KR102216386B1

KR102216386B1 - 암의 진단용 조성물

Info

Publication number: KR102216386B1
Application number: KR1020190082513A
Authority: KR
Inventors: 김성수; 한승만
Original assignee: 주식회사 베르티스
Priority date: 2019-07-09
Filing date: 2019-07-09
Publication date: 2021-02-17
Also published as: KR20210006650A

Abstract

본 발명은 암을 진단할 수 있는 조성물, 이를 포함하는 진단용 키트 및 상기 조성물을 이용하여 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 바이오마커를 사용하는 경우, 암 중에서도 특히 유방암을 조기에 정확하면서도 간편하게 진단할 수 있고, 더 나아가서는 암의 병기를 진단할 수 있고, 치료 반응성 또는 치료 후 예후를 예측할 수 있다.

Description

암의 진단용 조성물{A Composition for Diagnosing Cancer}

본 발명은 암을 진단할 수 있는 조성물, 이를 포함하는 진단용 키트 및 상기 조성물을 이용하여 암의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

전 세계에서 유방암은 폐암에 이어 두 번째로 흔히 발생되는 암이며, 사망률은 5위에 해당하는 위험한 암이다. 특히 최근에는 저출산, 짧은 수유기간, 이른 초경, 늦은 폐경 등 생리적으로 왕성한 신체적 변화를 겪는 시기의 여성들에서는 여성호르몬의 자극을 받는 횟수의 급격한 증가로 인한 유선조직의 민감도 증가, 식생활의 서구화, 생활환경의 오염 등의 이유로 유방암 발생이 급격하게 증가하고 있다. 유방암의 경우 일단 암세포가 주변 조직에 침범하거나 림프절로 전이가 시작되면 완치가 어렵기 때문에 조기 발견이 다른 암보다 더 중요하다고 할 수 있다.

유방암으로 인한 사망률을 줄이기 위해서는 첫째, 유방암을 조기 진단하고, 둘째, 일차 수술에 의한 치료 이후 예후를 진단하여 적절한 부가 치료 (Adjuvant therapy)를 하는 것이 중요하다. 현재 유방암 진단에는 1차 촉진에 의한 자가 진단 외에, 유방 X-선 조영술, 초음파검사법 등이 예방차원에서의 검진방법으로 사용되고 있으며 이 방법은 초기의 유방암을 진단하는 데에도 가장 널리 사용되는 방법이다. 그러나 유방 X-선 조영술은 우리나라 여성들에서 흔히 발견되는 조밀유방일 경우 섬유질이 많아서, 진단율이 떨어지는 단점이 있으며, 특히 젊은 여성같이 유선이 많이 발달되어 있어도 진단율이 떨어진다. 또한, X-선을 사용하기 때문에 진단 과정에서 오히려 유방암이 생길 가능성도 배제할 수 없다. 그래서 대안으로 초음파검사법이 사용되고 있지만 이 역시 악성종양(cancer)과 양성종양(non-cancer)을 구별하기는 쉽지 않다. 실제 임상에서는 이상 소견이 있으면 세침흡입세포검사법, 자기공명촬영법 등을 부가적으로 사용하여 진단율을 높이고 있다. 그러나 이 방법들을 사용하더라도 정상조직과 비 정상조직을 형태상으로 구분할 뿐 악성종양(cancer)과 양성종양(non-cancer)을 구분하기가 쉽지 않기 때문에 확진을 위해서는 더욱 정밀한 조직검사를 하게 된다.

이와 같은 이유들로 인해 유방암은 다른 암에 비해 비교적 분자 유전학적인 방법으로 유방암을 진단하는 방법이 발달되어 있다. 조직검사에서 조직을 잘라서 병변을 확인한 다음 적출을 위한 1차 수술이 시행된다. 이후의 부가치료를 어떻게 할지 결정하기 위하여 에스트로겐 수용체(Estrogen receptor, ER)의 유무와 유방암 특이 종양표지자인 HER2/neu(Human Epidermal growth factor Receptor 2, ErbB-2 또는 ERBB2라고도 알려져 있다) 유전자의 수를 조직내 교잡법(in situ hybridization)을 통해 확인하는 방법을 사용한다. 만약, 발견된 암 조직이 에스트겐 수용체를 가지고 있으면, 타목시펜(Tamoxifen)과 같은 에스트로겐 유사체를 사용하여 치료를 하게 되고, HER2/neu 유전자가 과발현되어 있으면, HER2/neu 단클론항체인 trastuzumab을 제품화한 허셉틴(Herceptin)을 유방암의 치료에 사용하게 된다. 유방암의 진단 및 치료에 가장 유용하게 사용되는 유방암 특이 진단 마커인 HER2/neu 유전자의 증폭 및 과발현은 침습성 유방암의 20 ~ 35%에서 발견된다. 따라서. HER2/neu 검사는 에스트로겐 수용체 검사와 더불어 유방암 환자의 치료에 결정적인 역할을 한다.

그러나 유방암 환자 모두가 ER 유전자나 Her2/neu 유전자가 과발현되어 있는 것은 아니므로, 이러한 진단 방법들의 단점을 보완하고 좀 더 빠르고 확실하게 암을 구분하기 위하여 암 특이적 종양표지자(biomarker)를 찾기 위한 시도가 다양하게 이루어지고 있다. 이 중 암 특이적 종양표지자 중 탄산 탈수효소 4(Carbonic Anhydrase 4; CA4)는 유방암에서 아직 마커로 연구된 적이 없어 신규한 진단 마커로 기능할 수 있다.

