KR102277330B1

KR102277330B1 - 암의 면역 치료 후 예후 예측용 바이오 마커

Info

Publication number: KR102277330B1
Application number: KR1020190142296A
Authority: KR
Inventors: 신의철; 김경환
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2019-11-08
Filing date: 2019-11-08
Publication date: 2021-07-15
Also published as: KR20210055922A

Abstract

본 발명은 면역항암제(PD-1/PD-L1) 치료 후 면역 관련 이상 반응(immune-related adverse events; irAEs) 발생이 예견되는 환자를 선별하기 위한 바이오 마커에 관한 것이다. 암 환자, 특히 흉선종 및 비소세포폐암 환자에 대해 면역항암제 사용 전 irAEs 발생을 미리 예측함으로써 비소세포폐암환자에 대한 면역항암제 사용 여부를 결정할 수 있게 함으로써, 기대 수명을 연장할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

암의 면역 치료 후 예후 예측용 바이오 마커{Biomarkers for predicting prognosis after immunotherapy of cancer}

본 발명은 암의 면역 치료 후 예후를 예측하기 위한 바이오 마커로, 보다 구체적으로는 상기 암의 면역 치료 후 발생되는 면역 관련 이상 반응(immune-related adverse events, irAEs)이 예견되는 환자를 선별하기 위한 바이오 마커에 관한 것이다.

지난 10년간 암 진단과 치료에 있어 비약적으로 발전하고 있지만, 암 발병으로 인한 치사율은 여전히 높다. 현재까지의 항암제의 연구 동향을 살펴보게 되면 크게 1세대로는 화학 항암제, 2세대로는 표적 항암제, 3세대로는 면역 항암제로 구분될 수 있다. 1세대 화학 항암제는 암 세포뿐만 아니라 정상 세포에까지 손상을 주기에 부작용이 심하다. 즉, 암 세포를 사멸하기 위해 정상 세포까지 공격하여 환자의 면역 체계를 파괴하고 강한 독성으로 인해 탈모, 구토, 식욕저하, 피로감, 극심한 체력 저하 등 각종 부작용이 발생한다. 이와 달리, 2세대 표적 항암제는 암 세포만을 식별해 공격하는 장점이 있지만, 유전자 변이를 가진 환자에게만 사용할 수 있어 다양한 암 치료가 불가능하고, 내성으로 치료가 불가능해지는 단점이 있다. 3세대 면역 항암제는 억제되어 있던 인체의 면역 세포를 활성화시켜서 암 세포를 사멸시키는 새로운 기전을 갖고 있으며, 특정 유전자 변이가 없어도 다양한 암종에 폭넓게 사용할 수 있다는 장점이 있다. 최근의 암 치료는 기존에 각광받던 표적 항암 치료에서 면역 치료제로 세대 교체가 이루어지고 있으며, 최근 3~4년 사이 면역 요법의 암 치료는 한단계 진화하여 효과 있는 물질들이 활발하게 개발되고 있다.

현재 항암 치료에 사용되고 있는 항암제의 대부분은 빠르게 증식하는 암세포를 표적으로 하는 약물이 대부분이다. 그러나 이는 암 자체를 공격하는 2세대 항암제로, 3세대 항암제인 면역 항암제가 인공면역 단백질을 체내에 주입하여 면역 체계를 자극함으로써 면역 세포가 선택적으로 암 세포만을 공격하도록 유도하는 치료 약제인 것과 차이가 있다. 이처럼 면역 항암제는 1세대 화학 항암제의 부작용과 2세대 표적 항암제의 내성 문제를 개선하였고, 장기간 효과 지속(durable response), 장기 생존 가능(long-term survival), 폭넓은 항암 효과(broad anti-tumor activity) 및 낮은 부작용(low toxicity profile) 등을 특징으로 한다. 면역 항암 요법은 체내 면역 체계를 활성화시켜 자가 면역력을 높여주고, 이를 통하여 면역 세포가 암 세포를 공격하도록 하는 치료법으로, 기존의 방사선 요법, 세포독성 치료제, 표적 항암제와는 작용 메커니즘이 다르다.

그러나, 일부 환자에게서는 면역 관련 이상 반응(immune-related adverse events, irAEs)이 발생하는 것이 보고되고 있으나, 이를 미리 예측하여 irAEs가 발생할 가능성이 있는 환자를 선별할 수 있는 마커는 현재 발굴되지 않은 실정이다.

본 발명의 일 목적은 암 환자의 면역 치료 후 예후에서도 특히 면역 관련 이상 반응(immune-related adverse events, irAEs) 발생 유무를 예측하기 위한 바이오 마커 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 암 환자의 면역 치료 후 예후에서도 특히 면역 관련 이상 반응(irAEs) 발생 유무를 예측하기 위한 예후 예측용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 암 환자의 면역 치료 후 예후에서도 특히 면역 관련 이상 반응(irAEs) 발생 유무를 예측할 수 있는 키트를 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 환자의 면역 치료 후 예후에서도 특히 면역 관련 이상 반응(irAEs) 발생 유무를 예측하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

이하, 본원에 기재된 다양한 구체예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세 사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구체예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구체예" 또는 "구체예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구체예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구체예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구체예에서" 또는 "구체예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구체예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구체예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.

본 발명 내 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당 업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.

본 발명에서 "암의 면역 치료제"와 "면역 항암제(cancer immunotherapy)"는 혼용하여 사용될 수 있으며, 이는 억제되어 있던 체내 면역 세포를 활성화시켜 암세포를 사멸시키는 새로운 기전을 갖고 있는 항암제에 해당한다. 상기 면역 항암제는 환자 스스로의 면역 강화를 통해 치료를 한다는 점에서 부작용이 적으며, 암 환자의 삶의 질을 높이고 생존 기간도 대폭 연장되는 효과를 가지고 있다. 면역 항암제는 면역 체계의 특이성(specificity), 기억 능력(memory), 적응력(adaptiveness)을 증강시킴으로써 항암 효과를 나타낸다. 즉 인체의 면역 시스템을 이용하여 정확하게 암 세포만 공격해 부작용이 적고 면역 시스템의 기억 능력과 적응력을 이용하기 때문에 면역 항암제에 효과가 있는 환자는 지속적인 항암 효과를 볼 수 있다. 이처럼, 면역 항암제는 1세대 화학 항암제의 부작용과 2세대 표적 항암제의 내성을 개선하였고, 장기간 효과 지속(durable response), 장기 생존 가능(long-term survival), 폭넓은 항암 효과(broad anti-tumor activity) 및 낮은 부작용(low toxicity profile) 등을 특징으로 한다. 면역 항암제는 크게 수동 면역과 능동 면역 치료로 구분되며, 수동 면역 치료에는 면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)와 면역 세포 치료제(immune cell therapy), 치료용 항체 등이 있다. 능동 면역 치료에는 암 치료 백신, 면역 조절제(immune-modulation agents) 등이 있다.

본 발명에서 "면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor)"는 T 세포 억제에 관여하는 면역 체크포인트 단백질(immune checkpoint protein)의 활성을 차단함으로써 T 세포를 활성화시켜 암 세포를 공격하는 약제를 말한다. 즉, 다시 말하면 암세포는 면역 세포의 공격을 PD-L1을 발현함으로써 자기로 인식하도록 하여, 공격을 피하는 회피 메커니즘이 있는데, 상기 약물은 면역 반응 회피 신호를 억제하여 면역 세포가 암 세포를 공격하게 하여 암 세포가 제거될 수 있도록 한다. 이처럼 암 세포의 면역 체계 회피 반응을 무력화하기 위해 개발된 신약들은 대표적으로 CTLA-4, PD-1, PD-L1 부위를 타깃으로 인식하는 항체를 사용한다.

본 발명에서 면역관문 억제제는 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 니볼루맙(Nivolumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab), 아벨루맙(Avelumab), 더발루맙(Durvalumab), 세미플리맙(Cemiplimab)과 같은 "PD-1/PD-L1 치료제" 또는 이필리무맙(Ipilimumab), 트레멜리무맙(Tremelimumab)과 같은 "CTLA-4 치료제"일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 "PD-1/PD-L1 치료제"는 T 세포의 PD-1 수용체에 결합하여 암 세포의 면역 회피 기능을 억제한다. CD274, B7-H1이라고도 불리는 PD-L1이라는 암 세포의 표면이나 조혈 세포에 있는 단백질이 특정 세포 표면에서 발현되면 이는 T세포의 표면에 있는 단백질인 PD-1과 결합하여 T 세포 기능을 억제하여 암 세포를 공격하지 못하게 만든다. PD-1 억제제의 경우, PD-1에 PD-1 단클론 항체가 결합하게 되면 억제되어 있던 T 세포가 활성화되면서 암 세포를 공격하여 사멸시키게 된다. 기존의 면역 치료제(사이토카인 치료제, 항암 백신)와는 달리 암 세포와 T 세포의 결합 부위에 결합하여 면역 회피 신호를 차단함으로써 면역학적 시냅스가 형성되지 못하게 하고, 이에 따라 면역 회피 방해를 받지 않는 T 세포가 암 세포를 파괴하는 기전을 가지고 있다. 다시 말하면, 암 세포는 PD-L1이라는 면역 회피 물질을 갖고 있어 면역 세포를 무력화시켜 증식하게 되지만, PD-1 항체가 PD-L1과 PD-1 결합 부위에 먼저 결합하게 되면 면역 회피 신호가 차단되어 이러한 신호를 받지 않은 T 세포가 암 세포를 사멸하게 되는 원리를 이용한다. PD-L1 억제제의 경우, 체내 면역 세포와 암 세포에 발현하는 단백질인 PD-1/PD-L1 경로를 표적으로 하여 이들의 상호관계를 차단하면서 면역 세포들이 암 세포를 공격할 수 있도록 돕는 역할을 한다.

본 발명에서 "바이오 마커"란 체내 세포나 혈관, 단백질, DNA, RNA, 대사 물질 등을 이용하여 체내 변화를 알아낼 수 있는 생물학적 지표로, 미국 국립보건원(NIH)은 상기 바이오 마커를 정상적인 생물학적 과정, 질병 진행 상황, 치료 방법에 대한 약물의 반응성을 객관적으로 측정하고 평가할 수 있는 지표라고 정의하였다. 즉, 특정 질병이나 암의 경우 정상이나 병적인 상태를 구분할 수 있거나 치료 반응을 예측할 수 있고 이를 객관적으로 측정할 수 있는 표지자를 의미한다. 따라서 바이오 마커는 정상적인 생물학적 과정, 질병 진행 상황, 치료 방법에 대한 약물의 반응성을 객관적으로 측정하고 평가할 수 있는 역할을 하여야 한다. 활용도에 따라 약물 타깃의 존재를 확인하는 타깃 마커, 병의 유무를 진단하는 진단 마커, 특정 약물에 대한 반응군과 비반응군을 구별할 수 있는 예상 마커, 약물 치료 효과를 모니터링 할 수 있는 대리 표지자 마커, 질병의 예후를 알려주는 예후 바이오 마커 등이 존재한다.

