KR102535150B1 - 암의 예후 예측용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암의 예후 예측을 위한 조성물, 이를 포함하는 예후 예측용 키트 및 상기 조성물을 이용하여 암의 예후 예측을 위해 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

Description

암의 예후 예측용 조성물{Composition for Predicting Cancer Prognosis}
본 발명은 암의 예후를 예측할 수 있는 조성물, 이를 포함하는 예후 예측용 키트 및 상기 조성물을 이용하여 암의 예후 예측을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
전 세계에서 유방암은 폐암에 이어 두 번째로 흔히 발생되는 암이며, 사망률은 5위에 해당하는 위험한 암이다. 특히 최근에는 저출산, 짧은 수유기간, 이른 초경, 늦은 폐경 등 생리적으로 왕성한 신체적 변화를 겪는 시기의 여성들에서는 여성호르몬의 자극을 받는 횟수의 급격한 증가로 인한 유선조직의 민감도 증가, 식생활의 서구화, 생활환경의 오염 등의 이유로 유방암 발생이 급격하게 증가하고 있다. 유방암의 경우 일단 암세포가 주변 조직에 침범하거나 림프절로 전이가 시작되면 완치가 어렵기 때문에 조기 발견이 다른 암보다 더 중요하다고 할 수 있다.
유방암으로 인한 사망률을 줄이기 위해서는 첫째, 유방암을 조기 진단하고, 둘째, 일차 수술에 의한 치료 이후 예후를 예측하여 적절한 부가 치료 (Adjuvant therapy)를 하는 것이 중요하다.
실제 임상에서는 이상 소견이 있으면 세침흡입세포검사법, 자기공명촬영법 등을 부가적으로 사용하여 진단율을 높이고 있으나, 정상조직과 비 정상조직을 형태상으로 구분할 뿐 악성종양(cancer)과 양성종양(non-cancer)을 구분하기가 쉽지 않기 때문에 확진을 위해서는 더욱 정밀한 조직검사를 하게 된다. 이와 같은 이유들로 인해 유방암은 다른 암에 비해 비교적 분자 유전학적인 방법으로 유방암을 진단하는 방법이 발달되어 있다.
따라서, 지금까지 대부분의 연구는 유방암의 조기 발견에 초점을 맞추고 있어 유방암에 대한 선행항암요법과의 관계 및 예후 예측에 대한 성공적인 연구 결과는 거의 없었다. 따라서, 유방암 환자를 수술하기 전에 수술 후의 치료에 따른 예후를 예측할 수 있는 바이오 마커에 대한 연구가 필요한 실정이다.
본 발명의 일 목적은 암 중에서도 특히 유방암의 예후를 예측하는 조성물을 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암의 예후를 예측하는 키트를 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암의 예후를 예측하는 정보 제공 방법을 제공하고자 한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
이하, 본원에 기재된 다양한 구현예가 도면을 참조로 기재된다. 하기 설명에서, 본 발명의 완전한 이해를 위해서, 다양한 특이적 상세사항, 예컨대, 특이적 형태, 조성물 및 공정 등이 기재되어 있다. 그러나, 특정의 구현예는 이들 특이적 상세 사항 중 하나 이상 없이, 또는 다른 공지된 방법 및 형태와 함께 실행될 수 있다. 다른 예에서, 공지된 공정 및 제조 기술은 본 발명을 불필요하게 모호하게 하지 않게 하기 위해서, 특정의 상세사항으로 기재되지 않는다. "한 가지 구현예" 또는 "구현예"에 대한 본 명세서 전체를 통한 참조는 구현예와 결부되어 기재된 특별한 특징, 형태, 조성 또는 특성이 본 발명의 하나 이상의 구현예에 포함됨을 의미한다. 따라서, 본 명세서 전체에 걸친 다양한 위치에서 표현된 "한 가지 구현예에서" 또는 "구현예"의 상황은 반드시 본 발명의 동일한 구현예를 나타내지는 않는다. 추가로, 특별한 특징, 형태, 조성, 또는 특성은 하나 이상의 구현예에서 어떠한 적합한 방법으로 조합될 수 있다.
본 발명 내 특별한 정의가 없으면 본 명세서에 사용된 모든 과학적 및 기술적인 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다.
본 발명의 일 구현 예에 따르면, 아포리포단백질 C1(Apolipoprotein C-I; APOC1), 탄산탈수효소 1 단백질(Carbonic anhydrase 1; CA1), 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질(Neural cell adhesion molecule L1-like protein; CHL1) 중 적어도 하나의 단백질; 상기 단백질의 단편; 또는 상기 단백질 또는 상기 단편을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암의 예후 예측을 위한 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 "아포리포단백질" C1은 인간 19번 염색체의 APOC1 유전자에 의해 코딩되며, 아포리포단백질 C 패밀리의 구성원이다. 상기 APOC1 유전자는 주로 간에서 발현되며 단핵구가 대식세포로 분화될 때 활성화된다. 대안적으로 이 유전자에 대해 접합된 전사 변이체가 발견되었지만, 일부 변이체의 생물학적 유효성은 결정되지 않았다. 아포리포단백질 C1은 57개의 아미노산 길이를 갖고, 혈장에서 정상적으로 발견된다.
