KR20190134614A - B7-h3 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이의 의학적 용도 - Google Patents

B7-h3 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이의 의학적 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 B7-H3 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이의 의학적 용도를 제공한다. 또한, 본 발명은 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약학 조성물 및 의약으로서 이의 용도를 개시한다. 특히, 본 발명은 B7-H3 관련 질환 또는 상태의 치료용 약제의 제조를 위한, 인간 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도를 개시한다.

Description

B7-H3 항체, 이의 항원-결합 단편 및 이의 의학적 용도
본 발명은 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편에 관한 것이고, 본 발명은 또한 B7-H3 항체의 CDR 영역을 포함하는 인간 항체에 관한 것이며, 본 발명은 또한 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 약학 조성물, 및 B7-H3 관련 질환에 대한 진단시약 및 치료제로서의 이의 용도에 관한 것이다.
T 세포-매개성 면역 반응은 유기체의 항-종양 프로세스(anti-tumor process)에서 매우 중요한 역할을 하지만, T 세포의 활성화 및 증식은 TCR에 의해 인식되는 항원 신호뿐만 아니라 동시-자극성 분자(co-stimulatory molecule)에 의해 제공되는 제2 신호 또한 필요로 한다. B7 패밀리의 분자는 동시-자극성 분자 면역글로불린 슈퍼패밀리(superfamily)에 속한다. 점점 더 많은 연구에서 이 패밀리의 분자가 유기체의 정상적인 면역 기능과 병리학적 상태에서 중요한 조절 역할을 한다는 것이 밝혀졌다.
B7-H3은 B7 패밀리의 구성원으로 제I형 막관통 단백질(transmembrane protein)에 속하며, 이는 아미노 말단에서의 신호 펩타이드, 세포 외 면역글로불린-유사 가변 영역(IgV) 및 불변 영역(IgC), 막관통 영역, 및 45개의 아미노산을 가지는 세포질 꼬리 영역(cytoplasmic tail region)을 함유한다(Tissue Antigens. 2007 Aug; 70(2): 96-104). 현재, B7-H3은 주로 두 종류의 스플라이싱 변이체(splicing variant) B7-H3a 및 B7-H3b를 포함한다. B7-H3a의 세포 외 도메인은 IgV-IgC(2IgB7-H3이라고도 함)의 2개의 면역글로불린 도메인으로 이루어진 반면, B7-H3b의 세포 외 도메인은 IgV-IgC-IgV-IgC(4IgB7-H3이라고도 함)의 4개의 면역글로불린 도메인으로 이루어진다.
B7-H3 단백질은 정상 조직 및 세포에서 발현되지 않거나 불량하게 발현되지만, 다양한 종양 조직에서 고도로 발현되며 종양 진행, 환자 생존 및 예후와 밀접하게 관련되어 있다. B7-H3은 많은 유형의 암, 특히 비-소세포 폐암(non-small cell lung cancer), 신장암(renal cancer), 뇨관 상피암(urinary tract epithelial cancer), 결장직장암(colorectal cancer), 전립선암(prostate cancer), 다형성 교아종(glioblastoma multiforme), 난소암(ovarian cancer) 및 췌장암(pancreas cancer)에서 과-발현되는 것으로 임상적으로 보고되었다(Lung Cancer. 2009 Nov; 66(2): 245-249; Clin Cancer Res. 2008 Aug 15; 14(16): 5150-5157). 또한, 전립선암에서, B7-H3의 발현 수준은 임상 병리학적 악성종양(malignancy)(예컨대, 종양 부피, 전립선외 침습(extra-prostatic invasion) 또는 글리슨 점수(Gleason score))과 양의(positively) 상관관계가 있으며, 또한 암 진행과 관련이 있는 것으로 문헌에 보고되어 있다(Cancer Res. 2007 Aug 15; 67(16):7893-7900). 유사하게는, 다형성 교아종에서 B7-H3의 발현은 무합병증 생존률(event-free survival)과 역(inversely)의 상관관계가 있으며, 췌장암에서 B7-H3의 발현은 림프절 전이 및 병리학적 진행과 관련이 있다. 따라서, B7-H3은 새로운 종양 마커 및 잠재적인 치료 표적으로 고려된다.
