JP2017526896A - 補体因子bタンパク質に特異的に結合する抗体及び糖鎖抗原19−9タンパク質に特異的に結合する抗体を含む膵臓癌診断用キット - Google Patents
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Abstract
Description
MGSNLSPQLCLMPFILGLLSGGVTTTPWSLARPQGSCSLEGVEIKGGSFRLLQEGQALEYVCPSGFYPYPVQTRTCRSTGSWSTLKTQDQKTVRKAECRAIHCPRPHDFENGEYWPRSPYYNVSDEISFHCYDGYTLRGSANRTCQVNGRWSGQTAICDNGAGYCSNPGIPIGTRKVGSQYRLEDSVTYHCSRGLTLRGSQRRTCQEGGSWSGTEPSCQDSFMYDTPQEVAEAFLSSLTETIEGVDAEDGHGPGEQQKRKIVLDPSGSMNIYLVLDGSDSIGASNFTGAKKCLVNLIEKVASYGVKPRYGLVTYATYPKIWVKVSEADSSNADWVTKQLNEINYEDHKLKSGTNTKKALQAVYSMMSWPDDVPPEGWNRTRHViiLMTDGLHNMGGDPITVIDEIRDLLYIGKDRKNPREDYLDVYVFGVGPLVNQVNINALASKKDNEQHVFKVKDMENLEDVFYQMIDESQSLSLCGMVWEHRKGTDYHKQPWQAKISVIRPSKGHESCMGAVVSEYFVLTAAHCFTVDDKEHSIKVSVGGEKRDLEIEVVLFHPNYNINGKKEAGIPEFYDYDVALIKLKNKLKYGQTIRPICLPCTEGTTRALRLPPTTTCQQQKEELLPAQDIKALFVSEEEKKLTRKEVYIKNGDKKGSCERDAQYAPGYDKVKDISEVVTPRFLCTGGVSPYADPNTCRGDSGGPLIVHKRSRFIQVGVISWGVVDVCKNQKRQKQVPAHARDFHINLFQVLPWLKEKLQDEDLGFL
一具体例において、個体から分離した血液試料内の補体因子Bのタンパク質発現水準を正常対照群内の補体因子Bのタンパク質発現水準と比較する段階をさらに含むことができる。本明細書で、正常対照群は、膵臓癌その他疾病がない健常な個体から分離した血液試料を意味する。2つの膵臓癌の試料を比較し、膵臓癌疑い患者の試料の補体因子Bのタンパク質発現水準が正常対照群試料の補体因子Bのタンパク質発現水準より高い場合、前記候補患者を膵臓癌患者に分類できる。例えば、膵臓癌候補患者の試料の補体因子Bタンパク質水準が正常対照群試料の補体因子Bタンパク質水準より2倍以上高い場合、前記候補患者を膵臓癌患者に分類できる。
一具体例において、血液試料は、全血、血漿または血清試料であることができる。
一具体例において、膵臓癌疑い患者から分離した血液試料内の補体因子B及びCA19−9のタンパク質発現水準を正常対照群内の補体因子B及びCA19−9のタンパク質発現水準と比較する段階をさらに含むことができる。2つの試料を比較し、膵臓癌疑い患者の試料の補体因子B及びCA19−9のタンパク質の発現水準が、いずれも、正常対照群試料の補体因子B及びCA19−9のタンパク質の発現水準より高い場合、前記候補患者を膵臓癌患者に分類できる。例えば、膵臓癌疑い患者の試料の補体因子Bのタンパク質水準が正常対照群試料の補体因子Bのタンパク質水準より2倍以上高くて、膵臓癌疑い患者の試料のCA19−9の濃度が37U/mL以上である場合、前記膵臓癌疑い患者を膵臓癌患者に分類できる。
一具体例において、血液試料は、全血、血漿または血清試料であることができる。
個体から血液試料を収集する第1段階と;
バイオマーカーに特異的に結合し、検出可能に標識された抗体に前記血液試料を接触して、前記抗体及び前記バイオマーカーの複合体を形成する第2段階と;
複合体を含まない標識された抗体から前記第2段階で形成された複合体を分離する第3段階と;
前記第2段階で形成された複合体を含む抗体の検出可能な標識から信号を定量し、前記血液試料内のバイオマーカーの量を測定する第4段階と;
前記第4段階で測定されたバイオマーカーの量と対照群バイオマーカーの量を比較する第5段階と;
前記第5段階で、試料においてバイオマーカーの量が対照群バイオマーカーの量より多い場合、膵臓癌として診断する第6段階とを含む膵臓癌診断方法を提供する。
前記第4段階で、バイオマーカー−抗体複合体の検出可能な標識からの信号は、血液試料内のバイオマーカーの量と比例するので、これから前記バイオマーカーの量を把握できる。
一具体例において、対照群バイオマーカーの量は、膵臓癌がない個体の血液試料内のバイオマーカーの量を意味する。
