KR101777259B1 - En2 단백질을 특이적으로 인식하는 단클론 항체 또는 이를 함유하는 전립선암 진단용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 EN2 단백질을 특이적으로 인식하는 EN2 단클론 항체에 관한 것이다. 상기 EN2 단클론 항체는 체내에 존재하는 EN2 단백질의 유무 확인 및 정량이 가능하며, 기존의 EN2 단백질 항체보다 검출 민감성이 현저하게 우수하여 전립선암의 진단제 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명의 항체를 이용하여 전립선 암을 진단할 때 기존 전립선암 진단 방법인 혈액에서의 PSA(prostate-specific antigen) 검출 결과보다 높은 진단 유효성이 있는 것이 확인된다.

Description

EN2 단백질을 특이적으로 인식하는 단클론 항체 또는 이를 함유하는 전립선암 진단용 조성물 {Specific monoclonal antibody to EN2 protein or composition comprising the same for diagnosis of prostate cancer}

본 발명은 EN2 단백질을 특이적으로 인식하는 단클론 항체 또는 이를 함유하는 전립선암 진단용 조성물에 관한 것이다.

항체라 함은 일반적으로 외부 물질(일정 이상의 크기와 조건을 갖춘 물질)(항원)을 생물체에 주입하고 생물체에서는 체액성 면역 반응을 통하여 외부 물질을 특이적으로 인식할 수 있는 부분(epitope)을 가진 항체를 형성하고 이를 혈액에서 채취하여 혈청에서 분리해낸다. 이렇게 형성된 항체는 항원을 인식하는 부분을 여러 개 가지고 있는 다클론 항체이다.

체액성 면역반응에서 항원은 여러 가지의 항원제시세포(antigen presenting cell; APC)에 의하여 작은 조각 에피토프(epitope)으로 B cell에 보여지게 (presenting)되고 B cell을 활성시킨다. B cell은 이러한 활성과정에서 항체를 만드는 전체 유전자 가운데 항원에 반응할 수 있는 항체를 만드는 유전자만 재배열 되고 나머지 불필요한 유전자는 제거되어 한가지의 항체만을 다량으로 생성하여 세포외로 분비하는 플라즈마 세포(plasma cell)로 분화한다. 항원은 일반적으로 여러개의 에피토프를 가지므로 분화된 플라즈마 세포도 여러 종류이며, 따라서 생성되는 항체도 여러가지이다. 이렇게 여러 종류의 플라즈마 세포(즉, 항체를 만드는 유전자 자체가 각각 다른)에서 분비된 여러 종류의 항체 전체 집합을 '다클론 항체'라 하며, 한 종류의 플라즈마 세포에서 만들어진 한 종류의 항체만을 '단일클론 항체'라 한다.

항체를 이용한 진단 시장은 1980년 이후로 급속히 증가되고 있으며 질병이나 증상에 따라 특이적으로 발현되는 단백질을 극소량으로도 검출할 수 있어 민감도가 우수해 높은 효율의 진단 키트 개발 및 진단 기법에 활용되고 있다. 이를 위해서는 질환 및 증상에 의해 발현되는 단백질(항원)에 특이성과 민감도를 모두 갖춘 항체 개발이 필수적이다. 특이성과 민감도를 갖춘 항체를 생성하기 위해서는 몇 가지 고려하여 항체의 효율을 극대화 할 수 있다. 첫 번째, 생성하려는 항원의 1차 서열을 비교하여 항원의 동물종과 면역동물이 이질성이 강한 것을 선택하는 것이 면역 반응을 극대화할 수 있다. 예를 들어 사람 단백질의 서열을 활용할 경우 그 서열과 이질성이 높은 동물을 선정하여 면역 반응을 유도하는 것이 높은 역가의 항체를 얻을 수 있다. 두 번째, 항원의 서열에서 번역 후 변형에 따른 수식으로의 특성과 입체 구조에 따른 항원으로서의 질이 달라질 수 있으므로 고려해서 선택한다. 특히 단백질 전체를 항원으로 사용하지 않고 일부 펩타이드 형태로 항원으로 사용할 때는 특히 고려하여 선택하여야 한다. 세 번째, 목적에 따른 항체의 특성에 맞추어 제작한다. 다클론 항체의 경우 제작이 간편하고 여러 epitope로 인한 항원 검출이 용이하고 항원에 따른 면역 동물의 선택의 폭이 넓다는 장점이 있다. 하지만 항체 특이성이 떨어지고 같은 역가의 대량 생산에는 용이하지 않다. 단일클론 항체의 경우는 배양 상층액에서의 항체를 얻을 수 있어 같은 역가의 특이성을 가지는 항체를 대량으로 생산할 수 있는 장점을 가지고 있지만 또 제작기간이 오래 걸리고 면역 동물이 제한적이며 면역염색 등의 실험에 적합하지 않다는 단점을 가지고 있다. 따라서, 일반적으로 다클론 항체 생산을 통한 항원의 특이성을 확인한 후에 동일한 역가를 갖는 항체의 대량생산이 필요한 경우 단일클론 항체를 제작하게 된다.

전립선(prostate)은 방광 바로 밑, 직장 앞쪽에 있는 밤톨만 한 크기의 남성 생식기관으로, 정액의 일부를 만들어내고 저장하는 역할을 한다. 위로는 방광경부, 즉 방광에서 요도로 이행하는 부위와 인접해 앞쪽의 치골전립선인대에 고정되어 있고, 아래로는 비뇨생식격막에 의해 고정되어 있다. 전립선에서 발생하는 암의 대부분은 전립선 세포에서 발생하는 선암(샘세포의 암)이다. 종양 조직의 분화 정도와 세포의 특성 등에 따라 유형을 구분할 수 있다. 전립선암은 전세계적으로 가장 흔한 비뇨기계 종양 중 하나로서, 미국에서는 2016년에만 약 180,890명이 전립선암으로 새로이 진단되어 미국 내 전체 신규 종양진단의 10.7%를 차지하며, 유방암과 폐암에 이어 세 번째로 빈번하게 발병이 되는 종양이다. 2009년부터 2013년까지의 통계에 비추어 전세계 100,000명의 남성 중 129.4명이 전립선암을 가지고 있으며 전립선암의 사망률은 2016년 통계로 26,120명에 이른다. 또한 전립선암은 50세 이전에는 흔하지 않은 질환이나 50세를 넘게 되면 급격히 증가하는 양상을 보인다. 최근 평균 수명의 연장으로 국내에서도 노인 남성의 수가 급증하고 전립선암을 조기에 진단하여 전이가 발생하는 등으로 악화되지 않도록 지속적인 관리를 필요로 한다. 특히 사람 전립선암은 뼈로 전이되는 성향을 가지는 것으로 보이며, 안드로겐 의존성 상태로부터 안드로겐 내성 상태로 불가피하게 진행되어 환자의 사망률을 증가시킨다고 알려져 있다. 더욱이, 전립선암 치료를 받은 남성의 약 25%는 병이 재발하여 추가적인 치료를 필요로 하는 질병으로서, 현재 미국에서 남자의 암 사망 원인 중 제2의 원인을 차지하고 있는바, 이에 대한 조기진단 및 치료가 필요한 실정이다.

