KR101594287B1 - 보체인자 b 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 췌장암 진단용 키트 - Google Patents

Abstract

본 출원은 보체인자 B 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 췌장암 진단용 키트 및 이를 이용하여 췌장암 진단을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다. 본 출원에 따르면 민감도 및 특이도가 향상된 췌장암 진단용 마커를 제공할 수 있다.

Description

보체인자 B 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 췌장암 진단용 키트{A KIT FOR PANCREATIC CANCER DIAGNOSIS COMPRISING COMPLEMEMT FACTOR B-SPECIFIC BINDING ANTIBODY}

본 출원은 보체인자 B 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 췌장암 진단용 키트 및 이를 이용하여 췌장암 진단을 위한 정보의 제공 방법에 관한 것이다.

췌장암은 세계적으로 9번째로 많이 발병되는 주요 암으로서 사망률은 4번째로 높은 악성 종양이다(Lowenfels, A.B., et al., Best Pract Res Clin Gastroenterol, 197-209, 2006). 대개의 국가에서 췌장암이 전체 악성 종양 발생에서 차지하는 비중은 2-3% 에 지나지 않지만 사망자수가 차지하는 비중은 전체 종양 관련 사망 가운데 무려 6%를 차지한다. 그 이유는 췌장암의 2년 생존율이 10% 내외에 불과할 정도로 낮고 5년 생존율도 5%를 넘지 못할 정도로 예후가 불량하기 때문이다(Lee, C.N., et al., Pancreas, 94-94, 2012).

췌장암은 상당히 진행되기 전까지는 증상이 나타나지 않는 경우가 대부분이기 때문에 일단 췌장암이 진단되면 이미 매우 진전된 후여서 수술이 불가능한 경우가 많다. 또한, 수술이 가능한 경우에도 수술한 환자의 80~90%가 재발하고 사망에 이르게 된다. 췌장암을 치료하기 위하여 수술요법 외에도 방사선 요법, 화학 요법 등이 시행되고 있지만 환자의 생존 기간에는 제한된 효과를 나타내는 경우가 대부분이다. 따라서 췌장암을 조기에 진단하는 것이 매우 중요하다.

췌장암을 진단하는 방법으로는 전산화 단층촬영(computed tomography; CT)이나 자기공명 영상장치(magnetic resonance imaging; MRI)를 사용하는 조직검사가 있으며 최근에는 췌장암을 진단할 수 있는 임상시료로서 혈장과 같은 체액에서의 단백질 분석을 동시에 측정하여 췌장암 존재 또는 발병 가능성 여부를 판단하고 있다. 현재 췌장암과 관련되어 가장 흔히 쓰이는 종양 표지자는 카보하이드레이트 안티젠 19-9 (carbohydrate antigen 19-9: CA 19-9) 이지만, CA 19-9는 췌장암 이외에도 담도를 포함한 소화기계의 암 환자의 혈장에서 모두 상승된다고 알려져 있고, 또한 악성 종양이 없는 담관염과 담도 폐색이 있는 경우에도 상승 된다고 알려져 있어 특이도가 낮다는 문제점이 있다. (출처: 국가건강정보포털). 또한 조기암에서는 CA 19-9 표지자의 혈중 농도가 정상으로 나타나는 경우가 많으므로 조기 진단에는 사용할 수 없다.

한편, 보체인자 B (Complement factor b; CFB)는 CFB라고도 불려지는 단백질로서, 보체 활성의 대체 경로(Alternative pathway) 중 중요한 성분 중 하나이다. 대체경로는 항원-항체 복합체 형성과 상관없이 병원체 세포 표면의 당 구조에 의해 활성화된다. 먼저 혈액 중에 소량 존재하는 C3b가 미생물 표면에 결합함으로써 활성화가 유도된다. C3b는 혈액중의 보체인자 B와 결합하면 보체인자 D에 의해 C3bBb와 Ba로 분해되고, C3bBb는 프로페리딘에 의해 안정화되어 대체경로의 C3 전환효소(con.vertase)가 되고 보다 많은 C3b를 만들어내는 증폭 과정(amplification phase)에 들어간다. 그 결과 보다 많은 C3 전환효소가 생성되며, 생성된 C3 전환효소와 C3b가 미생물 세포 표면에 결합하여 C3bBb3b 복합체를 형성한다. 형성된 C3bBb3b 복합체는 대체경로의 C5 전환효소 작용을 나타내어, C5를 C5a와 C5b로 분해하고 최종적으로 세균 표면에 MAC을 형성하게 되된다. 그 결과 세균이 죽고 항원이 제거된다. 보체인자 B는 이 대체 경로의 초기 단계인 c3b 단백질과 결합하여 c5 생성에 중요한 역할을 하는 분비 단백질(secreted protein)로 알려져 있으며 당단백질로서 글라이칸 위치 (glycan site)가 5개가 존재하고 있다.

보체인자 B는 난소암(Wu.J., et al., JPR, 4541-52, 2012), 상인두암(Seriramalu. R., et al., Electrophoresis, 2388-95, 2010), 유방암 (Doustjalali, S.R., et al., Electrophoresis, 2392-401, 2004) 등의 다양한 환자의 혈청에서 분비된다고 알려져 있지만 혈액에서 보체인자 B와 췌장암의 발병 상관관계에 대하여는 알려진 바 없다.