본 발명의 일 목적은 암 중에서도 특히 유방암을 정확하고 간편하게 진단할 수 있는 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명의 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암을 정확하고 간편하게 진단할 수 있는 키트를 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암을 진단하기 위한 정보를 제공하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암의 치료 반응성을 예측하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암의 예후를 예측하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암의 병기를 예측하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암의 재발 가능성을 예측하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 중에서도 특히 유방암을 치료하기 위한 약물을 스크리닝하는 방법을 제공하고자 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 탄산 탈수효소 4(Carbonic Anhydrase 4; CA4)를 포함하는 암 진단용 마커에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 탄산 탈수효소 4 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암의 진단용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 탄산 탈수효소 4 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 탄산 탈수효소 4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 탄산 탈수효소 4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 탄산 탈수효소 4 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 본 발명의 암의 진단용 조성물을 포함하는 암의 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 탄산 탈수효소 4 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암의 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)일 수 있다.

본 발명에서 상기 탄산 탈수효소 4 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 탄산 탈수효소 4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 탄산 탈수효소 4 단백질의 발현 수준의 측정은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행될 수 있다.

본 발명에서 탄산 탈수효소 4 단백질의 발현 수준의 측정은 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM) 방법에 의할 수 있다.

본 발명에서 상기 탄산 탈수효소 4의 MRM 정량에 사용하기 위한 탄산 탈수효소 4 타겟 펩티드는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명에서 상기 탄산 탈수효소 4 타겟 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍은 505.73 m/z와 569.26 m/z 일 수 있다.

본 발명에서 상기 다중 반응 모니터링 방법 시 탄산 탈수효소 4 단백질의 절대량을 정량하기 위해 탄산 탈수효소 4 타겟 펩티드 중 특정 아미노산을 동위원소로 치환한 합성 펩타이드 또는 대조군으로 대장균 베타 갈락토시다아제를 이용할 수 있다.

대장균 베타 갈락토시다아제 타겟 펩티드는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있으며, 어미이온과 딸이온은 각각 542.3 m/z 와 636.3 m/z 일 수 있다.

본 발명에서 상기 탄산 탈수효소 4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준의 측정은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩에 의할 수 있다.

본 발명에서 상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 탄산 탈수효소 4 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가한 경우, 상기 암의 발병 가능성이 높은 것으로 예측할 수 있다.

본 발명에서 상기 정보 제공 방법은 목적하는 개체의 화학적 항암 치료 또는 면역 치료에 대한 반응성을 예측하는 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 정보 제공 방법은 목적하는 개체가 외과적 수술 후 예후를 예측하는 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 정보 제공 방법은 상기 목적하는 개체의 암의 병기를 진단하는 것일 수 있다.

본 발명에서 상기 정보 제공 방법은 상기 목적하는 개체의 암의 재발 가능성을 예측하는 것일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (a) 암 개체로부터 분리한 시료 또는 암 질환 동물 모델에 후보 약제를 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보 약제가 처리된 시료 또는 암 질환 동물 모델에서 탄산 탈수효소 4 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 시료는 암 개체로부터 분리된 세포 또는 조직일 수 있다.

본 발명에서 (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 탄산 탈수효소 4 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 후보 약제가 처리되기 전에 비하여 감소하거나 증가한 경우 상기 후보 약제를 암의 예방 또는 치료용 약제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

[서열목록]

서열번호 1: 탄산 탈수효소 4

10 20 30 40 50

MRMLLALLAL SAARPSASAE SHWCYEVQAE SSNYPCLVPV KWGGNCQKDR

60 70 80 90 100

QSPINIVTTK AKVDKKLGRF FFSGYDKKQT WTVQNNGHSV MMLLENKASI

110 120 130 140 150

SGGGLPAPYQ AKQLHLHWSD LPYKGSEHSL DGEHFAMEMH IVHEKEKGTS

160 170 180 190 200

RNVKEAQDPE DEIAVLAFLV EAGTQVNEGF QPLVEALSNI PKPEMSTTMA

210 220 230 240 250

ESSLLDLLPK EEKLRHYFRY LGSLTTPTCD EKVVWTVFRE PIQLHREQIL

260 270 280 290 300

AFSQKLYYDK EQTVSMKDNV RPLQQLGQRT VIKSGAPGRP LPWALPALLG

310

PMLACLLAGF LR

서열번호 2: 탄산 탈수효소 4의 타겟 펩티드

FFFSGYDK

서열번호 3: 대장균 베타 갈락토시다아제의 타겟 펩티드

GDFQFNISR

본 발명의 바이오마커를 사용하는 경우, 암 중에서도 특히 유방암을 조기에 정확하면서도 간편하게 진단할 수 있고, 더 나아가서는 암의 병기를 진단할 수 있고, 치료 반응성 또는 치료 후 예후를 예측할 수 있다.

도 1은 본 발명의 실시예 1에서 유방암 환자와 비 환자 대조군 사이에 탄산 탈수효소 4의 단백질 발현량의 차이를 확인한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명의 실시예 1에서 유방암 환자와 비 환자 대조군 사이에 탄산 탈수효소 4의 바이오마커의 정량 결과를 바탕으로 한 수용자-조작 특성(ROC) 그래프를 나타낸 것이다.