현재 사용되고 있는 전립선암 진단법 중 직접적인 방법으로는, 전립선을 직접 조영하거나 조직검사를 통한 진단법이 있다. 직접 조영하거나 조직검사를 통해 진단하는 경우에는, 초기에 전립선암의 발병 여부를 진단함에 어려움이 있는 바, 체외에서 진단할 수 있는 방법의 개발이 시급하다. 간접적인 방법으로는 PSA(prostate-specific antigen) 검사를 이용하여 체외에서 검진할 수 있는 진단법이 있다. 그러나 진단에 이용되는 PSA는 악성 전립선 상피 조직뿐만 아니라 정상 및 양성에서도 생성되어 전립선암 검출에 있어서의 가성 양성율을 높이는 결과를 가져왔다. 또한, 혈청 PSA 수준이 아주 높은 경우에는 효과적인 전립선암의 표준적 진단방법으로 이용할 수 있는 반면, PSA 혈청 수준이 2-10 ng/㎖의 수준인 경우와 같이 약하게 올라가는 경우에는 확실한 전립선암 진단을 할 수 없다. 이와 같이 약하게 올라가는 경우의 혈청 PSA는 BPH(benign prostatic hyperplasia), 전립선염 또는 기타 신체적 외상과 같은 비-종양 질병으로부터 유래할 수 있으므로 전립선암 진단을 위한 PSA 분석은 검출 특이성과 관련하여 문제점이 존재한다. 따라서, 신규 바이오마커를 이용한 전립선암의 진단이 주요한 과제의 대상이 되고 있고, 이에 대한 연구가 이루어지고 있으나(한국공개특허 제10-2009-0111307호) 아직 미비한 실정이다. 근래에 EN2(Engrailed-2)를 바이오마커로 하여 전립선암을 진단하는 방법들이 제시된 바 있는데, EN2는 종래 전립선암 진단에 사용되는 PSA(prostate specific antigen) 검사의 검출 특이성 문제를 해결할 수 있는 바이오마커(bio-marker)로 잘 알려져 있다. EN2 단백질은 세포 내에서 전사인자로서 작용하며, 전립선암 세포 내에서만 과다 발현되어 DNA 전사 조절 장애를 초래한다. 더욱이 전립선암 세포 내에서 EN2 발현이 증가할 경우, 소변으로 배설되는 EN2 단백질 양 역시 증가하는 바 체외분석에 적합하다. 이에 미국등록특허 제8460882호, 일본공개특허 제2012-532621호 또는 미국등록특허 제8722643호 등에서 EN2 단백질을 인식하는 진단용 조성물에 관한 기술이 개시되어 있고, 한국공개특허 제10-2016-0077788호에는 EN2에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머에 관한 기술이 개시되어 있다.

이에, 본 발명자들은 전립선암 진단 관련 조성물에 관해 연구하던 중, EN2 단백질을 더욱 효과적으로 진단할 수 있는 단클론 항체를 제작하였으며 이 항체를 이용하여 전립선암 진단 조성물을 제조함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.

미국등록특허 제8460882호 (발명의 명칭 : Cancer biomarkers, 출원인 : The University of Surrey, 등록일 : 2013.06.11) 미국등록특허 제8722643호 (발명의 명칭 : Targeting EN2, PAX2, and/or DEFB1 for treatment of prostate conditions, 출원인 : Phigenix, Inc., 등록일 : 2014.05.13) 미국등록특허 제7358045호 (발명의 명칭 : Methods for determining a predisposition to develop breast adenocarcinoma or breast inflammatory carcinoma, 출원인 : INST RECH S CLINIQUES DE MONTR, 등록일 : 2008.04.15) 일본공개특허 제2012-532621호 (발명의 명칭 : 치료 펩티드, 폴리펩티드 및 핵산 배열, 출원인 : The University of Surrey, 공개일 : 2012.12.20) 한국공개특허 제10-2009-0111307호 (발명의 명칭 : EN2에 특이적으로 결합하는 DNA 압타머 및 이의 용도, 출원인 : 포항공과대학교 산학협력단, 공개일 : 2016.07.04) 한국공개특허 제10-2016-0077788호 (발명의 명칭 : 전립선 특이적 전사물 및 전립선암의 치료 및 진단에 사용되는 이의 용도, 출원인 : 엑손히트 써라퓨틱스 에스에이, 공개일 : 2009.10.26.)

본 발명의 목적은 EN2 단백질을 특이적으로 인식하는 단클론 항체 또는 이를 함유하는 전립선암 진단용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 서열번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역; 및, 서열번호 5, 6 또는 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역;을 포함하는 것을 특징으로 하는 단클론 항체에 관한 것이다.

또한 상기 항체는 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 에피토프(epitope)를 인식하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 단클론 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 EN2(Engrailed-2, Accession No. NP_001418.2) 단백질 또는 이의 재조합 단백질을 인식하는 것을 특징으로 한다.

상기 항체는 면역글로불린 G 타입인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 또한 상기 단클론 항체를 포함하는 EN2(Engrailed-2) 단백질의 유무를 진단하는 진단용 조성물 또는 전립선암 진단제를 제공할 수 있다.

본 발명은 또한 수탁번호 KCLRF-BP-00404인 하이브리도마 세포주에 관한 것이며, 상기 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 단클론 항체를 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명에서 이용하는 EN2 단백질, 이의 재조합 단백질, EN2 단백질의 단편, 이를 인식하는 항체 내에 포함되는 아미노산 서열정보는 하기와 같다.

하기의 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질은 포유류, 특히, 인간의 체내에서 발현되는 EN2 단백질에 관한 것이다.

서열번호 1 : NCBI Reference Sequence Accession No. NP_001418.2

하기의 서열번호 2~7의 아미노산 서열은 본 발명의 단클론 항체를 구성하는 아미노산 서열이다. 하기의 서열번호 2~7의 가변중쇄 또는 가변경쇄 서열을 포함하는 항체는 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 EN2 whole protein으로 면역반응 유도된 동물의 lymphocyte와 myeloma cell과의 융합으로 얻은 단클론 세포(하이브리도마 세포)(수탁번호 KCLRF-BP-00404)로부터 얻는 것을 특징으로 한다. 각 서열에서 밑줄친 부분은 CDR3의 서열이다.

