CN114113639B - 一种血型抗体检测方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种血型抗体检测方法，一种血型抗体检测试剂盒、一种血型抗体结合蛋白、一种编码血型抗体结合蛋白的核酸及包含该核酸的载体。特别是，上述血型抗体结合蛋白包含与SEQ ID NO：2、4、6、8或10具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示氨基酸序列，具备抗原特异性，可以用于血型抗体检测。

Description

一种血型抗体检测方法及其应用
技术领域
此本发明涉及血型抗体和抗原技术领域，具体涉及一种血型抗体检测方法和在生物医药领域的应用。
背景技术
Duffy血型是发现比较早的一种血型系统，1950年，Cusbush等人在一名多次输血导致溶血反应的患者血清中发现了Fya抗体，由于该患者姓Duffy，把这个新发现的血型命名为Duffy血型。一年后，Ikin等人发现了与Fya抗体相对应的Fyb抗体。1995年，国际输血协会将Duffy血型系统编号为008。Fya抗原与Fyb抗原在胎儿出生时就发育完全，在怀孕初期6-7周就可以检测到该抗原的存在。Duffy血型因其在临床应用中的重要意义而备受关注，最新研究显示，Duffy血型不仅与输血安全及母婴血型不合引起的新生儿溶血病有关，而且Duffy抗原可作为趋化因子在人类疟原虫受体、炎症、自身免疫性疾病、肿瘤、移植排斥等方面发挥作用。
MNSs血型是继ABO血型后被检出的第二个血型，在稀有血型中MNs抗原的多态性数目仅次于Rh血型系统。1927年，生物学家卡尔·兰德斯坦纳和菲利普·列文（PhilipLevine）在将人类血液输入家兔体内以获得特异性抗体时，发现了M和N抗原。1947年，Walsh和Montgomery发现了另一种抗原，取名S，Sanger等证明此抗原与MN型连锁。1951年列文等又进一步发现了S的对偶抗原s。MNS血型系统包括超过40种抗原，其中四种最为重要，分别称为M、N、S、s抗原，它们对应的抗体都与输血反应有关。M、N、S、s抗原均为糖蛋白，与MN有关的糖蛋白称为血型糖蛋白A（glycophorins A，GPA），与Ss有关的称为血型糖蛋白B（glycophorins B，GPB）。
目前，血型抗体的检测技术主要是利用抗体鉴定谱细胞，该方法存在鉴定谱细胞保存期短，无法直接鉴定单一抗体等问题，因此重组蛋白的合成对抗体鉴定至关重要。但是，由于血型抗原存在多个跨膜区和疏水区，均无法全长表达，因此选择合适的序列进行表达是目前亟待解决的问题，若序列选择不合适则会出现无抗原性等问题。
发明内容
本发明的第一方面，提供了一种血型抗体检测方法，所述的血型抗体检测方法包括使待测物与血型抗体结合蛋白混合。
优选的，所述的血型为Duffy或MNS血型。
优选的，所述的血型抗体结合蛋白为可溶性蛋白，优选的，所述的血型抗体结合蛋白为Fya、Fyb、S、s或N血型抗体结合蛋白。
优选的，所述的血型抗体结合蛋白长度为50-150aa。
优选的，所述的Fya或Fyb血型抗体结合蛋白长度为55-70aa，进一步优选的，所述的Fya或Fyb血型抗体结合蛋白长度为66aa。
优选的，所述的S或s血型抗体结合蛋白长度为50-70aa，进一步优选的，所述的S或s血型抗体结合蛋白长度为59aa。
优选的，所述的N血型抗体结合蛋白长度为80-150aa，进一步优选的，所述的N血型抗体结合蛋白长度为91aa。
优选的，所述的血型抗体结合蛋白包含与SEQ ID NO：2、4、6、8或10具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示氨基酸序列。
优选的，所述的Fya血型抗体结合蛋白包含与SEQ ID NO：2具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。
优选的，所述的Fyb血型抗体结合蛋白包含与SEQ ID NO：4具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列。
优选的，所述的S血型抗体结合蛋白包含与SEQ ID NO：6具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列。
优选的，所述的s血型抗体结合蛋白包含与SEQ ID NO：8具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：8所示氨基酸序列。
优选的，所述的N血型抗体结合蛋白包含与SEQ ID NO：10具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：10所示氨基酸序列。
优选的，所述的血型抗体为Fya、Fyb、S、s和/或N抗体。
优选的，所述的待测物为全血、血清、血浆或待测血型抗体。
优选的，所述的检测方法检测血型抗体的有无或含量。
优选的，所述的血型抗体检测方法选自微柱凝胶法、沉淀反应、凝集试验、补体结合试验、标记免疫测定、免疫印迹法、快速测定法。优选的，所述的标记免疫测定选自酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定，所述的快速测定法选自快速斑点免疫结合试验、液相芯片法。
优选的，所述的血型抗体检测方法可以获得血型检测结果。
本发明的第二方面，提供了一种血型抗体结合蛋白，所述的血型抗体结合蛋白为Duffy或MNS血型抗体结合蛋白。
优选的，所述的血型抗体结合蛋白为可溶性蛋白，进一步优选的，所述的血型抗体结合蛋白为Fya、Fyb、S、s或N血型抗体结合蛋白。
优选的，所述的血型抗体选自Fya、Fyb、S、s或N抗体。
优选的，所述的血型抗体结合蛋白包含与SEQ ID NO：2、4、6、8或10具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示氨基酸序列。
优选的，所述的Fya血型抗体结合蛋白包含与SEQ ID NO：2具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。
优选的，所述的Fyb血型抗体结合蛋白包含与SEQ ID NO：4具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列。
优选的，所述的S血型抗体结合蛋白包含与SEQ ID NO：6具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列。
优选的，所述的s血型抗体结合蛋白包含与SEQ ID NO：8具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：8所示氨基酸序列。
优选的，所述的N血型抗体结合蛋白包含与SEQ ID NO：10具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：10所示氨基酸序列。
本发明的第三方面，提供了一种编码本发明所述的血型抗体结合蛋白的核酸。
本发明的第四方面，提供了一种包含上述核酸的载体。
具体地，上述载体可以采用任何适于表达本发明上述血型抗体结合蛋白的表达载体。
在本发明的一个实施方式中，上述载体为原核表达载体。
在本发明的一个实施方式中，上述载体为真核表达载体。
本发明的第五方面，提供一种血型抗体检测试剂盒，所述的血型抗体检测试剂盒包含血型抗体结合蛋白、上述的核酸或上述的载体。
优选的，所述的血型为Duffy或MNS血型。
优选的，所述的结合蛋白为可溶性蛋白，进一步优选的，所述的血型抗体结合蛋白为Fya、Fyb、S、s或N血型抗体结合蛋白。
