KR101473328B1 - 사이토케라틴１７―특이적인 인간항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 사이토케라틴17(Cytokeratin17)-특이적인 인간항체에 관한 것으로, 구체적으로 사이토케라틴17에 특이적으로 결합하는 인간으로부터 유도된 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)과 프레임 워크 영역(framework region, FR)으로 구성된 인간 항체에 관한 것이다. 본 발명의 사이토케라틴17에 특이적인 인간 항체는 상기 사이토케라틴17이 과발현되는 암질환의 진단, 질환의 분류, 영상화, 치료 및 예후 판정 등에 이용될 수 있다.
사이토케라틴17, 인간항체, 암

Description

사이토케라틴１７―특이적인 인간항체{Cytokeratin17―specific human antibody}
본 발명은 사이토케라틴17(Cytokeratin17)-특이적인 인간항체에 관한 것이다.
사이토케라틴(Cytokeratin: CK)은 세포골격 필라멘트 단백질(cytoskeleletal filament protein)로, 약 20종의 아형(subtypes)이 다양한 형태의 인간의 상피세포(epithelial cells)에서 발현되는 것으로 현재까지 보고되고 있다. 상기 CK는 40 KDa와 68 KDa사이의 분자량과 4.9-7.8 사이의 등전(isoelectric) pH의 범위에 있고, 인간 CK의 각각은 1부터 20까지 숫자화되어 있다. 인체의 다양한 상피 내에서 성숙(maturation)이나 분화(differentiation)의 정도와 관련된 CK를 발현한다. CK 아이소타입(isotype)은 세포질에서 CK의 위치(localization)와 세포유형(cell type)에 의존하여 결정된다. 서로 다른 CK 형태들은 분자량뿐만 아니라 그들이 산성형(acidic type) 또는 염기형(basic type) 인지에 따라 다양한 CK가 인체를 통틀 어 여러 종류의 상피 사이에 다르게 분포되어 있다. CK 아형의 발현 양상은 다른 형태의 상피성 암종(epithelial malignancies)의 특징에서 증가하는 정도로 사용되기도 한다. 또한, 세포질 분자(cytoplasmic molecules)인 CK는 HSP70(heat shock protein 70)과 마찬가지로 여러 가지 암세포의 표면에서 과발현되고 일부는 나쁜 예후과 관련되어 있다는 점에서 현재 주목받고 있다. 사이토케라틴17의 경우, 유방암을 비롯하여 자궁암, 피부암 등과 같은 다양한 암에서의 과발현되고 있어 바이오마커로서의 가능성이 대두하고 있으나 아직 이에 대한 구체적인 증거는 미미하다.
최근의 여러 보고에 따르면, 자궁의 예비 세포(reserve cells)의 마커인 사이토케라틴 17이 사이토케라틴 8과 함께 자궁경부 상피내 종양(uterine cervical intraepithelial neoplasia, CIN) 진단의 가치있는 마커이고, 이들의 면역염색은 CIN의 증가한 병변 등급(increasing lesion grade)과 관련된 것을 보고 하고 있다(Ikeda K et al., Gynecol Oncol.108(3):598-602, 2008). 또한, 사이토케라틴17은 화생(metaplasia)을 일으키고(Martens JE et al., Anticancer Res. 24:771-775, 2004), 미성숙 이형성 편평 상피세포(immature metaplastic squamous epithelium)에서 발현된다고 알려져 있다(Smedts F et al., Obstet . Gynecol . 82:465-474, 1993). 또한, 구강 편평암 세포(oral squamous cancer cells)에서 CK17의 RT-PCR결과 바이오마커로서의 가능성이 대두하고 있으며, 췌담관선암(pancreaticobiliary adenocarcinoma)에서 CK17 고발현이 보고되고 있으나(Sarbia M et al., Am J Clin Pathol. 128(2):255-259, 2007), 이에 대한 연구가 부족하여 자세한 기작이 알려 져 있질 않다.
비록 정상적인 세포 내에서 발견되고 있는 중간미세섬유(intermediate filaments)인 사이토케라틴들인 CK-5/6, CK-14와 CK-17등이 유방암과 같은 종양에서 과발현되어 나타나는 정확한 기원에 대해선 알려져 있지 않더라도, 일반적으로 이러한 종양들이 높은 등급(high grade)과 단계(stage) 및 나쁜 예후 등과 관련되어 있으나(Gusterson B et al., Breast Cancer Res 7:143-148, 2005), 이러한 기저형태(basal phenotypes)들의 독립적인 예후판정(prognostic significance)에 대해선 아직도 상반되는 결과들이 보고되어 논란이 되고 있다(Foulkes W et al., Cancer Res 64:830-835, 2004). 현재 사이토케라틴 항체들은 세포병리학(cytopathology)과 유세포분석(flow cytometric assays)에서 유용한 도구로 사용될 뿐만 아니라 조직 절편(tissue sections)에서 면역조직화학분석을 사용한 종양의 여러 진단법에서 보조적으로 사용되기도 한다.
이에, 본 발명자들은 사이토케라틴17에 특이적으로 결합하는 7종의 인간 항체를 선별하고, 상기 인간 항체가 사이토케라틴17이 발현된 암세포주 내 사이토케라틴17에 대한 결합능 및 특이성을 가지는 것을 확인하고, 본 발명의 인간 항체가 사이토케라틴17 과발현 암질환의 치료에 효과적으로 이용될 수 있음을 제시함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 사이토케라틴17(Cytokeratin17)에 특이적인 인간 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드 및 인간 중쇄의 불변영역을 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체의 경쇄 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드 및 인간 경쇄의 불변영역을 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체의 경쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 및 경쇄 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 형질전환체를 배양하여 사이토케라틴17에 특이적인 인간 항체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체를 포함하는, 사이토케라틴17이 과발현되는 암질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체 및 치료용 방사선 동위원소를 포함하는 사이토케라틴17이 과발현되는 암질환의 방사선면역 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 약학적으로 유효한 양의 상기 인간 항체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 사이토케라틴17이 과발현되는 암질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 인간 항체, 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄, 또는 그의 단편의 진단적 유효량을 포함하는 사이토케라틴17이 과발현되는 암질환의 검출용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 암세포와 접촉하는 단계를 포함하는 시험관 내 사이토케라틴17이 과발현되는 암의 면역검출 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 암의 검출용 조성물의 진단적 유효량을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 생체내 사이토케라틴17이 과발현되는 암의 영상화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 이용하는 사이토케라틴17이 과 발현되는 암의 생체내 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 검출용 조성물을 이용하는 사이토케라틴17이 과발현되는 암 치료의 예후 평가 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 서열번호 24 내지 30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정영역(이하, HCDR) 1, 서열번호 31 내지 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 HCDR 2 및 서열번호 38 내지 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 중쇄 또는 그의 단편; 및,
서열번호 45 내지 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정영역(이하, LCDR) 1, 서열번호 51 내지 57로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 LCDR 2 및 서열번호 58 내지 64로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 경쇄 또는 그의 단편을 포함하는 사이토케라틴17(Cytokeratin17)에 특이적인 인간 항체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발 현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 경쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 경쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 및 경쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 사이토케라틴17에 특이적인 인간 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체를 포함하는, 사이토케라틴17이 과발현되는 암질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체 및 치료용 방사선 동위원소를 포함하는 사이토케라틴17이 과발현되는 암질환의 방사선면역 치료용 약학적 조성물을 제공한 다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 인간 항체를 사이토케라틴17이 과발현되는 암질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 사이토케라틴17이 과발현되는 암질환을 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체, 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄, 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편의 진단적 유효량을 포함하는 사이토케라틴17이 과발현되는 암질환의 검출용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 검출용 조성물을 암세포와 접촉하는 단계를 포함하는 시험관 내 사이토케라틴17이 과발현되는 암의 면역검출 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 상기 검출용 조성물의 진단적 유효량을 개체에 투여하는 단계; 및,
2) 상기 개체에 대한 검출영상을 수득하는 단계를 포함하는 생체내 사이토케라틴17이 과발현되는 암의 영상화 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 검출용 조성물을 개체의 정맥내 투여하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 조성물을 검출하여 종양 세포를 확인하는 단계;
3) 단계 2)에서 확인된 종양 세포를 수술적 절제에 의해 제거하는 단계를 포함하는 사이토케라틴17이 과발현되는 암의 생체내 치료 방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은
1) 상기 검출용 조성물을 종양 세포가 제거된 환자의 정맥내 투여하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 조성물을 검출하여 종양 세포를 확인하는 단계;
3) 단계 2)에서 종양 세포가 검출되지 않으면, 종양 세포가 모두 제거된 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 사이토케라틴17이 과발현되는 암 치료 환자의 예후 평가 방법을 제공한다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 설명한다.
"가변영역"이란 항원과 특이적으로 결합하는 기능을 수행하면서 서열상의 많은 변이를 보이는 항체 분자의 부분을 의미하고, 가변영역에는 CDR1, CDR2 및 CDR3가 존재한다. 상기 CDR 사이에는 프레임 워크 영역(framework region, FR) 부분이 존재하여 CDR 고리를 지지해주는 역할을 한다.
"상보성 결정 영역"은 항원의 인식에 관여하는 고리모양의 부위로서 이 부위의 서열이 변함에 따라 항체의 항원에 대한 특이성이 결정된다.
"패닝(panning)"은 파아지의 외벽(coat)에 펩타이드를 발현(display)하는 파아지 라이브러리로부터, 표적 분자(항체, 효소, 세포표면 리셉터 등)와 결합하는 성질을 지닌 펩타이드를 표면에 발현하고 있는 파아지만을 선택해 내는 과정을 일컫는다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 24 내지 30으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 상보성 결정영역(이하, HCDR) 1, 서열번호 31 내지 37로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 HCDR 2 및 서열번호 38 내지 44로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 HCDR 3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 중쇄 또는 그의 단편; 및,
서열번호 45 내지 50으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 상보성 결정영역(이하, LCDR) 1, 서열번호 51 내지 57로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 LCDR 2 및 서열번호 58 내지 64로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 LCDR 3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 경쇄 또는 그의 단편을 포함하는 사이토케라틴17에 특이적인 인간 항체를 제공한다.
바람직하게는, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 10 내지 16으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖고, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 17 내지 23으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는다.
상기 항체는 전체(whole) 항체 형태일 뿐 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 항 체 분자의 기능적인 단편이란 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, 항체 단편의 예는 (i) 경쇄의 가변역역(VL) 및 중쇄의 가변영역(VH)과 경쇄의 불변역역(CL) 및 중쇄의 첫번째 불변 영역(CH1)으로 이루어진 Fab 단편; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편; (iv) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편(Ward ES et al., Nature 341:544-546 (1989)]; (v) 분리된 CDR 영역; (vi) 2개의 연결된 Fab 단편을 포함하는 2가 단편인 F(ab')2 단편; (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 항원 결합 부위를 형성하도록 결합시키는 펩타이드 링커에 의해 결합된 단일쇄 Fv 분자(scFv); (viii) 이특이적인 단일쇄 Fv 이량체(PCT/US92/09965) 및 (ix) 유전자 융합에 의해 제작된 다가 또는 다특이적인 단편인 디아바디(diabody) WO94/13804) 등을 포함한다.
