYGGFDSPTV AYSVLVVAKV EKGKSKKLKS VKELLGITIM
1381 ERSSFEKNPI DFLEAKGYKE VKKDLIIKLP KYSLFELENG RKRMLASAGE LQKGNELALP
1441 SKYVNFLYLA SHYEKLKGSP EDNEQKQLFV EQHKHYLDEI IEQISEFSKR VILADANLDK
1501 VLSAYNKHRD KPIREQAENI IHLFTLTNLG APAAFKYFDT TIDRKRYTST KEVLDATLIH
1561 QSITGLYETR IDLSQLGGDG SPKKKRKV（配列番号17058）を含むか、このアミノ酸配列からなる。あるいは融合タンパク質は、
1 atgcctaaga agaagcggaa ggtggaaggc atcaaaagca acatctccct cctgaaagac
61 gaactccggg ggcagattag ccacattagt cacgaatacc tctccctcat cgacctggct
121 ttcgatagca agcagaacag gctctttgag atgaaagtgc tggaactgct cgtcaatgag
181 tacgggttca agggtcgaca cctcggcgga tctaggaaac cagacggcat cgtgtatagt
241 accacactgg aagacaactt tgggatcatt gtggatacca aggcatactc tgagggttat
301 agtctgccca tttcacaggc cgacgagatg gaacggtacg tgcgcgagaa ctcaaataga
361 gatgaggaag tcaaccctaa caagtggtgg gagaacttct ctgaggaagt gaagaaatac
421 tacttcgtct ttatcagcgg gtccttcaag ggtaaatttg aggaacagct caggagactg
481 agcatgacta ccggcgtgaa tggcagcgcc gtcaacgtgg tcaatctgct cctgggcgct
541 gaaaagattc ggagcggaga gatgaccatc gaagagctgg agagggcaat gtttaataat
601 agcgagttta tcctgaaata cggtggcggt ggatccgata aaaagtattc tattggttta
661 gccatcggca ctaattccgt tggatgggct gtcataaccg atgaatacaa agtaccttca
721 aagaaattta aggtgttggg gaacacagac cgtcattcga ttaaaaagaa tcttatcggt
781 gccctcctat tcgatagtgg cgaaacggca gaggcgactc gcctgaaacg aaccgctcgg
841 agaaggtata cacgtcgcaa gaaccgaata tgttacttac aagaaatttt tagcaatgag
901 atggccaaag ttgacgattc tttctttcac cgtttggaag agtccttcct tgtcgaagag
961 gacaagaaac atgaacggca ccccatcttt ggaaacatag tagatgaggt ggcatatcat
1021 gaaaagtacc caacgattta tcacctcaga aaaaagctag ttgactcaac tgataaagcg
1081 gacctgaggt taatctactt ggctcttgcc catatgataa agttccgtgg gcactttctc
1141 attgagggtg atctaaatcc ggacaactcg gatgtcgaca aactgttcat ccagttagta
1201 caaacctata atcagttgtt tgaagagaac cctataaatg caagtggcgt ggatgcgaag
1261 gctattctta gcgcccgcct ctctaaatcc cgacggctag aaaacctgat cgcacaatta
1321 cccggagaga agaaaaatgg gttgttcggt aaccttatag cgctctcact aggcctgaca
1381 ccaaatttta agtcgaactt cgacttagct gaagatgcca aattgcagct tagtaaggac
1441 acgtacgatg acgatctcga caatctactg gcacaaattg gagatcagta tgcggactta
1501 tttttggctg ccaaaaacct tagcgatgca atcctcctat ctgacatact gagagttaat
1561 actgagatta ccaaggcgcc gttatccgct tcaatgatca aaaggtacga tgaacatcac
1621 caagacttga cacttctcaa ggccctagtc cgtcagcaac tgcctgagaa atataaggaa
1681 atattctttg atcagtcgaa aaacgggtac gcaggttata ttgacggcgg agcgagtcaa
1741 gaggaattct acaagtttat caaacccata ttagagaaga tggatgggac ggaagagttg
1801 cttgtaaaac tcaatcgcga agatctactg cgaaagcagc ggactttcga caacggtagc
1861 attccacatc aaatccactt aggcgaattg catgctatac ttagaaggca ggaggatttt
1921 tatccgttcc tcaaagacaa tcgtgaaaag attgagaaaa tcctaacctt tcgcatacct
1981 tactatgtgg gacccctggc ccgagggaac tctcggttcg catggatgac aagaaagtcc
2041 gaagaaacga ttactccatg gaattttgag gaagttgtcg ataaaggtgc gtcagctcaa
2101 tcgttcatcg agaggatgac caactttgac aagaatttac cgaacgaaaa agtattgcct
2161 aagcacagtt tactttacga gtatttcaca gtgtacaatg aactcacgaa agttaagtat
2221 gtcactgagg gcatgcgtaa acccgccttt ctaagcggag aacagaagaa agcaatagta
2281 gatctgttat tcaagaccaa ccgcaaagtg acagttaagc aattgaaaga ggactacttt
2341 aagaaaattg aatgcttcga ttctgtcgag atctccgggg tagaagatcg atttaatgcg
2401 tcacttggta cgtatcatga cctcctaaag ataattaaag ataaggactt cctggataac
2461 gaagagaatg aagatatctt agaagatata gtgttgactc ttaccctctt tgaagatcgg
2521 gaaatgattg aggaaagact aaaaacatac gctcacctgt tcgacgataa ggttatgaaa
2581 cagttaaaga ggcgtcgcta tacgggctgg ggacgattgt cgcggaaact tatcaacggg
2641 ataagagaca agcaaagtgg taaaactatt ctcgattttc taaagagcga cggcttcgcc
2701 aataggaact ttatgcagct gatccatgat gactctttaa ccttcaaaga ggatatacaa
2761 aaggcacagg tttccggaca aggggactca ttgcacgaac atattgcgaa tcttgctggt
2821 tcgccagcca tcaaaaaggg catactccag acagtcaaag tagtggatga gctagttaag
2881 gtcatgggac gtcacaaacc ggaaaacatt gtaatcgaga tggcacgcga aaatcaaacg
2941 actcagaagg ggcaaaaaaa cagtcgagag cggatgaaga gaatagaaga gggtattaaa
3001 gaactgggca gccagatctt aaaggagcat cctgtggaaa atacccaatt gcagaacgag
3061 aaactttacc tctattacct acaaaatgga agggacatgt atgttgatca ggaactggac
3121 ataaaccgtt tatctgatta cgacgtcgat gccattgtac cccaatcctt tttgaaggac
3181 gattcaatcg acaataaagt gcttacacgc tcggataaga accgagggaa aagtgacaat
3241 gttccaagcg aggaagtcgt aaagaaaatg aagaactatt ggcggcagct cctaaatgcg
3301 aaactgataa cgcaaagaaa gttcgataac ttaactaaag ctgagagggg tggcttgtct
3361 gaacttgaca aggccggatt tattaaacgt cagctcgtgg aaacccgcca aatcacaaag
3421 catgttgcac agatactaga ttcccgaatg aatacgaaat acgacgagaa cgataagctg
3481 attcgggaag tcaaagtaat cactttaaag tcaaaattgg tgtcggactt cagaaaggat
3541 tttcaattct ataaagttag ggagataaat aactaccacc atgcgcacga cgcttatctt
3601 aatgccgtcg tagggaccgc actcattaag aaatacccga agctagaaag tgagtttgtg
3661 tatggtgatt acaaagttta tgacgtccgt aagatgatcg cgaaaagcga acaggagata
3721 ggcaaggcta cagccaaata cttcttttat tctaacatta tgaatttctt taagacggaa
3781 atcactctgg caaacggaga gatacgcaaa cgacctttaa ttgaaaccaa tggggagaca
3841 ggtgaaatcg tatgggataa gggccgggac ttcgcgacgg tgagaaaagt tttgtccatg
3901 ccccaagtca acatagtaaa gaaaactgag gtgcagaccg gagggttttc aaaggaatcg
3961 attcttccaa aaaggaatag tgataagctc atcgctcgta aaaaggactg ggacccgaaa
4021 aagtacggtg gcttcgatag ccctacagtt gcctattctg tcctagtagt ggcaaaagtt
4081 gagaagggaa aatccaagaa actgaagtca gtcaaagaat tattggggat aacgattatg
4141 gagcgctcgt cttttgaaaa gaaccccatc gacttccttg aggcgaaagg ttacaaggaa
4201 gtaaaaaagg atctcataat taaactacca aagtatagtc tgtttgagtt agaaaatggc
4261 cgaaaacgga tgttggctag cgccggagag cttcaaaagg ggaacgaact cgcactaccg
4321 tctaaatacg tgaatttcct gtatttagcg tcccattacg agaagttgaa aggttcacct
4381 gaagataacg aacagaagca actttttgtt gagcagcaca aacattatct cgacgaaatc
4441 atagagcaaa tttcggaatt cagtaagaga gtcatcctag ctgatgccaa tctggacaaa
4501 gtattaagcg catacaacaa gcacagggat aaacccatac gtgagcaggc ggaaaatatt
4561 atccatttgt ttactcttac caacctcggc gctccagccg cattcaagta ttttgacaca
4621 acgatagatc gcaaacgata cacttctacc aaggaggtgc tagacgcgac actgattcac
4681 caatccatca cgggattata tgaaactcgg atagatttgt cacagcttgg gggtgacgga
4741 tcccccaaga agaagaggaa agtctga（配列番号17059）の配列を含むかこの配列からなる核酸を含むか、この核酸からなる。
本開示の細胞と、改変されていない細胞と、改変された細胞のいくつかの実施態様では、ナノトランスポゾンは、ガイド配列と、不活性化Cas9（dCas9）をコードする配列とClo051ヌクレアーゼまたはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列を含む融合タンパク質をコードする配列を含む遺伝子編集組成物を含んでいる。
本開示の細胞と、改変されていない細胞と、改変された細胞のいくつかの実施態様では、細胞は、遺伝子編集組成物を一過性に発現する。
本開示の細胞と、改変されていない細胞と、改変された細胞のいくつかの実施態様では、細胞はT細胞であり、ガイドRNAは、内在性TCRをコードする標的配列と相補的な配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、ガイドRNAは、B2Mポリペプチドをコードする標的配列と相補的な配列を含んでいる。
本開示の細胞と、改変されていない細胞と、改変された細胞のいくつかの実施態様では、ガイドRNAは、ゲノムDNA配列のセーフハーバー部位の中の標的配列と相補的な配列を含んでいる。
本開示の細胞と、改変されていない細胞と、改変された細胞のいくつかの実施態様では、Clo051ヌクレアーゼまたはそのヌクレアーゼドメインは、標的配列の中に一本鎖または二本鎖の切断を誘導する。いくつかの実施態様では、ドナー配列、またはドナープラスミド、またはドナーナノトランスポゾンITR内配列は、一本鎖または二本鎖の切断位置、および／または標的配列内の細胞修復の位置に組み込まれる。
本開示により、本開示の改変された細胞を含む組成物が提供される。いくつかの実施態様では、組成物は、医薬として許容可能な担体をさらに含んでいる。
本開示により、本開示による複数の改変された細胞を含む組成物が提供される。いくつかの実施態様では、組成物は、医薬として許容可能な担体をさらに含んでいる。
本開示により、疾患または障害の治療に用いるための本開示の組成物が提供される。
本開示により、疾患または障害の治療のための本開示による組成物の利用が提供される。
本開示により、疾患または障害を治療する方法として、その治療を必要とする対象に治療に有効な量の本開示の組成物を投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施態様では、対象は、組成物の投与後に移植片対宿主（GvH）病および／または宿主対移植片（HvG）病を発症しない。いくつかの実施態様では、投与は全身投与である。いくつかの実施態様では、組成物は静脈内経路によって投与される。いくつかの実施態様では、組成物は、静脈内注射または静脈内輸液によって投与される。
本開示により、疾患または障害を治療する方法として、その治療を必要とする対象に治療に有効な量の本開示の組成物を投与することを含む方法が提供される。いくつかの実施態様では、対象は、組成物の投与後に移植片対宿主（GvH）病および／または宿主対移植片（HvG）病を発症しない。いくつかの実施態様では、投与は局所投与である。いくつかの実施態様では、組成物は、腫瘍内経路、脊椎内経路、脳室内経路、眼内経路、骨内経路のいずれかによって投与される。いくつかの実施態様では、組成物は、腫瘍内への注射または輸液、脊椎内への注射または輸液、脳室内への注射または輸液、眼内への注射または輸液、骨内への注射または輸液のいずれかによって投与される。
疾患または障害を治療する本開示の方法のいくつかの実施態様では、治療に有効な用量は一回量であり、組成物の同種他家由来細胞が十分な時間にわたって定着および／または持続して疾患または障害を治療する。いくつかの実施態様では、一回量は、同時に製造される少なくとも2個、5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、またはこれらの数値の間の任意の個数の用量のうちの1つである。
疾患または障害を治療する本開示の方法のいくつかの実施態様では、治療に有効な用量は一回量であり、組成物の自己由来細胞が十分な時間にわたって定着および／または持続して疾患または障害を治療する。いくつかの実施態様では、一回量は、同時に製造される少なくとも2個、5個、10個、15個、20個、25個、30個、35個、40個、45個、50個、55個、60個、65個、70個、75個、80個、85個、90個、95個、100個、またはこれらの数値の間の任意の個数の用量のうちの1つである。

ベクターと宿主細胞
本開示は、本開示の単離された核酸分子を含むベクターと、組み換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞と、本分野でよく知られている組み換え技術による少なくとも1つのセンチリンまたはCARTyrinの作製にも関する。Sambrook他、上記文献；Ausbel他、上記文献を参照されたい（それぞれの全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。
例えばPB-EF1aベクターを使用できる。このベクターは、以下のヌクレオチド配列：
tgtacatagattaaccctagaaagataatcatattgtgacgtacgttaaagataatcatgcgtaaaattgacgcatgtgttttatcggtctgtatatcgaggtttatttattaatttgaatagatattaagttttattatatttacacttacatactaataataaattcaacaaacaatttatttatgtttatttatttattaaaaaaaaacaaaaactcaaaatttcttctataaagtaacaaaacttttatcgaatacctgcagcccgggggatgcagagggacagcccccccccaaagcccccagggatgtaattacgtccctcccccgctagggggcagcagcgagccgcccggggctccgctccggtccggcgctccccccgcatccccgagccggcagcgtgcggggacagcccgggcacggggaaggtggcacgggatcgctttcctctgaacgcttctcgctgctctttgagcctgcagacacctggggggatacggggaaaagttgactgtgcctttcgatcgaaccatggacagttagctttgcaaagatggataaagttttaaacagagaggaatctttgcagctaatggaccttctaggtcttgaaaggagtgggaattggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccgccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccacctggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtgagaattctaatacgactcactatagggtgtgctgtctcatcattttggcaaagattggccaccaagcttgtcctgcaggagggtcgacgcctctagacgggcggccgctccggatccacgggtaccgatcacatatgcctttaattaaacactagttctatagtgtcacctaaattccctttagtgagggttaatggccgtaggccgccagaattgggtccagacatgataagatacattgatgagtttggacaaaccacaactagaatgcagtgaaaaaaatgctttatttgtgaaatttgtgatgctattgctttatttgtaaccattataagctgcaataaacaagttaacaacaacaattgcattcattttatgtttcaggttcagggggaggtgtgggaggttttttcggactctaggacctgcgcatgcgcttggcgtaatcatggtcatagctgtttcctgttttccccgtatccccccaggtgtctgcaggctcaaagagcagcgagaagcgttcagaggaaagcgatcccgtgccaccttccccgtgcccgggctgtccccgcacgctgccggctcggggatgcggggggagcgccggaccggagcggagccccgggcggctcgctgctgccccctagcgggggagggacgtaattacatccctgggggctttgggggggggctgtccctctcaccgcggtggagctccagcttttgttcgaattggggccccccctcgagggtatcgatgatatctataacaagaaaatatatatataataagttatcacgtaagtagaacatgaaataacaatataattatcgtatgagttaaatcttaaaagtcacgtaaaagataatcatgcgtcattttgactcacgcggtcgttatagttcaaaatcagtgacacttaccgcattgacaagcacgcctcacgggagctccaagcggcgactgagatgtcctaaatgcacagcgacggattcgcgctatttagaaagagagagcaatatttcaagaatgcatgcgtcaattttacgcagactatctttctagggttaatctagctagccttaagggcgcctattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagtcagaagaactcgtcaagaaggcgatagaaggcgatgcgctgcgaatcgggagcggcgataccgtaaagcacgaggaagcggtcagcccattcgccgccaagctcttcagcaatatcacgggtagccaacgctatgtcctgatagcggtccgccacacccagccggccacagtcgatgaatccagaaaagcggccattttccaccatgatattcggcaagcaggcatcgccatgggtcacgacgagatcctcgccgtcgggcatgctcgccttgagcctggcgaacagttcggctggcgcgagcccctgatgctcttcgtccagatcatcctgatcgacaagaccggcttccatccgagtacgtgctcgctcgatgcgatgtttcgcttggtggtcgaatgggcaggtagccggatcaagcgtatgcagccgccgcattgcatcagccatgatggatactttctcggcaggagcaaggtgagatgacaggagatcctgccccggcacttcgcccaatagcagccagtcccttcccgcttcagtgacaacgtcgagcacagctgcgcaaggaacgcccgtcgtggccagccacgatagccgcgctgcctcgtcttgcagttcattcagggcaccggacaggtcggtcttgacaaaaagaaccgggcgcccctgcgctgacagccggaacacggcggcatcagagcagccgattgtctgttgtgcccagtcatagccgaatagcctctccacccaagcggccggagaacctgcgtgcaatccatcttgttcaatcataatattattgaagcatttatcagggttcgtctcgtcccggtctcctcccaatgcatgtcaatattggccattagccatattattcattggttatatagcataaatcaatattggctattggccattgcatacgttgtatctatatcataata（配列番号18051）を含んでいる。
ポリヌクレオチドは、宿主の中で増殖させるため、選択マーカーを含むベクターに場合によっては接合することができる。一般に、プラスミドベクターが、沈殿物（リン酸カルシウム沈殿物など）の中、または帯電した脂質との複合体の中に導入される。ベクターがウイルスである場合には、適切なパッケージング細胞系を用いてインビトロで包装した後、宿主細胞に形質導入することができる。
DNAインサートは、適切なプロモータに機能可能に連結させねばならない。発現コンストラクトはさらに、転写開始部位と転写終結部位を含み、転写される領域内には翻訳のためのリボソーム結合部位を含むことになろう。コンストラクトが発現する成熟転写産物のコード部分は、冒頭部の翻訳開始コドンと、翻訳されるmRNAの末端に適切に位置する終止コドン（例えばUAA、UGA、UAGのいずれか）を含むことが好ましかろう。哺乳動物細胞または真核細胞での発現にはUAAとUAGが好ましい。
発現ベクターは、少なくとも1つの選択マーカーを含むことが好ましいであろうが、それはオプションである。そのようなマーカーの非限定的な例に含まれるのは、例えば真核細胞培養のための耐性遺伝子であるアンピシリン、ゼオシン（Sh bla遺伝子）、ピューロマイシン（pac遺伝子）、ハイグロマイシンB（hygB遺伝子）、G418／ゲネチシン（neo遺伝子）、ミコフェノール酸、又は、グルタミンシンテターゼ（GS、アメリカ合衆国特許第5,122,464号；第5,770,359号；第5,827,739号）、ブラスチシジン（bsd遺伝子）のほか、大腸菌やそれ以外の細菌、または原核生物の中で培養するための耐性遺伝子であるアンピシリン、ゼオシン（Sh bla遺伝子）、ピューロマイシン（pac遺伝子）、ハイグロマイシンB（hygB遺伝子）、G418／ゲネチシン（neo遺伝子）、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ポリミクシンB、テトラサイクリンである（上記の特許は全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。上記の宿主細胞のための適切な培地と条件が本分野で知られている。適切なベクターは、当業者にはただちに明らかであろう。宿主細胞へのベクターコンストラクトの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、DEAE-デキストランを媒介としたトランスフェクション、カチオン性脂質を媒介としたトランスフェクション、電気穿孔、形質導入、感染のいずれか、または他の公知の方法によって実行することができる。このような方法は例えば、Sambrook、上記文献、第1章～第4章と第16章～第18章；Ausbel、上記文献、第1章、第9章、第13章、第15章、第16章に記載されている。
発現ベクターは、本開示の組成物と方法によって改変された細胞を単離するため少なくとも1つの選択細胞表面マーカーを含むことが好ましいであろうが、それはオプションである。本開示の選択細胞表面マーカーは、1個の細胞または細胞のサブセットを別の決められた細胞のサブセットから識別する表面タンパク質、または糖タンパク質、または一群のタンパク質を含んでいる。選択細胞表面マーカーは、本開示の組成物または方法によって改変された細胞を、本開示の組成物または方法によって改変されていない細胞から識別することが好ましい。そのような細胞表面マーカーの非限定的な例に含まれるのは「分化のクラスター」タンパク質または「分類決定」タンパク質（「CD」と略記されることがしばしばある）であり、例えばCD19、CD271、CD34、CD22、CD20、CD33、CD52の切断形態または完全長形態、またはこれらの任意の組み合わせである。細胞表面マーカーは、自殺遺伝子マーカーRQR8（Philip B他、Blood. 2014年8月21日；第124巻(8)：1277～1287ページ）をさらに含んでいる。
発現ベクターは、本開示の組成物または方法によって改変された細胞を単離するための少なくとも1つの選択薬剤耐性マーカーを含むことが好ましいであろうが、それはオプションである。本開示の選択薬剤耐性マーカーは、野生型または変異体のNeo、TYMS、FRANCF、RAD51C、GCS、MDR1、ALDH1、NKX2.2のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。
本開示の少なくとも1つのセンチリンまたはCARTyrinは、改変された形態（融合タンパク質など）で発現させることができ、分泌シグナルだけでなく、追加の機能的な異種領域も含むことができる。例えば追加アミノ酸（特に帯電したアミノ酸）の領域をCARTyrinのN末端に付加し、精製中の、またはその後の処理中と保管中の宿主細胞の中での安定性と持続性を改善することができる。また、ペプチド部分を本開示のCARTyrinに付加して精製しやすくすることができる。このような領域は、CARTyrin、またはその少なくとも1つの断片を最終的に調製する前に除去することができる。このような方法は多くの標準的な実験室マニュアルに記載されており、その例は、Sambrook、上記文献、第17.29章～第17.42章と第18.1章～第18.74章；Ausbel、上記文献、第16章、第17章、第18章である。
当業者は、本開示のタンパク質をコードする核酸を発現させるのに利用できる多数の発現系をよく知っている。あるいは本開示の核酸は、本開示のセンチリンまたはCARTyrinをコードする内在性DNAを含む宿主細胞の中で（操作によって）オンにすることにより、宿主細胞の中で発現させることができる。このような方法は本分野で周知であり、例えばアメリカ合衆国特許第5,580,734号、第5,641,670号、第5,733,746号、第5,733,761号に記載されている（参照によって全体が本明細書に組み込まれている）。
CARTyrin、その特定の部分、またはそのバリアントの生成に役立つ細胞培養物の実例は、本分野で知られているように、細菌細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞系は、複数の単層細胞の形態であることがしばしばあろうが、哺乳動物細胞の懸濁液またはバイオリアクターも使用することができる。完全なグリコシル化タンパク質を発現することのできる多数の適切な宿主細胞系が本分野でこれまでに開発されており、その中に含まれるのは、COS-1（例えばATCC CRL 1650）細胞系、COS-7（例えばATCC CRL-1651）細胞系、HEK293細胞系、BHK21（例えばATCC CRL-10）細胞系、CHO（例えばATCC CRL 1610）細胞系、BSC-1（例えばATCC CRL-26）細胞系、Cos-7細胞、CHO細胞、hep G2細胞、P3X63Ag8.653細胞、SP2/0-Ag14細胞、293細胞、HeLa細胞などであり、これらは例えばAmerican Type Culture Collection、マナサス、ヴァージニア州（www.atcc.org）から容易に入手できる。好ましい宿主細胞に含まれるのは、リンパ球起源の細胞（骨髄腫細胞、リンパ腫細胞など）である。特に好ましい宿主細胞は、P3X63Ag8.653細胞（ATCC登録番号CRL-1580）とSP2/0-Ag14細胞（ATCC登録番号CRL-1851）である。特に好ましい一実施態様では、組み換え細胞は、P3X63Ab8.653細胞またはSP2/0-Ag14細胞である。
これら細胞のための発現ベクターには、以下の発現制御配列、すなわち複製起点；プロモータ（例えば後期または初期のSV40プロモータ、CMVプロモータ（アメリカ合衆国特許第5,168,062号；第5,385,839号）、HSV tkプロモータ、pgk（ホスホグリセル酸キナーゼ）プロモータ、EF-1アルファプロモータ（アメリカ合衆国特許第5,266,491号）、少なくとも1つのヒトプロモータ）；エンハンサ；および／またはプロセシング情報部位（リボソーム結合部位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えばSV40大型T AgポリA付加部位）、転写終止配列など）のうちの1つ以上を含めることができるが、これらに限定されない。例えばAusbel他、上記文献；Sambrook他、上記文献を参照されたい。本発明の核酸またはタンパク質の生成に役立つ他の細胞は、知られている、および／または例えば細胞系とハイブリドーマのAmerican Type Culture Collection Catalogue（www.atcc.org）から入手するか、他の既知または市販の供給源から入手することが可能である。
真核生物宿主細胞を用いるとき、ポリアデニル化配列または転写終止配列は、典型的にはベクターの中に組み込まれる。終止配列の一例は、ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化配列である。転写産物の正確なスプライシングのための配列も含めることができる。スプライシング配列の一例は、SV40からのVP1イントロンである（Sprague他、J. Virol. 第45巻： 773～781ページ（1983年））。それに加え、本分野で知られているように、宿主細胞の中で複製を制御するための遺伝子配列をベクターに組み込むことができる。

CARTyrinの精製
センチリンまたはCARTyrinは、組み換え細胞培養物から周知の方法によって回収して精製することができる。方法の非限定的な例に含まれるのは、プロテインA精製、硫酸アンモニウム沈降またはエタノール沈降、酸抽出、アニオン交換クロマトグラフィまたはカチオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、レクチンクロマトグラフィである。高性能液体クロマトグラフィ（「HPLC」）も精製に使用することができる。例えばColligan、『Current Protocols in Immunology』または『Current Protocols in Protein Science』、John Wiley & Sons社、ニューヨーク、ニューヨーク州、（1997～2001年）の第1章、第4章、第6章、第8章、第9章、第10章を参照されたい（それぞれの全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。
本開示のセンチリンまたはCARTyrinは、精製された産物、化学合成手続きの産物、組み換え技術によって原核生物宿主または真核生物宿主（例えば大腸菌、酵母、高等植物、昆虫、哺乳動物の細胞が含まれる）から生成された産物を含んでいる。組み換え生成手続きで用いる宿主に応じ、本開示のCARTyrinは、グリコシル化すること、または非グリコシル化することができる。そのような方法は、多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている（例えばSambrook、上記文献、セクション17.37～17.42；Ausbel、上記文献、第10章、第12章、第13章、第16章、第18章、第20章；Coligan、『Protein Science』、上記文献、第12章～第14章；これらすべての全体が、参照によって本明細書に組み込まれている）。

アミノ酸コード
本開示のCARTyrinを構成するアミノ酸は略記されることがしばしばある。アミノ酸の指定は、本分野でよく理解されているように、アミノ酸をその一文字コード、三文字コード、名称、3つのヌクレオチドコドンのいずれかを用いて指定することによって示すことができる（Alberts, B.他、『Molecular Biology of The Cell』、第3版、Garland Publishing, Inc.社、ニューヨーク、1994年を参照されたい）。本開示のCARTyrinは、本明細書に具体的に記載されているように、自発的な、または変異および／または人為的操作からの1つ以上のアミノ酸の置換、または欠失、または付加を含むことができる。本開示のCARTyrinの中にあって機能する上で不可欠なアミノ酸は、本分野で知られている方法（例えば部位指定突然変異誘発、またはアラニン走査突然変異誘発）によって同定することができる（例えばAusubel、上記文献、第8章、第15章；CunninghamとWells、Science 第244巻：1081～1085ページ（1989年））。後者の手続きによって単一のアラニン変異が分子内のすべての残基に導入される。得られる変異分子はその後、生物活性（例えば少なくとも1つの中和活性だが、それに限定されない）を試験される。CARTyrinの結合にとって決定的に重要な部位も構造分析（例えば結晶化、核磁気共鳴、光親和性ラベリングのいずれか）によって同定することができる（Smith他、J. Mol. Biol. 第224巻：899～904ページ（1992年）とde Vos他、Science第255巻：306～312ページ（1992年））。
当業者であればわかるように、本発明は、本開示の少なくとも1つの生物活性なCARTyrinを含んでいる。生物活性なCARTyrinは、天然（非合成）の内在性CARTyrinまたは関連した既知のCARTyrinの比活性の少なくとも20％、または30％、または40％、好ましくは少なくとも50％、または60％、または70％、最も好ましくは少なくとも80％、または90％、または95％～99％超の比活性を有する。酵素活性と基質特異性を調べて定量的に測定する方法は、当業者に周知である。
別の1つの側面では、本開示は、有機部分の共有結合によって改変された本明細書に記載のセンチリンと断片に関する。このような改変により、薬物動態特性が改善された（例えば生体内血清半減期が増加した）CARTyrin断片を生成させることができる。有機部分として、直線状の、または分岐した親水性ポリマー基、または脂肪酸基、または脂肪酸エステル基が可能である。特別な実施態様では、親水性ポリマー基は、約800～約120,000ダルトンの分子量を持つことができ、ポリアルカングリコール（例えばポリエチレングリコール（PEG）、ポリプロピレングリコール（PPG））、炭水化物ポリマー、アミノ酸ポリマー、ポリビニルピロリドンのいずれかが可能であり、脂肪酸基または脂肪酸エステル基は、約8～約40個の炭素原子を含むことができる。
本開示の改変されたCARTyrinと断片は、抗体に直接または間接に共有結合する1つ以上の有機部分を含むことができる。本開示のCARTyrinまたはその断片に結合する各有機部分として、独立に、親水性ポリマー基、または脂肪酸基、または脂肪酸エステル基が可能である。本明細書では、「脂肪酸」という用語は、モノカルボン酸とジカルボン酸を包含する。本明細書で用いられている「親水性ポリマー基」という用語は、オクタンの中よりも水の中に多く溶ける有機ポリマーを意味する。例えばポリリシンは、オクタンの中よりも水の中に多く溶ける。したがってポリリシンの共有結合によって改変されたセンチリンまたはCARTyrinが本開示に包含される。本開示のセンチリンまたはCARTyrinを改変するのに適した親水性ポリマーは、直線状であること、または分岐していることが可能であり、その中に含まれるのは、例えばポリアルカングリコール（例えばPEG、モノメトキシ-ポリエチレングリコール（mPEG）、PPGなど）、炭水化物（例えばデキストラン、セルロース、オリゴ糖、多糖など）、親水性アミノ酸のポリマー（例えばポリリシン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸など）、ポリアルカンオキシド（例えばポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドなど）、ポリビニルピロリドンである。本開示のCARTyrinを改変する親水性ポリマーは、独立した分子として約800～約150,000ダルトンの分子量を有することが好ましい。例えばPEG5000とPEG20,000を用いることができる（数字は、ダルトンで表わしたポリマーの平均分子量である）。親水性ポリマー基は、1個～約6個のアルキル基、または脂肪酸基、または脂肪酸エステル基で置換することができる。脂肪酸基または脂肪酸エステル基で置換された親水性ポリマーは、適切な方法を用いて調製することができる。例えばアミン基を含むポリマーを脂肪酸または脂肪酸エステルのカルボキシレートにカップルさせ、脂肪酸または脂肪酸エステル上の（例えばN,N-カルボニルジイミダゾールを用いて活性化された）活性化されたカルボキシレートをポリマー上のヒドロキシル基にカップルさせることができる。
本開示のCARTyrinを改変するのに適した脂肪酸と脂肪酸エステルは、飽和させること、または1つ以上の不飽和単位を含むことができる。本開示のCARTyrinを改変するのに適した脂肪酸に含まれるのは、例えばn-ドデカノアート（C12、ラウリン酸塩）、n-テトラデカノアート（C14、ミリスチン酸塩）、n-オクタデカノアート（C18、ステアリン酸塩）、n-エイコサノアート（C20、アラキドン酸塩）、n-ドコサノアート（C22、ベヘン酸塩）、n-トリアコンタノアート（C30）、n-テトラコンタノアート（C40）、シス-Δ9-オクタデカノアート（C18、オレイン酸塩）、全シス-Δ5,8,11,14-エイコサテトラエノアート（C20、アラキドン酸塩）、オクタン二酸、テトラデカン二酸、オクタデカン二酸、ドコサン二酸などである。適切な脂肪酸エステルに含まれるのは、直線状の、または分岐した低級アルキル基を含むジカルボン酸のモノエステルである。低級アルキル基は、1～約12個、好ましくは1～約6個の炭素原子を含むことができる。
改変されたCARTyrinと断片は、適切な方法を利用して（例えば1つ以上の改変剤との反応によって）調製することができる。「改変剤」は、本明細書では、活性化基を含む適切な有機基（例えば親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）を意味する。「活性化基」は、適切な条件下で第2の化学基と反応することにより、改変剤と第2の化学基の間に共有結合を形成する化学的部分または官能基である。例えばアミン反応性活性化基に含まれるのは、求電子基であるトシラート、メシラート、ハロ（クロロ、ブロモ、フルオロ、ヨード）、N-ヒドロキシスクシンイミジルエステル（NHS）などである。チオールと反応することのできる活性化基に含まれるのは、例えばマレイミド、ヨードアセチル、アクリロリル、ピリジルジスルフィド、5-チオール-2-ニトロ安息香酸チオール（TNB-チオール）などである。アルデヒド官能基をアミン含有分子またはヒドラジド含有分子にカップルさせることと、アジド基を3価リン基と反応させてホスホラミデート結合またはホスホリミド結合を形成することができる。活性化基を分子の中に導入する適切な方法は本分野で知られている（例えばHermanson, G. T.、『Bioconjugate Techniques』、Academic Press社：サン・ディエゴ、カリフォルニア州（1996年）を参照されたい）。活性化基は、有機基（例えば親水性ポリマー、脂肪酸、脂肪酸エステル）に直接結合させること、またはリンカー部分（例えば2価のC1～C12基であり、その中の1個以上の炭素原子をヘテロ原子（酸素、窒素、イオウのいずれか）で置換することができる）を介して結合させることができる。適切なリンカー部分に含まれるのは、例えばテトラエチレングリコール、-(CH2)3-、-NH-(CH2)6-NH-、-(CH2) 2-NH-、-CH2-O-CH2-CH2-O-CH2-CH2-O-CH-NH-である。リンカー部分を含む改変剤は、例えばモノ-Boc-アルキルジアミン（例えばモノ-Boc-エチレンジアミン、モノ-Boc-ジアミノヘキサン）を1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド（EDC）の存在下で脂肪酸と反応させ、遊離アミンと脂肪酸カルボキシレートの間にアミド結合を形成することによって製造することができる。Boc保護基をトリフルオロ酢酸（TFA）で処理することによって生成物から除去し、第一級アミンを露出させて別のカルボキシレートとカップルさせること、またはBoc保護基を無水マレイン酸と反応させ、得られた生成物を環化して脂肪酸の活性化されたマレイミド誘導体を生成させることができる。（例えばThompson他、WO 92/16221を参照されたい；その教示全体が、参照によって本明細書に組み込まれている）。
本開示の改変されたCARTyrinと断片は、CARTyrinタンパク質または断片を改変剤と反応させることによって生成させることができる。例えばアミン反応性改変剤（例えばPEGのNHSエステル）を用いることによって有機部分を非部位特異的なやり方でCARTyrinタンパク質に結合させることができる。本開示のCARTyrinの特定の部位に結合する有機部分を含む改変されたCARTyrinタンパク質と断片は、適切な方法（例えば、逆タンパク質分解（Fisch他、Bioconjugate Chem.、第3巻：147～153ページ（1992年）；Werlen他、Bioconjugate Chem.、第5巻：411～417ページ（1994年）；Kumaran他、Protein Sci. 第6巻(10)：2233～2241ページ（1997年）； Itoh他、Bioorg. Chem.、第24巻(1)：59～68ページ（1996年）； Capellas他、Biotechnol. Bioeng.、第56巻(4)：456～463ページ（1997年））と、Hermanson, G. T.、『Bioconjugate Techniques』、Academic Press社：サン・ディエゴ、カリフォルニア州（1996年）に記載されている方法）を利用して調製することができる。