优选的，所述的血型抗体结合蛋白包含与SEQ ID NO：2、4、6、8或10具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：2、4、6、8或10所示氨基酸序列。
优选的，所述的Fya血型抗体结合蛋白包含与SEQ ID NO：2具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：2所示氨基酸序列。
优选的，所述的Fyb血型抗体结合蛋白包含与SEQ ID NO：4具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：4所示氨基酸序列。
优选的，所述的S血型抗体结合蛋白包含与SEQ ID NO：6具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：6所示氨基酸序列。
优选的，所述的s血型抗体结合蛋白包含与SEQ ID NO：8具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：8所示氨基酸序列。
优选的，所述的N血型抗体结合蛋白包含与SEQ ID NO：10具有80%以上的同源性或者包含SEQ ID NO：10所示氨基酸序列。
优选的，所述的血型抗体检测试剂盒选自免疫磁珠检测试剂盒、凝集检测试剂盒、液相芯片检测试剂盒、酶联免疫试剂盒、荧光免疫检测试剂盒，所述的试剂盒优选为液相芯片检测试剂盒。
优选的，所述的血型抗体检测试剂盒还包含偶联血型抗体结合蛋白的微球、探针分子或报告分子，其中，所述的微球为聚苯乙烯微球或磁性微球，所述的探针分子是可以和微球表面的羧基等基团偶联并能与被检测物特异性结合的生物分子，所述的报告分子可以是一种能与被检测物特异性结合的荧光染料，也可以是标记有荧光的、能与被检测物结合的其他物质(如抗体、抗原、核酸等)。
优选的，所述的血型抗体检测试剂盒还可以包含固相载体、补体、酶标记的抗体或抗补体和显色液，固相载体材质可以为聚苯乙烯、聚氯乙烯，优选为聚苯乙烯，进一步优选的，本发明所述的固相载体为微量滴定板或微孔板，包括8孔板、48孔板或96孔板；优选的，所述的补体能够与抗原抗体复合物反应，并且不与单独的抗原和抗体反应，所述的抗体可以与待测抗体结合。
优选的，所述的血型抗体检测试剂盒还可以包含磁珠。
优选的，所述的血型抗体检测试剂盒还可以包含荧光物质，进一步所述的荧光物质包括蛋白质、药物或微生物，进一步优选的，所述的蛋白质包括酶、接受体或抗体。
优选的，所述的血型抗体检测试剂盒还包括稀释液、清洗溶液、缓冲液、底物和/或终止溶液。
优选的，所述的血型抗体检测试剂盒还包括阴性对照和/或阳性对照。
本发明的第六方面，提供上述血型抗体结合蛋白、上述核酸、上述载体、上述的血型抗体检测试剂盒在血型抗体检测中的应用。
本发明的第七方面，提供一种上述血型抗体检测方法、上述血型抗体结合蛋白、上述核酸、上述载体、上述的血型抗体检测试剂盒在预防和/或治疗寄生虫病、免疫性疾病、肿瘤或炎性疾病中的应用。
本发明的第八方面，提供一种上述血型抗体检测方法、上述血型抗体结合蛋白、上述核酸、上述载体、上述的血型抗体检测试剂盒在诊断寄生虫病、免疫性疾病、肿瘤或炎性疾病中的应用。
本发明中的血型抗体结合蛋白，无论后续采用何种免疫学方法进行抗体鉴定均需使用。其中，所述的免疫学方法包括但不限于微柱凝胶法、沉淀反应、凝集试验、补体结合试验、标记免疫测定(如酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定、发光免疫测定等)、免疫印迹法、快速测定法(如快速斑点免疫结合试验、液相芯片法等)。
本发明所述的“寄生虫病”包括但不限于蛔虫病、鞭虫病、蛲虫病、阿米巴病、钩虫病、姜片虫病、弓形虫病、疟疾病或阴道毛滴虫病等，其中疟疾病中包括间日疟原虫。
本发明所述的“免疫性疾病”包括但不限于溶血性输血反应、新生儿溶血症、过敏、哮喘、心肌炎、肾炎、肝炎、系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎、硬皮病、甲状腺功能亢进、原发性血小板减少性紫癜、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、自身免疫性肝病、糖尿病、重症肌无力、多发性硬化、荨麻疹、牛皮癣、皮肌炎、干燥综合症、疼痛或神经障碍等。
本发明所述的“炎性疾病”包括急性炎症，也包括慢性炎症。具体的，包括但不限于变质性炎症、渗出性炎症、增生性炎症、特异性炎症等，包括但不限于重度烧伤、内毒素血症、感染性休克、成人呼吸窘迫综合征、血液透析、过敏性休克、哮喘、血管性水肿、克罗恩氏病、镰状细胞贫血、链球菌感染后肾小球肾炎、胰腺炎、肠炎、血管炎、不良药物反应、药物变态反应、IL-2诱导的血管渗漏综合征或放射摄影(对比)造影剂变态反应等。
本发明所述的“肿瘤”包括但不限于淋巴瘤、B细胞肿瘤、T细胞肿瘤、骨髓/单核细胞肿瘤、非小细胞肺癌、白血病、卵巢癌、鼻咽癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、膀胱癌、肺癌、支气管癌、骨癌、前列腺癌、胰腺癌、肝和胆管癌、食管癌、肾癌、甲状腺癌、头颈部癌、睾丸癌、胶质母细胞瘤、星形细胞瘤、黑色素瘤、骨髓增生异常综合征、以及肉瘤。其中，所述的白血病选自急性淋巴细胞性（成淋巴细胞性）白血病、急性骨髓性白血病、髓性白血病、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、浆细胞白血病、以及慢性骨髓性白血病；所述淋巴瘤选自霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤，包括B细胞淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区B细胞淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症；所述肉瘤选自骨肉瘤、尤文肉瘤、平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、软组织肉瘤、血管肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤、横纹肌肉瘤、及软骨肉瘤。
本发明所述的“治疗”表示在疾病已开始发展后减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。
本发明所述的“诊断”是指以查明患者过去、诊断时或将来是否患有疾病或病症，或者是查明疾病的进展或将来可能的进展。
本发明所述的“预防”表示为了阻止或延迟疾病或病症或症状在机体内的发生而实施的方式。
本发明所述的“包含”在本申请中用于描述蛋白质或核酸的序列时，所述蛋白质或核酸可以是由所述序列组成，或者在所述蛋白质或核酸的一端或两端可以具有额外的氨基酸或核苷酸，但仍然具有本发明所述的活性。
本发明所述“同源性”，是指在使用蛋白序列或核苷酸序列的方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要对序列进行调整，使使用序列与现有技术获得的序列相比，具有（包括但不限于）1%，2%，3%，4%，5%，6%，7%，8%，9%，10%，11%，12%，13%，14%，15%，16%，17%，18%，19%，20%，21%，22%，23%，24%，25%，26%，27%，28%，29%，30%，31%，32%，33%，34%，35%，36%，37%，38%，39%，40%，41%，42%，43%，44%，45%，46%，47%，48%，49%，50%，51%，52%，53%，54%，55%，56%，57%，58%，59%，60%，70%，80%，81%，82%，83%，84%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%，99.1%，99.2%，99.3%，99.4%，99.5%，99.6%，99.7%，99.8%，99.9%的同源性，例如“与SEQ ID NO：2具有80%以上的同源性”包括比SEQ ID NO：2更短的序列或者更长的序列或者一个或多个位点突变的序列，其与SEQ ID NO：2具有80%以上同一性。