본 발명에서는 사이토케라틴17에 대한 인간 항체를 파지 표출 기술(Phage Display Technology)을 이용하여 scFv 형태로 수득하였으며, 단일 파지 클론(mono phage clone) 형태로 스크리닝(screening)함으로써 사이토케라틴17에 특이적인 7종의 단일 클론 파아지(monoclone phage)를 수득하였다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 재조합 기술로 수득한 사이토케라틴17(도 1 내지 도 5 참조)을 단일클론 항체의 제조에 이용하였다. 상기 사이토케라틴17을 다양성을 가진 인간 유래 scFv 라이브러리 세포(human naive scFv library cell)로부터 제조한 라이브러리 파지와 반응하여 패닝(panning)시킨 후, 사이토케라틴17 항원에 강하게 결합하는 단일 클론을 스크리닝(screening)하였다(표 1 내지 3 및 도 6 참조). 상기 선별된 단일 클론들을 핑거프린팅(fingerprinting)으로 확인한 후(도 7 참조), 각각의 서열을 분석하여 항체의 VH와 VL의 CDR 부위(region)를 확인하였다(표 6 및 도 8, 9 참조). 상기 항체와 생식 계열(germ line) 항체군의 유사성을 NCBI의 Ig BLAST 프로그램(//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)을 이용하여 확인한 결과(표 7 참조), 7종의 사이토케라틴17에 특이적인 파아지 항체를 얻었다. 상기 선별된 단일 클론 항체는 CK17이 과발현된 난소암 세포주에서 CK17을 특이적으로 인식하고 결합할 수 있었다(도 10 참조).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 단일 클론 파아지의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 유전자를 수득하여 각각 벡터에 연결한 후, 상기 발현벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 발현된 전체 IgG 형태의 인간 항체를 확인하였다(도 11 참조). 상기 인간 항체를 수득하여(도 12 참조), SKOV3 세포주에서 상기 전체 항체의 CK17에 대한 결합력(도 13 참조) 및 특이성(표 9 참조)을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 경쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발 현벡터를 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서 재조합 기술로 수득한 사이토케라틴17(도 1 내지 도 5 참조) 및 인간 유래 scFv 라이브러리 세포로부터 제조한 라이브러리 파지를 이용하여, 사이토케라틴17 항원에 강하게 결합하는 단일 클론을 스크리닝하였다(표 1 내지 3 및 도 1 내지 6 참조). 상기 선별된 단일 클론들을 분류한 후, 서열을 분석하여 7종의 사이토케라틴17에 특이적인 파아지 항체를 얻었고(도 7 내지 9 및 표 6 및 7 참조), 상기 선별된 단일 클론 항체는 CK17이 과발현된 난소암 세포주에서 CK17을 특이적으로 인식하고 결합하는 것을 확인하였다(도 10 참조). 이후, 상기 단일 클론 항체의 경쇄 및 중쇄를 발현하기 위한 벡터가 도입된 숙주세포로부터 전체 IgG 형태의 인간 항체를 수득한 후(도 11 및 도 12 참조), SKOV3 세포주에서 상기 전체 항체의 CK17에 대한 결합력(도 13 참조) 및 특이성(표 9 참조)을 확인하였다.
본 발명의 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 코돈의 축퇴성(degeneracy)으로 인하여 또는 상기 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편을 발현시키고자 하는 생물에서 선호되는 코돈을 고려하여, 코딩영역으로부터 발현되는 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편의 아미노산 서열을 변화시키지 않는 범위 내에서 코딩영역에 다양한 변형이 이루어질 수 있고, 코딩영역을 제외한 부분에서도 유전자의 발현에 영향을 미치지 않는 범위 내에서 다양한 변형 또는 수식이 이루어질 수 있으며, 그러한 변형 유전자 역시 본 발명의 범위에 포함됨을 당업자는 잘 이해할 수 있을 것이다. 즉, 본 발명의 폴리뉴클레 오티드는 이와 동등한 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이될 수 있으며, 이들 또한 본 발명의 범위에 포함된다. 이러한 폴리뉴클레오티드의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 RNA(mRNA)분자일 수 있다.
상기 발현벡터의 제작 시에는, 상기 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편을 생산하고자 하는 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(inhancer) 등과 같은 발현조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
본 발명의 발현벡터는 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오 파아지 벡터 및 바이러스 벡터 등을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 적합한 발현벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 발현벡터의 프로모터는 구성적 또는 유도성일 수 있다. 상기 시그널 서열에는 숙주가 에쉐리키아속(Escherichia sp.)균인 경우에는 PhoA 시그널 서열, OmpA 시그널 서열 등이, 숙주가 바실러스속(Bacillus sp.)균인 경우에는 α-아밀라아제 시그널 서열, 서브틸리신 시그널 서열 등이, 숙주가 효모(yeast)인 경우에는 MFα 시그널 서열, SUC2 시그널 서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 시그널 서열, α-인터페론 시그널 서열, 항체 분자 시그널 서열 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 발현벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포 함할 수 있고, 복제 가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 경쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체의 중쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 및 경쇄 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 제조된 형질전환체를 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 사이토케라틴17에 특이적인 인간 유래 단일 클론 파아지의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 유전자를 수득하여 각각 벡터에 연결한 후, 상기 발현벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 발현된 전체 IgG 형태의 인간 항체를 확인하였다. 상기 인간 항체를 수득하여, 사이토케라틴17에 대한 결합능(도 13 참조) 및 특이성(표 9 참조)을 확인하였다.
본 발명에 따른 상기 발현벡터를 적절한 숙주 세포, 예를 들어, 대장균 또는 효모 세포 등에 형질전환시킨 후, 형질전환된 숙주세포를 배양함으로써 본 발명에 따른 인간 항체의 경쇄 및 중쇄 또는 그의 단편을 대량 생산할 수 있다. 숙주세포 의 종류에 따른 적절한 배양 방법 및 배지 조건 등은 당해 분야의 통상의 기술자에게 알려진 공지 기술로부터 당업자가 용이하게 선택할 수 있다. 상기 숙주세포는 대장균(E. coli) 또는 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis)와 같은 원핵 생물일 수 있다. 또한, 사카로마이세스 세르비시아(Saccharomyces cerevisiae)와 같은 효모, 곤충 세포, 식물 세포, 동물 세포로부터 유래한 진핵 세포일 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 동물 세포는 자가 또는 동종 이계 동물 세포일 수 있다. 자가 또는 동종 이계 동물 세포에 도입하여 제조된 형질전환체는 개체에 투여되어 암을 치료하는 세포치료 등에 이용될 수도 있다. 상기 숙주세포로의 발현벡터 도입방법은 당업자에게 공지된 어느 방법을 사용해도 무방하다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 사이토케라틴17에 특이적인 인간 항체를 제조하는 방법을 제공한다.
구체적으로,
1) 상기 형질전환체를 배양하는 단계; 및
2) 상기 배양액으로부터 상기 인간 항체를 정제하는 단계를 포함하는 사이토케라틴17 에 특이적인 인간 항체의 제조방법을 제공한다.
상기 배양 배지로는 당업자에게 공지된 배양 배지 중 형질전환체에 적합한 배지를 선택하여 이용하는 것이 바람직하다. 상기 항체 정제 방법은 당업자에게 공지된 어떠한 정제 방법도 사용 가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는 사이토케라틴17에 특이적인 인간 유래 단 일 클론 파아지의 경쇄 및 중쇄를 암호화하는 유전자를 수득하여 각각 벡터에 연결한 후, 상기 발현벡터를 동시에 숙주세포에 도입하여 발현된 전체 IgG 형태의 인간 항체를 확인하였다. 상기 인간 항체를 수득하여, 사이토케라틴17에 대한 결합능(도 13 참조) 및 특이성(표 9 참조)을 확인하였다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체를 포함하는, 사이토케라틴17이 과발현되는 암질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 사이토케라틴17이 과발현되는 암질환은 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 사이토케라틴17이 과발현되는 암은 모두 가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 사이토케라틴17에 대한 결합능 및 특이성을 나타낸 단일클론 항체는 사이토케라틴17가 과발현된 암질환의 예방 또는 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 사이토케라틴17에 특이적인 인간 항체 또는 상기 형질전환체를 선택적으로 함유할 수 있으며, 상기 성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물의 투여를 위해서 상기에 기재된 유효성분 이외에 추가로 약제학적 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 약제학적으로 허용 가능한 담체로는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 하나 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 및 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액 및 유탁액 등과 같은 주사용 제형으로 제제화할 수 있으며, 표적 세포에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 세포에 특이적인 항체 또는 기타 리간드를 상기의 담체와 함께 결합시켜 사용할 수 있다. 아울러, 당해 기술분야의 적정한 방법 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 게재되어 있는 방법 등을 이용하여 각 질환 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 본 발명의 약학적 조성물은 안정제 또는 완충제와 함께 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제화한다.
본 발명의 약학적 조성물은 투여 경로에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 약학적 조성물은 주사용도에 적합한 멸균 수용액 또는 분산액의 형태로 제조될 수 있거나, 또는 동결-건조 기술을 이용하여 냉동건조된 형태로 제조될 수 있다. 냉동건조된 약학적 조성물은 전형적으로 약 4℃에서 유지되며, 보조제를 함유하거나 함유하지 않은 안정화 용액, 예를 들면, 식염수 또는/및 HEPES에 의해 복원될 수 있다.
본 발명의 방법을 실시하는데 있어서, 투여될 약학적 조성물의 양에 영향을 미치는 인자들로는, 이에 한정되는 것은 아니지만 투여 방식, 투여 빈도, 치료가 진행 중인 특정 질병, 질병의 심각성, 질병의 병력, 개체가 다른 치료제와 함께 협력 치료법이 진행중인 지의 여부, 및 치료가 진행중인 개체의 연령, 키, 체중, 건강, 및 신체 조건을 포함한다. 일반적으로 치료가 진행중인 환자의 체중이 증가할 수록 본 발명의 약학적 조성물을 더 많은 양으로 투약하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체 및 치료용 방사선 동위원소를 포함하는 사이토케라틴17이 과발현되는 암질환의 방사선면역 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 사이토케라틴17이 과발현되는 암질환은 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 사이토케라틴17이 과발현되는 암은 모두 가능하다.
바람직한 치료용 방사선 동위원소의 예로는 3H, 11C, 14C, 18F, 64Cu, 76Br, 86Y, 99mTc, 111In, 123I, 177Lu 및 이들의 혼합물 및 조합을 포함한다. 상기 치료용 방사선 동위원소는 인간 항체와 결합되거나 인간 항체가 결합된 운반체에 포함되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 인간 항체를 사이토케라틴17이 과발현되는 암질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 사이토케라틴17이 과발현되는 암질환을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 사이토케라틴17이 과발현되는 암질환은 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 사이토케라틴17이 과발현되는 암은 모두 가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 사이토케라틴17에 대한 결합능 및 특이성을 나타낸 단일클론 항체는 사이토케라틴17가 과발현된 암질환의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명이 적용가능한 개체는 척추동물이고 바람직하게는 포유동물이며, 그보다 바람직하게는 쥐, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이고, 가장 바람직하게는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물이다.