Wu.J., et al., JPR, 4541-52, 2012 Seriramalu. R., et al., Electrophoresis, 2388-95, 2010 Doustjalali, S.R., et al., Electrophoresis, 2392-401, 2004

따라서, 본 출원은 특이도 및 민감도가 우수한 새로운 췌장암 진단용 바이오 마커인 보체인자 B 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 췌장암 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공하고자 한다.

본 출원은 개체로부터 분리된 혈액 시료 내의 보체인자 B의 단백질 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는 췌장암 진단 방법 및 췌장암 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.

본 출원은 또한 보체인자 B(complement factor B; CFB)의 췌장암 진단 마커로서의 용도를 제공한다. 구체적으로 본 출원은 보체인자 B 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 췌장암 진단용 키트를 제공한다.

한 구체예에서, 보체인자 B 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

서열번호 1:

MGSNLSPQLCLMPFILGLLSGGVTTTPWSLARPQGSCSLEGVEIKGGSFRLLQEGQALEYVCPSGFYPYPVQTRTCRSTGSWSTLKTQDQKTVRKAECRAIHCPRPHDFENGEYWPRSPYYNVSDEISFHCYDGYTLRGSANRTCQVNGRWSGQTAICDNGAGYCSNPGIPIGTRKVGSQYRLEDSVTYHCSRGLTLRGSQRRTCQEGGSWSGTEPSCQDSFMYDTPQEVAEAFLSSLTETIEGVDAEDGHGPGEQQKRKIVLDPSGSMNIYLVLDGSDSIGASNFTGAKKCLVNLIEKVASYGVKPRYGLVTYATYPKIWVKVSEADSSNADWVTKQLNEINYEDHKLKSGTNTKKALQAVYSMMSWPDDVPPEGWNRTRHVIILMTDGLHNMGGDPITVIDEIRDLLYIGKDRKNPREDYLDVYVFGVGPLVNQVNINALASKKDNEQHVFKVKDMENLEDVFYQMIDESQSLSLCGMVWEHRKGTDYHKQPWQAKISVIRPSKGHESCMGAVVSEYFVLTAAHCFTVDDKEHSIKVSVGGEKRDLEIEVVLFHPNYNINGKKEAGIPEFYDYDVALIKLKNKLKYGQTIRPICLPCTEGTTRALRLPPTTTCQQQKEELLPAQDIKALFVSEEEKKLTRKEVYIKNGDKKGSCERDAQYAPGYDKVKDISEVVTPRFLCTGGVSPYADPNTCRGDSGGPLIVHKRSRFIQVGVISWGVVDVCKNQKRQKQVPAHARDFHINLFQVLPWLKEKLQDEDLGFL

한 구체예에서 개체는 췌장암이 의심되는 환자일 수 있다.

한 구체예에 있어서, 개체로부터 분리된 혈액 시료 내의 보체인자 B의 단백질 발현 수준을 정상 대조군 내의 보체인자 B의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 본 명세서에서, 정상 대조군은 췌장암 기타 질병이 없는 건강한 개체로부터 분리된 혈액 시료를 의미한다. 췌장암 두 시료를 비교하여 췌장암 의심 환자의 시료의 보체인자 B의 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료의 보체인자 B의 단백질 발현 수준보다 높은 경우 상기 후보 환자를 췌장암 환자로 분류할 수 있다. 예를 들어, 췌장암 후보 환자의 시료의 보체인자 B 단백질 수준이 정상 대조군 시료의 보체인자 B 단백질 수준보다 2배 이상 높은 경우 상기 후보 환자를 췌장암 환자로 분류할 수 있다.

한 구체예에서, 혈액 시료는 전혈, 혈장 또는 혈청 시료일 수 있다.

본 출원에서 용어 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 출원의 목적에 비추어, 진단은 췌장암의 생성 및 재발 여부를 확인하는 것이다.

본 출원에서 용어 "진단용 마커" 또는 "진단 마커"는 암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 암을 가진 세포에서 증가 또는 감소하는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 출원의 목적에 비추어, 췌장암 진단 마커는 정상 췌장 조직의 세포에 비하여, 췌장암 세포에서 특이적으로 높은 수준의 발현을 보이는 CA 19-9 및/또는 보체인자 B의 유전자 및 이에 의해 코딩되는 단백질이다.

본 출원에서 용어 "단백질 발현 수준 측정"이란 암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 암 마커 유전자에서 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블럿(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 출원에서 "특이적으로 결합하는"이란 결합에 의해 타겟 물질의 존재 여부를 검출할 수 있을 정도로, 다른 물질에 비하여 타겟 물질에 대한 결합력이 뛰어남을 의미한다.

본 출원에서 "항체"는 항원 또는 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자들, 또는 이것의 단편으로부터 유래되거나 이를 본떠서 만든 실질적으로 이에 의해 암호화된 펩타이드 또는 폴리펩타이드를 나타낸다. 본 출원에서 항체는 전체 항체 및 항체 단편을 포함하며 이에 제한되지 않는 다양한 형태의 항체 구조를 포함한다. 항체 단편은 전체 길이의 항체의 일부분, 항체의 가변 도메인, 또는 적어도 항체의 항원 결합 부위를 포함한다. 항체 단편의 예는 다이아바디(diabody), 단일-쇄 항체 분자 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함한다.