治療活性な成分をさらに含むCARTyrin組成物
本開示のセンチリンまたはCARTyrinの化合物、または組成物、または組み合わせは、適切な任意の助剤（その非限定的な例は、希釈剤、結合剤、安定剤、バッファ、塩、親油性溶媒、保存剤、アジュバントなどである）のうちの少なくとも1つをさらに含むことができる。医薬として許容可能な助剤が好ましい。このような減菌溶液の非限定的な例と、その調製方法は本分野で周知であり、Gennaro編、『Remington's Pharmaceutical Sciences』、第18版、Mack Publishing Co.社（イーストン、ペンシルヴェニア州）1990年などがあるが、それに限定されない。医薬として許容可能な担体は、本分野で周知のように、または本明細書に記載されているように、センチリンまたはCARTyrin、または断片、またはバリアント組成物の投与様式、および／または溶解性、および／または安定性に適したものを定型的に選択することができる。
本発明の組成物で有用な医薬用の賦形剤と添加剤の非限定的な例に含まれるのは、タンパク質、ペプチド、アミノ酸、脂質、炭水化物（例えば糖（その中には単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖が含まれる）；アルジトール、アルドン酸、エステル化された糖などの誘導体化された糖；多糖または糖ポリマー）であり、それが単独で、または組み合わされて存在することができ、単独で、または組み合わせで1～99.99％の重量または体積を占めている。代表的なタンパク質賦形剤に含まれるのは、血清アルブミン（ヒト血清アルブミン（HSA）、組み換えヒトアルブミン（rHA）など）、ゼラチン、カゼインなどである。代表的なアミノ酸／タンパク質成分は緩衝能力においても機能することができ、その中に含まれるのは、アラニン、グリシン、アルギニン、ベタイン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸、システイン、リシン、ロイシン、イソロイシン、バリン、メチオニン、フェニルアラニン、アスパルタムなどである。好ましい1つのアミノ酸はグリシンである。
本発明で用いるのに適した炭水化物賦形剤に含まれるのは、例えば単糖（フルクトース、マルトース、ガラクトース、D-マンノース、ソルボースなど）；二糖（ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオースなど）；多糖（ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプンなど）；アルジトール（マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトールソルビトール（グルシトール）、ミオイノシトールなど）である。本発明で用いるのに適した好ましい炭水化物賦形剤は、マンニトール、トレハロース、ラフィノースである。
CARTyrin組成物は、バッファまたはpH調整剤も含むことができる。典型的には、バッファは、有機酸または有機塩基から調製される塩である。代表的なバッファに含まれるのは、有機酸塩（例えばクエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、カルボン酸、酒石酸、コハク酸、酢酸、フタル酸の塩）；トリス、トロメタミンヒドロクロリド、リン酸塩バッファである。本組成物で用いるのが好ましいバッファは、有機酸塩（クエン酸塩など）である。
それに加えて、本発明のCARTyrin組成物に含めることができるのはポリマー賦形剤／添加剤であり、例えばポリビニルピロリドン、フィコール（ポリマー糖）、デキストレート（例えば 2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンなどのシクロデキストリン）、ポリエチレングリコール、香味剤、抗微生物剤、甘味剤、抗酸化剤、帯電防止剤、界面活性剤（例えば「TWEEN（登録商標） 20」、「TWEEN（登録商標） 80」などのポリソルベート）、脂質（例えばリン脂質、脂肪酸）、ステロイド（例えばコレステロール）、キレート剤（例えばEDTA）がある。
本発明によるセンチリンまたはCARTyrin、または部分、またはバリアント組成物で用いるのに適したこれらの医薬用の賦形剤および／または添加剤と、追加の既知の賦形剤および／または添加剤は本分野で知られており、例えば『Remington: The Science & Practice of Pharmacy』、第19版、Williams & Williams社（1995年）と、『Physician's Desk Reference』、第52版、Medical Economics社、モントヴェール、ニュージャージー州（1998年）に掲載されている（その開示は全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。好ましい担体材料または賦形剤材料は、炭水化物（例えば糖とアルジオール）とバッファ（例えばクエン酸塩）または重合剤である。代表的な1つの担体分子はムコ多糖であるヒアルロン酸であり、これは関節内送達に有用である可能性がある。

白血球除去産物からのT細胞単離
白血球除去産物または血液は、臨床施設で閉鎖系と標準的な方法（例えばCOBEスペクトル・アフェレーシス・システム）を利用して対象から回収することができる。産物は病院または施設の標準的な白血球除去手続きに従って白血球除去回収バッグの中に回収することが好ましい。例えば本開示の方法の好ましい実施態様では、追加の抗凝固剤または血液添加剤（ヘパリンなど）が、白血球除去の間に通常使用される量を超えては含まれていない。
あるいは（Biosafe Sepax 2（閉鎖式／自動化）を使用して）白血球細胞（WBC）／末梢血単核細胞（PBMC）を、または（CliniMACS（登録商標）Prodigy（閉鎖式／自動化）を使用して）T細胞を、全血から直接単離することができる。しかし何人かの対象（例えばがんと診断された対象、および／またはがんの治療を受けている対象）では、WBC/PBMCの収量は、全血から単離されるときには白血球除去によって単離されるときよりも有意に少ない可能性がある。
本開示の任意の対象に対して白血球除去手続きおよび／または直接的細胞単離手続きのどちらを利用してもよい。
白血球除去産物、および／または血液、および／またはWBC/PBMC組成物、および／またはT細胞組成物は、臨床プロトコルでの利用を承認する標準的な病院の制度的採血手続きに従い、絶縁された容器の中に包装するとともに、制御された室温（+19℃～+25℃）に維持すべきである。白血球除去産物、および／または血液、および／またはWBC/PBMC組成物、および／またはT細胞組成物は、冷却してはならない。
白血球除去産物、および／または血液、および／またはWBC/PBMC組成物、および／またはT細胞組成物の細胞濃度は、輸送中に1 ml当たり0.2×109細胞を超えてはならない。白血球除去産物、および／または血液、および／またはWBC/PBMC組成物、および／またはT細胞組成物を強く混合することは避けるべきである。
白血球除去産物、および／または血液、および／またはWBC/PBMC組成物、および／またはT細胞組成物を（例えば一晩）保管せねばならない場合には、（上と同じ）制御された室温に維持すべきである。保管中、白血球除去産物、および／または血液、および／またはWBC/PBMC組成物、および／またはT細胞組成物の濃度は、1 ml当たり0.2×109細胞を決して超えてはならない。
好ましくは、白血球除去産物、および／または血液、および／またはWBC/PBMC組成物、および／またはT細胞組成物の細胞は、自家血漿の中に保管すべきである。いくつかの実施態様では、白血球除去産物、および／または血液、および／またはWBC/PBMC組成物、および／またはT細胞組成物の細胞濃度が1 ml当たり0.2×109細胞よりも大きい場合には、産物を自家血漿で希釈すべきである。
好ましくは、白血球除去産物、および／または血液、および／またはWBC/PBMC組成物、および／またはT細胞組成物は、標識と分離の手続きを開始するとき、24時間よりも前のものであってはならない。白血球除去産物、および／または血液、および／またはWBC/PBMC組成物、および／またはT細胞組成物は、細胞に標識するため、閉鎖システムおよび／または自動化システム（例えばCliniMACS Prodigy）を利用して処理すること、および／または調製することができる。
自動化システムは、追加のバフィーコート単離を、おそらくは細胞産物（例えば白血球除去産物、および／または血液、および／またはWBC/PBMC組成物、および／またはT細胞組成物）のフィコレーション（ficolation）および／または洗浄によって実施することができる。
閉鎖システムおよび／または自動システムを利用して（例えば白血球電気泳動産物、および／または血液、および／またはWBC/PBMC組成物、および／またはT細胞組成物から）T細胞を単離するための細胞を調製してその細胞に標識することができる。
WBC/PBMCには直接ヌクレオフェクトすることができる（それがより簡単であり、追加工程が節約される）が、本開示の方法は、ヌクレオフェクションの前に最初にT細胞を単離することを含むことができる。より容易な戦略であるPBMCへの直接的なヌクレオフェクションは、CARTyrinシグナル伝達を通じて媒介されるCARTyrin+細胞の選択的な増殖を必要とするため、そのこと自体が、T細胞を機能的に疲弊させることによって産物の生体内効力を直接低下させる劣った増殖法であることを証明している。産物は、T細胞、NK細胞、NKT細胞、単球、またはこれらの任意の組み合わせを含むCARTyrin+細胞の混成組成物である可能があり、そのことで産物内の変動性が患者ごとに大きくなり、投与とCRS管理がより難しくなる。T細胞は腫瘍の抑制と殺傷における一次エフェクタであると考えられているため、自己由来の産物を作製するためのT細胞単離によって、混成度がより大きい他の組成物よりも顕著な利点が得られる可能性がある。
T細胞は、標識した細胞の富化、または標識した細胞の枯渇により、1工程標識手続きでは直接的に、または2工程標識手続きでは間接的に単離することができる。本開示のいくつかの富化戦略によれば、T細胞はCell Collection Bagに回収し、標識されていない細胞（非標的細胞）はNegative Fraction Bagに回収することができる。本開示の1つの富化戦略とは異なり、標識されていない細胞（標的細胞）はCell Collection Bagに回収し、標識された細胞（非標的細胞）はNegative Fraction BagまたはNon-Target Cell Bagにそれぞれ回収する。選択試薬の非限定的な例に含まれるのは、抗体で被覆されたビーズである。抗体で被覆されたビーズは、改変工程および／または増殖工程の前に除去すること、または改変工程および／または増殖工程の前に細胞上に保持することができる。T細胞を単離するのに細胞マーカーの以下の非限定的な例、すなわちCD3、CD4、CD8、CD25、抗ビオチン、CD1c、CD3/CD19、CD3/CD56、CD14、CD19、CD34、CD45RA、CD56、CD62L、CD133、CD137、CD271、CD304、IFN-ガンマ、TCRアルファ／ベータのうちの1つ以上、および／またはこれらの任意の組み合わせを用いることができる。T細胞を単離する方法は、T細胞の単離に使用できる細胞マーカーの以下の非限定的な例、すなわちCD3、CD4、CD8、CD25、抗ビオチン、CD1c、CD3/CD19、CD3/CD56、CD14、CD19、CD34、CD45RA、CD56、CD62L、CD133、CD137、CD271、CD304、IFN-ガンマ、TCRアルファ／ベータのうちの1つ以上、および／またはこれらの任意の組み合わせに特異的に結合する、および／または検出可能に標識する1つ以上の試薬を含むことができる。これらの試薬は「適正製造基準」（「GMP」）グレードであってもなくてもよい。試薬の非限定的な例に含めることができるのは、Thermo DynaBeads 製品とMiltenyi CliniMACS製品である。本開示のT細胞を単離する方法は、標識工程および／または単離工程の多数回の繰り返しを含むことができる。本開示のT細胞を単離する方法の任意の時点で望まない細胞および／または望まない細胞タイプを、その望まない細胞および／または望まない細胞タイプを陽性選択または陰性選択することにより、本開示のT細胞産物組成物から枯渇させることができる。本開示のT細胞産物組成物は、CD4、および／またはCD8、および／または別のT細胞マーカーを発現することのできる追加の細胞タイプを含むことができる。
T細胞にヌクレオフェクトするための本開示の方法は、T細胞単離の工程をなくすことができる。それは例えば、WBC/PBMCの集団または組成物の中のT細胞にヌクレオフェクトし、ヌクレオフェクションの後に、単離工程、またはTCRシグナル伝達を通じた選択的増殖工程を含む方法によって可能である。
いくつかの細胞集団は、T細胞の富化および／またはソーティングの前または後の陽性選択または陰性選択によって枯渇させることができる。細胞産物組成物から枯渇させることのできる細胞組成物の例に含めることができるのは、骨髄細胞、CD25+制御性T細胞（T Reg）、樹状細胞、マクロファージ、赤血球細胞、マスト細胞、ガンマ-デルタT細胞、ナチュラルキラー（NK）細胞、ナチュラルキラー（NK）様細胞（例えばサイトカイン誘導キラー（CIK）細胞）、誘導ナチュラルキラー（iNK）T細胞、NK T細胞、B細胞のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせである。
本開示のT細胞産物組成物は、CD4+ T細胞とCD8+ T細胞を含むことができる。CD4+ T細胞とCD8+ T細胞は、単離または選択の手続き中に別々の回収バッグの中に単離することができる。CD4+ T細胞とCD8+ T細胞は、別々にさらに処理すること、または特定の比率で再構成した（同じ組成にする組み合わせの）後に処理することができる。
CD4+ T細胞とCD8+ T細胞を再構成することのできる具体的な比率は、T細胞産物組成物の増殖のために利用する増殖技術のタイプと効力、および／または細胞培地、および／または増殖条件に依存する。可能なCD4+：CD8+比の非限定的な例に含まれるのは、50％：50％、60％：40％、40％：60％、75％：25％、25％：75％である。
CD8+ T細胞は、腫瘍細胞を殺傷する強い能力を示すのに対し、CD4+ T細胞は、CD8+ T細胞の増殖能力と機能をサポートするのに必要な多くのサイトカインを提供する。正常なドナーから単離されたT細胞はCD4+が優勢であるため、T細胞産物組成物のCD4+：CD8+比をインビトロで人工的に調節し、そうでない場合に生体内で存在すると考えられるCD8+ T細胞に対するCD4+ T細胞の比率を改善する。自己由来T細胞産物組成物の生体外増殖で最適な比率を利いることもできる。T細胞産物組成物のCD4+：CD8+比を人工的に調節しているため、本開示の産物組成物は顕著に異なっている可能性があり、T細胞のどの内在性集団よりも顕著に大きい利点を提供できることに注意することが重要である。
T細胞を単離する好ましい方法は、無垢な汎T細胞を生成させるための陰性選択戦略を含むことができる。これは、得られるT細胞組成物が、これまで操作されたことがなくて内在性の多様性／比率であるT細胞を含むことを意味する。
陽性選択または陰性選択に使用できる試薬の非限定的な例に含まれるのは、磁性細胞分離ビーズである。磁性細胞分離ビーズは、CD4+ T細胞の選択された集団、CD8+ T細胞の選択された集団、CD4+ T細胞とCD8 + T細胞両方の混合集団のいずれかから除去すること、または枯渇させることを、本開示のT細胞単離法の中の次の工程を実行する前に実施してもしなくてもよい。
T細胞組成物とT細胞産物組成物を調製し、低温保存すること、および／または標準的なT細胞培地の中で保管すること、および／または遺伝子改変することができる。
T細胞組成物、T細胞産物組成物、刺激されていないT細胞組成物、休止しているT細胞組成物、またはこれらの任意の部分は、ヒト細胞を大きな回収率、および／または大きな生存率、および／または優れた表現型、および／または優れた機能的能力で保管して回収するために最適化された標準的な低温保存法を利用して低温保存することができる。市場で利用できる低温保存媒体および／またはプロトコルを利用することができる。本開示の低温保存法は、凍結に関連する毒性を低下させる無DMSO低温保存剤（例えばCryoSOfree（商標）無DMSO低温保存媒体）を含むことができる。
T細胞組成物、T細胞産物組成物、刺激されていないT細胞組成物、休止しているT細胞組成物、またはこれらの任意の部分は、培養培地の中に保管することができる。本開示のT細胞培養培地は、細胞の保管、および／または細胞の遺伝子改変、および／または細胞の表現型、および／または細胞の増殖に関して最適化することができる。本開示のT細胞培養培地は、1つ以上の抗生物質を含むことができる。細胞培地の中に抗生物質を含めると、ヌクレオフェクションを通じた遺伝子改変の後にトランスフェクション効率および／または細胞収率が低下する可能性があるため、特定の抗生物質（またはその組み合わせ）とそれぞれの濃度を変化させ、ヌクレオフェクションを通じた遺伝子改変の後に最適なトランスフェクション効率および／または細胞収率になるようにすることができる。
本開示のT細胞培地は血清を含むことができ、さらに、最適な細胞な細胞が得られるように血清の組成と濃度を変えることができる。ヒトAB血清は、T細胞の培養に関してFBS/FCSよりも好ましい。なぜなら本開示のT細胞培養培地での使用を考えるとしても、FBS/FCSは異物タンパク質を導入する可能性があるからである。血清は、培養中のT細胞組成物を投与する予定の対象の血液から単離できるため、本開示のT細胞培地は自己由来血清を含むことができる。無血清培地または血清代替物も本開示のT細胞培地で使用することができる。本開示のT細胞培地と方法のいくつかの実施態様では、無血清培地または血清代替物は、培地に異種血清を補充することと比べて利点を提供することができ、その非限定的な例に含まれるのは、より大きな生存率を持つより健康な細胞、および／またはより大きな効率でヌクレオフェクトするより健康な細胞、および／またはヌクレオフェクション後により大きな生存率を示すより健康な細胞、および／またはより望ましい細胞表現型を示すより健康な細胞、および／または増殖技術を適用したときにより多い／より速い増殖を示すより健康な細胞である。
T細胞培地は市販の細胞増殖培地を含むことができる。代表的な市販の細胞増殖培地の非限定的な例に含まれるのは、PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培地、CTS OpTimizer T細胞増殖SFM、TexMACS培地、PRIME-XV T細胞増殖培地、ImmunoCult-XF T細胞増殖培地、またはこれらの任意の組み合わせである。
T細胞組成物、T細胞産物組成物、非刺激T細胞組成物、休止しているT細胞組成物、またはこれらの任意の部分を遺伝子改変のために調製することができる。T細胞組成物、T細胞産物組成物、非刺激T細胞組成物、休止しているT細胞組成物、またはこれらの任意の部分を遺伝子改変のために調製する操作は、細胞洗浄、および／または望むヌクレオフェクションバッファの中への再懸濁を含むことができる。ヌクレオフェクションによる遺伝子改変のため、低温保存されたT細胞組成物を解凍して調製することができる。低温保存されたT細胞組成物は、標準的なプロトコルまたは既知のプロトコルに従って解凍することができる。低温保存された細胞の解凍と調製を最適化し、より大きな生存率を持つ細胞、および／またはより大きな効率でヌクレオフェクトされる細胞、および／またはヌクレオフェクション後により大きな生存率を示す細胞、および／またはより望ましい細胞表現型を示す細胞、および／または増殖技術を適用したときにより多い／より速い増殖を示す細胞を生成させることができる。解凍および／または調製プロセスで例えばGrifols Albutein（25％ヒトアルブミン）を用いることができる。