본 발명의 인간 항체의 투여방법은 사용목적에 따라 비경구 투여(예를 들면, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 등에 투여하는 방법)로 할 수 있으며, 바람직하게는 정맥 투여가 바람직하다. 경우에 따라 고형암에 대한 투여에서는 항체의 접근을 빠르고 용이하게 하기 위하여 국부적인 투여가 바람직할 수도 있다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 1회 투여량은 약 5 내지 500 ㎎/m2의 양으로 일 단위 또는 주 단위로 투여될 수 있다. 상기 유효량은 상기 환자를 치료하는 의사의 재량에 따라 조절될 수 있다.
본 발명의 인간 항체는 암환자의 치료를 위하여 단독 또는 수술, 호르몬 치 료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제와 병행하여 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 인간 항체, 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄, 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편의 진단적 유효량을 포함하는 사이토케라틴17이 과발현되는 암질환의 검출용 조성물을 제공한다.
상기 사이토케라틴17이 과발현되는 암질환은 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 사이토케라틴17이 과발현되는 암은 모두 가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 사이토케라틴17에 대한 결합능 및 특이성을 나타낸 단일클론 항체는 사이토케라틴17가 과발현된 암질환의 검출용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.
상기 인간 항체, 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄, 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편은 치료용 방사선 동위원소, 형광체, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제 또는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 검출가능한 표지에 직접적으로 또는 간접적으로 결합되거나 연결된다. 바람직한 치료용 방사선 동위원소의 예로는 3H, 11C, 14C, 18F, 64Cu, 76Br, 86Y, 99mTc, 111In, 123I, 177Lu 및 이들의 혼합물 및 조합을 포함한다.
또한, 본 발명은 상기 검출용 조성물을 암세포와 접촉하는 단계를 포함하는 시험관 내 사이토케라틴17이 과발현되는 암의 면역검출 방법을 제공한다.
상기 사이토케라틴17이 과발현되는 암은 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 사이토케라틴17이 과발현되는 암은 모두 가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 사이토케라틴17에 대한 결합능 및 특이성을 나타낸 단일클론 항체는 사이토케라틴17가 과발현된 암의 검출에 유용하게 이용될 수 있다.
상기 검출용 조성물은 세척이나 복합체의 분리 등 그 이후의 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질(solid substrate)에 결합될 수 있다. 고형 기질은 예를 들어 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 및 미세비드 등이 있다. 또한, 상기 합성수지에는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 및 나일론 등이 있다.
또한, 암세포는 상기 검출용 조성물과 접촉 전에 알맞은 정도로 희석될 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 상기 검출용 조성물의 진단적 유효량을 개체에 투여하는 단계; 및,
2) 상기 개체에 대한 검출영상을 수득하는 단계를 포함하는 생체내 사이토케라틴17이 과발현되는 암의 영상화 방법을 제공한다.
상기 사이토케라틴17이 과발현되는 암은 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유 방암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 사이토케라틴17이 과발현되는 암은 모두 가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 사이토케라틴17에 대한 결합능 및 특이성을 나타낸 단일클론 항체는 사이토케라틴17가 과발현된 암의 영상화 방법에 유용하게 이용될 수 있다.
상기 검출영상은 근적외광 이미징, PET, MRI 또는 초음파 이미징에 의해 수득되는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은
1) 상기 검출용 조성물을 개체의 정맥내 투여하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 조성물을 검출하여 종양 세포를 확인하는 단계;
3) 단계 2)에서 확인된 종양 세포를 수술적 절제에 의해 제거하는 단계를 포함하는 사이토케라틴17이 과발현되는 암의 생체내 치료 방법을 제공한다.
상기 사이토케라틴17이 과발현되는 암은 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것이 바람직하나 이에 한정되지 않고 사이토케라틴17이 과발현되는 암은 모두 가능하다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 사이토케라틴17에 대한 결합능 및 특이성을 나타낸 단일클론 항체는 사이토케라틴17가 과발현된 암의 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
아울러, 본 발명은
1) 상기 검출용 조성물을 종양 세포가 제거된 환자의 정맥내 투여하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 조성물을 검출하여 종양 세포를 확인하는 단계;
3) 단계 2)에서 종양 세포가 검출되지 않으면, 종양 세포가 모두 제거된 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는 암 치료 환자의 예후 평가 방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 사이토케라틴17에 대한 결합능 및 특이성을 나타낸 단일클론 항체는 사이토케라틴17가 과발현된 암의 예후 평가에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 사이토케라틴17에 특이적인 인간 항체는 상기 사이토케라틴17이 과발현되는 암질환의 진단, 질환의 분류, 영상화, 치료 및 예후 판정 등에 이용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 사이토케라틴17 ( CK17 ) 항원단백질 제조
<1-1> CK17 유전자 클로닝
<1-1-1> 소수성 영역 분석
CK17 단백질의 소수성(hydrophobicity) 영역을 확인하기 위해, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 기반으로 플롯 프로그램(plot program; //www.vivo.colostate.edu/molkit/hydropathy)을 이용하여 Kyte-Doolittle에 의해 처음 제안된 친수도 도표(hydropathy plot)를 작성하였고, 이를 도 1에 나타내었다. 이때, 세포표면으로의 발현에 크게 영향을 주지 않는 아미노 말단 부분을 임의로 도메인 1 내지 3으로 나누어서 화살표로 표시하였다.
상기 도메인 1을 결실하도록 발현된 단백질을 CK17-D1(서열번호 2)으로, 상기 도메인 1 내지 3을 결실하도록 발현된 단백질을 CK17-D3(서열번호 3)으로 명명하였다.
<1-1-2> CK17 - D1 (80a.a.~432a.a.)의 클로닝
한국생명공학연구원 인간유전체기능연구사업단의 KUGI(Korean UniGene Information)에서 인간 사이토케라틴17 유전자를 함유하고 있는 플라스미드(hMU000313, Kugi # IRAT-04-C01)를 분양받았다. 상기 플라스미드를 주형 DNA로 하고, 상기 CK17-D1을 발현시키기 위한 정방향 프라이머(서열번호 4: 5'-GTCTAGCCATGGAACTGGCTGGAGGTGAG-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 5: 5'-GTCTAGAAGCTTGCGGGTGGTCTGGTG-3')를 사용하여 유전자를 하기 조건으로 증폭한 후, NcoI과 HindⅢ으로 처리한 후, pET28A(69864-3: Novagen, USA)에 서브클로닝하였 다. PCR 조건은 전체 반응액이 50 ㎕일 때, 주형은 100 ng이 되도록 넣어 주었고, 94℃ 5 분, 95℃ 30 초, 55℃ 30 초, 72℃ 1분 30초로 25 사이클, 72℃ 10분간 반응시켜 PCR 산물을 얻었다.
<1-1-3> CK17 - D3 (157a.a~432a.a)의 클로닝
hMU000313을 주형으로 하여 상기 CK17-D3을 발현시키기 위한 정방향 프라이머(서열번호 6: 5'-GTCTAGCCATGGAACTACAGATTGACAATGCC-3') 및 역방향 프라이머(서열번호 5)를 사용하여 실시예 1-1-2와 동일한 방법으로 PCR 증폭(단, 어닐링 온도는 58℃)한 후, NcoI과 HindⅢ으로 처리한 후, pET28A에 서브클로닝하였다.
아울러, 상기 서브클로닝된 CK17-D1과 CK17-D3 벡터의 염기서열을 확인하였다.
<1-2> CK17 - D1 및 CK17 - D3 단백질 발현 및 정제
<1-2-1> CK17 - D1 발현 및 정제
CK17-D1을 발현하는 벡터로 형질전환한 BL21(DE3)의 배양액에 1 mM IPTG를 첨가한 후, 37℃에서 4 시간; 28℃에서 6시간; 28℃에서 밤새도록 또는 20℃에서 밤새도록 배양하였다. 최종 O.D값이 동일하도록 보정한 후, 전체 세포 추출물을 수득하여 10% SDS-PAGE 젤에서 전기영동한 후, 쿠마시 블루법으로 단백질의 발현양상을 확인하였다.
그 결과, 도 2에서 나타난 바와 같이 20℃에서 밤새도록 단백질 발현을 유도한 경우에서, 수용성 단백질의 발현량이 많은 것을 확인하였다.
이에, 최종적으로 배양액에 1 mM IPTG를 첨가한 후, 20℃에서 밤새도록 단백질 발현을 유도한 배양액 500 ㎖을 원심분리하였다. 상등액을 0.22 ㎛의 Top-filter(Millipore, Cat#: SCGP T05 RE, USA)를 사용하여 필터한 후, LabScale TFF System(Millipore, Cat#: XX42LSS11)의 pellicon XL membrane(Millipore, 8K, cat #: PXB0 08A 50)을 이용하여 1/10 부피로 농축한 다음, 농축된 10배 부피의 IMAC 완충용액(300 mM KCl, 50 mM KH2PO4, 5 mM imidazole, pH8.0)을 넣어 농축하면서 IMAC 완충용액으로 교환한 다음, Bio-Rad의 ProfiniaTM protein Purification System의 Bio-Scle Mini profinity IMAC 카트리지(cat#:732-4610)를 사용하여 1 ㎖/분 속도로 제조사의 지시대로 정제하였다. 구체적으로, 농축된 용액에 Ni-NTA(Qiagen 1024473) 비드를 첨가하여 4℃에서 2시간 동안 결합시킨 후, 세척액(300 mM NaCl, 50 mM sodium phosphage buffer, 20 mM imidazole, pH 8.0)으로 차례 세척하였다. 이후, 용리용액(300 mM NaCl, 50 mM sodium phosphage buffer, 250 mM imidazole, pH 8.0)으로 단백질을 용리 하였다. 상기 용액을 투석 멤브레인망(10K, 132574: SPECTRAPOR, USA)에 넣은 후, 4℃에서 4L의 투석용액(100 mM tris-HCl pH 8.0, 300 mM NaCl, 1 mM DTT, 10% glycerol)으로 밤새 투석하였다. Bradford 방법으로 단백질 농도를 측정한 결과, 400 ㎍의(0.3 ㎎/㎖)의 CK17-D1 단백질을 얻었고, 10% SDS-PAGE 젤에서 확인하여 대략 39 KDa 크기의 정제된 CK17-D1 단백질을 확인하였다(도 3).
<1-2-2> CK17 - D3 발현 및 정제
CK17-D3을 발현하는 벡터로 형질전환한 BL21(DE3)의 배양액에 1 mM IPTG를 첨가한 후, 37℃에서 4 시간; 28℃에서 4시간; 28℃에서 밤새도록; 20℃에서 4시간; 또는 20℃에서 밤새도록 배양하였다. 최종 O.D값이 동일하도록 보정한 후, 전체 세포 추출물을 수득하여 10% SDS-PAGE 젤에서 전기영동한 후, 쿠마시 블루법으로 단백질의 발현양상을 확인하였다.