本发明提供的血型抗体结合蛋白，其序列长度较短，具有抗原性及特异性，易于合成，可以用于血型抗体检测。解决了血型抗原存在多个跨膜区和疏水区，无法全长表达的问题。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：
图1：Fya血型抗体结合蛋白小量诱导15%SDS-PAGE图，其中M为蛋白分子量标准(180kD,130kD,95kD,72kD,55kD,43kD,34kD,26kD,17kD,10kD)，Lane1为pET32a-Fya-血型抗体结合蛋白总菌体裂解液(未诱导)，Lane2为pET32a-Fya-血型抗体结合蛋白总菌体裂解液(0.5mM IPTG诱导4小时后，37°C)；
图2：Fya血型抗体结合蛋白超声破碎15%SDS-PAGE图，其中M为蛋白分子量标准(180kD,130kD,95kD,72kD,55kD,43kD,34kD,26kD,17kD,10kD)，Lane1为Fya血型抗体结合蛋白总菌体裂解液(未诱导)，Lane2为Fya血型抗体结合蛋白总菌体裂解液(0.5mM IPTG诱导12小时后，20°C)，Lane3为超声上清，Lane4为超声沉淀；
图3：Fya血型抗体结合蛋白纯化15%SDS-PAGE图，其中M为蛋白分子量标准(180kD,130kD,95kD,72kD,55kD,43kD,34kD,26kD,17kD,10kD)，Lane1为超声上清用PBS溶解液(待纯化样品)，Lane2为流穿，Lane3为NTA-10洗脱，Lane4为NTA-20洗脱，Lane5为NTA-50洗脱，Lane6为NTA-200洗脱，Lane7为NTA-500洗脱，NTA-10/20/50/200/500为10/20/50/200/500mM不同咪唑浓度；
图4：Fya血型抗体结合蛋白定量15%SDS-PAGE图，其中M为蛋白分子量标准(180kD,130kD,95kD,72kD,55kD,43kD,34kD,26kD,17kD,10kD)，Lane1为1ug BSA标准品，Lane2为2ug BSA标准品，Lane3为4ug BSA标准品，Lane4为1ul Fya血型抗体结合蛋白，Lane5为2ulFya血型抗体结合蛋白，Lane6为4ulFya血型抗体结合蛋白；
图5：Fya血型抗体结合蛋白凝集抑制实验结果；
图6：Fya血型抗体结合蛋白的动力学曲线；
图7：Fya血型抗体结合蛋白与Fyb抗体交叉反应性结果；
图8：Fyb血型抗体结合蛋白小量诱导15%SDS-PAGE图，其中M为蛋白分子量标准(180kD,130kD,95kD,72kD,55kD,43kD,34kD,26kD,17kD,10kD)，Lane1为pET32a-Fyb-血型抗体结合蛋白总菌体裂解液(未诱导)，Lane2为pET32a-Fyb-血型抗体结合蛋白总菌体裂解液(0.5mM IPTG诱导4小时后，37°C)；
图9：Fyb血型抗体结合蛋白超声破碎15%SDS-PAGE图，其中M为蛋白分子量标准(180kD,130kD,95kD,72kD,55kD,43kD,34kD,26kD,17kD,10kD)，Lane1为Fyb血型抗体结合蛋白总菌体裂解液(未诱导)，Lane2为Fyb血型抗体结合蛋白总菌体裂解液(0.5mM IPTG诱导12小时后，20°C)，Lane3为超声上清，Lane4为超声沉淀；
图10：Fyb血型抗体结合蛋白纯化15%SDS-PAGE图，其中M为蛋白分子量标准(180kD,130kD,95kD,72kD,55kD,43kD,34kD,26kD,17kD,10kD)，Lane1为超声上清，Lane2为流穿，Lane3为NTA-10洗脱，Lane4为NTA-20洗脱，Lane5为NTA-50洗脱，Lane6为NTA-200洗脱，Lane7为NTA-500洗脱，NTA-10/20/50/200/500为10/20/50/200/500mM不同咪唑浓度；
图11：Fyb血型抗体结合蛋白定量15%SDS-PAGE图，其中M为蛋白分子量标准(180kD,130kD,95kD,72kD,55kD,43kD,34kD,26kD,17kD,10kD)，Lane1为1ug BSA标准品，Lane2为2ug BSA标准品，Lane3为4ug BSA标准品，Lane4为1ul Fyb血型抗体结合蛋白，Lane5为2ul Fyb血型抗体结合蛋白;
图12：Fyb血型抗体结合蛋白凝集抑制实验结果；
图13：S血型抗体结合蛋白SDS-PAGE分析图；
图14：s血型抗体结合蛋白SDS-PAGE分析图；
图15：S血型抗体结合蛋白凝集抑制实验结果；
图16：s血型抗体结合蛋白凝集抑制实验结果；
图17：N血型抗体结合蛋白SDS-PAGE分析图；
图18：N血型抗体结合蛋白凝集抑制实验结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在下述每一实施例中，设备和材料是从以下所指出的几家公司获得：
抗Fya抗体购自sanquin，货号8000260141；
抗Fyb抗体购自sanquin，货号8000450774；
抗S抗体购自sanquin，货号8000261570；
抗s抗体购自sanquin，货号8000254005；
抗N抗体购自上海血液生物医药有限公司，货号20210407。
实施例1：Fya、Fyb血型抗体结合蛋白的表达、纯化及其效果验证
一、Fya、Fyb血型抗体结合蛋白的表达
本实施例首先分别根据Fya抗原编码区氨基酸序列（SEQ ID NO：1）以及Fyb抗原编码区氨基酸序列（SEQ ID NO：3）设计Fya血型抗体结合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO：2）和Fyb血型抗体结合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO：4），接下来构建表达质粒，通过PCR扩增目的基因或外包合成基因序列，并通过KpnI与EcoRI插入到pET32a载体中，经过酶切与测序鉴定，获得插入基因片段大小，其中，Fya血型抗体结合蛋白和Fyb血型抗体结合蛋白表达质粒预期插入基因大小均约为198bp，经酶切鉴定与预期相符，测序结果正确。
之后获得表达质粒后将其转化至感受态细胞中，将蛋白小量诱导表达来检测其表达情况，然后将蛋白超声破碎并检测蛋白性质，最后纯化蛋白，具体实验步骤及结果如下：
1、转化
1)取出感受态菌室温放置至半融状态。
2)加入5μl质粒，轻搅至混匀。冰浴30min。
3)42°C热休克45-50s，冰浴2min。
4)加入500μl无抗LB液体培养基，37°C摇床培养30min。
5)取菌液100μl涂平板，37°C倒置培养12-16h。
其中，LB液体培养基包含：
胰化蛋白胨 1g
酵母提取物 0.5g
NaCl 1g
加dH2O至总体积为100ml，高压蒸汽灭菌。
2、小量诱导表达:
1)挑取单菌落于10ml LB培养基（氨苄抗性）中，37°C 250rpm振摇过夜；
2)次日按1:100接种于1000ml LB培养基（氨苄抗性）中，37°C 250rpm振摇至菌体OD600为0.6-0.8约3h；
3)取出1ml培养物，10000g室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀；
4)向剩余的培养物中加入0.5mM IPTG，37°C 250rpm振摇4hrs，诱导蛋白表达，或者加入0.5mM 20℃诱导12小时；