본 발명에서, 상기 아포리포단백질 C1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 아포리포단백질 C1의 단편은 서열번호 4 내지 7 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에서, 상기 "탄산무수화효소 1"은 CA1 유전자에 의해 암호화되는 효소로, 탄산무수화효소는 아연 금속효소(zinc metalloenzymes)의 큰 패밀리로서, 이산화탄소의 역수화를 촉매하는 역할을 한다. 이들은 다양한 생물학적 반응으로 예를 들면, 세포 호흡, 석회화, 산-염기 균형, 뼈 재흡수, 뇌척수액, 타액, 위산의 생성 등에 관여하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 상기 탄산무수화효소 1은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 탄산탈수효소 1 단백질의 단편은 서열번호 8 또는 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에서 상기 "신경세포 접착분자 L1 유사 단백질"은 L1의 근접 상동체(close homolog of L1)라고도 불리우며, CHL1 유전자에 의해 암호화되는 단백질이다. CHL1은 L1과 매우 밀접하게 관련된 세포 접착 분자로, 멜라닌 세포에서 CHL1 유전자 발현은 MITF에 의해 조절되며 유사 분열의 간기 단계에서 나선 효소로 작용하기도 한다.
본 발명에서, 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질의 단편은 서열번호 10 내지 14 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에서, 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질 또는 이들의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 및 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에 상기 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나로 표시되는 폴리펩티드에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다.
본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에 상기 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩티드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991). "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide". Science 254(5037): 1497-1500]에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명에서 상기 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩티드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)]에 상세하게 개시되어 있다.
본 발명에서, 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질, 또는 이들의 단편을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 및 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.
본 발명에서 상기 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩티드, 폴리펩티드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩티드 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 "LNA(Locked nucleic acids)"란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다 [J Weiler, J Hunziker and J Hall Gene Therapy (2006) 13, 496.502]. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 Watson-Crick 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다. 본 발명에서 상기 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 폴리펩티드의 아미노산 서열 정보는 서열번호 1 내지 14 중 어느 하나로 표시되므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 폴리펩티드를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.
본 발명에서 예후 예측의 대상이 되는 질환으로 상기 "암"은 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징 지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리킨다.
본 발명에서, 상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(central nerve system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있으나, 바람직하게는 유방암일 수 있다.
본 발명에서 상기 "예후(prognosis) 예측"은 암 환자가 암 치료에 대해 선호적으로 또는 비선호적으로 반응할 지 여부를 예측하는 것을 의미한다. 본 발명에서 예후 예측은 암 치료로, 예를 들어, 외과적 절제술, 화학적 치료 방법, 면역 치료 방법 또는 방사선 치료 방법, 바람직하게는 외과적 절제술 후 치료 반응성으로, 암의 재발 여부를 예측함으로써 적절한 치료 방식을 선택하기 위한 정보를 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 암의 예후 예측용 조성물을 포함하는 암의 예후 예측용 키트에 관한 것이다.
본 발명에서, 상기 예후 예측용 키트를 이용하여 암 환자가 암 치료에 대하여 선호적으로 또는 비선호적으로 반응할 지 여부를 예측할 수 있고, 상세하게는 암 치료로, 예를 들어, 외과적 절제술, 화학적 치료 방법, 면역 치료 방법 또는 방사선 치료 방법, 바람직하게는 외과적 절제술 후 치료 반응성으로, 암의 재발 여부를 예측할 수 있다.
본 발명에서, 상기 예후 예측의 대상이 되는 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(central nerve system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있으나, 바람직하게는 유방암일 수 있다.
본 발명에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인, 암의 예후 예측용 키트 일 수 있다.
본 발명의 상기 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.
예를 들면, 본 발명에서 상기 암의 예후 예측용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
또한, 상기 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 키트에서 항원-항체 결합반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(Well plate), 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 예후 예측용 키트에서 2차 항체의 표지체는 발색 반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(폴리 L-라이신-플루오르세인 아이소티오시아네이트), RITC(로다민-B-아이소티오시아네이트) 등의 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye) 등의 표지체가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 키트에서 발색을 유도하기 위한 발색 기질은 발색 반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB(3,3',5,5'-테트라메틸 베지딘), ABTS[2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)], OPD(o-페닐렌다이아민) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색기질은 완충용액(0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 이차항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고, 이 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 상기 마커 단백질들의 존재 유무를 검출한다.
상기 키트에서 세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 구성된 완충용액(PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 첨가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 황산 용액(H2SO4)이 바람직하게 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 아포리포단백질 C1(Apolipoprotein C-I; APOC1), 탄산탈수효소 1 단백질(Carbonic anhydrase 1; CA1) 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질(Neural cell adhesion molecule L1-like protein; CHL1) 중 적어도 하나의 단백질; 상기 단백질의 단편; 또는 상기 단백질 또는 상기 단편을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 상기 "목적하는 개체"란, 암이 발병하였거나 발병 가능성이 높은 개체, 혹은 암이 발병한 것으로 진단되어 항암 치료로, 예를 들면, 외과적 절제술, 화학적 치료 방법, 면역 치료 방법 또는 방사선 치료 방법, 바람직하게는 외과적 절제술을 받을 것이 예정된 개체일 수 있다.
본 발명에서 상기 "생물학적 시료" 내지 "시료"는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 및 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 및 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩티드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 아포리포단백질 C1은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 탄산무수화효소 1은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 CHL1은 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 예시로, 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질 또는 이의 단편의 발현 수준의 측정은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 예시로, 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 및 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질의 발현 수준의 측정은 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM) 방법에 의할 수 있다.
