CN103429617A - 包含抗-ck8/18复合物自身抗体的标记物及其诊断癌症的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体或者其包括抗原结合位点（互补位）的片段、所述抗体在诊断乳腺癌中的用途、具有与所述自身抗体特异性结合的表位的氨基酸序列的多肽、包括能够测量所述自身抗体或者其包括抗原结合位点的片段的表达水平的试剂的用于诊断乳腺癌的组合物、产生所述自身抗体的杂交瘤细胞系、以及包括本发明的组合物的用于诊断乳腺癌的试剂盒。另外，本发明涉及一种用于诊断乳腺癌的方法，该方法包括使用本发明的组合物来检测细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体或者其包括所述抗原结合位点的片段的步骤；以及本发明涉及一种使用所述自身抗体筛选用于乳腺癌的治疗剂的方法。

Description

包含抗-CK8/18复合物自身抗体的标记物及其诊断癌症的用途
技术领域
本发明涉及：一种细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体或者其包含抗原结合位点（互补位）的片段；这种自身抗体在诊断乳腺癌中的用途；具有与该自身抗体特异性结合的表位的氨基酸序列的多肽；一种用于诊断乳腺癌的组合物，该组合物包括能够测量该自身抗体的表达水平或者该自身抗体的包含抗原结合位点的片段的表达水平的试剂；产生该自身抗体的杂交瘤细胞系；以及一种用于诊断乳腺癌的包括本发明的组合物的试剂盒。此外，本发明涉及一种用于诊断乳腺癌的方法，该方法包括以下步骤：使用本发明的组合物来检测细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体或者检测该自身抗体的包括抗原结合位点的片段；以及本发明涉及一种用于使用该自身抗体来筛选乳腺癌的治疗剂的方法。
背景技术
在多数的经合组织国家，在各种癌症中乳腺癌具有最高的发病率。在韩国，随着肥胖的逐渐增多和饮食习惯的西方化，乳腺癌发病率也已不断增长。通常，通过乳房X线照相术、超声照相法以及磁共振成像（MRI）来诊断乳腺癌。乳房X线照相术为受压缩的乳房的X-射线检查，且对于检测小乳腺癌是有用的。然而，许多韩国女士具有较少的脂肪组织以及致密的纤维组织，因此难于检测作为乳腺癌早期警告信号的钙化。因此，乳房X线照片通常与用于检测实性乳腺肿块和囊性乳腺肿块的超声照相法一起进行。这些机械检查通过简单的检查程序来执行，但由于这些机械检查依赖于读取人员的主观解释，故检测精确度是有限的。因此，需要后续的组织活检。这样的组织活检是一种侵入性方法，包括检查组织中的乳腺癌特异性蛋白表达或组织观察，且需要大量的费用，同时对患者造成感情上的、生理上的和经济上的负担。为了克服这些缺陷，需要开发简单易行的乳腺癌诊断方法。
同时，免疫系统在发育的早期阶段被构建为区分自我与异己的独特系统，并且发展为诱导抗原-抗体反应（体液免疫应答）和细胞免疫应答来抵御外来抗原，在正常情况下，仅有外来抗原受免疫系统作用。然而，在特殊的疾病中观察到针对自身抗原的抗体的产生，这归因于由于相应抗原的表达位点异常、形状的改变、或其它异常特征而造成的细胞内抗原的细胞外释放。从20世纪70年代以来，也已经报道了在伴随有异常肿瘤生长的癌变中观察到针对源自癌细胞的抗原的自身抗体的产生，这些抗原和抗体分别被称作肿瘤相关抗原和肿瘤相关自身抗体。肿瘤相关抗原产生的自身抗体预先存在且在疾病发作前被发现，这表明可作为用于早期诊断的生物标记物。
至今，已经识别了多种肿瘤相关抗原。在这些肿瘤相关抗原中，在20%至30%的乳腺癌患者中发现的HER-2/neu肿瘤蛋白的过度表达据知诱导自身抗体，且肿瘤抑制蛋白p53也被报道诱导自身抗体。还已知细胞增殖相关蛋白、细胞周期蛋白B1和CENP-F（着丝粒蛋白质F）诱导自身抗体。这些结果表明存在针对大量的肿瘤相关抗原的自身抗体，且已经进行许多试验来筛选可被用作癌症生物标记物的肿瘤相关自身抗体。
为了识别肿瘤相关自身抗体，已使用了SEREX（利用自体血清的人肿瘤重组cDNA表达文库的血清学分析），其是一种通过利用源自癌细胞的基因表达文库分析癌症患者血清的反应性来寻找自身抗体的常规方法。然而，利用文库水平的最大多样性来表达源自癌细胞的蛋白存在困难。此外，即使在转录后，最终蛋白产物进行翻译后修饰（PTM）（例如磷酸化作用和糖基化作用），这未反应在蛋白表达文库中。因此，该方法不足以检测自身抗原。可替选地，近年来已经进行了基于蛋白质组学的自身抗体的识别。基于蛋白质组学的方法包括以下过程：执行源自癌细胞的蛋白的二维的聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE）、使用癌症患者血清作为自身抗体样本检测显示反应性的蛋白质斑点、以及通过质谱分析来识别蛋白质；并且该基于蛋白质组学的方法通常缩写成SERPA（血清蛋白质组分析）。还使用MAPPING（多重亲和蛋白质谱），其中亲和层析树脂与从患者血液中分离的抗体结合，且源自癌细胞的蛋白质被应用于此以通过质谱分析法来识别结合蛋白质。此外，癌细胞裂解物被分离成数千个单独的片段以制成蛋白质芯片，患者血液对于蛋白质芯片的反应性被检查以识别自身抗体。由于针对翻译后修饰（PTM）的源自癌细胞的蛋白质的抗体的反应性可直接被检查且从而能够识别不能通过SEREX识别的自身抗体，故这类各种基于蛋白质组学的识别方法是有利的。
然而，上述方法仍包括其它限制。首先，抗体的数量存在问题。当分析物为两种或更多种组分的混合物时，在分析中相对大量的分析物优于其它分析物。这意味着少量的分析物可能被排除在可分析的范围之外。在这种情况下，患者的血清是众多抗体的混合物，通过构成自身抗体的数量以及自身抗体对于抗原的亲和性的差异来确定分析上可测量的范围，因此对所需的自身抗体的分析将是不切实际的。其次，由于待分析的自身抗体样本对于患者的依赖性，故在系统分析根据癌变的自身抗体产生的方面存在局限，且自患者采集足够大量的血液样本也存在困难，这成为进一步研究的障碍。最后，在保持与抗体进行反应的表位方面存在问题。根据现有的免疫学知识，存在两种类型的表位：顺序表位和构象表位。抗原特异性抗体产生的体内诱导反映了免疫细胞抗体首次遇到的抗原，这意味着抗原-抗体反应在溶液中发生且抗原蛋白具有在血液中维持其溶解形式的结构。因此，由于抗原抗体的自然结合样式在溶液中很好地体现，故抗原-抗体反应的体外测试优选地在溶液中进行。然而，在上文提到的SERPA中，执行二维电泳来分析蛋白质混合物。即，待分析的蛋白质通过使用SDS和尿素进行变性，然后检查它们与抗体的反应。因此，如果表位是顺序表位，则其是可检测到的，但是如果表位是构象表位，其是不可检测到的。
尽管先前对于自身抗体的研究表明自身抗体可用作癌变相关的标记物，但是它们的诊断效果不令人满意，且在自身抗体用作癌症诊断的生物标记物方面还存在局限。另外，由于自身抗体检测方法不包括大量的病案或者实际需要过多的试验，因此该自身抗体检测方法在实际应用中具有局限性。实际上，在识别自身抗体作为用于癌症的诊断标记物方面仍存在困难。
发明内容
技术问题
因此，本申请的发明人努力开发用于诊断乳腺癌的自身抗体。从而，发明人开发了一种使用肿瘤模型小鼠来识别有效的肿瘤相关自身抗体的方法，且发现针对细胞角蛋白8/18复合物的自身抗体在该肿瘤模型小鼠中被诱导。此外，本申请的发明人从肽文库中筛选表达与自身抗体特异性结合的抗原决定簇（表位）的噬菌体，以设计用于自身抗体检测的酶联免疫吸附测定（ELISA），并且发明人发现患有乳腺癌的个体可使用自身抗体检测得到诊断，从而完成了本发明。
技术方案
本发明的一个目的在于提供一种细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体或者其包含抗原结合位点的片段。
本发明的另一目的在于提供一种多肽，该多肽为与本发明的自身抗体特异性结合的表位。
本发明的另一目的在于提供一种用于诊断乳腺癌的组合物，该组合物包括能够测量本发明的自身抗体的表达水平或者该自身抗体的包含抗原结合位点的片段的表达水平的试剂。
本发明的另一目的在于提供一种杂交瘤细胞系，该杂交瘤细胞系产生本发明的自身抗体。
本发明的另一目的在于提供一种用于诊断乳腺癌的试剂盒，该试剂盒含有本发明的组合物。
本发明的另一目的在于提供一种用于诊断乳腺癌的方法，该方法包括使用本发明的组合物来检测细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体或其包含抗原结合位点的片段的步骤。
本发明的另一目的在于提供一种用于筛选用于乳腺癌的治疗剂的方法，所述方法包括以下步骤：（a）测量细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体的表达水平；（b）施用用于乳腺癌的候选治疗剂；和（c）与步骤（a）中的表达水平相比，检查细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体的表达水平是否下降。
本发明的另一目的在于提供本发明的自身抗体或者其包含抗原结合位点的片段在诊断乳腺癌中的用途。
有益效果
当本发明的细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体用作乳腺癌的诊断标记物时，可以使用非侵入性生物样本（例如血液、血浆、血清和淋巴液）而不使用侵入性组织样本，以50%灵敏度和82%的特异性诊断乳腺癌的发病率。此外，在本发明中识别了与标记物反应的序列。因此，不需要设计用于标记物识别的复合物反应物质，且乳腺癌可通过仅仅使用识别出的氨基酸序列来诊断，从而导致建立用于乳腺癌的诊断试剂盒。
附图说明
图1示出从源自H-ras12V肝癌转基因小鼠的B细胞杂交瘤克隆体获得的自身抗体对肝癌细胞的反应性。从上述结果可知，得到TAB-K94抗体。具体地，在固定和透化之后，肝癌细胞系HepG2和Hepa1c1c7利用源自肝癌模型小鼠的自身抗体进行处理，与用荧光物质标记的第二抗体反应，然后进行流式细胞术。