본 발명에서 진단의 대상이 되는 질환으로 상기 "암"은 포유류에서 전형적으로 조절되지 않는 세포 성장으로 특징 지어진 생리적 상태를 나타내거나 가리킨다. 본 발명에서 진단의 대상이 되는 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있으나, 바람직하게는 유방암일 수 있다.

본 발명에서 상기 "탄산 탈수효소 4(Carbonic anhydrase 4; CA4)"는 탄산무수화효소 4(Carbonic anhydrase 4)으로도 불리우며, 탄산 탈수효소 4 유전자에 의해 암호화되는 효소로, 탄산무수화효소의 동형 단백질(isofomer) 중 하나이다. 탄산무수화효소는 아연 금속효소(zinc metalloenzymes)의 큰 패밀리로서, 이산화탄소의 역수화를 촉매하는 역할을 한다. 이들은 다양한 생물학적 반응으로 예를 들면, 세포 호흡, 석회화, 산-염기 균형, 뼈 재흡수, 뇌척수액, 타액, 위산의 생성 등에 관여하는 것으로 알려져 있다. 본 발명에서 상기 탄산 탈수효소 4는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 탄산 탈수효소 4 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암의 진단용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 진단의 대상이 되는 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있으나, 바람직하게는 유방암일 수 있다.

본 발명에서 상기 "진단"은 특정 질병 또는 질환에 대한 대상(subject)의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 대상이 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는지 여부를 판정하는 것, 특정 질병 또는 질환에 걸린 대상의 예후(prognosis)(예컨대, 전-전이성 또는 전이성 암 상태의 동정, 암의 단계 결정 또는 치료에 대한 암의 반응성 결정)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링하는 것)을 포함한다. 본 발명의 목적상, 상기 진단은 상기한 암의 발병 여부 또는 발병 가능성(위험성)을 확인하는 것이다.

본 발명에서 상기 탄산 탈수효소 4 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 예를 들면 상기 탄산 탈수효소 4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명에 상기 "항체"는 항원과 특이적으로 결합하여 항원-항체 반응을 일으키는 물질을 가리킨다. 본 발명의 목적상, 항체는 탄산 탈수효소 4 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미한다. 본 발명의 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다. 상기 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 다클론 항체는 상기 단백질의 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 과정을 포함하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물로부터 제조될 수 있다. 또한, 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method; Kohler 및 Milstein (1976) European Journal of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리 기술(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991 참조)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체는 2개의 전장의 경쇄 및 2개의 전장의 중쇄를 갖는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.

본 발명에 상기 "PNA(Peptide Nucleic Acid)"는 인공적으로 합성된, DNA 또는 RNA와 비슷한 중합체를 가리키며, 1991년 덴마크 코펜하겐 대학교의 Nielsen, Egholm, Berg와 Buchardt 교수에 의해 처음으로 소개되었다. DNA는 인산-리보스당 골격을 갖는데 반해, PNA는 펩타이드 결합에 의해 연결된 반복된 N-(2-아미노에틸)-글리신 골격을 가지며, 이로 인해 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 크게 증가되어 분자 생물학, 진단 분석 및 안티센스 치료법에 사용되고 있다. PNA는 문헌[Nielsen PE, Egholm M, Berg RH, Buchardt O (December 1991). "Sequence-selective recognition of DNA by strand displacement with a thymine-substituted polyamide". Science 254(5037): 1497-1500]에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명에서 상기 "앱타머"는 올리고핵산 또는 펩타이드 분자이며, 앱타머의 일반적인 내용은 문헌[Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med. 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R. "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA. 95(24): 142727(1998)]에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명에서 상기 "프라이머"는 표적 유전자 서열을 인지하는 단편으로서, 정방향 및 역방향의 프라이머 쌍을 포함하나, 바람직하게는, 특이성 및 민감성을 가지는 분석 결과를 제공하는 프라이머 쌍이다. 프라이머의 핵산 서열이 시료 내 존재하는 비-표적 서열과 불일치하는 서열이어서, 상보적인 프라이머 결합 부위를 함유하는 표적 유전자 서열만 증폭하고 비특이적 증폭을 유발하지 않는 프라이머일 때, 높은 특이성이 부여될 수 있다.