도 5에서 보는 바와 같이,20℃,28℃과 37℃에서 발현양이 높고 비슷하였으나 solubility는 20℃에서 가장 높아, 단백질을 얻기 위하여 20℃에서 IPTG 1 mM 농도로 overnight induction 시키고 상기와 같은 방법으로 정제하여 bradford 방법으로 단백질 농도를 농도를 측정한 후, 400 ㎍의(1mg/mlmM)의 CK17-D3 단백질을 얻었고, 10% SDS-PAGE 젤에서 확인하여 도6에서 보는 바와 같이, 약 31 KDa 크기의 정제된 CK17-D3 단백질을 확인하였다. CK17-D1과 마찬가지로 정제된 CK17-D3단백질도 항원으로 사용하였다.
그 결과, 도 4에서 나타난 바와 같이 20℃에서 밤새도록 단백질 발현을 유도한 경우에서, 수용성 단백질의 발현량이 많은 것을 확인하였다.
이에, 최종적으로 배양액에 1 mM IPTG를 첨가한 후, 20℃에서 밤새도록 단백질 발현을 유도한 배양액 500 ㎖으로부터 실시예 1-2-1과 동일한 방법으로 단백질을 정제하였고, 그 결과 400 ㎍의(1 ㎎/㎖)의 CK17-D3 단백질을 얻었고, 10% SDS-PAGE 젤에서 확인하여 대략 31 KDa 크기의 정제된 CK17-D3 단백질을 확인하였다(도 5).
< 실시예 2> 라이브러리 파아지의 제조
다양성을 가진 인간 유래 scFv 라이브러리 세포 2.7 × 1010를 2×YT CM[Tryptone(CONDA, 1612.00) 17 g, Yeast extract(CONDA, 1702.00) 10 g, NaCl(sigma, S7653-5 ㎏) 5 g, chloramphenicol(sigma, C0857) 34 ㎍/㎖)], 2% glucose(sigma, G5400) 및 5 mM MgCl2(sigma, M2393)을 포함하는 배지(3 L)에서 37℃에서 2~3시간 동안 배양한 후(OD600=0.5~0.7), 헬퍼 파아지(helper phage)를 감염시켜 2×YTCMK[2×YT CM, Kanamycin(sigma, K1876) 70 ㎍/㎖, 1 mM IPTG(ELPISBIO, IPTG025)] 배지에 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리(4500 rpm, 15분, 4℃)한 후, 상등액에 4% PEG(Fluka, 81253) 6000과 3% NaCl(sigma, S7653)을 첨가하여 잘 녹인 후 얼음에서 1시간 동안 반응하였다. 다시 원심분리(8000 rpm, 20분, 4℃)한 후, 펠렛에 PBS를 첨가하여 녹인 다음 원심분리(12000 rpm, 10 분, 4℃)하여 라이브러리 파아지를 포함하는 상등액을 새 튜브에 넣어 4℃에서 보관하였다.
<실시예 3> 단일 클론 항체의 제조
<3-1> 패닝 ( Panning ) 과정
실시예 1에서 수득한 정제된 CK17-D1 항원 또는 CK17-D3 50 ㎍을 Immunosorb 튜브(Nunc 470319)에 4 ㎖의 코팅 완충용액[coating buffer; Na2CO3(sigma, S7795) 1.59 g, NaHCO3(sigma, S8875) 2.93 g, NaN3(sigma, S2002), 0.2 g]으로 4℃에서 16시간 정도 회전기(rotator)로 코팅한 후, 실온에서 2시간 동안 PBS에 녹여 skim milk[(BD,232100)-4% in 1XPBS]를 사용하여 면역튜브(immunotube)에서 차단하였다. 면역튜브에 실시예 2에서 제조한 라이브러리 파아지 2 ㎖을 첨가하여 실온에서 2시간 동안 반응시켰고 PBST(0.05%)로 5회, PBS로 2회 세척하였다. 세척 후 특이적으로 결합한 scFv-파아지들만 100 mM TEA(Sigma T-0886)로 용리하여, 용출된 파아지들을 대장균(XL1-Blue, stratagene, 200249)에 감염시켜 증폭했다. 첫 번째 패닝에서 증폭된 파아지를 PBST 세척 횟수만 늘려서(2차: 13번, 3차: 23번, 4차: 25) 동일한 방법으로 2차, 3차 및 4차 패닝을 수행하였다. CK17-D3의 경우, 3차 패닝까지만 수행하였다.
그 결과, CK17-D1의 경우, 표 1에서 나타난 바와 같이 1차에 비해 4차 항원에 대한 파아지의 콜로니 역가가 30배 이상 증폭됨을 확인하였고, CK17-D3의 경우, CK17-D3 항원에 대한 결합능이 2차 다클론 scFv-파아지 풀(pools)부터 증강하기 시작하여 3차에 결합능이 포화상태에 이른 것을 확인하였다. 또한, CK17-D3 항원에 대한 파아지의 콜로니 역가가 2차에 비해 약 500배 이상 증폭되었다.
표적 항원 패닝 횟수 초기 파아지수 결합한 파아지수
CK17-D1 1st 1.1 x 1013 1.4 x 106
2nd 4 x 1013 1.1 x 107
3rd 6 x 1012 1.0 x 107
4th 4 x 1013 3.3 x 108
CK17-D3 1st 1.1 x 1013 1.38 x 108
2nd 1.2 x 1013 4.0 x 104
3rd 8 x 1012 2.0 x 107
<3-2> 파아지 ELISA 에 의한 파아지 항체 탐색
<3-2-1> 패닝 결과 확인
1차부터 4차까지(CK17-D3의 경우, 3차까지) 패닝하여 얼려두었던 세포 저장물(stock)을 5 ㎖의 2×YTCM, 2% Glucose, 5 mM MgCl2 배지에 OD600=0.1이 되게 넣어준 다음, 37℃에서 2~3시간(OD600=0.5~0.7) 배양하였다. 이후 M1 헬퍼 파아지를 감염시키고 2×YTCMK, 5 mM MgCl2, 1 mM IPTG 배지에 30℃에서 16시간 동안 배양하였다. 이때, 사이토케라틴17과 상관없는 발생과정에 관련 있는 WW45항원에 특이적으로 결합하는, 본 발명의 실시예대로 제조된 단일 파아지항체(#38)를 대조군으로 이용하였다. 배양 세포를 원심분리한 후(4500 rpm, 15 분, 4℃) 상등액(패닝된 poly scFv-파아지)을 새 튜브로 옮겼다. 96웰 면역 플레이트(NUNC 439454)에 사이토케라틴17 항원을 웰 당 100 ng 씩 4℃에서 16시간 정도 코팅 완충용액으로 처리하여 코팅한 후, PBS에 녹인 skim milk(4 %)를 사용하여 각 웰을 차단하였다. 각 웰 마다 PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖으로 씻어준 다음 패닝된 poly scFV-파아지를 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 다시 각 웰마다 PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖을 사용하여 4번 세척한 후 이차 항체인 항-M13-HRP(Amersham 27-9421-01)를 1:2000으로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응하였다. PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖으로 세척한 후에 OPD 정제(Sigmap 8787-TAB)를 PC 완충용액[C6H8O7·H2O(sigma, C0706) 5.1 g, Na2HPO4(sigma, S7907) 7.3 g]에 녹인 기질 용액을 만들어 웰당 100 ㎕씩 넣어 10분 동안 발색시킨 다음 490 ㎚에서 흡광도를 Spectrophotometer(MolecularDevice, 미국)로 측정하였다.
그 결과, 도 6a 및 6b에서 나타난 바와 같이 CK17-D1과 CK17-D3 항원에 대한 결합능이 각각 2차 다클론 scFv-파아지 풀(pools)부터 증강하기 시작하여 4차와 3차에 결합능이 포화상태에 이르렀음을 확인할 수 있었다.
<3-2-2> 단일 클론 항체 선별
상기 결합능이 큰 다클론 파아지 항체군((CK17-D1과 CK17-D3의 각각 4차와 3차 패닝군)에서 얻은 콜로니를 2×YTCM, 2% glucose, 5 mM MgCl2 배지 1 ㎖이 포함된 96-deep 웰 플레이트(바이오니아 90030)에서, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 세포의 OD600 값이 0.1이 되도록 100~200 ㎕를 취해 1 ㎖의 2×YTCM, 2% glucose, 5 mM MgCl2 배지에 희석한 다음, 96-deep 웰 플레이트에서 37℃에서 OD600 값이 0.5~0.7 되도록 2~3시간 배양하였다. M1 헬퍼 파아지를 MOI값이 1:20이 되도록 감염시킨 후, 2×YTCMK, 5 mM MgCl2, 1 mM IPTG 배지에 30℃에서 16시간 배양하였다. 배양한 세포를 원심분리(4500 rpm, 15 분, 4℃)한 후, 상등액을 취해 4% PEG 6000과 3% NaCl을 첨가하여 잘 녹인 후 얼음에서 1시간 동안 반응시켰다. 다시 원심분리(8000 rpm, 20분, 4℃)한 후 펠렛에 PBS를 첨가하여 녹인 다음 원심분리(12000 rpm, 10분, 4℃)하여 상등액을 취해 새 튜브에 옮겨 3차 또는 4차 패닝하여 얻은 단일 클론 scFv-phage를 4℃에서 보관하였다.
이후, 96웰 면역 플레이트에 CK17-D1과 CK17-D3 항원을 웰당 100 ng씩을 넣어 4℃에서 16시간 동안 코팅한 후 PBS에 녹인 skim milk(4%)를 사용하여 각 웰을 차단하였다. 각 웰마다 PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖을 사용하여 세척한 다음 상기 방법으로 수득한 단일클론 scFv-파아지(each 100 scFv-phage)를 각 웰에 100 ㎕씩 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 다시 각 웰마다 PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖을 사용하여 4번 씻어준 후 2차 항체인 anti-M13-HRP를 1/2000로 희석하여 실온에서 1시간 동안 반응하였다. PBS-tween20(0.05%) 0.2 ㎖로 세척한 후에 발색하여 흡광도 490 ㎚에서 측정하였다.
그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이 CK17-D1 항원에 대한 결합능이 1.6 이상인 34개의 단일 파아지 클론들(표 2에서 강조한 것)을 선별하였고, 표 3에 나타난 바와 같이 CK17-D3 항원에 대한 결합능이 2 이상인 60개의 단일 파아지 클론들(표 2에서 강조한 것)을 선별하였다.
Figure 112009026201576-pat00001
Figure 112009026201576-pat00002
<3-3> 단일 클론 파아지 분류 및 검사
<3-3-1> 핑거 프린팅에 의한 검증
1차 선별된 CK17-D1에 대한 34개 단일 클론과 CK17-D3에 대한 60개의 단일클론 세포 1 ㎕와 Taq.DNA polymerase(젠닥스 5U/㎕) 0.2 ㎕, 50 p/㎕의 정방향 프라이머(pelB5, 서열번호 7:5'-CTAGATAACGAGGGCAAATCATG-3') 및 역방향 프라이머(cla3, 서열번호 8:5'-CGTCACCAATGAAACCATC-3') 0.2 ㎕, 10X 완충용액 3 ㎕, 10 mM dNTP mix 0.6 ㎕, 증류수 24.8 ㎕를 혼합하여 콜로니 PCR(iCycler iQ, BIO-RAD)을 수행하였다. PCR 프로그램의 조건은 하기 표 4와 같다.