한 구체예에서, 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체일 수 있다. 보체인자 B 단백질에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 보체인자 B 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

본 출원에서 용어, "민감도(sensitivity)"란 해당 질환에 걸렸을 때 그 진단 검사 결과가 양성으로 나타나게 될 확률을 나타내며, "특이도(specificity)"란 어떤 질환에 걸려 있지 않을 경우 검사 결과가 음성이 될 가능성의 정도를 나타낸다.

췌장암 진단용 마커의 후보물질로 보체인자 B 단백질을 선정하고 정상인 및 췌장암 환자의 혈장에서 보체인자 B 단백질의 존재를 확인하고 변화를 관찰하였다. 그 결과, 보체인자 B의 단백질 발현 수준이 췌장암 환자의 혈장에서 정상 대조군에 비해 매우 높다는 것을 확인할 수 있었다(실시예 1 및 실시예 2). 또한, 기존에 췌장암 진단용 마커로 알려진 CA 19-9와 비교하였을 때, CFB의 췌장암 진단용 마커로서의 효용성을 검증하고자, ELISA 및 ROC(Receiver Operating Characteristic) 곡선 분석을 수행하였고, 이들의 최적 컷-오프 값에 기초하여 CFB 및 CA 19-9 각각의 민감도 및 특이도를 분석하였다(실시예 3 내지 6). 그 결과, CA 19-9는 췌장암을 비롯하여 간암, 담관암 및 위암에서도 발현이 증가하여, 특이도가 떨어짐을 알 수 있었다. 즉, 이는 CA 19-9 단독으로는 췌장암 진단 마커로 사용하기에 부적합함을 의미한다. 그러나, CFB는 췌장암에서만 특이적으로 발현이 증가하였고, 민감도 및 특이도가 우수하여 췌장암 진단용 마커로 적합함을 의미한다.

한편, CA 19-9 단독으로는 췌장암 진단 마커로서 특이도가 떨어지는 문제가 있으나, CA 19-9를 CFB와 함께 사용하였을 때는, 민감도 및 특이도가 가장 우수함을 알 수 있었다. 이는 CA 19-9 단독의 경우 췌장암 진단을 위한 마커로 사용하기에 적합하지 않으나, CFB와 함께 사용한 경우, 더욱 정확하게 췌장암을 진단할 수 있음을 의미한다.

따라서, 한 구체예에서, 상기 키트는 카보하이드레이트 안티젠 19-9에 특이적으로 결합하는 항체를 추가로 포함할 수 있다.

본 출원은 또한 개체로부터 분리된 혈액 시료 내의 보체인자 B 및 카보하이드레이트 안티젠 19-9의 단백질 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는 췌장암 진단 방법 및 췌장암 진단을 위한 정보의 제공 방법을 제공한다.

한 구체예에서, 개체는 췌장암 의심 환자군일 수 있다.

한 구체예에 있어서, 췌장암 의심 환자로부터 분리된 혈액 시료 내의 보체인자 B 및 CA 19-9의 단백질 발현 수준을 정상 대조군 내의 보체인자 B 및 CA 19-9의 단백질 발현 수준과 비교하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 두 시료를 비교하여 췌장암 의심 환자의 시료의 보체인자 B 및 CA 19-9의 단백질 발현 수준이 정상 대조군 시료의 보체인자 B 및 CA 19-9의 단백질 발현 수준보다 모두 높은 경우 상기 후보 환자를 췌장암 환자로 분류할 수 있다. 예를 들어, 췌장암 의심 환자의 시료의 보체인자 B 단백질 수준이 정상 대조군 시료의 보체인자 B 단백질 수준보다 2배 이상 높고, 췌장암 의심 환자의 시료의 CA 19-9의 농도가 37U/ml 이상인 경우 상기 췌장암 의심 환자를 췌장암 환자로 분류할 수 있다.

한 구체예에서, 혈액 시료는 전혈, 혈장 또는 혈청 시료일 수 있다.

본 출원에 따르면 민감도 및 특이도가 향상된 췌장암 진단용 마커를 제공할 수 있다.

도 1a는 정상인 혈장에 대한 2차원 전기영동 이미지를, 도 1b는 췌장암 환자의 혈장에 대한 2차원 전기영동 이미지를 보여준다. 화살표가 가리키는 스팟은 보체인자 B 단백질을 의미한다.
도 3a는 정상인과 췌장암 환자 혈장의 보체인자 B의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 보여준다 (N: 정상인, C: 췌장암 환자).
도 3b는 도 3a의 웨스턴 블롯 밴드의 강도를 나타낸 그래프이다.
도 4a는 정상 세포주(HPDE)와 췌장암 세포주(HPAC1, BXPC3, PANC1)에서 보체인자 B의 단백질 발현 수준을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과를 보여준다.
도 4b는 정상 세포주(HPDE)와 췌장암 세포주(HPAC1, BXPC3, PANC1)에서 보체인자 B의 단백질 발현 수준을 RT-PCR로 분석한 결과를 보여준다.
도 4c는 도 1b의 밴드 강도를 나타낸 그래프이다.
도 5a는 웨스턴 블롯에 의한 보체인자 B(CFB)의 단백질 발현 수준을 분석한 결과이다. HD는 정상, CP는 췌장염, PC는 췌장암을 나타낸다.
도 5b는 도 5a의 웨스턴 블롯 밴드의 강도를 나타낸 그래프이다. HD는 정상, CP는 췌장염, PC는 췌장암을 나타낸다.
도 6은 다양한 암에 있어서, CFB 및 CA 19-9의 발현 수준을 ELISA에 의하여 분석한 결과를 보여준다 (a: CFB, b: CA 19-9). HD는 정상, CP는 췌장염, PC는 췌장암, HCC는 간암, CC는 담관암 및 GC는 위암을 나타낸다.
도 7은 CA 19-9, CFB 및 CFB + CA 19-9의 ROC 곡선을 보여준다.