본 발명에서 "면역 관련 이상 반응(immune-related adverse events, irAEs)"은 PD-1 억제제 치료 환자에게서 다양한 형태로 발생할 수 있고, 이에 제한되는 것은 아니지만, 예를 들면, 대장염, 간염, 폐렴, 내분비 병증 또는 피부염이나, 드물게 발생되는 심장, 신장 및 신경계와 관련된 면역 반응을 포함할 수 있다. 자가 항체, 조직-침윤 T 세포, 사이토카인, B 세포의 초기 변화 및 마이크로바이옴(Microbiome)은 irAEs와 관련이 있는 것으로 제안되었지만, irAEs의 병리생리학은 완전히 밝혀지지 않았다. 이러한 광범위한 임상증상 및 관련 인자는 irAEs가 단일 메커니즘에 의해서가 아니라 이종 메커니즘에 의해 야기됨을 시사한다. 대부분의 환자는 스테로이드 또는 면역억제제를 사용하여 irAEs에서 회복하지만 심한 경우 치료 중단 및 사망을 초래할 수 있다. 치명적인 케이스에서는 조기 발견 및 적절한 면역 조절 및 관리가 중요하다. 그러나, 중증 irAEs를 예측하는 임상적으로 이용 가능한 바이오 마커는 개발되지 않았다. 대부분의 중증 irAEs는 PD-1 억제제 치료를 시작한 후 1~2 개월 일찍 발생한다. irAEs 관련 면역학적 변화는 치료 직후에 시작될 수 있다.

본 발명의 "예후"란, 질병의 경과 및 사망 또는 생존의 결과를 미리 예측하는 행위를 말한다. 상기 예후 또는 예후 예측이란 질환의 경과가 환자의 생리적 또는 환경적 상태에 따라 달라질 수 있으며, 이러한 환자의 상태를 종합적으로 고려하여 치료 전/후 질병의 경과를 예측하는 모든 행위를 의미하는 것으로 해석될 수 있다. 본 발명의 목적상 상기 예후는 암의 면역 치료, 바람직하게는 PD-1/PD-L1치료 후 irAEs 발생을 미리 예상하는 행위 또는 이를 토대로 적절한 치료 반응성을 선택하는 행위로 해석될 수 있다. 구체적으로, 예후가 나쁠 수 있음은 PD-1/PD-L1치료 이후 환자에게 irAEs가 발생할 가능성이 높을 수 있음을 의미한다.

이처럼, 본 발명은 면역 항암제(PD-1/PD-L1) 치료 후 irAEs을 복수 개의 그룹으로 나누어 정밀하게 예측함으로써 환자 개개인마다의 치료 효과를 미리 기대할 수 있으며, 치료 효과를 기대할 수 없는 일부 환자를 선별하여 실질적 생존 기간을 연장할 수 있도록 한다.

본 발명에서 "종양" 또는 "암"은 세포 주기가 조절되지 않아 세포 분열을 계속하는 질병으로서, 발생 부위에 따라 암종(Carcinoma)과 육종(Sarcoma)으로 나뉜다. 암종(Carcinoma)은 점막, 피부 같은 상피성 세포에서 발생한 악성 종양을 뜻하고, 육종(Sarcoma)은 근육, 결합 조직, 뼈, 연골, 혈관 등의 비상피성 세포에서 발생한 악성 종양을 뜻한다.

본 발명에서 상기 암은 유방암, 자궁암, 식도암, 위암, 뇌암, 직장암, 대장암, 폐암, 피부암, 난소암, 자궁경부암, 신장암, 혈액암, 췌장암, 전립선암, 고환암, 후두암, 구강암, 두경부암, 갑상선암, 간암, 방광암, 골육종, 림프종, 백혈병, 흉선종, 흉선암, 편평상피세포암, 선암종 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 암일 수 있다.

본 발명에서 상기 암은 흉선 상피성 종양(thymic epithelial tumor; TET) 또는 비소세포폐암(non-small cell lung cancer; NSCLC)일 수 있으며, 종양의 분화 및/또는 증식 등 암의 진행이 본 발명에서 기술하는 암 세포에 의존적인 암의 종류라면 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "비소세포폐암(non-small-cell lung cancer; NSCLC)"은 폐암의 일종으로 조직형에 따라서 소세포성 폐암이 아닌 비소세포성 폐암을 말한다. 비소세포성 폐암은 암의 발생 부위에 따라 종류가 나뉘며, 기관지에서 발생하는 편평상피세포암, 비교적 크기가 작은 세기관지 상피에서 발생하는 선암종, 폐 표면 근처에서 주로 발생하는 대세포암종 등이 있다. 비소세포성 폐암은 소세포폐암에 비하여 비교적 성장 속도가 느리고 주변 조직으로 퍼진 후 나중에 전이하는 특징을 지니고 있는 암종에 해당한다.

본 발명에서 "흉선 상피성 종양(thymic epithelial tumor; TET)"은 조직병리학적으로 흉선종(thymomas) 및 흉선암(thymic carcinomas)의 이종 그룹을 나타내며, 연간 백만명 당 1.3 내지 3.2명의 발생 보고가 있는 희귀암에 해당한다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, IL-17A(Interleukin-17A), IFN-gamma(Interferon-gamma), Ki-67, CD45RA(cluster of differentiation 45 RA), FoxP3(Forkhead box protein 3), 및 TNF-alpha(tumor necrosis factor-alpha)에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는, 암 환자의 면역 치료 후 예후 예측용 바이오 마커 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 바이오 마커 조성물은 IL-17A 및 IFN-gamma; Ki-67; CD45RA 및 FoxP3; 및 TNF-alpha;에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 IL-17A은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 IFN-gamma는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 Ki-67은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 CD45RA는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 FoxP3은 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 TNF-alpha는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 바이오 마커의 상기 단백질 또는 상기 유전자의 발현 수준은 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포에 대하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 IL-17A 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 IFN-gamma 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자;는 CD4+ T 세포에 대해 그 발현이 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 Ki-67 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 CD8+ T 세포, 바람직하게는 PD-1+CD8+ T 세포에 대해 그 발현이 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 CD45RA 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 FoxP3 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 CD4+ T 세포에 대해 그 발현이 측정되는 것일 수는 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 TNF-alpha 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포에 대해 그 발현이 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 암 환자의 면역 치료는 수동 면역 치료와 능동 면역 치료 중 어느 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 수동 면역 치료는 면역관문 억제제(immune checkpoint inhibitor), 면역 세포 치료제(immune cell therapy) 또는 치료용 항체 등을 이용한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 면역관문 억제제는 CTLA-4, PD-1 또는 PD-L1의 발현 억제제일 수 있고, 바람직하게는 항 CTLA-4 항체, 항 PD-1항체 또는 항 PD-L1 항체일 수 있다.

본 발명에서 상기 능동 면역 치료는 암 치료 백신 또는 면역 조절제(immune-modulation agents) 등을 이용한 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서 상기 예후는 암 환자의 면역 치료 후 치료 반응성, 바람직하게는 면역 관련 이상 반응(irAEs)의 발생 가능성 또는 발생 유무일 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, IL-17A, IFN-gamma, Ki-67, CD45RA, FoxP3 및 TNF-alpha에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암 환자의 면역 치료 후 예후 예측용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 예후 예측용 조성물은 IL-17A 및 IFN-gamma; Ki-67; CD45RA 및 FoxP3; 및 TNF-alpha;에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 IL-17A, IFN-gamma, Ki-67, CD45RA, FoxP3 및 TNF-alpha에서 선택된 1종 이상의 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 IL-17A, IFN-gamma, Ki-67, CD45RA, FoxP3 또는 TNF-alpha의 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 상기 IL-17A, IFN-gamma, Ki-67, CD45RA, FoxP3, 또는 TNF-alpha 각각의 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당 업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당 업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991 참조) 을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.

본 발명에서 상기 "올리고펩타이드"는 펩타이드로 2 내지 20 개의 아미노산으로 구성되며 디 펩티드, 트리 펩티드, 테트라 펩티드 및 펜타 펩티드를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 상기 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991). "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide". Science 254 (5037): 1497-1500]에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명에서 상기 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)]에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명에서 상기 IL-17A, IFN-gamma, Ki-67, CD45RA, FoxP3 및 TNF-alpha로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는, 상기 IL-17A, IFN-gamma, Ki-67, CD45RA, FoxP3 또는 TNF-alpha단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.

본 발명에서 상기 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당 업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 "LNA(Locked nucleic acids)"란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다 [J Weiler, J Hunziker and J Hall Gene Therapy (2006) 13, 496.502]. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 Watson-Crick 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다. 본 발명에서 상기 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA: 올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 IL-17A, IFN-gamma, Ki-67, CD45RA, FoxP3 및 TNF-alpha 단백질이나, 이들을 코딩하는 유전자의 정보는 알려져 있으므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.

본 발명에서 상기 IL-17A 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함으로써 Th17 세포의 발현을 측정할 수 있다.

본 발명에서 상기 IFN-gamma 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함으로써 Th1 세포의 발현을 측정할 수 있다.

본 발명에서 상기 CD45RA 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 FoxP3 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현 수준을 측정함으로써 활성화된 조절 T 세포(Effector Regulatory T Cell; eTreg 세포)의 발현을 측정할 수 있다.

본 발명에서 상기 IL-17A, IFN-gamma, Ki-67, CD45RA, FoxP3 및 TNF-alpha에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준은 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포에 대하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 IL-17A 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 IFN-gamma 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 CD4+ T 세포에 대하여 그 발현이 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 Ki-67 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 CD8+ T 세포, 바람직하게는 PD-1+CD8+ T 세포에 대하여 그 발현이 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 CD45RA 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 FoxP3 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자;는 CD4+ T 세포에 대하여 그 발현이 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 TNF-alpha 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자는 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포에 대하여 그 발현이 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 예후는 암 환자의 면역 치료 후 치료 반응성, 바람직하게는 면역 관련 이상 반응(irAEs)의 발생 가능성 또는 발생 유무일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 암 환자의 면역 치료 후 예후 예측용 조성물을 포함하는 암 환자의 면역 치료 후 예후 예측용 키트에 관한 것이다.

본 발명에서 "키트"는 바이오 마커 성분에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 항체를 검출 가능한 표지로 표지하여 바이오 마커의 발현 수준을 평가할 수 있는 도구를 말한다. 프로브 또는 항체 관련하여 검출 가능한 물질을 기질과의 반응에 의해서 직접적으로 표지하는 것뿐만 아니라, 직접적으로 표지된 다른 시약과의 반응성에 의한 발색하는 표지체가 접합된 간접적 표지도 포함한다. 상기 표지체와 발색 반응할 발색 기질 용액, 세척액 및 기타 다른 용액 등을 포함할 수 있으며, 사용되는 시약 성분을 포함하여 제작될 수 있다. 본 발명에서 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있으며, 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소, 역전사효소, DNase, RNase 억제제, 멸균수 등을 포함할 수 있다. 또한, 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 HPD 예후 예측용 유전자를 검출하기 위한 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트는 당 업계에 공지되어 있는 것이라면, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.