본 발명에서 상기 다중 반응 모니터링 방법은 질량분석기 (mass-spectrometry), 바람직하게는 삼중 사극자 질량분석기 (triple quadrupole mass-spectrometry)를 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 질량분석기 (mass-spectrometry)를 이용한 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM) 방법은 특정 분석물질을 선택적으로 분리하여 검출하고 정량하여 그 농도변화를 모니터링할 수 있는 분석기술이다. MRM은 생체 시료 중에 존재하는 미량의 바이오마커와 같은 물질을 정량적으로 정확하게 다중 측정할 수 있는 방법으로 제1 질량필터 (Q1)를 이용하여 이온화원에서 생성된 이온 단편들 중 어미이온을 선택적으로 충돌관으로 전달한다. 이어 충돌관에 도달한 어미이온은 내부 충돌기체와 충돌하여, 쪼개져 딸이온을 생성하여 제2 질량 필터 (Q2)로 보내지고, 여기서 특징적인 이온만이 검출부로 전달된다. 이런 방식으로 목적하는 성분의 정보만을 검출할 수 있는 선택성 및 민감도가 높은 분석방법이다. MRM은 작은 분자의 정량분석에 활용되어 특정 유전병을 진단하는데 쓰이고 있다. MRM 방법은 다수의 펩티드를 동시에 측정하기에 용이하며, 항체가 없이 정상인과 암환자 사이에서 단백질 예후 예측 마커 후보들의 상대적 농도차를 확인할 수 있다는 장점이 있다. 또한 민감도와 선택성이 탁월하여 특히, 질량분석기를 이용한 프로테옴 분석에서 혈액 내에 있는 복잡한 단백질과 펩티드의 분석을 위해 MRM 분석방법이 도입되고 있다(Anderson L. et al., Mol CellProteomics, 5: 375-88, 2006; DeSouza, L. V. et al., Anal. Chem., 81: 3462-70, 2009).
본 발명에서, 상기 아포리포단백질 C1의 타겟 펩티드는 서열번호 4 내지 7 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에서, 상기 아포리포단백질 C1의 타겟 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍은 각각 526.75 m/z 과 605.31 m/z, 526.75 m/z 과 776.38 m/z, 526.75 m/z 과 719.36 m/z, 526.75 m/z 과 504.27 m/z, 526.75 m/z 과 391.18 m/z 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 탄산탈수효소 1 단백질의 타겟 펩티드는 서열번호 8 또는 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에서, 상기 탄산탈수효소 1의 타겟 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍은 각각 485.80 m/z 과 758.44 m/z, 485.80 m/z 과 643.41 m/z, 485.80 m/z 과 572.38 m/z, 485.80 m/z 과 459.29 m/z 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서, 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질의 타겟 펩티드는 서열번호 10 내지 14 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
본 발명에서, 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질의 타겟 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍은 각각 642.81 m/z 과 836.42 m/z, 642.81 m/z 과 689.35 m/z, 642.81 m/z 과 618.31 m/z, 642.81 m/z 과 504.27 m/z 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서는 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질 또는 이의 단편을 검출하기 위하여, 상기한 각각의 단백질의 타겟 펩티드 중 일부 아미노산이 안정한 동위원소로 치환된 펩티드를 합성하고, 다중 반응 모니터링 분석 시 내부 표준 물질로 사용하면 상기 단백질의 혈액 내 절대량도 측정할 수 있어 분석의 정확도를 더욱 높일 수 있다.
본 발명에서 내부 표준 물질은 상기 다중 반응 모니터링 분석 시 일반적으로 사용되는 임의의 내부 표준 물질이 사용될 수 있으나, 상기 모니터링 방법 시 내부 표준 물질은 타겟 펩티드를 구성하는 특정 아미노산을 동위원소로 치환한 합성 펩티드 또는 대장균 베타 갈락토시다아제를 사용할 수 있다.
본 발명에서 상기 대장균 베타 갈락토시다아제의 타겟 펩티드는 서열번호 15로 표시되는 폴리펩티드로 이루어지며 어미이온과 딸이온은 각각 542.3 m/z 와 636.3 m/z일 수 있다.
또한, 본 발명에서 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질의 혈액 내 절대량을 측정하기 위하여 타겟 펩티드의 일부 아미노산이 안정한 동위원소로 치환된 특정 펩티드를 내부 표준물질로서 합성하는 경우, 동위 원소로 치환된 아미노산은 리신(Lysine)이나 아르기닌(Arginine)이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 여기서 합성된 펩티드는 95% 이상 순수 분리된 펩티드를 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에서, 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질 또는 이의 단편을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질 및 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.
본 발명에서, 상기 아포리포단백질 C1, 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질, 또는 이의 단편을 코딩하는 유전자의 발현 수준의 측정은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩에 의하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 발현 수준을 측정하는 단계는 목적하는 개체가 암 치료를 받기 전에 분리된 생물학적 시료에 대하여 수행될 수 있다.
본 발명에서 상기 암 치료를 받기 전에 분리된 생물학적 시료는, 암 치료 수행일 또는 수행 예정일 이전에 채취된 것이면 무방하고 채취 시점을 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면, 암 치료 수행일 또는 수행 예정일로부터 48 개월 이전, 36 개월 이전, 24 개월 이전, 12 개월 이전, 10 개월 이전, 8 개월 이내, 6 개월 이전, 4 개월 이전, 10 주 이전, 8 주 이전, 7 주 이전, 6 주 이전, 5 주 이전, 4 주 이전, 3 주 이전, 2 주 이전, 1 주 이전, 6 일 이전, 5 일 이전, 4 일 이전, 3 일 이전, 2 일 이전, 1 일 이전, 12 시간 이전, 6 시간 이전, 4 시간 이전, 2 시간 이전 또는 1 시간 이전에 분리된 생물학적 시료일 수 있다. 여기서 상기 암 치료는 1회 이상 수행될 수 있고, 복수 회 수행되는 경우 어느 일 암 치료 시점을 기준으로 48 개월 이전에 분리된 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 목적하는 개체가 암 치료를 받은 후에 분리된 생물학적 시료에 대하여 아포리포단백질 C1(APOC1), 탄산탈수효소 1 단백질(CA1) 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질(CHL1) 중 적어도 하나의 단백질; 상기 단백질의 단편; 또는 상기 단백질 또는 상기 단편을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 암 치료를 받은 후에 분리된 생물학적 시료는, 암 치료 수행일 또는 수행 예정일 이후에 채취된 것이면 무방하고 채취 시점을 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면, 암 치료로부터 48 개월 이내, 36 개월 이내, 24 개월 이내, 12 개월 이내, 10 개월 이내, 8 개월 이내, 6 개월 이내, 4 개월 이내, 10 주 이내, 8 주 이내, 1 주 내지 8 주 이내에, 2 주 내지 8 주 이내에 또는 4 주 내지 8 주 이내에 분리된 생물학적 시료일 수 있다. 여기서 상기 암 치료는 1회 이상 수행될 수 있고, 복수 회 수행되는 경우 어느 일 암 치료 시점을 기준으로 48 개월 이내에 분리된 것일 수 있다.