본 발명에서 상기 "프로브"란 시료 내의 검출하고자 하는 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있는 물질을 의미하며, 상기 결합을 통하여 특이적으로 시료 내의 표적 물질의 존재를 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 프로브의 종류는 당업계에서 통상적으로 사용되는 물질로서 제한은 없으나, 바람직하게는 PNA(peptide nucleic acid), LNA(locked nucleic acid), 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, RNA 또는 DNA일 수 있으며, 가장 바람직하게는 PNA이다. 보다 구체적으로, 상기 프로브는 바이오 물질로서 생물에서 유래되거나 이와 유사한 것 또는 생체 외에서 제조된 것을 포함하는 것으로, 예를 들어, 효소, 단백질, 항체, 미생물, 동식물 세포 및 기관, 신경세포, DNA, 및 RNA일 수 있으며, DNA는 cDNA, 게놈 DNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, RNA는 게놈 RNA, mRNA, 올리고뉴클레오타이드를 포함하며, 단백질의 예로는 항체, 항원, 효소, 펩타이드 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 "LNA(Locked nucleic acids)"란, 2'-O, 4'-C 메틸렌 브릿지를 포함하는 핵산 아날로그를 의미한다 [J Weiler, J Hunziker and J Hall Gene Therapy (2006) 13, 496.502]. LNA 뉴클레오사이드는 DNA와 RNA의 일반적 핵산 염기를 포함하며, Watson-Crick 염기 쌍 규칙에 따라 염기 쌍을 형성할 수 있다. 하지만, 메틸렌 브릿지로 인한 분자의 'locking'으로 인해, LNA는 Watson-Crick 결합에서 이상적 형상을 형성하지 못하게 된다. LNA가 DNA 또는 RNA 올리고뉴클레오티드에 포함되면, LNA는 보다 빠르게 상보적 뉴클레오티드 사슬과 쌍을 이루어 이중 나선의 안정성을 높일 수 있다. 본 발명에서 상기 "안티센스"는 안티센스 올리고머가 왓슨-크릭 염기쌍 형성에 의해 RNA 내의 표적 서열과 혼성화되어, 표적서열 내에서 전형적으로 mRNA와 RNA:올리고머 헤테로이중체의 형성을 허용하는, 뉴클레오티드 염기의 서열 및 서브유닛간 백본을 갖는 올리고머를 의미한다. 올리고머는 표적 서열에 대한 정확한 서열 상보성 또는 근사 상보성을 가질 수 있다.

본 발명에 따른 탄산 탈수효소 4 단백질이나, 이들을 코딩하는 유전자의 정보는 알려져 있으므로, 당업자라면 이를 바탕으로 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 용이하게 디자인할 수 있을 것이다.

본 발명의 다른 구현 예에 따르면, 본 발명에 따른 암의 진단용 조성물을 포함하는 암의 진단용 키트에 관한 것이다.

본 발명에서는 상기 진단용 키트를 이용하여 암 질환의 발병 여부, 발병 가능성, 치료 반응성, 예후, 병기, 재발 가능성 등을 진단할 수 있다. 본 발명에서 상기 진단의 대상이 되는 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS central nervoussystem) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있으나, 바람직하게는 유방암일 수 있다.

본 발명에서 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 상기 암의 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함할 수 있다.

예를 들면, 본 발명에서 상기 암의 진단용 키트는 역전사 중합효소반응을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 더 포함할 수 있다. 역전사 중합효소반응 키트는 마커 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 특이적인 프라이머 쌍을 포함한다. 프라이머는 상기 유전자의 핵산서열에 특이적인 서열을 가지는 뉴클레오티드로서, 약 7 bp 내지 50 bp의 길이, 보다 바람직하게는 약 10 bp 내지 30 bp의 길이를 가질 수 있다. 또한 대조군 유전자의 핵산 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 그 외 역전사 중합효소반응 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 용기, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제 DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 진단용 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)가 부착되어 있는 기판, 및 형광표지 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한 기판은 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA 또는 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 진단용 키트는 ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함할 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질에 대해 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 마커 단백질에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 진단용 키트에서 항원-항체 결합반응을 위한 고정체로는 니트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(Well plate), 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 진단용 키트에서 2차 항체의 표지체는 발색 반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(폴리 L-라이신-플루오르세인 아이소티오시아네이트), RITC(로다민-B-아이소티오시아네이트) 등의 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye) 등의 표지체가 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 진단용 키트에서 발색을 유도하기 위한 발색 기질은 발색 반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB(3,3',5,5'-테트라메틸 베지딘), ABTS[2,2'-아지노-비스(3-에틸벤조티아졸린-6-설폰산)], OPD(o-페닐렌다이아민) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색기질은 완충용액(0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 이차항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고, 이 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 상기 마커 단백질들의 존재 유무를 검출한다.

본 발명의 진단용 키트에서 세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 구성된 완충용액(PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 2차 항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 첨가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 황산 용액(H2SO4)이 바람직하게 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, 목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 탄산 탈수효소 4 단백질 또는 상기 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암의 진단을 위한 정보 제공 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 "목적하는 개체"란, 상기 암의 발병 여부가 불확실한 개체로, 발병 가능성이 높은 개체를 의미한다.

본 발명에서 상기 "생물학적 시료"는 개체로부터 얻어지거나 개체로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 의미하는 것으로, 예를 들면, 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함할 수 있지만, 바람직하게는 발병 가능성이 높은 환자의 피부를 절개하지 않고 중공침 등을 생체 내 기관에 자입하여 병리조직학적 검사용으로 채취한 액체 생검(예를 들면, 환자의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 복수(ascites) 등)일 수 있다.

본 발명에서는 상기와 같이 분리된 생물학적 시료에서 탄산 탈수효소 4 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 상기 탄산 탈수효소 4 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 특별히 제한하지는 않으나, 바람직하게는 상기 탄산 탈수효소 4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명에 상기 탄산 탈수효소 4 단백질의 발현 수준을 측정 또는 비교 분석 방법으로는 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 및 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 탄산 탈수효소 4 단백질의 발현 수준을 측정 또는 비교 분석 방법으로는 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM) 방법에 의할 수 있다.

본 발명에서 상기 다중 반응 모니터링 방법은 질량분석기 (mass-spectrometry), 바람직하게는 삼중 사극자 질량분석기 (triple quadrupole mass-spectrometry)를 이용하여 수행될 수 있다.