이하에서, 본 출원을 실시예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 출원을 예시하는 것일 뿐 본 출원의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 1] 보체인자 B( CFB )의 단백질 발현 수준 분석

[ 실시예 1-1] 전기영동 및 질량분석에 의한 혈장에서의 CFB 단백질 검출

정상인 및 췌장암 환자의 혈장에서 CFB의 존재 및 양을 검출하고자, 전기영동 및 질량분석을 수행하였다.

혈장의 수득은 세브란스 병원 유전자 은행과 소화기 내과로부터 공급받았고, 임상시험위원회(IRB) 규정에 따랐다. 혈장시료는 200μl씩 분주하여 -70 °C에서 실험전 까지 보관하여 사용하였다. 2차원 전기영동을 위하여, 10명의 정상인 혈장 및 10명의 췌장암 환자 혈장의 시료에 대하여 각 분석시료와 그에 해당하는 표준시료 50 μg은 형광염료인 400 pmol Cy3, Cy5, Cy2 (GE Healthcare)로 암흑 조건에서 30분간 표지시켰고, 1 μL 10 mM 라이신(lysine)으로 반응을 정지시켰다. 형광 염료로 각각 표지된 3개의 시료는 서로 혼합시켜 최종 450 μL가 되도록 시료완충용액[6 M 우레아, 2 M 티오우레아, 4% 챕스, 60 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol; DTT), 30 mM 트리스, pH 8.5]을 첨가하였고, 2% IPG 4-7NL 완충용액과 함께 상온에서 16시간 동안 재수화(rehydration)시켰다. 등전집속(isoelectric focusing; IEF)은 이모빌린 드라이스트립(Immobiline DryStrip) pH 4-7NL(GE Healthcare)을 사용하여 MultiPhor II 전기영동(electrophoresis) 시스템(GE Healthcare)에서 최적요건인 95,000 V까지 올려 실시 하였고, 트리부틸포스핀(Tributylphosphine) 완충용액[6 M 우레아, 2% 황산염(Sodium dodecyl sulfate, SDS), 30 mM 트리스, 20% 글리세롤(glycerol), 2.5% 아크릴아미드 용액(acrylamide solution), 5 mM 트리부틸포스핀]으로 25분 동안 원-스텝 환원 및 알킬화하였다.

정상인 혈장에 대한 2차원 전기영동 결과를 도 1a에 도시하고, 췌장암 환자의 혈장에 대한 2차원 전기영동 결과를 도 1b에 도시하였다. 도면 내의 화살표는 CFB를 나타낸다. 그 결과, 췌장암 환자에 있어서, CFB의 발현이 증가함을 알 수 있었다.

또한, 정상인과 췌장암 환자의 혈장에서, CFB의 발현 차이를 알아 보기 위하여, 2차 수직전기영동을 수행하였다. 2차 수직전기영동은 Ettan Dalttwelve 전기영동시스템(GE Healthcare)을 사용하여 9%~16% 폴리아크릴아마이드겔을 사용하여 분리하였고, 전기영동이 끝난 후 Typhoon 9400(GE Healthcare) 스캐너를 이용하여 Cy2, Cy3, Cy5에 해당하는 파장으로 스캔하였다. 각 겔 이미지는 DeCyder 2-D 분석소프트웨어(GE Healthcare)를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 2차원 전기영동 결과와 마찬가지로, 췌장암 환자에 있어서, CFB의 발현이 증가함을 알 수 있었다 (도 2).

이미지 분석 후, CFB의 존재를 확인하기 위하여 도 1a 및 도 1b의 화살표가 가리키는 스팟에 대하여 질량 분석을 수행하였다. 단백질 스팟은 쿠마시블루(Coomassie blue) 염료로 염색된 겔로부터 피킹(picking)하였고, 탈색하여 트립신으로 절단(digestion)한 후, 절단된 펩티드들은 포로스(Poros) R2 및 올리고(Oligo) R3 레진(resin) 혼합물을 사용하여 탈염(desalting)시켰다. 단백질 동정은 Q-TOF (Agilent)으로 분석하였으며, Q-TOF-MS로 얻은 스펙트럼은 MASCOT 데이터베이스를 이용하여 동정하였다.

그 결과, 하기 표 1에 도시한 바와 같이, 도 1a 및 도 1b의 화살표가 가리키는 스팟이 CFB임을 확인할 수 있었다.