自己由来T細胞産物組成物の遺伝子改変
T細胞組成物、T細胞産物組成物、非刺激T細胞組成物、休止しているT細胞組成物、またはこれらの任意の部分は、例えば電気穿孔などのヌクレオフェクション戦略を利用して遺伝子を改変することができる。ヌクレオフェクトされる細胞の総数、ヌクレオフェクション反応の全体積、サンプルを調製する正確なタイミングを最適化し、より大きな生存率を持つ細胞、および／またはより大きな効率でヌクレオフェクトされる細胞、および／またはヌクレオフェクション後により大きな生存率を示す細胞、および／またはより望ましい細胞表現型を示す細胞、および／または増殖技術を適用したときにより多い／より速い増殖を示す細胞が生成するようにできる。
ヌクレオフェクションおよび／または電気穿孔は、例えばLonza Amaxa、および／またはMaxCyte PulseAgile、および／またはHarvard Apparatus BTX、および／またはInvitrogen Neonを利用して実現することができる。非金属電極系（プラスチックポリマー電極が含まれるが、それに限定されない）が、ヌクレオフェクションには好ましい可能性がある。
T細胞組成物、T細胞産物組成物、非刺激T細胞組成物、休止しているT細胞組成物、またはこれらの任意の部分は、ヌクレオフェクションによる遺伝子改変の前に、ヌクレオフェクションバッファの中に再懸濁させることができる。本開示のヌクレオフェクションバッファは、市販のヌクレオフェクションバッファを含んでいる。本開示のヌクレオフェクションバッファを最適化し、より大きな生存率を持つ細胞、および／またはより大きな効率でヌクレオフェクトされる細胞、および／またはヌクレオフェクション後により大きな生存率を示す細胞、および／またはより望ましい細胞表現型を示す細胞、および／または増殖技術を適用したときにより多い／より速い増殖を示す細胞を生成させることができる。本開示のヌクレオフェクションバッファの非限定的な例に含まれるのは、PBS、HBSS、OptiMEM、BTXpress、Amaxa Nucleofector、ヒトT細胞ヌクレオフェクションバッファと、これらの任意の組み合わせである。本開示のヌクレオフェクションバッファは、より大きな生存率を持つ細胞、および／またはり大きな効率でヌクレオフェクトされる細胞、および／またはヌクレオフェクション後により大きな生存率を示す細胞、および／またはより望ましい細胞表現型を示す細胞、および／または増殖技術を適用したときにより多い／より速い増殖を示す細胞が生成するよう、1つ以上の補助因子を含むことができる。代表的な補助因子の非限定的な例に含まれるのは、組み換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキンと、これらの任意の組み合わせである。代表的なサイトカイン、ケモカイン、インターロイキンの非限定的な例に含まれるのは、IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-ガンマ、IL-1アルファ/IL-1F1、IL-1ベータ/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/Fヘテロダイマー、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32β、IL-32γ、IL-33、LAP（TGF-ベータ1）、リンホトキシン-アルファ／TNF-ベータ、TGF-ベータ、TNF-アルファ、TRANCE/TNFSF11/RANKLと、これらの任意の組み合わせである。代表的な補助因子の非限定的な例に含まれるのは、塩、ミネラル、代謝産物、またはこれらの任意の組み合わせである。代表的な塩、ミネラル、代謝産物の非限定的な例に含まれるのは、HEPES、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、MEM非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、FBS/FCS、ヒト血清、血清代替物、抗生物質、pH調整剤、アール塩、2-メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組み換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Nucleofector PLUSサプリメント、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、ラクトビオン酸ナトリウム、マニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、CINa、グルコース、Ca(NO3)2、トリス／HCl、K2HPO4、KH2PO4、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロキサマー188、ポロキサマー181、ポロキサマー407、ポリビニルピロリドン、Pop313、クラウン-5と、これらの任意の組み合わせである。代表的な補助因子の非限定的な例に含まれるのは、PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培地、CTS OpTimizer T細胞増殖SFM、TexMACS培地、PRIME-XV T細胞増殖培地、ImmunoCult-XF T細胞増殖培地などの培地と、これらの任意の組み合わせである。代表的な補助因子の非限定的な例に含まれるのは、細胞のDNA感知、代謝、分化、シグナル伝達、アポトーシス経路と、これらの組み合わせの阻害剤である。阻害剤の非限定的な例に含まれるのは、TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型インターフェロン、炎症促進性サイトカイン、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNAポリメラーゼIII、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、カスパーゼ1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3Aいずれかの阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3β（GSK-3β）の阻害剤（例えばTWS119）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMKと、これらの任意の組み合わせである。代表的な補助因子の非限定的な例に含まれるのは、1つ以上の核酸を修飾して、または安定化させて細胞送達を増強する試薬、および／または核送達または核輸送を増強する試薬、および／または核への核酸の容易な輸送を増強する試薬、および／または染色体外核酸の分解を増強する試薬、および／またはDNAを媒介とした毒性を低下させる試薬である。1つ以上の核酸を修飾する、または安定化させる代表的な試薬の非限定的な例に含まれるのは、pH調整剤、DNA結合タンパク質、脂質、リン脂質、CaPO4、NLS配列を含むまたは含まない実効中性電荷DNA結合ペプチド、TREX1酵素と、これらの任意の組み合わせである。
転移試薬を、トランスポゾンとトランスポザーゼを含め、（場合によっては、ヌクレオフェクション反応用のバイアルまたはキュベットに収容された）ヌクレオフェクションバッファに細胞を添加する前、または添加するのと同時に、または添加した後に、本開示のヌクレオフェクション反応物に添加することができる。本開示のトランスポゾンは、プラスミドDNA、直線状プラスミドDNA、PCR産物、DOGGYBONE（商標）DNA、mRNA鋳型、一本鎖または二本鎖のDNA、タンパク質-核酸の組み合わせのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。本開示のトランスポゾンは、1つ以上のTTAA部位、1つ以上の逆方向末端反復（ITR）、1つ以上の長い末端反復（LTR）、1つ以上のインシュレータ、1つ以上のプロモータ、1つ以上の完全長遺伝子または切断型遺伝子、1つ以上のポリAシグナル、1つ以上の自己切断2Aペプチド切断部位、1つ以上の内部リボソーム侵入部位（IRES）、1つ以上のエンハンサ、1つ以上の調節因子、1つ以上の複製起点のいずれかをコードするか、これらの任意の組み合わせをコードする1つ以上の配列を含むことができる。
本開示のトランスポゾンは、1つ以上の完全長遺伝子または切断型遺伝子をコードする1つ以上の配列を含むことができる。本開示のトランスポゾンによって導入される完全長遺伝子および／または切断型遺伝子は、シグナルペプチド、CARTyrin、抗PSMA CARTyrin、センチリン、PSMA特異的センチリン、ヒンジ、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、キメラ抗原受容体（CAR）、キメラT細胞受容体（CAR-T、CARTyrin、抗PSMA CARTyrinのいずれか）、受容体、リガンド、サイトカイン、薬剤耐性遺伝子、腫瘍抗原、アロ抗原または自己抗原、酵素、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、蛍光タンパク質、突然変異タンパク質のうちの1つ以上、またはこれらの任意の組み合わせをコードすることができる。
本開示のトランスポゾンは、水、TAE、TBE、PBS、HBSS、培地、本開示の補助因子のいずれかの中、またはこれらの任意の組み合わせの中で調製することができる。
本開示のトランスポゾンは、臨床での安全性および／または製造しやすさが最適化されるように設計することができる。非限定的な一例として、本開示のトランスポゾンは、不要な配列または領域を除去すること、および／または非抗生物質選択マーカーを含めることにより、臨床での安全性および／または製造しやすさが最適化されるように設計することができる。本開示のトランスポゾンは、GMPグレードであってもなくてもよい。
本開示のトランスポザーゼ酵素は、プラスミドDNA、mRNA、タンパク質、タンパク質-核酸の組み合わせのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせの1つ以上の配列によってコードすることができる。
本開示のトランスポザーゼ酵素は、水、TAE、TBE、PBS、HBSS、培地、本開示の補助因子のいずれかの中、またはこれらの任意の組み合わせの中で調製することができる。本開示のトランスポザーゼ酵素、またはこれらをコードまたは送達する配列／コンストラクトは、GMPグレードであってもなくてもよい。
本開示のトランスポゾンとトランスポザーゼ酵素は、任意の手段によって細胞に送達することができる。
本開示の組成物と方法は、プラスミドDNA（pDNA）によって本開示のトランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼ酵素を細胞に送達することを含んでいるが、送達のためにプラスミドを使用することで、トランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼが細胞の染色体DNAに組み込まれる可能性があり、そのことによってトランスポザーゼの連続した発現につながる可能性がある。したがって本開示のトランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼ酵素は、染色体に組み込まれるあらゆる可能性を除去するため、mRNAまたはタンパク質として細胞に送達することができる。
本開示のトランスポゾンとトランスポザーゼは、このトランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼをヌクレオフェクション反応物の中に導入する前に、単独で、または別のトランスポゾンまたはトランスポザーゼと組み合わせて、あらかじめインキュベートすることができる。それぞれのトランスポゾンとトランスポザーゼの絶対量のほか、相対量（トランスポザーゼに対するトランスポゾンの比率）を最適化することができる。
ヌクレオフェクション反応物を場合によってはバイアルまたはキュベットの中で調製した後、この反応物をヌクレオフェクタ装置にロードし、製造者のプロトコルに従って電気パルスを送達するために活性化することができる。本開示のトランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼ（または本開示のトランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼをコードする配列）を細胞に送達するのに用いる電気パルスの条件を最適化し、より大きな生存率を持つ細胞、および／またはより大きなヌクレオフェクション効率を持つ細胞、および／またはヌクレオフェクション後の生存率がより大きい細胞、および／または望ましい細胞表現型を持つ細胞、および／または増殖技術を適用したときに増殖がより多い／より速い細胞を生成させることができる。Amaxaヌクレオフェクタ技術を利用するときには、Amaxa 2BヌクレオフェクタまたはAmaxa 4Dヌクレオフェクタのためのさまざまなヌクレオフェクションプログラムのそれぞれが考慮される。
本開示のヌクレオフェクション反応の後、細胞を細胞培地にそっと添加することができる。例えばT細胞がヌクレオフェクション反応をするとき、T細胞をT細胞培地に添加することができる。本開示のヌクレオフェクション後細胞培地は、任意の1つ以上の市販の培地を含むことができる。本開示のヌクレオフェクション後細胞培地を（本開示の本開示のヌクレオフェクション後T細胞培地を含めて）最適化し、より大きな生存率を持つ細胞、および／またはより大きなヌクレオフェクション効率を持つ細胞、および／またはヌクレオフェクション後により大きな生存率を示す細胞、および／またはより望ましい細胞表現型を示す細胞、および／または増殖技術を適用したときにより多い／より速い増殖を示す細胞を生成させることができる。本開示のヌクレオフェクション後細胞培地は、（本開示の本開示のヌクレオフェクション後T細胞培地を含め）、PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培地、CTS OpTimizer T細胞増殖SFM、TexMACS培地、PRIME-XV T細胞増殖培地、ImmunoCult-XF T細胞増殖培地と、これらの任意の組み合わせを含むことができる。本開示のヌクレオフェクション後細胞培地は、（本開示の本開示のヌクレオフェクション後T細胞培地を含め）、生存率、および／またはヌクレオフェクション効率、および／またはヌクレオフェクション後の生存率、および／または細胞表現型、および／または増殖技術を適用したときのより多い／より速い増殖を増強するため、本開示の1つ以上の補助因子を含むことができる。代表的な補助因子の非限定的な例に含まれるのは、組み換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキンと、これらの任意の組み合わせである。代表的なサイトカイン、ケモカイン、インターロイキンの非限定的な例に含まれるのは、IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-ガンマ、IL-1アルファ/IL-1F1、IL-1ベータ/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/Fヘテロダイマー、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32β、IL-32γ、IL-33、LAP（TGF-ベータ1）、リンホトキシン-アルファ／TNF-ベータ、TGF-ベータ、TNF-アルファ、TRANCE/TNFSF11/RANKLと、これらの任意の組み合わせである。代表的な補助因子の非限定的な例に含まれるのは、塩、ミネラル、代謝産物、またはこれらの任意の組み合わせである。代表的な塩、ミネラル、代謝産物の非限定的な例に含まれるのは、HEPES、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、MEM非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、FBS/FCS、ヒト血清、血清代替物、抗生物質、pH調整剤、アール塩、2-メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組み換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Nucleofector PLUSサプリメント、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、ラクトビオン酸ナトリウム、マニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、CINa、グルコース、Ca(NO3)2、トリス／HCl、K2HPO4、KH2PO4、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロキサマー188、ポロキサマー181、ポロキサマー407、ポリビニルピロリドン、Pop313、クラウン-5と、これらの任意の組み合わせである。代表的な補助因子の非限定的な例に含まれるのは、PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培地、CTS OpTimizer T細胞増殖SFM、TexMACS培地、PRIME-XV T細胞増殖培地、ImmunoCult-XF T細胞増殖培地などの培地と、これらの任意の組み合わせである。代表的な補助因子の非限定的な例に含まれるのは、細胞のDNA感知、代謝、分化、シグナル伝達、1つ以上のアポトーシス経路と、これらの組み合わせの阻害剤である。阻害剤の非限定的な例に含まれるのは、TLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型インターフェロン、炎症促進性サイトカイン、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNAポリメラーゼIII、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、カスパーゼ1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3Aいずれかの阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3β（GSK-3β）の阻害剤（例えばTWS119）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMKと、これらの任意の組み合わせである。代表的な補助因子の非限定的な例に含まれるのは、1つ以上の核酸を修飾して、または安定化させて細胞送達を増強する試薬、および／または核送達または核輸送を増強する試薬、および／または核への核酸の容易な輸送を増強する試薬、および／または染色体外核酸の分解を増強する試薬、および／またはDNAを媒介とした毒性を低下させる試薬である。1つ以上の核酸を修飾する、または安定化させる代表的な試薬の非限定的な例に含まれるのは、pH調整剤、DNA結合タンパク質、脂質、リン脂質、CaPO4、NLS配列を含むまたは含まない実効中性電荷DNA結合ペプチド、TREX1酵素と、これらの任意の組み合わせである。
本開示のヌクレオフェクション後細胞培地は、（本開示の本開示のヌクレオフェクション後T細胞培地を含め）、室温で、または例えば32℃～37℃（端点を含む）にあらかじめ温めて使用することができる。本開示のヌクレオフェクション後細胞培地は、（本開示の本開示のヌクレオフェクション後T細胞培地を含め）、細胞の生存率および／または本開示のトランスポゾンまたはその一部の発現を維持または増強する任意の温度にあらかじめ温めることができる。
本開示のヌクレオフェクション後細胞培地は、（本開示の本開示のヌクレオフェクション後T細胞培地を含め）、組織培養用のフラスコまたは皿、G-Rexフラスコ、Bioreactorまたは細胞培養バッグのいずれか、または他の標準的な任意の容器の中に収容することができる。本開示のヌクレオフェクション後細胞培地は、（本開示の本開示のヌクレオフェクション後T細胞培地を含め）、静置状態を維持すること、または撹乱すること（例えば揺すること、かき混ぜること、振盪すること）ができる。
ヌクレオフェクション後細胞培地は、遺伝子改変された細胞を含むことができる。ヌクレオフェクション後T細胞培地は、遺伝子改変されたT細胞を含むことができる。本開示の遺伝子改変された細胞は、規定された期間静置すること、または増殖のため例えばT Cell Expander技術の適用によって刺激することができる。いくつかの実施態様では、本開示の遺伝子改変された細胞は、規定された期間静置すること、または増殖のため例えばT Cell Expander技術の適用によってただちに刺激することができる。本開示の遺伝子改変された細胞を、馴化するのに十分な時間、および／または転移が起きるのに十分な時間、および／または陽性または陰性の選択に十分な時間にわたって静置し、その結果として、より大きな生存率を持つ細胞、および／またはより大きなヌクレオフェクション効率を持つ細胞、および／またはヌクレオフェクション後の生存率がより大きい細胞、および／または望ましい細胞表現型を持つ細胞、および／または増殖技術を適用したときに増殖がより多い／より速い細胞となるようにすることができる。本開示の遺伝子改変された細胞は、例えば1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、23時間、24時間、またはそれよりも長い時間にわたって静置することができる。いくつかの実施態様では、本開示の遺伝子改変された細胞は、例えば一晩静置することができる。いくつかの側面では、一晩は約12時間である。本開示の遺伝子改変された細胞は、例えば1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、またはそれよりも多い日数にわたって静置することができる。
本開示の遺伝子改変された細胞は、ヌクレオフェクション反応の後、かつExpander技術を適用する前に選択することができる。遺伝子改変された細胞の最適な選択のため、細胞をヌクレオフェクション後細胞培地の中に少なくとも2～14日間静置し、改変された細胞が容易に同定されるようにすること（例えば改変されていない細胞から改変された細胞を識別すること）ができる。
本開示のトランスポゾンのヌクレオフェクションが成功すると、早ければヌクレオフェクションの24時間後に、改変されたT細胞の中で本開示のセンチリンまたはCARTyrinと選択マーカーを検出できる可能性がある。トランスポゾンの染色体外発現が理由で、選択マーカーだけの発現では改変されていない細胞（トランスポゾンがうまく組み込まれなかった細胞）から改変された細胞（トランスポゾンがうまく組み込まれた細胞）を識別することはできない可能性がある。トランスポゾンが染色体外発現することで選択マーカーによる改変された細胞の検出が不明瞭になるときには、ヌクレオフェクトされた細胞（改変された細胞と改変されていない細胞の両方）をある期間（例えば2～14日間）にわたって静置し、細胞に発現を終えさせるか、あらゆる染色体外トランスポゾンの発現を失わせることができる。この延長された静置期間の後は、改変された細胞だけが選択マーカーの発現に関して陽性のままであるはずである。この延長された静置期間の長さは、各ヌクレオフェクション反応と選択プロセスに関して最適化することができる。トランスポゾンが染色体外発現することで選択マーカーによる改変された細胞の検出が不明瞭になるときには、選択は、この延長された静置期間なしで実施できるが、あとの時点で（例えば増殖段階の間または後に）追加選択工程が含まれる可能性がある。
本開示の遺伝子改変された細胞の選択は、任意の手段によって実施することができる。本開示の方法のいくつかの実施態様では、本開示の遺伝子改変された細胞の選択は、特定の選択マーカーを発現している細胞を単離することによって実現できる。本開示の選択マーカーは、トランスポゾン内の1つ以上の配列によってコードすることができる。本開示の選択マーカーは、成功した転移（すなわちトランスポゾン内の1つ以上の配列によってコードされていないこと）の結果として、改変された細胞が発現することができる。いくつかの実施態様では、本開示の遺伝子改変された細胞は、ヌクレオフェクション後細胞培地の有害な化合物に対する耐性を与える選択マーカーを含んでいる。有害な化合物は、例えば改変された細胞に選択マーカーによって与えられる耐性が存在しない場合に細胞死に至る可能性のある抗生物質または薬を含むことができる。代表的な選択マーカーの非限定的な例に含まれるのは、以下の遺伝子：neo、DHFR、TYMS、ALDH、MDR1、MGMT、FANCF、RAD51C、GCS、NKX2.2のうちの1つ以上の野生型（WT）形態または変異形態である。代表的な選択マーカーの非限定的な例に含まれるのは、表面で発現する選択マーカー、または表面で発現するタグであり、そのそれぞれを、Abで被覆した磁性ビーズ技術またはカラム選択によって標的とすることができる。タンパク質の精製で使用されるような切断可能なタグを本開示の選択マーカーに付加し、効率的なカラム選択、洗浄、溶離を実施することができる。いくつかの実施態様では、本開示の選択マーカーは、改変された細胞（改変されたT細胞が含まれる）によって内在的に発現されることはないため、改変された細胞の（例えばセルソーティング技術による）物理的単離において有用である可能性がある。改変された細胞（改変されたT細胞が含まれる）が内在的に発現することのない本開示の代表的な選択マーカーの非限定的な例に含まれるのは、CD271、CD19、CD52、CD34、RQR8、CD22、CD20、CD33の完全長形態、または変異形態、または切断形態と、これらの任意の組み合わせである。
本開示の遺伝子改変された細胞は、ヌクレオフェクション反応の後に選択的に増殖させることができる。いくつかの実施態様では、CARTyrinを含む改変された細胞は、CARTyrin刺激によって選択的に増殖させることができる。CARTyrinを含む改変された細胞は、標的で覆われた試薬（例えば標的を発現している腫瘍系または正常な細胞系、または標的に覆われているエクスパンダービーズ）との接触によって刺激することができる。あるいはCARTyrinを含む改変された細胞は、照射された腫瘍細胞、照射された同種他家由来の正常な細胞、照射された自己由来のPBMCとの接触によって刺激することができる。例えば細胞産物組成物を対象に直接投与できるとき、本開示の細胞産物組成物が刺激に用いる標的発現細胞でできるだけ汚染されないようにするため、刺激は、CARTyrin標的タンパク質で被覆されたエクスパンダービーズを用いて実施することができる。CARTyrinを含む改変されたT細胞のCARTyrin刺激による選択的増殖を最適化し、改変されたT細胞が機能的に疲弊するのを回避することができる。
選択された本開示の遺伝子改変細胞は、低温保存すること、または規定された期間静置すること、またはCell Expander技術の適用によって増殖を刺激することができる。選択された本開示の遺伝子改変細胞は、低温保存すること、または規定された期間静置すること、またはCell Expander技術の適用によって増殖をただちに刺激することができる。選択された遺伝子改変細胞がT細胞であるときには、T Cell Expander技術を適用することによってそのT細胞を刺激して増殖させることができる。選択された本開示の遺伝子改変細胞は、例えば1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、7時間、8時間、9時間、10時間、11時間、12時間、13時間、14時間、15時間、16時間、17時間、18時間、19時間、20時間、21時間、22時間、23時間、24時間、またはそれよりも長い時間にわたって静置することができる。いくつかの実施態様では、選択された本開示の遺伝子改変細胞は、例えば一晩静置することができる。いくつかの側面では、一晩は約12時間である。選択された本開示の遺伝子改変細胞は、例えば1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、またはそれよりも多い日数にわたって静置することができる。選択された本開示の遺伝子改変細胞を任意の期間静置し、生存率がより大きい細胞、および／またはヌクレオフェクション効率がより大きい細胞、および／またはヌクレオフェクション後の生存率がより大きい細胞、および／または望ましい細胞表現型を持つ細胞、および／または増殖技術を適用したときに増殖がより多い／より速い細胞にすることができる。
選択された遺伝子改変細胞（本開示の選択された遺伝子改変T細胞が含まれる）は、任意の標準的な低温保存法を利用して低温保存することができる。この方法は、ヒト細胞を大きな回収率、および／または大きな生存率、および／または優れた表現型、および／または優れた機能的能力で保管および／または回収するために最適化することができる。本開示の低温保存法は、市販の低温保存媒体および／またはプロトコルを含むことができる。
選択された遺伝子改変細胞（本開示の選択された遺伝子改変T細胞が含まれる）の転移効率は、任意の手段によって評価することができる。例えばエクスパンダー技術を適用する前に、選択された遺伝子改変細胞（本開示の選択された遺伝子改変T細胞が含まれる）によるトランスポゾンの発現を蛍光活性化セルソーティング（FACS）によって測定することができる。選択された遺伝子改変細胞（本開示の選択された遺伝子改変T細胞が含まれる）の転移効率の測定は、トランスポゾン（例えばCARTyrin）を発現している選択された細胞の割合を求めることを含むことができる。その代わりに、またはそれに加えて、T細胞の純度、および／またはトランスポゾン発現（例えばCARTyrin発現）の平均蛍光強度（MFI）、および／または（トランスポゾンの中に送達される）CARTyrinが、CARTyrinリガンドを発現している標的細胞の脱顆粒化および／または殺傷を媒介する能力、および／または選択された遺伝子改変細胞（本開示の選択された遺伝子改変T細胞が含まれる）の表現型を任意の手段によって評価することができる。
本開示の細胞産物組成物は、所定の判定基準に合致するとき、対象に投与するために出荷することができる。代表的な判定基準の非限定的な例に含まれるのは、細胞表面にCARTyrinを検出可能なレベルで発現している改変されたT細胞、および／または選択されたT細胞、および／または増殖されたT細胞の個々の割合である。

自己由来のT細胞産物組成物の遺伝子改変
本開示の遺伝子改変された細胞（選択された遺伝子改変T細胞が含まれる）は、エクスパンダー技術を利用して増殖させることができる。本開示のエクスパンダー技術は、市販のエクスパンダー技術を含むことができる。本開示の代表的なエクスパンダー技術は、TCRを通じて本開示の遺伝子改変された細胞を刺激することを含んでいる。本開示の遺伝子改変された細胞を刺激するあらゆる手段が考えられるが、TCRを通じて本開示の遺伝子改変されたT細胞を刺激することが、好ましい1つの方法であり、優れたレベルの殺傷能力を持つ産物が生成する。
TCRを通じて本開示の遺伝子改変された細胞を刺激するため、Thermo Expander DynaBeadsを、ビーズとT細胞の比を3：1にして使用することができる。このエクスパンダービーズが生物分解性でない場合には、ビーズをエクスパンダー組成物から除去することができる。例えばビーズは約5日後にエクスパンダー組成物から除去することができる。TCRを通じて本開示の遺伝子改変された細胞を刺激するため、StemCell Technologies社のImmunoCult Human CD3/CD28またはCD3/CD28/CD2 T細胞活性化試薬を用いることができる。この可溶性四量体抗体複合体はある期間が経過した後に分解するためプロセスから除去する必要がないと考えられるという理由で、この技術がより好ましい可能性がある。
人工抗原提示細胞（APC）は、操作して標的抗原を同時に発現させることができ、本開示のTCRおよび／またはCARTyrinを通じて本開示の細胞またはT細胞を刺激するのに用いることができる。人工APCは、腫瘍細胞系（例えば不死化された骨髄性白血病系K562が含まれる）を含むこと、または腫瘍細胞系に由来することができ、操作して多数の共刺激分子または共刺激技術（CD28、4-1BBL、CD64、mbIL-21、mbIL-15、CAR標的分子など）を同時に発現させることができる。本開示の人工APCを共刺激分子と組み合わせるとき、条件を最適化して望ましくない表現型と機能的能力、すなわち最終的に分化したエフェクタT細胞の発達または出現を阻止することができる。
照射されたPBMC（自己またはアロ）はいくつかの標的抗原（CD19など）を発現することができ、本開示のTCRおよび／またはCARTyrinを通じて本開示の細胞またはT細胞を刺激するのに用いることができる。その代わりに、またはそれに加えて、照射された腫瘍細胞はいくつかの標的抗原を発現することができ、本開示のTCRおよび／またはCARTyrinを通じて本開示の細胞またはT細胞を刺激するのに用いることができる。
プレートに結合した、および／または可溶性の抗CD3、および／または抗CD2、および／または抗CD28の刺激を用い、本開示のTCRおよび／またはCARTyrinを通じて本開示の細胞またはT細胞を刺激することができる。
抗原で被覆したビーズは標的タンパク質を提示することができるため、本開示のTCRおよび／またはCARTyrinを通じて本開示の細胞またはT細胞を刺激するのに用いることができる。その代わりに、またはそれに加えて、CARTyrin標的タンパク質で被覆したエクスパンダービーズを用い、本開示のTCRおよび／またはCARTyrinを通じて本開示の細胞またはT細胞を刺激することができる。
増殖法を適用し、TCRおよび／またはCARTyrinを通じてと、遺伝子改変されたT細胞の表面に発現したCD2、および／またはCD3、および／またはCD28、および／または4-1BB、および／または他のマーカーを通じて本開示の細胞またはT細胞を刺激する。
増殖技術は、ヌクレオフェクションの直後からヌクレオフェクションの約24時間後まで本開示の細胞に適用することができる。さまざまな細胞培地を増殖手続きの間に使用できるが、本開示の望ましいT細胞増殖培地は、例えば生存率がより大きい細胞、より優れた細胞表現型を持つ細胞、全増殖がより大きい細胞や、生体内の持続性、移植、CARを媒介とした殺傷に関する能力がより大きい細胞を生成させることができる。本開示の細胞培地を最適化し、本開示の遺伝子改変された細胞の増殖、表現型、機能を改善／増強することができる。増殖されたT細胞の好ましい1つの表現型に含めることができるのは、幹記憶T細胞、セントラル記憶T細胞、エフェクタ記憶T細胞の混合物である。Expander Dynabeadsは、臨床における優れた性能につながる可能性があるセントラル記憶T細胞を主に生成させることができる。
本開示の代表的なT細胞増殖培地は、部分的に、または全体が、PBS、HBSS、OptiMEM、DMEM、RPMI 1640、AIM-V、X-VIVO 15、CellGro DC培地、CTS OpTimizer T細胞増殖SFM、TexMACS培地、PRIME-XV T細胞増殖培地、ImmunoCult-XF T細胞増殖培地のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせを含むことができる。本開示のT細胞増殖培地は、1つ以上の補助因子をさらに含むことができる。本開示のT細胞増殖培地に含めることのできる補助因子は、生存率、細胞表現型、全増殖を増強したり、生体内の持続性、移植、CARTyrinを媒介とした殺傷の能力を増強したりする。本開示のT細胞増殖培地に含めることのできる補助因子の非限定的な例に含まれるのは、組み換えヒトサイトカイン、および／またはケモカイン、および／またはインターロイキン、例えば、IL2、IL7、IL12、IL15、IL21、IL1、IL3、IL4、IL5、IL6、IL8、CXCL8、IL9、IL10、IL11、IL13、IL14、IL16、IL17、IL18、IL19、IL20、IL22、IL23、IL25、IL26、IL27、IL28、IL29、IL30、IL31、IL32、IL33、IL35、IL36、GM-CSF、IFN-ガンマ、IL-1アルファ/IL-1F1、IL-1ベータ/IL-1F2、IL-12 p70、IL-12/IL-35 p35、IL-13、IL-17/IL-17A、IL-17A/Fヘテロダイマー、IL-17F、IL-18/IL-1F4、IL-23、IL-24、IL-32、IL-32ベータ、IL-32ガンマ、IL-33、LAP（TGF-ベータ1）、リンホトキシン-アルファ／TNF-ベータ、TGF-ベータ、TNF-アルファ、TRANCE/TNFSF11/RANKLのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせである。本開示のT細胞増殖培地に含めることのできる補助因子の非限定的な例に含まれるのは、塩、および／またはミネラル、および／または代謝産物、例えばHEPES、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、L-グルタミン、MEM非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、FBS/FCS、ヒト血清、血清代替物、抗生物質、pH調整剤、アール塩、2-メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組み換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Nucleofector PLUSサプリメント、KCL、MgCl2、Na2HPO4、NAH2PO4、ラクトビオン酸ナトリウム、マニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、CINa、グルコース、Ca(NO3)2、トリス／HCl、K2HPO4、KH2PO4、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロキサマー188、ポロキサマー181、ポロキサマー407、ポリビニルピロリドン、Pop313、クラウン-5のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせである。本開示のT細胞増殖培地に含めることのできる補助因子の非限定的な例に含まれるのは、細胞のDNA感知、および／または代謝、および／または分化、および／またはシグナル伝達、および／またはアポトーシス経路の阻害剤、例えばTLR9、MyD88、IRAK、TRAF6、TRAF3、IRF-7、NF-KB、1型インターフェロン、炎症促進性サイトカイン、cGAS、STING、Sec5、TBK1、IRF-3、RNAポリメラーゼIII、RIG-1、IPS-1、FADD、RIP1、TRAF3、AIM2、ASC、カスパーゼ1、Pro-IL1B、PI3K、Akt、Wnt3Aいずれかの阻害剤、グリコーゲン合成酵素キナーゼ-3β（GSK-3β）の阻害剤（例えばTWS119）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、AC-YVAD-CMK、Z-VAD-FMK、Z-IETD-FMKのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせである。
本開示のT細胞増殖培地に含めることのできる補助因子の非限定的な例に含まれるのは、核酸を修飾して、または安定化させて、細胞送達を増強する試薬、および／または核送達または核輸送を増強する試薬、および／または核への核酸の容易な輸送を増強する試薬、および／または染色体外核酸の分解を増強する試薬、および／またはDNAを媒介とした毒性を低下させる試薬、例えばpH調整剤、DNA結合タンパク質、脂質、リン脂質、CaPO4、NLS配列を含むまたは含まない実効中性電荷DNA結合ペプチド、TREX1酵素のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせである。
本開示の遺伝子改変された細胞は、増殖プロセスの間に、選択を可能にする薬または化合物を用いて選択することができる。例えばいくつかの実施態様では、本開示のトランスポゾンが、遺伝子改変された細胞に、細胞培地に添加された薬に対する耐性を与える選択マーカーをコードできるとき、選択は増殖プロセスの間に起こることができ、選択が起こるには約1～14日間の培養が必要とされる可能性がある。本開示のトランスポゾンによってコードされる選択マーカーとして使用できる薬剤耐性遺伝子の非限定的な例に含まれるのは、遺伝子Neo、DHFR、TYMS、FRANCF、RAD51C、GCS、MDR1、ALDH1、NKX2.2のいずれかの野生型（WT）形態または変異形態、またはこれらの任意の組み合わせである。選択マーカーが耐性を与えることのできる培養培地に添加することのできる対応する薬または化合物の非限定的な例に含まれるのは、G418、ピューロマイシン、アンピシリン、カナマイシン、メトトレキサート、メファラン、テモゾロミド、ビンクリスチン、エトポシド、ドキソルビシン、ベンダムスチン、フルダラビン、アレディア（パミドロン酸二ナトリウム）、ベセヌム（カルムスチン）、BiCNU（カルムスチン）、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、カルムブリス（カルムスチン）、カルムスチン、クラフェン（シクロホスファミド）、シクロホスファミド、シトキサン（シクロホスファミド）、ダラツムマブ、ダルザレックス（ダラツムマブ）、ドキシル（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、塩酸ドキソルビシンリポソーム、ドックス-SL（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、エロツズマブ、エムプリシティ（エロツズマブ）、エバセット（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、ファリーダック（パノビノスタット）、クエン酸イクサゾミブ、キプロリス（カルフィルゾミブ）、レナリドマイド、リポドックス（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、モゾビル（プレリキサホル）、ネオサル（シクロホスファミド）、ニンラロ（クエン酸イクサゾミブ）、パミドロン酸二ナトリウム、パノビノスタット、プレリキサホル、ポマリドマイド、ポマリスト（ポマリドマイド）、レブリミド（レナリドマイド）、シノビル（サリドマイド）、サリドマイド、サロミド（サリドマイド）、ベルケイド（ボルテゾミブ）、ゾレドロン酸、ゾメタ（ゾレドロン酸）のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせである。
本開示のT細胞増殖プロセスは、WAVE Bioreactorの中の細胞培養バッグの中、またはG-Rexフラスコの中、または他の適切な任意の容器および／または反応器の中で起こることができる。
本開示の細胞培養物またはT細胞培養物は、安定な状態、揺らした状態、かき混ぜた状態、振盪させた状態のいずれかに維持することができる。
本開示の細胞増殖プロセスまたはT細胞増殖プロセスは、いくつかの条件を最適化することができ、条件の非限定的な例に含まれるのは、培養時間、細胞の濃度、T細胞培地の添加／除去のスケジュール、細胞のサイズ、全細胞数、細胞表現型、細胞集団の純度、増殖している細胞集団の中の遺伝子改変された細胞の割合、サプリメントの使用と組成、エクスパンダー技術の適用／除去のいずれか、またはこれらの任意の組み合わせである。
本開示の細胞増殖プロセスまたはT細胞増殖プロセスは、得られる増殖した細胞集団が形成される前のあらかじめ決めたエンドポイントまで継続することができる。例えば本開示の細胞増殖プロセスまたはT細胞増殖プロセスは、あらかじめ決めた時間にわたって継続すること、例えば少なくとも2時間、4時間、6時間、8時間、10時間、12時間、14時間、16時間、18時間、20時間、22時間、24時間；または少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、21日間、22日間、23日間、24日間、25日間、26日間、27日間、28日間、29日間、30日間；または少なくとも1週間、2週間、3週間、4週間、5週間、6週間、7週間、8週間、9週間、10週間、11週間、12週間；または少なくとも1ヶ月間、2ヶ月間、3ヶ月間、4ヶ月間、5ヶ月間、6ヶ月間；または少なくとも1年間にわたって継続することができる。本開示の細胞増殖プロセスまたはT細胞増殖プロセスは、得られる培養物があらかじめ決めた全細胞密度に到達するまで、例えば体積（μl、ml、Ｌ）当たり1個、10個、100個、1000個、104個、105個、106個、107個、108個、109個、1010個の細胞、またはこれらの数値の間の任意の密度に到達するまで継続することができる。本開示の細胞増殖プロセスまたはT細胞増殖プロセスは、得られる培養物の遺伝子改変された細胞が、本開示のトランスポゾンのあらかじめ決めた発現レベルを示すまで、例えば発現の閾値レベル（得られた遺伝子改変された細胞が臨床で有効であることを示す発現の最低レベル、または最高レベル、または平均レベル）の1％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、またはこれらの数値の間の任意の割合を示すまで継続することができる。本開示の細胞増殖プロセスまたはT細胞増殖プロセスは、得られる培養物の遺伝子改変された細胞の割合と改変されていない細胞の割合が、あらかじめ決めた閾値に到達するまで、例えば少なくとも1：10、1：9、1：8、1：7、1：6、1：5、1：4、1：3、1：2、1：1、2：1、2：1、4：1、5：1、6：1、7：1、8：1、9：1、10：1、またはこれらの間の任意の比に到達するまで継続することができる。

出荷するための遺伝子改変された自己由来T細胞の分析
遺伝子改変された細胞の割合は、本開示の増殖プロセスの間または後に評価することができる。本開示の改変された細胞によるトランスポゾンの細胞発現は、蛍光活性化セルソーティング（FACS）によって測定することができる。例えばFACSを利用して本開示のCARTyrinを発現する細胞またはT細胞の割合を求めることができる。その代わりに、またはそれに加えて、遺伝子改変された細胞またはT細胞の純度、および／または本開示の遺伝子改変された細胞またはT細胞が発現するCARTyrinの平均蛍光強度（MFI）、および／またはCARTyrinが、CARTyrinリガンドを発現している標的細胞の脱顆粒化および／または殺傷を媒介する能力、および／またはCARTyrin+ T細胞の表現型を評価することができる。
対象に投与するための本開示の組成物は、この組成物が、医薬産物としての製剤、および／または対象への投与に関して安全かつ効果的であることを示す1つ以上の「判定基準」を満たしている必要がある可能性がある。判定基準には、本開示の組成物（例えば本開示のT細胞産物）が、その細胞表面に検出可能なレベルの本開示のCARTyrinを発現している特定の割合のT細胞を含むという条件を含めることができる。
増殖プロセスは、具体的な基準（例えば細胞が所定の総数に到達する、特定の集団の記憶細胞に到達する、特定のサイズの集団に到達する）が満たされるまで継続すべきである。
いくつかの基準が、増殖プロセスを終わらせるべき時点を通知する。例えば細胞が300 fLの細胞サイズに達すると、製剤化、または再活性化、または低温保存すべきである（そうしないと、この閾値を超えたサイズに達した細胞は死に始める可能性がある）。細胞の集団が300 fL未満の平均細胞サイズに達した直後に低温保存すると、解凍して培養したときに細胞の回収率がより優れている可能性がある。なぜなら細胞は、低温保存の前にまだ完全な休止状態には到達していなかったからである（完全休止のサイズは約180 fL）。増殖の前に本開示のT細胞は約180 fLの細胞サイズを持っている可能性があるが、増殖の3日後にはその4倍超の細胞サイズである約900 fLに達する可能性がある。次の6～12日間をかけてT細胞の集団は細胞サイズがゆっくりと減少し、180 fLで完全に休止する。
製剤のための細胞集団を調製する方法は、非限定的な例として、細胞集団の細胞を濃縮する工程、および／または細胞を洗浄する工程、および／または特定の表面発現マーカーに対する薬剤耐性または磁性ビーズソーティングを通じて細胞をさらに選択する工程を含むことができる。製剤のための細胞集団を調製する方法は、最終産物の安全性と純度を保証するためのソーティング工程をさらに含むことができる。例えば患者からの腫瘍細胞を用いて本開示の遺伝子改変された細胞を刺激した場合、または製剤のために調製中の本開示の遺伝子改変された細胞を刺激するのに腫瘍細胞が遺伝子改変されている場合、患者からの腫瘍細胞が最終産物にまったく含まれないことが極めて重要である。

細胞産物の輸液および／または輸液のための低温保存
本開示の医薬製剤は、輸液のため、および／または低温保存のため、および／または保管のため、複数のバッグの中に分配することができる。
本開示の医薬製剤は、標準的なプロトコルと、場合によっては輸液可能な低温保存媒体を用いて低温保存することができる。例えば無DMSO低温保存媒体（例えばCryoSOfree（商標）無DMSO低温保存媒体）を用いて凍結関連毒性を減らすことができる。本開示の低温保存された医薬製剤は、患者に後日輸液するために保管することができる。有効な治療は、本開示の医薬製剤の多数回投与を必要とする可能性があるため、医薬製剤は、凍結保管できるが個々の用量を解凍するために分離されているあらかじめアリコート化された「用量」に包装することができる。
本開示の医薬製剤は室温で保管することができる。有効な治療は、本開示の医薬製剤の多数回投与を必要とする可能性があるため、医薬製剤は、まとめて保管できるが個々の用量を投与するために分離されているあらかじめアリコート化された「用量」に包装することができる。
本開示の医薬製剤は、のちの再増殖および／または選択のためにアーカイブ化することができる。それは、例えば病状の寛解と再発の後の将来のある日に投与する必要がある可能性のある同種他家療法の場合に同じ患者への追加用量を生成させるためである。