본 발명에서, 상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 아포리포단백질 C1, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 암 치료 전에 비하여 암 치료 후에 증가한 경우, 상기 예후가 좋을 것으로 예측할 수 있다.
본 발명에서, 상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 암 치료 전에 비하여 암 치료 후에 감소한 경우, 상기 예후가 좋을 것으로 예측할 수 있다.
본 발명에서, 상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 암 치료 전에 비하여 암 치료 후에 감소한 경우, 상기 예후가 좋을 것으로 예측할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 예시에서, 상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된,
1) 상기 아포리포단백질 C1, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 암 치료 전에 비하여 암 치료 후에 증가한 경우;
2) 상기 탄산탈수효소 1 단백질, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 암 치료 전에 비하여 암 치료 후에 감소한 경우; 및
3) 상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 암 치료 전에 비하여 암 치료 후에 감소한 경우; 중 적어도 하나의 경우, 바람직하게는 상기 1) 내지 3) 중 두가지의 경우에 해당하는 경우, 보다 바람직하게는 상기 1) 내지 3) 모두에 해당하는 경우, 상기 예후가 좋을 것으로 예측할 수 있다.
본 발명에서, 상기 예후는 목적하는 개체에 대한 암 치료로, 예를 들어, 외과적 절제술, 화학적 치료 방법, 면역 치료 방법 또는 방사선 치료 방법, 바람직하게는 외과적 절제술 후 치료 반응성일 수 있고, 보다 바람직하게는 상기의 치료 후 암의 재발 여부일 수 있다.
본 발명에서, 상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(central nerve system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있으나, 바람직하게는 유방암일 수 있다.
본 발명에서는 아포리포단백질 C1, 탄산탈수효소 1 단백질 및 신경세포 접착분자 L1 유사 바이오마커의 발현 수준을 측정함으로써, 암, 특히는 유방암에 대한 치료 후 예후를 예측하여, 적절한 치료 방식을 선택하기 위한 정보를 제공할 수 있다.
도 1은 본 발명의 실시예 1에서 유방암 환자에서 유방암 수술 전후로 아포리포단백질 C1(Apolipoprotein C-I; APOC1); 탄산탈수효소 1 단백질(Carbonic anhydrase 1; CA1); 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질(Neural cell adhesion molecule L1-like protein; CHL1) 발현량의 차이를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 유방암 환자에서 유방암 수술 전후로 아포리포단백질 C1(Apolipoprotein C-I; APOC1); 탄산탈수효소 1 단백질(Carbonic anhydrase 1; CA1); 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질(Neural cell adhesion molecule L1-like protein; CHL1)의 바이오마커의 정량 결과를 바탕으로 한 수용자-조작 특성(ROC) 그래프를 나타낸 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
[실시예 1] 유방암 절제술 후 예후 예측을 위한 타겟 펩티드의 검출
1. 시료의 준비
본 발명의 바이오마커 조합의 유방암 예후 예측의 정확도를 확인하기 위하여, 유방암 환자 중 유방 절제술 치료를 받은 뒤 재발이 없는 예후가 좋은 환자 36명을 선별하였다. 이들 환자에 대하여 수술 전 채혈로 혈액 샘플을 수집하였고, 같은 환자에게서 수술 후 4 내지 8주에 채혈로 혈액 샘플을 수집하였다. 수집된 혈액 샘플에서 혈장을 분리하고, Bradford assay를 통하여 총 단백질을 정량하였다. 이 중 총 단백질 200 ㎍을 우레아(urea)로 변형시킨 뒤 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)로 환원시키고, 이오도아세트아미드(iodoacetamide)를 통해 알킬화 시켰다. 이후, 트립신을 넣어주어 펩티드화 시키고, C18 컬럼을 이용하여 염을 제거하였다. 내부표준물질로는 펩티드의 말단에 붙어있는 아미노산기가 동위원소로 치환된 합성품을 이용하였다.
2. 삼중 사극자 질량분석기(텐덤메스 질량분석기)를 이용한 다중 반응 모니터링 수행
삼중 사극자 질량분석을 위하여 본 발명의 아포리포단백질 C1(Apolipoprotein C-I; APOC1), 탄산탈수효소 1 단백질(Carbonic anhydrase 1; CA1) 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질(Neural cell adhesion molecule L1-like protein; CHL1)의 타겟 펩티드와 어미이온과 딸이온 쌍을 선정하여 그 결과는 하기 표 1에 나타내었다.