[표 1]

[ 실시예 1-2] 혈장 내에서의 CFB 단백질 발현 수준 분석

췌장암 환자 혈장에서의 CFB 단백질 발현 수준을 분석하기 위하여, 면역 블롯을 수행하였다. 10명에 대한 정상인 혈장과 10명의 췌장암 환자 혈장에서 동일한 단백질 양으로부터 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였다. 혈장 단백질 10μg을 10% SDS-PAGE 분석 후 웨스턴 블롯을 위해 겔 전체를 니트로셀루로오스(nitrocellulose; NC) 막으로 전환(transfer)한 후 5% 탈지유(skimmed milk)가 포함된 TBS-T 완충용액 [20 mM 트리스, 137 mM 염화나트륨, 0.1% 트윈20(Tween-20), pH 7.6]으로 1시간동안 블로킹하였다. 항-보체인자 B 항체(CFB, Abcam)를 5% 탈지유가 포함된 TBS-T 완충용액에 1:1000배씩 희석하여 1차 처리하고 항-마우스(mouse) IgG-HRP (Santa Cruz)를 1:10000배를 2차 처리하였다. 최종 NC막은 ECL Plus 웨스턴 블롯 시약(GE Healthcare)으로 1분간 반응시켰고, Typhoon 9400 스캐너로 스캔하여 분석하였다.

그 결과, 도 3a에 도시한 바와 같이, 췌장암 환자군에서 CFB의 발현이 증가함을 알 수 있었다.

도 3a의 결과를, 밴드 강도(Band intensity)를 통해 fold ratio를 분석한 결과, 정상군에 비해 췌장암 환자의 혈장에서 CFB가 높게 발현하는 것을 확인하였다(도 3b).

[ 실시예 1-3] 췌장암 세포 내에서의 CFB 발현 수준 분석

췌장암 세포주에서의 CFB 발현 수준을 확인하기 위해 웨스턴 블롯과 RT-PCR을 수행하였다. 정상 세포주로는 HPDE(human pancreatic duct epithelial cell)를 사용하였고, 췌장암 세포주로는 HPAC1, BXPC3(human pancreas adenocarcinoma epithelial cell), PANC1(human pancreas epithelioid carcinoma)을 사용하였다. 각각의 세포 용해물(cell lysate) 1mg을 사용하여 항-보체 인자 B 항체 2ug, 단백질 G 아가로즈 10ul를 함께 1ml 튜브에서 2시간 동안 면역 침강 시킨 후 웨스턴 블롯을 통해 정상 세포와 췌장암 세포 내에서의 CFB 발현 수준을 확인 하였다. 그 결과, CFB가 정상 세포에서는 검출되지 않고 췌장암 세포에서만 검출되는 것을 확인하였다(도4a).

다음은 RT-PCR을 이용하여 CFB의 mRNA 발현 수준을 확인하였다. 총 RNA는 easy-BLUE(iNtRON, Gyeonggi, Korea) 를 사용하여 추출하였고, cDNA은 옴니스크립트 RT 키트(omniscript RT kit; Qiagen, Hilden, Germany)를 사용하여 합성하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같다:

CFB 프라이머 (서열번호 2): 5'-CAACAGAAGCGGAAGATCGTC-3' (포워드)

CFB 프라이머 (서열번호 3):5'-TATCTCCAGGTCCCGCTTCTC-3' (리버스)

GAPDH 프라이머 (서열번호 4): 5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3' (포워드)

GAPDH 프라이머 (서열번호 5): 5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3' (리버스)

PCR 조건은 35 사이클, 변성(denaturation) 94℃ 1분, 어닐링 59℃ 1분, 프라이머 신장(primer extension) 72℃ 1분으로 하였다. 그 결과 웨스턴 블롯 데이터와 마찬가지로 정상 세포에서는 CFB가 거의 검출되지 않고 췌장암 세포에서만 CFB가 검출이 되는 것을 확인하였다(도 4b). 도 1b의 결과를, 밴드 강도(Band intensity)를 통해 fold ratio를 분석해 본 결과, 정상 세포주에 비해 췌장암 세포주에서 CFB가 높게 발현하는 것을 확인하였다(도 4c).

[ 실시예 2] 다수의 샘플을 이용한 보체인자 B( CFB )의 단백질 발현 수준 분석

CFB가 바이오마커 후보로서의 확실한 가능성을 알아보기 위해 독립적이고 대규모 환자 집단(large patient cohorts)를 사용하여 추가 확인 실험을 수행하였다.

정상인 44명, 췌장염 환자 12명, 췌장암 환자 40명의 혈장을 사용하였고, 표준으로 정상인 혈장은 풀링(pooling)한 샘플을 사용하여 실시예 1-3과 동일한 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다. 그 결과 HD와 CP에 비해 PC에서 CFB가 높게 발현하는 것을 확인 할 수 있었고(도 5a), 이 웨스턴 블롯 밴드들의 강도(intensity)를 점으로 나타낸 결과 p < 0.05로 HD와 CP에 비해 PC에서 CFB가 높게 발현하는 것으로 나타났다(도 5b). 따라서 대규모 환자 집단을 사용하고 독립적인 실험을 했을 때에도 CFB가 유의적인 값으로 HD와 CP에 비해 PC에서 2 배 정도 높게 발현하고 있는 것을 확인 할 수 있었다.