서열번호 2 : EN2 단클론 항체의 가변중쇄 아미노산 서열

서열번호 3 : EN2 단클론 항체의 가변중쇄 아미노산 서열

서열번호 4 : EN2 단클론 항체의 가변중쇄 아미노산 서열

서열번호 5 : EN2 단클론 항체의 가변경쇄 아미노산 서열

서열번호 6 : EN2 단클론 항체의 가변경쇄 아미노산 서열

서열번호 7 : EN2 단클론 항체의 가변경쇄 아미노산 서열

하기 서열번호 8의 아미노산 서열은 본 발명에서 단클론 항체 제조를 위해 사용한 EN2 재조합 단백질을 구성하는 아미노산 서열이다. 하기 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 EN2 재조합 단백질은, EN2 단백질(Accession No. NP_001418.2)의 발현 효율을 높이기 위해 T7 tag(파란색)를 포함하고 있으며 정제를 용이 하도록 His tag(노란색)을 포함하고 있다. 또한 대장균을 활용한 대량 배양을 위하여 대장균 발현 벡터를 활용하여 유전자 재조합하였으며 이를 위하여 제한 효소 인식부위(restriction enzyme site - 하늘색)를 활용하여 제조한다.

서열번호 8 : 재조합 EN2 단백질

서열번호 9 : 본 발명의 항체가 인식하는 에피토프(epitope)

DGEGGSKTLSLHGGA

본 발명의 단클론 항체는 EN2 단백질을 인식한다. 상기 EN2 단백질은 포유류의 체내에 포함된 것을 체외로 추출한 것일 수 있으며, 또한 재조합 EN2 단백질일 수도 있다. 따라서 본 발명을 통해 전립선암 환자의 체내에서 증감하는 EN2 단백질의 유무를 확인하거나 정량할 수 있다. 즉, 본 발명은 상기 단클론 항체를 이용하여 EN2 단백질을 특이적으로 인식함으로써 EN2 단백질의 유무를 진단하는 방법을 제공할 수 있다. 이 때 EN2 단백질의 존재 유무 확인 방법은 기존의 단백질 존재유무 또는 정량방법에 사용되는 통상의 실험적인 방법이라면 어떤 것이든지 이용가능하다.

또한, 본 발명은 EN2 단백질을 특이적으로 인식하는 EN2 단클론 항체 조성물 또는 이를 함유하는 진단제를 제공한다. 상기 진단제에는, 표지된 2차 항체, 발색단, 항체와 컨쥬게이트된 효소 및 그 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등이 포함될 수 있다.

한편 본 발명의 진단제에는 진단대상의 체내에 포함된 EN2 단백질을 정량할 수 있는 재조합 EN2 단백질이 포함될 수 있다.

일반적으로 항체는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 따라서 본 발명의 대상이 되는 항체는 바람직하게는 EN2 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 단클론 항체를 포함할 수 있다.

본 발명의 단클론 항체는, 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 대로, 하이브리도마 방법(Kohler G. and Milstein C.), 또는, 파지 항체 라이브러리(Clackson et al. Marks et al.) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 하이브리도마 방법을 수행하기 위해서는 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주동물의 세포와, 암 또는 골수종 세포주를 이용할 수 있다. 이후, 폴리에틸렌글라이콜 등을 이용하는 방법, 즉, 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지된 방법으로, 이러한 두 종류의 세포들을 융합시킨 후, 항체 생산 세포를 표준적인 조직 배양방법으로 증식시킬 수 있다. 이 후, 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 얻은 후, 본 발명의 재조합 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내 또는 생체 내에서 대량 배양할 수 있다. 상기 파지 항체 라이브러리 방법은, 본 발명의 재조합 단백질에 대한 항체 유전자를 획득하여, 이를 파지(phage)의 표면에 융합 단백질 형태로 발현하여 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 상기 라이브러리로부터 본 발명의 재조합 단백질과 결합하는 단일클론 항체를 분리 및 제작하여 수행할 수 있다. 상기 방법들에 의하여 제조된 항체는 원심분리, 전기영동, 투석, 이온교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등의 방법으로 분리할 수 있다.

따라서 본 발명에서는 EN2 단백질 또는 이의 재조합 단백질을 이용하여 항체를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 EN2 단클론 항체는 EN2 단백질 또는 이의 재조합 단백질을 항원으로 하여 동물에 주사한 뒤 비장 조직을 분리하여 myeloma cell과 융합 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 동물로는 생쥐, 랫트 등 임의의 동물 숙주를 이용할 수 있다.

이에 보다 자세하게는 본 발명의 항체를 제조하는 방법으로서 하기의 방법을 따를 수도 있다.

바람직하게는 (제1단계) 대장균 발현 벡터를 이용하여 EN2 재조합 단백질을 발현하고 분리 정제하여 항체 제조용 항원을 준비하는 단계;

(제2단계) 상기 항원과 보조제를 혼합하여 유화하는 단계;

(제3단계) 보조제가 유화된 항원을 동물에 2~6회 5~20일 간격으로 피내주사하는 단계;

(제4단계) 항원 투여를 마친 7~20일 후, 상기 동물로부터 혈청을 분리하고 항체의 역가를 확인한 후 상기 동물의 비장을 분리하는 단계;

(제5단계) 상기 비장으로부터 lymphocyte를 분리한 후 myeloma cell과 혼합하여 세포 융합을 유도하고, 융합된 세포 중에서 EN2 재조합 단백질에 대한 높은 항원-항체 반응을 갖는 항체를 생산하는 단클론 세포를 선별하는 단계;

(제6단계) 선별된 단클론 세포를 배양하여 배양 배지로부터 면역글로불린을 획득하는 단계; 및,

(제7단계) 상기 면역글로불린을 분리 정제하는 단계;

를 포함할 수 있다.

상기 항체는 2개의 전체 길이 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, F(ab)2, Fv 등이 있다.

상기 항체 제조방법에서 동물은 면역반응을 일으킬 수 있는 동물이라면 어떤 동물이라도 사용가능하나 현재 단클론 항체 생산에 가장 용이하게 사용되는 생쥐를 사용함이 바람직하다 할 수 있다. 상기 제6단계의 면역글로불린은 어떤 타입이라도 사용가능하나 바람직하게는 면역글로불린 G일 수 있다.

본 발명은 또한 EN2 단백질이나 이의 재조합 단백질 또는 이를 특이적으로 인식하는 항체를 이용한 전립선암의 진단방법을 제공한다.

상기 진단방법은, (1단계) 분석할 시료에서 체단백질을 분리하는 단계;

(2단계) 상기 1단계의 체단백질과 본 발명의 항체를 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계; 및,

(3단계) 상기 2단계에서 생성된 항원-항체 복합체를 정량 검출 및 분석하는 단계;를 포함할 수 있다.