본 발명의 상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명에서 상기 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산 서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로써, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 예후 예측용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 예후 예측용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 예후 예측용 키트에서 항원-항체 결합반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(Well plate), 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 예후 예측용 키트에서 2차 항체의 표지체는 발색 반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(폴리 L-라이신-플루오르세인 아이소티오시아네이트), RITC(로다민-B-아이소티오시아네이트) 등의 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye) 등의 표지체가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 예후 예측용 키트에서 발색을 유도하기 위한 발색 기질은 발색 반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB(3,3',5,5'-테트라메틸 베지딘), ABTS[2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)], OPD(o-페닐렌다이아민) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색 기질은 완충 용액(0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 이차 항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고, 이 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 상기 마커 단백질들의 존재 유무를 검출한다.

본 발명의 예후 예측용 키트에서 세척액은 인산염 완충 용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 구성된 완충 용액(PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합 반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 첨가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지 용액은 황산 용액(H2SO4)이 바람직하게 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 IL-17A, IFN-gamma, Ki-67, CD45RA, FoxP3 및 TNF-alpha에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암 환자의 면역 치료 후 예후 예측을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

본 발명의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법은 상기 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 IL-17A 및 IFN-gamma; Ki-67; CD45RA 및 FoxP3; 및 TNF-alpha에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 생물학적 시료는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으며, 바람직하게는 말초 혈액(peripheral blood)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 예시로, 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 IL-17A 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 IFN-gamma 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 예시로, 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 Ki-67 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 예시로, 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 CD45RA 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 FoxP3 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 예시로, 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 TNF-alpha 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 발현 수준을 측정하는 단계에서 상기 IL-17A 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함으로써 Th17 세포의 발현을 측정할 수 있다.

본 발명의 상기 발현 수준을 측정하는 단계에서 상기 IFN-gamma 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정함으로써 Th1 세포의 발현을 측정할 수 있다.

본 발명의 상기 발현 수준을 측정하는 단계에서 상기 CD45RA 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 FoxP3 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현 수준을 측정함으로써 활성화된 조절 T 세포(Effector Regulatory T Cell; eTreg 세포)의 발현을 측정할 수 있다.

본 발명에서 상기 IL-17A 및 IFN-gamma; Ki-67; CD45RA 및 FoxP3; TNF-alpha에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준은 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포에 대하여 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 IL-17A 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 IFN-gamma 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자;는 CD4+ T 세포에 대하여 그 발현이 측정되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 IL-17A, IFN-gamma, Ki-67, CD45RA, FoxP3 또는 TNF-alpha 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 IL-17A, IFN-gamma, Ki-67, CD45RA, FoxP3 또는 TNF-alpha 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 정보 제공 방법에서 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid), 앱타머(aptamer) 등에 관한 기재는 앞서 기재된 바와 중복되어 명세서의 과도한 복잡을 피하기 위하여 이하 그 자세한 기재를 생략한다.

본 발명에서 상기 IL-17A, IFN-gamma, Ki-67, CD45RA, FoxP3 또는 TNF-alpha 단백질의 발현 수준의 측정은 단백질 칩 분석, 면역 측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역 분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행될 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 IL-17A, IFN-gamma, Ki-67, CD45RA, FoxP3 또는 TNF-alpha 단백질의 발현 수준의 측정은 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM) 방법에 의할 수 있다.

본 발명에서 상기 다중 반응 모니터링 방법 시 내부 표준 물질은 타깃 펩타이드를 구성하는 특정 아미노산을 동위원소로 치환한 합성 펩타이드 또는 대장균 베타 갈락토시다아제를 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 IL-17A의 타깃 펩티드는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지거나; 상기 IFN-gamma의 타깃 펩티드는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지거나; 상기 Ki-67의 타깃 펩티드는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지거나; 상기 CD45RA의 타깃 펩티드는 서열번호 4로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지거나; 상기 FoxP3의 타깃 펩티드는 서열번호 5로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지거나; 상기 TNF-alpha을 대표하는 타깃 펩티드는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 IL-17A, IFN-gamma, Ki-67, CD45RA, FoxP3 또는 TNF-alpha 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 IL-17A 및 IL-17A, IFN-gamma, Ki-67, CD45RA, FoxP3 또는 TNF-alpha 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 IL-17A, IFN-gamma, Ki-67, CD45RA, FoxP3 또는 TNF-alpha 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준의 측정은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩에 의할 수 있다.

본 발명에서 상기 발현 수준을 측정하는 단계 시 상기 IL-17A 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 IFN-gamma 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현 수준은 목적하는 개체에 대하여 면역 치료의 수행 전, 수행 중 또는 수행 후 측정될 수 있으나, 바람직하게는 면역 치료의 수행 전에 측정될 수 있다.

본 발명에서 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 생물학적 시료 중 CD4+ T 세포에 대하여 IL-17A 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 IFN-gamma 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현 수준을 측정하며 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 IFN-gamma+ 세포 수에 대한 IL-17A+ 세포 수의 비율을 측정하며 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 IFN-gamma+ CD4+ T 세포 수, 바람직하게는 Th1 세포 수에 대한, IL-17A+ CD4+ T 세포 수, 바람직하게는 Th17 세포 수의 비율(Th17 세포수/Th1 세포수)을 측정하며 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 IFN-gamma+ 세포 수에 대한 IL-17A+ 세포 수의 비율이 대조군에 비하여 증가한 경우, 상기 암 면역 치료 후의 예후가 나쁠 것으로 예측할 수 있다.

본 발명에서 상기 IFN-gamma+CD4+ T 세포 수, 바람직하게는 Th1 세포 수에 대한, IL-17A+CD4+ T 세포 수, 바람직하게는 Th17 세포 수의 비율(Th17 세포수/Th1 세포수)이 대조군에 비하여 증가한 경우, 상기 암 면역 치료 후의 예후가 나쁠 것으로 예측할 수 있다.

본 발명에서 상기 목적하는 개체에 대하여 면역 치료의 수행 전 분리된 생물학적 시료에 있어서, 상기 IFN-gamma+ 세포 수에 대한 IL-17A+ 세포 수의 비율, 바람직하게는 IFN-gamma+ CD4+ T 세포 수에 대한 IL-17A+CD4+ T 세포 수의 비율, 보다 바람직하게는 Th1 세포 수에 대한 Th17 세포 수의 비율(Th17/Th1_pre)이 대조군에 비하여 증가한 경우, 상기 암 면역 치료 후의 예후가 나쁠 것으로 예측할 수 있다.

본 발명에서 상기 발현 수준을 측정하는 단계 시 상기 Ki-67 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준은 목적하는 개체에 대하여 면역 치료의 수행 전, 수행 중 또는 수행 후 측정될 수 있으나, 바람직하게는 면역 치료의 수행 후에 측정될 수 있다.

본 발명에서 상기 Ki-67 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계는 Ki-67+ 세포 수를 측정하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 생물학적 시료 중 CD8+ T 세포, 바람직하게는 PD-1+CD8+ T 세포 중 Ki-67+ 세포의 비율, 즉 PD-1+CD8+ T 세포 수에 대한 Ki-67+ 세포 수의 비율을 측정하며 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 Ki-67 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군에 비하여 증가한 경우, 상기 암 면역 치료 후의 예후가 나쁠 것으로 예측할 수 있다.

본 발명에서 상기 CD8+ T 세포에 있어서, 바람직하게는 PD-1+CD8+ T 세포 중 Ki-67+ 세포의 비율, 즉 PD-1+CD8+ T 세포 수에 대한 Ki-67+ 세포 수의 비율이 대조군에 비하여 증가한 경우, 상기 암 면역 치료 후의 예후가 나쁠 것으로 예측할 수 있다.

본 발명에서 상기 목적하는 개체에 대하여 면역 치료의 수행 후 분리된 생물학적 시료에 있어서, 상기 CD8+ T 세포, 바람직하게는 PD-1+CD8+ T 세포 중 Ki-67+ 세포의 비율, 즉 PD-1+CD8+ T 세포 수에 대한 Ki-67+ 세포 수의 비율(Ki-67_post)이 대조군에 비하여 증가한 경우, 상기 암 면역 치료 후의 예후가 나쁠 것으로 예측할 수 있다.

본 발명에서 상기 발현 수준을 측정하는 단계 시 상기 CD45RA 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 FoxP3 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현 수준은 목적하는 개체에 대하여 면역 치료의 수행 전, 수행 중 또는 수행 후 측정될 수 있으나, 바람직하게는 면역 치료 전 및 후 각각에서 상기 CD45RA 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 FoxP3 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자;의 발현량의 변화가 측정될 수 있다.

본 발명에서 상기 CD45RA 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 FoxP3 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계는 CD45RA-FoxP3^high 세포 수, 바람직하게는 CD25+CD127^lowCD45RA-FoxP3^high 세포(활성화된 조절 T 세포; Effector Regulatory T Cell; eTreg 세포) 수를 측정하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 생물학적 시료에 있어서, CD4+ T 세포 중 eTreg 세포의 비율, 즉 CD4+ T 세포 수에 대한 eTreg 세포 수의 비율을 측정하며 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 CD45RA 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자; 및 FoxP3 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 암 면역 치료 전에 비해 암 면역 치료 후가 대조군에 비해 감소한 경우, 상기 암 면역 치료 후의 예후가 나쁠 것으로 예측할 수 있다.

본 발명에서 상기 CD4+ T 세포 중 eTreg 세포의 비율, 즉 CD4+ T 세포 수에 대한 eTreg 세포 수의 비율이 대조군에 비하여 증가한 경우, 상기 암 면역 치료 후의 예후가 나쁠 것으로 예측할 수 있다.

본 발명에서 상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여, 암 면역 치료 전에 비해 암 면역 치료 후 CD4+ T 세포 중 eTreg 세포의 비율, 즉 CD4+ T 세포 수에 대한 eTreg 세포 수의 비율(eTreg_post/pre)이 대조군에 비해 감소한 경우, 상기 암 면역 치료 후의 예후가 나쁠 것으로 예측할 수 있다.

본 발명에서 상기 발현 수준을 측정하는 단계 시 상기 TNF-alpha 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준은 목적하는 개체에 대하여 면역 치료의 수행 전, 수행 중 또는 수행 후 측정될 수 있으나, 바람직하게는 면역 치료의 수행 후에 측정될 수 있다.

본 발명에서 상기 TNF-alpha 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계는 TNF-alpha+ 세포 수를 측정하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 생물학적 시료에 있어서, CD4+ T 세포 중 TNF-alpha+CD4+ T 세포의 비율, 즉 CD4+ T 세포 수에 대한 TNF-alpha+CD4+ T 세포 수의 비율을 측정하며 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 생물학적 시료에 있어서, CD8+ T 세포 중 TNF-alpha+CD8+ T 세포의 비율, 즉 CD8+ T 세포 수에 대한 TNF-alpha+CD8+ T 세포 수의 비율을 측정하며 수행될 수 있다.

본 발명에서 상기 TNF-alpha 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군에 비하여 증가한 경우, 상기 암 면역 치료 후의 예후가 나쁠 것으로 예측할 수 있다.