[ 실시예 3] ELISA에 의한 다양한 암 환자에서 CFB 및 CA 19-9의 단백질 발현 수준 분석

현재 췌장암 바이오 마커로 알려져 있는 CA 19-9와 CFB의 발현 수준을 비교하기 위하여 HD, CP, PC, HCC, CC, GC의 혈장을 사용하여 ELISA 테스트를 수행하였다. CFB와 CA 19-9 ELISA KIT는 각각 USCN과 Panomics 제품을 사용하였고 각 제품마다 각각의 프로토콜에 따라 실험을 수행하였다.

먼저 CFB ELISA의 경우 각각의 혈장들을 1:10,000로 희석한 후 CFB에 대한 항체가 깔려 있는 웰에 각각 100ul씩 넣어주었다. 2시간 상온에서 인큐베이션하였다. 그 후, 웰에서 혈장을 제거하고 100ul의 검출 시약 A 워킹 용액(working solution)을 넣어준 후 상온에서 1시간 동안 인큐베이션 하였다. 1시간 후, 용액을 웰에서 제거 한 후, 350ul의 세척 용액을 넣어 3번 반복해서 세척하였다. 그 후 각각의 웰에 100ul의 검출 시약 B 워킹 용액을 넣고 상온에서 30분 동안 반응시켰다. 세척 용액으로 5회 세척하였다. 그 후 90ul의 기질 용액(substrate solution)을 각각의 웰에 넣어준 후 15분 동안 다크 조건에서 반응시켰고 그 이후 50ul의 정지 용액(stop solution)을 넣어 준 후 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450mm에서 정량하였다. 이들 그룹에서 CFB의 발현 수준은 34.0(범위: 26.1-41.3), 73.5(범위: 62.3-77.1), 92.0(범위: 75.2-121.6), 37.0(범위: 28.8-47.5), 41.5(범위: 29.1-52.1), 63.0(범위: 56.3-72.9) ng/ml로 나타났다(도 6a).

CA 19-9 ELISA의 경우 CA 19-9 항체가 깔려있는 플레이트에 각각의 혈장을 10ul씩 넣어주고 100ul CA 19-9 어세이 버퍼를 그 위에 넣어주었다. 그 후 30초 동안 잘 섞어 준 후 상온에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 웰에서 버퍼를 제거하고 워시 버퍼(wash buffer)를 사용하여 4번 반복 세척하였다. 그 후, 워킹 컨쥬게이트 시약(working conjugate reagent) 100ul를 각각의 웰에 넣어주고 30초 동안 잘 섞어 준 후 상온에서 90분 동안 인큐베이션하였다. 시약을 웰에서 제거하고 워시 버퍼를 사용하여 4번 반복 세척하였다. 그 후, TMB를 각각의 웰에 넣어주고 10초간 섞어 준 후 다크 조건에서 20분 동안 반응시켰다. 그 후, 100ul의 정지 용액(stop solution)을 넣어 준 후 30초 동안 섞어 주고 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450mm에서 정량하였다. 이들 그룹에서 CA 19-9의 수준은 각각 4.6(범위: 2.8-7.2), 10.2(범위: 6.0-21.4), 298.8(범위: 111.4-832.6), 50.5(범위: 18.1-159.5), 137.5(범위: 53.8-537.9), 10.0(범위: 9.4-16.7) U/ml로 나타났다(도 6b). CFB의 혈장 내 발현 수준은 CA 19-9와 마찬가지로 비-PC 군(HD, CP, HCC, CC, GC)보다 PC 군에서 특히 높게 발현되었다(p < 0.002). 또한, CFB의 경우 CA 19-9와 비교하여, PC와 비-PC 환자를 더 잘 구별해 내는 것으로 나타났다(p < 0.0001).

이는 CA 19-9 단독으로는 췌장암 진단 마커로 사용하기에 부적합한 반면에, 췌장암에서만 특이적으로 발현이 증가하는 CFB는 췌장암 진단용 마커로 적합함을 의미한다.

[ 실시예 4] 췌장암 진단에 있어서 , ROC(Receiver Operating Characteristic) 곡선에 의한 CFB 및 CA 19-9의 민감도 및 특이도 분석

CFB와 CA 19-9이 췌장암 환자와 아닌 사람(HD, CP, HCC, CC, GC)을 얼마나 잘 구별해 내는지를 확인하기 위해 Mann-Whitney rank sum test 프로그램을 이용하여 ROC 곡선 분석을 수행하였다. AUC 밸류를 통해 CFB와 CA 19-9를 비교하였다. 그 결과 CFB의 경우 0.958 (95% CI: 0.956-0.959)으로 CA 19-9의 0.833 (95% CI: 0.829-0.837) 보다 AUC 값이 더 높게 나타났다. 두 가지 (CFB + CA 19-9)를 조합하였을 때의 AUC는 0.986 (0.985-0.986)으로 CFB와 CA 19-9 (p < 0.01)을 단독으로 사용했을 때 보다 상당히 높은 AUC 값을 나타냈다 (도 7).

이는, CFB 단독 또는 CFB 및 CA 19-9의 조합에 의해 췌장암을 진단할 수 있음을 의미한다.