图2示出纯化的TAB-K94抗体的SDS-PAGE电泳的结果。免疫球蛋白M（IgM）类型的TAB-K94抗体使用MBP-琼脂糖或蛋白L-琼脂糖进行纯化，利用用还原剂（R）或非原剂（NR）处理的样本溶液处理10μg的纯化抗体并使其进行10%SDS-凝胶电泳，然后进行考马斯染色。当不利用还原剂处理时，发现IgM具有170kDa或更高的分子量。当利用还原剂处理时，发现重链蛋白和轻链蛋白分别具有72kDa和25kDa的分子量。
图3示出TAB-K94抗体对于各种癌细胞系的反应性以及人癌组织的免疫组织化学染色的结果。(A)示出在利用TAB-K94抗体对各种癌细胞进行细胞内染色之后，通过流式细胞仪测量的反应性。在肝癌细胞系HepG2和乳腺癌细胞系MCF-7中观测到高的反应性，而在正常的细胞系、张氏肝细胞和HT22神经元细胞中观测到较低的反应性。（B）为示出TAB-K94抗体对人癌组织的反应性的免疫组织化学的结果。由于高的非特异反应性，在肝癌组织中几乎没有观测到任何有差异的反应（未示出数据），但在乳腺癌组织中、尤其在入侵前端观测到通过与TAB-K94抗体的反应的强烈的完全染色。
图4示出分析TAB-K94抗体的重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）的互补性决定区（CDR）的结果。从产生TAB-K94抗体的B细胞杂交瘤提取总RNA以合成cDNA，使用用于重链可变区和轻链可变区的互补性决定区的引物来执行PCR扩增，以及，扩增产物连接至pTOP Blunt V2载体以制备重组质粒。在宿主细胞内扩增重组质粒、提取、然后通过序列测定来分析相应的区。从已识别的碱基序列来分析蛋白质序列，然后根据Kabat CDR定义来确定CDR序列。
图5示出用于分析TAB-K94抗体特异性抗原蛋白的蛋白质印迹法和用于识别相应的蛋白质的胶内消化的结果。量化各种癌细胞系的细胞裂解物（CL）和无血清细胞培养基（CCM），分别取其50μg进行10%（w/v）SDS-PAGE，然后使用TAB-K94抗体执行蛋白质印迹法（A）。结果，不仅在乳腺癌细胞系MCF-7的细胞裂解物而且在细胞培养基中观测到极高的反应性。基于这点，MCF-7细胞培养基用于识别TAB-K94抗体特异性抗原。收集过量的细胞培养基、浓缩、然后使用HiTrap-Q离子交换树脂色谱法进行分离。仅仅收集包含TAB-K94抗体特异性抗原的部分、浓缩、然后进行8%-10%(w/v)SDS-PAGE。所收集的包含TAB-K94抗体特异性抗原的部分中的一部分被用于蛋白质印迹以检查TAB-K94抗原的存在，剩余部分被用于考马斯染色以检查蛋白质带。对应于TAB-K94抗体反应的两个蛋白质带用于通过质谱分析法识别蛋白质（B）。
图6示出通过利用CK8特异性siRNA或CK18特异性siRNA处理MCF-7细胞和HT29细胞而抑制CK8表达或CK18表达后的TAB-K94抗体反应性的差异，以证实CK8和CK18确定为TAB-K94抗体特异性抗原。（A）为RT-PCR的结果以检查CK8表达或CK18表达的抑制。（B）和（C）示出利用TAB-K94抗体的流式细胞术和蛋白质印迹法分析的结果。当CK8表达和CK18表达均被抑制时，K94抗体反应在两种情况下都下降。
图7为示出TAB-K94抗体为针对借助利用重组蛋白检查而识别的CK8/18复合物的抗体的结果。为了检查TAB-K94抗体对由蛋白质识别证实的CK8和CK18的反应性，制备CK8（MW：54.8kDa，包括标签序列）和CK18（MW：53kDa，包括标签序列）重组蛋白。在（A）中，在SDS-PAGE上通过考马斯染色来分析重组蛋白，通过使用对于每一蛋白特异的抗体（CK8特异性抗体或CK18特异性抗体）来检查正确的重组蛋白的表达。（B）为蛋白质印迹法以检查上述所证实的每一蛋白或其合物对TAB-K94抗体的反应性的结果。结果是，当CK8或CK18单独进行时，观测不到TAB-K94抗体反应，但是当进行CK8/18混合物时，观测到反应。在（C）中，为了证实仅仅当CK8和CK18形成蛋白质复合物时才表现出对TAB-K94抗体的反应性，示出了在使TAB-K94抗体反应前进行CK18蛋白或CK8蛋白到PVDF膜的处理的情况下诱导其对于TAB-K94抗体的反应性。执行CK8、CK18或CK8/18混合物的ELISA用于分析。
图8示出TAB-K94抗体的精细表位定位的结果。将CK18蛋白制备成大小不同的截短的重组蛋白。如在（A）中示意性示出的，CK18（氨基酸1-70）、CK18（氨基酸1-125）、CK18（氨基酸1-193）、CK18（氨基酸1-284）、和CK18（氨基酸1-400）被表示为CK18截短变异体。每一重组蛋白经SDS-PAGE进行分离且执行蛋白免疫印迹以检查在CK8重组蛋白或CK18重组蛋白处理后对于TAB-K94抗体的反应性，这在（B）中示出。结果，确定了仅在对应于CK18的氨基酸194-284的区域的存在下形成的复合物示出对TAB-K94抗体的反应性。（C）为证实上述结果的ELISA的结果。通过以等量混合CK8重组蛋白和CK18截短的重组蛋白制备的混合物被包被，检查对于TAB-K94抗体的反应性。
图9示出了TAB-K94抗体以及由CK8抗体或CK18抗体识别的抗原的细胞内定位的荧光染色的结果。在CK8蛋白和CK18蛋白的染色结果中，在整个细胞质以及细胞核中观测到表达，然而在TAB-K94抗体的染色结果中，染色强烈定位在细胞膜中，这对应于CK8/18复合物形成的区域。
图10示出了对于TAB-K94抗体的噬菌体肽文库筛选的结果。通过筛选，表达TAB-K94抗体特异性抗原的噬菌体被选择。使用TAB-K94抗体执行5轮筛选。（A）示出根据筛选轮的数目而扩增的噬菌体的数目，且具有不同肽序列的两种噬菌体（K94p1、K94p7）被选择。（B）为用以检查选择的噬菌体对于TAB-K94抗体的反应性的ELISA的结果，示出K94p1噬菌体具有TAB-K94抗体特异性反应性。
图11示出使用选择的K94p1分析乳腺癌患者的血清以及正常个体的血清的结果。（A）为使用K94p1分析乳腺癌患者的血清和正常个体的血清的ELISA的结果，K94p1是作为包被抗原的表达TAB-K94抗体特异性肽的噬菌体。结果，在（B）中示出，当截断值确定为0.056时，可以以50%灵敏度和82.61%特异性诊断乳腺癌患者。
图12为使用选择的K94p1分析肝癌患者的血清和正常个体的血清的结果。使用K94p1执行ELISA，K94p1是作为包被抗原的表达TAB-K94抗体特异性肽的噬菌体，以分析肝癌患者和正常个体的血清。结果，与乳腺癌中的结果不同，在肝癌患者的血清和正常患者的血清之间无显著差异。
具体实施方式
在为了实现上述目的的一个实施方式中，本发明提供了一种细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体或者其包括抗原结合位点的片段。
本文中所使用的术语“细胞角蛋白（CK）”是一种中间丝状体，且指主要在上皮细胞中发现的丝状体。CK是形成细胞骨架的必要成分，且维持完整的细胞形状以及固定细胞核。总共存在20种不同的亚型。CK表达与在人体的各种上皮细胞内的成熟或分化的程度相关，且CK同种型取决于细胞类型以及CK在细胞质中的定位。不同的CK类型取决于CK是酸性类型还是碱性类型、以及其分子量，各种CK的分布在整个人体的几种上皮细胞之间存在差异。
本文中所使用的术语“细胞角蛋白8/18复合物”指细胞角蛋白8和其互补的亚单位细胞角蛋白18的复合物。在正常组织中，细胞角蛋白8或细胞角蛋白18主要在腺上皮细胞或移行上皮细胞以及肝细胞中表达，然而其表达在乳腺癌和结肠癌中通常是下降的，而在头颈癌中增大。据报道，CK表达诱导癌发展以及不良预后。然而，在乳腺癌患者的血清中尚没有发现针对细胞角蛋白8或细胞角蛋白18的自身抗体，且本申请的发明人首次建立了细胞角蛋白8/18特异性自身抗体且证明了该细胞角蛋白8/18特异性自身抗体可用于诊断乳腺癌。
本文中所使用的术语“自身抗体”指与自身蛋白进行特异反应的抗体。身体通常不启动针对其自身抗原的免疫响应，因此不产生抗体。偶然地，身体将其自身的蛋白识别为抗原以产生抗体，导致自身免疫性疾病，例如全身性红斑狼疮和类风湿性关节炎。另一方面，本发明的自身抗体指针对伴随异常肿瘤生长的癌细胞相关的抗原的抗体。具体地，本发明的自身抗体指的是针对肿瘤相关抗原（细胞角蛋白8/18复合物）的自身抗体。
在本发明中，在乳腺癌组织中高度表达的针对细胞角蛋白8/18复合物的自身抗体的抗原结合位点被识别，且相应的抗体被指定为‘TAB-K94抗体’、‘TAB-K94自身抗体’或‘自身抗体TAB-K94’。为了研究自身抗体的特性，本申请的发明人对本发明的自身抗体执行序列分析。结果发现本发明的自身抗体包括重链可变区和轻链可变区，该重链可变区包括由SEQ ID NO.3表示的重链CDR1、由SEQ ID NO.4表示的重链CDR2、以及由SEQ ID NO.5表示的重链CDR3，该轻链可变区包括由SEQ ID NO.6表示的轻链CDR1、由SEQ ID NO.7表示的轻链CDR2、以及由SEQ ID NO.8表示的轻链CDR3，并且本发明的自身抗体包括由SEQ ID NO.1表示的重链氨基酸序列和由SEQ ID NO.2表示的轻链氨基酸序列。通常，单个抗体分子具有两条重链和两条轻链，且每一重链和每一轻链在其N-末端均包括可变区。每一可变区由三个互补性决定区（CDR）和四个框架区（FR）组成，且互补性决定区确定抗体的抗原结合特异性，且在可变域内作为由保守框架区支撑的相对短的肽序列存在。优选地，本发明的自身抗体可包括由作为重链可变区的一部分的SEQ ID NO.3的CDR1序列、SEQID NO.4的CDR2序列或者SEQ ID NO.5的CDR3序列、或者其包括抗原结合位点的片段组成的自身抗体，且本发明的自身抗体可为包括CDR1序列、CDR2序列和CDR3序列或者这些序列的片段的全部的自身抗体。此外，本发明的自身抗体可包括由作为轻链可变区的一部分的SEQ ID NO.6的CDR1序列、SEQID NO.7的CDR2序列或者SEQ ID NO.8的CDR3序列或者其包括抗原结合位点的片段组成的自身抗体。此外，显然，编码这些序列的核酸序列也包括在本发明中。