一具体例において、前記第1段階と第2段階との間に、免疫沈降によって血液試料内のバイオマーカー以外のタンパク質とバイオマーカーを分離する段階をさらに含むことができる。
i)個体から分離した血液試料をバイオマーカーに特異的に結合する抗体と接触して、前記抗体と前記バイオマーカーとの間に複合体を形成する段階と;
ii)前記i)段階で形成された複合体を沈降させる段階と;
iii)バイオマーカー以外の他のタンパク質及び複合体を形成しない抗体を含む試料の上澄み液から沈降された複合体を分離する段階とを含むことができる。
[実施例1−1]電気泳動及び質量分析による血漿でのCFBタンパク質検出
正常人及び膵臓癌患者の血漿においてCFBの存在及び量を検出するために、電気泳動及び質量分析を行った。
膵臓癌患者の血漿でのCFBタンパク質発現水準を分析するために、免疫ブロットを行った。10人に対する正常人の血漿と10人の膵臓癌患者の血漿において同一のタンパク質量から抗体を利用してウェスタンブロッティングを行った。血漿タンパク質10μgを10%SDS−PAGE分析後、ウェスタンブロッティングのためにゲル全体をニトロセルロース(nitrocellulose;NC)膜に転換(transfer)した後、5%脱脂乳(skimmed milk)が含まれたTBS−T緩衝溶液[20mMトリス、137mM塩化ナトリウム、0.1%ツイン20(Tween−20)、pH7.6]で1時間ブロッキングした。抗−補体因子B抗体(CFB、Abcam)を5%脱脂乳が含まれたTBS−T緩衝溶液に1:1000倍ずつ希釈して1次処理し、抗−マウス(mouse)IgG−HRP(Santa Cruz)を1:10000倍を2次処理した。最終NC膜は、ECL Plusウェスタンブロッティング試薬(GE Healthcare)で1分間反応させ、Typhoon 9400スキャナでスキャンして分析した。
膵臓癌細胞株でのCFB発現水準を確認するために、ウェスタンブロッティングとRT−PCRを行った。正常細胞株としては、HPDE(human pancreatic ductepithelial cell)を使用し、膵臓癌細胞株としては、HPAC1、BXPC3(human pancreas adenocarcinoma epithelial cell)、PANC1(human pancreas epithelioidcarcinoma)を使用した。それぞれの細胞溶解物(cell lysate)1mgを使用して抗−補体因子B抗体2ug、タンパク質Gアガローズ10uLを一緒に1mLのチューブで2時間免疫沈降させた後、ウェスタンブロッティングを通じて正常細胞と膵臓癌細胞内でのCFB発現水準を確認した。その結果、CFBが正常細胞では検出されず、膵臓癌細胞だけで検出されることを確認した(図4a)。
CFBプライマー(配列番号2):5’−CAACAGAAGCGGAAGATCGTC−3’(フォワード)
CFBプライマー(配列番号3):5’−TATCTCCAGGTCCCGCTTCTC−3’(リバース)
GAPDHプライマー(配列番号4):5’−ACCACAGTCCATGCCATCAC−3’(フォワード)
GAPDHプライマー(配列番号5):5’−TCCACCACCCTGTTGCTGTA−3’(リバース)
CFBがバイオマーカー候補としての確かな可能性を調べるために、独立的な且つ大規模患者集団(large patient cohorts)を使用して追加確認実験を行った。
現在膵臓癌バイオマーカーとして知られているCA19−9とCFBの発現水準を比較するためにHD、CP、PC、HCC、CC、GCの血漿を使用してELISAテストを行った。CFBとCA19−9 ELISA KITは、それぞれUSCNとPanomics製品を使用し、各製品ごとにそれぞれのプロトコルによって実験を行った。
CFBとCA19−9が、膵臓癌患者と膵臓癌患者でない人(HD、CP、HCC、CC、GC)をどれほど良好に区別するかどうかを確認するために、Mann−Whitney rank sum testプログラムを利用してROC曲線分析を行った。AUC値を通じてCFBとCA19−9を比較した。その結果、CFBの場合、0.958(95%CI:0.956−0.959)であって、CA19−9の0.833(95%CI:0.829−0.837)よりAUC値がさらに高かった。2つの(CFB+CA19−9)を組み合わせた場合のAUCは、0.986(0.985−0.986)であって、CFBとCA19−9(p<0.01)を単独で使用した場合より非常に高いAUC値を示した(図7)。