5)取出1ml培养物，12000g室温离心2min，弃上清，用100μl 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。
6)进行12-15%SDS-PAGE分析。
其中，IPTG配置是用8ml蒸馏水融解2g IPTG配制成20％的溶液，用蒸馏水定溶至10ml。用0.22um过滤器过滤除菌，保存于-20℃。
对于Fya血型抗体结合蛋白的蛋白小量诱导15%SDS-PAGE的结果如图1所示，Lane1为pET32a-Fya-血型抗体结合蛋白总菌体裂解液(未诱导)，Lane2为pET32a-Fya-血型抗体结合蛋白总菌体裂解液(0.5mM IPTG诱导4小时后，37°C)。实验预期pET32a-Fya-血型抗体结合蛋白分子量大小为23kD，从图1中可以看到在预期大小附近有一诱导条带，pET32a-Fya-血型抗体结合蛋白的表达符合预期结果。
对于Fyb血型抗体结合蛋白的蛋白小量诱导15%SDS-PAGE的结果如图8所示，Lane1为pET32a-Fyb-血型抗体结合蛋白总菌体裂解液(未诱导)，Lane2为pET32a-Fyb-血型抗体结合蛋白总菌体裂解液(0.5mM IPTG诱导4小时后，37°C)。实验预期pET32a-Fyb-血型抗体结合蛋白分子量大小为24kD，从图8中可以看到在预期大小附近有一诱导条带，pET32a-Fyb-血型抗体结合蛋白的表达符合预期结果。
3、蛋白超声破碎
1）每200ml菌液离心所得沉淀以10ml破菌缓冲液充分重悬，同时加入蛋白酶抑制剂PMSF至终浓度1mM。
超声破碎前加入终浓度为0.1-1mM的PMSF或其他蛋白酶抑制剂，防止目的蛋白降解;
2）超声破碎细菌(300W,10s超声，10s间隔，30次)破菌于100ml破菌缓冲液中；
3）将细菌破碎液以10000rpm，10分钟，4°C离心，离心后分别收集沉淀和上清。用等同于上清体积的超声破碎液重悬沉淀。
4）分别取10μl上清和沉淀重悬液用于SDS-PAGE检测，以确定是包涵体表达还是上清表达。其余置于-70°C保存。
其中，破菌缓冲液:50mM PBS，pH7.4，0.15M NaCl；
Fya血型抗体结合蛋白的蛋白超声破碎结果如图2所示，其中Lane1为Fya血型抗体结合蛋白总菌体裂解液(未诱导)，Lane2为Fya血型抗体结合蛋白总菌体裂解液(0.5mMIPTG诱导12小时后，20°C)，Lane3为超声上清，Lane4为超声沉淀，由图2可以看出Fya血型抗体结合蛋白以可溶的形式表达。
Fyb血型抗体结合蛋白的蛋白超声破碎结果如图9所示，其中Lane1为Fyb血型抗体结合蛋白总菌体裂解液(未诱导)，Lane2为Fyb血型抗体结合蛋白总菌体裂解液(0.5mMIPTG诱导12小时后，20°C)，Lane3为超声上清，Lane4为超声沉淀，由图9可以看出Fyb血型抗体结合蛋白以可溶的形式表达。
4、蛋白的纯化
1)取离心后的上清，上样于预先平衡好的NTA纯化柱(Fya血型抗体结合蛋白为5mlNTA介质，Fyb血型抗体结合蛋白为3mlNTA介质，10倍柱体积NTA-0缓冲液平衡);
2)样品上样完成以后，使用NTA-0缓冲液洗柱10个柱体积;
3)顺序使用NTA-X缓冲液各洗柱1个柱体积;
4)分步收集不同组分并电泳检测，最终将含目的蛋白的组分混合在一起。
其中，NTA-X:50mM PBS，pH7.4，0.15M NaCl，XmM咪唑。
Fya血型抗体结合蛋白的蛋白纯化结果如图3所示，其中Lane1为超声上清用PBS溶解液(待纯化样品)，Lane2流穿，Lane3为NTA-10洗脱，Lane4为NTA-20洗脱，Lane5为NTA-50洗脱，Lane6为NTA-200洗脱，Lane7为NTA-500洗脱。图3NTA纯化结果表明，Fya血型抗体结合蛋白在可溶条件下与NTA柱结合效果较好，在20-200mM咪唑处可洗脱获得目的蛋白，接下来重复实验并挑取纯度较高部分进行合并。
Fyb血型抗体结合蛋白的蛋白纯化结果如图10所示，其中Lane1为超声上清用PBS溶解液(待纯化样品)，Lane2流穿，Lane3为NTA-10洗脱，Lane4为NTA-20洗脱，Lane5为NTA-50洗脱，Lane6为NTA-200洗脱，Lane7为NTA-500洗脱。图10 NTA纯化结果表明，Fyb血型抗体结合蛋白与NTA柱结合效果较好，在200-500mM咪唑处可洗脱获得目的蛋白，接下来重复实验并挑取纯度较高部分进行合并，超滤浓缩。
5、蛋白定量
获取的蛋白样本采取SDS-PAGE和UV OD280的方法对蛋白表达过程进行监控以及对产品进行浓度和纯度的检测。
分别对BSA标准品1ug、2ug和4ug，以及1ul、2ul和4ul Fya血型抗体结合蛋白蛋白进行电泳检测，根据BSA标准品条带的灰度制作标曲，并估算出Fya血型抗体结合蛋白的相应浓度。电泳结果如图4所示，最终估算出Fya血型抗体结合蛋白浓度约0.7mg/ml。
分别对BSA标准品1ug、2ug和4ug，以及1ul和2ul Fyb血型抗体结合蛋白进行电泳检测，根据BSA标准品条带的灰度制作标曲，并估算出Fyb血型抗体结合蛋白的相应浓度。电泳结果如图11所示，最终估算出Fyb血型抗体结合蛋白浓度约1.0mg/ml。
二、Fya、Fyb血型抗体结合蛋白效果验证
本实施例中，为了检测获得的血型抗体结合蛋白的结合效果，首先通过凝集抑制试验检测血型抗体结合蛋白的抗原性，接下来绘制抗原的动力学曲线来获得血型抗体结合蛋白与抗体结合反应的动力学情况，最后进行抗原交叉反应性检测抗原特异性。
1、凝集抑制实验：
将抗Fya抗体进行标化，找到凝集强度为2+的抗体滴度。取2管25ul标化后的抗Fya抗体，分别加入3ul的S血型抗体结合蛋白、M血型抗体结合蛋白（SEQ ID NO：11）、Fya血型抗体结合蛋白、Lub血型抗体结合蛋白（SEQ ID NO：12）、s血型抗体结合蛋白和3ul生理盐水，室温放置15min。取25ul上述混合液和相应标准试剂红细胞50ul加入到抗人球蛋白卡中，孵育15min，离心10min，观察凝集强度。如图5所示，只有Fya血型抗体结合蛋白与Fya抗体反应，其他抗原与Fya抗体均未反应，说明Fya血型抗体结合蛋白具有良好的抗原性，且无交叉反应，可以用于Fya血型抗体的检测。
将抗Fyb抗体进行标化，找到凝集强度为2+的抗体滴度。取2管25ul标化后的抗Fyb抗体，分别加入3ul的S抗原、Fya血型抗体结合蛋白、Fyb血型抗体结合蛋白、Lub抗原、s重组抗原和3ul生理盐水，室温放置15min。取25ul上述混合液和相应标准试剂红细胞50ul加入到抗人球蛋白卡中，孵育15min，离心10min，观察凝集强度。如图12所示，只有Fyb血型抗体结合蛋白与Fyb抗体反应，其他抗原或蛋白与Fyb抗体均未反应，说明Fyb血型抗体结合蛋白具有良好的抗原性，且无交叉反应，可以用于Fyb血型抗体（抗Fyb抗体）的检测。
2、Fya血型抗体结合蛋白的动力学曲线：
将Fya抗体进行一系列稀释：5倍、15倍、30倍、60倍、180倍、540倍、1620倍，向不同稀释度Fya抗体中加入实施例1中获得的Fya血型抗体结合蛋白，利用芯片法检测不同稀释度Fya抗体与Fya血型抗体结合蛋白反应信号值，结果信号值呈梯度上升，如图6所示，结果说明Fya血型抗体结合蛋白与Fya抗体反应具有良好的动力学曲线。
3、Fya血型抗体结合蛋白交叉反应性验证：
将Fyb抗体进行一系列稀释：5倍、15倍、30倍、60倍、180倍、540倍、1620倍，向不同稀释度Fyb抗体中加入实施例1中获得的Fya血型抗体结合蛋白，继续利用芯片法进行检测，结果信号值基本无变化，如图7所示，结果说明Fya血型抗体结合蛋白与Fyb抗体反应无交叉反应，具有良好的特异性。
实施例2S、s血型抗体结合蛋白的表达、纯化及其效果验证
一、S、s血型抗体结合蛋白的表达与纯化