온도 시간 사이클(cycle)
95℃ 5 min
95℃ 30 sec 30 사이클
56℃ 30 sec
72℃ 1 min
72℃ 10 min
4℃
상기 콜로니 PCR 산물은 1% 아가로스 겔(Seakem LE, CAMERES 50004)에서 확인하였고, BstNI(Roche11288075001, 10 U/㎕) 0.2 ㎕를 가하여 37℃에서 2~3시간 반응하였다. 반응 조건은 하기 표 5와 같다. 상기 절단된 산물을 8% DNA 폴리아크릴 아마이드 겔에서 확인하였다.
10X Buffer 3 ㎕
콜로니 PCR 산물 10 ㎕
BstNI(10U/㎕) 0.2 ㎕
증류수 16.8 ㎕
그 결과, 도 7a와 도 7b에서 나타난 바와 같이 BstNI에 의해 잘려진 단일 클론 파아지 항체들의 단편들에 대해 다양성이 확인되었고, CK17-D1에 대해 2종류 및 CK17D3에 대해 5종류의 서로 다른 항체가 선별된 것을 유추하였다.
<3-3-2> 염기서열 분석에 의한 검증
상기 CK17-D1에 대해 2종류 및 CK17D3에 대해 5종류의 단일 파아지 클론을 2×YTCM, 2% glucose, 5 mM MgCl2 배지(5 ㎖)에 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 배양한 단일 클론으로부터 DNA 정제 키트(Nuclogen 5112)를 이용하여 DNA를 수득한 후, 서열번호 125의 pelB5 프라이머를 이용한 서열 분석을 의뢰하였다(솔젠트, 한국).
그 결과, 표 6 및 도 8 및 도 9에서 나타난 바와 같이 선별된 항체의 VH와 VL의 CDR 영역을 확인하였다.
이들 항체와 생식세포 계열(germ line) 항체군의 유사성을 NCBI의 Ig BLAST 프로그램(//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/)을 이용하여 조사한 결과 2종의 CK17-D1에 특이적인 파아지 항체와 5종의 CK17-D3에 특이적인 파아지 항체를 얻었고 이는 하기 표 7에서 정리하여 제시하였다. 특히, 중쇄의 경우 인간 생식세포 계열서열과 82.1%에서 대략 95%까지의 상동성을 보여주었으며, 경쇄의 경우 89.5%에서 약 98.9%의 상동성을 보여주었다. 또한, 각각의 인간항체의 중쇄 및 경쇄의 CDR3에서 사용되고 있는 폴리펩티드를 분석하였으며, 서로 서열이 다른 것을 확인하였다. 이때, 중쇄의 경우 VH3-23이 3종, VH3-53, VH3-72, VH3-7 및 VH1-46이 각각 1종씩 포함되었다. 경쇄의 경우 람다(λ)-사슬이 2종 및 카파(κ)-사슬이 2종이었다. 각각의 인간항체의 중쇄 및 경쇄의 CDR3에서 사용되고 있는 아미노산 서열을 분석하였으며, 서로 다른 서열을 갖는 것을 확인하였다
　 　 중쇄 경쇄
그룹 클론명 CDR1 CDR2 CDR3 CDR1 CDR2 CDR3
1 D1-1B2 LSTYAMN: 서열번호 24 LISGSGGTTYYADSVKG: 서열번호 31 GRASFDL: 서열번호 38 RASQSISR: 서열번호 45 KASYLRT: 서열번호 51 QQYNTFPLT: 서열번호 58
2 D1-1F FSDYAMT: 서열번호 25 ATSASGGSTHYADSVRG: 서열번호 32 GLVLDY: 서열번호 39 SGTSDDIGRYN: 서열번호 46 DVTRRSS: 서열번호 52 SSFTNNRTVV: 서열번호 59
3 D3-12E FSSYAMT: 서열번호 26 SISHSGRVTYYGDSVKG: 서열번호 33 ELTPSYGFDT: 서열번호 40 TGTSSDVGGYNYVS: 서열번호 47 DVSKRPS: 서열번호 53 SSYTSSSTVV: 서열번호 60
4 D3-12F FHNYAMS: 서열번호 27 VIYSTGGTYYADSVKG: 서열번호 34 GSYAGYIRD: 서열번호 41 TGTSSDVGGHDHVS: 서열번호 48 DVSERPS: 서열번호 54 TSYTTTNSYV: 서열번호 61
5 D3-6G FSSYWMH: 서열번호 28 EINPGNGHTNYNEKFKS: 서열번호 35 DLGRYAHFYMAD: 서열번호 42 TGTSSDVGGYNYVS: 서열번호 47 DVTKRPS: 서열번호 55 ASYAGSSYV: 서열번호 62
6 D3-5C FSDYYMD: 서열번호 29 RSRNKANSHTTEYAASVKG: 서열번호 36 DPWGGFYGMDV: 서열번호 43 RASQGISSWLA: 서열번호 49 AASTLHS: 서열번호 56 QQANSFPYT: 서열번호 63
7 D3-9D FTRYWMQ: 서열번호 30 GIKNDGNRTMYADSVKG: 서열번호 37 EIGGAFDI: 서열번호 44 TGTSSDVAAYNFVS: 서열번호 50 NIRTRPS: 서열번호 57 TSYAGRNTYV: 서열번호 64
Group Clone Name VH Identities VH (CDR3- a.a seq) VL Identities Vk (CDR3-a.a seq)
1 D1-1B2 VH3-23 274/294 (93.20%) GRASFDL L12a 262/280 (93.57%) QQYNTFPLT
2** D1-1F VH3-23 275/294 (93.54%) GLVLDY V1-4 263/294 (89.46%) SSFTNNRTVV
3 D3-12F VH3-53 262/291 (90.03%) RGSYAGYIRD V1-4 280/294 (95.24%) TSYTTTNSYV
4 D3-12E VH3-23 275/295 (93.22%) ELTPSYGFDT V1-4 290/294 (98.64%) SSYTSSSTVV
5 D3-5C VH3-72 287/301 (95.35%) DPWGGFYGMDV L5 281/284 (98.94%) QQANSFPYT
6 D3-9D VH3-7 251/295 (85.08%) EIGGAFDI V1-3 281/295 (95.25%) TSYAGRNTYV
7 D3-6G VH1-46 243/296 (82.09%) KDLGRYAHFYMAD V1-3 274/287 (95.47%) ASYAGSSYV
< 실시예 4> CK17 에 대한 인간항체의 특성 분석
<4-1> 파아지 FACS 분석
100 ㎜ 플레이트에서 CK17이 과발현된 난소암 세포주 SKOV3(ATCC HTB-77)를 PBS로 2번 세척한 후, 무효소 PBS 기반-해리 완충용액(Gibco)을 첨가해서 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 이후, 세포를 스크래퍼로 모은 후, 1300 rpm에서 3분 동안 원심분리해서 펠렛을 2% PBF(2% FBS가 든 1XPBS)용액으로 두 번 세척한 후, 2% PBF 용액을 넣어 재현탁하여 ≥5×105 세포의 농도로 준비하였다. 본 발명의 단일 클론 파아지 항체 100 ㎕를 PEG로 10배 농축한 다음 1/2로 희석하여 상기 세포에 섞어주었다. 이때, 상업적으로 구매한 마우스 항 CK17 항체(Anti KRT17; Cat#:MAB1677: Chemicon, USA)를 양성대조군으로 사용하였고, 정상 마우스 IgG를 음성대조군으로 사용하였다. 얼음에서 1시간 동안 반응한 후, 1300 rpm으로 4℃에서 3분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 200 ㎕의 2% PBF 용액으로 3번 세척한 후, 2% PBF 용액에 1:200으로 희석시킨 항-g8p 항체(Abcam) 100 ㎕를 넣어 잘 섞어주고, 얼음에서 30분 동안 반응시켰다. 1300 rpm으로 4℃에서 3분 동안 원심분리한 후, 상등액을 제거하고 200 ㎕의 2% PBF 용액으로 3번 세척하였다. 2% PBF 용액에 1:1000으로 희석시킨 FITC-연결된 항-마우스 IgG 100 ㎕를 각각의 시료에 섞어준 후, 얼음에서 30분 동안 반응시켰다. 추가로 세척한 다음, 500 ㎕의 2% PBF 용액을 첨가하여 FACS 용 튜브(Falcon)에 시료를 옮겨서 볼텍싱 한 후, 염색된 세포들을 유세포분석기(Beckman Coulter)로 분석하였다. 매번 실험시 다른 항원에 특이하게 결합하는 단일 파아지항체 #38을 동일한 조건으로 시료에 처리하여 내부 대조군(internal control)으로 사용하였다. 데이터는 WINMDI2.9 software(//facs.scripps.edu/software.html, The Scripps Research Institute)를 사용하여 분석하였다.
그 결과, 도 10에서 나타난 바와 같이 CK17이 과발현된 난소암 세포주에서 CK17을 특이적으로 인식하고 결합하는 단일클론 파아지 항체를 선별하였다. 구체적으로, CK17-D1에 대해 D1-1B2, CK17-D3에 대해 D3-5C, D3-9D 및 D3-12F 등을 선별하였다. 이외에도, CK17-D1에 대해 D1-1F, CK17-D3에 대해 D3-6G 및 D3-12E 등도 선별하였으나, 결과는 본 명세서에 따로 기재하지 않았을 뿐이다.
<4-2> 전체 IgG 변환 분석
CK17에 대한 단일 클론 파아지 항체들을 파아지에서 IgG 전체 벡터로 전환하기 위해 중쇄는 단일 클론 DNA 1 ㎕와 10 pmole/㎕ 표 8의 중쇄 정방향 프라이머와 중쇄 역방향 프라이머, 10X buffer 5 ㎕, 10 mM dNTP mix 1 ㎕, pfu DNA 중합효소(솔젠트, 2.5 U/㎕) 0.5 ㎕,증류수를 혼합하여 콜로니 PCR(iCycler iQ, BIO-RAD)을 수행하였다. 또한, 경쇄도 표 8의 경쇄 정방향 및 역방향 프라이머를 사용하여 동일한 방법으로 콜로니 PCR을 수행하였다.