それぞれのグループ別に(HD;正常、CP;膵臓炎、PC;膵臓癌、HCC;肝臓癌、CC;胆管癌、GC;胃癌)CA19−9とCFBの診断効率を確認した。その結果、下記表2に示されたように、CA19−9とCFBがいずれもPCにおいて類似な診断効率を示した(CA19−9:80.5%、CFB:73.2%)。しかし、CA19−9の場合、他の癌(HCC、CC、GC)でも高い診断効率(HCC:61.3%、CC:77.2%、GC:17.1%)を示したが、CFBは、他の癌では低い診断効率を示した(HCC:0%、CC:0%、GC:8.6%)。これは、他の癌と比較したとき、CFBがCA19−9よりPCにさらに特異的であることを意味する。
CFB、CA19−9及びCFB+CA19−9の膵臓癌診断指標としての正確度を評価するために、最大ヨーデン指標(maximum Youden index)によって予測された最適のカット−オフ値によるCA19−9、CFB及びCFB+CA19−9の他の疾病と比較した膵臓癌診断の敏感度及び特異度(%)を確認した。その結果、下記表3に示されたように、PCと他の群(HD、CP、HCC、CC、GC)を比較した場合、CA19−9の敏感度は80.4%、特異度は70.0%であり、CFBは、敏感度73.1%、特異度97.9%であることが分かった。また、CFBとCA19−9を組み合わせた場合には、敏感度90.1%、特異度97.2%であった。これは、CA19−9とCFBを単独で使用した場合に比べて、CA19−9とCFBを組み合わせた場合にさらに好適な診断効率が発揮されることを意味する。
Claims (13)
- 個体から分離した血液試料内の補体因子B及び糖鎖抗原19−9のタンパク質発現水準を測定することを含む、膵臓癌診断のための情報の提供方法。
- 個体から分離した血液試料内の補体因子B及び糖鎖抗原19−9のタンパク質発現水準を正常対照群内の補体因子B及び糖鎖抗原19−9のタンパク質発現水準とそれぞれ比較する段階をさらに含む、請求項1に記載の膵臓癌診断のための情報の提供方法。
- 血液試料は、全血、血漿または血清試料である、請求項1に記載の膵臓癌診断のための情報の提供方法。
- 補体因子B及び糖鎖抗原19−9のタンパク質発現水準は、2次元蛍光電気泳動、ウェスタンブロッティング、ELISA、放射免疫分析、放射免疫拡散法、免疫電気泳動または質量分析を利用して測定するものである、請求項1に記載の膵臓癌診断のための情報の提供方法。
- 補体因子Bに特異的に結合する抗体及び糖鎖抗原19−9に特異的に結合する抗体を含む膵臓癌診断用キット。
- 補体因子Bは、配列番号1のアミノ酸配列よりなる、請求項5に記載の膵臓癌診断用キット。
- 抗体は、ポリクロナル抗体またはモノクロナル抗体である、請求項5に記載の膵臓癌診断用キット。
- 膵臓癌診断用バイオマーカーとして補体因子B及び糖鎖抗原19−9のタンパク質発現水準を測定することを含む膵臓癌診断方法において、
個体から血液試料を収集する第1段階と;
バイオマーカーに特異的に結合し、検出可能に標識された抗体に前記血液試料を接触して、前記抗体及び前記バイオマーカーの複合体を形成する第2段階と;
複合体を含まない標識された抗体から前記第2段階で形成された複合体を分離する第3段階と;
前記第2段階で形成された複合体を含む抗体の検出可能な標識から信号を定量し、前記血液試料内のバイオマーカーの量を測定する第4段階と;
前記第4段階で測定されたバイオマーカーの量と対照群バイオマーカーの量を比較する第5段階と;
前記第5段階で、試料においてバイオマーカーの量が対照群バイオマーカーの量より多い場合、膵臓癌として診断する第6段階と;を含む膵臓癌診断方法。 - 対照群バイオマーカーの量は、膵臓癌がない個体の血液試料内のバイオマーカーの量である、請求項8に記載の膵臓癌診断方法。
- 血液試料は、全血、血漿または血清試料である、請求項8に記載の膵臓癌診断方法。
- 第1段階と第2段階との間に、
免疫沈降によって血液試料内のバイオマーカー以外のタンパク質とバイオマーカーを分離する段階をさらに含む、請求項8に記載の膵臓癌診断方法。 - バイオマーカー以外のタンパク質とバイオマーカーを分離する段階は、
i)個体から分離した血液試料をバイオマーカーに特異的に結合する抗体と接触して、前記抗体と前記バイオマーカーとの間に複合体を形成する段階と;
ii)前記i)段階で形成された複合体を沈降させる段階と;
iii)バイオマーカー以外の他のタンパク質及び複合体を形成しない抗体を含む試料の上澄み液から沈降された複合体を分離する段階とを含む、請求項11に記載の膵臓癌診断方法。 - 請求項8に記載の方法によって膵臓癌として診断される場合、個体に膵臓癌治療剤を処理することを含む膵臓癌治療方法。
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