본 발명에서 질량분석기 (mass-spectrometry)를 이용한 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM) 방법은 특정 분석물질을 선택적으로 분리하여 검출하고 정량하여 그 농도변화를 모니터링할 수 있는 분석기술이다. MRM은 생체 시료 중에 존재하는 미량의 바이오마커와 같은 물질을 정량적으로 정확하게 다중 측정할 수 있는 방법으로 제1 질량필터 (Q1)를 이용하여 이온화원에서 생성된 이온 단편들 중 어미이온을 선택적으로 충돌관으로 전달한다. 이어 충돌관에 도달한 어미이온은 내부 충돌기체와 충돌하여, 쪼개져 딸이온을 생성하여 제2 질량 필터 (Q2)로 보내지고, 여기서 특징적인 이온만이 검출부로 전달된다. 이런 방식으로 목적하는 성분의 정보만을 검출할 수 있는 선택성 및 민감도가 높은 분석방법이다. MRM은 작은 분자의 정량분석에 활용되어 특정 유전병을 진단하는데 쓰이고 있다. MRM 방법은 다수의 펩티드를 동시에 측정하기에 용이하며, 항체가 없이 정상인과 암환자 사이에서 단백질 진단 마커 후보들의 상대적 농도차를 확인할 수 있다는 장점이 있다. 또한 민감도와 선택성이 탁월하여 특히, 질량분석기를 이용한 프로테옴 분석에서 혈액 내에 있는 복잡한 단백질과 펩타이드의 분석을 위해 MRM 분석방법이 도입되고 있다(Anderson L. et al., Mol CellProteomics, 5: 375-88, 2006; DeSouza, L. V. et al., Anal. Chem., 81: 3462-70, 2009).

본 발명에서 상기 다중 반응 모니터링 방법에 의해 탄산 탈수효소 4 단백질의 발현 수준을 분석하기 위해, 상기 탄산 탈수효소 4 단백질을 대표할 수 있는 타겟 펩티드를 선정할 수 있다.

또한, 본 발명에서 상기 다중 반응 모니터링 방법에 의해 탄산 탈수효소 4 단백질의 발현 수준을 분석하기 위하여, 상기 선정된 타겟 펩티드에서의 어미이온/딸이온 쌍을 선정할 수 있다.

본 발명에서 상기 탄산 탈수효소 4 단백질을 대표하는 타겟 펩티드 및 상기 타겟 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍의 정보는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

구분	유전자명칭	단백질 명칭	uniprotKB	펩티드 서열		어미이온	딸이온
1	CA4	Carbonic anhydrase 4	P22748	1	FFFSGYDK (서열번호 2)	505.73	569.26

본 발명에서는 상기 탄산 탈수효소 4 단백질을 검출하기 위하여, 상기한 각각의 단백질의 타겟 펩티드 중 일부 아미노산이 안정한 동위원소로 치환된 펩티드를 합성하고, 다중 반응 모니터링 분석 시 내부 표준 물질로 사용하면 상기 단백질의 혈액 내 절대량도 측정할 수 있어 분석의 정확도를 더욱 높일 수 있다.

본 발명에 있어서 내부 표준 물질은 상기 다중 반응 모니터링 분석 시 일반적으로 사용되는 임의의 내부 표준 물질이 사용될 수 있으나, 예를 들어, 대장균 베타 갈락토시다아제가 사용될 수 있다. 대장균 베타 갈락토시다아제를 대표하는 타겟 펩티드는 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어지며 어미이온과 딸이온은 각각 542.3 m/z 와 636.3 m/z 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명에서 상기 탄산 탈수효소 4 단백질의 혈액 내 절대량을 측정하기 위하여 타겟 펩티드의 일부 아미노산이 안정한 동위원소로 치환된 특정 펩티드를 내부 표준물질로서 합성하는 경우, 동위 원소로 치환된 아미노산은 리신(Lysine)이나 아르기닌(Arginine)이 바람직하나 이에 제한되는 것은 아니다. 여기서 합성된 펩티드는 95% 이상 순수 분리된 펩티드를 사용하는 것이 바람직하다.

한편, 본 발명에서 상기 탄산 탈수효소 4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명에 상기 탄산 탈수효소 4 단백질을 코딩하는 유전자의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로 mRNA의 양을 측정하는 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체 예에서 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 탄산 탈수효소 4 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가하거나 감소한 경우, 상기 암의 발병 가능성이 높은 것으로 예측할 수 있다.

본 발명의 다른 구체 예에서 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 탄산 탈수효소 4 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 치료 반응성, 바람직하게는 화학적 항암 치료 또는 면역 치료에 대한 반응성을 예측할 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체 예에서 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 탄산 탈수효소 4 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 상기 개체의 예후, 바람직하게는 외과적 수술 후 예후를 예측할 수 있다. 여기서 상기 목적하는 개체는 암이 발병하여 외과적 절제 수술을 받은 개체일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구체 예에서 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 탄산 탈수효소 4 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 상기 개체에서 암의 병기를 예측할 수 있다.