상기 진단방법에서, 1단계의 시료는 전립선암의 발생 유무 또는 진행여부를 확인할 대상에게서 추출할 수 있으며, 바람직하게는, 포유동물(사람 또는 기타 동물)의 조직, 세포 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 소변, 혈액, 혈장, 혈청, 간세포(liver cells) 등일 수 있다.

상기 1단계에서 체단백질을 분리하는 과정은 공지된 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, 체단백질의 양은 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

상기 2단계의 항원-항체 복합체란 시료 내의 체단백질에 포함된 EN2 단백질(또는 본 발명의 재조합 단백질)과 항체의 특이적인 결합물을 의미한다. 즉, 상기 복합체에서 항원은 EN2 단백질을 의미한다.

즉, 상기 분석방법을 통하여 대조군의 항원-항체 복합체의 형성량과 전립선암의 유무 또는 진행여부를 확인할 대상의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 전립선암의 유무 또는 진행여부를 확인할 대상의 EN2 단백질 발현량을 판단하여 전립선암을 직접적으로 진단할 수 있다.

상기 3단계에서 전립선암의 발생 유무 또는 진행여부를 확인할 대상의 시료의 EN2 함량은 본 발명에 활용된 재조합 EN2 단백질의 농도를 확인한 표준값을 통해 확인할 수 있다.

전립선암의 발생 유무 또는 진행여부를 확인할 대상의 EN2 단백질 발현량은 전립선암 환자의 소변 EN2 단백질 농도 범위로 알려진 3.1~65.4 nM(Sci.Rep. 2013;3:2059)에 해당되는지를 통해 판단할 수 있다.

상기 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 신호 크기를 통하여 정량적으로 측정할 수 있다. 상기 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으나, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 라벨로 효소를 사용하는 경우, 이용할 수 있는 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스터라아제, 글루코스옥시다아제, 헥소키나아제 등이 있으나, 상기 기재된 범위로 제한되지는 않는다. 상기 형광물질로는 플루오레신, 피코시아닌, 플루오레스카민 등이 있으나, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 상기 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 발광물질로는 루시페린 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 미소입자로는 콜로이드, 금 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 레독스 분자로는 퀴논, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 방사선 동위원소에는 ³H, ¹⁴C 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 진단방법은, 웨스턴 블롯(western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), RIA(radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오크털로니면역확산법(ouchterlony immunodiffusion), 로켓면역전기영동법(rocket immunoelectrophoresis), 조직면역염색법(immunohistochemistry), 면역침전분석법(immunoprecipitation), 보체고정분석법(complement fixation assay), FACS(fluorescense activated cell sorter), 단백질 칩(protein chip) 등에 적용할 수 있으나, 기재된 방법에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 재조합 단백질 또는 항체를 이용할 있는 진단대상은 EN2 단백질이 체내에 생성되는 대상이라면 모두 가능하며, 사람을 포함하는 모든 포유류에 대한 진단이 가능하다. 상기 포유류는 사람, 개, 고양이, 토끼, 소, 염소, 돼지, 말 등 어떤 종류의 포유류도 모두 적용 가능하다.

본 발명은 EN2 단백질을 특이적으로 인식하는 EN2 단클론 항체에 관한 것이다. 상기 EN2 단클론 항체는 체내에 존재하는 EN2 단백질의 유무 확인 및 정량이 가능하며, 기존의 EN2 단백질 항체보다 검출 민감성이 현저하게 우수하여 전립선암의 진단제 조성물로서 유용하게 이용될 수 있다. 본 발명의 항체를 이용하여 전립선 암을 진단할 때 기존 전립선암 진단 방법인 혈액에서의 PSA(prostate-specific antigen) 검출 결과보다 높은 진단 유효성이 있는 것이 확인된다. 관련 선행기술로서 미국등록특허 제8460882호에도 EN2 항체에 관한 정보가 개시되어 있기는 하지만, 본 발명에 개시된 것과 같은 아미노산 서열을 갖는 EN2 단클론 항체 또는 본 발명의 하이브리도마 세포로부터 제조된 EN2 단클론 항체는 상기 선행기술에 개시된 것과는 기술적 특징이 전혀 다른 신규한 조성물이라고 할 수 있다.

도 1A는 실시예 1-1에서 homeobox protein engrailed-2(EN2)의 단백질을 대량 배양하기 위해 대장균 발현 벡터를 사용하여 cloning한 것을 도식화한 것이고, 도 1B는 실시예 1-1에서 대장균 대량 배양 후 분리 정제된 재조합 EN2 단백질을 SDS-PAGE를 전개하여 나타낸 것이다.
도 2는 재조합 EN2 단백질을 항원으로 하여 제작된 단클론 항체를 분리, 정제, 용출된 결과를 나타낸다.
이 때, 비교대상 단클론 세포로부터 분리된 단클론 항체는 Another Clone이라 표기하였고 이후 도 3에서부터는 Anti-EN2(N.S)라 기재하며, 본 발명의 단클론 항체는 Whole protein form(W)라 표기하였고, 이후 도 3에서부터는 Anti-EN2(w)라 기재한다.
도 3의 A는 본 발명의 EN2 단클론 항체(Anti-EN2(w))와 비교군 단클론 항체(Anti-EN2(N.S))에 대한 전립선암 세포주 PC3 및 LNCaP 발현 EN2 단백질의 선택적 검출 정도를 western blot 실험을 통하여 확인한 결과이며, B는 이를 수치화한 결과이다.
도 4의 A는 본 발명의 EN2 단클론 항체(Anti-EN2(w))와 비교군 단클론 항체(Anti-EN2(N.S))에 대한 재조합 EN2 단백질의 항원 검출 가능한 농도를 western blot 실험을 통하여 정량적으로 확인한 결과이며, B는 이를 수치화한 결과이다.
도 5의 A 및 B는 본 발명의 EN2 단클론 항체(Anti-EN2(w))와 비교군 단클론 항체Anti-EN2(N.S)에 대한 LNCap 전립선암 세포주, C 및 D는 PC3 전립선암 세포주에서 발현된 EN2 단백질에 대한 선택적 검출 정도를 공초점 레이저 현미경(Confocal Laser Scanning Microscope:CLSM)으로 촬영한 형광사진이다.
도 6의 A는 본 발명의 EN2 단클론 항체(Anti-EN2(w))의 EN2 단백질에 대한 선택적 검출 정도를 ELISA 방법으로 확인한 결과(EN2 단백질 정량 표준선)이며, B는 A의 결과를 이용하여 ELISA 방법으로 실제 양성 전립선 비대증 환자(P1), 전립선염 환자(P2) 또는 전립선암 환자(P3~P8)의 검체(소변)에서의 EN2 단백질을 정량한 결과를 나타낸다.
도 7의 A는 본 발명의 EN2 단클론 항체(Anti-EN2(w))를 활용하여 실제 환자(P1~P8)의 검체(소변)에서 전립선암과 전립선염, 또는 전립선 비대증과의 구분이 가능한지를 western blot 방법을 통하여 확인한 결과이며, B는 이들 환자의 PSA(prostate-specific antigen) 농도를 나타낸 결과이다.
도 8은 본 발명에서 제작된 단클론 항체의 경쇄(light chain)와 중쇄(heavy chain)의 아미노산 서열을 분석한 결과를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 단클론 항체를 이용하여 Epitope mapping 을 통해 예측되는 Epitope 서열을 나타낸다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 재조합 EN2 단백질 cloning, 발현, 정제 및 항원 준비>