製剤
上に指摘したように、本開示により、安定な製剤（生理食塩水または選択された塩を含むリン酸塩バッファを含んでいることが好ましい）、保存剤を含む保存された溶液と製剤、医薬または獣医学で用いるのに適した多用途の保存された製剤が提供され、これら製剤は、医薬として許容可能な製剤の中に少なくとも1つのCARTyrinを含んでいる。保存された製剤は、水性希釈剤の中に、少なくとも1つの既知の保存剤を含んでいるか、場合によっては少なくとも1つのフェノール、m-クレゾール、p-クレゾール、o-クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム（例えば六水和物）、アルキルパラベン（メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベンなど）、塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、チメロサール、ポリマーからなるグループから選択された保存剤、またはこれらの混合物を含んでいる。本分野で知られている適切な任意の濃度または混合物（例えば約0.0015％、またはその中の任意の範囲、または値、または一部）を用いることができる。非限定的な例に含まれるのは、保存剤なし、約0.1～2％のm-クレゾール（例えば0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.9％、1.0％）、約0.1～3％のベンジルアルコール（例えば0.5％、0.9％、1.1％、1.5％、1.9％、2.0％、2.5％）、約0.001～0.5％のチメロサール（例えば0.005％、0.01％）、約0.001～2.0％のフェノール（例えば0.05％、0.25％、0.28％、0.5％、0.9％、1.0％）、0.0005～1.0％のアルキルパラベン（例えば0.00075％、0.0009％、0.001％、0.002％、0.005％、0.0075％、0.009％、0.01％、0.02％、0.05％、0.075％、0.09％、0.1％、0.2％、0.3％、0.5％、0.75％、0.9％、1.0％）などである。
上に指摘したように、本発明により、製造品として、包装材料と、場合によっては水性希釈剤の中に少なくとも1つのCARTyrinと処方されたバッファおよび／または保存剤を含む溶液を収容した少なくとも1つのバイアルを含む製品が提供される。この場合に包装材料は、このような溶液を1時間、2時間、3時間、4時間、5時間、6時間、9時間、12時間、18時間、20時間、24時間、30時間、36時間、40時間、48時間、54時間、60時間、66時間、72時間、またはそれよりも長い期間にわたって保持できることを示すラベルを含んでいる。本発明は、製造品として、包装材料と、凍結乾燥させた少なくとも1つのCARTyrinを収容した第1のバイアルと、処方されたバッファまたは保存剤の水性希釈剤を収容した第2のバイアルを含む製造品をさらに含んでいる。この場合に包装材料は、少なくとも1つのCARTyrinを水性希釈剤の中で再構成して溶液を形成すると、この溶液を24時間またはそれよりも長い期間にわたって保持できることを患者に教えるラベルを含んでいる。
本発明に従って用いられる少なくとも1つのCARTyrinは、組み換え手段によって哺乳動物細胞またはトランスジェニック調製物から生成させること、または本明細書に記載されているか本分野で知られている他の生物供給源から精製することができる。
本発明の製品中の少なくとも1つのCARTyrinの範囲は、湿／乾系の中にある場合に再構成されたとき約1.0μg/ml～約1000 mg/mlの濃度を生じさせる量を含んでいるが、より低い濃度とより高い濃度が可能であり、その範囲は、想定する送達ビヒクルに依存する（例えば溶液製剤は、経皮パッチ、肺法、経粘膜法、浸透圧法、マイクロポンプ法のいずれとも異なる）。
水性希釈剤は、医薬として許容可能な保存剤を場合によってはさらに含んでいることが好ましい。好ましい保存剤に含まれるのは、フェノール、m-クレゾール、p-クレゾール、o-クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベンなど）、塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、チメロサールからなるグループから選択されたもの、またはこれらの混合物である。製剤の中で用いられる保存剤の濃度は、抗菌効果を生じさせるのに十分な濃度である。そのような濃度は選択される保存剤に依存しており、当業者によって容易に求められる。
他の賦形剤（例えば等張剤、バッファ、抗酸化剤、保存増強剤）を場合によっては希釈剤に添加することができ、そうすることが好ましい可能性がある。等張剤（グリセリンなど）が、既知の濃度で一般に使用される。生理学的に容認されるバッファを添加してpH制御を改善することが好ましい。製剤は広い範囲のpH（例えばpH約4～pH約10）をカバーできるが、好ましい範囲はpH約5～pH約9であり、最も好ましい範囲は約6.0～約8.0である。本発明の製剤は、約6.8～約7.8のpHを持つことが好ましい。好ましいバッファはリン酸塩バッファを含み、最も好ましくはリン酸ナトリウム、特にリン酸塩緩衝化生理食塩水（PBS）を含んでいる。
他の添加剤、例えば医薬として許容可能な溶解剤（Tween（登録商標） 20（ポリオキシエチレン（20）モノラウリン酸ソルビタン）、Tween（登録商標） 40（ポリオキシエチレン（20）モノパルミチン酸ソルビタン）、Tween（登録商標） 80（ポリオキシエチレン（20）モノオレイン酸ソルビタン）、Pluronic F68（ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックコポリマー）、PEG（ポリエチレングリコール）など）、非イオン性表面活性剤（ポリソルベート20または80、またはポロキサマー184または188、Pluronic（登録商標）ポリオール、他のブロックコポリマー）、キレート剤（例えばEDTAとEGTA）を場合によっては製剤または組成物に添加して凝集を減らすことができる。これら添加剤は、ポンプまたはプラスチック製容器を用いて製剤を投与する場合に特に有用である。医薬として許容可能な界面活性剤が存在していると、タンパク質が凝集する傾向が緩和される。
本発明の製剤は、少なくとも1つのCARTyrinと、フェノール、m-クレゾール、p-クレゾール、o-クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、アルキルパラベン（メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、ブチルパラベンなど）、塩化ベンズアルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、チメロサールからなるグループから選択された1つの保存剤、またはこれら保存剤の混合物を、水性希釈剤の中で混合することを含むプロセスによって調製することができる。水性希釈剤の中での少なくとも1つのCARTyrinと保存剤の混合は、従来の溶解手続きと混合手続きを利用して実施される。適切な製剤を調製するため、例えば緩衝化溶液の中の測定された量の少なくとも1つのCARTyrinを、緩衝化溶液の中の望む保存剤と、このタンパク質と保存剤を望む濃度で提供するのに十分な量で組み合わせる。当業者であればこのプロセスのバリエーションを知っているであろう。例えば構成成分を添加する順番、追加添加剤を用いるかどうか、製剤を調製するpHと温度が、使用する濃度と投与手段のために最適化することのできる全因子である。
本発明の製剤は、透明な溶液として、または二重バイアルとして、患者に提供することができる。二重バイアルは、再構成される凍結乾燥された少なくとも1つのCARTyrinのバイアルと、水および／または保存剤および／または賦形剤（リン酸塩バッファおよび／または生理食塩水と、選択された塩が好ましい）を水性希釈剤の中に含む第2のバイアルを含んでいる。単一溶液バイアル、または再構成を必要とする二重バイアルは多数回再利用することができ、患者治療の単回サイクルまたは多数回サイクルにとって十分である可能性があるため、現在利用できるよりも便利な治療計画を提供することができる。
本発明の製造品は、直後から24時間またはそれよりも長い範囲の期間にわたる投与に有用である。したがって本発明の製造品は、患者に大きな利点を提供する。本発明の製剤は、場合によっては約2℃～約40℃の温度で安全に保管することと、タンパク質の生物活性を長期間にわたって保持することができるため、包装ラベルに、この溶液を6時間、12時間、18時間、24時間、36時間、48時間、72時間、96時間、またはそれよりも長い期間にわたって保持および／または使用できることを示すことができる。保存された希釈液を用いる場合には、そのようなラベルは、1～12ヶ月間、および／または半年間、および／または1年半の間、および／または2年間までの使用を含むことができる。
本発明の少なくとも1つのCARTyrinの溶液は、少なくとも1つのCARTyrinを水性希釈剤の中で混合することを含む方法によって調製することができる。混合は、従来の溶解手続きと混合手続きを利用して実施される。適切な希釈液を調製するため、例えば水またはバッファの中の測定された量の少なくとも1つのCARTyrinを、場合によっては保存剤またはバッファと、このタンパク質と保存剤またはバッファを望む濃度で提供するのに十分な量で組み合わせる。当業者であればこのプロセスのバリエーションを知っているであろう。例えば構成成分を添加する順番、追加添加剤を用いるかどうか、製剤を調製するpHと温度が、使用する濃度と投与手段のために最適化することのできる全因子である。
本発明の製品は、透明な溶液として、または二重バイアルとして患者に提供することができる。二重バイアルは、凍結乾燥された少なくとも1つのCARTyrinのバイアルを含んでいて、このCARTyrinは、水性希釈剤を含む第2のバイアルを用いて再構成される。単一溶液バイアル、または再構成を必要とする二重バイアルは多数回再利用することができ、患者治療の単回サイクルまたは多数回サイクルにとって十分である可能性があるため、現在利用できるよりも便利な治療計画を提供することができる。
本発明の製品は、薬局、クリニック、または他のそのような機関と施設に、透明な溶液を提供することによって、または凍結乾燥された少なくとも1つのCARTyrinのバイアルを含む二重バイアル（CARTyrinは、水性希釈剤を含む第2のバイアルを用いて再構成される）を提供することによって、患者に間接的に提供することができる。この場合の透明な溶液は、1リットルまでにすること、またはより一層大きなサイズにすることができるため、大きなリザーバが用意され、そのリザーバから、少なくとも1つのCARTyrinの溶液のより小さな部分を、より小さなバイアルに移すために1回または多数回取り出し、薬局またはクリニックが顧客および／または患者に提供することができる。
単一バイアル系を含む公知の装置に含まれるのは、溶液を送達するためのペン型注入装置、例えばBecton Dickinson社（フランクリン・レイクス、ニュージャージー州、www.bectondickenson.com）、Disetronic社（ブルクドルフ、スイス国、www.disetronic.com； Bioject社、ポートランド、オレゴン州（www.bioject.com）； National Medical Products, Weston Medical社（ピーターバラ、連合王国、www.weston-medical.com）、Medi-Ject Corp社（ミネアポリス、ミネソタ州、 www.mediject.com）によって製造または開発された例えばBD Pens、BD Autojector（登録商標）、Humaject（登録商標）、NovoPen（登録商標）、B-D（登録商標）Pen、AutoPen（登録商標）、OptiPen（登録商標）、GenotropinPen（登録商標）、Genotronorm Pen（登録商標）、Humatro Pen（登録商標）、Reco-Pen（登録商標）、Roferon Pen（登録商標）、Biojector（登録商標）、Iject（登録商標）、J-tip Needle-Free Injector（登録商標）、Intraject（登録商標）、Medi-Ject（登録商標）と、これらと同様の適切な装置である。二重バイアル系を含む公知の装置に含まれるのは、再構成された溶液を送達するため、凍結乾燥された薬を送達用カートリッジの中で再構成するためのペン型注入装置（例えばHumatroPen（登録商標））である。適切な他の装置の例に含まれるのは、あらかじめ充填された注射器、自己注入器、針なし注入器、針なし静脈内輸液セットである。
本発明の製品は、包装材料を含んでいる。包装材料は、規制当局が要求する情報に加え、この製品を使用できる条件を提供する。本発明の包装材料は、二重バイアル湿／乾製品に関しては、少なくとも1つのCARTyrinを水性希釈剤の中で再構成して溶液を形成し、この溶液を2～24時間またはそれよりも長い期間にわたって使用するという指示を患者に提供する。単一バイアルの溶液製品に関しては、ラベルは、そのような溶液を2～24時間またはそれよりも長い期間にわたって使用できることを示す。本発明の製品は、ヒトの医薬製品で使用するのに有用である。
本発明の製剤は、少なくとも1つのCARTyrinと、選択されたバッファ（好ましくは、生理食塩水または選択された塩を含むリン酸塩バッファ）を混合することを含む方法によって調製することができる。水性希釈剤の中での少なくとも1つのCARTyrinと保存剤の混合は、従来の溶解手続きと混合手続きを利用して実施される。適切な製剤を調製するため、例えば水またはバッファの中の測定された量の少なくとも1つのCARTyrinを、水の中の望む緩衝剤と、このタンパク質とバッファを望む濃度で提供するのに十分な量で組み合わせる。当業者であればこのプロセスのバリエーションを知っているであろう。例えば構成成分を添加する順番、追加添加剤を用いるかどうか、製剤を調製するpHと温度が、使用する濃度と投与手段のために最適化することのできる全因子である。
本発明の安定な製剤または保存された製剤は、透明な溶液として、または二重バイアルとして患者に提供することができる。二重バイアルは、凍結乾燥されたCARTyrinのバイアルを含んでいて、このCARTyrinは、水性希釈剤の中に保存剤またはバッファと賦形剤を含む第2のバイアルを用いて再構成される。単一溶液バイアル、または再構成を必要とする二重バイアルは多数回再利用することができ、患者治療の単回サイクルまたは多数回サイクルにとって十分である可能性があるため、現在利用できるよりも便利な治療計画を提供することができる。
CARTyrinを安定化させる他の製剤または方法により、CARTyrinを含む凍結乾燥粉末の透明な溶液以外のものになる可能性がある。不透明な溶液の1つに粒子状懸濁液を含む製剤があり、この粒子状懸濁液は、さまざまなサイズの構造になったCARTyrinを含む組成物であり、ミクロスフェア、マイクロ粒子、ナノ粒子、ナノスフェア、リポソームなどのさまざまな名称で知られる。活性剤を含んでいてこのように比較的一様で本質的に球形である粒子製剤は、アメリカ合衆国特許第4,589,330号に教示されているように、活性剤とポリマーを含む水相と非水相を接触させた後、非水相を蒸発させて水相からの粒子同士を合体させることによって形成できる。多孔性マイクロ粒子は、アメリカ合衆国特許第4,818,542号に教示されているように、連続溶媒の中に分散された活性剤とポリマーを含む第1の相を使用し、凍結乾燥または希釈-抽出-沈殿によってその溶媒を懸濁液から除去することによって調製できる。このような調製物にとって好ましいポリマーは、天然または合成のコポリマーまたはポリマーであり、その選択は、ゼラチン寒天、デンプン、アラビノガラクタン、アルブミン、コラーゲン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコリド-L(－)ラクチドポリ(イプシロン-カプロラクトン、ポリ(イプシロン-カプロラクトン-CO-乳酸）、ポリ(イプシロン-カプロラクトン-CO-グリコール酸）、ポリ(β-ヒドロキシ酪酸)、ポリエチレンオキシド、ポリエチレン、ポリ(アルキル-2-シアノアクリレート)、ポリ(ヒドロキシエチルメタクリレート)、ポリアミド、ポリ(アミノ酸)、ポリ(2-ヒドロキシエチル DL-アスパルタミド)、ポリ(エステルウレア)、ポリ(L-フェニルアラニン／エチレングリコール／1,6-ジイソシアナトヘキサン)、およびポリ(メチルメタクリレート) からなるグループからなされる。特に好ましいポリマーは、ポリエステル、例えばポリグリコール酸、ポリ乳酸、グリコシド-L(－)ラクチドポリ(イプシロン-カプロラクトン、ポリ(イプシロン-カプロラクトン-CO-乳酸)、ポリ(イプシロン-カプロラクトン-CO-グリコール酸である。ポリマーおよび／または活性剤を溶かすのに有用な溶媒に含まれるのは、水、ヘキサフルオロイソプロパノール、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、ヘキサン、ベンゼン、ヘキサフルオロアセトンセスキ水和物のいずれかである。活性剤を含む相を第2の相を用いて分散させる方法は、第1の相に圧力をかけて強制的にノズルの中のオフィリスを通過させて液滴形成に影響を及ぼすことを含むことができる。
乾燥粉末製剤は、凍結乾燥以外の方法から得ること、例えばスプレー乾燥によって、または蒸発による溶媒抽出によって、または結晶組成物を沈殿させた後に水性溶媒または非水性溶媒を除去する1つ以上の工程によって得ることができる。スプレー乾燥させたCARTyrin調製物の調製は、アメリカ合衆国特許第6,019,968号に教示されている。CARTyrinに基づく乾燥粉末組成物は、溶媒中のCARTyrinの溶液またはスラリーと場合によっては賦形剤を、呼吸可能な乾燥粉末を提供する条件下でスプレー乾燥させることによって生成させることができる。溶媒は極性化合物（水、エタノールなど）を含むことができ、それは容易に乾燥させることができる。CARTyrinの安定性は、酸素の不在下（例えば窒素ブランケット下）でスプレー乾燥手続きを実施することによって、または乾燥ガスとして窒素を用いることによって増大させることができる。別の比較的乾燥した製剤は、WO 9916419に教示されているように、複数の孔開き微小構造が、典型的にはヒドロフルオロアルカン推進剤を含む分散媒体に分散された分散液である。安定化された分散液は、定量吸入器を用いて患者の肺に投与することができる。スプレー乾燥された薬を市販用に製造するのに役立つ装置は、Buchi Ltd.社またはNiro Corp.社によって製造されている。
本明細書に記載されている安定な製剤か溶液、または保存された製剤か溶液の中の少なくとも1つのCARTyrinは、本分野で周知のように、本発明に従い、多彩な送達法（SC注射またはIM注射；経皮、肺、経粘膜、インプラント、浸透圧ポンプ、カートリッジ、マイクロポンプのいずれか、または当業者が高く評価する他の手段が含まれる）を通じて患者に投与することができる。

治療への応用
本発明により、細胞、組織、臓器、動物、患者のいずれかにおける、本分野で知られているか本明細書に記載されている疾患を、本発明の少なくとも1つのCARTyrinを用いて（例えばその細胞、組織、臓器、動物、患者いずれかに治療に有効な量のCARTyrinを投与するか、その細胞、組織、臓器、動物、患者いずれかを治療に有効な量のCARTyrinと接触させて）調節または治療する方法も提供される。本発明により、細胞、組織、臓器、動物、患者のいずれかの疾患（悪性疾患が含まれるが、それに限定されることはない）を調節または治療する方法も提供される。
本発明により、細胞、組織、臓器、動物、患者のいずれかにおける少なくとも1つの悪性疾患を調節または治療する方法も提供される。悪性疾患の非限定的な例に含まれるのは、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、急性リンパ性白血病、B細胞ALL、T細胞ALL、FAB ALL、急性骨髄性白血病（AML）、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病（CML）、慢性リンパ性白血病（CLL）、有毛細胞白血病、骨髄異形成症候群（MDS）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、大腸癌、膵臓癌、鼻咽頭癌、悪性組織球症、腫瘍随伴症候群／悪性腫瘍に伴う高カルシウム血症、固形腫瘍、膀胱がん、乳がん、大腸がん、子宮内膜がん、頭部がん、首部がん、遺伝性非ポリポーシスがん、ホジキンリンパ腫、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、卵巣がん、膵臓がん、前立腺がん、腎細胞癌、精巣がん、腺癌、肉腫、悪性黒色腫、血管腫、転移性疾患、がん関連骨再吸収、がん関連骨疼痛などのうちの少なくとも1つである。
本発明のどの方法も、少なくとも1つのCARTyrinを含む有効量の組成物または医薬組成物を、そのような調節、または処置、または治療を必要とする細胞、組織、臓器、動物、患者のいずれかに投与することを含んでいる。このような方法は、場合によってはそのような疾患または障害を治療するための共投与または併用療法をさらに含むことができ、少なくとも1つのCARTyrin、またはその特定の一部、またはそのバリアントの投与は、それよりも前に、および／またはそれと同時に、および／またはそれよりも後に、アルキル化剤、有糸分裂阻害剤、放射性医薬品のうちの少なくとも1つから選択された少なくとも1つを投与することをさらに含んでいる。適切な用量は本分野で周知である。例えばWells他編、『Pharmacotherapy Handbook』、第2版、Appleton and Lange社、スタンフォード、コネチカット州（2000年）； 『PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000』、豪華版、Tarascon Publishing社、ロマ・リンダ、カリフォルニア州（2000年）；『Nursing 2001 Handbook of Drugs』、第21版、Springhouse Corp.社、スプリングハウス、ペンシルヴェニア州、2001年；『Health Professional's Drug Guide 2001』、Shannon、Wilson、Stang編、Prentice-Hall, Inc社、アッパー・サドル・リヴァー、ニュージャージー州を参照されたい（各参考文献は、参照によって全体が本明細書に組み込まれている）。
好ましい用量は、場合によっては、投与1回当たり約0.1～99 mg/kgおよび／または100～500 mg/kg、またはその間の任意の範囲、または値、または一部を含むこと、または単回投与または多数回投与ごとに約0.1～5000μg/ml、またはその間の任意の範囲、または値、または一部という血清濃度を実現することができる。本発明のCARTyrinの好ましい用量範囲は、患者の体重1 kg当たり約1 mgから約3 mgまで、または約6 mgまで、または約12 mgまでである。
あるいは投与される用量は、わかっている因子（個々の薬剤の薬物動態特性、その投与様式と投与経路；レシピエントの年齢、健康、体重；症状の性質と程度、同時に実施している治療の種類、治療の頻度、望む効果）に依存して変化する可能性がある。通常は活性成分の用量として、体重1キログラム当たり約0.1～100ミリグラムが可能である。通常は、投与ごとに、または持続放出の形態で、1キログラム当たり0.1～50ミリグラム、好ましくは0.1～10ミリグラムが、望む効果を得るのに有効である。
非限定的な一例として、ヒトまたは動物の治療は、本発明の少なくとも1つのCARTyrinの一回用量または定期用量として、単回用量、または輸液用量、または反復用量を用い、1日当たり約0.1～100 mg/kgまたはその間の任意の範囲、または値、または一部を、1～40日目の少なくとも1つの日に、あるいはその代わりに、またはそれに加えて、1～52週の少なくとも1つの週に、あるいはその代わりに、またはそれに加えて、1～20年の少なくとも1つの年に、またはこれらの任意の組み合わせに提供することができる。
内部投与に適した剤形（組成物）は、一般に、ユニットまたは容器ごとに約0.001ミリグラム～約500ミリグラムの活性成分を含んでいる。これら医薬組成物では、活性成分は通常、組成物の全重量を基準にして約0.5～99.999重量％の量で存在することになる。
非経口投与するため、CARTyrinは、溶液、懸濁液、乳液、粒子、粉末、凍結乾燥された粉末のいずれかとして、医薬として許容可能な非経口ビヒクルと組み合わせて、または非経口ビヒクルとは分離して製剤化することができる。そのようなビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンゲル溶液、デキストロース溶液、約1～10％ヒト血清アルブミンである。リポソームと非水性ビヒクル（不揮発性油など）も使用することができる。ビヒクルまたは凍結乾燥された粉末は、等張性を維持する添加剤（例えば塩化ナトリウム、マンニトール）と、化学的安定性を維持する添加剤（例えばバッファと保存剤）を含むことができる。製剤は、公知の技術または適切な技術によって殺菌される。
適切な医薬用担体は、この分野の標準的な参考書である『Remington's Pharmaceutical Sciences』、A. Osolの最新版に記載されている。

代替投与
多くの知られている様式と開発された様式を本発明に従って利用し、医薬として有効な量の本発明の少なくとも1つのCARTyrinを投与することができる。以下の説明では肺投与を利用するが、他の投与様式を本発明に従って利用して適切な結果を得ることができる。本発明のCARTyrinは、吸入による投与、または本明細書に記載されているか本分野で知られている他の様式による投与に適した多彩な装置と方法のうちの任意のものを利用し、担体の中で、溶液、乳液、コロイド、懸濁液のいずれかとして、または乾燥粉末として送達することができる。

非経口製剤と投与
非経口投与のための製剤は、一般的な賦形剤として、殺菌した水または生理食塩水、ポリアルキレングリコール（ポリエチレングリコールなど）、植物起源の油、水素化ナフタレンなどを含むことができる。注射用の水性または油性の懸濁液は、公知の方法に従って適切な乳化剤または湿潤剤と懸濁剤を用いることによって調製できる。注射用の薬剤として、非毒性で非経口投与可能な希釈剤（水溶液、溶媒中の殺菌注射溶液または懸濁液など）が可能である。使用可能なビヒクルまたは溶媒として、水、リンゲル溶液、等張生理食塩水などが許容される。通常の溶媒または懸濁溶媒として、殺菌不揮発性油を使用できる。これらの目的のため、任意の種類の不揮発性油と脂肪酸を使用することができ、その中には天然または合成または半合成の脂肪油または脂肪酸、天然または合成または半合成のモノグリセリド、またはジグリセリド、またはトリグリセリドが含まれる。非経口投与は本分野で知られており、その非限定的な例に含まれるのは、通常の注射手段、アメリカ合衆国特許第5,851,198号に記載されているガス圧針なし注射装置、アメリカ合衆国特許第5,839,446号に記載されているレーザー穿孔装置である（全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。

代替送達
本発明はさらに、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、動脈内、気管支内、腹部内、嚢内、軟骨内、腔内（intracavitary）、腔内（intracelial）、脳内、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎内、網膜内、脊髄内、滑膜内、胸腔内、子宮内、膀胱内、病変内、ボーラス、膣、直腸、口腔、舌下、鼻腔内、経皮という手段のいずれかによる少なくとも1つのCARTyrinの投与に関する。少なくとも1つのCARTyrin組成物は、非経口投与（皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与）または他の任意の投与で使用するためには、特に溶液または懸濁液の形態で調製することができ；膣または直腸への投与で使用するためには特に半固体の形態（非限定的な例としてクリーム、座薬など）で調製することができ；口腔または舌下に投与するためには、非限定的な例として錠剤またはカプセルの形態で調製することができ；鼻腔内投与するためには、非限定的な例として粉末、点鼻薬、エアロゾルのいずれか、またはいくつかの薬剤の形態で調製することができ；経皮投与するためには、非限定的な例としてゲル、軟膏、ローション、懸濁液、パッチ送達システムのいずれかの形態で調製することができ、パッチ送達システムでは、皮膚構造を変えるか、経皮パッチ内の薬の濃度を大きくするための化学的エンハンサ（ジメチルスルホキシドなど）（『Drug Permeation Enhancement』、Hsieh, D. S.編の中のJunginger他、59～90ページ (Marcel Dekker, Inc.社、ニューヨーク1994年；その全体が参照によって本明細書に組み込まれている）を用いるか、タンパク質とペプチドを含む製剤を皮膚に適用することを可能にする酸化剤（WO 98/53847）を用いるか、一過性の輸送経路を作り出すため（電気穿孔など）、または皮膚を通過する帯電した薬の移動度を大きくするため電場を印加する（イオン導入など）か超音波を適用する（超音波導入など）（アメリカ合衆国特許第4,309,989号と第4,767,402号）（上記の刊行物と特許は、全体が参照によって本明細書に組み込まれている）。

養子細胞療法としての改変された細胞の輸液
本開示により、本開示の1つ以上のCARおよび／またはCARTyrinを発現する改変された細胞が提供される。この改変された細胞は、これを必要とする対象に投与するために選択および／または増殖されたものである。本開示の改変された細胞を製剤化し、任意の温度（室温と体温が含まれる）で保管することができる。本開示の改変された細胞を製剤化して低温保存し、あとで解凍することができる。本開示の改変された細胞を医薬として許容可能な担体の中で製剤化し、殺菌包装から対象に直接投与することができる。本開示の改変された細胞を、細胞の生存率および／またはCAR/CARTyrin発現レベルのインジケータとともに医薬として許容可能な担体の中で製剤化し、最低レベルの細胞機能とCAR/ CARTyrin発現を保証することができる。本開示の改変された細胞を、1つ以上の試薬とともに、医薬として許容可能な処方された密度の担体の中で製剤化し、さらなる増殖を抑制すること、および／または細胞死を阻止することができる。