更优选地，本发明的自身抗体可包括由作为重链可变区序列的SEQ ID NO.1的氨基酸序列或者其包括抗原结合位点的片段构成的自身抗体以及由作为轻链可变区序列的SEQ ID NO.2的氨基酸序列或者其包括抗原结合位点的片段构成的自身抗体。此外，重链和轻链可根据目的被单独使用或者一起使用；并且取决于本领域技术人员的目的，根据典型基因工程方法可进行多个CDR序列和轻链和重链的任意组合。
关于在乳腺癌中形成针对细胞角蛋白8/18复合物的自身抗体还没有报道。尤其是，本申请的发明人首次研究了在患有乳腺癌的个体中针对细胞角蛋白8/18复合物的自身抗体显著增加，这导致了细胞角蛋白8/18复合物的表位的拟肽序列的识别。
本发明的自身抗体包括编码两个全长重链或者具有该抗体分子的免疫学活性的片段的多核苷酸以实现抗体抗原结合。此外，本发明的自身抗体包括编码两个全长轻链或者具有该抗体分子的免疫学活性的片段的多核苷酸以实现抗体抗原结合。具有抗体分子的免疫学活性的片段表示持有抗原结合能力的片段，该抗体片段的示例包括：（i）由轻链可变区（VL）、重链可变区（VH）、轻链恒定区（CL）和重链恒定区1（CH1）组成的Fab片段；（ii）由VH域和CH1域组成的Fd片段；（iii）由单克隆抗体的VL域和VH域组成的Fv片段；（iv）由VH域组成的dAb片段（Ward ES等，Nature341:544-546(1989)）；（v）隔离的CDR区；（vi）F(ab')2片段，包括两个连接的Fab片段的二价片段；（vii）单链Fv分子（scFv），其中VH域和VL域通过连接肽连接，该连接肽允许两个域连接以形成抗原结合位点；（viii）双特异性单链Fv二聚物（PCT/US92/09965）和（ix）“双链抗体”，通过基因融合构成的多价的或多特异性片段（WO94/13804），但不限于此。优选地，本发明的自身抗体或者其包括抗原结合位点的片段可为：由入藏号KCTC11799BP的杂交瘤细胞系产生的自身抗体或者其包括抗原结合位点的片段，更优选地为识别作为表位的由SEQ ID NO.21表示的ISPDAHS（Ile-Ser-Pro-Asp-Ala-His-Ser）的氨基酸序列、由SEQ ID NO.22表示的TLSHTRT（Thr-Leu-Ser-His-Thr-Arg-Thr）的氨基酸序列、由SEQ ID NO.27表示的ISPGAHS（Ile-Ser-Pro-Gly-Ala-His-Ser）的氨基酸序列、由SEQ ID NO.28表示的IAPDAHS（Ile-Ala-Pro-Asp-Ala-His-Ser）的氨基酸序列、由SEQ ID NO.29表示的ISADAHS（Ile-Ser-Ala-Asp-Ala-His-Ser）的氨基酸序列、由SEQ ID NO.30表示的ISPDAAS（Ile-Ser-Pro-Asp-Ala-Ala-Ser）的氨基酸序列、或者由SEQ IDNO.31表示的ISPDAHA(Ile-Ser-Pro-Asp-Ala-His-Ala)的氨基酸序列的自身抗体或者其包括抗原结合位点的片段；并且最优选地，识别由SEQ ID NO.21表示的ISPDAHS的氨基酸序列、由SEQ ID NO.28表示的IAPDAHS的氨基酸序列、或者由SEQ ID NO.31表示的ISPDAHA的氨基酸序列的自身抗体或其包括抗原结合位点的片段，其中，在20种必需氨基酸中，I表示异亮氨酸（Ile）、S表示丝氨酸（Ser）、P表示脯氨酸（Pro）、D表示天冬氨酸（Asp）、A表示丙氨酸（Ala）、H表示组氨酸（His）、T表示苏氨酸（Thr）、L表示亮氨酸（Leu）、R表示精氨酸（Arg）以及G表示甘氨酸（Gly）。
为了识别与本发明的自身抗体结合的表位序列，本申请的发明人利用通过7个氨基酸形成环状结构的噬菌体展示环肽文库系统。优选地，选择与细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体特异性结合的噬菌体。从选择的噬菌体中，仅仅纯化示出对本发明的细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体具有高反应性的噬菌体群且将其作为包被抗原，然后检查抗体对抗原的反应性以分析它们的氨基酸序列。
在另一实施方式中，本发明提供了一种多肽，该多肽具有由SEQ ID NO.21表示的ISPDAHS的氨基酸序列、由SEQ ID NO.22表示的TLSHTRT的氨基酸序列、由SEQ ID NO.27表示的ISPGAHS的氨基酸序列、由SEQ ID NO.28表示的IAPDAHS的氨基酸序列、由SEQ ID NO.29表示的ISADAHS的氨基酸序列、由SEQ ID NO.30表示的ISPDAAS的氨基酸序列、或者由SEQ ID NO.31表示的ISPDAHA的氨基酸序列，所述的氨基酸序列为与本发明的自身抗体特异结合的表位。
优选地，包括7个氨基酸的多肽被制备成在两端包括附加的半胱氨酸（Cys；C），以CX7C的形式，从而所述多肽能够形成稳定的环状结构。这样的多肽可用作检测本发明的自身抗体的表位-模拟肽。在本发明的具体示例中，使用表达环状肽文库（其中在其两端具有半胱氨酸的7个氨基酸形成环状结构，Ph.D.-C7C噬菌体展示肽文库试剂盒；New England Biolabs）的噬菌体从随机序列中识别对TAB-K94抗体示出高反应性的由SEQ ID NO.21表示的ISPDAHS（表2）。另外，所述序列的每一氨基酸残基被甘氨酸或丙氨酸取代以检查其反应性，从而识别由SEQ ID NO.27至SEQ ID NO.31表示的表位模拟多肽，其部分地或者近似全部地维持抗体反应性（表3）。
在另一实施方式中，本发明提供一种用于诊断乳腺癌的组合物，该组合物包括能够测量本发明的自身抗体的表达水平或者该自身抗体的包括抗原结合位点的片段的表达水平的试剂。
在本文中所使用的术语“诊断”指评估病理状态的存在或性质。关于本发明的目的，诊断不仅包括乳腺癌发生率的确定，而且还包括治疗效果（包括复发、转移扩散、以及药物反应性和抗药性）的预测。优选地，本发明的针对细胞角蛋白8/18复合物的自身抗体用于确定从疑似患有乳腺癌的个体分离出的样本中的细胞角蛋白8/18的表达水平，从而预测个体的预后以及诊断乳腺癌的发生率。优选地，自身抗体可为特异性识别由SEQ ID NO.21表示的ISPDAHS的氨基酸序列、由SEQ ID NO.28表示的IAPDAHS的氨基酸序列、或者由SEQ IDNO.31表示的ISPDAHA的氨基酸序列的抗体，但不限于此。
在本文中所使用的术语“从个体分离出的样本”指在细胞角蛋白8/18复合物的表达水平上示出差异性的组织、细胞、全血、血清、血浆、唾液、痰、脑脊髓液或尿，但不限于此。
在本文中所使用的术语“诊断标记物、用于诊断的标记物”意在表示能够通过将癌细胞与正常细胞区别开来诊断癌症的物质。优选地，本发明的诊断标记物可为与细胞角蛋白8/18复合物特异性结合的自身抗体以用于诊断乳腺癌。在本发明的示例中，本发明的组合物用于执行乳腺癌组织的免疫组织化学染色。结果发现，该组合物特异性地染色仅在乳腺癌中过度表达的细胞角蛋白8/18复合物，尤其是，与包括本发明的自身抗体的组合物的反应在乳腺癌组织的入侵前端区中是突出的（图3B）。
在本文中所使用的术语“乳腺癌”指从乳腺细胞中形成的恶性肿瘤，且通常指在乳腺的导管和小叶中形成的癌。尚未明确乳腺癌的风险因素，但诸如雌激素、年龄、分娩经历、饮酒、以及家族史的因素与乳腺癌风险增大是相关联的。据报道，0期乳腺癌的5年存活率高达100%，但是4期乳腺癌的5年存活率低于20%。存在手术、化学疗法、放射、和激素疗法的治疗选项。因此，早期诊断是最重要的。相应地，本申请的发明人证实本发明的自身抗体用于以高度特异性诊断乳腺癌的发生（图11和图12）。由于释放到血液中的肿瘤特异蛋白的半存留期缩短，故检测癌中过度表达的蛋白的常规方法并不适合于诊断癌。因此，肿瘤特异蛋白用作癌症的诊断标记物存在问题。本发明的针对细胞角蛋白8/18复合物的自身抗体具有示出高的检测灵敏度的长的半存留期，且诸如血液的样本也可通过非侵入性方法从患者简单采集。因此，本发明的自身抗体适合用作癌的诊断标记物。
在本文中所使用的术语“能够测量细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体的表达水平的试剂”指用于通过测量在患有乳腺癌的个体或者疑似患有乳腺癌的个体的全血、血清、血浆、淋巴液和间质液中过度表达的细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体（标记物）的表达水平来检测该标记物的分子。优选地，该试剂可为与自身抗体特异性结合的多肽。与该自身抗体特异性结合的多肽可为具有由SEQ ID NO.21表示的ISPDAHS的氨基酸序列、由SEQ ID NO.22表示的TLSHTRT的氨基酸序列、由SEQ ID NO.27表示的ISPGAHS的氨基酸序列、由SEQ ID NO.28表示的IAPDAHS的氨基酸序列、由SEQ ID NO.29表示的ISADAHS的氨基酸序列、由SEQ ID NO.30表示的ISPDAAS的氨基酸序列、或者由SEQ ID NO.31表示的ISPDAHA的氨基酸序列的多肽。通过在该多肽的两端添加半胱氨酸，该多肽可被制备成具有稳定的环状结构，且还与载体蛋白制备成融合蛋白的形式以获得表位的有效表达结构。本文中所使用的术语“载体蛋白”指与所需要的蛋白质或多肽结合的蛋白或其片段以有效地维持表位的表达。载体蛋白可为GFP（绿色荧光蛋白）、HAS（人血清白蛋白）、或者MBP（麦芽糖结合蛋白），但不限于此，且优选为MBP。在本发明的具体示例中，未示出与人血清非特异性结合的MBP被用作载体蛋白以制备本发明的融合蛋白形式的多肽，以增大诊断试剂盒的灵敏度和特异性（示例13）。