실시예 1-1. 재조합 EN2 단백질 cloning, 발현, 정제

제작된 항체의 항원을 제공하기 위해 재조합 EN2 단백질을 제조하였다. 단백질의 발현을 극대화하기 위해 단백질의 N terminal에 T7 Tag을 사용하였으며 이후 단백질 정제를 용이하게 하기 위하여 N, C terminal에 His Tag을 사용하였다. 또한 pET 28a plasmid에 삽입을 위하여 BamH1, Xho1의 제한효소 자리를 활용하였다. 도 1(a)에 pET28b/EN2 plasmid를 도식화하였다. cloning 과정을 통하여 제작된 pET28b/EN2 plasmid를 대장균(BL21/DE3)에 형질전환하여 0.1 mM IPTG와 37℃ 조건에서 EN2 단백질을 과발현시켰다. 과발현된 대장균 세포를 lysis buffer(20 mM Tris-Cl at pH 8.0, 300 mM NaCl, 20 mM imidazole, 1x protease inhibitor cocktail, 1 mg/㎖ lysozyme)와 함께 초음파로 분쇄하고 원심분리하여 수용성 단백질만을 얻었다. 이를 Ni-NTA agarose bead에 EN2/His Tag과 Ni에 친연성 결합시고, 이 후 elution buffer(20 mM Tris-Cl at pH 8.0, 300 mM NaCl, 300 mM imidazole, 1x protease inhibitor cocktail)로 EN2 단백질만을 분리하였으며, storage buffer (50 mM Tris-HCl at pH 8.0, 200 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 mM PMSF, 20% glycerol) 상태에서 투석(cut off 10K)을 통하여 imidazole을 제거한 후 BCA(Bicinchoninic acid) 정량 및 280nm 흡광도에 의해 단백질 농도를 정량하였다.

실시예 1-2. 보조제와 유화된 항원 준비

항원을 면역동물에 투여하기 위해 생체에서 용해도가 높은 항원이 오래 머물 수 있도록 보조제(adjuvants)와의 결합이 필요하여 보조제와 항원이 유화된 상태의 조성물을 제조하였다. 또한 효과적인 면역 유발을 위해, 실시예 1-1에서 준비한 항원을 총 4번 투여하기로 하였는데, 첫 번째 투여용 항원은 면역반응을 극대화하기 위해 사멸된 mycobacterium을 포함하는 Freund's complete adjuvant(FCA)를 혼합하여 준비하였고, 나머지 3번의 투여용 항원에는 사멸된 mycobacterium이 제외된 Freund's incomplete adjuvant(FIA)을 혼합하여 준비하였다. 이 때, 수용성인 항원과 소수성인 보조제의 효과적인 유화를 위하여 초음파(probe sonication) 방법을 사용하여 항원과 보조제를 혼합하였으며, 혼합과정 중 항원에 열이 가해지지 않도록 4℃를 유지하도록 한다. 항원과 보조제는 1:1 부피로 혼합하였다.

이 후, EN2 단백질에 대한 반응성이 좋은 단클론 항체를 제조하기 위해, 항체 반응이 좋은 혈청을 생산하는 면역동물을 선별하고 이 동물의 lymphocyte로부터 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 선별하는 과정이 포함된 실시예 2의 실험을 수행하였다.

<실시예 2. 항원을 이용한 면역 반응 유도>

실시예 2-1. 면역 동물 선정

사람의 EN2 단백질의 서열에 대한 면역 반응을 유도하기 위한 동물은 생쥐(BALB/C)를 사용하였다. 면역 반응이 개체에 따른 정도가 다를 수 있으므로 개체 특이성을 고려하여 항원(실시예 1-2에서 제조한 보조제와 혼합한 재조합 단백질)에 대해 5주령의 암컷 2개체에 면역 반응을 유도하였다. 이후 단클론 항체 제작과정에 사용되는 면역 동물로 동일한 종류의 생쥐를 사용하였다.

실시예 2-2. 면역 반응 유도 및 항체의 역가 확인

첫 번째 항원 투여는 100 ㎕을 유화액(emulsion)을 만들어 실험마우스(BALB/C)의 발바닥에 투여하여 면역반응을 유도하였다. 첫번째 주입 이후 2주 후 동일한 항원 100 ㎕ 을 실험마우스의 발바닥에 투여하여 면역반응을 유도하였다. 재투입은 1 주 간격으로 최대 4회까지 진행하였고, 면역 후 소량의 serum을 채혈하여 ELISA test를 통해 serum 내의 다클론 항체의 역가를 확인하였다.

이를 위해 ELISA 확인용 항원(EN2 재조합 단백질)을 coating buffer에 5 ㎍/㎖ 농도로 희석한 후 96 well plate에 well당 50 ㎕씩 분주 coating한 후 4℃에서 하룻밤 동안 반응시켰다. 다음날 2% skim milk로 1시간 동안 blocking 한 후 primary antibody를 배율에 맞게 희석하여 plate well에 50 ㎕씩 분주하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 plate는 TBS-T로 3회 세척한 후 HRP가 conjugation되어 있는 Goat anti-mouse IgG를 1:10,000 비율로 희석하여 plate well에 50 ㎕씩 분주하여 37℃ 에서 1시간 동안 반응하였다. 반응 완료 후 5회 세척하고 TMB 용액을 plate well에 50 ㎕씩 분주하여 5분 반응 시킨 후 1N H₂SO₄ 100㎕/well을 넣어 반응을 종결하였고, Microplate reader로 450nm에서 흡광도 값을 측정하여 serum내 titer를 확인하였다.

<실시예 3. 면역동물 lymphocyte와 myeloma cell과의 융합 및 cloning>

실시예 3-1. 세포 융합(Fusion) - 하이브리도마 세포의 제조

실시예 2를 통해 확인된 면역된 마우스의 serum내 titer를 기준으로 높은 역가를 갖는 항체를 제조하는 면역 동물을 선정하여 Lymphocyte를 분리하고 세포 융합(fusion)을 실시하였다.