클론명 중쇄 경쇄
정방향 프라이머 역방향 프라이머 정방향 프라이머 역방향 프라이머
(Sfi I) (NheI) (Sfi I) (Bgl II)
D1-1B2 NATVH3-2: 서열번호 65 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGGTGCAGCTGGTGGAGTC NATJH-ALL: 서열번호 67 GAGGAGGCTAGCTGAGGAGACGGTGA NATVK1-1: 서열번호 68 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGGACATCCAGATGACCCAGTC NATJK-R4: 서열번호 70 GAGGAGAGATCTTTTGATTTCCACCTTGGT
D3-9D NATVL4: 서열번호 69 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGTCTGCCCTGACTCAGCC NATJL1-R: 서열번호 71 GAGGAGAGATCTTAGGACGGTGACCTTGGTCCC
D3-5C NATVH1-1: 서열번호 66 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGGTGCAGCTGGTGCAGTC NATVK1-1: 서열번호 68 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGGACATCCAGATGACCCAGTC NATJK-R7: 서열번호 72 GAGGAGAGATCTTTTGATTTCCAGCTTGGT
D3-12F NATVL4: 서열번호 69 TTGGTGGCCACAGCGGCCGATGTCCACTCGCAGTCTGCCCTGACTCAGCC NATJL1-R: 서열번호 71 GAGGAGAGATCTTAGGACGGTGACCTTGGTCCC
PCR 결과 수득한 중쇄 유전자를 DNA-겔 추출 키트(Qiagen)로 정제한 후, pNATAB H 벡터(도 14a) 1 ㎕(10 ng), 중쇄(100~200 ng) 15 ㎕, 10 X Buffer 2 ㎕, Ligase (1 U/㎕) 1 ㎕, 증류수를 혼합하여 실온에서 1~2시간 방치하여 상기 벡터와 연결하였다. 상기 벡터를 형질전환용 세포(XL1-blue)와 함께 얼음에 30분간 방치한 후, 42℃에서 90초간 열충격을 주어 형질도입하였다. 다시 얼음에 5분간 방치한 후, LB 배지 1 ㎖을 주입하고 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. LB Amp 고체배지에 도말한 후, 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 단일 콜로니를 LB Amp 액체배지 5 ㎖에 접종하여 37℃에서 16시간 동안 배양하였다. 상기 배양액으로부터 DNA-prep. 키트(Nuclogen)를 이용하여 DNA를 추출하였다.
또한, 경쇄는 pNATAB L 벡터(도 14b)를 사용하여 상기와 같은 방법으로 DNA를 추출하였다.
상기 수득한 DNA의 CMV-proF 프라이머(서열번호 9: AAA TGG GCG GTA GGC GTG)를 이용한 염기서열 분석을 의뢰하였다(솔젠트).
그 결과, 전체 IgG로 전환한 CK17에 대한 4개의 클론 파아지의 중쇄와 경쇄의 서열이 파아지 항체의 서열과 일치됨을 확인하였다.
<4-3> 전체 IgG 의 검증
293E 세포에 PEI 40 ㎍과 실시예 4-2에서 수득한 전체 형태(Whole form) 항체 중쇄 DNA 10 ㎍, 경쇄 DNA 10 ㎍을 넣어 공동-형질감염체를 수득하였다. 이를 배양하여 얻은 상등액을 전기영동한 후, 웨스턴 블랏으로 확인하였다. 대조군으로는 정상 인간 IgG(Jackson Lab)을 이용하였다.
그 결과, 도 11에서 나타난 바와 같이 대조군과 비교하여 성공적으로 전체 IgG 형태로 전환되었음을 확인하였다.
또한, 상기 4개의 전체 형태 IgG 를 단백질 A-친화도 크로마토그래피 컬럼(Pharmacia, GE, USA)을 이용하여 정제한 후(도 12), 실시예 4-1의 방법으로 SKOV3 세포주에서 상기 전체 항체의 CK17에 대한 결합력을 상업적으로 구매한 항 CK17 항체(Anti-KRT17)와 비교하여 FACS로 확인하였다(도 13a 및 13b). 이때, 사용한 정제된 D1-1B2 항체를 허셉틴(Herceptin, Roche, 스위스)을 대조군으로 사용하여, SDS-PAGE 방법으로 환원 및 비환원 조건에서 품질을 비교한 결과를 도 13c에서 나타내었다.
아울러, 농도별 항원 CK17-D1과 CK17-D3에 대한 본 발명의 항체들, 인간 IgG, 항 CK17 항체 및 정상 마우스 IgG의 결합 특이성을 실시예 3-2-2와 동일한 방법으로 확인하였다.
그 결과, 표 9에서 나타난 바와 같이 예상대로 각 항체들이 각각의 항원에 대해 특이성을 보였고, 항 CK17 항체의 경우 CK17-D3와 비교하여 CK17-D1에만 결합하였고, 이로부터 CK17-D2 부위를 특이적으로 인식하는 것을 제한하였다.
Figure 112009026201576-pat00003
도 1은 사이토케라틴17 단백질의 소수성 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 발현 조건에 따른 CK17-D1의 발현량을 SDS-PAGE로 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 정제된 CK17-D1을 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 발현 조건에 따른 CK17-D3의 발현량을 SDS-PAGE로 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 정제된 CK17-D3를 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 패닝 단계에서의 파아지 항체 탐색 결과를 나타낸 도이다:
a: CK17-D1; 및,
b: CK17-D3.
도 7은 인간 CK17 단일 파아지 클론 항체 다양성을 핑거프린팅을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다:
a: CK17-D1; 및,
b: CK17-D3.
도 8은 CK17-D1에 대한 인간 CK17 단일 파아지 클론 항체의 CDR에서 폴리펩티드를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 9는 CK17-D3에 대한 인간 CK17 단일 파아지 클론 항체의 CDR에서 폴리펩티드를 분석한 결과를 나타낸 도이다:
a: 중쇄; 및,
b: 경쇄.
도 10은 인간 CK17 단일클론 항체의 결합 특이성을 비교한 결과를 나타낸 도이다:
a: CK17-D1; 및,
b: CK17-D3.
도 11은 전체 IgG로의 전환을 웨스턴 블랏팅으로 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 12는 정제된 전체 IgG를 SDS-PAGE로 확인한 결과를 나타낸 도이다:
a: D3-5C, D3-9D; 및,
b: D3-12F, D1-1B2.
도 13은 정제된 전체 IgG의 결합 특이성을 비교한 결과를 나타낸 도이다:
a: 항 KRT17;
b: D1-1B2; 및,
c: 품질비교.
도 14는 pNATAB H 벡터 및 pNATAB L 벡터의 개열지도를 나타낸 도이다:
a: pNATAB H 벡터; 및,
b: pNATAB L 벡터.
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Cytokeratin17 specific human antibody <130> 9P-04-66 <160> 72 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 432 <212> PRT <213> Homo sapiens Cytokeratin 17 <400> 1 Met Thr Thr Ser Ile Arg Gln Phe Thr Ser Ser Ser Ser Ile Lys Gly 1 5 10 15 Ser Ser Gly Leu Gly Gly Gly Ser Ser Arg Thr Ser Cys Arg Leu Ser 20 25 30 Gly Gly Leu Gly Ala Gly Ser Cys Arg Leu Gly Ser Ala Gly Gly Leu 35 40 45 Gly Ser Thr Leu Gly Gly Ser Ser Tyr Ser Ser Cys Tyr Ser Phe Gly 50 55 60 Ser Gly Gly Gly Tyr Gly Ser Ser Phe Gly Gly Val Asp Gly Leu Leu 65 70 75 80 Ala Gly Gly Glu Lys Ala Thr Met Gln Asn Leu Asn Asp Arg Leu Ala 85 90 95 Ser Tyr Leu Asp Lys Val Arg Ala Leu Glu Glu Ala Asn Thr Glu Leu 100 105 110 Glu Val Lys Ile Arg Asp Trp Tyr Gln Arg Gln Ala Pro Gly Pro Ala 115 120 125 Arg Asp Tyr Ser Gln Tyr Tyr Arg Thr Ile Glu Glu Leu Gln Asn Lys 130 135 140 Ile Leu Thr Ala Thr Val Asp Asn Ala Asn Ile Leu Leu Gln Ile Asp 145 150 155 160 Asn Ala Arg Leu Ala Ala Asp Asp Phe Arg Thr Lys Phe Glu Thr Glu 165 170 175 Gln Ala Leu Arg Leu Ser Val Glu Ala Asp Ile Asn Gly Leu Arg Arg 180 185 190 Val Leu Asp Glu Leu Thr Leu Ala Arg Ala Asp Leu Glu Met Gln Ile 195 200 205 Glu Asn Leu Lys Glu Glu Leu Ala Tyr Leu Lys Lys Asn His Glu Glu 210 215 220 Glu Met Asn Ala Leu Arg Gly Gln Val Gly Gly Glu Ile Asn Val Glu 225 230 235 240 Met Asp Ala Ala Pro Gly Val Asp Leu Ser Arg Ile Leu Asn Glu Met 245 250 255 Arg Asp Gln Tyr Glu Lys Met Ala Glu Lys Asn Arg Lys Asp Ala Glu 260 265 270 Asp Trp Phe Phe Ser Lys Thr Glu Glu Leu Asn Arg Glu Val Ala Thr 275 280 285 Asn Ser Glu Leu Val Gln Ser Gly Lys Ser Glu Ile Ser Glu Leu Arg 290 295 300 Arg Thr Met Gln Ala Leu Glu Ile Glu Leu Gln Ser Gln Leu Ser Met 305 310 315 320 Lys Ala Ser Leu Glu Gly Asn Leu Ala Glu Thr Glu Asn Arg Tyr Cys 325 330 335 Val Gln Leu Ser Gln Ile Gln Gly Leu Ile Gly Ser Val Glu Glu Gln 340 345 350 Leu Ala Gln Leu Arg Cys Glu Met Glu Gln Gln Asn Gln Glu Tyr Lys 355 360 365 Ile Leu Leu Asp Val Lys Thr Arg Leu Glu Gln Glu Ile Ala Thr Tyr 370 375 380 Arg Arg Leu Leu Glu Gly Glu Asp Ala His Leu Thr Gln Tyr Lys Lys 385 390 395 400 Glu Pro Val Thr Thr Arg Gln Val Arg Thr Ile Val Glu Glu Val Gln 405 410 415 Asp Gly Lys Val Ile Ser Ser Arg Glu Gln Val His Gln Thr Thr Arg 420 425 430 <210> 2 <211> 353 <212> PRT <213> CK17-D1 <400> 2 Leu Ala Gly Gly Glu Lys Ala Thr Met Gln Asn Leu Asn Asp Arg Leu 1 5 10 15 Ala Ser Tyr Leu Asp Lys Val Arg Ala Leu Glu Glu Ala Asn Thr Glu 20 25 30 Leu Glu Val Lys Ile Arg Asp Trp Tyr Gln Arg Gln Ala Pro Gly Pro 35 40 45 Ala Arg Asp Tyr Ser Gln Tyr Tyr Arg Thr Ile Glu Glu Leu Gln Asn 50 55 60 Lys Ile Leu Thr Ala Thr Val Asp Asn Ala Asn Ile Leu Leu Gln Ile 65 70 75 80 Asp Asn Ala Arg Leu Ala Ala Asp Asp Phe Arg Thr Lys Phe Glu Thr 85 90 95 Glu Gln Ala Leu Arg Leu Ser Val Glu Ala Asp Ile Asn Gly Leu Arg 100 105 110 Arg Val Leu Asp Glu Leu Thr Leu Ala Arg Ala Asp Leu Glu Met Gln 115 120 125 Ile Glu Asn Leu Lys Glu Glu Leu Ala Tyr Leu Lys Lys Asn His Glu 130 135 140 Glu Glu Met Asn Ala Leu Arg Gly Gln Val Gly Gly Glu Ile Asn Val 145 150 155 160 Glu Met Asp Ala Ala Pro Gly Val Asp Leu Ser Arg Ile Leu Asn Glu 165 170 175 Met Arg Asp Gln Tyr Glu Lys Met Ala Glu Lys Asn Arg Lys Asp Ala 180 185 190 Glu Asp Trp Phe Phe Ser Lys Thr Glu Glu Leu Asn Arg Glu Val Ala 195 200 205 Thr Asn Ser Glu Leu Val Gln Ser Gly Lys Ser Glu Ile Ser Glu Leu 210 215 220 Arg Arg Thr Met Gln Ala Leu Glu Ile Glu Leu Gln Ser Gln Leu Ser 225 230 235 240 Met Lys Ala Ser Leu Glu Gly Asn Leu Ala Glu Thr Glu Asn Arg Tyr 245 250 255 Cys Val Gln Leu Ser Gln Ile Gln Gly Leu Ile Gly Ser Val Glu Glu 260 265 270 Gln Leu Ala Gln Leu Arg Cys Glu Met Glu Gln Gln Asn Gln Glu Tyr 275 280 285 Lys Ile Leu Leu Asp Val Lys Thr Arg Leu Glu Gln Glu Ile Ala Thr 290 295 300 Tyr Arg Arg Leu Leu Glu Gly Glu Asp Ala His Leu Thr Gln Tyr Lys 305 310 315 320 Lys Glu Pro Val Thr Thr Arg Gln Val Arg Thr Ile Val Glu Glu Val 325 330 335 Gln Asp Gly Lys Val Ile Ser Ser Arg Glu Gln Val His Gln Thr Thr 340 345 350 Arg <210> 3 <211> 276 <212> PRT <213> CK17-D3 <400> 3 Leu Gln Ile Asp Asn Ala Arg Leu Ala Ala Asp Asp Phe Arg Thr Lys 1 5 10 15 Phe Glu Thr Glu Gln Ala Leu Arg Leu Ser Val Glu Ala Asp Ile Asn 20 25 30 Gly Leu Arg Arg Val Leu Asp Glu Leu Thr Leu Ala Arg Ala Asp Leu 35 40 45 Glu Met Gln Ile Glu Asn Leu Lys Glu Glu Leu Ala Tyr Leu Lys Lys 50 55 60 Asn His Glu Glu Glu Met Asn Ala Leu Arg Gly Gln Val Gly Gly Glu 65 70 75 80 Ile Asn Val Glu Met Asp Ala Ala Pro Gly Val Asp Leu Ser Arg Ile 85 90 95 Leu Asn Glu Met Arg Asp Gln Tyr Glu Lys Met Ala Glu Lys Asn Arg 100 105 110 Lys Asp Ala Glu Asp Trp Phe Phe Ser Lys Thr Glu Glu Leu Asn Arg 115 120 125 Glu Val Ala Thr Asn Ser Glu Leu Val Gln Ser Gly Lys Ser Glu Ile 130 135 140 Ser Glu Leu Arg Arg Thr Met Gln Ala Leu Glu Ile Glu Leu Gln Ser 145 150 155 160 Gln Leu Ser Met Lys Ala Ser Leu Glu Gly Asn Leu Ala Glu Thr Glu 165 170 175 Asn Arg Tyr Cys Val Gln Leu Ser Gln Ile Gln Gly Leu Ile Gly Ser 180 185 190 Val Glu Glu Gln Leu Ala Gln Leu Arg Cys Glu Met Glu Gln Gln Asn 195 200 205 Gln Glu Tyr Lys Ile Leu Leu Asp Val Lys Thr Arg Leu Glu Gln Glu 210 215 220 Ile Ala Thr Tyr Arg Arg Leu Leu Glu Gly Glu Asp Ala His Leu Thr 225 230 235 240 Gln Tyr Lys Lys Glu Pro Val Thr Thr Arg Gln Val Arg Thr Ile Val 245 250 255 Glu Glu Val Gln Asp Gly Lys Val Ile Ser Ser Arg Glu Gln Val His 260 265 270 Gln Thr Thr Arg 275 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CK17-D1 Forward primer <400> 4 gtctagccat ggaactggct ggaggtgag 29 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CK17-D1 Reverse primer <400> 5 gtctagaagc ttgcgggtgg tctggtg 27 