用于测量表达水平的分析方法包括但不限于蛋白免疫印迹、ELISA（酶联免疫吸附测定）、放射免疫测定（otA）、放射免疫扩散、Ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组织化学染色、免疫沉淀分析、补体结合试验、FACS、和蛋白芯片分析。通过以上检测方法，在正常对照样本中的抗原-抗体复合物的形成可与患有乳腺癌的个体或疑似患有乳腺癌的个体中的抗原-抗体复合物的形成比较，从而诊断疑似患有乳腺癌的患者的乳腺癌的发生率。
乳腺癌的诊断方法可通过本发明的细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体和与该自身抗体特异性结合的抗原之间的抗体-抗原反应来实现。在本文中所使用的术语“抗原-抗体复合物”用于指乳腺癌标记物自身抗体和对该自身抗体特异性的抗原的结合产物。所形成的抗原-抗体复合物的量可通过测量检测标签的信号强度来定量地确定。优选地，本发明中的抗原-抗体复合物可为细胞角蛋白8/18复合物特异性抗体与对该抗体特异性的抗原的结合产物。
这样的检测标签可选自酶、荧光物质、配体、发光物质、微粒、氧化还原分子和放射性同位素，但本发明不限于这些示例。可用作检测标签的酶的示例包括但不限于β-葡萄糖醛酸酶、β-D-葡糖苷酶、β-D-半乳糖苷酶、脲酶、过氧化物酶或者碱性磷酸酶、乙酰胆碱酯酶、葡糖氧化酶、己糖激酶和GDPase、核糖核酸酶、葡萄糖氧化酶和荧光素酶、磷酸果糖激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧激酶、天冬氨酸氨基转移酶、磷酸烯醇式丙酮酸脱羧酶、和β-内酰胺酶。荧光物质的示例包括但不限于荧光素、异硫氰酸酯、若丹明、藻红蛋白、藻青蛋白、别藻蓝素、邻苯二甲醛和荧光胺。配体的示例包括但不限于生物素衍生物。发光物质的示例包括但不限于吖啶酯、荧光素和荧光素酶。微粒的示例包括但不限于胶体金和彩色乳胶。氧化还原分子的示例包括但不限于二茂铁、钌复合物、紫碱、醌、Ti离子、Cs离子、二酰亚胺、1,4-苯醌、氢醌、K4W(CN)8、[Os(bpy)3]2+、[RU(bpy)3]2+、和[MO(CN)8]4-。放射性同位素的示例包括但不限于3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I和186Re。
此外，本申请的发明人通过以下实验证明了与CK8/18复合物特异性结合的媒介体可被用作乳腺癌的诊断标记物。
首先，从肝癌小鼠模型获取脾细胞作为亲本细胞，将其与骨髓瘤细胞融合以产生B细胞杂交瘤。从所产生的杂交瘤细胞分泌的抗体中，选择出表现为与肝癌细胞具有反应性的抗体以分离出本发明的TAB-K94自身抗体（图1）。
此后，检查与所分离的自身抗体进行反应的抗原的存在。为了更具体地分析抗原，纯化大量的分离的自身抗体TAB-K94，且进行MBP-琼脂糖（甘露糖结合蛋白-琼脂糖）或蛋白L-琼脂糖纯化以检查抗原的细胞内表达位点（在细胞膜中的表达）以及识别相应的自身抗原蛋白（图2）。
另外，本申请的发明人使用由7个氨基酸构成的噬菌体展示肽文库检查特异表位序列，以识别与纯化的自身抗体结合的表位序列（表2）。使用已识别的噬菌体序列作为包被抗原以及已识别的自身抗体作为第一抗体来进行ELISA，以识别示出高反应性的抗原组。找出示出最高反应性的抗原（利用指定为K94p1和K94p7的噬菌体文库进行识别）且将其指定为K94抗原或K94自身抗原（图10）。另外，检查所识别的抗原的类型和功能。结果，发现对应的抗原为细胞角蛋白8/18复合物（图5、图6和图7，和表1）。
在另一实施方式中，本发明提供了一种产生本发明的自身抗体的培养基细胞系。
在文中所使用的术语“培养基”指的是由两种不同的细胞的人工融合得到的细胞，以及通过使用诱导细胞融合的物质（诸如聚乙二醇或一种病毒）制备的两种或更多种同源细胞或异源细胞的融合细胞。杂交瘤细胞将不同细胞的不同功能并到一个细胞内且由淋巴细胞表示。尤其，通过骨髓瘤细胞和B细胞（其为负责在脾或淋巴结中的淋巴细胞中产生抗体的前体细胞）的融合而制备的杂交细胞产生单克隆抗体且因此被广泛用在科研或临床试验中。此外，在实际中也使用产生淋巴激活素（生理活性物质）的T细胞及其肿瘤细胞的杂交瘤。产生本发明的自身抗体的杂交瘤细胞可通过本领域技术人员对本领域已知的细胞进行修饰来适当制备。在本发明的一个实施例中，小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0和B细胞被融合且被培养，然后仅选择产生肝癌细胞反应性抗体的B细胞杂交瘤细胞且将其指定为TAB-K94，其于2010年10月29日以入藏号KCTC11799BP存放在韩国生物科学和技术研究所的生物资源中心。优选地，杂交瘤细胞系可为入藏号为KCTC11799BP的细胞系。
在另一实施方式中，本发明提供了一种用于诊断乳腺癌的试剂盒，其包括本发明的组合物。
在文中所使用的术语“与细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体特异性结合的抗原”包括所有的能够与该自身抗体特异性结合的蛋白，不限于特定的蛋白或多肽。优选地，抗原可包括其任何片段或者其任何变异体，只要其可以被细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体识别。抗原可由7至16个氨基酸组成，优选可包括430个氨基酸或483个氨基酸。更优选地，抗原可为可被本发明的自身抗体标记物识别的表位序列。表位序列在其大小或类型方面不受限制，只要其为本发明的自身抗体所识别的序列即可，且优选地，该表位序列可为由7个氨基酸组成的多肽序列。由7个氨基酸组成的序列可为包括一个多肽或多个多肽的序列，该多肽选自ISPDAHS（Ile-Ser-Pro-Asp-Ala-His-Ser）、TLSHTRT（Thr-Leu-Ser-His-Thr-Arg-Thr）、ISPGAHS（Ile-Ser-Pro-Gly-Ala-His-Ser）、IAPDAHS（Ile-Ala-Pro-Asp-Ala-His-Ser）、ISADAHS（Ile-Ser-Ala-Asp-Ala-His-Ser）、ISPDAAS（Ile-Ser-Pro-Asp-Ala-Ala-Ser）、和ISPDAHA（Ile-Ser-Pro-Asp-Ala-His-Ala），但本发明的自身抗体所识别的序列的类型不限于这些示例。本申请的发明人使用7个肽展示噬菌体识别了由本发明的自身抗体识别的序列。结果，发现本发明的自身抗体对ISPDAHS（Ile-Ser-Pro-Asp-Ala-His-Ser）的序列表现出相当高的反应性（表2）。
本发明的用于乳腺癌的诊断试剂盒可不仅包括用以测量作为乳腺癌的诊断标记物的细胞角蛋白8/18复合物的表达水平的引物、探针、或者选择性识别该标记物的抗体，而且还包括适于该分析方法的其他组分的一种或多种组合物、溶液、或者装置。
另外，用于测量从编码诊断标记物的基因—细胞角蛋白8/18复合物基因表达的蛋白的表达水平的试剂盒可包括基质、合适的缓冲溶液、着色酶、或者标记有用于抗体的免疫学检测的荧光物质、着色底物等的第二抗体。关于基质，可使用硝酸纤维素膜、由聚乙烯树脂制成的96孔板、由聚苯乙烯树脂制成的96孔板、以及载玻片。关于着色酶，可使用过氧化物酶和碱性磷酸酶。关于荧光物质，可使用FITC和RITC，关于着色底物溶液，可使用ABTS（2,2'-联氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)）、OPD（邻苯二胺）或TMB（四甲基联苯胺）。
测量蛋白水平的分析方法包括但不限于蛋白免疫印迹、ELISA（酶联免疫吸附测定）、放射免疫测定（otA）、放射免疫扩散、Ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组织化学染色、免疫沉淀分析、补体结合试验、FACS、以及蛋白质芯片分析，且优选地，本发明的试剂盒可为具有细胞角蛋白8/18复合物或细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体的表位且使用ELISA的试剂盒。
可通过ELISA测量蛋白质的表达水平。ELISA的示例包括：直接ELISA，其使用标记抗体识别固定在固相载体上的抗原；间接ELISA，其使用标记抗体识别抗体复合物中的捕捉抗体，该捕捉抗体识别在固相载体上固定的抗原；直接夹心ELISA，其使用另一标记抗体识别固定在固相载体上的抗原-抗体复合物中的抗原；和间接夹心ELISA，其中，识别固定在固相载体上的抗原-抗体复合物中的抗原的另一标记抗体进行反应，然后使用识别该先前抗体的标记的第二抗体。例如，通过夹心ELISA检测蛋白质表达水平，其中，样本与固定在固相载体上的抗体反应，通过添加对抗原特异的标记抗体、然后进行酶显色来检测所得到的抗原-抗体复合物，或者通过添加对识别抗原-抗体复合物中的抗原的抗体特异的标记的第二抗体、然后进行酶显色来检测所得到的抗原-抗体复合物。可通过测量诊断标记物（细胞角蛋白8/18复合物）与其抗体的复合物形成的程度来诊断乳腺癌的发生率。在本发明的一个示例中，与本发明的自身抗体反应的表位序列使用7个肽噬菌体文库进行识别、与第一抗体进行反应、然后与IgGAM-HRP反应、随后检查抗原-抗体复合物的形成及形成的量。结果，在正常个体的血清和乳腺癌个体的血清之间的图案具有明显的差异。
当以这样的方式进行检测细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体或诊断乳腺癌时，可以高特异性和高灵敏度诊断乳腺癌。在本发明的优选的实施方式中，ELISA（酶联免疫吸附测定）用于执行该检测。结果，可以以50%的灵敏度和82.61%的特异性诊断患有乳腺癌的个体且将其与正常的个体进行区分。