[ 실시예 5] CFB 및 CA 19-9의 최적 컷- 오프 값(cut-off value)에 기초한 췌장암 진단

각각의 그룹 별로(HD; 정상, CP; 췌장염, PC; 췌장암, HCC; 간암, CC; 담관암, GC; 위암) CA 19-9와 CFB의 진단 효율을 확인하였다. 그 결과, 하기 표 2에 도시한 바와 같이, CA 19-9와 CFB 모두 PC에서 비슷한 진단 효율을 보였다(CA 19-9: 80.5%, CFB: 73.2%). 하지만 CA 19-9의 경우 다른 암(HCC, CC, GC)에서도 높은 진단 효율(HCC: 61.3%, CC: 77.2%, GC: 17.1%)을 보인 반면, CFB는 다른 암들에서는 낮은 진단 효율을 보였다(HCC: 0%, CC:0%, GC: 8.6%). 이것은 다른 암과 비교했을 때 CFB가 CA 19-9보다 PC에 더욱 특이적임을 의미한다.

[표 2]

[ 실시예 6] CFB 및 CA 19-9의 민감도와 특이도 확인

CFB, CA 19-9 및 CFB + CA 19-9의 췌장암 진단 지표로서의 정확도를 평가하기 위하여, 최대 유덴 인덱스(maximum Youden index)에 의해 예측된 최적 컷-오프 값에 따른 CA 19-9, CFB 및 CFB + CA 19-9의 다른 질병과 비교한 췌장암 진단의 민감도 및 특이도(%)를 확인하였다. 그 결과, 하기 표 3에 나타낸 바와 같이, PC와 다른 군(HD, CP, HCC, CC, GC)을 비교하였을 때 CA 19-9의 민감도는 80.4%, 특이도 는 70.0%로 나타났고 CFB는 민감도 73.1%, 특이도 97.9%로 나타났다. 그리고 CFB와 CA 19-9를 조합하였을 때에는 민감도 90.1%, 특이도 97.2%로 나타났다. 이는, CA 19-9와 CFB를 단독으로 사용한 경우에 비하여, CA19-9와 CFB를 조합하였을 때에 더 좋은 진단 효율이 나타남을 의미한다.

[표 3]