誘導性アポトーシス促進ポリペプチド
本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、既存の誘導性ポリペプチドよりも優れている。なぜなら本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、免疫原性がはるかに少ないからである。本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは組み換えポリペプチドであるため天然に存在しないが、本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを生成させるために組み換えられた配列は、宿主であるヒト免疫系が「非自己」と認識する可能性のある非ヒト配列を含んでおらず、その帰結として、本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを受け取る対象、またはこの誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む細胞を受け取る対象、またはこの誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むか、この誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む細胞を含む組成物を受け取る対象に免疫反応を誘導することがない。
本開示により、リガンド結合領域と、リンカーと、アポトーシス促進ペプチドを含むが、非ヒト配列は含まない誘導性アポトーシス促進ポリペプチドが提供される。いくつかの実施態様では、非ヒト配列は制限部位を含んでいる。いくつかの実施態様では、アポトーシス促進ペプチドは、カスパーゼポリペプチドである。いくつかの実施態様では、カスパーゼポリペプチドは、カスパーゼ9ポリペプチドである。いくつかの実施態様では、カスパーゼ9ポリペプチドは、切断型カスパーゼ9ポリペプチドである。本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドとして、天然に存在しないものが可能である。
本開示のカスパーゼポリペプチドの非限定的な例に含まれるのは、カスパーゼ1、カスパーゼ2、カスパーゼ3、カスパーゼ4、カスパーゼ5、カスパーゼ6、カスパーゼ7、カスパーゼ8、カスパーゼ9、カスパーゼ10、カスパーゼ11、カスパーゼ12、カスパーゼ14である。本開示のカスパーゼポリペプチドの非限定的な例に含まれるのは、アポトーシスに関連するカスパーゼポリペプチドであり、その中には、カスパーゼ2、カスパーゼ3、カスパーゼ6、カスパーゼ7、カスパーゼ8、カスパーゼ9、カスパーゼ10が含まれる。本開示のカスパーゼポリペプチドの非限定的な例に含まれるのは、アポトーシスを開始するカスパーゼポリペプチドであり、その中には、カスパーゼ2、カスパーゼ8、カスパーゼ9、カスパーゼ10が含まれる。本開示のカスパーゼポリペプチドの非限定的な例に含まれるのは、アポトーシスを実行するカスパーゼポリペプチドであり、その中には、カスパーゼ3、カスパーゼ6、カスパーゼ7が含まれる。
本開示のカスパーゼポリペプチドは、野生型のアミノ酸配列または核酸配列と比べて1つ以上の修飾を有するアミノ酸配列または核酸配列によってコードすることができる。本開示のカスパーゼポリペプチドをコードする核酸配列は、コドンを最適化することができる。本開示のカスパーゼポリペプチドのアミノ酸配列および／または核酸配列に対する1つ以上の修飾は、野生型のアミノ酸配列または核酸配列と比べて本開示のカスパーゼポリペプチドの相互作用、または架橋、または交差活性化、または活性化を増大させる可能性がある。その代わりに、またはそれに加えて、本開示のカスパーゼポリペプチドのアミノ酸配列および／または核酸配列に対する1つ以上の修飾は、野生型のアミノ酸配列または核酸配列と比べて本開示のカスパーゼポリペプチドの免疫原性を低下させる可能性がある。
本開示のカスパーゼポリペプチドは、野生型カスパーゼポリペプチドと比べて切断されている可能性がある。例えばカスパーゼポリペプチドを切断してカスパーゼの活性化とリクルートのドメイン（CARD）をコードする配列を除去することで、本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含む細胞内でアポトーシスを開始することに加え、局所的炎症反応を活性化する可能性をなくすか最少にすることができる。本開示のカスパーゼポリペプチドをコードする核酸配列をスプライスし、野生型カスパーゼポリペプチドとは異なる本開示のカスパーゼポリペプチドのバリアントアミノ酸配列を形成することができる。本開示のカスパーゼポリペプチドは、組み換え配列および／またはキメラ配列によってコードすることができる。本開示の組み換えおよび／またはキメラのカスパーゼポリペプチドは、1つ以上の異なるカスパーゼポリペプチドからの配列を含むことができる。その代わりに、またはそれに加えて、本開示の組み換えおよび／またはキメラのカスパーゼポリペプチドは、1つ以上の種からの配列（例えばヒト配列と非ヒト配列）を含むことができる。本開示のカスパーゼポリペプチドとして、天然に存在しないものが可能である。
本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドのリガンド結合領域は、本開示の第1の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドと本開示の第2の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの二量体化を容易にするか促進する任意のポリペプチド配列を含むことができ、その二量体化によってアポトーシス促進ポリペプチドの架橋と細胞内でのアポトーシスの開始が活性化、または誘導される。
リガンド結合（「二量体化」）領域は、内在性リガンドまたは天然に存在しないリガンド（すなわち誘導剤）（例えば天然に存在しない合成リガンド）を用いた誘導を可能にするであろう任意のポリペプチドまたはその機能ドメインを含むことができる。リガンド結合領域は、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの性質とリガンド（すなわち誘導剤）の選択に応じて細胞膜の内部または外部に存在することができる。多彩なリガンド結合ポリペプチドとその機能ドメインが、受容体を含めて知られている。本開示のリガンド結合領域は、受容体からの1つ以上の配列を含むことができる。特に興味深いのは、リガンド（例えば小さな有機リガンド）が知られているか、リガンドを容易に生成させることのできるリガンド結合領域である。これらのリガンド結合領域または受容体の非限定的な例に含まれるのは、FKBP、シクロフィリン受容体、ステロイド受容体、テトラサイクリン受容体などのほか、「天然に存在しない」受容体（抗体、特に重鎖または軽鎖のサブユニットから得ること、その変異した配列から得ること、確率的な手続きやコンビナトリアル合成などによって得られるランダムなアミノ酸配列から得ることができる）である。いくつかの実施態様では、リガンド結合領域は、FKBPリガンド結合領域、シクロフィリン受容体リガンド結合領域、ステロイド受容体リガンド結合領域、テトラサイクリン受容体リガンド結合領域からなるグループから選択される。
1つ以上の受容体ドメインを含むリガンド結合領域は、内在性ドメインまたはその切断型活性部分として、少なくとも約50個のアミノ酸かつ約350個未満のアミノ酸が可能であり、通常は200個未満のアミノ酸である。結合領域は、例えば小さな（ウイルスベクターに効率的にトランスフェクトできるように25 kDa未満の）単量体で非免疫原性であるものが可能であり、二量体化のための構成にできる、合成可能で細胞透過性で非毒性のリガンドを有する。
1つ以上の受容体ドメインを含むリガンド結合領域は、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの設計と、適切なリガンド（すなわち誘導剤）の利用可能性に応じ、細胞内または細胞外に存在する可能性がある。疎水性リガンドに関しては、結合領域は膜のどちら側に存在していてもよいが、親水性リガンド、特にタンパク質リガンドに関しては、リガンドを結合に利用できる形態で内部化するための輸送システムが存在しないのであれば、結合領域は通常は細胞膜の外側に存在することになろう。細胞内受容体に関しては、誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、またはこの誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含むトランスポゾンまたはベクターは、シグナルペプチドと、受容体ドメイン配列の膜貫通ドメイン5'または3'をコードすること、または受容体ドメイン配列の脂質付着シグナル配列5'を持つことができる。受容体ドメインがシグナルペプチドと膜貫通ドメインの間にある場合には、受容体ドメインは細胞外に存在することになろう。
抗体と抗体サブユニット（例えば重鎖または軽鎖、特に断片、さらに特定するならば、可変領域の全体または一部、または高親和性結合を生じさせる重鎖と軽鎖の融合体）は、本開示のリガンド結合領域として使用することができる。考慮する抗体に含まれるのは、異所的に発現するヒト産物である抗体（例えば免疫反応を開始させず、一般に末梢（すなわちCNS／脳領域の外）では発現しないと考えられる細胞外ドメイン）である。このような例の非限定的な例に含まれるのは、低親和性神経増殖因子受容体（LNGFR）と、胚性表面タンパク質（すなわち癌胎児性抗原）である。さらに、生理学的に許容できるハプテン分子に対する抗体を調製し、個々の抗体サブユニットを結合親和性に関してスクリーニングすることができる。サブユニットをコードするcDNAを単離し、定常領域の欠失、可変領域の一部の欠失、可変領域の突然変異誘発などによって改変して、リガンドにとって適切な親和性を有する結合タンパク質ドメインを得ることができる。このようにして、生理学的に許容できるほぼすべてのハプテン化合物をリガンドとして用いること、またはリガンドのためのエピトープを提供することができる。抗体ユニットの代わりに内在性受容体を用いることができる。そのとき結合領域または結合ドメインは既知であり、結合のための有用なリガンドまたは既知のリガンドが存在している。
受容体を多量体化するため、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドのリガンド結合領域／受容体ドメインのためのリガンドを多量体化することが、リガンドが少なくとも2つの結合部位を持ち、各結合部位がリガンド受容体領域に結合できる（すなわち第1の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドのリガンド結合領域に結合できる第1の結合部位を有するリガンドと、第2の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドのリガンド結合領域に結合できる第2の結合部位を有するリガンド；ここで第1と第2の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドのリガンド結合領域は、同じであるか異なっている）という意味で可能である。したがって本明細書では、「多量体リガンド結合領域」という用語は、本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドのリガンド結合領域であって、多量体リガンドに結合するものを意味する。本開示の多量体リガンドは、二量体リガンドを含んでいる。本開示の二量体リガンドは、リガンド受容体ドメインに結合できる2つの結合部位を持つことができる。いくつかの実施態様では、本開示の多量体リガンドは、小さな合成有機分子の二量体、またはより高次のオリゴマーであり、通常はほぼ四量体を超えることはなく、個々の分子は典型的には少なくとも約150 Daかつ約5 kDa未満であり、通常は約3 kDa未満である。合成リガンドと受容体のさまざまなペアを用いることができる。例えば内在性受容体が関与する実施態様では、二量体FK506をFKBP12受容体とともに使用でき、二量体化したシクロスポリンAをシクロフィリン受容体とともに使用でき、二量体化したエストロゲンをエストロゲン受容体とともに、二量体化したグルココルチコイドをグルココルチコイド受容体とともに、二量体化したテトラサイクリンをテトラサイクリン受容体とともに、二量体化したビタミンDをビタミンD受容体ととともに使用できる、などである。あるいはより高次のリガンド（例えば三量体）を用いることができる。天然に存在しない受容体（例えば抗体サブユニット、改変された抗体サブユニット、可撓性リンカーによって隔てられたタンデム式の重鎖と軽鎖の可変領域からなる一本鎖抗体、改変された受容体、これらの変異した配列など）が関与する実施態様に関しては、多彩な化合物のうちの任意のものを用いることができる。本開示の多量体リガンドを含むユニットの重要な1つの特徴は、各結合部位が受容体に大きな親和性で結合できることと、好ましくはこれらを化学的に二量体化できることである。また、リガンドの疎水性／親水性をバランスさせて、これらリガンドが機能するレベルで血清に溶け、しかもたいていの用途では形質膜を通過して拡散できるようにする方法を利用できる。
本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの活性化は、例えば誘導剤を媒介とした化学的誘導二量体化（CID）を通じて条件的に制御されたタンパク質またはポリペプチドを生成させることによって実現できる。本開示のアポトーシス促進ポリペプチドは、不安定な二量体化剤の分解、または単量体競合阻害剤の投与が理由で、誘導性であるだけでなく、これらポリペプチドの誘導が可逆的でもある。
いくつかの実施態様では、リガンド結合領域は、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、リガンド結合領域は、36位にフェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換（F36V）を有するFKBP12ポリペプチドを含んでいる。リガンド結合領域が36位にフェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換（F36V）を有するFKBP12ポリペプチドを含むいくつかの実施態様では、誘導剤は、合成薬であるAP1903（CASインデックス名：2-ピペリジンカルボン酸、1-[(2S)-1-オキソ-2-(3,4,5-トリメトキシフェニル)ブチル]-1,2-エタンジイルビス[イミノ(2-オキソ-2,1-エタンジイル)オキシ-3,1-フェニレン[(1R)-3-(3,4-ジメトキシフェニル)プロピリデン]]エステル、 [2S-[1(R*),2R*[S*[S*[1(R*),2R*]]]]]-(9Cl) CAS登録番号：195514-63-7；分子式：C78H98N4O20；分子量：1411.65））を含むことができる。リガンド結合領域が36位にフェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換（F36V）を有するFKBP12ポリペプチドを含むいくつかの実施態様では、誘導剤は、AP20187（CAS登録番号：195514-80-8、分子式：C82H107N5O20）を含むことができる。いくつかの実施態様では、誘導剤はAP20187類似体（例えばAP1510）である。本明細書では、誘導剤AP20187、AP1903、AP1510は、交換可能に用いることができる。
AP1903 APIはAlphora Research Inc.社によって製造されており、注射用のAP1903薬製品はFormatech Inc.社によって製造されている。それは、非イオン性可溶剤Solutol HS 15の25％溶液（250 mg/ml、BASF社）の中のAP1903の5 mg/ml溶液として製剤化されている。この製剤は、室温では透明なわずかに黄色の溶液である。冷却するとこの製剤は可逆的な転移を起こし、ミルク状の溶液になる。この相転移は、再度室温まで温めると逆転する。充填体積は、3 mlのガラス製バイアルに2.33 mlである（1つのバイアルにつき合計で注射用の約10 mgのAP1903）。AP1903の投与が必要であると判断されると、患者には、非DEHP非エチレンオキシド殺菌輸液セットを使用して、例えば単一固定用量の注射用AP1903（0.4 mg/kg）を2時間かけて静脈内輸液によって投与することができる。AP1903の用量は、すべての患者について個別に計算され、体重が10％以上変動する場合を除いて再計算されることはない。計算された用量は、100 mlの通常の0.9％生理食塩水の中で希釈された後に輸液される。AP1903に関する以前の第I相試験では、24人の健康なボランティアが、単一用量の注射用AP1903を0.01 mg/kg、0.05 mg/kg、0.1 mg/kg、0.5 mg/kg、1.0 mg/kgの用量レベルで2時間かけて静脈内に輸液する治療を受けた。AP1903の血漿レベルは用量に直接比例しており、平均Cmax値は0.01～1.0 mg/kgの用量範囲で約10～1275 ng/mlの範囲であった。最初の輸液期間の後、血中濃度は急速分布相を示し、血漿レベルは、投与してから0.5時間後、2時間後、10時間後に、最大濃度が約18％、約7％、約1％にそれぞれ低下した。注射用AP1903はあらゆる用量レベルで安全であってよく忍容されることが示されるとともに、好ましい薬物動態プロファイルであることが実証された。Iuliucci J D他、J Clin Pharmacol. 第41巻：870～879ページ、2001年。
使用した固定用量の注射用AP1903は、例えば0.4 mg/kgを2時間かけて静脈内に輸液することができる。インビトロで細胞の有効なシグナル伝達に必要なAP1903の量は、10～100 nM（1600 Da MW）である。これは、16～160μg/l、または約0.016～1.6μg/kg（1.6～160μg/kg）に等しい。1 mg/kgまでの用量が、上記のAP1903の第I相試験ではよく忍容された。したがって0.4 mg/kgは、治療細胞と組み合わせた第I相試験でのAP1903の安全かつ有効な用量である可能性がある。
本開示のリガンド結合領域をコードするアミノ酸配列および／または核酸配列は、野生型のアミノ酸配列または核酸配列と比べて1つ以上の修飾を持つ配列を含むことができる。例えば本開示のリガンド結合領域をコードするアミノ酸配列および／または核酸配列として、コドンが最適化された配列が可能である。1つ以上の修飾は、本開示のリガンド結合領域に対するリガンド（例えば誘導剤）の結合親和性を野生型ポリペプチドと比べて大きくする可能性がある。その代わりに、またはそれに加えて、1つ以上の修飾は、本開示のリガンド結合領域の免疫原性を野生型ポリペプチドと比べて低下させる可能性がある。本開示のリガンド結合領域および／または本開示の誘導剤として、天然に存在しないものが可能である。
本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、リガンド結合領域と、リンカーと、アポトーシス促進ペプチドを含むが、非ヒト配列は含んでいない。いくつかの実施態様では、非ヒト配列は制限部位を含んでいる。リンカーは、リガンド結合領域が二量体化したときにアポトーシス促進ポリペプチドの相互作用、または架橋、または交差活性化、または活性化を可能にする任意の有機材料または無機材料を含むことができ、アポトーシス促進ポリペプチドのその相互作用または活性化によって細胞内でアポトーシスが開始される。いくつかの実施態様では、リンカーはポリペプチドである。いくつかの実施態様では、リンカーは、G/Sリッチアミノ酸配列を含むポリペプチドである（「GS」リンカー）。いくつかの実施態様では、リンカーは、アミノ酸配列GGGGS（配列番号18028）を含むポリペプチドである。好ましい実施態様では、リンカーはポリペプチドであり、このポリペプチドをコードする核酸は、制限エンドヌクレアーゼのための制限部位を含んでいない。本開示のリンカーとして、天然に存在しないものが可能である。
本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを細胞内で発現させることが、この細胞内で本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの発現を開始および／または調節することのできる任意のプロモータの転写調節のもとで可能である。「プロモータ」という用語は、本明細書では、遺伝子を転写するためRNAポリメラーゼが最初に結合する部位として機能するプロモータを意味する。例えば本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを哺乳動物細胞の中で発現させることが、哺乳動物細胞の中で本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの発現の開始および／または調節が可能な任意のプロモータ（その非限定的な例に、天然に存在するプロモータ、内在性プロモータ、外来性プロモータ、異種プロモータが含まれる）の転写調節下において可能である。好ましい哺乳動物細胞にはヒト細胞が含まれる。したがって本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドをヒト細胞の中で発現させることが、ヒト細胞の中で本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの発現の開始および／または調節が可能な任意のプロモータ（その非限定的な例に、ヒトプロモータまたはウイルスプロモータが含まれる）の転写調節下において可能である。ヒト細胞の中で発現させるための代表的なプロモータの非限定的な例に含まれるのは、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）極初期遺伝子プロモータ、SV40初期プロモータ、ラウス肉腫ウイルス長い末端反復β-アクチンプロモータ、ラットインスリンプロモータ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼプロモータであり、そのそれぞれを用いて本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを高レベルに発現させることができる。本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを発現させるのに本分野で周知の他のウイルスプロモータまたは哺乳動物細胞プロモータまたは細菌ファージプロモータを用いることも考えられるが、発現レベルが細胞内でアポトーシスを開始させるのに十分であることが条件である。周知の特性を有するプロモータを用いることにより、トランスフェクションまたは形質転換の後の興味あるタンパク質の発現レベルと発現パターンを最適化できる。
特定の生理学的シグナルまたは合成シグナルに反応して調節されるプロモータを選択することにより、本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチドの誘導的発現が可能になる。エクジソン系（Invitrogen社、カールスバッド、カリフォルニア州）はそのような1つの系である。この系は、哺乳動物細胞の中で興味ある遺伝子の調節された発現が可能になるように設計されている。この系は、導入遺伝子の基礎発現レベルは実質的にゼロだが200倍を超える誘導性を可能にする厳しく調節される発現機構からなる。この系は、ショウジョウバエのヘテロダイマーエクジソン受容体に基づいており、エクジソンまたは類似体（ムリステロンAなど）が受容体に結合するとき、受容体がプロモータを活性化して下流の導入遺伝子の発現をオンにすることで、高レベルのmRNA転写産物が達成される。この系では、ヘテロダイマー受容体の両方の単量体が1つのベクターから構成的に発現される一方で、興味ある遺伝子の発現を駆動するエクジソン反応性プロモータは別のプラスミド上にある。したがってこのタイプの系を操作して興味あるベクターに入れることは有用である可能性がある。有用である可能性のある別の誘導可能な系は、Tet-Off（商標）系またはTet-On（商標）系（Clontech社、パロ・アルト、カリフォルニア州）であり、そもそもはGossenとBujard (GossenとBujard、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、第89巻：5547～5551ページ、1992年；Gossen他、Science、第268巻：1766～1769ページ、1995年）によって開発された。この系も、テトラサイクリンまたはテトラサイクリン誘導体（ドキシサイクリンなど）に反応して調節される高レベルの遺伝子発現を可能にする。Tet-On（商標）系では、ドキシサイクリンの存在下で遺伝子発現がオンにされるのに対し、Tet-Off（商標）系では、ドキシサイクリンの不在下で遺伝子発現がオンにされる。これらの系は、大腸菌のテトラサイクリン耐性オペロンに由来する2つの調節エレメント、すなわち（テトラサイクリンリプレッサが結合する）テトラサイクリンオペレータ配列とテトラサイクリンリプレッサタンパク質に基づいている。興味ある遺伝子は、プラスミドに、テトラサイクリン反応性エレメントを内部に有するプロモータの後の位置にクローニングされる。第2のプラスミドは、テトラサイクリンに制御されるトランスアクチベータと呼ばれる調節エレメントを含んでいる。これは、Tet-Off（商標）系では、単純ヘルペスウイルスからのVP16ドメインと、野生型テトラサイクリンリプレッサで構成されている。したがってドキシサイクリンの不在下では、転写は構成的にオンにされる。Tet-On（商標）系では、テトラサイクリンリプレッサは野生型ではなく、ドキシサイクリンの存在下で転写が活性化される。遺伝子療法ベクターを作製するため、Tet-Off（商標）系を用いることにより、産生細胞がテトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在下で増殖できて、潜在的に毒性のある導入遺伝子の発現を阻止できるが、ベクターが患者に導入されたときには遺伝子発現が構成的にオンになるようにすることができる。
いくつかの場合には、遺伝子療法ベクターの中の導入遺伝子の発現を調節することが望ましい。望む発現レベルに応じ、例えば活性の強度がさまざまな異なるウイルスベクターを使用する。哺乳動物の細胞では、強い転写活性化を提供するのにCMV極初期プロモータがしばしば用いられる。CMVプロモータは、Donnelly, J. J.他、1997年、Annu. Rev. Immunol. 第15巻：617～648ページに概説されている。効力がより小さいCMVプロモータの改変バージョンも、導入遺伝子の発現レベルが低いことが望まれるときには使用されてきた。造血細胞の中で導入遺伝子を発現させることが望ましいとき、レトロウイルスプロモータ（MLVまたはMMTVからのLTRなど）がしばしば用いられる。望む効果に応じて使用される他のウイルスプロモータに含まれるのは、SV40プロモータ、RSV LTRプロモータ、HIV-1 LTRプロモータ、HIV-2 LTRプロモータ、アデノウイルスプロモータ（E1A領域、E2A領域、MLP領域いずれかからのプロモータなど）、AAV LTRプロモータ、HSV-TKプロモータ、トリ肉腫ウイルスプロモータである。
別の例では、プロモータは、発生的に調節されるものと、特定の分化した細胞の中で活性であるものを選択することができる。したがって、例えばプロモータは多能性幹細胞の中では活性でなくてもよいが、例えばその多能性幹細胞が分化してより成熟した細胞になると、そのプロモータは活性化される可能性がある。
同様に、組織特異的プロモータを用いて特定の組織または細胞の中で転写を実行し、標的とされない組織に対する潜在的な毒性または望ましくない効果を減らす。これらプロモータにより、より強いプロモータ（CMVプロモータなど）と比べて発現が低下する可能性があるが、発現と免疫原性がより制限される可能性もある（Bojak, A.他、2002年、Vaccine 第20巻：1975～1979ページ； Cazeaux, N.他、2002年、Vaccine 第20巻：3322～3331ページ）。例えば組織特異的プロモータ（例えばPSA関連プロモータまたは前立腺特異的腺性カリクレイン）、または筋肉クレアチンキナーゼ遺伝子を適切な場所で用いることができる。
組織特異的プロモータまたは分化特異的プロモータの非限定的な例に含まれるのは、B29（B細胞）；CD14（単球細胞）；CD43（白血球と血小板）；CD45（造血細胞）；CD68（マクロファージ）；デスミン（筋肉）；エラスターゼ-1（膵臓腺房細胞）；エンドグリン（内皮細胞）；フィブロネクチン（分化している細胞、治癒中の組織）；Flt-1（内皮細胞）；GFAP（アストロサイト）である。
いくつかの徴候では、遺伝子療法ベクターを投与した後に転写を特定の回数活性化させることが望ましい。これは、ホルモンまたはサイトカインを調節できるプロモータによってなされる。サイトカインと炎症性タンパク質に反応する使用可能なプロモータに含まれるのは、KキニノーゲンとTキニノーゲン（Kageyama他（1987年）J. Biol. Chem.、第262巻、2345～2351ページ）、c-fos、TNF-アルファ、C反応性タンパク質（Arcone他（1988年）Nucl. Acids Res.、第16巻(8)、3195～3207ページ）、ハプトグロビン（Oliviero他（1987年）EMBO J.、第6巻、1905～1912ページ）、血清アミロイドA2、C/EBPアルファ、IL-1、IL-6（PoliとCortese、（1989年）Proc. Nat'l Acad. Sci. USA、第86巻、8202～8206ページ）、補体C3（Wilson他（1990年）Mol. Cell. Biol.、6181～6191ページ）、IL-8、アルファ-1酸性糖タンパク質（ProwseとBaumann、（1988年）Mol. Cell. Biol.、第8巻、42～51ページ）、アルファ-1アンチトリプシン、リポタンパク質リパーゼ（Zechner他、Mol. Cell. Biol.、2394～2401ページ、1988年）、アンジオテンシノーゲン（Ron他（1991年）Mol. Cell. Biol.、2887～2895ページ）、フィブリノーゲン、c-jun（ホルボールエステル、TNF-アルファ、UV照射、レチノイン酸、過酸化水素によって誘導可能）、コラゲナーゼ（エステルとレチノイン酸によって誘導される）、メタロチオネイン（重金属とグルココルチコイドによって誘導可能）、ストロメライシン（ホルボールエステル、インターロイキン-1、EGFによって誘導可能）、アルファ-2マクログロブリン、アルファ-1抗キモトリプシンである。他のプロモータに含まれるのは、例えば、SV40、MMTV、ヒト免疫不全ウイルス（MV）、モロニーウイルス、ALV、エプスタイン-バーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロビン、クレアチンである。
上記のどのプロモータも、単独で、または別のプロモータとの組み合わせで、望む作用に応じて有用である可能性があることが予想される。プロモータと他の調節エレメントは、望む細胞または組織の中で機能するように選択される。それに加え、プロモータのこのリストは網羅的であるとか限定的であると見なしてはならず、他のプロモータが、本明細書に開示されているプロモータおよび方法と組み合わせて使用される。

武装化T細胞「ノックダウン」戦略
本開示のT細胞の遺伝子を改変してその治療能力を増強することができる。その代わりに、またはそれに加えて、本開示のT細胞を改変して免疫学的チェックポイントおよび／または代謝的チェックポイントに対する感受性を低下させることができる。このタイプの改変によって本開示のT細胞を「武装化」する。改変後のT細胞を、本明細書では「武装化」T細胞と呼ぶことができる。本開示の武装化T細胞は、例えば免疫抑制性腫瘍微小環境内において、例えばT細胞に送達される特定のチェックポイントシグナルを阻止および／または希釈すること（すなわちチェックポイント抑制）によって生成させることができる。
いくつかの実施態様では、本開示の武装化T細胞は、T細胞、NK細胞、造血前駆細胞、末梢血（PB）由来T細胞（G-CSF動員末梢血から単離されたT細胞、またはG-CSF動員末梢血に由来するT細胞が含まれる）、臍帯血（UCB）由来T細胞のいずれかに由来する。いくつかの実施態様では、本開示の武装化T細胞は、本開示のキメラリガンド受容体（足場タンパク質、抗体、ScFv、抗体模倣体のいずれかを含むCLR）／キメラ抗原受容体（足場タンパク質、抗体、ScFv、抗体模倣体のいずれかを含むCAR）、CARTyrin（センチリンを含むCAR）、VCAR（ラクダVHHまたは単一ドメインVHを含むCAR）のうちの1つ以上を含んでいる。いくつかの実施態様では、本開示の武装化T細胞は、（a）リガンド結合領域と、（b）リンカーと、（c）切断型カスパーゼ9を含むが、非ヒト配列は含まない誘導性アポトーシス促進ポリペプチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、非ヒト配列は制限部位である。いくつかの実施態様では、誘導性カスパーゼポリペプチドのリガンド結合領域は、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含んでいる。いくつかの実施態様では、FK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列の36位に修飾を含んでいる。いくつかの実施態様では、修飾は、36位におけるフェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換である（F36V）。いくつかの実施態様では、本開示の武装化T細胞は、外来性配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、外来性配列は、治療用タンパク質をコードする配列を含んでいる。代表的な治療用タンパク質として、核タンパク質、細胞質タンパク質、細胞内タンパク質、膜貫通タンパク質、細胞表面結合タンパク質、分泌タンパク質のいずれかが可能である。武装化T細胞によって発現される代表的な治療用タンパク質は、この武装化T細胞の活性を変化させること、または第2の細胞の活性を変化させることができる。いくつかの実施態様では、本開示の武装化T細胞は、選択遺伝子または選択マーカーを含んでいる。いくつかの実施態様では、本開示の武装化T細胞は、合成遺伝子発現カセット（本明細書では、誘導性導入遺伝子コンストラクトとも呼ばれる）を含んでいる。
いくつかの実施態様では、本開示のT細胞を改変して抑制性チェックポイントシグナルの受容体をコードする1つ以上の遺伝子の発現を沈黙または低下させ、本開示の武装T細胞を生成させる。代表的な抑制性チェックポイントシグナルの非限定的な例に含まれるのは、本開示のCAR-T細胞上のPD-1受容体に結合するPD-L1リガンド、またはCAR-T細胞上のTGFβRII受容体に結合するTGFβサイトカインである。抑制性チェックポイントシグナルの受容体は、T細胞の表面で、またはT細胞の細胞質内で発現する。抑制性チェックポイントシグナルの受容体をコードする遺伝子の発現を沈黙または低下させると、本開示の武装化T細胞の表面上または細胞質内で、抑制性チェックポイント受容体のタンパク質発現が失われる。したがって抑制性チェックポイント受容体をコードする1つ以上の遺伝子の発現が沈黙または低下した本開示の武装化T細胞は、チェックポイントシグナルに対して抵抗性、または非受容性、または非感受性である。抑制性チェックポイントシグナルに対する武装化T細胞の抵抗性または低下した感受性は、これら抑制性チェックポイントシグナルの存在下における武装化T細胞の治療能力を増強する。抑制性チェックポイントシグナルの非限定的な例に含まれるのは、表1に掲載されている例である。本開示の武装化T細胞において沈黙させることのできる代表的な抑制性チェックポイントシグナルの非限定的な例に含まれるのは、PD-1とTGFβRIIである。
表1：代表的な抑制性チェックポイントシグナル（と、免疫抑制を誘導するタンパク質）。本開示のCSRは、この表の任意の1つのタンパク質のエンドドメインを含むことができる。
Figure 0007399866000001
Figure 0007399866000002
Figure 0007399866000003
いくつかの実施態様では、本開示のT細胞を改変してチェックポイントシグナル伝達に関与する細胞内タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子の発現を沈黙または低下させ、本開示の武装T細胞を生成させる。本開示のT細胞の活性は、チェックポイントシグナル伝達経路に関与する任意の細胞内シグナル伝達タンパク質を標的とすることによって増強することができ、そのことによって1つ以上のチェックポイント経路へのチェックポイント抑制またはチェックポイント干渉が実現される。チェックポイントシグナル伝達に関与する細胞内シグナル伝達タンパク質の非限定的な例に含まれるのは、表2に提示されている代表的な細胞内シグナル伝達タンパク質である。
表2：代表的な細胞内シグナル伝達タンパク質。
Figure 0007399866000004
いくつかの実施態様では、本開示のT細胞を改変して治療の効力を妨げる転写因子をコードする1つ以上の遺伝子の発現を沈黙または低下させ、本開示の武装T細胞を生成させる。武装T細胞の活性は、治療の効力を妨げる転写因子の発現を沈黙または低下させる（または機能を抑える）ことによって増強すること、または変化させることができる。改変して発現を沈黙または低下させる、またはその機能を抑えることのできる代表的な転写因子の非限定的な例は、表3に提示されている代表的な転写因子である。例えばFOXP3遺伝子の発現を本開示の武装T細胞の中で沈黙または低下させ、T制御性CAR-T細胞（CAR-Treg細胞）（その発現または活性が、治療の効力を低下させる可能性がある）の形成を阻止すること、または低下させることができる。
表3：代表的な転写因子。
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いくつかの実施態様では、本開示のT細胞を改変して細胞死受容体または細胞アポトーシス受容体をコードする1つ以上の遺伝子の発現を沈黙または低下させ、本開示の武装化T細胞を生成させる。死受容体とその内在性リガンドが相互作用するとアポトーシスが開始される。細胞死受容体および／または細胞アポトーシス受容体、および／またはリガンドの発現、または活性、または相互作用を阻害すると、本開示の武装化T細胞が死シグナルをより受けにくくなり、その帰結として本開示の武装化T細胞が腫瘍環境においてより効果的になる。本開示の武装化T細胞において改変することのできる細胞死受容体の一例はFas（CD95）である。本開示の代表的な細胞死受容体および／または細胞アポトーシス受容体とリガンドの非限定的な例に含まれるのは、表4に提示されている代表的な受容体とリガンドである。
表4：代表的な細胞死受容体および／または細胞アポトーシス受容体とリガンド。
Figure 0007399866000046
いくつかの実施態様では、本開示のT細胞を改変して代謝感知タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子の発現を沈黙または低下させ、本開示の武装化T細胞を生成させる。本開示の武装化T細胞によって免疫抑制性腫瘍微小環境の代謝的感知が阻害されることで（酸素、pH、グルコースと、他の分子が低レベルであることを特徴とする）、T細胞機能の保持が延長され、その帰結として1つの武装化T細胞が殺す腫瘍細胞がより多くなる。例えばHIF1aとVHLは、低酸素環境にある間、T細胞が機能する上である役割を果たす。本開示の武装化T細胞は、HIF1aまたはVHLをコードする 1つ以上の遺伝子の発現を沈黙または低下させた可能性がある。代謝感知に関与する遺伝子とタンパク質の非限定的な例に含まれるのは、表5に提示されている代表的な遺伝子とタンパク質である。
表5：代表的な代謝感知遺伝子（と、コードされるタンパク質）
Figure 0007399866000047
Figure 0007399866000048
いくつかの実施態様では、本開示のT細胞を改変してがん療法（モノクローナル抗体が含まれる）に対する感受性を与えるタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子の発現を沈黙または低下させ、本開示の武装化T細胞を生成させる。したがって本開示の武装化T細胞は機能することができ、がん療法（例えば化学療法、モノクローナル抗体療法、または別の抗腫瘍治療）の存在下で優れた機能または効力を示す可能性がある。がん療法に対する感受性を与えるのに関与するタンパク質の非限定的な例に含まれるのは、表6に提示されている代表的なタンパク質である。
表6：がん治療剤に対する感受性を与える代表的なタンパク質
Figure 0007399866000049
いくつかの実施態様では、本開示のT細胞を改変して増殖促進因子をコードする1つ以上の遺伝子の発現を沈黙または低下させ、武装化T細胞を生成させる。がん遺伝子の発現を沈黙または低下させると、本開示の武装化T細胞の増殖が有利になる可能性がある。例えばCAR-T作製プロセスの間にTET2遺伝子の発現を沈黙または低下させる（例えば発現を阻害する）と、増殖能力が欠けた非武装化CAR-Tと比べて増殖とその後の腫瘍根絶の能力が顕著な武装化CAR-Tが生成する。この戦略は安全スイッチ（例えば本開示のiC9安全スイッチ）と組み合わせることが可能であり、そうすることで、対象からの有害反応、または武装化CAR-Tの制御されない増殖が発生した場合に武装化CAR-T細胞を標的とした破壊が可能になる。代表的な増殖促進因子の非限定的な例に含まれるのは、表7に提示されている因子である。