此外，可使用针对诊断标记物的一种或多种抗体来执行蛋白免疫印迹。总蛋白从样本中分离出来、经电泳以根据尺寸分离、转移到硝酸纤维膜上、然后与抗体进行反应。通过使用标记的抗体来测量产生的抗原-抗体复合物的量来确定由基因表达产生的蛋白的量，从诊断乳腺癌的发生率。
此外，使用一种或多种针对标记物的抗体通过免疫组织化学染色来测量蛋白质表达水平。收集并固定来自乳腺癌患者或疑似患有乳腺癌的个体的组织样本，然后根据普遍已知的方法制备石蜡包埋块。根据已知的方法，将石蜡包埋块切成几微米厚的小切片，附到载玻片上以与本发明的自身抗体的包括抗原结合位点的片段进行反应。随后，冲洗未反应的抗体，反应的抗体利用选自上述检测标签中的一种标签进行标记，然后在显微镜下观测。
可使用蛋白质芯片，在蛋白质芯片中，针对标记物的一种抗体或多种抗体以高的密度布置且固定在基板上预定的位置处。就这点而言，蛋白质从样本中分离出来且与蛋白质芯片进行杂交以形成抗原-抗体复合物，然后，该抗原-抗体复合物被读取以检查所关注的蛋白的存在或表达水平，从而诊断乳腺癌的发生。
在另一实施方式中，本发明提供了一种用于诊断乳腺癌的方法，包括使用本发明的组合物检测细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体或其包括抗原结合位点的片段。
优选地，本发明的用于检测细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体的方法可包括以下步骤：（a）测量来自疑似乳腺癌患者的生物样本中的细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体或者其包括抗原结合位点的片段的表达水平；和（b）将所测量的蛋白质水平与正常的对照样本的蛋白质水平相比较。
本文所使用的术语“个体”包括马、狗、猫、猪、山羊、兔、仓鼠、猴子、豚鼠、大鼠、小鼠、蜥蜴、蛇、绵羊、牛、鱼、和鸟，而没有限制，并且可指任何动物（例如人类），且广泛包括这些动物的细胞系，而没有限制。
本文所使用的术语“对照组”为源自表现出比乳腺癌或疑似乳腺癌低的细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体的表达水平的个体的样本，并且指使用本发明的细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体通过抗原-抗体反应被用作用于诊断乳腺癌的标准的样本。
本文所使用的术语“样本”指选自全血、血清、血液、血浆、唾液、尿、痰、淋巴液、脑脊髓液、和间质液的任何一种或多种样本，该样本在乳腺癌的诊断标记物（细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体）的表达水平上具有差异，但不限于此。
此外，用于测量蛋白表达水平的分析方法包括蛋白免疫印迹、ELISA（酶联免疫吸附测定）、放射免疫测定（otA）、放射免疫扩散、Ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组织化学染色、免疫沉淀分析、补体结合试验、FACS和蛋白芯片分析，但用于测量蛋白表达水平的方法并不限于这些示例。
在另一实施方式中，本发明提供了一种用于筛选用于乳腺癌的治疗剂的方法，包括以下步骤：（a）测量细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体的表达水平；（b）施用用于乳腺癌的候选治疗剂；和（c）与步骤（a）中的细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体的表达水平相比，检查细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体的表达水平是否下降。
在步骤（a）中，可通过本领域中常用的方法执行测量细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体的表达水平的步骤，而没有限制，常用方法的示例包括蛋白免疫印迹、ELISA（酶联免疫吸附测定）、放射免疫测定（otA）、放射免疫扩散、Ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组织化学染色、免疫沉淀分析、补体结合试验、FACS和蛋白芯片分析。
步骤（b）和步骤（c）为筛选用于乳腺癌的治疗剂的步骤，包括施用用于乳腺癌的候选治疗剂以及检查细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体的表达水平与用该候选物质治疗之前相比是否下降的步骤。
本文中所使用的术语“用于乳腺癌的候选治疗剂”指预计治疗乳腺癌的物质。可使用任何物质而没有限制，只要预计该物质直接或间接地减轻或改善乳腺癌即可。该用于乳腺癌的候选治疗剂包括全部候选的治疗物质，例如化合物、基因或蛋白质。本发明的筛选方法检查在施用候选物质之前和施用候选物质之后的细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体的表达水平。当表达水平与施用前相比降低时，相应的候选物质可被确定为用于乳腺癌的治疗剂。
在另一实施方式中，本发明提供了细7胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体或其包括抗原结合位点的片段在诊断乳腺癌中的用途。
在下文中，将结合下面实施例更详细地描述本发明。然而，这些实施例仅出于示例性目的，并不用于限制本发明。
实施例1.产生自身抗体的细胞群和产生K94自身抗体的细胞的获取
为了获取在癌变期间产生的自身抗体，利用据报道形成类似人肝癌的肝癌的H-ras12V转基因小鼠。从患有肝癌的H-ras12V转基因小鼠获取脾细胞作为B细胞组，将脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0融合以制备B细胞杂交瘤细胞系。根据常见的B细胞杂交瘤制备方法执行细胞融合。使用HAT培养基（次黄嘌呤-氨基喋呤-胸苷培养基）执行融合细胞的初级选择，并且仅克隆形成细胞被分离培养。在这些培养的细胞中，仅仅选择和保持检测到癌细胞反应性的抗体的培养基中的细胞。
在固定和透化、然后细胞内染色之后，通过癌细胞系的流式细胞检测分析来检查自身抗体对癌细胞的反应性。如下详细描述该方法。利用胰蛋白酶处理肝癌细胞系HepG2或Hepa1c1c7（70%至80%克隆率），使其与细胞培养板分离以及用PBS冲洗。每2×105个细胞添加100μl的细胞固定/细胞通透（Cytofix/Cytoperm）溶液（BD），细胞在4℃下培育20分钟，用于固定和透化。在培育后，添加1ml的细胞冲洗/细胞通透溶液（BD）并搅匀。然后，混合物以1700rpm离心5分钟，冲洗细胞团块。将50μl的第一抗体溶液（B细胞杂交瘤细胞培养基或纯化的第一抗体溶液）添加到冲洗后的样本中，在4℃下进行培育40分钟。在培育后，冲洗细胞三次，利用抗小鼠Igs-RPE(DaKo)在4℃下处理40分钟。然后，再冲洗细胞三次，使细胞团块再次悬浮在300μl的PBS中，然后使用FACSCaliber（BD）进行分析。获取且比较对应于抗体反应的荧光的平均值。将50μl的不含小鼠抗体的DMEM培养基添加到不显示抗体反应的对照组中。
结果，得到许多产生自身抗体的克隆体。在这些克隆体当中，在本发明中研究了TAB-K94单克隆抗体（图1）。
产生所述TAB-K94单克隆抗体的杂交瘤细胞系于2010年10月29日以入藏号KCTC11799BP被存放在生物资源中心（KCTC），韩国生物科学和生物技术研究所（KRIBB）。
实施例2.TAB-K94单克隆抗体的纯化
为了分析针对TAB-K94自身抗体的抗原，需要纯化的抗体。将通过培养大量的产生TAB-K94抗体的克隆体或者产生TAB-K94抗体的细胞得到的细胞培养基注射到小鼠的腹腔内，由此获得腹水液且利用该腹水液用于抗体纯化。使用通常使用的同型ELISA来识别TAB-K94抗体的类型为IgM。MBP-琼脂糖（甘露糖结合蛋白固定的琼脂糖：Pierce）或蛋白L琼脂糖被用在亲和层析中以用于IgM纯化。在SDS-电泳后，纯化的抗体通过考马斯染色进行检查，在使用前执行蛋白量化（图2）。
实施例3.TAB-K94抗体的针对癌细胞系的反应性以及乳腺癌组织的免疫 组织化学染色
以与实施例1相同的方式对各种癌细胞系进行细胞内染色后，通过流式细胞检测分析检查TAB-K94自身抗体针对各种癌细胞系的反应性（图3A）。结果，在肝癌细胞系HepG2和乳腺癌细胞系MCF-7中，TAB-K94抗体反应性蛋白的表达显著增加（图3A）。
基于针对癌细胞的反应性，使用TAB-K94抗体，通过对人肝癌组织和乳腺癌组织进行免疫组织化学染色来检查TAB-K94抗体反应性抗原的表达。结果，在肝癌组织中没有观测到明显的反应（数据未示出），但在乳腺癌组织中、尤其是入侵前端观测到细胞膜周围有的强烈染色（图3B）。这些结果表明，与肝癌相比，TAB-K94抗原更适合于诊断乳腺癌。
实施例4.TAB-K94抗体的互补性决定区（CDR）的分析
已经证实TAB-K94抗体特异性地识别癌细胞中过度表达的抗原。为了得到关于TAB-K94抗体的抗原特异性的信息，进行相应抗原的互补性决定区（CDR）的序列测定。详细方法如下：