本实施例首先分别根据S抗原编码区氨基酸序列（SEQ ID NO：5）以及s抗原编码区氨基酸序列（SEQ ID NO：7）设计S血型抗体结合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO：6）和s血型抗体结合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO：8）。通过真核表达载体对S、s血型抗体结合蛋白进行表达与纯化。
1表达载体构建
通过PCR扩增目的基因或外包合成基因序列；将目的基因插入对应表达载体；测序得到含有正确序列的质粒；质粒放大生产传递下游表达。
2细胞培养与蛋白表达
使用293无血清CD培养基（货号SMM293-TI）传代培养HEK293细胞，将目的蛋白表达质粒与转染试剂TF1混合后加入细胞中，转染后第1，3和5天分别添加293无血清加料液（货号:M293-SUPI-100）。细胞培养7天后进行蛋白纯化。
3蛋白纯化
（1）培养料液离心后，收集细胞，破碎后离心去除细胞碎片，取上清纯化蛋白。
（2）金属螯合亲和层析纯化：将Ni-离子亲和层析柱使用上样缓冲液平衡后将培养液上清上样至层析柱，待杂蛋白流穿后使用咪唑梯度洗脱目标蛋白。将纯化后的目标蛋白进行换液后标定蛋白浓度并进行纯度检测。
4质量检测
获取的蛋白样本采取SDS-PAGE和UV OD280的方法对蛋白表达过程进行监控以及对产品进行浓度和纯度的检测，最终结果如图13和14所示，获得纯化蛋白及其分子量。
二、S、s血型抗体结合蛋白效果验证
为了检测获得的血型抗体结合蛋白的结合效果，首先通过凝集抑制试验检测血型抗体结合蛋白的抗原性及交叉反应。
将抗S抗体进行标化，找到凝集强度为2+的抗体滴度。取2管25ul标化后的抗S抗体，分别加入3ul的S血型抗体结合蛋白、M血型抗体结合蛋白（SEQ ID NO：11）、Fya血型抗体结合蛋白、Fyb血型抗体结合蛋白、Lub血型抗体结合蛋白（SEQ ID NO：12）、s血型抗体结合蛋白和3ul生理盐水，室温放置15min。取25ul上述混合液和相应标准试剂红细胞50ul加入到抗人球蛋白卡中，孵育15min，离心10min，观察凝集强度。
如图15所示，只有S血型抗体结合蛋白与S抗体反应，其他抗原与S抗体均未反应，说明S血型抗体结合蛋白具有良好的抗原性，且无交叉反应，可以用于S血型抗体（抗S抗体）的检测。
将抗s抗体进行标化，找到凝集强度为2+的抗体滴度。取2管25ul标化后的抗s抗体，分别加入3ul S血型抗体结合蛋白、M血型抗体结合蛋白（SEQ ID NO：11）、Fya血型抗体结合蛋白、Fyb血型抗体结合蛋白、Lub血型抗体结合蛋白（SEQ ID NO：12）、s血型抗体结合蛋白和3ul生理盐水，室温放置15min。取25ul上述混合液和相应标准试剂红细胞50ul加入到抗人球蛋白卡中，孵育15min，离心10min，观察凝集强度。
如图16所示，只有s血型抗体结合蛋白与s抗体反应，其他抗原与s抗体均未反应，说明s血型抗体结合蛋白具有良好的抗原性，且无交叉反应，可以用于s血型抗体的检测。
实施例3N血型抗体结合蛋白的表达、纯化及其效果验证
一、N血型抗体结合蛋白的表达与纯化
本实施例首先分别根据N抗原编码区氨基酸序列（SEQ ID NO：9）设计N血型抗体结合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO：10）。通过真核表达载体对N血型抗体结合蛋白进行表达与纯化。
N血型抗体结合蛋白的表达与纯化步骤与实施例2中S、s血型抗体结合蛋白的表达与纯化步骤一致。最终质量结果如图17所示，获得纯化N血型抗体结合蛋白及其分子量。
二、N血型抗体结合蛋白的效果验证
采用凝集抑制实验验证N血型抗体结合蛋白的抗原性，步骤如下：
将抗N抗体进行标化，找到凝集强度为2+的抗体滴度。取2管25μL标化后的抗N抗体，分别加入3μL实施例1制备的N血型抗体结合蛋白和3μL生理盐水，室温放置15min。取25μL上述混合液和相应标准试剂红细胞50μL加入到抗人球蛋白卡中，孵育15min，离心10min，观察凝集强度。
结果如图18所示，N血型抗体结合蛋白具有良好的抗原性，可以用于N血型不规则抗体的检测。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
序列表
<110> 北京大有天弘科技有限公司
<120> 一种血型抗体检测方法及其应用
<130> 1
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 336
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 1
Met Gly Asn Cys Leu His Arg Ala Glu Leu Ser Pro Ser Thr Glu Asn
1 5 10 15
Ser Ser Gln Leu Asp Phe Glu Asp Val Trp Asn Ser Ser Tyr Gly Val
20 25 30
Asn Asp Ser Phe Pro Asp Gly Asp Tyr Gly Ala Asn Leu Glu Ala Ala
35 40 45
Ala Pro Cys His Ser Cys Asn Leu Leu Asp Asp Ser Ala Leu Pro Phe
50 55 60
Phe Ile Leu Thr Ser Val Leu Gly Ile Leu Ala Ser Ser Thr Val Leu
65 70 75 80
Phe Met Leu Phe Arg Pro Leu Phe Arg Trp Gln Leu Cys Pro Gly Trp
85 90 95
Pro Val Leu Ala Gln Leu Ala Val Gly Ser Ala Leu Phe Ser Ile Val
100 105 110
Val Pro Val Leu Ala Pro Gly Leu Gly Ser Thr Arg Ser Ser Ala Leu
115 120 125
Cys Ser Leu Gly Tyr Cys Val Trp Tyr Gly Ser Ala Phe Ala Gln Ala
130 135 140
Leu Leu Leu Gly Cys His Ala Ser Leu Gly His Arg Leu Gly Ala Gly
145 150 155 160
Gln Val Pro Gly Leu Thr Leu Gly Leu Thr Val Gly Ile Trp Gly Val
165 170 175
Ala Ala Leu Leu Thr Leu Pro Val Thr Leu Ala Ser Gly Ala Ser Gly
180 185 190
Gly Leu Cys Thr Leu Ile Tyr Ser Thr Glu Leu Lys Ala Leu Gln Ala
195 200 205
Thr His Thr Val Ala Cys Leu Ala Ile Phe Val Leu Leu Pro Leu Gly
210 215 220
Leu Phe Gly Ala Lys Gly Leu Lys Lys Ala Leu Gly Met Gly Pro Gly
225 230 235 240
Pro Trp Met Asn Ile Leu Trp Ala Trp Phe Ile Phe Trp Trp Pro His
245 250 255
Gly Val Val Leu Gly Leu Asp Phe Leu Val Arg Ser Lys Leu Leu Leu
260 265 270
Leu Ser Thr Cys Leu Ala Gln Gln Ala Leu Asp Leu Leu Leu Asn Leu