유전자명칭 단백질 명칭 uniprotKB 서열번호 펩티드 서열 어미이온 딸이온
APOC1 Apolipoprotein C-I P02654 5 EFGNTLEDK 526.75 605.31
526.75 776.38
526.75 719.36
526.75 504.27
526.75 391.18
CA1 Carbonic anhydrase 1 P00915 8 VLDALQAIK 485.80 758.44
485.80 643.41
485.80 572.38
485.80 459.29
CHL1 Neural cell adhesion molecule L1-like protein O00533 12 GDLYFANVEEK 642.81 836.42
642.81 689.35
642.81 618.31
642.81 504.27
상기 1.에서 준비된 최종 시료를 역상 수지 크로마토그래피에 걸어 혈장 펩티드 절편을 분리하였고, 삼중 사극자 질량분석기(기기: 5500 Qtrap, AB Sciex, USA)를 사용해 각 펩티드의 MRM 스펙트럼을 얻었다. 이때, 역상 수지 크로마토그래피는 HALOTM C18 컬럼 (Eksigent, USA) 컬럼으로 45분간 5%~40%의 아세토니트릴 농도 구배를 이용하여 실시하였다. MultiQuantTM 컴퓨터 정량 분석 프로그램 (AB Sciex, USA)으로 타깃 펩티드의 MRM 크로마토그램의 피크 면적을 계산하여 정량 정보를 확인하였다. 이때 각 타깃 펩티드의 정량값은 내부 표준물질로 넣어준 대장균 베타 갈락토시다아제의 MRM 크로마토그램의 피크 면적에 대한 비율로 표시하였다.
3. 각 타겟 펩티드의 유방암 예후 예측의 정확도 확인
상기 2.에서 확인된 유방 절제술 전과 후에서의 혈액 샘플 내 아포리포단백질 C1(Apolipoprotein C-I; APOC1), 탄산탈수효소 1 단백질(Carbonic anhydrase 1; CA1), 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질(Neural cell adhesion molecule L1-like protein; CHL1) 발현량의 차이를 정량하였다.
그 결과 수술이 성공적으로 이루어져서 예후가 양호한 경우 아포리포단백질 C1은 수술 후 농도의 상승이 주로 나타났으며, 탄산탈수효소 1 단백질 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질은 수술 후 농도의 하락이 주로 나타났다.
이들 개별 값을 마스토체크 (식약처 제조허가19-5호, 체외진단용소프트웨어)에 대입 시, 도 1의 결과에 대하여 수술 전의 민감도는 67%, 수술 후의 특이도는 64%를 보였다. 또한 상기 아포리포단백질 C1, 탄산탈수효소 1 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질 3종 바이오마커 농도값의 조합을 로지스틱회귀분석을 통해 최적화시켰을 때, 도 2와 같이 AUC 값은 0.72 이며, 민감도 67%, 특이도 75%를 나타났다.
이처럼 본 발명의 서열번호 4 내지 6으로 표시되는 타겟 펩티드를 이용한 아포리포단백질 C1(Apolipoprotein C-I; APOC1), 탄산탈수효소 1 단백질(Carbonic anhydrase 1; CA1), 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질(Neural cell adhesion molecule L1-like protein; CHL1) 마커의 조합은 높은 정확도로 유방암의 예후를 예측할 수 있음을 알 수 있었다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> BERTIS CO. LTD. SEOUL NATIONAL UNIVERSITY HOSPITAL <120> Composition for Diagnosing Cancer <130> PDPB194405 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 83 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Leu Phe Leu Ser Leu Pro Val Leu Val Val Val Leu Ser Ile 1 5 10 15 Val Leu Glu Gly Pro Ala Pro Ala Gln Gly Thr Pro Asp Val Ser Ser 20 25 30 Ala Leu Asp Lys Leu Lys Glu Phe Gly Asn Thr Leu Glu Asp Lys Ala 35 40 45 Arg Glu Leu Ile Ser Arg Ile Lys Gln Ser Glu Leu Ser Ala Lys Met 50 55 60 Arg Glu Trp Phe Ser Glu Thr Phe Gln Lys Val Lys Glu Lys Leu Lys 65 70 75 80 Ile Asp Ser <210> 2 <211> 261 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Ser Pro Asp Trp Gly Tyr Asp Asp Lys Asn Gly Pro Glu Gln 1 5 10 15 Trp Ser Lys Leu Tyr Pro Ile Ala Asn Gly Asn Asn Gln Ser Pro Val 20 25 30 Asp Ile Lys Thr Ser Glu Thr Lys His Asp Thr Ser Leu Lys Pro Ile 35 40 45 Ser Val Ser Tyr Asn Pro Ala Thr Ala Lys Glu Ile Ile Asn Val Gly 50 55 60 His Ser Phe His Val Asn Phe Glu Asp Asn Asp Asn Arg Ser Val Leu 65 70 75 80 Lys Gly Gly Pro Phe Ser Asp Ser Tyr Arg Leu Phe Gln Phe His Phe 85 90 95 His Trp Gly Ser Thr Asn Glu His Gly Ser Glu His Thr Val Asp Gly 100 105 110 Val Lys Tyr Ser Ala Glu Leu His Val Ala His Trp Asn Ser Ala Lys 115 120 125 Tyr Ser Ser Leu Ala Glu Ala Ala Ser Lys Ala Asp Gly Leu Ala Val 130 135 140 Ile Gly Val Leu Met Lys Val Gly Glu Ala Asn Pro Lys Leu Gln Lys 145 150 155 160 Val Leu Asp Ala Leu Gln Ala Ile Lys Thr Lys Gly Lys Arg Ala Pro 165 170 175 Phe Thr Asn Phe Asp Pro Ser Thr Leu Leu Pro Ser Ser Leu Asp Phe 180 185 190 Trp Thr Tyr Pro Gly Ser Leu Thr His Pro Pro Leu Tyr Glu Ser Val 195 200 205 Thr Trp Ile Ile Cys Lys Glu Ser Ile Ser Val Ser Ser Glu Gln Leu 210 215 220 Ala Gln Phe Arg Ser Leu Leu Ser Asn Val Glu Gly Asp Asn Ala Val 225 230 235 240 Pro Met Gln His Asn Asn Arg Pro Thr Gln Pro Leu Lys Gly Arg Thr 245 250 255 Val Arg Ala Ser Phe 260 <210> 3 <211> 1208 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Glu Pro Leu Leu Leu Gly Arg Gly Leu Ile Val Tyr Leu Met Phe 1 5 10 15 Leu Leu Leu Lys Phe Ser Lys Ala Ile Glu Ile Pro Ser Ser Val Gln 20 25 30 Gln Val Pro Thr Ile Ile Lys Gln Ser Lys Val Gln Val Ala Phe Pro 35 40 45 Phe Asp