본 발명에서 상기 "병기(stage)"란 암세포가 퍼진 정도, 암의 진행 단계를 의미하는 것으로, 암의 진행상황에 따른 국제적분류는 일반적으로 TNM 병기 분류에 따른다. 여기서 'T(Tumor Size)'는 원발 종양의 크기에 따른 분류이고, 'N(Lymph Node)'은 림프절 전이 정도에 따른 분류이며, 'M(Metastasis)'은 다른 장기로의 전이 여부에 따른 분류에 해당한다. T, N, M에 있어서 상세 분류는 하기 표 2와 같으며 이에 따른 암의 병기 분류는 하기 표 3과 같다.

TNM 병기		정의
원발 종양의 크기 (T 병기) Size of the primary tumor (T stage)	T0	종양세포의 형태가 악성종양의 모습을 보이나 발생한 점막 또는 상피에 국한돼 있고 아직 기저막을 침윤하지 않은 종양
	T1	원발된 장기에 제한된 병변, 종양이 가동성이 있으며 인접 및 주위조직에 침범이 없음
	T2	종양의 크기가 2~5cm 정도
	T3	종양의 크기가 T2 보다 크나 장기 내에 국한됨
	T4	주변 조직과 유착 및 침윤한 상태
림프절 전이 여부 (N 병기) Lymph node status (N stage)	N0	림프절 병변의 증거가 없음
	N1	촉지되고 가동성이 있으며 첫 번째 위치에 제한되어 있는 림프절(1~2cm 이상, 보통 3cm까지의 크기) 하나에 침범
	N2	촉지되고 부분적으로 가동성이 있는 또는 단단하거나 딱딱한 림프절, 현미경적으로 침범의 증거가 있고 임상적으로 서로 엉켜있으며 반대측 또는 양측에서 나타남(3~5cm)
	N3	완전히 고정되어 있고 피막을 통과해 뼈나 큰 혈관, 피부, 신경 등에 완전히 고정되어 있으며 6cm 이상의 크기
원격전이 여부 (M 병기) Distant metastasis (M stage)	M0	원격전이가 없음
원격전이 여부 (M 병기) Distant metastasis (M stage)	M1	원격전이가 있음

병기분류	T1	T2	T3	T4
N0	1기		2기
N1	3기
N2
N3
M1	4기

본 발명의 또 다른 구체 예에서 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 탄산 탈수효소 4 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하여 암의 재발 가능성을 예측할 수 있다.

본 발명에서 상기 암은 유방암, 난소암, 대장암, 위암, 간암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 부갑상선암, 폐암, 비소세포성폐암, 전립선암, 담낭암, 담도암, 비호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 혈액암, 방광암, 신장암, 흑색종, 결장암, 골암, 피부암, 두부암, 자궁암, 직장암, 뇌종양, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 질암, 음문암종, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(central nervous system; CNS) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종일 수 있으나, 바람직하게는 유방암일 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현 예에 따르면, (a) 암 개체로부터 분리한 시료 또는 암 질환 동물 모델에 후보 약제를 처리하는 단계; 및 (b) 상기 후보 약제가 처리된 시료 또는 암 질환 동물 모델에서 탄산 탈수효소 4 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 상기 "시료"란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액, 파열된 진핵세포 및 세균 발현계 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 목적상 상기 분리된 시료는 암 개체로부터 분리된 세포 또는 조직임이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 암의 예방 또는 치료용 후보 약제와 반응시킬 수 있다.

본 발명에 상기 "암 질환 동물 모델"이란 인간을 제외한 동물로서, 암의 병리학적 상태에 있다고 통상의 기술자가 판단할 수 있는 상태에 있는 동물을 의미한다.

본 발명에서는 상기 암 개체로부터 분리한 시료 또는 암 질환 동물 모델에 후보 약제를 처리하기에 앞서, 상기 시료 또는 암 질환 동물 모델에서 탄산 탈수효소 4 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 수행할 수 있다.

본 발명에서의 용어 "후보 물질"은 암 환자에 적용하여 암에 의한 환자의 증세를 호전시키거나 이롭게 변경할 수 있는 물질을 의미하며, 탄산 탈수효소 4 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 또는 활성을 감소시킬 수 있는 물질로, 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 핵산, 단백질, 펩티드, 기타 추출물 또는 천연물을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않고 제한없이 포함될 수 있다.

본 발명에서 상기 후보 약제의 처리 전 또는 후에 있어서, 시료 또는 암 질환 동물 모델에서 탄산 탈수효소 4 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법 및 그에 사용되는 제제는 상기 암의 진단을 위한 정보 제공 방법에 기재된 바와 중복되어 이하 자세한 기재를 생략한다.

본 발명에서는, (c) 상기 (b) 단계에서 측정된 탄산 탈수효소 4 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 후보 약제가 처리되기 전에 비하여 증가하거나 바람직하게는 감소한 경우 상기 후보 약제를 암의 예방 또는 치료용 약제로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예

[실시예 1] 유방암 진단을 위한 탄산 탈수효소 4의 검출

1. 시료의 준비

본 발명의 바이오마커 조합의 유방암 진단의 정확도를 확인하기 위하여, 유방암 환자들과 정상 대조군들로부터 얻은 혈액 시료에서 혈장을 분리하고, Bradford assay를 통하여 총 단백질을 정량하였다. 이 중 총 단백질 200 ㎍을 우레아(urea)로 변형시킨 뒤 디티오트레이톨(dithiothreitol, DTT)로 환원시키고, 이오도아세트아미드(iodoacetamide)를 통해 알킬화 시켰다. 이후, 트립신을 넣어주어 펩티드화 시키고, C18 컬럼을 이용하여 염을 제거하였다. 내부표준물질로는 펩타이드의 말단에 붙어있는 아미노산기가 동위원소로 치환된 합성품을 이용하였다.