采集大约106个产生TAB-K94抗体的细胞，使用RNA提取试剂盒（Qiagen）从采集的细胞中提取总RNA。使用互补DNA（cDNA）合成试剂盒（Invitrogen）从5μg的总RNA合成cDNA。使用1μg的合成cDNA和小鼠重链引物（5'-CTTCCG GAA TTC SAR GTN MAG CTG SAG SAG TCW GG-3'(SEQ ID NO.17)以及5'-GGA AGA TCT GAC ATT TGG GAA GGA CTG ACT CTC-3'(SEQ ID NO.18)）以及小鼠轻链引物（5'-GGG AGC TCG AYAT TGT GMT SAC MCA RWCTMC A-3'(SEQ ID NO.19)以及5'-GGT GCA TGC GGA TAC AGT TGG TGCAGC ATC-3'(SEQ ID NO.20)），通过聚合酶链反应（PCR）分别对包含CDR的小鼠重链区和小鼠轻链区进行扩增。作为PCR反应混合物，被稀释成最终浓度1X的10X缓冲液、2μl的cDNA、10mM的dNTP（2.5mM/μl）、5U的nPfu聚合酶（Enzynomix,5U/μl）、以及2皮摩尔的每一引物被混合，加水直到最终体积50μl，在94℃下熔化3分钟。扩增进行30个循环，每个循环包括94℃下持续1分钟、63℃下持续1分钟、以及72℃下持续2分钟；在72℃下持续10分钟进行延伸；然后将产物冷却至4℃。在扩增后，利用TOPcloner Blunt试剂盒（Enzynomics）将产物连接到pTOP Blunt V2载体上。将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中，铺展在增补有氨苄青霉素的LB确定的培养板上，在37℃下培养15小时。在该板上形成的群落中的一个群落在LB液体确定成分培养基中培养12小时或更长时间，提取质粒，然后进行序列测定分析。根据所分析的碱基序列，确定蛋白质序列且根据Kabat CDR定义分析该蛋白质序列以确定TAB-K94抗体的CDR。
结果，发现TAB-K94自身抗体具有由SEQ ID NO.11表示的重链CDR1、由SEQ ID NO.12表示的重链CDR2、以及由SEQ ID NO.13表示的重链CDR3、和由SEQ ID NO.14表示的轻链CDR1、由SEQ ID NO.15表示的轻链CDR2、以及由SEQ ID NO.16表示的轻链CDR3（图4）。
实施例5.在各种癌细胞中TAB-K94抗体特异性抗原的表达以及抗原蛋白 的识别
通过蛋白免疫印迹检查各种癌细胞系中的TAB-K94抗体特异性抗原蛋白的表达（图5A）。详细方法如下。收集待分析的细胞且将其溶解在包含PBS的RIPA缓冲液（0.1%(w/v)SDS、0.1%(w/v)脱氧胆酸钠、1.0%(v/v)NP40、蛋白酶抑制剂混合物（Roche））中以用作蛋白分析样本。通过Bradford测定进行蛋白量化。将每50μg所制备的蛋白样本进行10%的还原性的SDS-PAGE，然后转移到PVDF膜上。此后，将该膜封闭在5%(w/v)脱脂奶/TBS（三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水）中，利用第一抗体处理。纯化的TAB-K94抗体以浓度10μg/ml稀释在封闭液中，然后用作第一抗体。在第一抗体处理后，该抗体用TBST（包含0.02%（v/v）吐温-20的TBS）进行彻底冲洗，然后利用第二抗体（抗小鼠IgGAM-HRP）进行处理。随后，通过ECL（增强化学发光）来检测抗体反应性蛋白质带。结果，在包括Hep3B、PLC/PRF/5和SK-Hep1的肝癌细胞系中发现TAB-K94抗体特异性抗原，其作为具有45kDa分子量的带。值得注意的是，在结肠癌细胞HT29和乳腺癌细胞MCF-7中观测到TAB-K94抗体反应性蛋白的过度表达（图5A）。
为了在个体中诱导抗体，特异性蛋白应释放到血液中。即，在细胞内表达的蛋白的细胞外释放有助于自身抗体的诱导。因此，通过蛋白免疫印迹在表达TAB-K94抗体特异性抗原的细胞系的细胞培养基中检查抗原的存在。分别收集10ml不含血清的细胞培养基且浓缩，并且将每50μg的量化的蛋白进行10%的还原性的SDS-PAGE。以与上文相同的方式进行蛋白免疫印迹。结果，在乳腺癌细胞系MCF-7中观测到TAB-K94抗体特异性抗原的过度释放（图5A）。
为了识别TAB-K94抗体特异性抗原蛋白，通过质谱分析法分析从不含血清的MCF-7培养基部分地纯化的TAB-K94抗体特异性抗原蛋白。详细方法如下：收集500ml的不含血清的MCF-7培养基，浓缩以得到6mg的蛋白，然后使用HiTrap-Q（GE healthcare）柱进行分离。从每一部分的蛋白免疫印迹的生成物中，选择包括TAB-K94抗体特异性抗原蛋白的部分、然后利用丙酮沉淀以浓缩。浓缩的抗原蛋白溶液经8-10%的SDS-PAGE分离，其一部分被用于蛋白免疫印迹以检查TAB-K94抗原的存在，且剩下的抗原蛋白溶液被用于考马斯染色以检测蛋白质带。对应于TAB-K94抗体反应的蛋白质带被切割，然后使用胰蛋白酶进行胶内消化（图5B）。在胶内消化后，提取的肽部分进行质谱分析以得到关于蛋白质序列的信息。结果，发现TAB-K94抗体特异性抗原为细胞角蛋白8（CK8）和细胞角蛋白18（CK18）（表1）。
表1
针对TAB-K94抗体的特异性抗原的识别
Figure BDA0000383580960000241
实施例6.TAB-K94抗体特异性抗原蛋白的识别
为了证实通过质谱分析法得到的蛋白识别结果，在细胞中检查TAB-K94抗体反应的减少，在这些细胞中，CK8和CK18的表达通过使用siRNA被抑制。详细方法如下：
作为用于抑制CK8表达和CK18表达的siRNA，使用由Bioneer提供的siRNA（CK8正义：5'-CCG CAG UUA CGG UCA ACC A(dTdT)-3'(SEQ ID NO.23)，CK8反义：5'-UGG UUG ACC GUA ACU GCG G(dTdT)-3'(SEQ ID NO.24)；CK18正义：5'-CUC ACA GAG CUG AGA CGU A(dTdT)-3'(SEQ ID NO.25)，CK18反义：5'-UAC GUC UCA GCU CUG UGA G(dTdT)-3'(SEQ ID NO.26)），然后使用Lipofectamine2000（Invitrogen）将其注射到MCF-7细胞或者HT29细胞中。在siRNA处理后72小时时，收集细胞以提取总RNA，使用5μg的RNA作为模板以合成cDNA。使用对CK8和CK18具有特异性的引物，所合成的cDNA被用作模板以执行聚合酶链反应。所得到的产物在1%琼脂糖凝胶上分析。结果，发现CK8和CK18的表达被抑制了50%或更多（图6A）。
在RT-PCR中示出CK8和CK18的表达被siRNA抑制的细胞以与实施例1和实施例3相同的方式进行流式细胞分析，以检查细胞的TAB-K94抗体反应。结果，在CK8或CK18的表达受抑制的细胞中观测到下降的TAB-K94抗体反应（图6B），这表明CK8和CK18的表达分别与TAB-K94抗体特异性抗原的表达有关。然而，先前研究报道CK8和CK18形成复合物以执行细胞内功能。因此，可设想两种蛋白中的一种蛋白的表达的变化影响另一种蛋白的表达，该设想通过蛋白免疫印迹进行检查。在对CK8或CK18进行siRNA处理后，使用对每一种蛋白有特异性的抗体进行蛋白免疫印迹。结果，每一蛋白的抑制显著地降低了TAB-K94抗体特异性抗原的量。根据使用CK8特异性抗体或CK18特异性抗体的检测结果，发现每一蛋白的量减半。尤其，对应于两种蛋白的截短形式的蛋白质带在强度上也大大降低（图6C），这表明基于CK8蛋白和CK18蛋白的复合物形成检测TAB-K94抗体反应。
实施例7.TAB-K94抗体结合位点的识别：对CK8/18复合物的反应性
在实施例6中，证实TAB-K94抗体特异性抗原蛋白为CK8/CK18复合物。为了进一步证实，制备CK8和CK18重组蛋白以检查TAB-K94抗体对于每一蛋白及其混合物的反应性。详细方法如下：
为了克隆人CK8基因和CK18基因，使用每一特定的引物（CK8F：5'-CCGCAT ATG ATG TCC ATC AGG GTG ACC-3'(SEQ ID NO.32)，R：5'-ATA GTCGAC CTT GGG CAG GAC GTC AGA-3'(SEQ ID NO.33)，CK18F：5'-CCG GAATTC ATG AGC TTC ACC ACT CGC-3'(SEQ ID NO.34)，R：5'-ATA CTC GAGATG CCT CAG AAC TTT GGT-3'(SEQ ID NO.35)）、nPfu DNA聚合酶（Enzynomix）和100ng的MCF-7细胞来源的cDNA（模板）来执行PCR。得到的基因和pET29a(+)载体（Novagen）利用限制性内切酶（CK8:NdeI/SalI；CK18:EcoRI/XhoI）37℃处理15小时，然后以预定的比率混合消化的基因和载体。添加连接酶（Roche），在16℃下进行连接16小时。连接混合物转化至DH5α中，铺展在增补有卡那霉素的LB确定的培养板上，然后在37℃下培养15小时。在该板上形成的群落被选择，然后在LB确定的液体培养基中培养以分离扩增的重组质粒。所分离的质粒的碱基序列被分析且再次转化至BL21（DE3）株系中，以表达CK8和CK18重组蛋白。通过添加IPTG诱导蛋白表达，添加IPTG后，在37℃下培养细胞4小时以得到蛋白质。每一重组蛋白以包含体的形式得到，溶解在8M尿素/PBS（pH7.4）溶液中，用于进一步的试验。所得到的重组蛋白单独地或以混合物的方式进行10%的SDS-PAGE，且对应于期望分子量的带通过考马斯染色检测。相同的凝胶进行蛋白免疫印迹，并且市售的CK8特异性抗体或CK18特异性抗体被用于检查是否得到正确的重组蛋白（图7A）。检查TAB-K94抗体针对这些蛋白或其混合物的反应。结果，CK8蛋白和CK18蛋白均对TAB-K94抗体不显示反应性,然而，CK8蛋白和CK18蛋白的混合物对TAB-K94抗体显示反应性。