表7：代表的な増殖促進因子
Figure 0007399866000050
 武装化T細胞「ヌル受容体またはスイッチ受容体」戦略
いくつかの実施態様では、本開示のT細胞を改変して改変された／キメラチェックポイント受容体を発現させ、本開示の武装化T細胞を生成させる。
いくつかの実施態様では、改変された／キメラチェックポイント受容体は、ヌル受容体、デコイ受容体、ドミナントネガティブ受容体のいずれかを含んでいる。本開示のヌル受容体、またはデコイ受容体、またはドミナントネガティブ受容体として、改変された／キメラ受容体／タンパク質が可能である。本開示のヌル受容体、またはデコイ受容体、またはドミナントネガティブ受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインを発現させるために切断することができる。その代わりに、またはそれに加えて、本開示のヌル受容体、またはデコイ受容体、またはドミナントネガティブ受容体は、細胞内シグナル伝達ドメイン内にあって有効なシグナル伝達にとって決定的な、または必要な1つ以上のアミノ酸位置で変異させることができる。本開示のヌル受容体、またはデコイ受容体、またはドミナントネガティブ受容体の切断または変異により、受容体がチェックポイントシグナルを細胞に、または細胞内で運ぶ能力または伝達する能力が失われる可能性がある。
例えば腫瘍細胞の表面に発現するPD-L1受容体からの免疫抑制性チェックポイントシグナルの希釈または阻止は、改変された／キメラPD-1ヌル受容体を本開示の武装化T細胞の表面に発現させることによって実現できる。そうすることで改変された／キメラPD-1ヌル受容体は、武装化T細胞の表面にやはり発現している内在性（改変されていない）PD-1受容体と効果的に競合し、武装化T細胞の内在性PD-1受容体を通じた免疫抑制チェックポイントシグナルの伝達を低下させる、または抑制する。この代表的な実施態様では、腫瘍細胞の表面に発現するPD-L1への結合に関して2つの異なる受容体の間で競合することで、有効なチェックポイントシグナル伝達のレベルが低下または減少し、そのことによってPD-1ヌル受容体を発現する武装化T細胞の治療能力が増強される。
いくつかの実施態様では、改変された／キメラチェックポイント受容体は、膜貫通受容体であるヌル受容体、デコイ受容体、ドミナントネガティブ受容体のいずれかを含んでいる。
いくつかの実施態様では、改変された／キメラチェックポイント受容体は、膜に関連した受容体／タンパク質または膜に結合した受容体／タンパク質であるヌル受容体、デコイ受容体、ドミナントネガティブ受容体のいずれかを含んでいる。
いくつかの実施態様では、改変された／キメラチェックポイント受容体は、細胞内受容体／タンパク質であるヌル受容体、デコイ受容体、ドミナントネガティブ受容体のいずれかを含んでいる。
いくつかの実施態様では、改変された／キメラチェックポイント受容体は、細胞内受容体／タンパク質であるヌル受容体、デコイ受容体、ドミナントネガティブ受容体のいずれかを含んでいる。本開示の代表的なヌル細胞内受容体／タンパク質、またはデコイ細胞内受容体／タンパク質、またはドミナントネガティブ細胞内受容体／タンパク質の非限定的な例に含まれるのは、抑制性チェックポイントシグナル（例えば表1と表2に提示されているもの）の下流のシグナル伝達要素、転写因子（例えば表3に提示されているもの）の下流のシグナル伝達要素、サイトカインまたはサイトカイン受容体、ケモカインまたはケモカイン受容体の下流のシグナル伝達要素、細胞死またはアポトーシスの受容体／リガンド（例えば表4に提示されているもの）の下流のシグナル伝達要素、代謝感知分子（例えば表5に提示されているもの）の下流のシグナル伝達要素、がん療法に対する感受性を与えるタンパク質（例えば表6に提示されているもの）の下流のシグナル伝達要素、がん遺伝子または腫瘍抑制遺伝子（例えば表7に提示されているもの）の下流のシグナル伝達要素である。本開示の代表的なサイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体の非限定的な例に含まれるのは、表8に提示されているサイトカインおよびサイトカイン受容体と、ケモカインおよびケモカイン受容体である。
表8：代表的なサイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体
Figure 0007399866000051
Figure 0007399866000052
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いくつかの実施態様では、改変された／キメラチェックポイント受容体は、スイッチ受容体を含んでいる。代表的なスイッチ受容体は、本開示の改変された／キメラ受容体／タンパク質を含むことができ、その中の天然の、すなわち野生型の細胞内シグナル伝達ドメインが、そのタンパク質にとって天然ではない異なる細胞内シグナル伝達ドメイン、および／または野生型ドメインではない異なる細胞内シグナル伝達ドメインに切り換えられる、または置き換えられる。例えば抑制性シグナル伝達ドメインを刺激性シグナル伝達ドメインで置き換えると、免疫抑制シグナルが免疫刺激シグナルに切り換わると考えられる。あるいは抑制性シグナル伝達ドメインを異なる抑制性ドメインで置き換えると、抑制性シグナル伝達のレベルを低下または上昇させることができる。スイッチ受容体の発現または過剰発現により、免疫抑制性腫瘍微小環境内で発現しているコグネイトチェックポイント受容体への結合に関して内在性野生型チェックポイント受容体（スイッチ受容体ではない）と競合することを通じてコグネイトチェックポイントシグナルの希釈および／または阻止が起こる可能性がある。本開示の武装化T細胞は、本開示のスイッチ受容体をコードする配列を含むことができるため、本開示の1つ以上のスイッチ受容体の発現につながり、その帰結として本開示の武装化T細胞の活性が変化する。本開示の武装化T細胞は、本開示のチェックポイント受容体、および／または転写因子、および／またはサイトカイン受容体、および／または死受容体、および／または代謝感知分子、および／またはがん療法、および／またはがん遺伝子、および／または腫瘍抑制のタンパク質または遺伝子の下流にあって細胞内で発現しているタンパク質を標的とする本開示のスイッチ受容体を発現することができる。
本開示の代表的なスイッチ受容体は、タンパク質を含むこと、またはタンパク質に由来することが可能であり、タンパク質の非限定的な例に含まれるのは、抑制性チェックポイントシグナル（例えば表1と表2に提示されているもの）の下流のシグナル伝達要素、転写因子（例えば表3に提示されているもの）の下流のシグナル伝達要素、サイトカインまたはサイトカイン受容体、ケモカインまたはケモカイン受容体の下流のシグナル伝達要素、細胞死またはアポトーシスの受容体／リガンド（例えば表4に提示されているもの）の下流のシグナル伝達要素、代謝感知分子（例えば表5に提示されているもの）の下流のシグナル伝達要素、がん療法に対する感受性を与えるタンパク質（例えば表6に提示されているもの）の下流のシグナル伝達要素、がん遺伝子または腫瘍抑制遺伝子（例えば表7に提示されているもの）の下流のシグナル伝達要素である。本開示の代表的なサイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体の非限定的な例に含まれるのは、表8に提示されているサイトカインおよびサイトカイン受容体と、ケモカインおよびケモカイン受容体である。
武装化T細胞「合成遺伝子発現」戦略
いくつかの実施態様では、本開示のT細胞を改変して条件的遺伝子発現を媒介するキメラリガンド受容体（CLR）またはキメラ抗原受容体（CAR）を発現させ、本開示の武装化T細胞を生成させる。武装化T細胞の核におけるCLR/CARと条件的遺伝子発現系の組み合わせが、コグネイトリガンドがCLRに結合したとき、またはコグネイト抗原がCARに結合したときに条件的に活性化される合成遺伝子発現系を構成する。この系は、例えばリガンドまたは抗原が結合する部位で、または腫瘍環境で、または腫瘍環境内において合成遺伝子の発現を低下させるか制限することにより、改変されたT細胞の治療能力を「武装化する」または増強するのを助けることができる。
外来性受容体
いくつかの実施態様では、武装化T細胞は、（a）誘導性プロモータをコードする配列と導入遺伝子をコードする配列を含む誘導性導入遺伝子コンストラクトと、（b）構成的プロモータをコードする配列と外来性受容体（CLR、CARなど）をコードする配列を含む受容体コンストラクトを含む組成物を含んでおり、（a）のコンストラクトと（b）のコンストラクトが細胞のゲノム配列に組み込まれると外来性受容体が発現し、この外来性受容体は、リガンドまたは抗原が結合すると、誘導性導入遺伝子（a）の発現を調節する誘導性プロモータを直接または間接に標的とする細胞内シグナルを伝達して遺伝子の発現を変化させる。
本開示の合成遺伝子発現系のいくつかの実施態様では、組成物は、遺伝子の発現を低下させることによって遺伝子の発現を変化させる。いくつかの実施態様では、組成物は、遺伝子の発現を一過性に（例えばリガンドが外来性受容体に結合している間）変化させることによって遺伝子の発現を変化させる。いくつかの実施態様では、組成物は、遺伝子の発現を急に変化させる（例えばリガンドが外来性受容体に可逆的に結合する）。いくつかの実施態様では、組成物は、遺伝子の発現を慢性的に変化させる（例えばリガンドが外来性受容体に不可逆的に結合する）。
本開示の組成物のいくつかの実施態様では、（b）の外来性受容体は、細胞のゲノム配列に対して内在性である受容体を含んでいる。代表的な受容体の非限定的な例に含まれるのは、細胞内受容体、細胞表面受容体、膜貫通受容体、リガンド依存性イオンチャネル、Gタンパク質共役受容体である。
本開示の組成物のいくつかの実施態様では、（b）の外来性受容体は、天然に存在しない受容体を含んでいる。いくつかの実施態様では、天然に存在しない受容体は、合成受容体、改変された受容体、組み換え受容体、変異受容体、キメラ受容体のいずれかである。いくつかの実施態様では、天然に存在しない受容体は、T細胞受容体（TCR）から単離されたかTCRに由来する1つ以上の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、天然に存在しない受容体は、足場タンパク質から単離されたか足場タンパク質に由来する1つ以上の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、天然に存在しない受容体が膜貫通ドメインを含まない実施態様を含め、天然に存在しない受容体は、第2の膜貫通受容体、および／または膜結合受容体、および／または細胞内受容体と相互作用し、これら受容体は、天然に存在しないその受容体と接触した後に細胞内シグナルを伝達する。
本開示の組成物のいくつかの実施態様では、（b）の外来性受容体は、天然に存在しない受容体を含んでいる。いくつかの実施態様では、天然に存在しない受容体は、合成受容体、改変された受容体、組み換え受容体、変異受容体、キメラ受容体のいずれかである。いくつかの実施態様では、天然に存在しない受容体は、T細胞受容体（TCR）から単離されたかTCRに由来する1つ以上の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、天然に存在しない受容体は、足場タンパク質から単離されたか足場タンパク質に由来する1つ以上の配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、天然に存在しない受容体は、膜貫通ドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、天然に存在しない受容体は、細胞内シグナルを伝達する細胞内受容体と相互作用する。いくつかの実施態様では、天然に存在しない受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、天然に存在しない受容体は、キメラリガンド受容体（CLR）である。いくつかの実施態様では、CLRはキメラ抗原受容体（CAR）である。
本開示の組成物のいくつかの実施態様では、（b）の外来性受容体は、天然に存在しない受容体を含んでいる。いくつかの実施態様では、CLRはキメラ抗原受容体（CAR）である。いくつかの実施態様では、キメラリガンド受容体は、（a）少なくとも足場タンパク質を含むリガンド認識領域を含むエクトドメインと；（b）膜貫通ドメインと；（c）少なくとも1つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、（a）のエクトドメインは、シグナルペプチドをさらに含んでいる。いくつかの実施態様では、（a）のエクトドメインは、リガンド認識領域と膜貫通ドメインの間にヒンジをさらに含んでいる。
本開示のCLR/CARのいくつかの実施態様では、シグナルペプチドは、ヒトのCD2シグナルペプチド、CD3δシグナルペプチド、CD3εシグナルペプチド、CD3γシグナルペプチド、CD3ζシグナルペプチド、CD4シグナルペプチド、CD8αシグナルペプチド、CD19シグナルペプチド、CD28シグナルペプチド、4-1BBシグナルペプチド、GM-CSFRシグナルペプチドのいずれかをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、シグナルペプチドは、ヒトCD8αシグナルペプチドをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、シグナルペプチドは、MALPVTALLLPLALLLHAARP（配列番号18004）を含むアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、シグナルペプチドは、atggcactgccagtcaccgccctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgcagctagaccaを含む核酸配列によってコードされている。
本開示のCLR/CARのいくつかの実施態様では、膜貫通ドメインは、ヒトのCD2膜貫通ドメイン、CD3δ膜貫通ドメイン、CD3ε膜貫通ドメイン、CD3γ膜貫通ドメイン、CD3ζ膜貫通ドメイン、CD4膜貫通ドメイン、CD8α膜貫通ドメイン、CD19膜貫通ドメイン、CD28膜貫通ドメイン、4-1BB膜貫通ドメイン、GM-CSFR膜貫通ドメインのいずれかをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、膜貫通ドメインは、ヒトCD8α膜貫通ドメインをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、膜貫通ドメインは、IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC（配列番号18006）を含むアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、膜貫通ドメインは、atctacatttgggcaccactggccgggacctgtggagtgctgctgctgagcctggtcatcacactgtactgc（配列番号18007）を含む核酸配列によってコードされている。
本開示のCLR/CARのいくつかの実施態様では、エンドドメインは、ヒトCD3ζエンドドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、少なくとも1つの共刺激ドメインは、ヒトの4-1BB細胞内セグメント、CD28細胞内セグメント、CD40細胞内セグメント、ICOS細胞内セグメント、MyD88細胞内セグメント、OX-40細胞内セグメントのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせを含んでいる。いくつかの実施態様では、少なくとも1つの共刺激ドメインは、ヒトのCD28共刺激ドメインおよび／または4-1BB共刺激ドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、CD3ζ共刺激ドメインは、RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR（配列番号18008）を含むアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、CD3ζ共刺激ドメインは、cgcgtgaagtttagtcgatcagcagatgccccagcttacaaacagggacagaaccagctgtataacgagctgaatctgggccgccgagaggaatatgacgtgctggataagcggagaggacgcgaccccgaaatgggaggcaagcccaggcgcaaaaaccctcaggaaggcctgtataacgagctgcagaaggacaaaatggcagaagcctattctgagatcggcatgaagggggagcgacggagaggcaaagggcacgatgggctgtaccagggactgagcaccgccacaaaggacacctatgatgctctgcatatgcaggcactgcctccaagg（配列番号18010）を含む核酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、4-1BB共刺激ドメインは、KRGRKKLL
YIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL（配列番号18011）を含むアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、4-1BB共刺激ドメインは、aagagaggcaggaagaaactgctgtatattttcaaacagcccttcatgcgccccgtgcagactacccaggaggaagacgggtgctcctgtcgattccctgaggaagaggaaggcgggtgtgagctg（配列番号18013）を含む核酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、4-1BB共刺激ドメインは、膜貫通ドメインとCD28共刺激ドメインの間に位置する。
本開示のCLR/CARのいくつかの実施態様では、ヒンジは、ヒトのCD8α配列、および／またはIgG4配列、および／またはCD4配列に由来する配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、ヒンジは、ヒトCD8α配列に由来する配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、ヒンジは、TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD（配列番号18014）を含むアミノ酸配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、ヒンジは、ACCACAACCCCTGCCCCCAGACCTCCCACACCCGCCCCTACCATCGCGAGTCAGCCCCTGAGTCTGAGACCTGAGGCCTGCAGGCCAGCTGCAGGAGGAGCTGTGCACACCAGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGAC（配列番号18016）、またはACCACAACCCCTGCCCCCAGACCTCCCACACCCGCCCCTACCATCGCGAGTCAGCCCCTGAGTCTGAGACCTGAGGCCTGCAGGCCAGCTGCAGGAGGAGCTGTGCACACCAGGGGCCTGGACTTCGCCTGCGAC（配列番号18017）を含む核酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、少なくとも1つの足場タンパク質がリガンドに特異的に結合する。
本開示の組成物のいくつかの実施態様では、（b）の外来性受容体は、天然に存在しない受容体を含んでいる。いくつかの実施態様では、CLRはキメラ抗原受容体（CAR）である。いくつかの実施態様では、キメラリガンド受容体は、（a）少なくとも足場タンパク質を含むリガンド認識領域を含むエクトドメインと；（b）膜貫通ドメインと；（c）少なくとも1つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、少なくとも1つの足場タンパク質は、抗体、抗体断片、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、抗体模倣体、センチリン（本明細書ではCARTyrinと呼ぶ）のいずれかを含んでいる。いくつかの実施態様では、リガンド認識領域は、抗体、抗体断片、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、抗体模倣体、センチリンのうちの1つ以上を含んでいる。いくつかの実施態様では、単一ドメイン抗体は、VHHまたはVH（本明細書ではVCARと呼ぶ）を含むか、VHHまたはVHからなる。いくつかの実施態様では、単一ドメイン抗体は、ヒト相補性決定領域（CDR）を含むVHHまたはVHを含むか、このVHHまたはVHからなる。いくつかの実施態様では、VHは、組み換えタンパク質またはキメラタンパク質である。いくつかの実施態様では、VHは、組み換えヒトタンパク質またはキメラヒトタンパク質である。いくつかの実施態様では、抗体模倣体は、アフィボディ、アフィリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、DARPin、Fynomer、クニッツドメインペプチド、モノボディのいずれかを含むか、これらのいずれかからなる。いくつかの実施態様では、センチリンは、少なくとも1つのフィブロネクチンIII型（FN3）ドメインのコンセンサス配列を含むか、このコンセンサス配列からなる。
本開示の組成物のいくつかの実施態様では、（b）の外来性受容体は、天然に存在しない受容体を含んでいる。いくつかの実施態様では、CLRはキメラ抗原受容体（CAR）である。いくつかの実施態様では、キメラリガンド受容体は、（a）少なくとも足場タンパク質を含むリガンド認識領域を含むエクトドメインと；（b）膜貫通ドメインと；（c）少なくとも1つの共刺激ドメインを含むエンドドメインを含んでいる。いくつかの実施態様では、センチリンは、少なくとも1つのフィブロネクチンIII型（FN3）ドメインのコンセンサス配列を含むか、このコンセンサス配列からなる。いくつかの実施態様では、少なくとも1つのフィブロネクチンIII型（FN3）ドメインは、ヒトタンパク質に由来する。いくつかの実施態様では、そのヒトタンパク質は、テネイシンCである。いくつかの実施態様では、コンセンサス配列は、LPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT（配列番号18018）を含んでいる。いくつかの実施態様では、コンセンサス配列は、MLPAPKNLVVSEVTEDSLRLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAINLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAEFTT（配列番号18019）を含んでいる。いくつかの実施態様では、コンセンサス配列は、1つ以上の位置における修飾を、（a）コンセンサス配列の13～16位にアミノ酸残基TEDS（配列番号18020）を含むか、これらアミノ酸残基からなるA-Bループの中；または（b）コンセンサス配列の22～28位にアミノ酸残基TAPDAAF（配列番号18021）を含むか、これらアミノ酸残基からなるB-Cループの中；または（c）コンセンサス配列の38～43位にアミノ酸残基SEKVGE（配列番号18022）を含むか、これらアミノ酸残基からなるC-Dループの中；または（d）コンセンサス配列の51～54位にアミノ酸残基GSER（配列番号18023）を含むか、これらアミノ酸残基からなるD-Eループの中；または（e）コンセンサス配列の60～64位にアミノ酸残基GLKPG（配列番号18024）を含むか、これらアミノ酸残基からなるE-Fループの中；または（f）コンセンサス配列の75～81位にアミノ酸残基KGGHRSN（配列番号18025）を含むか、これらアミノ酸残基からなるF-Gループの中；または（g）（a）～（f）の任意の組み合わせの中に有する。いくつかの実施態様では、センチリンは、少なくとも5個のフィブロネクチンIII型（FN3）ドメインのコンセンサス配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、センチリンは、少なくとも10個のフィブロネクチンIII型（FN3）ドメインのコンセンサス配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、センチリンは、少なくとも15個のフィブロネクチンIII型（FN3）ドメインのコンセンサス配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、足場は、10－9M以下のKD、10－10M以下のKD、10－11M以下のKD、10－12M以下のKD、10－13M以下のKD、10－14M以下のKD、10－15M以下のKDから選択された少なくとも1つの親和性で抗原に結合する。いくつかの実施態様では、KDは表面プラズモン共鳴によって求められる。
誘導性プロモータ
本開示の組成物のいくつかの実施態様では、（a）の誘導性プロモータをコードする配列は、NFκBプロモータをコードする配列を含んでいる。本開示の組成物のいくつかの実施態様では、（a）の誘導性プロモータをコードする配列は、インターフェロン（IFN）プロモータをコードする配列、またはインターロイキン-2プロモータをコードする配列を含んでいる。いくつかの実施態様では、インターフェロン（IFN）プロモータは、IFNγプロモータである。本開示の組成物のいくつかの実施態様では、誘導性プロモータは、サイトカインまたはケモカインのプロモータから単離されるか、サイトカインまたはケモカインのプロモータに由来する。いくつかの実施態様では、サイトカインまたはケモカインに含まれるのは、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL10、IL12、IL13、IL17A/F、IL21、IL22、IL23、トランスフォーミング増殖因子ベータ（TGFβ）、コロニー刺激因子2（GM-CSF）、インターフェロン-ガンマ（IFNγ）、腫瘍壊死因子（TNFα）、LTα、パーフォリン、グランザイムC（Gzmc）、グランザイムB（Gzmb）、C-Cモチーフケモカインリガンド5（CCL5）、C-Cモチーフケモカインリガンド4（Ccl4）、C-Cモチーフケモカインリガンド3（Ccl3）、X-Cモチーフケモカインリガンド1（Xcl1）、LIFインターロイキン6ファミリーサイトカイン（Lif）である。
本開示の組成物のいくつかの実施態様では、誘導性プロモータは、細胞の分化、活性化、疲弊、機能に関与する表面タンパク質を含む遺伝子のプロモータから単離されるか、このプロモータに由来する。いくつかの実施態様では、遺伝子に、CD69、CD71、CTLA4、PD-1、TIGIT、LAG3、TIM-3、GITR、MHCII、COX-2、FASL、4-1BBが含まれる。
本開示の組成物のいくつかの実施態様では、誘導性プロモータは、CDの代謝と分化に関与する遺伝子のプロモータから単離されるか、このプロモータに由来する。本開示の組成物のいくつかの実施態様では、誘導性プロモータは、Nr4a1、Nr4a3、Tnfrsf9（4-1BB）、Sema7a、Zfp36l2、Gadd45b、Dusp5、Dusp6、Neto2から単離されるか、これらに由来する。
誘導性導入遺伝子
いくつかの実施態様では、誘導性導入遺伝子コンストラクトは、抑制性チェックポイントシグナル（例えば表1と表2に提示されているもの）の下流のシグナル伝達要素、転写因子（例えば表3に提示されているもの）の下流のシグナル伝達要素、サイトカインまたはサイトカイン受容体、ケモカインまたはケモカイン受容体の下流のシグナル伝達要素、細胞死またはアポトーシスの受容体／リガンド（例えば表4に提示されているもの）の下流のシグナル伝達要素、代謝感知分子（例えば表5に提示されているもの）の下流のシグナル伝達要素、がん療法に対する感受性を与えるタンパク質（例えば表6または表9に提示されているもの）の下流のシグナル伝達要素、がん遺伝子または腫瘍抑制遺伝子（例えば表7に提示されているもの）の下流のシグナル伝達要素を含むか、これらのシグナル伝達要素の発現を駆動する。本開示の代表的なサイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカイン、ケモカイン受容体の非限定的な例に含まれるのは、表8に提示されているサイトカインおよびサイトカイン受容体と、ケモカインおよびケモカイン受容体である。
表9：代表的な治療用タンパク質（と、CAR-Tの効力を増大させるタンパク質）
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 Cas-Clover
本開示により、ガイドRNAを含むとともに、融合タンパク質、またはこの融合タンパク質をコードする配列を含む組成物が提供される。ただしこの融合タンパク質は、dCas9を含むとともに、Clo051エンドヌクレアーゼまたはそのヌクレアーゼドメインを含んでいる。
小さなCas9（SaCas9）
本開示により、エフェクタに機能可能に連結された小さなCas9（SaCas9）を含む組成物が提供される。いくつかの実施態様では、本開示により、DNA局在要素とエフェクタ分子（ここでエフェクタは、小さなCas9（SaCas9）を含む）を含む融合タンパク質、または主にこれらからなる融合タンパク質、またはこれらからなる融合タンパク質が提供される。いくつかの実施態様では、本開示の小さなCas9コンストラクトは、IIS型エンドヌクレアーゼを含むエフェクタを含むことができる。
活性な触媒部位を有する黄色ブドウ球菌Cas9のアミノ酸配列。
1 mkrnyilgld igitsvgygi idyetrdvid agvrlfkean vennegrrsk rgarrlkrrr
61 rhriqrvkkl lfdynlltdh selsginpye arvkglsqkl seeefsaall hlakrrgvhn
121 vneveedtgn elstkeqisr nskaleekyv aelqlerlkk dgevrgsinr fktsdyvkea
181 kqllkvqkay hqldqsfidt yidlletrrt yyegpgegsp fgwkdikewy emlmghctyf
241 peelrsvkya ynadlynaln dlnnlvitrd enekleyyek fqiienvfkq kkkptlkqia
301 keilvneedi kgyrvtstgk peftnlkvyh dikditarke iienaelldq iakiltiyqs
361 sediqeeltn lnseltqeei eqisnlkgyt gthnlslkai nlildelwht ndnqiaifnr
421 lklvpkkvdl sqqkeipttl vddfilspvv krsfiqsikv inaiikkygl pndiiielar
481 eknskdaqkm inemqkrnrq tnerieeiir ttgkenakyl iekiklhdmq egkclyslea
541 ipledllnnp fnyevdhiip rsvsfdnsfn nkvlvkqeen skkgnrtpfq ylsssdskis
601 yetfkkhiln lakgkgrisk tkkeylleer dinrfsvqkd finrnlvdtr yatrglmnll
661 rsyfrvnnld vkvksinggf tsflrrkwkf kkernkgykh haedaliian adfifkewkk
721 ldkakkvmen qmfeekqaes mpeieteqey keifitphqi khikdfkdyk yshrvdkkpn
781 relindtlys trkddkgntl ivnnlnglyd kdndklkkli nkspekllmy hhdpqtyqkl
841 klimeqygde knplykyyee tgnyltkysk kdngpvikki kyygnklnah lditddypns
901 rnkvvklslk pyrfdvyldn gvykfvtvkn ldvikkenyy evnskcyeea kklkkisnqa
961 efiasfynnd likingelyr vigvnndlln rievnmidit yreylenmnd krppriikti
1021 asktqsikky stdilgnlye vkskkhpqii kkg（配列番号18052）。
不活性化された小さなCas9（dSaCas9）
本開示により、エフェクタに機能可能に連結された不活性化された小さなCas9（dSaCas9）を含む組成物が提供される。いくつかの実施態様では、本開示により、DNA局在要素とエフェクタ分子（ここでエフェクタは、不活性化された小さなCas9（dSaCas9）を含む）を含む融合タンパク質、または主にこれらからなる融合タンパク質、またはこれらからなる融合タンパク質が提供される。いくつかの実施態様では、本開示の不活性化された小さなCas9（dSaCas9）コンストラクトは、IIS型エンドヌクレアーゼを含むエフェクタを含むことができる。
dSaCas9配列：D10A変異とN580A変異（太字、大文字、下線）が触媒部位を不活性化する。
Figure 0007399866000161
 不活性化されたCas9（dCas9）
本開示により、エフェクタに機能可能に連結された不活性化されたCas9（dCas9）を含む組成物が提供される。いくつかの実施態様では、本開示により、DNA局在要素とエフェクタ分子（ここでエフェクタは、不活性化されたCas9（dCas9）を含む）を含む融合タンパク質、または主にこれらからなる融合タンパク質、またはこれらからなる融合タンパク質が提供される。いくつかの実施態様では、本開示の不活性化されたCas9（dCas9）コンストラクトは、IIS型エンドヌクレアーゼを含むエフェクタを含むことができる。
いくつかの実施態様では、本開示のdCas9は、化膿性ブドウ球菌から単離されたdCas9、または化膿性ブドウ球菌に由来するdCas9を含んでいる。いくつかの実施態様では、dCas9は、dCas9のアミノ酸配列の10位と840位に触媒部位を不活性化する置換を有するdCas9を含んでいる。いくつかの実施態様では、これらの置換はD10AとH840Aである。いくつかの実施態様では、dCas9のアミノ酸配列は、
Figure 0007399866000162
 の配列を含んでいる。
いくつかの実施態様では、dCas9のアミノ酸配列は、
Figure 0007399866000163
 の配列を含んでいる。

Clo051エンドヌクレアーゼ
1つの代表的なClo051ヌクレアーゼドメインは、EGIKSNISLLKDELRGQISHISHEYLSL
IDLAFDSKQNRLFEMKVLELLVNEYGFKGRHLGGSRKPDGIVYSTTLEDNFGIIVDTKAYSEGYSLPISQADEMERYVRENSNRDEEVNPNKWWENFSEEVKKYYFVFISGSFKGKFEEQLRRLSMTTGVNGSAVNVVNLLLGAEKIRSGEMTIEELERAMFNNSEFILKY（配列番号18056）のアミノ酸配列を含むか、主にこのアミノ酸配列からなるか、このアミノ酸配列からなることができる。