<110> University-Industry Foundation, Yonsei University <120> COMPOSITION FOR PANCREATIC CANCER DIAGNOSIS COMPRISING COMPLEMEMT FACTOR B-SPECIFIC BINDING POLYPEPTIDE OR ANTIBODY <130> P16U16C0039 <160> 5 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 764 <212> PRT <213> human complement factor B <400> 1 Met Gly Ser Asn Leu Ser Pro Gln Leu Cys Leu Met Pro Phe Ile Leu 1 5 10 15 Gly Leu Leu Ser Gly Gly Val Thr Thr Thr Pro Trp Ser Leu Ala Arg 20 25 30 Pro Gln Gly Ser Cys Ser Leu Glu Gly Val Glu Ile Lys Gly Gly Ser 35 40 45 Phe Arg Leu Leu Gln Glu Gly Gln Ala Leu Glu Tyr Val Cys Pro Ser 50 55 60 Gly Phe Tyr Pro Tyr Pro Val Gln Thr Arg Thr Cys Arg Ser Thr Gly 65 70 75 80 Ser Trp Ser Thr Leu Lys Thr Gln Asp Gln Lys Thr Val Arg Lys Ala 85 90 95 Glu Cys Arg Ala Ile His Cys Pro Arg Pro His Asp Phe Glu Asn Gly 100 105 110 Glu Tyr Trp Pro Arg Ser Pro Tyr Tyr Asn Val Ser Asp Glu Ile Ser 115 120 125 Phe His Cys Tyr Asp Gly Tyr Thr Leu Arg Gly Ser Ala Asn Arg Thr 130 135 140 Cys Gln Val Asn Gly Arg Trp Ser Gly Gln Thr Ala Ile Cys Asp Asn 145 150 155 160 Gly Ala Gly Tyr Cys Ser Asn Pro Gly Ile Pro Ile Gly Thr Arg Lys 165 170 175 Val Gly Ser Gln Tyr Arg Leu Glu Asp Ser Val Thr Tyr His Cys Ser 180 185 190 Arg Gly Leu Thr Leu Arg Gly Ser Gln Arg Arg Thr Cys Gln Glu Gly 195 200 205 Gly Ser Trp Ser Gly Thr Glu Pro Ser Cys Gln Asp Ser Phe Met Tyr 210 215 220 Asp Thr Pro Gln Glu Val Ala Glu Ala Phe Leu Ser Ser Leu Thr Glu 225 230 235 240 Thr Ile Glu Gly Val Asp Ala Glu Asp Gly His Gly Pro Gly Glu Gln 245 250 255 Gln Lys Arg Lys Ile Val Leu Asp Pro Ser Gly Ser Met Asn Ile Tyr 260 265 270 Leu Val Leu Asp Gly Ser Asp Ser Ile Gly Ala Ser Asn Phe Thr Gly 275 280 285 Ala Lys Lys Cys Leu Val Asn Leu Ile Glu Lys Val Ala Ser Tyr Gly 290 295 300 Val Lys Pro Arg Tyr Gly Leu Val Thr Tyr Ala Thr Tyr Pro Lys Ile 305 310 315 320 Trp Val Lys Val Ser Glu Ala Asp Ser Ser Asn Ala Asp Trp Val Thr 325 330 335 Lys Gln Leu Asn Glu Ile Asn Tyr Glu Asp His Lys Leu Lys Ser Gly 340 345 350 Thr Asn Thr Lys Lys Ala Leu Gln Ala Val Tyr Ser Met Met Ser Trp 355 360 365 Pro Asp Asp Val Pro Pro Glu Gly Trp Asn Arg Thr Arg His Val Ile 370 375 380 Ile Leu Met Thr Asp Gly Leu His Asn Met Gly Gly Asp Pro Ile Thr 385 390 395 400 Val Ile Asp Glu Ile Arg Asp Leu Leu Tyr Ile Gly Lys Asp Arg Lys 405 410 415 Asn Pro Arg Glu Asp Tyr Leu Asp Val Tyr Val Phe Gly Val Gly Pro 420 425 430 Leu Val Asn Gln Val Asn Ile Asn Ala Leu Ala Ser Lys Lys Asp Asn 435 440 445 Glu Gln His Val Phe Lys Val Lys Asp Met Glu Asn Leu Glu Asp Val 450 455 460 Phe Tyr Gln Met Ile Asp Glu Ser Gln Ser Leu Ser Leu Cys Gly Met 465 470 475 480 Val Trp Glu His Arg Lys Gly Thr Asp Tyr His Lys Gln Pro Trp Gln 485 490 495 Ala Lys Ile Ser Val Ile Arg Pro Ser Lys Gly His Glu Ser Cys Met 500 505 510 Gly Ala Val Val Ser Glu Tyr Phe Val Leu Thr Ala Ala His Cys Phe 515 520 525 Thr Val Asp Asp Lys Glu His Ser Ile Lys Val Ser Val Gly Gly Glu 530 535 540 Lys Arg Asp Leu Glu Ile Glu Val Val Leu Phe His Pro Asn Tyr Asn 545 550 555 560 Ile Asn Gly Lys Lys Glu Ala Gly Ile Pro Glu Phe Tyr Asp Tyr Asp 565 570 575 Val Ala Leu Ile Lys Leu Lys Asn Lys Leu Lys Tyr Gly Gln Thr Ile 580 585 590 Arg Pro Ile Cys Leu Pro Cys Thr Glu Gly Thr Thr Arg Ala Leu Arg 595 600 605 Leu Pro Pro Thr Thr Thr Cys Gln Gln Gln Lys Glu Glu Leu Leu Pro 610 615 620 Ala Gln Asp Ile Lys Ala Leu Phe Val Ser Glu Glu Glu Lys Lys Leu 625 630 635 640 Thr Arg Lys Glu Val Tyr Ile Lys Asn Gly Asp Lys Lys Gly Ser Cys 645 650 655 Glu Arg Asp Ala Gln Tyr Ala Pro Gly Tyr Asp Lys Val Lys Asp Ile 660 665 670 Ser Glu Val Val Thr Pro Arg Phe Leu Cys Thr Gly Gly Val Ser Pro 675 680 685 Tyr Ala Asp Pro Asn Thr Cys Arg Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Ile 690 695 700 Val His Lys Arg Ser Arg Phe Ile Gln Val Gly Val Ile Ser Trp Gly 705 710 715 720 Val Val Asp Val Cys Lys Asn Gln Lys Arg Gln Lys Gln Val Pro Ala 725 730 735 His Ala Arg Asp Phe His Ile Asn Leu Phe Gln Val Leu Pro Trp Leu 740 745 750 Lys Glu Lys Leu Gln Asp Glu Asp Leu Gly Phe Leu 755 760 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFB forward primer <400> 2 caacagaagc ggaagatcgt c 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CFB reverse primer <400> 3 tatctccagg tcccgcttct c 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 4 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 5 tccaccaccc tgttgctgta 20

Claims (7)

1. 개체로부터 분리된 혈액 시료 내의 보체인자 B의 단백질 발현 수준 및 카보하이드레이트 안티젠 19-9의 단백질 발현 수준을 측정하는 것을 포함하는 췌장암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
2. 제1항에 있어서,
   개체로부터 분리된 혈액 시료 내의 보체인자 B의 단백질 발현 수준 및 카보하이드레이트 안티젠 19-9의 단백질 발현 수준을 정상 대조군 내의 보체인자 B의 단백질 발현 수준 및 카보하이드레이트 안티젠 19-9의 단백질 발현 수준과 각각 비교하는 단계를 더 포함하는 췌장암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
3. 제1항에 있어서,
   상기 혈액 시료는 전혈, 혈장 또는 혈청 시료인 췌장암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
4. 제1항에 있어서,
   상기 보체인자 B 또는 카보하이드레이트 안티젠 19-9의 단백질 발현 수준은 2차원 형광전기영동, 웨스턴블롯팅, ELISA, 방사선 면역분석, 방사면역확산법, 면역전기영동 또는 질량분석을 이용하여 측정하는 것인 췌장암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
5. 보체인자 B 단백질에 특이적으로 결합하는 항체 및 카보하이드레이트 안티젠 19-9에 특이적으로 결합하는 항체를 포함하는 췌장암 진단용 키트.
6. 제5항에 있어서, 보체인자 B 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 췌장암 진단용 키트.
7. 제5항에 있어서, 항체는 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체인 췌장암 진단용 키트.

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