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CK17-D3 Forward primer <400> 6 gtctagccat ggaactacag attgacaatg cc 32 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pelB5 Forward primer <400> 7 ctagataacg agggcaaatc atg 23 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cla3 Reverse primer <400> 8 cgtcaccaat gaaaccatc 19 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CMV-proF primer <400> 9 aaatgggcgg taggcgtg 18 <210> 10 <211> 141 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D1-1B2 Heavy chain <400> 10 Met Ala Gln Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Leu Ser 20 25 30 Thr Tyr Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ser Leu Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Val Ser Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Gly Arg Ala Ser Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Ile Thr Val Ser Ser Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Gly Val Gly Ser 130 135 140 <210> 11 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D1-1F Heavy chain <400> 11 Met Ala Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pro 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 Asp Tyr Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ser Ala Thr Ser Ala Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Lys Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Val Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Ile Thr Val Ser Ser Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Gly Val Gly Ser 130 135 140 <210> 12 <211> 145 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3-12E Heavy chain <400> 12 Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Ala Met Thr Trp Val Arg Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Ser Ser Ile Ser His Ser Gly Arg Val Thr Tyr Tyr Gly Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Ser Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Glu Leu Thr Pro Ser Tyr Gly Phe Asp Thr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Val Ile Thr Val Ser Ser Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Gly Val Gly Ser 130 135 140 Gln 145 <210> 13 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3-12F Heavy chain <400> 13 Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Ala Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Phe His 20 25 30 Asn Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Arg Val Ser Val Ile Tyr Ser Thr Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser 50 55 60 Val Lys Gly Arg Phe Ile Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu 65 70 75 80 Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 90 95 Cys Ala Arg Gly Ser Tyr Ala Gly Tyr Ile Arg Asp Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Gly Val Gly Phe Gln 130 135 140 <210> 14 <211> 147 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3- 6G Heavy chain <400> 14 Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Thr Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro 1 5 10 15 Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser 20 25 30 Ser Tyr Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu 35 40 45 Trp Met Gly Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu 50 55 60 Lys Phe Lys Ser Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Ala Ser Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Lys Asp Leu Gly Arg Tyr Ala His Phe Tyr Met Ala Asp 100 105 110 Trp Gly Lys Gly Thr Thr Ile Thr Val Ser Ser Gly Leu Gly Gly Leu 115 120 125 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Gly Val 130 135 140 Gly Ser Gln 145 <210> 15 <211> 148 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3- 5C Heavy chain <400> 15 Met Ala Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 Asp Tyr Tyr Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 40 45 Trp Val Gly Arg Ser Arg Asn Lys Ala Asn Ser His Thr Thr Glu Tyr 50 55 60 Ala Ala Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys 65 70 75 80 Lys Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 85 90 95 Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Pro Trp Gly Gly Phe Tyr Gly Met Asp 100 105 110 Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Leu Gly Gly 115 120 125 Leu Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Gly 130 135 140 Val Gly Ser Asp 145 <210> 16 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3- 9D Heavy chain <400> 16 Met Ala Gln Val Gln Leu Val Xaa Xaa Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro 1 5 10 15 Gly Gly Ser Leu Gly Phe Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr 20 25 30 Arg Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu Val 35 40 45 Trp Val Ala Gly Ile Lys Asn Asp Gly Asn Arg Thr Met Tyr Ala Asp 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ala Arg Glu Ile Gly Gly Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Leu Gly Gly Leu Gly Gly Gly Gly 115 120 125 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser Gly Val Gly Ser Gln 130 135 140 <210> 17 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D1-1B2 Light chain <400> 17 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg Trp 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Tyr Leu Arg Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ala Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Thr Phe Pro Leu 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<400> 22 Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly Asp 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu 20 25 30 Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 35 40 45 Ala Ala Ser Thr Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu 65 70 75 80 Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Tyr Thr 85 90 95 Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Ala Ser Leu 100 105 110 Val Glu Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 115 120 125 <210> 23 <211> 128 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3-9D Light chain <400> 23 Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln Ser 1 5 10 15 Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Ala Ala Tyr Asn 20 25 30 Phe Val Ser Trp Tyr Gln Gln Tyr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Met 35 40 45 Ile Tyr Asn Ile Arg Thr Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu Gln 65 70 75 80 Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Thr Ser Tyr Ala Gly Arg Asn 85 90 95 Thr Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly Gly 100 105 110 Ala Ser Leu Val Glu Phe Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 115 120 125 <210> 24 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D1-1B2 Heavy chain CDR1 <400> 24 Leu Ser Thr Tyr Ala Met Asn 1 5 <210> 25 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D1-1F Heavy chain CDR1 <400> 25 Phe Ser Asp Tyr Ala Met Thr 1 5 <210> 26 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3-12E Heavy chain CDR1 <400> 26 Phe Ser Ser Tyr Ala Met Thr 1 5 <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3-12F Heavy chain CDR1 <400> 27 Phe His Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3- 6G Heavy chain CDR1 <400> 28 Phe Ser Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3- 5C Heavy chain CDR1 <400> 29 Phe Ser Asp Tyr Tyr Met Asp 1 5 <210> 30 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3-9D Heavy chain CDR1 <400> 30 Phe Thr Arg Tyr Trp Met Gln 1 5 <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D1-1B2 Heavy chain CDR2 <400> 31 Leu Ile Ser Gly Ser Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 32 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D1-1F Heavy chain CDR2 <400> 32 Ala Thr Ser Ala Ser Gly Gly Ser Thr His Tyr Ala Asp Ser Val Arg 1 5 10 15 Gly <210> 33 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3-12E Heavy chain CDR2 <400> 33 Ser Ile Ser His Ser Gly Arg Val Thr Tyr Tyr Gly Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 34 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3-12F Heavy chain CDR2 <400> 34 Val Ile Tyr Ser Thr Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 1 5 10 15 <210> 35 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3- 6G Heavy chain CDR2 <400> 35 Glu Ile Asn Pro Gly Asn Gly His Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Ser <210> 36 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3- 5C Heavy chain CDR2 <400> 36 Arg Ser Arg Asn Lys Ala Asn Ser His Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3-9D Heavy chain CDR2 <400> 37 Gly Ile Lys Asn Asp Gly Asn Arg Thr Met Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 38 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D1-1B2 Heavy chain CDR3 <400> 38 Gly Arg Ala Ser Phe Asp Leu 1 5 <210> 39 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D1-1F Heavy chain CDR3 <400> 39 Gly Leu Val Leu Asp Tyr 1 5 <210> 40 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3-12E Heavy chain CDR3 <400> 40 Glu Leu Thr Pro Ser Tyr Gly Phe Asp Thr 1 5 10 <210> 41 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3-12F Heavy chain CDR3 <400> 41 Gly Ser Tyr Ala Gly Tyr Ile Arg Asp 1 5 <210> 42 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3- 6G Heavy chain CDR3 <400> 42 Asp Leu Gly Arg Tyr Ala His Phe Tyr Met Ala Asp 1 5 10 <210> 43 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3- 5C Heavy chain