이를 위해 마우스의 림프절을 손상 없이 적출하여 DMEM(Dulbecco/Vogt modified Eagle's minimal essential medium) 배지로 세척하였고, Lymphocyte를 분리하여 60 mm dish에 DMEM 배지를 담아 단일 세포로 분산시킨 후, 준비된 Myeloma cell(SP2/0 Ag 14 - ATCC #CRL-1581)과 Lymphocyte를 세포수 대비 1:1로 혼합하였다. 혼합된 세포들을 ECF buffer(0.3M mannitol, 0.1mM calcium chloride, 0.1mM magnesium chloride) 10~20 ㎖로 2~3회 세척하고, 원심분리하여 분산액을 버린 후 남은 cell pellet을 ECF buffer에 고르게 풀어주고 전극 용기에 넣어 약 1.3volt의 전극을 주어 cell fusion을 유도하였다. 96well plate에 well 당 200 ㎕씩 cell을 분주한 뒤(2.5ⅹ10⁷ cell/plate) 이를 CO₂ incubator에서 배양하였다. Fusion 5일 후 HAT media(hypoxanthine-aminopterin-thymidine medium)를 각 well당 50 ㎕씩 첨가하고, fusion 12일 후 colony를 확인하여 항원과의 반응 여부를 ELISA(Asb. 450nm) 방식으로 진행하여 결정하였다. 그 과정은 실시예 2와 동일하였다.

실시예 3-2.클로닝(Cloning) : 항원-항체 반응성이 우수한 항체를 생산하는 하이브리도마 선별

fusion 세포를 선별하기 위해 실시예 3-1에서 수행된 ELISA 결과 중, positive 선정 기준은 OD값 기준으로 1.0 이상인 값이지만(OD값이 1 이하인 것은 다음 cloning 과정을 지나고 나면 실제 단클론의 affinity 좋지 않은 경우가 있고, 또한 non specific binding 경우도 어느 정도 OD 값이 발생하므로 최소 1 이상의 값을 고르는 것이 좋음), 확인 결과에서 0.5 이상인 값이 대부분이기에, 일정량의 선별 대상 세포를 확보하기 위해 0.5 이상을 positive로 간주하여 단클론 세포를 선별하였다.

이를 위해, 세포 융합(fusion) 이후 ELISA OD 값을 기준으로 선정된 well을 선별하여 단클론 세포를 선별하기 위한 클로닝(cloning)을 수행하였다. 24well로 옮겨 ELISA test를 수행한 cell을 spin down 시킨 후 HT media로 분산시켰다. cell counting을 수행해 96well plate 1개 당 150 cell이 들어가도록 분주하였다. 10~12일이 지나고 ELISA test(실시예 3-1과 동일방법)를 수행하여 ELISA test 결과상 OD값이 높으면서 colony가 작고 1개인 well을 골라 2차 cloning을 진행하였다(ELISA의 positive 선정 기준은 실시예 3-1과 동일). 이후 추가적인 cloning을 계속 수행하였는데, 각 cloning 과정은 실시예 3-1과 동일하였다. 4차 cloning 부터는 세포배지만 complete media(DMEM, 10% FBS[fetal bovine serum]+1% PS[Penicillin-Streptomycin])를 사용하였다.

한편, positive well 간의 편차가 0.2 이하(OD 값 기준)인 상태에서 이를 단클론 세포의 선별을 위한 final cloning으로 선별하였고, 만약 2차 cloining에서 단클론 세포의 선별 조건에 부합하다고 판단되면 3차 cloning을 진행하지 않고 단클론 세포에 대한 final culture를 진행하였다. 이 단클론 세포가 자라면 75T flask와 150T flask로 점차 scale up 시켜 배양 후에 세포가 원하는 만큼 자라면 3x10⁶cells/㎖씩 분주하여 동결하였다(freezing media 조성 : 25㎖ FBS+20㎖ DMED+5㎖ DMSO).

<실시예 4. 면역글로블린 G (IgG) 정제>

실시예 4-1. 단클론 세포 배양액의 수집

실시예 3-3에서 획득한 세포를 37 ℃에서 녹여 DMEM/10% FBS/1%PS 배지를 사용하여 5% CO₂ 가습 배양기에서 10일 동안 배양하였고 이틀 간격으로 계대 배양을 진행해 배양 배지를 수집하였다.

실시예 4-2. 면역글로블린 G (IgG) 분리

이렇게 수집된 배양 배지에는 FBS을 포함한 여러 단백질이 함유되어 있기 때문에 항체의 역가와 특이성을 높이기 위해 면역글로블린 G(IgG)만을 정제하기로 하였다.

이를 위해 상기 배양 배지를 packing된 resin(mouse IgG에 특이적 결합을 하는 protein G가 결합된 resin : Protein G Sepharose 4 Fast Flow-GE Health care)에 결합시키고 bead 2-3배 부피의 완충제로 washing한 후 elution을 진행하였다. Elution 완충제는 protein G와 IgG와 특이적 결합을 끊기 위해 pH 2-3 완충제를 사용하였다. Elution 후에 바로 정상 pH로 올려주기 위해 Tris(pH 9)를 사용하였다. 또한 Elution은 resin 당 3㎖ Elution 후에 1㎖씩 10개의 분획으로 나누어 받았는데, 10 % SDS-PAGE를 활용하였으며 분획 9 ㎕와 4x sample buffer(reducing agent가 포함된) 3 ㎕와 mix하여 100 ℃에서 3분간 끓인 후 loading 하였다. 전기영동 진행 후 coomassie brilliant blue r-250을 통하여 염색을 진행하여 분획을 확인하였다. 이러한 과정을 통해 도 2에서와 같이 4~5번 분획에서 본 발명의 항체 IgG를 얻었다. 이 때, 도 2에서 A(Another Clone)는 하이브리도마 선택 과정에서 나타난 다른 단클론 세포로부터 얻은 항체 분획 결과를 나타내며, B는 본 발명의 항체를 제조하는 단클론 세포(하이브리도마)로부터 얻은 항체 분획 결과를 나타낸다. 상기 도 2B의 항체를 이후의 실험에서 비교군으로 지정하여 사용하였는데, Another Clone의 단클론 항체는 Anti-EN2(N.S)라 표기하여 사용하였고, 도 2A의 본 발명의 단클론 항체는 Anti-EN2(w)라 표기하여 사용하였다.

최종적으로 얻은 각 항체(IgG)는 정량 후 PBS/0.2% sodium azide/20% glycerol 완충제에 희석하고 분주하여 -80℃에 보관하였다.