본 발명에서 상기 CD4+ T 세포 중 TNF-alpha+CD4+ T 세포의 비율, 즉 CD4+ T 세포 수에 대한 TNF-alpha+CD4+ T 세포 수의 비율이 대조군에 비하여 증가한 경우, 상기 암 면역 치료 후의 예후가 나쁠 것으로 예측할 수 있다.

본 발명에서 상기 CD8+ T 세포 중 TNF-alpha+CD8+ T 세포의 비율, 즉 CD8+ T 세포 수에 대한 TNF-alpha+CD8+ T 세포 수의 비율이 대조군에 비하여 증가한 경우, 상기 암 면역 치료 후의 예후가 나쁠 것으로 예측할 수 있다.본 발명에서 상기 목적하는 개체에 대하여 면역 치료의 수행 후 분리된 생물학적 시료에 있어서, 상기 CD4+ T 세포 중 TNF-alpha+CD4+ T 세포의 비율, 즉 CD4+ T 세포 수에 대한 TNF-alpha+CD4+ T 세포 수의 비율(CD4TNF_post) 이 대조군에 비하여 증가한 경우, 상기 암 면역 치료 후의 예후가 나쁠 것으로 예측할 수 있다.

본 발명에서 상기 목적하는 개체에 대하여 면역 치료의 수행 후 분리된 생물학적 시료에 있어서, 상기 CD8+ T 세포 중 TNF-alpha+CD8+ T 세포의 비율, 즉 CD8+ T 세포 수에 대한 TNF-alpha+CD8+ T 세포 수의 비율(CD8TNF_post)이 대조군에 비하여 증가한 경우, 상기 암 면역 치료 후의 예후가 나쁠 것으로 예측할 수 있다.본 발명에서 "대조군"이란 정상 대조군이거나, 암 환자의 면역 치료 후 면역 관련 이상 반응(irAEs)이 발생하지 아니한 환자의 모집단의 중앙값(해당 환자의 평균값)일 수 있다.

본 발명에서 상기 예후가 나쁠 것으로 예측하는 것은 암 환자의 면역 치료 후 치료 반응성이 낮은 것, 상기 면역 치료 후 면역 관련 이상 반응(irAEs)이 발생할 가능성이 높은 것, 또는 생존율이 낮은 것으로 예측하는 것을 포함할 수 있고, 바람직하게는 상기 면역 치료 후 면역 관련 이상 반응(irAEs)이 발생할 가능성이 높은 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 면역관문 억제제는 CTLA-4, PD-1 또는 PD-L1의 발현 억제제일 수 있고, 바람직하게는 항 CTLA-4 항체, 항 PD-1 항체 또는 항 PD-L1 항체일 수 있다.

본 발명에 의하는 경우 암 환자 중 면역 치료 후에 면역 관련 이상 반응(irAEs)과 같은 예후를 보일 환자군을 조기에 예측하여 맞춤형 치료를 받게 함으로써, 기대 수명을 연장할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른, TET(n = 31, (a)) 또는 NSCLC(n = 60, (b)) 환자에서 항-PD-1 치료 전과 7일 후에 얻은 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 사용하여 유세포 분석을 수행하여, PD-1+CD8+ T 세포에 대한 게이팅 후 Ki-67 발현을 나타낸 플롯으로, 항-PD-1 치료 전후의 말초 혈액 T 세포의 변화이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른, TET(n = 31, (a)) 또는 NSCLC(n = 60, (b)) 환자에서 항-PD-1 치료 전과 7일 후에 얻은 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 사용하여 유세포 분석을 수행하여, PD-1+CD8+ T 세포 중 Ki-67+ 세포의 백분율을 나타낸, 항-PD-1 치료 전후의 말초 혈액 T 세포의 변화이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른, TET(n = 31, (a)) 또는 NSCLC(n = 60, (b)) 환자에서 항-PD-1 치료 전과 7일 후에 얻은 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 사용하여 유세포 분석을 수행하여, HLA-DR+CD38+ 세포의 백분율을 나타낸, 항-PD-1 치료 전후의 말초 혈액 T 세포의 변화이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른, TET(n = 31, (a)) 또는 NSCLC(n = 60, (b)) 환자에서 항-PD-1 치료 전과 7일 후에 얻은 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 사용하여 유세포 분석을 수행하여 CD4+ T 세포에 대해 게이팅 한 후 Treg 세포의 서브 세트의 발현을 나타낸 플롯으로, 항-PD-1 치료 전후의 말초 혈액 T 세포의 변화이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른, TET(n = 31, (a)) 또는 NSCLC(n = 60, (b)) 환자에서 항-PD-1 치료 전과 7일 후에 얻은 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 사용하여 유세포 분석을 수행하여 총 Treg(CD25+CD127^lowFoxP3+) 세포의 백분율을 나타낸, 항-PD-1 치료 전후의 말초 혈액 T 세포의 변화이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른, TET(n = 31, (a)) 또는 NSCLC(n = 60, (b)) 환자에서 항-PD-1 치료 전과 7일 후에 얻은 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 사용하여 유세포 분석을 수행하여, eTreg(CD25+CD127^lowCD45RA-FoxP3^high) 세포의 백분율을 나타낸, 항-PD-1 치료 전후의 말초 혈액 T 세포의 변화이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른, TET(n = 31, (a)) 또는 NSCLC(n = 60, (b)) 환자에서 항-PD-1 치료 전과 7일 후에 얻은 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 사용하여 유세포 분석을 수행하여, CD4+ T 세포를 게이팅 한 후 IFN-gamma 및 IL-17A의 항-CD3 자극 생산을 나타낸 플롯으로, 항-PD-1 치료 전후의 말초 혈액 T 세포의 변화이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른, TET(n = 31, (a)) 또는 NSCLC(n = 60, (b)) 환자에서 항-PD-1 치료 전과 7일 후에 얻은 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 사용하여 유세포 분석을 수행하여 CD4+ T 세포 중 IFN-gamma+ 세포의 백분율을 나타낸, 항-PD-1 치료 전후의 말초 혈액 T 세포의 변화이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른, TET(n = 31, (a)) 또는 NSCLC(n = 60, (b)) 환자에서 항-PD-1 치료 전과 7일 후에 얻은 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 사용하여 유세포 분석을 수행하여 CD4+ T 세포 중 IL-17A+ 세포의 백분율을 나타낸, 항-PD-1 치료 전후의 말초 혈액 T 세포의 변화이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른, TET(n = 31, (a)) 또는 NSCLC(n = 60, (b)) 환자에서 항-PD-1 치료 전과 7일 후에 얻은 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 사용하여 유세포 분석을 수행하여 CD4+ T 세포 중 TNF-alpha+ 세포 의 백분율을 나타낸, 항-PD-1 치료 전후의 말초 혈액 T 세포의 변화이다.
도 11은 본 발명의 일 실시예에 따른, TET(n = 31, (a)) 또는 NSCLC(n = 60, (b)) 환자에서 항-PD-1 치료 전과 7일 후에 얻은 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 사용하여 유세포 분석을 수행하여 CD8+ T 세포 중 IFN-gamma+ 세포의 백분율을 나타낸, 항-PD-1 치료 전후의 말초 혈액 T 세포의 변화이다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른, TET(n = 31, (a)) 또는 NSCLC(n = 60, (b)) 환자에서 항-PD-1 치료 전과 7일 후에 얻은 말초 혈액 단핵구(PBMC)를 사용하여 유세포 분석을 수행하여 CD8+ T 세포 중 TNF-alpha+ 세포의 백분율을 나타낸, 항-PD-1 치료 전후의 말초 혈액 T 세포의 변화이다.
도 13은 본 발명의 일 실시예에 따른, irAEs를 겪은 TET 환자(n = 7; 붉은색)과 겪지 않은 TET 환자(n = 25; 파란색)의 항-PD-1 치료 전후의 CD4+ T 세포에서 eTreg 값(eTreg_post/pre)의 폴드변화를 나타낸 것이다.
도 14는 본 발명의 일 실시예에 따른, G4 간염 형태의 irAEs를 겪은 TET 환자와 irAEs를 겪지 않은 TET 환자의, 항-PD-1 치료 전후의 게이팅한 CD4+ 세포 중 eTreg 세포를 나타낸 플롯이다.
도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른, irAEs를 겪은 TET 환자(n = 7; 붉은색)과 겪지 않은 TET 환자(n = 25; 파란색)의 항-PD-1 치료 전의 Th17(IL-17A+CD4+ T 세포) 대 Th1(IFN-gamma+CD4+ T 세포)의 비율(Th17/Th1_pre)의 폴드변화를 나타낸 것이다.
도 16은 본 발명의 일 실시예에 따른, G4 신장염 형태의 irAEs를 겪은 TET 환자와 irAEs를 겪지 않은 TET 환자의, 항-PD-1 치료 전의 게이팅한 CD4+ 세포 중 Th17(IL-17A+CD4+ T 세포) 대 Th1(IFN-gamma+CD4+ T 세포)의 비율(Th17/Th1_pre)을 나타낸 플롯이다.
도 17은 본 발명의 일 실시예에 따른, irAEs를 겪은 NSCLC 환자(n = 6; 붉은색)과 겪지 않은 NSCLC 환자(n = 54; 파란색)의, 항-PD-1 치료 후 PD-1+CD8+ T 세포 중 Ki-67+ 세포의 백분율을 나타낸 것이다.
도 18은 본 발명의 일 실시예에 따른, G3 간염 형태의 irAEs를 겪은 NSCLC 환자와 irAEs를 겪지 않은 NSCLC 환자의, 항-PD-1 치료 후의 게이팅한 CD8+ 세포 중 Ki-67의 발현을 나타낸 플롯이다.
도 19는 본 발명의 일 실시예에 따른, 중증 irAE를 가진 13 명의 환자 (1명의 환자/행)에서 3 개의 T 세포 매개변수(Th17/Th1_pre, Ki-67_post 및 eTreg_post/pre)를 사용한 비지도 계층적 군집 z-점수를 나타낸 것이다.
도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른, Th17 관련 하위 군(n = 3, 왼쪽)의 Th17/Th1_pre 및 Th17 관련 하위 군 이외의 모든 환자(n = 88, 오른쪽)의 Th17/Th1_pre를 나타낸 것이다.
도 21은 본 발명의 일 실시예에 따른, CD8에서 Ki-67 관련 하위 군(n = 3, 왼쪽)의 항-PD-1 치료 후 Ki-67 및 Ki-67 관련 하위 군 이외의 모든 환자(n = 88, 오른쪽)의 항-PD-1 치료 후 Ki-67을 나타낸 것이다.
도 22는 본 발명의 일 실시예에 따른, Treg 관련 하위 군(n = 3, 왼쪽)에서 항-PD-1 치료 전후 eTreg 증감(eTreg_post/pre)및 Treg 관련 하위 군 이외의 모든 환자(n = 88, 오른쪽)에서 항-PD-1 치료 후 eTreg 증감(eTreg_post/pre)을 나타낸 것이다.
도 23은 본 발명의 일 실시예에 따른, NOS 하위 군(n = 4, 왼쪽)에서 항-PD-1 치료 후 CD4+ 세포에서 TNF-alpha+ 세포 비율 및 NOS 하위 군 이외의 모든 환자(n = 87, 오른쪽)에서 항-PD-1 치료 후 CD4+ 세포에서 TNF-alpha+ 세포 비율을 나타낸 것이다.
도 24는 본 발명의 일 실시예에 따른, NOS 하위 군(n = 4, 왼쪽)에서 항-PD-1 치료 후 CD8+ 세포에서 TNF-alpha+ 세포 비율 및 NOS 하위 군 이외의 모든 환자(n = 87, 오른쪽)에서 항-PD-1 치료 후 CD8+ 세포에서 TNF-alpha+ 세포 비율을 나타낸 것이다.
도 25는 본 발명의 일 실시예에 따른, 중증 irAEs를 가진 13 명의 환자 (1명의 환자/행)에서 5 개의 T 세포 매개변수(Th17/Th1_pre, Ki-67_post, eTreg_post/pre, CD4TNF_post 및 CD8TNF_post)를 사용한 비지도 계층적 군집 z-점수를 나타낸 것이다.
도 26은 본 발명 실시예에 따른, 중증 irAEs의 각 그룹에 대한 T 세포 매개 변수의 예측값을 각각 ROC 곡선으로 나타낸 것이다.
도 27은 본 발명 실시예에 따른, 각 마커에 대한 유세포 분석을 위한 게이팅 전략을 나타낸 것으로, (a)는 CD8+ T 세포에서 Ki-67 발현 수준을 측정하는 것이고, (b)는 CD4+ T 세포에서 나이브 Treg, eTreg 세포의 발현을 측정하는 것이고, (c)는 CD4+ T 세포 및 CD8+ T 세포에서 IL-17A, IFN-gamma, TNF-alpha의 발현 수준을 측정하는 것을 나타낸 것이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예