2. 삼중 사극자 질량분석기를 이용한 다중 반응 모니터링 수행

삼중 사극자 질량분석을 위하여 본 발명의 탄산 탈수효소 4의 타겟 펩티드와 어미이온과 딸이온 쌍을 선정하여 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

상기 1.에서 준비된 최종 시료를 역상 수지 크로마토그래피에 걸어 혈장 펩티드 절편을 분리하였고, 삼중 사극자 질량분석기(기기: 5500 Qtrap, AB Sciex, USA)를 사용해 각 펩티드의 MRM 스펙트럼을 얻었다. 이때, 역상 수지 크로마토그래피는 HALOTM C18 컬럼 (Eksigent, USA) 컬럼으로 45분간 5%~40%의 아세토니트릴 농도 구배를 이용하여 실시하였다. MultiQuantTM 컴퓨터 정량 분석 프로그램 (AB Sciex, USA)으로 타깃 펩티드의 MRM 크로마토그램의 피크 면적을 계산하여 정량 정보를 확인하였다. 이때 각 타깃 펩티드의 정량값은 내부 표준물질로 넣어준 대장균 베타 갈락토시다아제의 MRM 크로마토그램의 피크 면적에 대한 비율로 표시하였다. 각 펩티드의 MRM 크로마토그램 면적비를 구함으로써 유방암 환자와 비 환자 대조군 사이에 탄산 탈수효소 4의 단백질 발현량의 차이를 확인하여 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보는 바와 같이, 비 환자 대조군에 비하여 유방암 환자에서 탄산 탈수효소 4의 단백질의 발현 수준이 현저히 증가한 것을 확인할 수 있었다.

3. 탄산 탈수효소 4의 바이오마커의 유방암 진단의 정확도 확인

상기 2.에서 확인된 탄산 탈수효소 4의 바이오마커의 정량 결과를 로지스틱 회귀분석을 통해 하나로 통합하여 다수의 마커로 구성된 하나의 진단 마커로 만들어 유방암 진단 효율을 확인하여, 도 2에 유방암 환자와 비 환자 대조군에 대한 수용자-조작 특성(ROC) 그래프로 도시하였다.

도 2에서 보는 바와 같이, 본 발명의 탄산 탈수효소 4 바이오마커에 있어서, 유방암 환자들과 정상 대조군들에 대한 수용자-조작 특성(ROC) 그래프로 도시한 결과 AUC(area under the curve)는 0.783으로 나타났다. 이처럼 본 발명의 탄산 탈수효소 4 바이오마커를 이용하는 경우 유방암을 높은 정확도로 진단할 수 있음을 알 수 있었다.

<110> BERTIS Inc. <120> A Composition for Diagnosing Cancer <130> PDPB194042 <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 312 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Arg Met Leu Leu Ala Leu Leu Ala Leu Ser Ala Ala Arg Pro Ser 1 5 10 15 Ala Ser Ala Glu Ser His Trp Cys Tyr Glu Val Gln Ala Glu Ser Ser 20 25 30 Asn Tyr Pro Cys Leu Val Pro Val Lys Trp Gly Gly Asn Cys Gln Lys 35 40 45 Asp Arg Gln Ser Pro Ile Asn Ile Val Thr Thr Lys Ala Lys Val Asp 50 55 60 Lys Lys Leu Gly Arg Phe Phe Phe Ser Gly Tyr Asp Lys Lys Gln Thr 65 70 75 80 Trp Thr Val Gln Asn Asn Gly His Ser Val Met Met Leu Leu Glu Asn 85 90 95 Lys Ala Ser Ile Ser Gly Gly Gly Leu Pro Ala Pro Tyr Gln Ala Lys 100 105 110 Gln Leu His Leu His Trp Ser Asp Leu Pro Tyr Lys Gly Ser Glu His 115 120 125 Ser Leu Asp Gly Glu His Phe Ala Met Glu Met His Ile Val His Glu 130 135 140 Lys Glu Lys Gly Thr Ser Arg Asn Val Lys Glu Ala Gln Asp Pro Glu 145 150 155 160 Asp Glu Ile Ala Val Leu Ala Phe Leu Val Glu Ala Gly Thr Gln Val 165 170 175 Asn Glu Gly Phe Gln Pro Leu Val Glu Ala Leu Ser Asn Ile Pro Lys 180 185 190 Pro Glu Met Ser Thr Thr Met Ala Glu Ser Ser Leu Leu Asp Leu Leu 195 200 205 Pro Lys Glu Glu Lys Leu Arg His Tyr Phe Arg Tyr Leu Gly Ser Leu 210 215 220 Thr Thr Pro Thr Cys Asp Glu Lys Val Val Trp Thr Val Phe Arg Glu 225 230 235 240 Pro Ile Gln Leu His Arg Glu Gln Ile Leu Ala Phe Ser Gln Lys Leu 245 250 255 Tyr Tyr Asp Lys Glu Gln Thr Val Ser Met Lys Asp Asn Val Arg Pro 260 265 270 Leu Gln Gln Leu Gly Gln Arg Thr Val Ile Lys Ser Gly Ala Pro Gly 275 280 285 Arg Pro Leu Pro Trp Ala Leu Pro Ala Leu Leu Gly Pro Met Leu Ala 290 295 300 Cys Leu Leu Ala Gly Phe Leu Arg 305 310 <210> 2 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Carbonic Anhydrase 4 protein fragment <400> 2 Phe Phe Phe Ser Gly Tyr Asp Lys 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 3 Gly Asp Phe Gln Phe Asn Ile Ser Arg 1 5