CDR3 <400> 43 Asp Pro Trp Gly Gly Phe Tyr Gly Met Asp Val 1 5 10 <210> 44 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3-9D Heavy chain CDR3 <400> 44 Glu Ile Gly Gly Ala Phe Asp Ile 1 5 <210> 45 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D1-1B2 Light chain CDR1 <400> 45 Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Arg 1 5 <210> 46 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D1-1F Light chain CDR1 <400> 46 Ser Gly Thr Ser Asp Asp Ile Gly Arg Tyr Asn 1 5 10 <210> 47 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3-12E and D3- 6G Light chain CDR1 <400> 47 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser 1 5 10 <210> 48 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3-12F Light chain CDR1 <400> 48 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly His Asp His Val Ser 1 5 10 <210> 49 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3- 5C Light chain CDR1 <400> 49 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Trp Leu Ala 1 5 10 <210> 50 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3-9D Light chain CDR1 <400> 50 Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Ala Ala Tyr Asn Phe Val Ser 1 5 10 <210> 51 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D1-1B2 Light chain CDR2 <400> 51 Lys Ala Ser Tyr Leu Arg Thr 1 5 <210> 52 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D1-1F Light chain CDR2 <400> 52 Asp Val Thr Arg Arg Ser Ser 1 5 <210> 53 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3-12E Light chain CDR2 <400> 53 Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 54 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3-12F Light chain CDR2 <400> 54 Asp Val Ser Glu Arg Pro Ser 1 5 <210> 55 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3- 6G Light chain CDR2 <400> 55 Asp Val Thr Lys Arg Pro Ser 1 5 <210> 56 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3- 5C Light chain CDR2 <400> 56 Ala Ala Ser Thr Leu His Ser 1 5 <210> 57 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3-9D Light chain CDR2 <400> 57 Asn Ile Arg Thr Arg Pro Ser 1 5 <210> 58 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D1-1B2 Light chain CDR3 <400> 58 Gln Gln Tyr Asn Thr Phe Pro Leu Thr 1 5 <210> 59 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D1-1F Light chain CDR3 <400> 59 Ser Ser Phe Thr Asn Asn Arg Thr Val Val 1 5 10 <210> 60 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3-12E Light chain CDR3 <400> 60 Ser Ser Tyr Thr Ser Ser Ser Thr Val Val 1 5 10 <210> 61 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3-12F Light chain CDR3 <400> 61 Thr Ser Tyr Thr Thr Thr Asn Ser Tyr Val 1 5 10 <210> 62 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3- 6G Light chain CDR3 <400> 62 Ala Ser Tyr Ala Gly Ser Ser Tyr Val 1 5 <210> 63 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3- 5C Light chain CDR3 <400> 63 Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Tyr Thr 1 5 <210> 64 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> D3-9D Light chain CDR3 <400> 64 Thr Ser Tyr Ala Gly Arg Asn Thr Tyr Val 1 5 10 <210> 65 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVH3-2 Forward primer <400> 65 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg caggtgcagc tggtggagtc 50 <210> 66 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVH1-1 Forward primer <400> 66 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg caggtgcagc tggtgcagtc 50 <210> 67 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATJH-ALL Reverse primer <400> 67 gaggaggcta gctgaggaga cggtga 26 <210> 68 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVK1-1 Forward primer <400> 68 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg gacatccaga tgacccagtc 50 <210> 69 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATVL4 Forward primer <400> 69 ttggtggcca cagcggccga tgtccactcg cagtctgccc tgactcagcc 50 <210> 70 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATJK-R4 Reverse primer <400> 70 gaggagagat cttttgattt ccaccttggt 30 <210> 71 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATJL1-R Reverse primer <400> 71 gaggagagat cttaggacgg tgaccttggt ccc 33 <210> 72 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NATJK-R7 Reverse primer <400> 72 gaggagagat cttttgattt ccagcttggt 30

Claims (31)

  1. 하기 1) 내지 7) 중 어느 하나의 사이토케라틴17(Cytokeratin17)에 특이적인 인간 항체:
    1) 서열번호 24의 아미노산 서열로 구성된 중쇄 상보성 결정영역(이하,HCDR)1, 서열번호 31의 아미노산 서열로 구성된 HCDR2 및 서열번호 38의 아미노산 서열로 구성된 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 중쇄, 및
    서열번호 45의 아미노산 서열로 구성된 경쇄 상보성 결정영역(이하, LCDR)1, 서열번호 51의 아미노산 서열로 구성된 LCDR2 및 서열번호 58의 아미노산 서열로 구성된 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 경쇄를 포함하는 사이토케라틴17(Cytokeratin17)에 특이적인 인간 항체;
    2) 서열번호 25의 아미노산 서열로 구성된 중쇄 상보성 결정영역(이하,HCDR)1, 서열번호 32의 아미노산 서열로 구성된 HCDR2 및 서열번호 39의 아미노산 서열로 구성된 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 중쇄, 및
    서열번호 46의 아미노산 서열로 구성된 경쇄 상보성 결정영역(이하, LCDR)1, 서열번호 52의 아미노산 서열로 구성된 LCDR2 및 서열번호 59의 아미노산 서열로 구성된 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 경쇄를 포함하는 사이토케라틴17(Cytokeratin17)에 특이적인 인간 항체;
    3) 서열번호 26의 아미노산 서열로 구성된 중쇄 상보성 결정영역(이하,HCDR)1, 서열번호 33의 아미노산 서열로 구성된 HCDR2 및 서열번호 40의 아미노산 서열로 구성된 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 중쇄, 및
    서열번호 47의 아미노산 서열로 구성된 경쇄 상보성 결정영역(이하, LCDR)1, 서열번호 53의 아미노산 서열로 구성된 LCDR2 및 서열번호 60의 아미노산 서열로 구성된 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 경쇄를 포함하는 사이토케라틴17(Cytokeratin17)에 특이적인 인간 항체;
    4) 서열번호 27의 아미노산 서열로 구성된 중쇄 상보성 결정영역(이하,HCDR)1, 서열번호 34의 아미노산 서열로 구성된 HCDR2 및 서열번호 41의 아미노산 서열로 구성된 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 중쇄, 및
    서열번호 48의 아미노산 서열로 구성된 경쇄 상보성 결정영역(이하, LCDR)1, 서열번호 54의 아미노산 서열로 구성된 LCDR2 및 서열번호 61의 아미노산 서열로 구성된 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 경쇄를 포함하는 사이토케라틴17(Cytokeratin17)에 특이적인 인간 항체;
    5) 서열번호 28의 아미노산 서열로 구성된 중쇄 상보성 결정영역(이하,HCDR)1, 서열번호 35의 아미노산 서열로 구성된 HCDR2 및 서열번호 42의 아미노산 서열로 구성된 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 중쇄, 및
    서열번호 47의 아미노산 서열로 구성된 경쇄 상보성 결정영역(이하, LCDR)1, 서열번호 55의 아미노산 서열로 구성된 LCDR2 및 서열번호 62의 아미노산 서열로 구성된 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 경쇄를 포함하는 사이토케라틴17(Cytokeratin17)에 특이적인 인간 항체;
    6) 서열번호 29의 아미노산 서열로 구성된 중쇄 상보성 결정영역(이하,HCDR)1, 서열번호 36의 아미노산 서열로 구성된 HCDR2 및 서열번호 43의 아미노산 서열로 구성된 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 중쇄, 및
    서열번호 49의 아미노산 서열로 구성된 경쇄 상보성 결정영역(이하, LCDR)1, 서열번호 56의 아미노산 서열로 구성된 LCDR2 및 서열번호 63의 아미노산 서열로 구성된 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 경쇄를 포함하는 사이토케라틴17(Cytokeratin17)에 특이적인 인간 항체; 및
    7) 서열번호 30의 아미노산 서열로 구성된 중쇄 상보성 결정영역(이하,HCDR)1, 서열번호 37의 아미노산 서열로 구성된 HCDR2 및 서열번호 44의 아미노산 서열로 구성된 HCDR3을 포함하는 중쇄 가변영역(VH)을 포함하는 중쇄, 및
    서열번호 50의 아미노산 서열로 구성된경쇄 상보성 결정영역(이하, LCDR)1, 서열번호 57의 아미노산 서열로 구성된 LCDR2 및 서열번호 64의 아미노산 서열로 구성된 LCDR3을 포함하는 경쇄 가변영역(VL)을 포함하는 경쇄를 포함하는 사이토케라틴17(Cytokeratin17)에 특이적인 인간 항체.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 1) 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 10, 2) 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 11, 3) 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 12, 4) 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 13, 5) 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 14, 6) 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 15, 7) 항체의 중쇄 가변영역은 서열번호 16의 아미노산 서열로 각각 구성되는 것을 특징으로 하는 인간 항체.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 1) 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 17, 2) 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 18, 3) 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 19, 4) 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 20, 5) 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 21, 6) 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 22, 7) 항체의 경쇄 가변영역은 서열번호 23의 아미노산 서열로 각각 구성되는 것을 특징으로 하는 인간 항체.
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  12. 제 1항의 인간 항체를 포함하는 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 사이토케라틴17이 과발현되는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 화학적 요법과 병행하여 투여하는 것을 특징으로 하는 약 학적 조성물.
  14. 제 1항의 인간 항체 및 치료용 방사선 동위원소를 포함하는 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 사이토케라틴17이 과발현되는 암의 방사선면역 치료용 약학적 조성물.
  15. 제 14항에 있어서, 상기 치료용 방사선 동위원소는 3H, 11C, 14C, 18F, 64Cu, 76Br, 86Y, 99mTc, 111In, 123I, 177Lu 및 이들의 혼합물 및 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 특징으로 하는 약학적 조성물.
  16. 제 14항 또는 제 15항에 있어서, 상기 치료용 방사선 동위원소는 인간 항체와 결합되거나 인간 항체가 결합된 운반체에 포함되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  17. 삭제
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  20. 제 1항의 인간 항체, 상기 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄, 또는 그의 면역학적으로 활성을 가진 단편의 진단적 유효량을 포함하는 대장암, 췌장암, 신장암, 폐암, 유방암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 사이토케라틴17이 과발현되는 암 질환 검출용 조성물.
  21. 삭제
  22. 제 20항에 있어서, 상기 인간 항체, 인간 항체의 경쇄 또는 중쇄, 또는 그의 단편은 치료용 방사선 동위원소, 형광체, 효소, 효소 기질, 효소 보조인자, 효소 억제제 또는 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 검출가능한 표지에 직접적으로 또는 간접적으로 결합되거나 연결된 것을 특징으로 하는 검출용 조성물.
  23. 제 22항에 있어서, 상기 치료용 방사선 동위원소는 3H, 11C, 14C, 18F, 64Cu, 76Br, 86Y, 99 mTc, 111In, 123I, 177Lu 및 이들의 혼합물 및 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 특징으로 하는 검출용 조성물.
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