1.1 환자군 모집

펨브롤리주맙(3주마다 200mg)의 안전성과 효능을 평가 한 Ⅱ상 시험에 등록된 TET 환자 31 명이 포함되었다. 또한, 펨브롤리주맙(3주마다 200mg; n = 42) 또는 니볼루맙(2주마다 2mg/kg; n = 18)으로 치료된 전이성 NSCLC 환자 60 명을 모집하였다. TET 환자는 2016년 3월부터 2016년 6월까지 등록되었고 NSCLC 환자는 2016년 4월부터 2018년 2월 사이에 등록되었다. 전신 치료가 필요한 자가면역질환이 1년 이내에 발병한 환자, 간질성 폐질환 발병 환자, 전신치료가 필요한 감염이 발생한 환자, 알려진 인간의 병력 면역 결핍 바이러스 감염된 환자, B 형 간염 또는 C 형 간염 바이러스 감염이 발병한 환자, 또는 2 주 이내에 전신 화학 요법 또는 방사선 요법을 받은 환자의 경우는 이 연구에 포함하지 않았다. 말초 혈액은 치료 직전 및 항-PD-1 작용제의 첫 번째 투여 후 7일 뒤에 수집되었다. 말초혈액단핵세포(PBMC)를 표준 피콜-파크(Ficoll-PaqueTM, GE Healthcare, 스웨덴 웁살라) 밀도 구배 원심 분리에 의해 전혈로부터 분리하였다. 이 연구는 삼성 서울 병원(Samsung Medical Center)의 기관 검토위원회에 의해 승인되었으며 헬싱키 선언에 따라 수행되었다. 모든 환자는 연구에 포함되기 전에 사전 동의를 제공했다.

1.2 임상 평가

신체 검사 및 실험실 테스트는 2 주 또는 3 주마다 수행되었다. irAEs는 잠재적으로 약물-관련 면역학적 원인에 대한 임상적 관심의 부작용으로 정의되었다. 모든 부작용은 국립 암 연구소의 이상 반응(National Cancer Institute Common Terminology Criteria for Adverse Events, CECAE) 버전 4.0에 따라 등급이 매겨졌다. CECAE에 따르면, CECAE 1등급은 무증상, 경증 증상 또는 임상적 진단적 관찰만 일어나고 의료 개입이 지시되지 않으며, CECAE 2등급은 국소 또는 비 침습적 의료지시 또는 연령에 따라 일상생활의 제한이 지시되고, CECAE 3등급은 심각하거나 의학적으로 유의미하지만 생명을 위협하지는 않음, 입원, 입원의 연장, 신체장애, 일상생활에서 자기관리의 제한이 일어나며, CECAE 4등급은 생명을 위협하는 결과 또는 응급 조치가 지시되고, CECAE 5등급은 부작용과 관련된 사망이다. 여기서 3등급 이상의 irAEs는 중증 irAEs로 정의되었다. 환자에게서 중증 irAEs 증상이 나타나면 항-PD-1 치료는 보류되었고, 부작용이 마지막 투여 후 12주 이내에 해결되지 않거나, 12주 이내에 코르티코스테로이드를 하루에 10mg 이하(또는 하루 프레드니손 용량과 동등한 투여량)로 줄일 수 없는 경우 치료는 중단되었다.

종양 반응을 고형 종양에서의 반응 평가 기준(Response Evaluation Criteria In Solid Tumors, RECIST), 버전 1.1에 따라 평가하였다. 객관적인 반응은 방사선학적으로 확인된 완전 또는 부분 반응으로 정의되었다. 무진행생존(Progression-free survival, PFS)은 항-PD-1 치료 시작부터 질병 진행(RECIST 버전 1.1에 따름) 또는 모든 원인으로 인한 사망까지의 시간으로 정의되었다. 전체생존(Overall survival, OS)은 항-PD-1 치료의 시작부터 임의의 원인으로 인한 사망까지의 시간으로 정의되었다.

1.3 다색 유세포 분석 도구

다색 유세포 분석에 사용되는 플루오르 크롬 - 컨쥬게이티드 단일 클론 항체는 다음과 같다. 항-CD8(SK1 및 RPA-T8), 항-CD3(UCTH1 또는 SK7), 항-CD45RA(HI100), 항-CD4(SK3), 항-CD25(M-A251), 항-그랜자임B(GB11)은 모두 BD Biosciences(San Jose, CA) 제품이다. 항-PD-1(EH.12.2H7), 항-Ki-67(Ki-67), 항-CD38(HB7), 항-CD127(A019D5)은 모두 캘리포니아 주 샌디에고의 Biolegend 제품이다. 항-HLA-DR(LN3), 항-FoxP3(PCH101), 항-CD14(61D3), 항-CD19(HIB19)는 모두 eBioscience(San Diego, CA) 제품이다. 항-인간 IgG4 Fc(HP6025)는 Southern Biotech 제품이다.

LIVE / DEAD Fixable Red Dead Cell Stain Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 죽은 세포를 염색하고 분석에서 제외시켰다. 세포 내 Ki-67, 그랜자임 B 및 FoxP3는 FoxP3 전사 인자 염색 완충제 세트(eBioscience, San Diego, CA) 및 특정 항체를 사용하여 염색하였다. 모든 염색된 샘플을 LSR Ⅱ 유세포 분석기(BD Biosciences, San Jose, CA)에서 계수하고 FlowJo 소프트웨어 버전 10.4.0 (Treestar, San Carlos, CA)을 사용하여 데이터를 분석하였다.

1.4 세포 내 사이토카인 염색

세포 내 사이토카인 염색의 경우, PBMC를 항-CD3 항체(1μg/mL; OKT3, eBioscience)로 6 시간 동안 자극하였다. Brefeldin A(GolgiPlug, BD Biosciences)를 항-CD3 자극 1 시간 후에 첨가하였다. 사이토카인 생성은 항-인터페론(IFN)-gamma(B27), 항-종양괴사인자(TNF)-alpha(MAb11) 및 항-인터루킨(IL)-17A(N49-653)를 사용하여 세포 내 염색에 의해 분석하였고, 모든 항체는 BD Biosciences(캘리포니아 산호세) 제품을 사용하였다.

1.5 통계적 방법

연속 및 범주 형 변수는 도 1 내지 도 27에 표시된 대로 비교되었다. 일변량 로지스틱 회귀 분석을 사용하여 중증 irAEs 및 T- 세포 파라미터의 상관 관계를 평가하였다. 감독되지 않은 계층 적 클러스터링이 수행되었고 pheatmap 패키지 버전 1.0.12를 사용하여 히트맵을 생성되었다. 0.05 미만의 양면 P- 값이 유의한 것으로 간주되었다. 모든 통계 분석은 프리즘 소프트웨어 버전 6.0 (GraphPad, La Jolla, CA) 및 R 통계 소프트웨어 버전 3.2.2(R 통계학 재단, 오스트리아 비엔나)를 사용하여 수행되었다.

2.1 환자 특성

연구에서, TET 환자의 기준선 특징은 표 1에 포함되어 있고, NSCLC 환자의 기준선 특징은 표 2에 포함되어 있다. TET를 가진 31명의 환자는 펨브롤리주맙을, NSCLC를 가진 42 및 18 명의 환자는 각각 펨브롤리주맙 및 니볼루맙을 받았다. 이전에 ICI 약제로 치료한 환자는 없었다. 흉선종이 있는 한 환자는 이전에 중증 근무력증이 있었지만, 활성 질환의 징후는 없었으며, 펨브롤리주맙을 투여하기 전 면역 억제 치료를 받지 않은지 1년이 넘었다. 표 1 및 표 2의 P값은 중증 irAEs 발생과 irAEs 발생하지 않음 사이의 유의확률이다.

	총계	중증 irAEs	중증 irAEs 없음
특성	(n = 31)	(n = 7)	(n = 24)	P
나이, 중간값(범위), 세	58 (26-78)	59 (26-66)	58 (30-78)	0.73
성별, n(%)				0.21
남성	20 (64.5)	3 (42.9)	17 (70.8)
여성	11 (35.5)	4 (57.1)	7 (29.2)
조직학적 분류, n(%)				0.014
흉선종	6 (19.4)	4 (57.1)	2 (8.3)
흉선암	25 (80.6)	3 (42.9)	22 (91.7)
종양크기, 중간값(범위), cm	12.4 (1.7-27.0)	14.6 (4.1-27.0)	11.5 (1.7-22.6)	0.23
이전 자가면역 질환, n (%)				0.23
중증 근무력증	1 (3.2)	1 (14.3)	0
해당없음	30 (96.8)	6 (85.7)	24 (100)
이전 화학요법의 숫자, 중간값(범위)	2 (1-5)	3 (2-4)	2 (1-5)	0.10
항-PD-1 제제
펨브롤리주맙	31 (100)	7 (100)	24 (100)
니볼루맙	0	0	0
PD-L1 상태, n (%)				0.13
≥1%	18 (58.0)	7 (100)	11 (45.8)
< 1%	7 (22.6)	0	7 (29.2)
사용 불가	6 (19.4)	0	6 (25.0)