275 280 285
Ala Glu Ala Leu Ala Ile Leu His Cys Val Ala Thr Pro Leu Leu Leu
290 295 300
Ala Leu Phe Cys His Gln Ala Thr Arg Thr Leu Leu Pro Ser Leu Pro
305 310 315 320
Leu Pro Glu Gly Trp Ser Ser His Leu Asp Thr Leu Gly Ser Lys Ser
325 330 335
<210> 2
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Gly Asn Cys Leu His Arg Ala Glu Leu Ser Pro Ser Thr Glu Asn
1 5 10 15
Ser Ser Gln Leu Asp Phe Glu Asp Val Trp Asn Ser Ser Tyr Gly Val
20 25 30
Asn Asp Ser Phe Pro Asp Gly Asp Tyr Gly Ala Asn Leu Glu Ala Ala
35 40 45
Ala Pro Cys His Ser Cys Asn Leu Leu Asp Asp Ser Ala Leu Pro Phe
50 55 60
Phe Ile
65
<210> 3
<211> 336
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 3
Met Gly Asn Cys Leu His Arg Ala Glu Leu Ser Pro Ser Thr Glu Asn
1 5 10 15
Ser Ser Gln Leu Asp Phe Glu Asp Val Trp Asn Ser Ser Tyr Gly Val
20 25 30
Asn Asp Ser Phe Pro Asp Gly Asp Tyr Asp Ala Asn Leu Glu Ala Ala
35 40 45
Ala Pro Cys His Ser Cys Asn Leu Leu Asp Asp Ser Ala Leu Pro Phe
50 55 60
Phe Ile Leu Thr Ser Val Leu Gly Ile Leu Ala Ser Ser Thr Val Leu
65 70 75 80
Phe Met Leu Phe Arg Pro Leu Phe Arg Trp Gln Leu Cys Pro Gly Trp
85 90 95
Pro Val Leu Ala Gln Leu Ala Val Gly Ser Ala Leu Phe Ser Ile Val
100 105 110
Val Pro Val Leu Ala Pro Gly Leu Gly Ser Thr Arg Ser Ser Ala Leu
115 120 125
Cys Ser Leu Gly Tyr Cys Val Trp Tyr Gly Ser Ala Phe Ala Gln Ala
130 135 140
Leu Leu Leu Gly Cys His Ala Ser Leu Gly His Arg Leu Gly Ala Gly
145 150 155 160
Gln Val Pro Gly Leu Thr Leu Gly Leu Thr Val Gly Ile Trp Gly Val
165 170 175
Ala Ala Leu Leu Thr Leu Pro Val Thr Leu Ala Ser Gly Ala Ser Gly
180 185 190
Gly Leu Cys Thr Leu Ile Tyr Ser Thr Glu Leu Lys Ala Leu Gln Ala
195 200 205
Thr His Thr Val Ala Cys Leu Ala Ile Phe Val Leu Leu Pro Leu Gly
210 215 220
Leu Phe Gly Ala Lys Gly Leu Lys Lys Ala Leu Gly Met Gly Pro Gly
225 230 235 240
Pro Trp Met Asn Ile Leu Trp Ala Trp Phe Ile Phe Trp Trp Pro His
245 250 255
Gly Val Val Leu Gly Leu Asp Phe Leu Val Arg Ser Lys Leu Leu Leu
260 265 270
Leu Ser Thr Cys Leu Ala Gln Gln Ala Leu Asp Leu Leu Leu Asn Leu
275 280 285
Ala Glu Ala Leu Ala Ile Leu His Cys Val Ala Thr Pro Leu Leu Leu
290 295 300
Ala Leu Phe Cys His Gln Ala Thr Arg Thr Leu Leu Pro Ser Leu Pro
305 310 315 320
Leu Pro Glu Gly Trp Ser Ser His Leu Asp Thr Leu Gly Ser Lys Ser
325 330 335
<210> 4
<211> 66
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Met Gly Asn Cys Leu His Arg Ala Glu Leu Ser Pro Ser Thr Glu Asn
1 5 10 15
Ser Ser Gln Leu Asp Phe Glu Asp Val Trp Asn Ser Ser Tyr Gly Val
20 25 30
Asn Asp Ser Phe Pro Asp Gly Asp Tyr Asp Ala Asn Leu Glu Ala Ala
35 40 45
Ala Pro Cys His Ser Cys Asn Leu Leu Asp Asp Ser Ala Leu Pro Phe
50 55 60
Phe Ile
65
<210> 5
<211> 91
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 5
Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Glu Ile Val Ser
1 5 10 15
Ile Ser Ala Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Ser Val Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Gly Glu Met
35 40 45
Gly Gln Leu Val His Arg Phe Thr Val Pro Ala Pro Val Val Ile Ile
50 55 60
Leu Ile Ile Leu Cys Val Met Ala Gly Ile Ile Gly Thr Ile Leu Leu
65 70 75 80
Ile Ser Tyr Ser Ile Arg Arg Leu Ile Lys Ala
85 90
<210> 6
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Glu Ile Val Ser
1 5 10 15
Ile Ser Ala Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Ser Val Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Gly Glu Met