Cas-Clover融合タンパク質
いくつかの実施態様では、1つの代表的なdCas9-Clo051融合タンパク質（実施態様1）は、
Figure 0007399866000164
 のアミノ酸配列（Clo051配列に下線、リンカーは太字イタリック、dCas9配列（化膿性ブドウ球菌）はイタリック）を含むか、主にこのアミノ酸配列からなるか、このアミノ酸配列からなることができる。
いくつかの実施態様では、1つの代表的なdCas9-Clo051融合タンパク質（実施態様1）は、
1 atggcaccaa agaagaaaag aaaagtggag ggcatcaagt caaacatcag cctgctgaaa
61 gacgaactgc ggggacagat tagtcacatc agtcacgagt acctgtcact gattgatctg
121 gccttcgaca gcaagcagaa tagactgttt gagatgaaag tgctggaact gctggtcaac
181 gagtatggct tcaagggcag acatctgggc gggtctagga aacctgacgg catcgtgtac
241 agtaccacac tggaagacaa cttcggaatc attgtcgata ccaaggctta ttccgagggc
301 tactctctgc caattagtca ggcagatgag atggaaaggt acgtgcgcga aaactcaaat
361 agggacgagg aagtcaaccc caataagtgg tgggagaatt tcagcgagga agtgaagaaa
421 tactacttcg tctttatctc aggcagcttc aaagggaagt ttgaggaaca gctgcggaga
481 ctgtccatga ctaccggggt gaacggatct gctgtcaacg tggtcaatct gctgctgggc
541 gcagaaaaga tcaggtccgg ggagatgaca attgaggaac tggaacgcgc catgttcaac
601 aattctgagt ttatcctgaa gtatggaggc gggggaagcg ataagaaata ctccatcgga
661 ctggccattg gcaccaattc cgtgggctgg gctgtcatca cagacgagta caaggtgcca
721 agcaagaagt tcaaggtcct ggggaacacc gatcgccaca gtatcaagaa aaatctgatt
781 ggagccctgc tgttcgactc aggcgagact gctgaagcaa cccgactgaa gcggactgct
841 aggcgccgat atacccggag aaaaaatcgg atctgctacc tgcaggaaat tttcagcaac
901 gagatggcca aggtggacga tagtttcttt caccgcctgg aggaatcatt cctggtggag
961 gaagataaga aacacgagcg gcatcccatc tttggcaaca ttgtggacga agtcgcttat
1021 cacgagaagt accctactat ctatcatctg aggaagaaac tggtggactc caccgataag
1081 gcagacctgc gcctgatcta tctggccctg gctcacatga tcaagttccg ggggcatttt
1141 ctgatcgagg gagatctgaa ccctgacaat tctgatgtgg acaagctgtt catccagctg
1201 gtccagacat acaatcagct gtttgaggaa aacccaatta atgcctcagg cgtggacgca
1261 aaggccatcc tgagcgccag actgtccaaa tctaggcgcc tggaaaacct gatcgctcag
1321 ctgccaggag agaagaaaaa cggcctgttt gggaatctga ttgcactgtc cctgggcctg
1381 acacccaact tcaagtctaa ttttgatctg gccgaggacg ctaagctgca gctgtccaaa
1441 gacacttatg acgatgacct ggataacctg ctggctcaga tcggcgatca gtacgcagac
1501 ctgttcctgg ccgctaagaa tctgagtgac gccatcctgc tgtcagatat tctgcgcgtg
1561 aacacagaga ttactaaggc cccactgagt gcttcaatga tcaaaagata tgacgagcac
1621 catcaggatc tgaccctgct gaaggctctg gtgaggcagc agctgcccga gaaatacaag
1681 gaaatcttct ttgatcagag caagaatgga tacgccggct atattgacgg cggggcttcc
1741 caggaggagt tctacaagtt catcaagccc attctggaaa agatggacgg caccgaggaa
1801 ctgctggtga agctgaatcg ggaggacctg ctgagaaaac agaggacatt tgataacgga
1861 agcatccctc accagattca tctgggcgaa ctgcacgcca tcctgcgacg gcaggaggac
1921 ttctacccat ttctgaagga taaccgcgag aaaatcgaaa agatcctgac cttcagaatc
1981 ccctactatg tggggcctct ggcacgggga aatagtagat ttgcctggat gacaagaaag
2041 tcagaggaaa ctatcacccc ctggaacttc gaggaagtgg tcgataaagg cgctagcgca
2101 cagtccttca ttgaaaggat gacaaatttt gacaagaacc tgccaaatga gaaggtgctg
2161 cccaaacaca gcctgctgta cgaatatttc acagtgtata acgagctgac taaagtgaag
2221 tacgtcaccg aagggatgcg caagcccgca ttcctgtccg gagagcagaa gaaagccatc
2281 gtggacctgc tgtttaagac aaatcggaaa gtgactgtca aacagctgaa ggaagactat
2341 ttcaagaaaa ttgagtgttt cgattcagtg gaaatcagcg gcgtcgagga caggtttaac
2401 gcctccctgg ggacctacca cgatctgctg aagatcatca aggataagga cttcctggac
2461 aacgaggaaa atgaggacat cctggaggac attgtgctga cactgactct gtttgaggat
2521 cgcgaaatga tcgaggaacg actgaagact tatgcccatc tgttcgatga caaagtgatg
2581 aagcagctga aaagaaggcg ctacaccgga tggggacgcc tgagccgaaa actgatcaat
2641 gggattagag acaagcagag cggaaaaact atcctggact ttctgaagtc cgatggcttc
2701 gccaacagga acttcatgca gctgattcac gatgactctc tgaccttcaa ggaggacatc
2761 cagaaagcac aggtgtctgg ccagggggac agtctgcacg agcatatcgc aaacctggcc
2821 ggcagccccg ccatcaagaa agggattctg cagaccgtga aggtggtgga cgaactggtc
2881 aaggtcatgg gacgacacaa acctgagaac atcgtgattg agatggcccg cgaaaatcag
2941 acaactcaga agggccagaa aaacagtcga gaacggatga agagaatcga ggaaggcatc
3001 aaggagctgg ggtcacagat cctgaaggag catcctgtgg aaaacactca gctgcagaat
3061 gagaaactgt atctgtacta tctgcagaat ggacgggata tgtacgtgga ccaggagctg
3121 gatattaaca gactgagtga ttatgacgtg gatgccatcg tccctcagag cttcctgaag
3181 gatgactcca ttgacaacaa ggtgctgacc aggtccgaca agaaccgcgg caaatcagat
3241 aatgtgccaa gcgaggaagt ggtcaagaaa atgaagaact actggaggca gctgctgaat
3301 gccaagctga tcacacagcg gaaatttgat aacctgacta aggcagaaag aggaggcctg
3361 tctgagctgg acaaggccgg cttcatcaag cggcagctgg tggagacaag acagatcact
3421 aagcacgtcg ctcagattct ggatagcaga atgaacacaa agtacgatga aaacgacaag
3481 ctgatcaggg aggtgaaagt cattactctg aaatccaagc tggtgtctga ctttagaaag
3541 gatttccagt tttataaagt cagggagatc aacaactacc accatgctca tgacgcatac
3601 ctgaacgcag tggtcgggac cgccctgatt aagaaatacc ccaagctgga gtccgagttc
3661 gtgtacggag actataaagt gtacgatgtc cggaagatga tcgccaaatc tgagcaggaa
3721 attggcaagg ccaccgctaa gtatttcttt tacagtaaca tcatgaattt ctttaagacc
3781 gaaatcacac tggcaaatgg ggagatcaga aaaaggcctc tgattgagac caacggggag
3841 acaggagaaa tcgtgtggga caagggaagg gattttgcta ccgtgcgcaa agtcctgtcc
3901 atgccccaag tgaatattgt caagaaaact gaagtgcaga ccgggggatt ctctaaggag
3961 agtattctgc ctaagcgaaa ctctgataaa ctgatcgccc ggaagaaaga ctgggacccc
4021 aagaagtatg gcgggttcga ctctccaaca gtggcttaca gtgtcctggt ggtcgcaaag
4081 gtggaaaagg ggaagtccaa gaaactgaag tctgtcaaag agctgctggg aatcactatt
4141 atggaacgca gctccttcga gaagaatcct atcgattttc tggaagccaa gggctataaa
4201 gaggtgaaga aagacctgat cattaagctg ccaaaatact cactgtttga gctggaaaac
4261 ggacgaaagc gaatgctggc aagcgccgga gaactgcaga agggcaatga gctggccctg
4321 ccctccaaat acgtgaactt cctgtatctg gctagccact acgagaaact gaaggggtcc
4381 cctgaggata acgaacagaa gcagctgttt gtggagcagc acaaacatta tctggacgag
4441 atcattgaac agatttcaga gttcagcaag agagtgatcc tggctgacgc aaatctggat
4501 aaagtcctga gcgcatacaa caagcaccga gacaaaccaa tccgggagca ggccgaaaat
4561 atcattcatc tgttcaccct gacaaacctg ggcgcccctg cagccttcaa gtattttgac
4621 accacaatcg atcggaagag atacacttct accaaagagg tgctggatgc taccctgatc
4681 caccagagta ttaccggcct gtatgagaca cgcatcgacc tgtcacagct gggaggcgat
4741 gggagcccca agaaaaagcg gaaggtgtct agttaa（配列番号18058）の核酸配列（化膿性ブドウ球菌に由来するdCas9配列）を含むか、主にこの核酸配列からなるか、この核酸配列からなることができる。
いくつかの実施態様では、本開示のdCas9-Clo051融合タンパク質（実施態様1）をコードする核酸配列は、DNAを含むことができる。いくつかの実施態様では、本開示のdCas9-Clo051融合タンパク質（実施態様1）をコードする核酸配列は、RNAを含むことができる。
いくつかの実施態様では、1つの代表的なdCas9-Clo051融合タンパク質（実施態様2）は、
Figure 0007399866000165
 のアミノ酸配列（Clo051配列に下線、リンカーは太字イタリック、dCas9配列（化膿性ブドウ球菌）はイタリック）を含むか、主にこのアミノ酸配列からなるか、このアミノ酸配列からなることができる。
いくつかの実施態様では、1つの代表的なdCas9-Clo051融合タンパク質（実施態様2）は、
1 atgcctaaga agaagcggaa ggtggaaggc atcaaaagca acatctccct cctgaaagac
61 gaactccggg ggcagattag ccacattagt cacgaatacc tctccctcat cgacctggct
121 ttcgatagca agcagaacag gctctttgag atgaaagtgc tggaactgct cgtcaatgag
181 tacgggttca agggtcgaca cctcggcgga tctaggaaac cagacggcat cgtgtatagt
241 accacactgg aagacaactt tgggatcatt gtggatacca aggcatactc tgagggttat
301 agtctgccca tttcacaggc cgacgagatg gaacggtacg tgcgcgagaa ctcaaataga
361 gatgaggaag tcaaccctaa caagtggtgg gagaacttct ctgaggaagt gaagaaatac
421 tacttcgtct ttatcagcgg gtccttcaag ggtaaatttg aggaacagct caggagactg
481 agcatgacta ccggcgtgaa tggcagcgcc gtcaacgtgg tcaatctgct cctgggcgct
541 gaaaagattc ggagcggaga gatgaccatc gaagagctgg agagggcaat gtttaataat
601 agcgagttta tcctgaaata cggtggcggt ggatccgata aaaagtattc tattggttta
661 gccatcggca ctaattccgt tggatgggct gtcataaccg atgaatacaa agtaccttca
721 aagaaattta aggtgttggg gaacacagac cgtcattcga ttaaaaagaa tcttatcggt
781 gccctcctat tcgatagtgg cgaaacggca gaggcgactc gcctgaaacg aaccgctcgg
841 agaaggtata cacgtcgcaa gaaccgaata tgttacttac aagaaatttt tagcaatgag
901 atggccaaag ttgacgattc tttctttcac cgtttggaag agtccttcct tgtcgaagag
961 gacaagaaac atgaacggca ccccatcttt ggaaacatag tagatgaggt ggcatatcat
1021 gaaaagtacc caacgattta tcacctcaga aaaaagctag ttgactcaac tgataaagcg
1081 gacctgaggt taatctactt ggctcttgcc catatgataa agttccgtgg gcactttctc
1141 attgagggtg atctaaatcc ggacaactcg gatgtcgaca aactgttcat ccagttagta
1201 caaacctata atcagttgtt tgaagagaac cctataaatg caagtggcgt ggatgcgaag
1261 gctattctta gcgcccgcct ctctaaatcc cgacggctag aaaacctgat cgcacaatta
1321 cccggagaga agaaaaatgg gttgttcggt aaccttatag cgctctcact aggcctgaca
1381 ccaaatttta agtcgaactt cgacttagct gaagatgcca aattgcagct tagtaaggac
1441 acgtacgatg acgatctcga caatctactg gcacaaattg gagatcagta tgcggactta
1501 tttttggctg ccaaaaacct tagcgatgca atcctcctat ctgacatact gagagttaat
1561 actgagatta ccaaggcgcc gttatccgct tcaatgatca aaaggtacga tgaacatcac
1621 caagacttga cacttctcaa ggccctagtc cgtcagcaac tgcctgagaa atataaggaa
1681 atattctttg atcagtcgaa aaacgggtac gcaggttata ttgacggcgg agcgagtcaa
1741 gaggaattct acaagtttat caaacccata ttagagaaga tggatgggac ggaagagttg
1801 cttgtaaaac tcaatcgcga agatctactg cgaaagcagc ggactttcga caacggtagc
1861 attccacatc aaatccactt aggcgaattg catgctatac ttagaaggca ggaggatttt
1921 tatccgttcc tcaaagacaa tcgtgaaaag attgagaaaa tcctaacctt tcgcatacct
1981 tactatgtgg gacccctggc ccgagggaac tctcggttcg catggatgac aagaaagtcc
2041 gaagaaacga ttactccatg gaattttgag gaagttgtcg ataaaggtgc gtcagctcaa
2101 tcgttcatcg agaggatgac caactttgac aagaatttac cgaacgaaaa agtattgcct
2161 aagcacagtt tactttacga gtatttcaca gtgtacaatg aactcacgaa agttaagtat
2221 gtcactgagg gcatgcgtaa acccgccttt ctaagcggag aacagaagaa agcaatagta
2281 gatctgttat tcaagaccaa ccgcaaagtg acagttaagc aattgaaaga ggactacttt
2341 aagaaaattg aatgcttcga ttctgtcgag atctccgggg tagaagatcg atttaatgcg
2401 tcacttggta cgtatcatga cctcctaaag ataattaaag ataaggactt cctggataac
2461 gaagagaatg aagatatctt agaagatata gtgttgactc ttaccctctt tgaagatcgg
2521 gaaatgattg aggaaagact aaaaacatac gctcacctgt tcgacgataa ggttatgaaa
2581 cagttaaaga ggcgtcgcta tacgggctgg ggacgattgt cgcggaaact tatcaacggg
2641 ataagagaca agcaaagtgg taaaactatt ctcgattttc taaagagcga cggcttcgcc
2701 aataggaact ttatgcagct gatccatgat gactctttaa ccttcaaaga ggatatacaa
2761 aaggcacagg tttccggaca aggggactca ttgcacgaac atattgcgaa tcttgctggt
2821 tcgccagcca tcaaaaaggg catactccag acagtcaaag tagtggatga gctagttaag
2881 gtcatgggac gtcacaaacc ggaaaacatt gtaatcgaga tggcacgcga aaatcaaacg
2941 actcagaagg ggcaaaaaaa cagtcgagag cggatgaaga gaatagaaga gggtattaaa
3001 gaactgggca gccagatctt aaaggagcat cctgtggaaa atacccaatt gcagaacgag
3061 aaactttacc tctattacct acaaaatgga agggacatgt atgttgatca ggaactggac
3121 ataaaccgtt tatctgatta cgacgtcgat gccattgtac cccaatcctt tttgaaggac
3181 gattcaatcg acaataaagt gcttacacgc tcggataaga accgagggaa aagtgacaat
3241 gttccaagcg aggaagtcgt aaagaaaatg aagaactatt ggcggcagct cctaaatgcg
3301 aaactgataa cgcaaagaaa gttcgataac ttaactaaag ctgagagggg tggcttgtct
3361 gaacttgaca aggccggatt tattaaacgt cagctcgtgg aaacccgcca aatcacaaag
3421 catgttgcac agatactaga ttcccgaatg aatacgaaat acgacgagaa cgataagctg
3481 attcgggaag tcaaagtaat cactttaaag tcaaaattgg tgtcggactt cagaaaggat
3541 tttcaattct ataaagttag ggagataaat aactaccacc atgcgcacga cgcttatctt
3601 aatgccgtcg tagggaccgc actcattaag aaatacccga agctagaaag tgagtttgtg
3661 tatggtgatt acaaagttta tgacgtccgt aagatgatcg cgaaaagcga acaggagata
3721 ggcaaggcta cagccaaata cttcttttat tctaacatta tgaatttctt taagacggaa
3781 atcactctgg caaacggaga gatacgcaaa cgacctttaa ttgaaaccaa tggggagaca
3841 ggtgaaatcg tatgggataa gggccgggac ttcgcgacgg tgagaaaagt tttgtccatg
3901 ccccaagtca acatagtaaa gaaaactgag gtgcagaccg gagggttttc aaaggaatcg
3961 attcttccaa aaaggaatag tgataagctc atcgctcgta aaaaggactg ggacccgaaa
4021 aagtacggtg gcttcgatag ccctacagtt gcctattctg tcctagtagt ggcaaaagtt
4081 gagaagggaa aatccaagaa actgaagtca gtcaaagaat tattggggat aacgattatg
4141 gagcgctcgt cttttgaaaa gaaccccatc gacttccttg aggcgaaagg ttacaaggaa
4201 gtaaaaaagg atctcataat taaactacca aagtatagtc tgtttgagtt agaaaatggc
4261 cgaaaacgga tgttggctag cgccggagag cttcaaaagg ggaacgaact cgcactaccg
4321 tctaaatacg tgaatttcct gtatttagcg tcccattacg agaagttgaa aggttcacct
4381 gaagataacg aacagaagca actttttgtt gagcagcaca aacattatct cgacgaaatc
4441 atagagcaaa tttcggaatt cagtaagaga gtcatcctag ctgatgccaa tctggacaaa
4501 gtattaagcg catacaacaa gcacagggat aaacccatac gtgagcaggc ggaaaatatt
4561 atccatttgt ttactcttac caacctcggc gctccagccg cattcaagta ttttgacaca
4621 acgatagatc gcaaacgata cacttctacc aaggaggtgc tagacgcgac actgattcac
4681 caatccatca cgggattata tgaaactcgg atagatttgt cacagcttgg gggtgacgga
4741 tcccccaaga agaagaggaa agtctga（配列番号18060）の核酸配列（化膿性ブドウ球菌に由来するdCas9配列）を含むか、主にこの核酸配列からなるか、この核酸配列からなることができる。
いくつかの実施態様では、本開示のdCas9-Clo051融合タンパク質（実施態様2）をコードする核酸配列は、DNAを含むことができる。いくつかの実施態様では、本開示のdCas9-Clo051融合タンパク質（実施態様2）をコードする核酸配列は、RNAを含むことができる。
実施例1：PSMA5 CARTyrinとPSMA8 CARTyrinの構成とインビトロでの特徴付け

PSMA5 CARTyrinとPSMA8 CARTyrinを図1、図2、図3A～図3C、図4A～図4Cに示したようにして構成した。図5は、抗PSMA CARTyrinの構造を示している。
本開示のCARTyrinの表面発現を、ヒト汎T細胞の中にPSMA5 CARTyrinまたはPSMA8 CARTyrinをコードする配列をmRNA電気穿孔してから24時間後にフローサイトメトリーによって評価した（図6A）。フローサイトメトリーにより、PSMAをトランスフェクトしたLNCaP腫瘍細胞系とK562細胞系の表面におけるPSMAタンパク質の発現を検出した（図6B）。CARTyrinを発現しているT細胞の機能を、腫瘍系に対する脱顆粒によって測定した。RNAを電気穿孔したPSMA CARTyrin T細胞の脱顆粒が、PSMA+腫瘍細胞系に対して観察された（図6C）。表面でのPSMAタンパク質の発現が、増量していくPSMA mRNAを用いたK562細胞系のトランスフェクションの後にフローサイトメトリーによって検出された（図6D）。RNAを電気穿孔したPSMA CARTyrin T細胞の脱顆粒が、さまざまな量のPSMAタンパク質を発現するK562に対して観察された（図6E）。これらのデータが合わさって、PSMA5 CARTyrinとPSMA8 CARTyrinはT細胞の表面で発現することができ、PSMA+ 細胞標的に対する細胞傷害機能を促進することを示している。
PSMA CARTyrinの生体内評価をサポートするため、piggyBac DNA改変系を用いてP-PSMA5-101とP-PSMA8-101を構成した。PSMA CARTyrinが、P-PSMA5-101プラスミドまたはP-PSMA8-101プラスミドを用いて転移された初代ヒトT細胞（代表的な一人のドナーに由来する）の表面で検出された（図7A）。表面発現マーカーを用いたフローサイトメトリー分析から、PSMA CARTyrinを発現しているT細胞はT幹細胞記憶表現型のマーカーを持つが、活性化および／または機能的T細胞疲弊表現型のマーカーは持たないことがわかった（図7B～図7C）。ELISA分析から、PSMA CARTyrinを発現しているT細胞は、PSMAを発現している細胞（LNCaP PSMA細胞とK562 PSMA細胞）の中でIFNγの分泌を引き起こすことがわかり、これは、T細胞のエフェクタ機能を実証している（図7D）。PSMA CARTyrinを発現しているT細胞は、標準的な殺傷アッセイと細胞増殖アッセイによって強い細胞傷害機能を示した（図7E～図7F）。これらのデータが合わさって、T細胞の表面でのP-PSMA5-101 PSMA CARTyrinとP-PSMA8-101 PSMA CARTyrinの発現が、PSMA+細胞標的に対するインビトロでの細胞傷害機能と増殖能力を実証していることを示している。インビトロでのこの強力な性能に続いて、PSMA CARTyrinが生体内で機能する能力を評価した。

実施例2：マウス異種移植片モデルを用いたPSMA5 CARTyrinとPSMA8 CARTyrinの生体内特徴付け
図8Aは、マウスでP-PSMA8-101 CARTyrinを用いた生体内研究のための処理スケジュールを示している。抗腫瘍活性の評価を、生存率（図8B）と、血液中でのP-PSMA8-101 CD8+ T細胞の増殖および検出（図8C）と、キャリパー測定による腫瘍体積の評価（図8D）と、LNCaP腫瘍の生物発光（図8E～図8F）によって実施した。「ストレス」用量と標準的な用量のP-PSMA8-101は、「無T細胞」対照マウスと比べてNSGマウスでは、確立されたSC LNCaP.luc固形腫瘍に対する抗腫瘍効果と生存率を有意に増強することを実証した。具体的には、対照マウスはまったく生き残らず、「超低」用量のP-PSMA8-101で処理したマウスは50％が生き残り、「ストレス」用量または標準的な用量のP-PSMA8-101で処理したマウスは100％が生き残った。標準的な用量のP-PSMA8-101は、研究の期間中（処理後の42日間）、確立されたLNCaP腫瘍を100％のマウスで除去したのに対し、「ストレス」用量のマウスは2/3が腫瘍なしのままであった。末梢血では、P-PSMA8-101が増殖して分化したエフェクタPSMA8 CARTyrin+ T細胞を生じさせると同時に、腫瘍負荷が減少してキャリパーの検出限界と生物発光イメージングの限界よりも下になった。これらのデータが合わさって、PSMA8 CARTyrinを発現しているマウスは対照と比べて腫瘍負荷が減少することを実証している。
図9Aは、マウス異種移植片モデルでP-PSMA5-101 CARTyrinとP-PSMA8-101 CARTyrinを「ストレス」用量（4×106）で用いたマウス生体内研究のための処理スケジュールを示している。抗腫瘍活性の評価を、生存率（図9B）と、血液中でのCD8+ T細胞の増殖および検出（図9C）と、キャリパー測定による腫瘍体積の評価（図9D）と、LNCaP腫瘍の生物発光（図9E～図9F）によって実施した。「ストレス」用量のP-PSMA5-101とP-PSMA8-101は、T細胞（CARなし）対照マウスと比べてNSGマウスでは、確立されたSC LNCaP.luc固形腫瘍に対する抗腫瘍効果と生存率を有意に増強することを実証した。具体的には、T細胞（CARなし）対照マウスはまったく生き残らず、P-BCMA-101で処理した群は25％が生き残り、P-PSMA5-101で処理した群は75％が生き残り、「ストレス」用量のP-PSMA8-101で処理したマウスは100％が生き残った。末梢血では、P-PSMA5-101とP-PSMA8-101が増殖して分化したエフェクタCARTyrin+ T細胞を生じさせると同時に、腫瘍負荷が減少し、キャリパーの検出限界と生物発光イメージングの限界よりも下になった。これらの細胞はその後収縮したが、それでも末梢血の中で存続した。

実施例3：組み込まれたiC9安全スイッチを含むpiggyBacのヒト汎T細胞における発現と機能
Amaxa 4Dヌクレオフェクタを用いてヒト汎T細胞に4つのpiggyBacトランスポゾンのうちの1つをヌクレオフェクトした。「モック」条件を受け入れる改変されたT細胞には空のpiggyBacトランスポゾンをヌクレオフェクトした。改変されたT細胞は、治療剤（CARTyrinをコードする配列）だけを含むpiggyBacトランスポゾン、または組み込まれたiC9配列と治療剤（CARTyrinをコードする配列）を含むpiggyBacトランスポゾンを受けた。
図8は、iC9安全スイッチの模式図を提示しており、このiC9安全スイッチは、リガンド結合領域と、リンカーと、切断型カスパーゼ9ポリペプチドを含んでいる。具体的には、iC9ポリペプチドは、36位にフェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換（F36V）を有するFK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含むリガンド結合領域を含有している。いくつかの実施態様では、FKBP12ポリペプチドは、GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE（配列番号18026）を含むアミノ酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、FKBP12ポリペプチドは、GGGGTCCAGGTCGAGACTATTTCACCAGGGGATGGGCGAACATTTCCAAAAAGGGGCCAGACTTGCGTCGTGCATTACACCGGGATGCTGGAGGACGGGAAGAAAGTGGACAGCTCCAGGGATCGCAACAAGCCCTTCAAGTTCATGCTGGGAAAGCAGGAAGTGATCCGAGGATGGGAGGAAGGCGTGGCACAGATGTCAGTCGGCCAGCGGGCCAAACTGACCATTAGCCCTGACTACGCTTATGGAGCAACAGGCCACCCAGGGATCATTCCCCCTCATGCCACCCTGGTCTTCGATGTGGAACTGCTGAAGCTGGAG（配列番号18027）を含む核酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、リガンド結合領域に対して特異的な誘導剤は、36位にフェニルアラニン（F）からバリン（V）への置換（F36V）を有するFK506結合タンパク質12（FKBP12）ポリペプチドを含むことができる。誘導剤には、AP20187および／またはAP1903が含まれる（両方とも合成薬）。
本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、または誘導性カスパーゼポリペプチド、または切断型カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、リンカー領域は、GGGGS（配列番号18028）を含むアミノ酸配列、またはGGAGGAGGAGGATCC（配列番号18029）を含む核酸配列によってコードされている。いくつかの実施態様では、リンカーをコードする核酸配列は制限部位を含んでいない。
本開示の切断型カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、切断型カスパーゼ9ポリペプチドは、配列の87位にアルギニン（R）を含まないアミノ酸配列によってコードされている。その代わりに、またはそれに加えて、本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、または誘導性カスパーゼポリペプチド、または切断型カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、切断型カスパーゼ9ポリペプチドは、配列の282位にアラニン（A）を含まないアミノ酸配列によってコードされている。本開示の誘導性アポトーシス促進ポリペプチド、または誘導性カスパーゼポリペプチド、または切断型カスパーゼ9ポリペプチドのいくつかの実施態様では、切断型カスパーゼ9ポリペプチドは、GFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS（配列番号18030）を含むアミノ酸配列、またはGGATTTGGGGACGTGGGGGCCCTGGAGTCTCTGCGAGGAAATGCCGATCTGGCTTACATCCTGAGCATGGAACCCTGCGGCCACTGTCTGATCATTAACAATGTGAACTTCTGCAGAGAAAGCGGACTGCGAACACGGACTGGCTCCAATATTGACTGTGAGAAGCTGCGGAGAAGGTTCTCTAGTCTGCACTTTATGGTCGAAGTGAAAGGGGATCTGACCGCCAAGAAAATGGTGCTGGCCCTGCTGGAGCTGGCTCAGCAGGACCATGGAGCTCTGGATTGCTGCGTGGTCGTGATCCTGTCCCACGGGTGCCAGGCTTCTCATCTGCAGTTCCCCGGAGCAGTGTACGGAACAGACGGCTGTCCTGTCAGCGTGGAGAAGATCGTCAACATCTTCAACGGCACTTCTTGCCCTAGTCTGGGGGGAAAGCCAAAACTGTTCTTTATCCAGGCCTGTGGCGGGGAACAGAAAGATCACGGCTTCGAGGTGGCCAGCACCAGCCCTGAGGACGAATCACCAGGGAGCAACCCTGAACCAGATGCAACTCCATTCCAGGAGGGACTGAGGACCTTTGACCAGCTGGATGCTATCTCAAGCCTGCCCACTCCTAGTGACATTTTCGTGTCTTACAGTACCTTCCCAGGCTTTGTCTCATGGCGCGATCCCAAGTCAGGGAGCTGGTACGTGGAGACACTGGACGACATCTTTGAACAGTGGGCCCATTCAGAGGACCTGCAGAGCCTGCTGCTGCGAGTGGCAAACGCTGTCTCTGTGAAGGGCATCTACAAACAGATGCCCGGGTGCTTCAATTTTCTGAGAAAGAAACTGTTCTTTAAGACTTCC（配列番号18031）を含む核酸配列によってコードされている。
誘導性アポトーシス促進ポリペプチド（その中に切断型カスパーゼ9ポリペプチドが含まれる）のいくつかの実施態様では、誘導性アポトーシス促進ポリペプチドは、GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKVDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLEGGGGSGFGDVGALESLRGNADLAYILSMEPCGHCLIINNVNFCRESGLRTRTGSNIDCEKLRRRFSSLHFMVEVKGDLTAKKMVLALLELAQQDHGALDCCVVVILSHGCQASHLQFPGAVYGTDGCPVSVEKIVNIFNGTSCPSLGGKPKLFFIQACGGEQKDHGFEVASTSPEDESPGSNPEPDATPFQEGLRTFDQLDAISSLPTPSDIFVSYSTFPGFVSWRDPKSGSWYVETLDDIFEQWAHSEDLQSLLLRVANAVSVKGIYKQMPGCFNFLRKKLFFKTS（配列番号18032）を含むアミノ酸配列、またはggggtccaggtcgagactatttcaccaggggatgggcgaacatttccaaaaaggggccagacttgcgtcgtgcattacaccgggatgctggaggacgggaagaaagtggacagctccagggatcgcaacaagcccttcaagttcatgctgggaaagcaggaagtgatccgaggatgggaggaaggcgtggcacagatgtcagtcggccagcgggccaaactgaccattagccctgactacgcttatggagcaacaggccacccagggatcattccccctcatgccaccctggtcttcgatgtggaactgctgaagctggagggaggaggaggatccggatttggggacgtgggggccctggagtctctgcgaggaaatgccgatctggcttacatcctgagcatggaaccctgcggccactgtctgatcattaacaatgtgaacttctgcagagaaagcggactgcgaacacggactggctccaatattgactgtgagaagctgcggagaaggttctctagtctgcactttatggtcgaagtgaaaggggatctgaccgccaagaaaatggtgctggccctgctggagctggctcagcaggaccatggagctctggattgctgcgtggtcgtgatcctgtcccacgggtgccaggcttctcatctgcagttccccggagcagtgtacggaacagacggctgtcctgtcagcgtggagaagatcgtcaacatcttcaacggcacttcttgccctagtctggggggaaagccaaaactgttctttatccaggcctgtggcggggaacagaaagatcacggcttcgaggtggccagcaccagccctgaggacgaatcaccagggagcaaccctgaaccagatgcaactccattccaggagggactgaggacctttgaccagctggatgctatctcaagcctgcccactcctagtgacattttcgtgtcttacagtaccttcccaggctttgtctcatggcgcgatcccaagtcagggagctggtacgtggagacactggacgacatctttgaacagtgggcccattcagaggacctgcagagcctgctgctgcgagtggcaaacgctgtctctgtgaagggcatctacaaacagatgcccgggtgcttcaattttctgagaaagaaactgttctttaagacttcc（配列番号18033）を含む核酸配列によってコードされている。
iC9安全スイッチを調べるため、4つの改変されたT細胞のそれぞれを、0 nM、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1000 nMいずれかのAP1903（AP1903の誘導剤）とともに24時間インキュベートした。アポトーシスする細胞のマーカーとして蛍光インターカレータである7-アミノアクチノマイシンD（7-AAD）を用いて生存率をフローサイトメトリーによって評価した。
細胞の生存率を12日目に評価した（図10参照）。データは、iC9コンストラクトを含む細胞内の誘導剤の濃度が増加するにつれて細胞集団が右下の象限から左上の象限にシフトすることを示している。しかしこの効果は、iC9コンストラクトが欠けている細胞（CARTyrinだけを受けた細胞）では観察されず、その細胞では、細胞が誘導剤の濃度に関係なくこれら2つの領域に均等に分布している。さらに、細胞の生存率を19日目に評価した（図11参照）。データは、図10（ヌクレオフェクションしてから12日目）に示されているのと同じ傾向であることを明らかにしている。しかし左上象限への集団のシフトは、後者（ヌクレオフェクションしてから19日目）の時点でより顕著である。
凝集した結果を定量化し、図12に示してある。この図は、iC9安全スイッチが、12日目（図10と左側のグラフ）または19日目（図11と右側のグラフ）に、改変されたそれぞれの細胞のタイプについてiC9スイッチの誘導剤（AP1903）の濃度の関数として細胞の生存率に対して顕著な影響を持つことを示している。iC9安全スイッチが存在することで12日目までに大半の細胞でアポトーシスが誘導され、この効果は19日目までにより一層劇的になる。
この研究の結果は、iC9安 全スイッチが、誘導剤（例えばAP1903）と接触させたときに活性な細胞を除去するのに極めて有効であることを示している。なぜならAP1903は、この研究の最低濃度（0.1 nM）でさえアポトーシスを誘導するからである。さらに、iC9安全スイッチは、トリシストロンベクターの一部として機能的に発現する可能性がある。