	총계	중증 irAEs	중증 irAEs 없음
특성	(n = 60)	(n = 6)	(n = 54)	P
나이, 중간값(범위), 세	65 (35-88)	65 (52-88)	65 (35-82)	0.88
성별, n(%)				0.32
남성	47 (78.3)	6 (100)	41 (75.9)
여성	13 (21.7)	0	13 (24.1)
조직학적 분류, n (%)				0.19
편평상피종	30 (50.0)	5 (83.3)	25 (46.3)
비-편평상피종	30 (50.0)	1 (16.7)	29 (53.7)
종양크기, 중간값(범위), cm	6.7 (0-15.7)	5.8 (2.0-7.5)	7.0 (0-15.7)	0.15
이전 자가면역 질환, n (%)				n.a.
중증 근무력증	0	0	0
해당없음	0	0	0
이전 화학요법의 숫자, 중간값(범위)	2 (0-9)	1 (0-3)	2 (0-9)	0.11
항-PD-1 제제				0.35
펨브롤리주맙	42 (70.0)	3 (50.0)	39 (72.2)
니볼루맙	18 (30.0)	3 (50.0)	15 (27.8)
PD-L1 상태, n (%)				0.61
≥1%	38 (63.3)	4 (66.7)	34 (63.0)
< 1%	11 (18.3)	2 (33.3)	9 (16.7)
사용 불가	11 (18.3)	0	11 (20.3)

2.2 항-PD-1 치료 전후 말초혈액 T 세포 분석

기준선 및 치료 후 7 일에 말초 혈액 CD8+ 및 CD4+ T 세포에서 하위 집단의 표현형 및 상대 빈도를 조사하였다. 유세포 분석에서 게이팅 전략은 도 27에 제시되어 있다. 먼저, 본 발명자들은 증식 마커(Ki-67) 및 활성화 마커(HLA-DR 및 CD38)의 발현에 대한 PD-1+CD8+ T 세포를 조사하였다. PD-1+CD8+ T 세포 중 Ki-67+ 세포(도 1 및 도 2) 및 HLA-DR+CD38+ 세포(도 3)의 백분율은 TET 및 NSCLC 환자에서 항-PD-1 치료 후 유의하게 증가하였다. 또한 CD4+CD25+CD127^lowFoxP3+ Treg 세포의 상대 빈도와 나이브 Treg 세포(CD45RA+FoxP3^low), 활성화된 조절 T 세포(eTreg 또는 이펙터 Treg 세포; CD45RA-FoxP3high) 및 비-억제 세포(CD45RA-FoxP3^low)와 같은 하위 집단을 평가했다(도 4). CD4+ T 세포 중 Treg 세포의 백분율은 항-PD-1 처리에 의해 변하지 않았지만(도 5), eTreg 세포의 백분율은 항-PD-1 처리에 의해 상당히 증가되었다(도 6). 나이브 Treg 세포 또는 비-억제 세포의 백분율은 변하지 않았다. 항-CD3 자극 후 세포 내 사이토카인 염색에 의해 CD4+ T 세포에 의한 이펙터 사이토카인의 생성을 평가하였다(도 7). 그러나, CD4 + T 세포 중 IFN-gamma+(도 8), IL-17A+ (도 9) 또는 TNF-alpha+(도 10)의 백분율은 항-PD-1 처리에 의해 크게 변하지 않았다. 유사하게, CD8+ T 세포 중 IFN-gamma+ 및 TNF-alpha+ 세포의 백분율은 크게 변하지 않았다(도 11 및 도 12).

2.3 중증 irAEs

16.3개월(평균 6.5-28.9 개월)의 중앙 추적 관찰에서 13 명의 환자에서 중증 irAEs가 발생하였다(TET 7명 및 NSCLC 6명). 중증 irAEs는 표 3 및 표 4에 요약 되어있다. 중증 irAEs까지의 걸린 시간의 중간값은 4주(범위, 1-28주)였으며, 11명의 환자는 3개월 내에 중증 irAEs가 발생했다(표 4). 중증 irAEs로 인해 11명의 환자에서 치료가 중단되었고, 중간값은 2회 주기(범위, 1-24 회)가 지시되었지만, 중증 irAEs가 발생하지 않은 환자는 중간값 7회의 치료주기(범위, 1-53 회)를 받았다. 중증의 irAEs를 가진 11 명의 환자는 항-PD-1 제제의 중단 및 면역 억제제의 투여에 의해 반응으로부터 완전히 회복되었다. NSCLC 환자 1명은 5등급 폐렴을 경험했으며, TET 환자 1명은 면역 억제 치료 동안 중첩된 거대 세포 바이러스 감염으로 사망하였다.

부작용	TET, n (%)	NSCLC, n (%)
간염	3 (9.7)	1 (1.7)
중증 근무력증	1 (3.2)	0
심근염	2 (6.5)	0
갑상선염	1 (3.2)	2 (3.3)
대장염	1 (3.2)	0
신장염	1 (3.2)	0
아급성 근간대경련	1 (3.2)	0
폐렴	0	3 (5.0)

범위	나이/ 성별	조직학적 분류	irAEs	Th17/Th1_pre	eTreg_post/pre	Ki-67_pre	CD8TNF_post	CD4TNF_post	기 존재 한 자가면역질환	항-PD-1 제제	irAEs 발병 시점 (주)
Th17 관련	60/여	흉선종 (B3)	G4 사구체신염	2.0	1.7	18.0	0.2	7.4	-	펨브롤리주맙	13
	64/여	흉선종 (B2)	G4 심근염, G3 갑상선기능저하증, G3 간염	1.0	1.2	8.7	6.9	6.5	-	펨브롤리주맙	4
	51/여	흉선종 (B2)	G4 심근염	1.4	1.1	14.4	3.0	3.7	-	펨브롤리주맙	4
TNF관련	65/남	편평상피암	G3 폐렴	0.04	1.1	11.3	27.1	7.8	-	펨브롤리주맙	4
	72/남	편평상피암	G3 갑상선기능저하증	0.08	1.2	23.3	22.3	18.4	-	니볼루맙	25
	57/남	편평상피암	G5 폐렴	0.05	1.0	20.7	13.8	11.2	-	펨브롤리주맙	4
	43/남	흉선암	G3 간염	0.2	0.7	10.3	22.5	21.0	-	펨브롤리주맙	4
	88/남	편평상피암	G3 갑상선기능저하증	0.003	1.2	13.1	18.6	28.4	-	니볼루맙	5
Treg관련	26/남	흉선암	G4 중증근무력증	0.5	0.4	22.6	2.2	8.2	-	펨브롤리주맙	4
	66/여	흉선종 (B2)	G4 간염, G3 대장염	0.003	0.7	24.6	0.2	7.4	중증근무력증	펨브롤리주맙	1
CD8관련	52/남	선암종	G3 폐렴	0.3	0.9	38.9	3.5	8.6	-	펨브롤리주맙	4
	59/남	흉선암	G3 아급성 근간대경련	0.3	1.4	34.0	3.4	5.6	-	펨브롤리주맙	28
	66/남	편평상피암	G3 간염	0.4	1.2	40.9	4.0	4.4	-	니볼루맙	1

중증 irAEs를 갖는 TET 환자가 흉선 암종보다 흉선종을 가질 가능성이 더 높다는 점을 제외하고, 중증 irAE를 갖거나 갖지 않은 환자간에 기준선 임상 병리학적 특성에서 유의미한 차이가 관찰되지 않았다(표 1 및 표 2). 또한 중증 irAEs가 발생한 환자는 중증 irAEs가 발생하지 않은 환자에 비해 객관적 반응률, PFS 및 OS에 유의한 차이가 없었다(표 5, 표 6, 표 7).

	전체 (n = 91)
위험 인자	중증irAEs (n = 13)	중증 irAEs 없음 (n = 78)	P
객관적 반응률, n (%)	4 (30.8)	19 (24.4)	0.73
PFS, 중간값 (95% CI), 개월	3.9 (0-8.8)	4.2 (2.3-6.1)	0.84
OS, 중간값 (95% CI), 개월	7.0 (5.5-8.5)	14.6 (10.4-18.8)	0.31

	TET (n = 31)
위험 인자	중증 irAEs (n = 7)	중증 irAEs 없음 (n = 24)	P
위험 인자	2 (33.3)	4 (16.7)	0.60
객관적 반응률, n (%)	3.9 (1.8-6.0)	5.9 (5.3-6.5)	0.28
PFS, 중간값 (95% CI), 개월	7.0 (3.5-10.5)	20.0 (7.1-32.9)	0.09

	NSCLC (n = 60)
위험 인자	중증 irAEs (n = 6)	중증 irAEs 없음 (n = 54)	P
위험 인자	2 (33.3)	15 (27.8)	1.00
객관적 반응률, n (%)	1.7 (0-7.1)	3.2 (1.0-5.5)	0.58
PFS, 중간값 (95% CI), 개월	6.1 (n.a.)	11.5 (5.5-17.5)	0.96

2.4. 중증 irAEs와 관계있는 말초혈액 T 세포 매개변수

다음으로, 우리는 TET(표 8) 및 NSCLC(표 9) 환자의 각 코호트에서 중증 irAEs와 상관되는 T-세포 매개 변수를 찾으려고 시도했다. 중증 irAEs가 있는 환자와 없는 환자 사이에 유의한 차이(표 8 및 표 9)와 일 변량 로지스틱 회귀분석(표 10)에서 중증 irAEs와의 유의한 연관성을 나타내는 파라미터가 선택되었다.

TET 환자에서, 치료 후 eTreg 빈도에서의 더 낮은 폴드변화(eTreg_post/pre; 교차비(OR) 0.06, 95 % 신뢰구간(CI) 0.00-0.95, P=0.046; 표 10, 도 13 및 도 14) 및 CD4+ T 세포 중 IL-17A+ 세포 및 IFN-gamma+ 세포의 더 높은 기준선 비율(Th17/Th1_pre; 교차비(OR) 6.52, 95 % 신뢰구간(CI) 1.09-39.22, P = 0.040; 표 10, 도 15 및 도 16)은 중증 irAEs의 발달과 관련이 있다.

NSCLC 환자에서, 치료 후 PD-1+CD8+ T 세포 중 Ki-67+ 세포의 더 높은 빈도(Ki-67_post; 교차비(OR) 1.12, 95 % 신뢰구간(CI) 1.03-1.22, P = 0.008; 표 10, 도 17 및 도 18)는 중증 irAEs의 발달과 유의한 관련이 있었다.