可通过蛋白免疫印迹诱导CK8/18复合物形成，还可观测到TAB-K94抗体对所形成的CK8/18复合物的反应性。首先，CK8蛋白或CK18蛋白进行SDS-PAGE，其可被转印到PVDF膜上。利用5%(w/v)脱脂奶/TBS（三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水）处理该膜，然后利用CK8或CK18重组蛋白溶液（50μg/ml的溶解在0.1M碳酸氢钠中的重组蛋白，pH8.6）在室温下处理该膜1小时。利用TBST（包含0.02%（v/v）吐温20的TBS）冲洗重组蛋白处理的膜，然后利用以浓度10μg/ml稀释在封闭液中的TAB-K94抗体在室温下处理该膜1小时。利用TBST充分冲洗该膜，然后用第二抗体（抗小鼠IgGAM-HRP）处理该膜。然后，通过ECL（增强化学发光）检测抗体反应性蛋白质带。结果，单独的CK8蛋白对TAB-K94抗体不显示反应性，但是CK8/CK18复合物诱导与抗体的反应（图7B）。此外，CK8、CK18和CK8/18复合物对TAB-K94抗体的反应性还通过ELISA（酶联免疫吸附测定）进行检查（图7C）。ELISA显示与蛋白免疫印迹相同的结果。即，观测不到TAB-K94抗体对每一蛋白的反应性，但是当两种蛋白的混合物被用作包被抗原时，观测到反应性，这表明TAB-K94抗体对CK8/18复合物示出反应性。这意味着本发明的TAB-K94自身抗体与CK8/18复合物特异性结合。
实施例8.TAB-K94抗体对CK8/18复合物的精细表位定位（Fine Epitope Mapping）
为了TAB-K94抗体对CK8/18复合物的表位定位，制备各种CK18截短的重组蛋白，并且分析TAB-K94抗体对由此形成的CK8/18复合物的反应性。详细方法如下。作为CK18截短的形式，CK18蛋白的氨基酸1-70的表达形式、CK18蛋白的氨基酸1-125的表达形式、CK18蛋白的氨基酸1-193的表达形式、CK18蛋白的氨基酸1-284的表达形式、以及CK18蛋白的氨基酸1-400的表达形式根据CK18重组蛋白的上述制备方法进行制备（图8A）。CK18截短的重组蛋白与CK8重组蛋白和CK18重组蛋白一起在15%SDS-PAGE凝胶上分离，然后进行考马斯染色。相同的凝胶转移到PVDF膜上，然后利用50μg/ml的CK8重组蛋白或CK18重组蛋白处理该膜1小时以诱导复合物形成。此后，使用TAB-K94抗体进行蛋白免疫印迹，并且识别TAB-K94抗体针对CK8/18复合物的表位（图8B）。此外，CK18截短的重组蛋白利用CK8重组蛋白处理以诱导复合物形成，然后该复合物被用作包被抗原以通过ELISA检查其对于TAB-K94抗体的反应性（图8C）。
一并考虑，确定CK18蛋白的氨基酸193-284形成了对于TAB-K94抗体特异的表位。
实施例9:TAB-K94抗原表达的细胞内定位
为了检查TAB-K94抗原表达的细胞内定位，在盖玻片上培养相应的细胞，然后进行细胞内染色，然后使用共聚焦激光显微镜（Zeiss）进行观察。作为第一抗体，以5μg/ml的浓度使用纯化的TAB-K94抗体和CK8特异性抗体或CK18特异性抗体；作为第二抗体，使用抗小鼠IgGAM-FITC。被染色的盖玻片利用包含DAPI的封固溶液进行处理，然后放置在载玻片上。如图9所示，在HepG2细胞、MCF-7细胞和HT29细胞中明显地观测到TAB-K94抗体特异性抗原，且其在整个细胞质中表达，但强烈地定位在细胞膜中。这证实了TAB-K94抗体特异性抗原为CK8/18复合物，因此细胞利用CK8的特异性抗体和CK18的特异性抗体进行染色以与TAB-K94抗体反应的定位相比较。在两种抗原的表达重叠区域中观测到TAB-K94抗体反应。
实施例10.表达TAB-K94抗体特异性肽抗原的噬菌体的测定
TAB-K94抗体特异性表位为用于在人血清中检测针对同一抗原位点的自身抗体的存在的方法的构建中的最重要的因素。为了容易地将反应性位点而不是将整个抗原蛋白用作TAB-K94抗体特异性表位，从肽表达文库中筛选TAB-K94抗体特异性肽抗原。表达环状肽文库（Ph.D.-C7C噬菌体展示肽文库试剂盒；NewEngland Biolabs）的噬菌体被用作肽表达文库，其中存在随机表达的7个氨基酸且两个附加的半胱氨酸残基位于两个末端以形成环状结构。根据制造商的指导进行筛选。详细方法如下：
300ng的TAB-K94抗体和表达2X1011个不同肽的噬菌体病毒粒子在200μl的TBST溶液中彼此混合，在室温下反应20分钟。得到的混合物与25μl的蛋白L-琼脂糖小球（利用封闭液（0.1M NaHCO3、pH8.6、5mg/ml BSA、0.02%(w/v)NaN3）预处理）在室温下反应15分钟。使抗体反应性噬菌体进行离心、并且回收抗体-病毒粒子-蛋白L琼脂糖结合物形式的细胞团块。使用TBST冲洗细胞团块数次，然后使用1ml的洗脱缓冲液（pH2.2）（0.2M Glycine-HCl、pH2.2、1mg/ml BSA）进行洗脱。紧接着，将1M Tris-HCl溶液（pH9.1）添加到细胞团块中用于pH中和。洗脱后的噬菌体的一部分用于滴定，剩余的部分用于噬菌体扩增。扩增后的噬菌体经受与上文相同的方式的筛选。
结果，使用TAB-K94抗体进行5轮筛选且得到具有两种不同的肽序列的噬菌体。在使用TAB-K94抗体筛选期间，扩增的噬菌体的数目在第三轮筛选后在每一轮中增加10倍，表明特异性结合噬菌体的数目增加（图10A）。从最后一轮筛选得到的噬菌体中随机选择10个噬菌体，通过DNA序列测定分析确定肽的序列，并且由此得到的氨基酸序列汇总在下表（表2）中。
表2
由TAB-K94抗体选择的肽展示噬菌体的插入肽序列
Figure BDA0000383580960000291
实施例11.用于检测表达抗体特异性肽的噬菌体的ELISA
为了检查所选择的TAB-K94抗体特异性噬菌体对TAB-K94抗体的反应性，使用噬菌体作为包被抗原且使用TAB-K94抗体作为第一抗体来进行ELISA。详细方法如下：
肽序列测定分析的结果表明，选择具有不同序列的两个噬菌体（K94p1、K94p7），扩增噬菌体，使用PEG/NaCl溶液进行部分地纯化噬菌体，然后将该噬菌体用作ELISA包被抗原。以100μl的包被溶液（0.1M碳酸氢钠缓冲液，pH8.6）稀释1010个纯化的噬菌体，然后将稀释后的噬菌体加入到96孔MaxisorpELISA板的每一孔内。为了抗原包被，添加噬菌体的板在4℃下存放16小时或更长时间。在噬菌体包被后，添加300μl的脱脂奶溶液（5%(w/v)脱脂奶/TBST），然后在抗原包被后，在室温下反应1小时以封闭剩余位点。在封闭后，用TBST（包含0.1%吐温-20的TBS）冲洗板两次，向其添加100ng/100μl的TAB-K94抗体，然后在室温下反应90分钟。此后，用TBST冲洗板6次，然后利用第二抗体（以1:2500的比率稀释的抗小鼠IgGAM-HRP（Pierce））处理。第二抗体也在室温下反应90分钟，然后用TBST冲洗板6次。使用TMB溶液（Pierce）作为HRP的底物来进行显色。测量450nm处的吸光度以量化抗原-抗体反应。
在用作抗原的两个噬菌体当中，K94p1对TAB-K94抗体示出高的反应性，而K94p7对TAB-K94抗体不显示反应性（图10和表2）。因此，最终选择由SEQ ID NO.21表示的表位。
实施例12.使用表达K94p1抗体反应性位点的噬菌体来确定患者血清中 TAB-K94样的自身抗体的存在
通常，通过刺激免疫系统来诱导抗体反应的抗原表位具有与完整蛋白结构的特定部分相对应的20个氨基酸或少于20个氨基酸的长度。另外，已知表位即使对于不同的个体（诸如人类、小鼠和山羊）也产生类似的功能。基于这种事实，从肝癌模型小鼠得到的自身抗体反应性表位预计在人体中显示类似的功能。因此，当显示TAB-K94抗体特异性反应性的K94p1噬菌体被应用于检测人自身抗体时，检查显示TAB-K94抗体特异性反应性的K94p1噬菌体是否能够检测人血清中的自身抗体。详细方法如下：
以100μl的0.1M的碳酸氢钠缓冲液（pH8.6）稀释1010个K94p1噬菌体，然后将其加入到ELISA板的每一孔内，在4℃下对其进行包被16小时。包被之后，除去剩余的抗原，将300μl的不含蛋白的封闭缓冲液（Pierce）添加到每一孔内以执行封闭。在封闭后，用TBST冲洗板6次，然后利用乳腺癌患者的血清和正常个体的血清处理板（这些血清利用作为第一抗体的噬菌体宿主细胞ER2738的提取物进行预吸附）。预吸附是对于使用人血清的ELISA通常所需的步骤，在本发明中如下进行预吸附：制备在噬菌体扩增中被用作宿主细胞的ER2738的细胞裂解物；采集对应于50μg蛋白的量，并将其与不表达肽序列的3×1010个正常M13细菌噬菌体（指示为Eph）混合在0.5ml的不含蛋白的封闭液（Pierce）（包含每2μl的人血清样本）中；和，在室温下反应2小时。在反应之后，100μl的产物被用作第一抗体。第一抗体反应在室温下进行2小时，反应后的剩余抗体利用TBST冲洗6次。作为第二抗体，以1:5000的比例利用不含蛋白的封闭液稀释抗人IgGAM-HRP（Pierce），将100μl稀释后的抗人IgGAM-HRP加入到第一抗体处理后的样本中，在室温下反应90分钟。在反应后，利用TBST冲洗板6次，然后添加100μl的TMB溶液用于HRP反应。测量450nm处的吸光度。使用K94p1对于人血清的ELISA重复4次或更多次以确定再现性，在图11中示出了代表性结果。
如图11所示，使用K94p1噬菌体的ELISA以50%灵敏度和82.61%特异性将乳腺癌患者的血清和正常个体的血清区别开。因此，可使用K94p1噬菌体进行人血清ELISA，K94p1噬菌体为对本发明的CK8/18复合物的自身抗体的表位模拟物，从而被用作用于乳腺癌的诊断方法。
另外，为了检查使用K94p1噬菌体是否可诊断肝癌患者，以与上述相同的方式对肝癌患者的血清进行ELISA。由于TAB-K94抗体为从肝癌模型小鼠获取的自身抗体，故预计其在肝癌中也具有诊断效果。然而，如在图12中所示，与乳腺癌患者不同，肝癌患者的血清结果和正常个体的血清结果未观测到不同。
一并考虑，TAB-K94自身抗体具有识别CK8/18复合物的特征，且其表位模拟K94p1噬菌体抗原被用作构成使用对乳腺癌特异性的ELISA的诊断方法。