実施例4：武装化T細胞上のチェックポイントシグナル伝達タンパク質のノックダウン効率
治療能力が増強された武装化T細胞を創出するためには、遺伝子改変を実施して免疫チェックポイントおよび／または代謝チェックポイントに対するT細胞の感受性をより小さくすることができる。武装化T細胞を生成させる1つの機構は、さまざまなチェックポイント受容体をノックアウトしてチェックポイントシグナル伝達を抑制することである。Cas-CLOVER（商標）プラットフォームを用い、休止（静止）中の初代汎T細胞の中のチェックポイント受容体PD-1、TGFβR2、LAG-3、Tim-3、CTLA-4を標的としてノックアウトした。フローサイトメトリーによって測定したとき、遺伝子編集によって細胞表面でのタンパク質発現が30～70％失われていた（図13）。これらの結果は、Cas-CLOVER（商標）がこれらの遺伝子のノックアウトを効率的に標的とすることができ、その結果としてT細胞の表面における標的タンパク質の発現が失われることを示している。ノックアウト効率は、ガイドRNAペアをさらに最適化することによって、または同じ遺伝子を標的とする、および／または標的遺伝子の調節因子またはプロモータを標的とする追加ガイドRNAペアを用いることによって、顕著に大きくすることができる。

実施例5：武装化T細胞上でヌル細胞内シグナル伝達タンパク質またはスイッチ細胞内シグナル伝達タンパク質を発現させるための戦略
武装化T細胞を生成させるための別の戦略は、改変された細胞内シグナル伝達ドメインを持つか細胞内シグナル伝達ドメインがないさまざまな改変された／キメラチェックポイント受容体を発現させることによって内在性チェックポイントシグナル伝達を低下させるか抑制するというものである。この戦略を利用して標的にすることができると考えられるチェックポイントシグナルに含まれるのは、T細胞のPD-1またはTGFβRIIであり、これらはそれぞれPD-L1リガンドとTGFβサイトカインに結合する。図14は、2つの異なる抑制性受容体（PD-1（上図）とTGFβRII（下図））に関してデコイ／ヌル／ドミナントネガティブ受容体（ヌル受容体）を生成させるためのさまざまな戦略の模式図を示している。ヌル受容体を設計するには、PD-1またはTGFβRIIの細胞内ドメイン（ICD）を変異させる（変異型ヌル）か欠失させる（切断型ヌル）ことができる。その結果、ヌル受容体のコグネイトリガンドの結合によってチェックポイントシグナルがT細胞に送達されることはない。さらに、ヌル受容体は、内在性リガンドの結合に関して野生型受容体と競合するため、ヌル受容体によるあらゆる結合が、内在性リガンドが野生型受容体に結合するのを阻止する。その結果として、T細胞に有効に送達されるチェックポイントシグナル伝達の全体レベルが低下し、しがたってチェックポイント抑制が低下する、または阻止される。図15も、抑制性受容体であるPD-1（上図）とTGFβRII（下図）のスイッチ受容体設計戦略を示している。スイッチ受容体では、野生型ICDが、免疫刺激性分子（共刺激性スイッチ）または異なる抑制性分子（抑制性スイッチ）からのICDで置き換えられている。免疫刺激性分子の非限定的な例に含まれるのは、CD3z、CD28、4-1BBと、表1に掲載されている例である。抑制性分子の非限定的な例に含まれるのは、CTLA4、PD1、Lag3と、表1および表9に掲載されている例である。前者の場合には、内在性リガンドが改変されたスイッチ受容体に結合すると正のシグナルがT細胞に送達されることで、T細胞の刺激を増強することを助け、腫瘍を標的として殺傷することの継続が容易になる。後者の場合には、内在性リガンドが改変されたスイッチ受容体に結合すると負のシグナルがT細胞に送達されることで、T細胞の刺激と活性を低下させるのを助ける。

実施例6：武装化T細胞上でのPD1とTGFβRIIのヌル細胞内シグナル伝達タンパク質とスイッチ細胞内シグナル伝達タンパク質の表面発現を増強する
武装化T細胞を創出するため、代替シグナルペプチド（SP）と膜貫通ドメイン（TM）を発現する多数の切断型ヌル受容体を設計し、改変されたT細胞の表面で発現が最大になるものを探した。図15Aは、PD-1（上）とTGFβRII（下）のためのいくつかのヌル受容体コンストラクトの模式図を示している。これらタンパク質の細胞外ドメイン（ECD）を改変し、野生型シグナルペプチド（SP）および／または膜貫通ドメイン（TM）をヒトT細胞CD8a受容体からのもの（赤い矢印）で置き換えた。図15Aに示した6つの切断型ヌルコンストラクトそれぞれのDNAを合成した後、mRNA IVT DNAベクター（pRT）にサブクローニングした。それぞれについてIVTを通じて高品質mRNAを生成させた。6つの分子のそれぞれをコードするmRNAを、電気穿孔（EP）を利用したトランスフェクションを実施することによって初代ヒトT細胞の中に送達し、EPの24時間後にFACS分析を実施して細胞表面での各コンストラクトの発現レベルを評価した（図15B）。フローサイトメトリーによれば、WT SPを代替CD8a（02.8aSP-PD-1と02.8aSP-TGFβRII）で置換するとT細胞の表面での発現が最高レベルになった。02.8aSP-PD-1ヌル受容体はMFIが43,680を示し、これは内在性T細胞PD-1の発現の177倍であり、野生型PD-1ヌル受容体の2.8倍である。02.8aSP-TGFβRIIヌル受容体はMFIが13,809を示した。これは内在性T細胞TGFβRIIの発現の102倍であり、野生型TGFβRIIヌル受容体の1.8倍である。これらの結果は、抑制性タンパク質PD1とTGFβRIIの両方で野生型SPを代替CD8a SPで置き換えると、表面でのヌル受容体またはスイッチ受容体の発現が増大することを示している。このことが今度は、内在性リガンドが結合したとき、それぞれチェックポイント抑制または共刺激を最大化するのに役立つことになろう。

実施例7：改変されたT細胞の中で発現させるためのNF-KB誘導性ベクターの設計
2つのT細胞活性化NF-KB誘導性ベクターを開発した（図16Aと図16B）。一方は順方向（A）の遺伝子発現系（GES）を持ち、他方は相補的な方向（B）であり、両方とも構成的EF1aプロモータよりも前にある。これらベクターは、T2A配列によって隔てられたCAR分子とDHFR選択遺伝子の発現も指令する。条件的NF-KB誘導系と、EF1aに指令される遺伝子の両方とも、EPを利用してT細胞の中に恒久的に組み込むことができるpiggyBacトランスポゾンの一部である。T細胞は、ゲノムに組み込まれると、膜表面にCARを、細胞内にDHFRを構成的に発現するのに対し、NF-KB誘導性遺伝子GFPは、T細胞が活性化されたときにだけ最大レベルで発現することになる。

実施例8：改変されたT細胞の中でGFPを発現させるためのNF-KB誘導性ベクター
順方向（pNFKB-GFP順）または逆方向（pNFKB-GFP逆）でGFPの発現を駆動するNF-KB誘導性発現系の不在（遺伝子発現系（GES）なし対照）下または存在下にて、EF1aプロモータの制御下で抗BCMA CARとDHFR突然変異タンパク質遺伝子を発現するpiggyBacベクターをT細胞にヌクレオフェクトした。細胞がほぼ完全に休止する（19日目）まで、細胞をメトトレキサート選択の存在下で培養し、GFPの発現を5日目と19日目に評価した。5日目、すべてのT細胞が増殖していて強く刺激されており、NF-KB誘導性発現カセットを有する細胞は、強いNF-κB活性のために高レベルのGFPを生じさせた（図17参照）。GESなし対照細胞は、検出可能なレベルのGFPを発現しなかった。19日目までにGES T細胞はほぼ完全に休止しており、GFPの発現は5日目よりも有意に少なかった（約1/8のMFI）。というのもNF-κB活性がより低いからである。GFPの発現は19日目にまだ観察される。それは、GFPタンパク質の半減期が長いこと（約30時間）、または例えばTCR、CAR、サイトカイン受容体、増殖因子受容体シグナルのいずれかを通じたNF-κB活性の基礎レベルが原因である可能性がある。

実施例9：改変されたT細胞の中で抗BCMA CARを媒介としてGFPを発現させるためのNF-KB誘導性ベクター
T細胞は、改変されていない（モックT細胞）か、順方向（pNFKB-GFP順）または逆方向（pNFKB-GFP逆）でGFPの発現を駆動するNF-KB誘導性発現系の不在（GESなし対照）下または存在下にて、EF1aプロモータの制御下で抗BCMA CARとDHFR突然変異タンパク質遺伝子を発現するpiggyBacベクターをヌクレオフェクトされた。すべての細胞を、細胞がほぼ完全に休止するまで、メトトレキサート選択あり、またはなし（モックT細胞）で22日間培養した。次に細胞を、BCMA-（K562）、BMCA+（RPMI 8226）、陽性対照である抗CD3抗CD28活性化試薬（CD3/28刺激）いずれかの不在下（刺激なし）または存在下で3日間刺激した。GFPの発現は、GESなし対照、またはモックT細胞では、すべての条件下で検出できなかった。しかしpNFKB-GFP順とpNFKB-GFP逆を用いて転移された細胞は、BCMA- K562細胞とともに培養したときには、刺激なし対照を上回るGFPの発現をほとんど示さなかったが、その両方とも、BCMA+ 腫瘍細胞の存在下、または陽性対照条件下では、遺伝子発現の劇的な上方調節を示した（図18）。pNFKB-GFP順とpNFKB-GFP逆を用いて転移された細胞をBCMA+ 腫瘍細胞とともに培養すると、両者の間でGFP発現の差はほとんど観察されなかった。

実施例10：改変されたT細胞における抗BCMA CARを媒介とした発現の制御
誘導性遺伝子の発現レベルは、誘導性プロモータよりも上流または前にある反応エレメントの数によって調節することができる。T細胞に、抗BCMA CARTyrinとその後に続く選択遺伝子（その両方ともヒトEF1aプロモータの制御下にある）をコードするpiggyBacベクターをヌクレオフェクトした（図19）。さらに、ベクターは、切断型CD19タンパク質（dCD19）の発現を駆動する条件的NF-KB誘導性遺伝子発現系を追加してコードしていて、0個から5個まで変化する数のNFKB反応エレメント（RE）を含み、GESはなし（GESなし）であるベクター、または、電気穿孔パルスを受け取るが、piggyBac核酸は受け取らないベクター（モック）であった。データは、逆（反対）方向／向きのGESだけについて示してある。すべての細胞を18日間培養し、メトトレキサート添加を利用したpiggyBac改変T細胞の選択を含んでいた。次に、抗CD3抗CD28ビーズ活性化試薬を用いて細胞を3日間刺激し、表面でのdCD19の発現をFACSによって0日目、3日目、18日目に評価し、データをFACSヒストグラムおよび標的タンパク質染色のMFIとして示した。表面でのdCD19の発現は、GESをコードするベクターを用いて転移されたすべてのT細胞で0日目に低レベルで検出された。刺激後3日目、dCD19発現の劇的な上方調節が、GESを発現しているすべてのT細胞で観察され、REの数がより多いT細胞では表面発現の増加倍率がより大きかった。したがって表面でのdCD19の発現は、GESの中にコードされているREの数に直接比例していた。GESを含まないT細胞（GESなしとモック対照）の表面ではdCD19がまったく検出されなかった

参照による組み込み
本明細書で引用されているあらゆる文書は、相互参照されているあらゆる特許や出願、関連するあらゆる特許や出願を含め、明示的に除外されていたり、それ以外の制限があったりする場合を除き、その全体が、参照によって本明細書に組み込まれている。どの文書の引用も、その文書が、本明細書の中で開示されたり権利請求されたりしている任意の発明に関する先行技術であると認めていることではないし、その文書が、単独で、または他の任意の参考文献との任意の組み合わせで、そのような任意の発明を教示、または示唆、または開示していると認めていることではない。さらに、本文書中の用語の意味または定義が、参照によって組み込まれている文書中の同じ用語の意味または定義と矛盾する場合には、本文書中のその用語に付与された意味または定義が優先する。
他の実施態様
本開示の特定の実施態様を図示して説明してきたが、本開示の精神と範囲を逸脱することなく、他のさまざまな変化や変更が可能である。添付の請求の範囲には、本開示の範囲に入るそのようなあらゆる変化と変更が含まれる。

Claims (33)

  1. （ａ）前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）に特異的に結合する少なくとも１つのセンチリンを含む抗原認識領域を含むエクトドメインと；
    （ｂ）膜貫通ドメインと；
    （ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含むエンドドメイン
    を含み、
    ＰＳＭＡに特異的に結合する前記少なくとも１つのセンチリンが、配列番号１８００２のアミノ酸配列を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
  2. 前記エクトドメインがシグナルペプチドをさらに含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
  3. 前記エクトドメインが、前記抗原認識領域と前記膜貫通ドメインの間にヒンジをさらに含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
  4. 前記シグナルペプチドが、ヒトのＣＤ２シグナルペプチド、ＣＤ３δシグナルペプチド、ＣＤ３εシグナルペプチド、ＣＤ３γシグナルペプチド、ＣＤ３ζシグナルペプチド、ＣＤ４シグナルペプチド、ＣＤ８αシグナルペプチド、ＣＤ１９シグナルペプチド、ＣＤ２８シグナルペプチド、４－１ＢＢシグナルペプチド、ＧＭ－ＣＳＦＲシグナルペプチドのいずれかをコードするアミノ酸配列を含む、請求項２に記載のＣＡＲ。
  5. 前記シグナルペプチドが、ヒトＣＤ８αシグナルペプチドをコードするアミノ酸配列を含む、請求項４に記載のＣＡＲ。
  6. 前記ヒトＣＤ８αシグナルペプチドが、配列番号１８００４のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載のＣＡＲ。
  7. 前記膜貫通ドメインが、ヒトのＣＤ２膜貫通ドメイン、ＣＤ３δ膜貫通ドメイン、ＣＤ３ε膜貫通ドメイン、ＣＤ３γ膜貫通ドメイン、ＣＤ３ζ膜貫通ドメイン、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、ＣＤ１９膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、４－１ＢＢ膜貫通ドメイン、ＧＭ－ＣＳＦＲ膜貫通ドメインのいずれかをコードするアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
  8. 前記膜貫通ドメインが、ヒトＣＤ８α膜貫通ドメインをコードするアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のＣＡＲ。
  9. 前記ヒトＣＤ８α膜貫通ドメインが、配列番号１８００６のアミノ酸配列を含む、請求項８に記載のＣＡＲ。
  10. 前記エンドドメインが、ヒトＣＤ３ζエンドドメインを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
  11. 前記少なくとも１つの共刺激ドメインが、ヒトの４－１ＢＢ細胞内セグメント、ＣＤ２８細胞内セグメント、ＣＤ４０細胞内セグメント、ＩＣＯＳ細胞内セグメント、ＭｙＤ８８細胞内セグメント、ＯＸ－４０細胞内セグメントのいずれか、またはこれらの任意の組み合わせを含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
  12. 前記少なくとも１つの共刺激ドメインが、ヒトの４－１ＢＢ共刺激ドメインを含む、請求項１１に記載のＣＡＲ。
  13. 前記ヒトＣＤ３ζエンドドメインが、配列番号１８００８のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載のＣＡＲ。
  14. 前記ヒト４－１ＢＢ共刺激ドメインが、配列番号１８０１２のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載のＣＡＲ。
  15. 前記ヒンジが、ヒトのＣＤ８α配列、ＩｇＧ４配列、ＣＤ４配列、またはそれらの任意の組み合わせに由来するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載のＣＡＲ。
  16. 前記ヒンジが、ヒトＣＤ８αに由来するアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載のＣＡＲ。
  17. ヒトＣＤ８αに由来する前記配列が、配列番号１８０１４のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載のＣＡＲ。
  18. 請求項１に記載のＣＡＲと、医薬として許容可能な少なくとも１つの担体を含む組成物。
  19. 請求項１に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を含むトランスポゾン。
  20. 請求項１９に記載のトランスポゾンを含む組成物。
  21. 請求項１に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を含むベクター。
  22. 請求項２１に記載のベクターを含む組成物。
  23. 請求項１に記載のＣＡＲを含む細胞。
  24. 請求項１９に記載のトランスポゾンを含む細胞。
  25. 請求項２１に記載のベクターを含む細胞。
  26. 免疫細胞である、請求項２３に記載の細胞。
  27. 前記免疫細胞が、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）様細胞、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞、造血前駆細胞、末梢血（ＰＢ）由来Ｔ細胞、臍帯血（ＵＣＢ）由来Ｔ細胞のいずれかである、請求項２６に記載の細胞。
  28. 自己由来である、請求項２３に記載の細胞。
  29. 細胞の集団を含む組成物であって、前記集団の複数の細胞が、請求項２３に記載の細胞を含む組成物。
  30. 改変されたＴ細胞の集団を製造する方法であって、
    （ａ）請求項１に記載のＣＡＲをコードする核酸配列を含む組成物を、複数のＴ細胞に導入することにより、改変されたＴ細胞の集団を生成させ；
    （ｂ）この改変されたＴ細胞の集団を、前記ＣＡＲをコードする核酸配列の組み込みに適した条件下で培養し；
    （ｃ）細胞表面に前記ＣＡＲを発現する前記改変されたＴ細胞の集団からの少なくとも１個の細胞を増殖させること、および／または選択すること
    を含む方法。
  31. 配列番号１８０７０のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のＣＡＲ。
  32. （ａ）ヒトＣＤ８αシグナルペプチド及び抗原認識領域を含むエクトドメインであって、ここで前記抗原認識領域が、ＰＳＭＡに特異的に結合する少なくとも１つのセンチリンを含む、エクトドメインと；
    （ｂ）ヒトＣＤ８αヒンジドメインを含むヒンジドメインと；
    （ｃ）ヒトＣＤ８α膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインと；
    （ｄ）ヒト４－１ＢＢ共刺激ドメイン及びヒトＣＤ３ζエンドドメインを含むエンドドメイン、
    を含み、
    ＰＳＭＡに特異的に結合する前記少なくとも１つのセンチリンが、配列番号１８００２のアミノ酸配列を含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）。
  33. 前記ヒトＣＤ８αシグナルペプチドが配列番号１８００４のアミノ酸配列を含み、
    前記ヒトＣＤ８αヒンジドメインが配列番号１８０１４のアミノ酸配列を含み、
    前記ヒトＣＤ８α膜貫通ドメインが配列番号１８００６のアミノ酸配列を含み、
    前記ヒト４－１ＢＢ共刺激ドメインが配列番号１８０１２のアミノ酸配列を含み、そして
    前記ヒトＣＤ３ζエンドドメインが配列番号１８００８のアミノ酸配列を含む、
    請求項３２に記載のＣＡＲ。
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JP (1) JP7399866B2 (ja)
KR (1) KR20200140270A (ja)
CN (1) CN112601583A (ja)
AU (1) AU2019230192A1 (ja)
BR (1) BR112020018049A2 (ja)
CA (1) CA3092947A1 (ja)
IL (1) IL277079A (ja)
MX (1) MX2020009309A (ja)
SG (1) SG11202008659TA (ja)
TW (1) TW202017592A (ja)
WO (1) WO2019173636A1 (ja)
ZA (1) ZA202005556B (ja)

Families Citing this family (56)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10961310B2 (en) 2017-03-15 2021-03-30 Pandion Operations, Inc. Targeted immunotolerance
CN108728477B (zh) * 2017-04-24 2022-02-22 华东理工大学 一种高效的转座突变系统及构建方法
BR112019024127A2 (pt) 2017-05-24 2020-06-23 Pandion Therapeutics, Inc. Imunotolerância alvejada
US10946068B2 (en) 2017-12-06 2021-03-16 Pandion Operations, Inc. IL-2 muteins and uses thereof
US10174092B1 (en) 2017-12-06 2019-01-08 Pandion Therapeutics, Inc. IL-2 muteins
US20210189337A1 (en) * 2018-03-28 2021-06-24 Board Of Regents, The University Of Texas System Use of histone modifiers to reprogram effector t cells
EP3847197A1 (en) * 2018-09-05 2021-07-14 Poseida Therapeutics, Inc. Allogeneic cell compositions and methods of use
US20220042038A1 (en) 2018-12-20 2022-02-10 Poseida Therapeutics, Inc. Nanotransposon compositions and methods of use
CN114679909A (zh) 2019-05-20 2022-06-28 潘迪恩运营公司 MAdCAM靶向的免疫耐受
CA3149892A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Eric M. Ostertag Allogeneic cell compositions and methods of use
AU2020363697A1 (en) * 2019-10-07 2022-04-07 Fate Therapeutics, Inc. Enhanced chimeric antigen receptor for immune effector cell engineering and use thereof
US20230079955A1 (en) 2019-12-20 2023-03-16 Poseida Therapeutics, Inc. Anti-muc1 compositions and methods of use
GB201919019D0 (en) * 2019-12-20 2020-02-05 Autolus Ltd Antigen-binding domain
US20230085945A1 (en) * 2020-02-25 2023-03-23 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Orthogonal safety switches to eliminate genetically engineered cells
JP2023515692A (ja) 2020-03-04 2023-04-13 ポセイダ セラピューティクス，インコーポレイティド 代謝性肝障害の治療のための組成物と方法
EP4118107A1 (en) 2020-03-11 2023-01-18 Poseida Therapeutics, Inc. Chimeric stimulatory receptors and methods of use in t cell activation and differentiation
CN111458517B (zh) * 2020-03-13 2022-08-16 深圳大学 Selenof作为阿尔茨海默病药物靶点的应用
US20210324332A1 (en) 2020-03-27 2021-10-21 Dcprime B.V. Ex vivo use of modified cells of leukemic origin for enhancing the efficacy of adoptive cell therapy
BR112022020333A2 (pt) 2020-04-10 2022-11-22 Juno Therapeutics Inc Métodos e usos relacionados à terapia celular projetada com um receptor de antígeno quimérico que alveja o antígeno de maturação de células b
IL297025A (en) 2020-04-14 2022-12-01 Poseida Therapeutics Inc Preparations and methods for use in cancer treatment
CN112194719A (zh) * 2020-09-01 2021-01-08 中日友好医院(中日友好临床医学研究所) Crt抗原和mage-a1抗原的制备及其应用
US20240000969A1 (en) 2020-10-21 2024-01-04 Poseida Therapeutics San Diego Compositions and methods for delivery of nucleic acids
US20220168407A1 (en) 2020-11-05 2022-06-02 Dcprime B.V. Use of tumor-independent antigens in immunotherapies
CN112480242B (zh) * 2020-12-04 2023-06-06 中国人民解放军陆军军医大学 Spink7蛋白在制备预防和/或治疗溃疡性结肠炎的药物中的应用
CN112574291B (zh) * 2020-12-14 2022-10-21 上海交通大学 一种生物活性肽shrkfsaprhgslgflpr及其制备方法和应用
CN112625142B (zh) * 2021-02-03 2023-05-09 郑州大学第一附属医院 Cxcl9修饰的car-t结构及其应用
WO2022170184A1 (en) * 2021-02-05 2022-08-11 University Of Cincinnati Lipocalin 10 as a therapeutic agent for inflammation-induced organ dysfunction
CA3208993A1 (en) 2021-02-23 2022-09-01 Joshua RYCHAK Compositions and methods for delivery of nucleic acids
US20240060090A1 (en) 2021-02-23 2024-02-22 Poseida Therapeutics, Inc. Genetically modified induced pluripotent stem cells and methods of use thereof
WO2022187671A1 (en) 2021-03-04 2022-09-09 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for the treatment of hemophilia
AU2022253223A1 (en) * 2021-04-07 2023-09-28 Century Therapeutics, Inc. Combined artificial cell death/reporter system polypeptide for chimeric antigen receptor cell and uses thereof
AU2022257093A1 (en) 2021-04-16 2023-11-02 Celgene Corporation T cell therapy in patients who have had prior stem cell transplant
EP4082560A1 (en) * 2021-04-27 2022-11-02 Academia Sinica Methods of treating hypertriglyceridemia or hypertriglyceridemia related diseases
CN115477705B (zh) * 2021-06-16 2024-02-23 四川大学华西医院 一种基于颗粒酶b构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用
WO2023060089A2 (en) 2021-10-04 2023-04-13 Poseida Therapeutics, Inc. Transposases and uses thereof
WO2023060088A1 (en) 2021-10-04 2023-04-13 Poseida Therapeutics, Inc. Transposon compositions and methods of use thereof
WO2023081735A1 (en) 2021-11-03 2023-05-11 Celgene Corporation Chimeric antigen receptors specific for b-cell maturation antigen for use in treating myeloma
CN114716564B (zh) * 2021-12-20 2023-02-28 四川大学华西医院 基于sectm1构建的嵌合抗原受体免疫细胞制备及其应用
CN113999873B (zh) * 2021-12-31 2022-05-20 北京市疾病预防控制中心 一种基因修饰的非人动物的构建方法及其应用
CN114470225B (zh) * 2022-01-20 2023-09-12 苏州市立医院 一种重组人cdc5l融合蛋白水凝胶、制备方法及应用
WO2023141576A1 (en) 2022-01-21 2023-07-27 Poseida Therapeutics, Inc. Compositions and methods for delivery of nucleic acids
WO2023147515A1 (en) 2022-01-28 2023-08-03 Juno Therapeutics, Inc. Methods of manufacturing cellular compositions
CN114113639B (zh) * 2022-01-29 2022-04-19 北京大有天弘科技有限公司 一种血型抗体检测方法及其应用
WO2023152498A1 (en) 2022-02-09 2023-08-17 Horizon Discovery Limited Polynucleotides with selection markers
WO2023164573A1 (en) 2022-02-23 2023-08-31 Poseida Therapeutics, Inc. Genetically modified cells and methods of use thereof
CN114573678B (zh) * 2022-03-11 2022-12-27 中山大学 一种Rheb蛋白激活剂及其应用
CN114644685B (zh) * 2022-04-07 2023-07-04 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种可拮抗hnRNPK蛋白RNA结合活性的多肽HIP-15及其应用
WO2023220641A2 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Juno Therapeutics, Inc. Methods and uses related to t cell therapy and production of same
WO2023220655A1 (en) 2022-05-11 2023-11-16 Celgene Corporation Methods to overcome drug resistance by re-sensitizing cancer cells to treatment with a prior therapy via treatment with a t cell therapy
CN114748498A (zh) * 2022-05-13 2022-07-15 南京大学 针对CBFβ的shRNA在制备治疗结直肠癌药物中的应用
WO2023230581A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Celgene Corporation Methods of manufacturing t cell therapies
WO2023230548A1 (en) 2022-05-25 2023-11-30 Celgene Corporation Method for predicting response to a t cell therapy
WO2023235897A2 (en) * 2022-06-03 2023-12-07 Oyster Point Pharma. Inc. Aav vector encoding diamine oxidase and uses thereof
WO2024036273A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Poseida Therapeutics, Inc. Chimeric cd8-alpha co-receptor compositions and methods of use
WO2024073440A1 (en) 2022-09-27 2024-04-04 Genentech, Inc. Inhibition of genotoxic stress to improve t cell engineering
CN116574193A (zh) * 2023-05-10 2023-08-11 浙江大学 一种可抑制肿瘤坏死因子的简化巨球蛋白及合成方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016179518A2 (en) 2015-05-06 2016-11-10 Janssen Biotech, Inc. Prostate specific membrane antigen (psma) bispecific binding agents and uses thereof
WO2016179534A2 (en) 2015-05-06 2016-11-10 Janssen Biotech, Inc. Prostate specific membrane antigen binding fibronectin type iii domains
WO2018014038A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Poseida Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors and methods for use

Family Cites Families (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4309989A (en) 1976-02-09 1982-01-12 The Curators Of The University Of Missouri Topical application of medication by ultrasound with coupling agent
GB2097032B (en) 1981-04-22 1984-09-19 Teron International Urban Dev A combined ceiling air and services distribution system mechanical chasse and structural roof member
US4656134A (en) 1982-01-11 1987-04-07 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Gene amplification in eukaryotic cells
US4818542A (en) 1983-11-14 1989-04-04 The University Of Kentucky Research Foundation Porous microspheres for drug delivery and methods for making same
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US4965188A (en) 1986-08-22 1990-10-23 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences using a thermostable enzyme
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4766067A (en) 1985-05-31 1988-08-23 President And Fellows Of Harvard College Gene amplification
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US4767402A (en) 1986-07-08 1988-08-30 Massachusetts Institute Of Technology Ultrasound enhancement of transdermal drug delivery
US4889818A (en) 1986-08-22 1989-12-26 Cetus Corporation Purified thermostable enzyme
US4921794A (en) 1987-01-14 1990-05-01 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US4795699A (en) 1987-01-14 1989-01-03 President And Fellows Of Harvard College T7 DNA polymerase
US5130238A (en) 1988-06-24 1992-07-14 Cangene Corporation Enhanced nucleic acid amplification process
US5066584A (en) 1988-09-23 1991-11-19 Cetus Corporation Methods for generating single stranded dna by the polymerase chain reaction
US5091310A (en) 1988-09-23 1992-02-25 Cetus Corporation Structure-independent dna amplification by the polymerase chain reaction
US5142033A (en) 1988-09-23 1992-08-25 Hoffmann-La Roche Inc. Structure-independent DNA amplification by the polymerase chain reaction
US4994370A (en) 1989-01-03 1991-02-19 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services DNA amplification technique
US5266491A (en) 1989-03-14 1993-11-30 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. DNA fragment and expression plasmid containing the DNA fragment
US5580734A (en) 1990-07-13 1996-12-03 Transkaryotic Therapies, Inc. Method of producing a physical map contigous DNA sequences
ATE240740T1 (de) 1991-03-15 2003-06-15 Amgen Inc Pegylation von polypeptiden
US5641670A (en) 1991-11-05 1997-06-24 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5968502A (en) 1991-11-05 1999-10-19 Transkaryotic Therapies, Inc. Protein production and protein delivery
US5643252A (en) 1992-10-28 1997-07-01 Venisect, Inc. Laser perforator
US6019968A (en) 1995-04-14 2000-02-01 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
US5730723A (en) 1995-10-10 1998-03-24 Visionary Medical Products Corporation, Inc. Gas pressured needle-less injection device and method
IL120943A (en) 1997-05-29 2004-03-28 Univ Ben Gurion A system for administering drugs through the skin
ATE238035T1 (de) 1997-09-29 2003-05-15 Inhale Therapeutic Syst Perforierte mikropartikel und deren verwendung
US20130266551A1 (en) * 2003-11-05 2013-10-10 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Chimeric receptors with 4-1bb stimulatory signaling domain
EP2465538A3 (en) * 2004-10-21 2013-11-20 Ono Pharmaceutical Co., Ltd. Use of immunesuppressant receptor
US10927384B2 (en) 2014-04-09 2021-02-23 Dna Twopointo Inc. DNA vectors, transposons and transposases for eukaryotic genome modification
GB201416960D0 (en) * 2014-09-25 2014-11-12 Antikor Biopharma Ltd Biological materials and uses thereof
GB201602563D0 (en) * 2016-02-12 2016-03-30 Autolus Ltd Signalling system
KR20190101979A (ko) * 2016-12-02 2019-09-02 유니버시티 오브 써던 캘리포니아 합성 면역 수용체 및 이의 사용 방법

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016179518A2 (en) 2015-05-06 2016-11-10 Janssen Biotech, Inc. Prostate specific membrane antigen (psma) bispecific binding agents and uses thereof
WO2016179534A2 (en) 2015-05-06 2016-11-10 Janssen Biotech, Inc. Prostate specific membrane antigen binding fibronectin type iii domains
WO2018014038A1 (en) 2016-07-15 2018-01-18 Poseida Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors and methods for use

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Production of Universal Anti-BCMA CAR T Cells with Reduced Alloreactivity, but Potent Effector Function for the Treatment of Multiple Myeloma，59th ASH Annual Meeting & Exposition [online]，2017年，[令和５年１月２６日検索]，http://cms.cws.net/content/beta.myelomasociety.org/files/2017ash/Shedlock,%20D-171210%20Poseida%20ASH%20for%20IMS.PDF
PSMA-specific CARTyrin T-stem cell memory therapy eliminates solid tumor in subcutaneous prostate cancer model，Journal for ImmunoTherapy of Cancer，2017年，Vol.5, Suppl. 2，p.236-237, P490，32nd Annual Meeting and Pre-Conference Programs of the Society for Immunotherapy of Cancer (SITC 2017): Part Two
Versatile CAR T-cells for cancer immunotherapy，Contemp Oncol (Pozn).，2018年03月，Vol.22, No.1A，p.73-80

Also Published As

Publication number Publication date
US20210107993A1 (en) 2021-04-15
CN112601583A (zh) 2021-04-02
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