매개변수	중증irAEs, 중간값(범위)	중증 irAEs 없음, 중간값(범위)	P
Ki-67+/PD-1+CD8+ T 세포
치료 전, %	3.93 (0.99-23.9)	6.69 (2.86-19.4)	0.96
치료 후, %	11.7 (1.27-38.1)	22 (11.3-40.9)	0.40
폴드변화	2.82 (0.38-8.23)	2.83 (2.01-4.64)	0.28
HLA-DR+CD38+/ PD-1+CD8+ T 세포
치료 전, %	7 (2.16-33.1)	11.72 (4.67-43.4)	0.89
치료 후, %	16.65 (4.15-59)	25.85 (12.9-77)	0.94
폴드변화	2.05 (1.22-8.24)	2.13 (1.77-3.7)	0.65
Treg (CD25+CD127^lowFoxP3+)/CD4+ T 세포
치료 전, %	6.81 (2.43-21)	6.09 (2.75-6.96)	0.60
치료 후, %	6.9 (3.34-15.4)	5.29 (3.42-9.06)	0.32
폴드변화	1.11 (0.55-1.91)	1.04 (0.81-1.48)	0.026^*
eTreg (CD25+CD127^lowCD45RA-FoxP3^high) /CD4+ T 세포
치료 전, %	2.28 (0.33-13.6)	1.66 (1.24-2.57)	0.52
치료 후, %	3.04 (1.01-6.14)	1.79 (1.46-2.99)	0.38
폴드변화	1.35 (0.43-6.05)	1.14 (0.9-1.2)	0.026*
비 억제 세포 (CD25+CD127^lowCD45RA-FoxP3^low) /CD4+ T 세포
치료 전, %	3.91 (1.48-9.25)	3.12 (1.47-4.26)	0.81
치료 후, %	3.7 (1.35-9.75)	2.95 (1.93-6.51)	0.81
폴드변화	0.97 (0.6-1.5)	0.97 (0.75-2.46)	0.20
TNF-alpha+/CD4+ T 세포
치료 전, %	6.66 (0.69-34.7)	7.6 (3.99-33.1)	0.96
치료 후, %	5.84 (0.57-34.1)	9.88 (4.37-28.44)	0.42
폴드변화	0.93 (0.3-2.28)	1.03 (0.86-1.74)	0.20
IFN-gamma+/CD4+ T 세포
치료 전, %	3.01 (0.26-23.18)	3.19 (1.21-27.65)	0.48
치료 후, %	2.59 (0.26-20.85)	4.59 (1.52-24.6)	0.89
폴드변화	1.02 (0.28-2.62)	1.16 (0.81-2.02)	0.29
IL-17A+/CD4+ T 세포
치료 전, %	0.37 (0.08-2.24)	0.33 (0.08-0.84)	0.07
치료 후, %	0.46 (0.05-1.92)	0.33 (0.15-1.45)	0.17
폴드변화	0.98 (0.26-2.58)	1.38 (0.71-3.31)	0.28
Th17/Th1 비율
치료 전	0.159 (0.027-1.093)	0.062 (0.003-0.431)	0.047^*
치료 후	0.17 (0.01-1.15)	0.09 (0.01-0.43)	0.20
폴드변화	1.08 (0.28-2.82)	0.76 (0.41-1.17)	0.032*
TNF-alpha+/CD8+ T 세포
치료 전, %	11.93 (0.69-49.1)	15.39 (2.1-25.43)	0.019*
치료 후, %	11.43 (0.94-44.46)	16.18 (3.49-27.07)	0.07
폴드변화	0.89 (0.37-1.97)	1.06 (0.71-1.92)	0.56
IFN-gamma+/CD8+ T 세포
치료 전, %	18.19 (0.78-53.02)	18.24 (3.98-35.4)	0.042*
치료 후, %	22.04 (0.89-57)	18.74 (4.64-31.14)	0.014*
폴드변화	0.95 (0.4-1.56)	1.07 (0.83-1.66)	0.30

매개변수	중증irAEs, 중간값(범위)	중증 irAEs 없음, 중간값(범위)	P
Ki-67+/PD-1+CD8+ T 세포
치료 전, %	3.93 (0.99-23.9)	6.69 (2.86-19.4)	0.10
치료 후, %	11.7 (1.27-38.1)	22 (11.3-40.9)	0.012*
폴드변화	2.82 (0.38-8.23)	2.83 (2.01-4.64)	0.61
HLA-DR+CD38+/ PD-1+CD8+ T 세포
치료 전, %	7 (2.16-33.1)	11.72 (4.67-43.4)	0.22
치료 후, %	16.65 (4.15-59)	25.85 (12.9-77)	0.12
폴드변화	2.05 (1.22-8.24)	2.13 (1.77-3.7)	0.45
Treg (CD25+CD127^lowFoxP3+)/CD4+ T 세포
치료 전, %	6.81 (2.43-21)	6.09 (2.75-6.96)	0.13
치료 후, %	6.9 (3.34-15.4)	5.29 (3.42-9.06)	0.10
폴드변화	1.11 (0.55-1.91)	1.04 (0.81-1.48)	0.69
eTreg (CD25+CD127^lowCD45RA-FoxP3^high) /CD4+ T 세포
치료 전, %	2.28 (0.33-13.6)	1.66 (1.24-2.57)	0.46
치료 후, %	3.04 (1.01-6.14)	1.79 (1.46-2.99)	0.05
폴드변화	1.35 (0.43-6.05)	1.14 (0.9-1.2)	0.043*
비 억제 세포 (CD25+CD127^lowCD45RA-FoxP3^low) /CD4+ T 세포
치료 전, %	3.91 (1.48-9.25)	3.12 (1.47-4.26)	0.15
치료 후, %	3.7 (1.35-9.75)	2.95 (1.93-6.51)	0.42
폴드변화	0.97 (0.6-1.5)	0.97 (0.75-2.46)	0.81
TNF-α+/CD4+ T 세포
치료 전, %	6.66 (0.69-34.7)	7.6 (3.99-33.1)	0.31
치료 후, %	5.84 (0.57-34.1)	9.88 (4.37-28.44)	0.08
폴드변화	0.93 (0.3-2.28)	1.03 (0.86-1.74)	0.29
IFN-gamma+/CD4+ T 세포
치료 전, %	3.01 (0.26-23.18)	3.19 (1.21-27.65)	0.34
치료 후, %	2.59 (0.26-20.85)	4.59 (1.52-24.6)	0.17
폴드변화	1.02 (0.28-2.62)	1.16 (0.81-2.02)	0.45
IL-17A+/CD4+ T 세포
치료 전, %	0.37 (0.08-2.24)	0.33 (0.08-0.84)	0.27
치료 후, %	0.46 (0.05-1.92)	0.33 (0.15-1.45)	0.69
폴드변화	0.98 (0.26-2.58)	1.38 (0.71-3.31)	0.15
Th17/Th1 비율
치료 전	0.159 (0.027-1.093)	0.062 (0.003-0.431)	0.14
치료 후	0.17 (0.01-1.15)	0.09 (0.01-0.43)	0.21
폴드변화	0.85 (0.26-6.86)	1.35 (0.51-3.72)	0.40
TNF-alpha+/CD8+ T 세포
치료 전, %	11.93 (0.69-49.1)	15.39 (2.1-25.43)	0.96
치료 후, %	11.43 (0.94-44.46)	16.18 (3.49-27.07)	0.69
폴드변화	0.89 (0.37-1.97)	1.06 (0.71-1.92)	0.29
IFN-gamma+/CD8+ T 세포
치료 전, %	18.19 (0.78-53.02)	18.24 (3.98-35.4)	0.63
치료 후, %	22.04 (0.89-57)	18.74 (4.64-31.14)	0.98
폴드변화	0.95 (0.4-1.56)	1.07 (0.83-1.66)	0.23

매개변수	OR (95% CI)	P
TET 환자
Treg의 폴드변화	0.01 (0.0-1.17)	0.057
eTreg의 폴드변화	0.06 (0.0-0.95)	0.046^a
치료 전 Th17/Th1 비율	6.52 (1.09-39.22)	0.040^*
Th17/Th1 비율의 폴드변화	0.07 (0.0-1.24)	0.069
치료 전 TNF-alpha+/CD8+ T 세포	0.81 (0.65-1.02)	0.079
치료 전 IFN-gamma+/CD8+ T 세포	0.86 (0.66-1.12)	0.254
치료 후 IFN-gamma+/CD8+ T 세포	0.90 (0.73-1.11)	0.331
NSCLC 환자
치료 후 Ki-67+/PD-1+CD8+ T 세포	1.12 (1.03-1.22)	0.008^a
eTreg 세포의 폴드변화	0.23 (0.03-2.01)	0.183

2.5. 중증 irAEs를 별개의 아형으로 군집화 하기

eTreg_post/pre, Th17/Th1_pre 및 Ki-67_post는 중증 irAE와 상관 관계가 있는 T 세포 매개변수로 확인되었기 때문에, 중증 irAEs를 가진 13 명의 환자에서 이러한 매개 변수로 비지도 군집분석을 수행하였다. 이 1차 군집 분석에서, 중증 irAE를 가진 환자는 Th17 관련, CD8 관련, Treg 관련 및 달리 지정되지 않은(not otherwise specified, NOS) 4가지 하위 그룹으로 군집되어 있음을 발견하였다(도 19). Th17 관련 하위 그룹은 Th17/Th1_pre 값이 높았고(도 20), CD8 관련 하위 그룹은 Ki-67_post 값이 높았다(도 21). Treg 관련 하위 그룹은 eTreg_post/pre 비율이 낮았고(도 22), NOS 하위 군은 3가지 위험 변수를 갖지 않았다. NOS 부분 군과 관련된 위험 변수를 찾기 위해 표 8 및 표 9에 나열된 T 세포 매개 변수를 추가로 분석했다. CD4+(CD4TNF_post; 도 23) 및 CD8+(CD8TNF_post; 도 24) T 세포 중 TNF-alpha+ 세포의 치료 후 백분율은 다른 모든 환자보다 NOS 하위 군에서 유의하게 더 높았다.

마지막으로, 중증 irAEs 환자 13명에서 eTreg_post/pre, Th17/Th1_pre, Ki-67_post, CD4TNF_post 및 CD8TNF_post를 포함한 5 가지 중요한 매개 변수를 사용하여 클러스터링 분석을 다시 수행했다. 재클러스터링 분석은 Th17 관련(높은 Th17/Th1_pre), TNF 관련(높은 CD4TNF_post 및 CD8TNF_post), Treg 관련(낮은 eTreg_post/pre) 및 CD8 관련(높은 Ki-67_post)의 네 가지 하위 그룹을 나타냈다 (도 25 및 표 4). 각 위험 매개 변수는 각 하위 그룹에 고유했으며 하위 그룹 중 높은 Th17/Th1_pre, 높은 CD4TNF_post 및 CD8TNF_post, 낮은 eTreg_post/pre 또는 높은 Ki-67_post의 여러 기능을 갖지 않았다.

2.6. 중증 irAEs의 각 하위그룹에 대한 T 세포 매개변수의 예측값

높은 Th17/Th1_pre, 높은 CD4TNF_post 및 CD8TNF_post, 낮은 eTreg_post/pre 및 높은 Ki-67_post은 각각 상응하는 Th17 관련, TNF 관련, Treg 관련 및 CD8 관련 하위 그룹에 해당하는 특징이기에, 우리는 중증 irAEs의 각 하위 군을 예측하는데 있어서 각각의 매개변수의 예측 값만을 평가하였다. 높은 Th17/Th1_pre, 높은 CD4TNF_post 및 CD8TNF_post, 낮은 eTreg_post/pre 또는 높은 Ki-67_post는 ROC 분석에서 중증 irAEs의 해당 하위 그룹을 개발하는 데 중요한 예측 값을 나타내었다(도 26, 표 11).