Claims

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탄산 탈수효소 4(Carbonic anhydrase 4; CA4) 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 암의 진단용 조성물로,
상기 암은 유방암인, 암의 진단용 조성물.
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제3항에 있어서,
상기 탄산 탈수효소 4 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 탄산 탈수효소 4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 암의 진단용 조성물.
제3항에 있어서,
상기 탄산 탈수효소 4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 탄산 탈수효소 4 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 암의 진단용 조성물.
제3항, 제5항 및 제6항 중 어느 한 항의 암의 진단용 조성물을 포함하는 암의 진단용 키트로,
상기 암은 유방암인, 암의 진단용 키트.
제7항에 있어서,
상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, ELISA 키트, 단백질 칩 키트, 래피드(rapid) 키트 또는 MRM(Multiple reaction monitoring) 키트인, 암의 진단용 키트.
목적하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료에서 탄산 탈수효소 4 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 암의 진단을 위한 정보 제공 방법으로,
상기 암은 유방암인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제9항에 있어서,
상기 생물학적 시료는 전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma), 혈청(serum), 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복강 세척액(peritoneal washings), 복수(ascites), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 췌장액(pancreatic fluid), 림프액(lymph fluid), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 기관 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 또는 뇌척수액(cerebrospinal fluid)인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제9항에 있어서,
상기 탄산 탈수효소 4 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제9항에 있어서,
상기 탄산 탈수효소 4 단백질의 발현 수준의 측정은 단백질 칩 분석, 면역측정법, 리간드 바인딩 어세이, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDI-TOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 방사선 면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 보체 고정 분석법, 2차원 전기영동 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LC-MS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry), 웨스턴 블랏팅 또는 ELISA(enzyme linked immunosorbentassay)에 의해 수행되는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제9항에 있어서,
상기 탄산 탈수효소 4 단백질의 발현 수준의 측정은 다중 반응 모니터링 (multiple reaction monitoring; MRM) 방법에 의하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제13항에 있어서,
상기 탄산 탈수효소 4의 타겟 펩티드는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제13항에 있어서,
상기 탄산 탈수효소 4의 타겟 펩티드의 어미이온/딸이온 쌍은 각각 505.73 m/z 과 569.26 m/z 인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제13항에 있어서,
상기 다중 반응 모니터링 방법 시 내부 표준 물질은 타겟 펩타이드를 구성하는 특정 아미노산을 동위원소로 치환한 합성 펩타이드 또는 대장균 베타 갈락토시다아제를 사용하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제16항에 있어서,
상기 대장균 베타 갈락토시다아제의 타겟 펩티드는 서열번호 3으로 표시되는 아미노산 서열로 이루어지며 어미이온과 딸이온은 각각 542.3 m/z 와 636.3 m/z 인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제9항에 있어서,
상기 탄산 탈수효소 4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 탄산 탈수효소 4 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머, 프로브 및 안티센스 뉴클레오티드로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제9항에 있어서,
상기 탄산 탈수효소 4 단백질을 코딩하는 유전자의 발현 수준의 측정은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 DNA 칩에 의하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제9항에 있어서,
상기 목적하는 개체의 생물학적 시료에 대하여 측정된 탄산 탈수효소 4 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 정상 대조군에 비하여 증가한 경우, 상기 암의 발병 가능성이 높은 것으로 예측하는, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제9항에 있어서,
상기 정보 제공 방법은 목적하는 개체의 화학적 항암 치료 또는 면역 치료에 대한 반응성을 예측하는 것인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제9항에 있어서,
상기 정보 제공 방법은 목적하는 개체가 외과적 수술 후 예후를 예측하는 것인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제9항에 있어서,
상기 정보 제공 방법은 상기 목적하는 개체의 암의 병기를 진단하는 것인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
제9항에 있어서,
상기 정보 제공 방법은 상기 목적하는 개체의 암의 재발 가능성을 예측하는 것인, 암의 진단을 위한 정보 제공 방법.
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(a) 암 개체로부터 분리한 시료 또는 암 질환 동물 모델에 후보 약제를 처리하는 단계; 및
(b) 상기 후보 약제가 처리된 시료 또는 암 질환 동물 모델에서 탄산 탈수효소 4 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝하는 방법으로,
상기 암은 유방암인, 암의 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝하는 방법.
제26항에 있어서,
상기 시료는 암 개체로부터 분리된 세포 또는 조직인, 암의 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝하는 방법.
제26항에 있어서,
(c) 상기 (b) 단계에서 측정된 탄산 탈수효소 4 단백질; 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 후보 약제가 처리되기 전에 비하여 증가하거나 감소한 경우 상기 후보 약제를 암의 예방 또는 치료용 약제로 판단하는 단계를 추가로 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약물을 스크리닝하는 방법.
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