Glu Tyr Phe Gln Ile Glu Cys Glu Ala Lys Gly Asn Pro Glu 50 55 60 Pro Thr Phe Ser Trp Thr Lys Asp Gly Asn Pro Phe Tyr Phe Thr Asp 65 70 75 80 His Arg Ile Ile Pro Ser Asn Asn Ser Gly Thr Phe Arg Ile Pro Asn 85 90 95 Glu Gly His Ile Ser His Phe Gln Gly Lys Tyr Arg Cys Phe Ala Ser 100 105 110 Asn Lys Leu Gly Ile Ala Met Ser Glu Glu Ile Glu Phe Ile Val Pro 115 120 125 Ser Val Pro Lys Phe Pro Lys Glu Lys Ile Asp Pro Leu Glu Val Glu 130 135 140 Glu Gly Asp Pro Ile Val Leu Pro Cys Asn Pro Pro Lys Gly Leu Pro 145 150 155 160 Pro Leu His Ile Tyr Trp Met Asn Ile Glu Leu Glu His Ile Glu Gln 165 170 175 Asp Glu Arg Val Tyr Met Ser Gln Lys Gly Asp Leu Tyr Phe Ala Asn 180 185 190 Val Glu Glu Lys Asp Ser Arg Asn Asp Tyr Cys Cys Phe Ala Ala Phe 195 200 205 Pro Arg Leu Arg Thr Ile Val Gln Lys Met Pro Met Lys Leu Thr Val 210 215 220 Asn Ser Ser Asn Ser Ile Lys Gln Arg Lys Pro Lys Leu Leu Leu Pro 225 230 235 240 Pro Thr Glu Ser Gly Ser Glu Ser Ser Ile Thr Ile Leu Lys Gly Glu 245 250 255 Ile Leu Leu Leu Glu Cys Phe Ala Glu Gly Leu Pro Thr Pro Gln Val 260 265 270 Asp Trp Asn Lys Ile Gly Gly Asp Leu Pro Lys Gly Arg Glu Ala Lys 275 280 285 Glu Asn Tyr Gly Lys Thr Leu Lys Ile Glu Asn Val Ser Tyr Gln Asp 290 295 300 Lys Gly Asn Tyr Arg Cys Thr Ala Ser Asn Phe Leu Gly Thr Ala Thr 305 310 315 320 His Asp Phe His Val Ile Val Glu Glu Pro Pro Arg Trp Thr Lys Lys 325 330 335 Pro Gln Ser Ala Val Tyr Ser Thr Gly Ser Asn Gly Ile Leu Leu Cys 340 345 350 Glu Ala Glu Gly Glu Pro Gln Pro Thr Ile Lys Trp Arg Val Asn Gly 355 360 365 Ser Pro Val Asp Asn His Pro Phe Ala Gly Asp Val Val Phe Pro Arg 370 375 380 Glu Ile Ser Phe Thr Asn Leu Gln Pro Asn His Thr Ala Val Tyr Gln 385 390 395 400 Cys Glu Ala Ser Asn Val His Gly Thr Ile Leu Ala Asn Ala Asn Ile 405 410 415 Asp Val Val Asp Val Arg Pro Leu Ile Gln Thr Lys Asp Gly Glu Asn 420 425 430 Tyr Ala Thr Val Val Gly Tyr Ser Ala Phe Leu His Cys Glu Phe Phe 435 440 445 Ala Ser Pro Glu Ala Val Val Ser Trp Gln Lys Val Glu Glu Val Lys 450 455 460 Pro Leu Glu Gly Arg Arg Tyr His Ile Tyr Glu Asn Gly Thr Leu Gln 465 470 475 480 Ile Asn Arg Thr Thr Glu Glu Asp Ala Gly Ser Tyr Ser Cys Trp Val 485 490 495 Glu Asn Ala Ile Gly Lys Thr Ala Val Thr Ala Asn Leu Asp Ile Arg 500 505 510 Asn Ala Thr Lys Leu Arg Val Ser Pro Lys Asn Pro Arg Ile Pro Lys 515 520 525 Leu His Met Leu Glu Leu His Cys Glu Ser Lys Cys Asp Ser His Leu 530 535 540 Lys His Ser Leu Lys Leu Ser Trp Ser Lys Asp Gly Glu Ala Phe Glu 545 550 555 560 Ile Asn Gly Thr Glu Asp Gly Arg Ile Ile Ile Asp Gly Ala Asn Leu 565 570 575 Thr Ile Ser Asn Val Thr Leu Glu Asp Gln Gly Ile Tyr Cys Cys Ser 580 585 590 Ala His Thr Ala Leu Asp Ser Ala Ala Asp Ile Thr Gln Val Thr Val 595 600 605 Leu Asp Val Pro Asp Pro Pro Glu Asn Leu His Leu Ser Glu Arg Gln 610 615 620 Asn Arg Ser Val Arg Leu Thr Trp Glu Ala Gly Ala Asp His Asn Ser 625 630 635 640 Asn Ile Ser Glu Tyr Ile Val Glu Phe Glu Gly Asn Lys Glu Glu Pro 645 650 655 Gly Arg Trp Glu Glu Leu Thr Arg Val Gln Gly Lys Lys Thr Thr Val 660 665 670 Ile Leu Pro Leu Ala Pro Phe Val Arg Tyr Gln Phe Arg Val Ile Ala 675 680 685 Val Asn Glu Val Gly Arg Ser Gln Pro Ser Gln Pro Ser Asp His His 690 695 700 Glu Thr Pro Pro Ala Ala Pro Asp Arg Asn Pro Gln Asn Ile Arg Val 705 710 715 720 Gln Ala Ser Gln Pro Lys Glu Met Ile Ile Lys Trp Glu Pro Leu Lys 725 730 735 Ser Met Glu Gln Asn Gly Pro Gly Leu Glu Tyr Arg Val Thr Trp Lys 740 745 750 Pro Gln Gly Ala Pro Val Glu Trp Glu Glu Glu Thr Val Thr Asn His 755 760 765 Thr Leu Arg Val Met Thr Pro Ala Val Tyr Ala Pro Tyr Asp Val Lys 770 775 780 Val Gln Ala Ile Asn Gln Leu Gly Ser Gly Pro Asp Pro Gln Ser Val 785 790 795 800 Thr Leu Tyr Ser Gly Glu Asp Tyr Pro Asp Thr Ala Pro Val Ile His 805 810 815 Gly Val Asp Val Ile Asn Ser Thr Leu Val Lys Val Thr Trp Ser Thr 820 825 830 Val Pro Lys Asp Arg Val His Gly Arg Leu Lys Gly Tyr Gln Ile Asn 835 840 845 Trp Trp Lys Thr Lys Ser Leu Leu Asp Gly Arg Thr His Pro Lys Glu 850 855 860 Val Asn Ile Leu Arg Phe Ser Gly Gln Arg Asn Ser Gly Met Val Pro 865 870 875 880 Ser Leu Asp