35 40 45
Gly Gln Leu Val His Arg Phe Thr Val Pro Ala
50 55
<210> 7
<211> 91
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 7
Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Glu Ile Val Ser
1 5 10 15
Ile Ser Ala Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Ser Val Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Gly Glu Thr
35 40 45
Gly Gln Leu Val His Arg Phe Thr Val Pro Ala Pro Val Val Ile Ile
50 55 60
Leu Ile Ile Leu Cys Val Met Ala Gly Ile Ile Gly Thr Ile Leu Leu
65 70 75 80
Ile Ser Tyr Ser Ile Arg Arg Leu Ile Lys Ala
85 90
<210> 8
<211> 59
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Glu Ile Val Ser
1 5 10 15
Ile Ser Ala Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Ser Val Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Gly Glu Thr
35 40 45
Gly Gln Leu Val His Arg Phe Thr Val Pro Ala
50 55
<210> 9
<211> 150
<212> PRT
<213> 人(human)
<400> 9
Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Glu Ile Val Ser
1 5 10 15
Ile Ser Ala Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Ser Val Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His
35 40 45
Lys Arg Asp Thr Tyr Ala Ala Thr Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu
50 55 60
Ile Ser Val Arg Thr Val Tyr Pro Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg
65 70 75 80
Val Gln Leu Ala His His Phe Ser Glu Pro Glu Ile Thr Leu Ile Ile
85 90 95
Phe Gly Val Met Ala Gly Val Ile Gly Thr Ile Leu Leu Ile Ser Tyr
100 105 110
Gly Ile Arg Arg Leu Ile Lys Lys Ser Pro Ser Asp Val Lys Pro Leu
115 120 125
Pro Ser Pro Asp Thr Asp Val Pro Leu Ser Ser Val Glu Ile Glu Asn
130 135 140
Pro Glu Thr Ser Asp Gln
145 150
<210> 10
<211> 91
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Glu Ile Val Ser
1 5 10 15
Ile Ser Ala Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Ser Val Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His
35 40 45
Lys Arg Asp Thr Tyr Ala Ala Thr Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu
50 55 60
Ile Ser Val Arg Thr Val Tyr Pro Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg
65 70 75 80
Val Gln Leu Ala His His Phe Ser Glu Pro Glu
85 90
<210> 11
<211> 91
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Tyr Gly Lys Ile Ile Phe Val Leu Leu Leu Ser Ala Ile Val Ser
1 5 10 15
Ile Ser Ala Ser Ser Thr Thr Gly Val Ala Met His Thr Ser Thr Ser
20 25 30
Ser Ser Val Thr Lys Ser Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Asn Asp Thr His
35 40 45
Lys Arg Asp Thr Tyr Ala Ala Thr Pro Arg Ala His Glu Val Ser Glu
50 55 60
Ile Ser Val Arg Thr Val Tyr Pro Pro Glu Glu Glu Thr Gly Glu Arg
65 70 75 80
Val Gln Leu Ala His His Phe Ser Glu Pro Glu
85 90
<210> 12
<211> 547
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Met Glu Pro Pro Asp Ala Pro Ala Gln Ala Arg Gly Ala Pro Arg Leu
1 5 10 15
Leu Leu Leu Ala Val Leu Leu Ala Ala His Pro Asp Ala Gln Ala Glu
20 25 30
Val Arg Leu Ser Val Pro Pro Leu Val Glu Val Met Arg Gly Lys Ser
35 40 45
Val Ile Leu Asp Cys Thr Pro Thr Gly Thr His Asp His Tyr Met Leu
50 55 60
Glu Trp Phe Leu Thr Asp Arg Ser Gly Ala Arg Pro Arg Leu Ala Ser
65 70 75 80
Ala Glu Met Gln Gly Ser Glu Leu Gln Val Thr Met His Asp Thr Arg
85 90 95
Gly Arg Ser Pro Pro Tyr Gln Leu Asp Ser Gln Gly Arg Leu Val Leu
100 105 110
Ala Glu Ala Gln Val Gly Asp Glu Arg Asp Tyr Val Cys Val Val Arg
115 120 125
Ala Gly Ala Ala Gly Thr Ala Glu Ala Thr Ala Arg Leu Asn Val Phe