매개변수	상응하는 중증 irAEs AUC (95% CI)	총 중증 irAEs AUC (95% CI)
Th17/Th1_pre	0.98 (0.95-1.00)	0.55 (0.33-0.76)
CD4TNF_post	0.87 (0.75-1.00)	0.65 (0.52-0.79)
CD8TNF_post	0.82 (0.71-0.93)	0.60 (0.41-0.79)
eTreg_post/pre	0.97 (0.91-1.00)	0.75 (0.62-0.87)
Ki-67_post	0.97 (0.93-1.00)	0.73 (0.59-0.87)

상기 결과를 바탕으로 암의 면역 치료 후 IL-17A 및 IFN-gamma; Ki-67; CD45RA 및 FoxP3; TNF-alpha 바이오 마커를 통하여 면역 관련 이상 반응(immune-related adverse events; irAEs) 발생이 예견되는 환자를 선별하여, 암 환자 중 면역 치료 후에 면역 관련 이상 반응(immune-related adverse events; irAEs)과 같은 예후를 보일 환자군을 조기에 예측하여 맞춤형 치료를 받게 함으로써, 기대 수명을 연장할 수 있을 것으로 기대된다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Advanced Institute of Science and Technology <120> Biomarkers for predicting prognosis after immunotherapy of cancer <130> PDPB194188 <160> 6 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 155 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Pro Gly Lys Thr Ser Leu Val Ser Leu Leu Leu Leu Leu Ser 1 5 10 15 Leu Glu Ala Ile Val Lys Ala Gly Ile Thr Ile Pro Arg Asn Pro Gly 20 25 30 Cys Pro Asn Ser Glu Asp Lys Asn Phe Pro Arg Thr Val Met Val Asn 35 40 45 Leu Asn Ile His Asn Arg Asn Thr Asn Thr Asn Pro Lys Arg Ser Ser 50 55 60 Asp Tyr Tyr Asn Arg Ser Thr Ser Pro Trp Asn Leu His Arg Asn Glu 65 70 75 80 Asp Pro Glu Arg Tyr Pro Ser Val Ile Trp Glu Ala Lys Cys Arg His 85 90 95 Leu Gly Cys Ile Asn Ala Asp Gly Asn Val Asp Tyr His Met Asn Ser 100 105 110 Val Pro Ile Gln Gln Glu Ile Leu Val Leu Arg Arg Glu Pro Pro His 115 120 125 Cys Pro Asn Ser Phe Arg Leu Glu Lys Ile Leu Val Ser Val Gly Cys 130 135 140 Thr Cys Val Thr Pro Ile Val His His Val Ala 145 150 155 <210> 2 <211> 144 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Gln Asp Pro Tyr Val Lys Glu Ala Glu Asn Leu Lys Lys Tyr Phe 1 5 10 15 Asn Ala Gly His Ser Asp Val Ala Asp Asn Gly Thr Leu Phe Leu Gly 20 25 30 Ile Leu Lys Asn Trp Lys Glu Glu Ser Asp Arg Lys Ile Met Gln Ser 35 40 45 Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Lys Asn Phe Lys Asp Asp 50 55 60 Gln Ser Ile Gln Lys Ser Val Glu Thr Ile Lys Glu Asp Met Asn Val 65 70 75 80 Lys Phe Phe Asn Ser Asn Lys Lys Lys Arg Asp Asp Phe Glu Lys Leu 85 90 95 Thr Asn Tyr Ser Val Thr Asp Leu Asn Val Gln Arg Lys Ala Ile His 100 105 110 Glu Leu Ile Gln Val Met Ala Glu Leu Ser Pro Ala Ala Lys Thr Gly 115 120 125 Lys Arg Lys Arg Ser Gln Met Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Gln 130 135 140 <210> 3 <211> 3256 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Trp Pro Thr Arg Arg Leu Val Thr Ile Lys Arg Ser Gly Val Asp 1 5 10 15 Gly Pro His Phe Pro Leu Ser Leu Ser Thr Cys Leu Phe Gly Arg Gly 20 25 30 Ile Glu Cys Asp Ile Arg Ile Gln Leu Pro Val Val Ser Lys Gln His 35 40 45 Cys Lys Ile Glu Ile His Glu Gln Glu 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Lys Pro Tyr Thr Lys Tyr Val Leu Ser Leu His Ala Tyr Ile Ile 450 455 460 Ala Lys Val Gln Arg Asn Gly Ser Ala Ala Met Cys His Phe Thr Thr 465 470 475 480 Lys Ser Ala Pro Pro Ser Gln Val Trp Asn Met Thr Val Ser Met Thr 485 490 495 Ser Asp Asn Ser Met His Val Lys Cys Arg Pro Pro Arg Asp Arg Asn 500 505 510 Gly Pro His Glu Arg Tyr His Leu Glu Val Glu Ala Gly Asn Thr Leu 515 520 525 Val Arg Asn Glu Ser His Lys Asn Cys Asp Phe Arg Val Lys Asp Leu 530 535 540 Gln Tyr Ser Thr Asp Tyr Thr Phe Lys Ala Tyr Phe His Asn Gly Asp 545 550 555 560 Tyr Pro Gly Glu Pro Phe Ile Leu His His Ser Thr Ser Tyr Asn Ser 565 570 575 Lys Ala Leu Ile Ala Phe Leu Ala Phe Leu Ile Ile Val Thr Ser Ile 580 585 590 Ala Leu Leu Val Val Leu Tyr Lys Ile Tyr Asp Leu His Lys Lys Arg 595 600 605 Ser Cys Asn Leu Asp Glu Gln Gln Glu Leu Val Glu Arg Asp Asp Glu 610 615 620 Lys Gln Leu Met Asn Val Glu Pro Ile His Ala Asp Ile Leu Leu Glu 625 630 635 640 Thr Tyr Lys Arg Lys Ile Ala Asp Glu Gly Arg Leu Phe Leu Ala Glu 645 650 655 Phe 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130 135 140 Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala 145 150 155 160 Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro 165 170 175 Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu 180 185 190 Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu 195 200 205 Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly 210 215 220 Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu 225 230

Claims

IL-17A(Interleukin-17A) 및 IFN-gamma(Interferon-gamma) 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 포함하는 암 환자의 면역 치료 후 예후 예측용 바이오 마커 조성물로서,
상기 암은 흉선 상피성 종양, 또는 비소세포폐암이고,
상기 IL-17A 및 IFN-gamma는 암 면역 치료 전의 생물학적 시료를 대상으로 발현 수준이 측정되어, IFN-gamma+CD4+ T 세포 수에 대한 IL-17A+CD4+ T 세포 수의 비율이 대조군에 비하여 증가하는 경우, 암 면역 치료 후 면역 관련 이상 반응(immune-related adverse events, irAEs)의 발생 가능성이 높을 것으로 예측하는 것으로,
상기 면역치료는 PD-1 억제제를 이용한 면역 치료인, 바이오 마커 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 바이오 마커 조성물은 Ki-67, CD45RA(cluster of differentiation 45 RA), FoxP3(Forkhead box protein 3), 및 TNF-alpha(tumor necrosis factor-alpha)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 것인, 바이오 마커 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 단백질은 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 측정되는 것인, 바이오 마커 조성물.
제 1항에 있어서,
상기 단백질을 코딩하는 유전자는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상으로 측정되는 것인, 바이오 마커 조성물.
IL-17A 및 IFN-gamma 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 환자의 면역 치료 후 예후 예측용 조성물로서,
상기 암은 흉선 상피성 종양, 또는 비소세포폐암이고,
상기 IL-17A 및 IFN-gamma는 암 면역 치료 전의 생물학적 시료를 대상으로 발현 수준이 측정되어, IFN-gamma+CD4+ T 세포 수에 대한 IL-17A+CD4+ T 세포 수의 비율이 대조군에 비하여 증가하는 경우, 암 면역 치료 후 면역 관련 이상 반응(immune-related adverse events, irAEs)의 발생 가능성이 높을 것으로 예측하는 것으로,
상기 면역치료는 PD-1 억제제를 이용한 면역 치료인 암 환자의 면역 치료 후 예후 예측용 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 예후 예측용 조성물은 Ki-67, CD45RA, FoxP3, 및 TNF-alpha로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 추가로 포함하는 것인, 암 환자의 면역 치료 후 예후 예측용 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 암 면역 치료 후 예후 예측용 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 암 면역 치료 후 예후 예측용 조성물.
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(a) 목적하는 개체로부터 암 면역 치료 전 분리된 생물학적 시료에서 IFN-gamma+CD4+ T 세포 수, 및 IL-17A+CD4+ T 세포 수를 측정하는 단계; 및,
(b) IFN-gamma+CD4+ T 세포 수에 대한 IL-17A+CD4+ T 세포 수의 비율이 대조군에 비하여 증가하는 경우, 암 면역 치료 후 면역 관련 이상 반응(immune-related adverse events, irAEs)의 발생 가능성이 높을 것으로 예측하는 단계;를 포함하고,
상기 면역치료는 PD-1 억제제를 이용한 면역 치료이며,
상기 암은 흉선 상피성 종양, 또는 비소세포폐암인, 암 면역 치료 후 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
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제 10항에 있어서,
(c) 목적하는 개체로부터 암 면역 치료 후 분리된 생물학적 시료에서 PD-1+CD8+ T 세포 수, 및 Ki-67+ 세포 수를 측정하는 단계; 및,
(d) PD-1+CD8+ T 세포 수에 대한 Ki-67+ 세포 수의 비율이 대조군에 비하여 증가한 경우, 암 면역 치료 후 면역 관련 이상 반응(immune-related adverse events, irAEs)의 발생 가능성이 높을 것으로 예측하는 단계;를 추가로 포함하는, 암 면역 치료 후 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
제 10항에 있어서,
(c) 목적하는 개체로부터 암 면역 치료 전과 후에 분리된 각각의 생물학적 시료에서 CD45RA-FoxP3^high 세포 수를 측정하는 단계; 및,
(d) 암 면역 치료 후 측정된 CD45RA-FoxP3^high 세포 수가 암 면역 치료 전 측정된 CD45RA-FoxP3^high 세포 수에 비하여 감소한 경우 암 면역 치료 후 면역 관련 이상 반응(immune-related adverse events, irAEs)의 발생 가능성이 높을 것으로 예측하는 단계;를 추가로 포함하는, 암 면역 치료 후 예측을 위한 정보 제공 방법.
제 10항에 있어서,
(c) 목적하는 개체로부터 암 면역 치료 후 분리된 생물학적 시료에서 CD4+ T 세포 수에 대한 TNF-alpha+CD4+ T 세포 수의 비율 또는 CD8+ T 세포 수에 대한 TNF-alpha+CD8+ T 세포 수의 비율을 측정하는 단계; 및,
(d) CD4+ T 세포 수에 대한 TNF-alpha+CD4+ T 세포 수의 비율 또는 CD8+ T 세포 수에 대한 TNF-alpha+CD8+ T 세포의 비율이 대조군에 비하여 증가한 경우, 암 면역 치료 후 면역 관련 이상 반응(immune-related adverse events, irAEs)의 발생 가능성이 높을 것으로 예측하는 단계;를 추가로 포함하는, 암 면역 치료 후 예측을 위한 정보 제공 방법.
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