< 실시예 5. 전립선암 세포주에서 EN2 단클론 항체의 EN2 단백질의 검출 능력 평가>

EN2 발현이 높은 전립선암 세포주 PC3(® CRL-1435™)와 LNCaP(® CRL-1740™)를 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)로부터 구입하고, 이를 37℃, 5% CO₂의 가습 배양기에서 25mM HEPES가 포함된 RPMI-1640 (PC3) 또는 RPMI-1640(LNCaP) 배지에 10% 소태아혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(P/S)을 첨가하여 배양하였다.

EN2 단클론 항체에 대한 반응을 확인하기 위해, 이 PC3와 LNCaP 세포를 각각 2x10⁶개씩 100cm² 배양접시에서 3일 동안 배양한 후, 차가운 PBS(phosphate buffered saline) 용액으로 2회 세척하여 세포를 수집하였고, protease inhibitor cocktail을 포함하는 RIPA 완충액을 첨가하여 30분 동안 얼음에서 세포를 용해하였다. 이렇게 얻은 세포 용해액을 13,000 rpm에서 20분 동안 원심분리한 후, 상층액을 취하여 BCA(bicinchoninic acid assay) 방법으로 단백질의 농도를 측정하고, 용해된 단백질들을 40 ㎍/well, 20 ㎍/well의 양으로 well 당 20 ㎕씩 loading하고 4-15% SDS-PAGE(Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis)를 이용하여 분리하였다. PAGE를 통하여 분리된 단백질들은 PVDF 멤브레인으로 옮기고 각각의 EN2 단클론 항체(6.6 nM)(Anti-EN2(N.S), Anti-EN2(w))를 5% skim milk/TBS-T(Tris-saline+Tween20)에 1:2000의 비율로 희석하여 4℃에서 하룻밤 동안 반응시키고, 다음날 TBS-T로 3번 세척한 후 홀스라다시 페록시다아제(HRP)가 접합된 항-mouse 항체를 5% skim milk/TBS-T에 1:2000의 비율로 희석하여 상온에서 2시간 반응시켰다. TBS-T로 3번 세척한 멤브레인은 ECL(enhanced chemiluminescence) 용액을 사용하여 2차 항체에 결합되어 있는 peroxidase의 기질인 luminol이 peroxidase에 의해 산화되면서 푸른색 빛을 내는 것을 X-ray 필름에 감광시켰다. 이에 대한 결과는 도 3에 나타내었는데, 도 3A는 웨스턴 블롯을 수행하여 얻은 band 사진이며, 도 3B는 이 결과를 수치화하여 그래프로 나타낸 것이다.

도 3의 결과를 참고하면, 본 발명의 항체인 Anti-EN2(w)가 Anti-EN2(N.S)에 비해 전립선 세포주에서 발현하는 EN2 단백질에 대한 검출능이 우수함을 알 수 있다.

<실시예 6. 재조합 EN2 단백질에 대한 항체 민감도 평가 - 웨스턴 블롯>

전립선암 세포주로부터 추출한 단백질 대신, 항체 제조용 항원으로 실시예 1-1에서 사용한 재조합 EN2 단백질을 검출용 단백질로 사용하여 최대 20 ng/20㎕(1 ng/㎕)(24 nM)부터 최소 1 ng/20㎕(0.05 ng/㎕)(1.2 nM)까지 농도별로 희석하여 앞의 실험예 1과 동일한 조건으로 항체의 민감도를 확인하였다. 이에 대한 결과는 도 4에 나타내었는데, 도 4a는 웨스턴 블롯을 수행하여 얻은 band 사진이며, 도 4b는 이 결과를 수치화하여 그래프로 나타낸 것이다.

도 4를 참고하면, Anti-EN2(w)가 최소 1 ng/20㎕(0.05 ng/㎕)(1.2 nM)까지 EN2 단백질이 검출되는 민감도를 보여, 단클론 항체의 단백질 검출능이 우수함을 알 수 있다. 이는 실제 환자의 소변 샘플에 적용할 경우에도 EN2 단백질을 민감하게 검출할 수 있음을 나타낸다(전립선암 환자의 소변 EN2 단백질 농도 범위: 3.1~65.4 nM : Sci.Rep. 2013;3:2059). 반면 다른 단클론 세포로부터 제조된 Anti-EN2(N.S) 항체의 경우, EN2 단백질의 검출능이 매우 낮은 것으로 확인된다.

<실시예 7. 전립선암 세포주에 대한 항체 민감도 평가 - 면역 형광 염색 방법>

전립선암 세포주 LNCap 및 PC3의 세포 내 EN2 단백질을 면역 형광 염색법으로 검출하였다. 1차 항체는 본 발명의 단클론 항체인 Anti-EN2(w)와 비교군 항체인 Anti-EN2(N.S)를 사용하고 2차 항체는 anti-mouse IgG/594를 사용하였으며 세포질 내에 분포하는 항원과의 결합능은 공초점 레이저 현미경(Confocal Laser Scanning Microscope)을 통하여 분석하였다.

이에 대한 형광염색 사진은 도 5에 나타내었는데, 도 5를 참고하면, Anti-EN2(w)가 전립선암 세포 내의 EN2의 검출정도가 현저하게 좋은 것이 확인되며, 이 항체가 non denaturation(비변성) 조건의 항원 검출에도 용이하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

<실시예 8. 재조합 EN2 단백질에 대한 항체 민감도 평가 - ELISA>

실시예 1-1에서 제조한 재조합 EN2 단백질(검출용 항원)을 4℃에서 밤새 96-well plate에 붙이고 2% skim milk를 포함하는 TBST 용액으로 37℃에서 blocking을 진행하였다. 이 때 재조합 EN2 단백질(검출용 항원)을 0, 0.312ng/well, 0.625ng/well, 1.25 ng/well, 2.5 ng/well, 5ng/well10ng/well로 계대 희석하여 붙이고 1차 항체로서 본 발명의 항체 Anti-EN2(w)를 3.3 nM로 희석하였다. 이후 각 well 마다 1차 항체를 처리하고 반응시킨 후 세척하였고, 2차 항체로서 HRP가 conjugation 된 anti-mouse IgG를 1/2000으로 희석하여 처리하였다. 2차 항체 반응 후 세척한 뒤, TMB (3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine) 용액을 사용하여 발색하였으며 1N sulfuric acid를 사용하여 발색 반응을 종료하였다. 이 후 ELISA reader를 통하여 얻은 결과값을 표 1에 내타내었고, 이 중 EN2(w)에 대한 결과를 도 6A의 표준선(standard line)으로 나타내었다.