130 135 140
Ala Lys Pro Glu Ala Thr Glu Val Ser Pro Asn Lys Gly Thr Leu Ser
145 150 155 160
Val Met Glu Asp Ser Ala Gln Glu Ile Ala Thr Cys Asn Ser Arg Asn
165 170 175
Gly Asn Pro Ala Pro Lys Ile Thr Trp Tyr Arg Asn Gly Gln Arg Leu
180 185 190
Glu Val Pro Val Glu Met Asn Pro Glu Gly Tyr Met Thr Ser Arg Thr
195 200 205
Val Arg Glu Ala Ser Gly Leu Leu Ser Leu Thr Ser Thr Leu Tyr Leu
210 215 220
Arg Leu Arg Lys Asp Asp Arg Asp Ala Ser Phe His Cys Ala Ala His
225 230 235 240
Tyr Ser Leu Pro Glu Gly Arg His Gly Arg Leu Asp Ser Pro Thr Phe
245 250 255
His Leu Thr Leu His Tyr Pro Thr Glu His Val Gln Phe Trp Val Gly
260 265 270
Ser Pro Ser Thr Pro Ala Gly Trp Val Arg Glu Gly Asp Thr Val Gln
275 280 285
Leu Leu Cys Arg Gly Asp Gly Ser Pro Ser Pro Glu Tyr Thr Leu Phe
290 295 300
Arg Leu Gln Asp Glu Gln Glu Glu Val Leu Asn Val Asn Leu Glu Gly
305 310 315 320
Asn Leu Thr Leu Glu Gly Val Thr Arg Gly Gln Ser Gly Thr Tyr Gly
325 330 335
Cys Arg Val Glu Asp Tyr Asp Ala Ala Asp Asp Val Gln Leu Ser Lys
340 345 350
Thr Leu Glu Leu Arg Val Ala Tyr Leu Asp Pro Leu Glu Leu Ser Glu
355 360 365
Gly Lys Val Leu Ser Leu Pro Leu Asn Ser Ser Ala Val Val Asn Cys
370 375 380
Ser Val His Gly Leu Pro Thr Pro Ala Leu Arg Trp Thr Lys Asp Ser
385 390 395 400
Thr Pro Leu Gly Asp Gly Pro Met Leu Ser Leu Ser Ser Ile Thr Phe
405 410 415
Asp Ser Asn Gly Thr Tyr Val Cys Glu Ala Ser Leu Pro Thr Val Pro
420 425 430
Val Leu Ser Arg Thr Gln Asn Phe Thr Leu Leu Val Gln Gly Ser Pro
435 440 445
Glu Leu Lys Thr Ala Glu Ile Glu Pro Lys Ala Asp Gly Ser Trp Arg
450 455 460
Glu Gly Asp Glu Val Thr Leu Ile Cys Ser Ala Arg Gly His Pro Asp
465 470 475 480
Pro Lys Leu Ser Trp Ser Gln Leu Gly Gly Ser Pro Ala Glu Pro Ile
485 490 495
Pro Gly Arg Gln Gly Trp Val Ser Ser Ser Leu Thr Leu Lys Val Thr
500 505 510
Ser Ala Leu Ser Arg Asp Gly Ile Ser Cys Glu Ala Ser Asn Pro His
515 520 525
Gly Asn Lys Arg His Val Phe His Phe Gly Thr Val Ser Pro Gln Thr
530 535 540
Ser Gln Ala
545

Claims (11)

1.一种血型抗体检测方法，其特征在于，所述的血型抗体检测方法包括使待测物与血型抗体结合蛋白混合，所述的血型抗体结合蛋白为Fya、Fyb、S、s或N血型抗体结合蛋白，
所述的Fya血型抗体结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，
所述的Fyb血型抗体结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，
所述的S血型抗体结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，
所述的s血型抗体结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，
所述的N血型抗体结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
2.根据权利要求1所述的血型抗体检测方法，其特征在于，所述的血型抗体为Fya抗体、Fyb抗体、S抗体、s抗体和N抗体。
3.根据权利要求1所述的血型抗体检测方法，其特征在于，所述的待测物为全血、血清、血浆或待测血型抗体。
4.根据权利要求1所述的血型抗体检测方法，其特征在于，所述的检测方法检测血型抗体的有无或含量。
5.根据权利要求1-4任一所述的血型抗体检测方法，其特征在于，所述的血型抗体检测方法选自微柱凝胶法、沉淀反应、凝集试验、补体结合试验、标记免疫测定、免疫印迹法、快速斑点免疫结合试验或液相芯片法。
6.根据权利要求5所述的血型抗体检测方法，其特征在于，所述的标记免疫测定选自酶联免疫测定、放射免疫测定、荧光免疫测定或发光免疫测定。
7.一种血型抗体结合蛋白，其特征在于，所述的血型抗体结合蛋白为Fya、Fyb、S、s或N血型抗体结合蛋白，
所述的Fya血型抗体结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，
所述的Fyb血型抗体结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示，
所述的S血型抗体结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示，
所述的s血型抗体结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，
所述的N血型抗体结合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。
8.一种编码权利要求7所述的血型抗体结合蛋白的核酸。
9.一种包含权利要求8所述的核酸的载体。
10.一种血型抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的血型抗体检测试剂盒包含权利要求7所述的血型抗体结合蛋白、权利要求8所述的核酸或权利要求9所述的载体。
11.一种权利要求7所述的血型抗体结合蛋白、权利要求8所述的核酸、权利要求9所述的载体或权利要求10所述的血型抗体检测试剂盒在血型抗体检测中的应用。
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