实施例13.对TAB-K94自身抗体具有反应性的表位序列
使用TAB-K94抗体筛选表达环状肽的噬菌体文库的结果显示，具有在两端的半胱氨酸序列之间的ISPDAHS序列（SEQ ID NO.21）的TAB-K94p1环状肽模拟K94抗体特异性表位结构。
由9个氨基酸组成的环状肽中的每一氨基酸形成表位结构以有助于与抗体结合。为了检查K94p1肽的每一氨基酸对于表位结构的贡献，制备对于每一位点的甘氨酸或丙氨酸取代基以检查其对于TAB-K94抗体的反应性。关于这点，采用MBP（麦芽糖结合蛋白）作为表位表达结构，并且MBP以在MBP的C末端插入由9个氨基酸构成的环状肽序列（-CX7C-）的形式表达。
每一肽变型体对TAB-K94抗体的反应性通过ELISA来检查（表3；TAB-K94抗体对K94p1肽抗原的反应性以100%设定为参照，且表示每一肽变型体的相对反应性）。结果，当K94p1序列肽抗原的反应性被确定为100%时，大多数甘氨酸变型体显示小于10%的反应性，这表明不具有侧链的甘氨酸的取代增大肽的结构自由，其导致形成环状肽结构的阻碍。呈现为，与甘氨酸的取代不同，丙氨酸的取代并不由于结构自由的增加而导致难于形成环状结构。变型体可被分成不具有抗体反应性的组（I1A，D4A）、具有部分抗体反应性的组（50%或更小的相对反应性：H6A、P3A、D4G）、以及具有接近完整的抗体反应性的组（70%或更大的相对反应性：S2A、S7A）。保持抗体反应性的组为丝氨酸残基的丙氨酸取代，表明丝氨酸的侧链羟基（OH-）实际上并不有助于抗体反应。相反，可表明具有减少的抗体反应性的组的每一侧链大为有助于环状肽结构的形成和抗体结合。
表3
K94p1肽抗原的Gly/Ala变型体对K94抗体的反应性
Figure BDA0000383580960000331
总之，结果表明具有由SEQ ID NO.21表示的ISPDAHS的氨基酸序列、SEQID NO.27表示ISPGAHS的氨基酸序列、SEQ ID NO.28表示的IAPDAHS的氨基酸序列、SEQ ID NO.29表示的ISADAHS的氨基酸序列、SEQ ID NO.30表示的ISPDAAS的氨基酸序列、或者SEQ ID NO.31表示的ISPDAHA的氨基酸序列的多肽可被用作抗原模拟肽，该抗原模拟肽能够检测被用作具有识别CK8/18复合物特征的乳腺癌诊断标记物的TAB-K94自身抗体。
国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约
根据条例7.1下发的原始保藏收据的国际表格
致：赵允伟
韩国生命工学研究院
韩国大田广域市儒城区，科学路111号，305-806
来自BP/4（KCTC表17）                  仅一页
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Claims (25)

1.一种细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体或者其包括抗原结合位点的片段。
2.根据权利要求1所述的自身抗体或片段，其中，所述自身抗体或所述片段识别由SEQ ID NO.21表示的ISPDAHS的氨基酸序列、由SEQ ID NO.22表示的TLSHTRT的氨基酸序列、由SEQ ID NO.27表示的ISPGAHS的氨基酸序列、由SEQ ID NO.28表示的IAPDAHS的氨基酸序列、由SEQ ID NO.29表示的ISADAHS的氨基酸序列、由SEQ ID NO.30表示的ISPDAAS的氨基酸序列、或者由SEQ ID NO.31表示的ISPDAHA的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的自身抗体或片段，其中，所述自身抗体或所述片段识别由SEQ ID NO.21表示的ISPDAHS的氨基酸序列、由SEQ ID NO.28表示的IAPDAHS的氨基酸序列、或者由SEQ ID NO.31表示的ISPDAHA的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的自身抗体或片段，其中，所述自身抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括由SEQ ID NO.3表示的重链CDR1、由SEQ ID NO.4表示的重链CDR2、以及由SEQ ID NO.5表示的重链CDR3，所述轻链可变区包括由SEQ ID NO.6表示的轻链CDR1、由SEQ ID NO.7表示的轻链CDR2、以及由SEQ ID NO.8表示的轻链CDR3。
5.根据权利要求1所述的自身抗体或片段，其中，所述自身抗体包括由SEQID NO.1表示的重链氨基酸序列和由SEQ ID NO.2表示的轻链氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的自身抗体或片段，所述自身抗体或所述片段由入藏号为KCTC11799BP的杂交瘤细胞系产生。
7.一种多肽，所述多肽具有由SEQ ID NO.21表示的ISPDAHS的氨基酸序列、由SEQ ID NO.22表示的TLSHTRT的氨基酸序列、由SEQ ID NO.27表示的ISPGAHS的氨基酸序列、由SEQ ID NO.28表示的IAPDAHS的氨基酸序列、由SEQ ID NO.29表示的ISADAHS的氨基酸序列、由SEQ ID NO.30表示的ISPDAAS的氨基酸序列、或者由SEQ ID NO.31表示的ISPDAHA的氨基酸序列，所述氨基酸序列为与权利要求1所述的自身抗体特异性结合的表位。
8.根据权利要求7所述的多肽，其中，所述多肽在两端包括附加的半胱氨酸。
9.一种用于诊断乳腺癌的组合物，包括能够测量权利要求1所述的自身抗体或片段的表达水平的试剂。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中，所述自身抗体为与抗原结合位点肽特异性结合的抗体，所述抗原结合位点肽包括由SEQ ID NO.21表示的ISPDAHS、由SEQ ID NO.28表示的IAPDAHS、或者由SEQ ID NO.31表示的ISPDAHA。
11.根据权利要求9所述的组合物，其中，能够测量所述自身抗体的表达水平的所述试剂为与所述自身抗体特异性结合的多肽。
12.根据权利要求11所述的组合物，其中，与所述自身抗体特异性结合的所述多肽为由SEQ ID NO.21表示的ISPDAHS的表位多肽、由SEQ ID NO.22表示的TLSHTRT的表位多肽、由SEQ ID NO.27表示的ISPGAHS的表位多肽、由SEQ ID NO.28表示的IAPDAHS的表位多肽、由SEQ ID NO.29表示的ISADAHS的表位多肽、由SEQ ID NO.30表示的ISPDAAS的表位多肽、或者由SEQ ID NO.31表示的ISPDAHA的表位多肽。
13.根据权利要求12所述的组合物，其中，所述多肽在两端包括附加的半胱氨酸。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中，所述多肽为所述表位多肽和载体蛋白的融合蛋白。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中，所述载体蛋白为麦芽糖结合蛋白MBP。
16.一种产生权利要求1所述的自身抗体的杂交瘤细胞系。
17.根据权利要求16所述的杂交瘤细胞系，其中，所述杂交瘤细胞系的入藏号为KCTC11799BP。
18.一种用于诊断乳腺癌的试剂盒，包括权利要求9至15中任一项所述的组合物。
19.根据权利要求18所述的试剂盒，其中，所述试剂盒用于蛋白免疫印迹、酶联免疫吸附测定ELISA、放射免疫测定、放射免疫扩散、Ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组织化学染色、免疫沉淀分析、补体结合试验、FACS、和蛋白芯片分析中的任一种。
20.一种用于诊断乳腺癌的方法，包括以下步骤：使用权利要求9至15中的任一项所述的组合物来检测细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体或者其包括抗原结合位点的片段。
21.根据权利要求20所述的方法，包括以下步骤：
a）测量来自疑似乳腺癌个体的生物样本中的细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体的表达水平或者其包括抗原结合位点的片段的表达水平；和
b）将所测量的蛋白质表达水平与正常的对照样本的蛋白质表达水平相比较。
22.根据权利要求21所述的方法，其中，所述生物样本是选自从个体分离的全血、血清、血浆、唾液、尿、痰、淋巴液、脑脊髓液和间质液的任何一种或多种。
23.根据权利要求21所述的方法，其中，所述自身抗体的表达水平或者其包括抗原结合位点的片段的表达水平通过使用蛋白免疫印迹、酶联免疫吸附测定ELISA、放射免疫测定、放射免疫扩散、Ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组织化学染色、免疫沉淀分析、补体结合试验、FACS、或蛋白芯片分析中的任一种来测量。
24.一种用于筛选用于乳腺癌的治疗剂的方法，包括以下步骤：
a）测量个体中的细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体的表达水平；
b）施用用于乳腺癌的候选治疗剂；和
c）与步骤a）中的表达水平相比，检查所述细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体的表达水平是否下降。
25.细胞角蛋白8/18复合物特异性自身抗体或者其包括抗原结合位点的片段在诊断乳腺癌中的用途。
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