조건	검출용 EN2 재조합 단백질 농도(ng/㎖)에 대한 ELISA O.D. value
	0 ng/㎖	0.312 ng/㎖	0.625 ng/㎖	1.25 ng/㎖	2.5 ng/㎖	5 ng/㎖	10 ng/㎖
EN2(w) 항체	0.073	0.109	0.142	0.22	0.371	0.669	1.266
EN2(N.S) 항체	0.066	0.0689	0.067	0.094	0.095	0.183	0.352

상기 표 1 및 도 6A에 따르면 EN2(w) 단클론 항체의 민감도가 매우 우수함을 알 수 있다.

또한 EN2(w) 단클론 항체를 이용하여 실제 전립선암 환자(P1), 전립선염 환자(P2) 또는 전립선 비대증 환자(P3~P8) 검체(소변 샘플 10000 g을 10분간 원심분리하고 상층액만을 모아 사용)의 EN2 단백질 농도를 상기 ELISA 법으로 확인한 바(음성 대조군(N or Normal)으로는 건강한 남성 소변을 사용), 도 6A의 표준선을 이용하여 도 6B에서처럼 실제 검체(소변)에서 EN2의 정량이 가능함을 알 수 있는데, 양성 전립선 비대증 환자(P1), 전립선염 환자(P2) 또는 전립선암 환자(P3~P8) 검체에서의 EN2 단백질 농도에 차이점이 있음을 확인할 수 있다.

따라서, 이러한 결과들을 통하여 본 발명의 항체가 단순히 암 존재여부를 판정하는 정성적 검사뿐 아니라 소변에서 EN2 검출과 암 진행의 상관관계를 수치화하여 암 진행 여부를 가늠할 수 있는 정량적 검사에도 활용 가능한 우수한 항체임을 알 수 있다.

<실시예 9. 전립선암 환자 소변 샘플에 대한 항체 민감도 평가 - 웨스턴 블롯>

웨스털 블롯을 이용해서도 본 발명 항체를 이용하여 전립선 질환 환자의 구분이 확인한지 확인하였다.

이를 위해 실시예 8에서 사용된 양성 전립선 비대증 환자(P1), 전립선염 환자(P2) 또는 전립선암 환자(P3~P8)의 소변 샘플 10000 g을 10분간 원심분리하고 상층액만을 모아, 각각의 상기 상층액 15 ㎕에 4x sample buffer 5 ㎕를 혼합하여 100℃ 5분간 끓여 웨스턴 블롯 시료로 사용하였다. 여기에 사용된 단클론 항체 Anti-EN2(w)의 농도는 3.3 nM이며, 음성 대조군(N or Normal)으로는 건강한 남성 소변을 사용하였고, 실험예 2의 방법으로 웨스턴 블롯을 수행하였다. 이에 대한 결과는 도 7에 나타내었다.

도 7A를 참고하면, 본 발명의 단클론 항체가 웨스턴 블롯을 통해서도 전립선암 환자의 소변 샘플에 대한 선택적인 인식이 가능한 항체임을 알 수 있다.

이에 반해 기존의 PSA 확인을 위한 ELISA로 동일 검체를 이용하여 전립선염, 비대증을 포함하는 환자 샘플을 실험한 바, 전립선암 환자의 진단이 잘 되지 않는 것으로 파악된다(도 7B 참조).

<실시예 10. 단클론 항체의 염기서열 분석 및 epitope 분석>

Anti-EN2(w) 항체를 제조하는 단클론 세포를 Y biologics(대전)에 제공하여 단클론 항체가 갖고 있는 경쇄와 중쇄의 아미노산 서열 분석을 진행하였고 그 결과를 도 8에 나타내었다. 이 경쇄와 중쇄의 아미노산 서열을 대표화하여 서열번호 2~4에는 항체의 가변중쇄 아미노산 서열을, 서열번호 5~7에는 항체의 가변경쇄 아미노산 서열을 기재하였다.

또한 항원으로 사용한 단백질의 서열과 단클론 항체를 앱클론(서울)에 제공하여 epitope mapping을 진행하여 도 9에 나타내었는데, 이 결과를 통해 Epitope 아미노산 서열은 DGEGGSKTLSLHGGA로 이루어짐을 확인하였다. 이렇게 확인된 Anti-EN2(w) 항체를 생산하는 단클론 세포를 EN2-W7이라 명명하고 한국세포주연구재단에 2017년 06월 28일 수탁번호 KCLRF-BP-00404로 기탁하였다.

한국세포주연구재단 KCLRF-BP-00404 20170628

<110> Moogene Medi Co., Ltd. <120> Specific monoclonal antibody to EN2 protein or composition comprising the same for diagnosis of prostate cancer <130> 153 <160> 9 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 333 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 1 Met Glu Glu Asn Asp Pro Lys Pro Gly Glu Ala Ala Ala Ala Val Glu 1 5 10 15 Gly Gln Arg Gln Pro Glu Ser Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 20 25 30 Gly Gly Ser Ser Pro Gly Glu Ala Asp Thr Gly Arg Arg Arg Ala Leu 35 40 45 Met Leu Pro Ala Val Leu Gln Ala Pro Gly Asn His Gln His Pro His 50 55 60 Arg Ile Thr Asn Phe Phe Ile Asp Asn Ile Leu Arg Pro Glu Phe Gly 65 70 75 80 Arg Arg Lys Asp Ala Gly Thr Cys Cys Ala Gly Ala Gly Gly Gly Arg 85 90 95 Gly Gly Gly Ala Gly Gly Glu Gly Gly Ala Ser Gly Ala Glu Gly Gly 100 105 110 Gly Gly Ala Gly Gly Ser Glu Gln Leu Leu Gly Ser Gly Ser Arg Glu 115 120 125 Pro Arg Gln Asn Pro Pro Cys Ala Pro Gly Ala Gly Gly Pro Leu Pro 130 135 140 Ala Ala Gly Ser Asp Ser Pro Gly Asp Gly Glu Gly Gly Ser Lys Thr 145 150 155 160 Leu Ser 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Claims (7)

1. 서열번호 2, 3 또는 4의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역; 및, 서열번호 5, 6 또는 7의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역;을 포함하는 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
2. 제1항에 있어서,
   상기 항체는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 EN2(Engrailed-2, Accession No. NP_001418.2) 단백질 또는 이의 재조합 단백질을 인식하는 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
3. 제1항에 있어서,
   상기 항체는 면역글로불린 G 타입인 것을 특징으로 하는 단클론 항체.
4. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 EN2(Engrailed-2) 단백질의 유무 진단용 조성물.
5. 제1항 내지 제3항 중의 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 전립선암 진단제.
6. 수탁번호 KCLRF-BP-00404의 하이브리도마 세포주.
7. 제6항의 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 것을 특징으로 하는 단클론 항체.

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