Ala Phe Ser Glu Phe His Leu Thr Val Leu Ala Tyr Asn 885 890 895 Ser Lys Gly Ala Gly Pro Glu Ser Glu Pro Tyr Ile Phe Gln Thr Pro 900 905 910 Glu Gly Val Pro Glu Gln Pro Thr Phe Leu Lys Val Ile Lys Val Asp 915 920 925 Lys Asp Thr Ala Thr Leu Ser Trp Gly Leu Pro Lys Lys Leu Asn Gly 930 935 940 Asn Leu Thr Gly Tyr Leu Leu Gln Tyr Gln Ile Ile Asn Asp Thr Tyr 945 950 955 960 Glu Ile Gly Glu Leu Asn Asp Ile Asn Ile Thr Thr Pro Ser Lys Pro 965 970 975 Ser Trp His Leu Ser Asn Leu Asn Ala Thr Thr Lys Tyr Lys Phe Tyr 980 985 990 Leu Arg Ala Cys Thr Ser Gln Gly Cys Gly Lys Pro Ile Thr Glu Glu 995 1000 1005 Ser Ser Thr Leu Gly Glu Gly Ser Lys Gly Ile Gly Lys Ile Ser Gly 1010 1015 1020 Val Asn Leu Thr Gln Lys Thr His Pro Val Glu Val Phe Glu Pro Gly 1025 1030 1035 1040 Ala Glu His Ile Val Arg Leu Met Thr Lys Asn Trp Gly Asp Asn Asp 1045 1050 1055 Ser Ile Phe Gln Asp Val Ile Glu Thr Arg Gly Arg Glu Tyr Ala Gly 1060 1065 1070 Leu Tyr Asp Asp Ile Ser Thr Gln Gly Trp Phe Ile Gly Leu Met Cys 1075 1080 1085 Ala Ile Ala Leu Leu Thr Leu Leu Leu Leu Thr Val Cys Phe Val Lys 1090 1095 1100 Arg Asn Arg Gly Gly Lys Tyr Ser Val Lys Glu Lys Glu Asp Leu His 1105 1110 1115 1120 Pro Asp Pro Glu Ile Gln Ser Val Lys Asp Glu Thr Phe Gly Glu Tyr 1125 1130 1135 Ser Asp Ser Asp Glu Lys Pro Leu Lys Gly Ser Leu Arg Ser Leu Asn 1140 1145 1150 Arg Asp Met Gln Pro Thr Glu Ser Ala Asp Ser Leu Val Glu Tyr Gly 1155 1160 1165 Glu Gly Asp His Gly Leu Phe Ser Glu Asp Gly Ser Phe Ile Gly Ala 1170 1175 1180 Tyr Ala Gly Ser Lys Glu Lys Gly Ser Val Glu Ser Asn Gly Ser Ser 1185 1190 1195 1200 Thr Ala Thr Phe Pro Leu Arg Ala 1205 <210> 4 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Target peptide sequence of APOC1 <400> 4 Thr Pro Asp Val Ser Ser Ala Leu Asp Lys 1 5 10 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Target peptide sequence of APOC1 <400> 5 Glu Phe Gly Asn Thr Leu Glu Asp Lys 1 5 <210> 6 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Target peptide sequence of APOC1 <400> 6 Glu Trp Phe Ser Glu Thr Phe Gln Lys 1 5 <210> 7 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Target peptide sequence of APOC1 <400> 7 Gln Ser Glu Leu Ser Ala Lys 1 5 <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Target peptide sequence of CA1 <400> 8 Val Leu Asp Ala Leu Gln Ala Ile Lys 1 5 <210> 9 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Target peptide sequence of CA1 <400> 9 Ala Asp Gly Leu Ala Val Ile Gly Val Leu Met Lys 1 5 10 <210> 10 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Target peptide sequence of CHL1 <400> 10 Ile Ile Pro Ser Asn Asn Ser Gly Thr Phe Arg 1 5 10 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Target peptide sequence of CHL1 <400> 11 Val Ile Ala Val Asn Glu Val Gly Arg 1 5 <210> 12 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Target peptide sequence of CHL1 <400> 12 Gly Asp Leu Tyr Phe Ala Asn Val Glu Glu Lys 1 5 10 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Target peptide sequence of CHL1 <400> 13 Ile Glu Asn Val Ser Tyr Gln Asp Lys 1 5 <210> 14 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Target peptide sequence of CHL1 <400> 14 Tyr His Ile Tyr Glu Asn Gly Thr Leu Gln Ile Asn Arg 1 5 10 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 15 Gly Asp Phe Gln Phe Asn Ile Ser Arg 1 5

Claims (27)

  1. 아포리포단백질 C1(Apolipoprotein C-I; APOC1), 탄산탈수효소 1 단백질(Carbonic anhydrase 1; CA1), 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질(Neural cell adhesion molecule L1-like protein; CHL1); 상기 단백질의 단편; 또는 상기 단백질 또는 상기 단편을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 유방암의 예후 예측을 위한 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 단백질 또는 상기 단편의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 상기 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 유방암의 예후 예측을 위한 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 단백질 또는 상기 단편을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질 또는 상기 단편을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 유방암의 예후 예측을 위한 조성물.
  4. 삭제
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 예후 예측은 상기 유방암의 치료 후 치료 반응성을 예측하는 것인, 유방암의 예후 예측을 위한 조성물.
  6. 제 5항에 있어서,
    상기 예후 예측은 상기 유방암의 외과적 절제술 후 치료 반응성을 예측하는 것인, 유방암의 예후 예측을 위한 조성물.
  7. 제 1항 내지 제 3항, 5항 및 6항 중 어느 한 항의 유방암의 예후 예측용 조성물을 포함하는 유방암의 예후 예측용 키트.
  8. 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 아포리포단백질 C1(Apolipoprotein C-I; APOC1), 탄산탈수효소 1 단백질(Carbonic anhydrase 1; CA1), 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질(Neural cell adhesion molecule L1-like protein; CHL1); 상기 단백질의 단편; 또는 상기 단백질 또는 상기 단편을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 유방암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)인, 유방암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  10. 제 8항에 있어서,
    상기 단백질 또는 상기 단편의 발현 수준의 측정은 상기 단백질 또는 상기 단편에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 유방암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  11. 제 8항에 있어서,
    상기 단백질 또는 상기 단편의 발현 수준 측정은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행되는, 유방암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  12. 제 8항에 있어서,
    상기 단백질 또는 상기 단편의 발현 수준 측정은 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM) 방법에 의하는, 유방암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    상기 아포리포단백질 C1의 타겟 펩티드는 서열번호 4 내지 7 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는, 유방암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  14. 제 12항에 있어서,
    상기 아포리포단백질 C1의 타겟 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍은 각각 526.75 m/z 과 605.31 m/z, 526.75 m/z 과 776.38 m/z, 526.75 m/z 과 719.36 m/z, 526.75 m/z 과 504.27 m/z, 526.75 m/z 과 391.18 m/z 인, 유방암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  15. 제 12항에 있어서,
    상기 탄산탈수효소 1 단백질의 타겟 펩티드는 서열번호 8 또는 9로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는, 유방암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  16. 제 12항에 있어서,
    상기 탄산탈수효소 1의 타겟 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍은 각각 485.80 m/z 과 758.44 m/z, 485.80 m/z 과 643.41 m/z, 485.80 m/z 과 572.38 m/z, 485.80 m/z 과 459.29 m/z 인, 유방암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  17. 제 12항에 있어서,
    상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질의 타겟 펩티드는 서열번호 10 내지 14 중 어느 하나로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는, 유방암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  18. 제 12항에 있어서,
    상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질의 타겟 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍은 각각 642.81 m/z 과 836.42 m/z, 642.81 m/z 과 689.35 m/z, 642.81 m/z 과 618.31 m/z, 642.81 m/z 과 504.27 m/z 인, 유방암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  19. 제 12항에 있어서,
    상기 다중 반응 모니터링 방법 시 내부 표준 물질은 타겟 펩타이드를 구성하는 특정 아미노산을 동위원소로 치환한 합성 펩타이드 또는 대장균 베타 갈락토시다아제를 사용하는, 유방암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  20. 제 19항에 있어서,
    상기 대장균 베타 갈락토시다아제의 타겟 펩티드는 서열번호 15로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지며 어미이온과 딸이온은 각각 542.3 m/z 와 636.3 m/z 인, 유방암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  21. 제 8항에 있어서,
    상기 예후 예측은 상기 유방암의 외과적 절제술 후 치료 반응성을 예측하는 것인, 유방암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  22. 제 21항에 있어서,
    상기 발현 수준을 측정하는 단계는 목적하는 개체가 유방암 치료를 받기 전에 분리된 생물학적 시료에 대하여 수행되는 것인, 유방암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  23. 제 22항에 있어서,
    상기 정보 제공 방법은 목적하는 개체가 유방암 치료를 받은 후에 분리된 생물학적 시료에 대하여 아포리포단백질 C1(APOC1), 탄산탈수효소 1 단백질(CA1) 및 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질(CHL1); 상기 단백질의 단편; 또는 상기 단백질 또는 상기 단편을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 더 포함하는, 유방암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  24. 제 23항에 있어서,
    상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 상기 아포리포단백질 C1, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 수술 전에 비하여 수술 후에 증가하고,
    상기 탄산탈수효소 1 단백질, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 수술 전에 비하여 수술 후에 감소하며,
    상기 신경세포 접착분자 L1 유사 단백질, 이의 단편 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 수술 전에 비하여 수술 후에 감소한 경우,
    상기 유방암의 예후가 좋을 것으로 예측하는, 유방암의 예후 예측을 위한 정보 제공 방법.
  25. 삭제
  26. 삭제
  27. 삭제
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