현재, 전임상 연구를 위한 B7-H3 표적에 특이적인 치료 전략이 있으며, 예를 들어 쥣과 B7-H3을 표적화하는 항체는 종양에서 침윤성(infiltrative) CD8-양성 T 세포를 증가시키고 종양 성장을 억제할 것이다(Mod Pathol. 2010 Aug; 23(8): 1104-1112). 또한, 특허 제WO 2008/066691호는 B7-H3 변이체 B7-H3a를 인식하는 항체가 선암종(adenocarcinoma)에서 생체 내(in vivo) 항-종양 효과를 나타내었음을 보여준다. 임상 연구에서, 방사성 I131과 접합된(conjugated) 쥣과 B7-H3 항체의 ADC는 환자에서 신경아세포종(neuroblastoma)의 성장을 현저하게 억제하였다(J Neufooocol 97(3):409-18 (2010)). 그러나, 현재 연구하에 있는 B7H3 항체는 쥣과 항체의 인간화에 의해 조작된 인간화 항체이다. 그러나 면역화 시 인간화 항체는 임의의 쥣과 항체 성분을 함유하지 않은 완전한 인간 항체보다 더 높은 면역원성(immunogenicity)을 갖는다. 이는 인간 적용에서는 바람직하지 않은 인자이다.
파아지 디스플레이(phage display) 기술은 파아지의 표면상에 외인성(exogenous) 단백질을 발현시키기 위하여, 외인성 단백질 또는 폴리펩타이드와 파아지 외피 단백질(coat protein)을 융합시키는 것을 지칭한다. 파아지 항체 라이브러리는 파아지 디스플레이 기술, PCR 증폭 기술 및 단백질 발현 기술을 조합함으로써 확립되는 항체 라이브러리이다.
파아지 항체 라이브러리의 가장 큰 장점은 생체 내 면역화 없이 생체 내에서 항체 생산의 3가지 프로세스를 모방(mimicking)함으로써 완전한 인간 항체를 제조하는 것이다. 또한, 파아지 항체 라이브러리는 다음의 장점을 갖는다: 1) 유전형 및 표현형의 통일(unification)이 달성된다; 또한, 실험 방법은 간단하고 빠르지만 하이브리도마 기술에 의한 전통적인 항체 생산 방법은 몇 개월이 걸린다; 대조적으로, 항체 라이브러리 기술은 단지 몇 주밖에 걸리지 않는다. 2) 발현된 생성물은 완전한 인간 항체이고, 이의 분자량은 작으며, 항체는 주로 활성 단편 Fab 및 scFv의 형태로 발현된다; 완전한 항체와 비교할 때, 그것은 조직 침투성에서 명백한 이점을 갖는다. 3) 스크리닝 용량(capacity)이 크다: 하이브리도마 기술은 수천 개의 클론(clone) 중에서 스크리닝하는데 사용되지만, 항체 라이브러리 기술은 수백만 또는 수억 개의 분자로부터 선택하는데 사용될 수 있으며; 따라서 더 많은 유형의 항체를 얻을 수 있다. 4) 광범위한 적용: 원핵생물(prokaryotic) 발현 시스템을 이용하면 대규모 생산에서 더욱 명백한 이점을 얻을 수 있다(Curr Opin Biotechnol. 2002 Dec;13(6):598-602; Immunotechnology, 2013, 48(13) 48(13): 63-73).
현재, 제WO2008100934호, 제WO2010096734호, 제WO2012147713호, 제WO2015181267호, 제WO2016044383호 등과 같은 특허는 B7-H3 항체를 보고하였지만, 이들 중 대부분은 쥣과 항체 또는 인간화 항체이고; 이들 중 대부분은 국내 또는 해외에서 여전히 임상 1상 및 발견 단계(discovery phase)에 있고, B7-H3를 표적으로 하는 항체 약물 중 어느 것도 시장에서 입수 가능하지 않으므로; 관련 질병의 치료 및 적용을 위해 더 높은 활성, 더 높은 친화성 및 높은 안전성을 갖는 B7-H3 완전 인간 항체를 추가로 개발할 필요가 있다.
본 발명의 한가지 목적은 아미노산 서열(들) 또는 B7-H3 세포 외 영역의 3-차원 구조에 결합하는 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하는 것이다. 또한, 본 발명의 다른 목적은 모노클로날 항체 또는 이의 항체 단편과 경쟁하는 매우 활성이며 매우 안정한 항-인간 B7-H3 완전 인간 항체를 스크리닝하고 수득하는 것이다.
또한, 본 발명은 항체를 암호화하는 DNA, DNA를 포함하는 벡터, 벡터를 형질전환시킴으로써 수득되는 형질전환체(transformant), 형질전환체를 사용하여 항체 또는 이의 항체 단편을 생산하는 방법, 및 상기 항체 또는 이의 항체 단편이 활성 성분으로서 제공되는 진단 시약 또는 치료제를 제공한다.
일 양태에서, 본 발명은 인간 B7-H3에 결합하는 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 여기에서 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음 (i) 내지 (ii)의 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편 중 임의의 하나로부터 선택된다:
(i) 하기 서열로부터 선택되거나 하기에 대해 적어도 95% 동일성(identity)을 갖는 아미노산 서열로부터 선택되는 하나 이상의 CDR 영역 서열을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 10, 11 및 12에 나타낸 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR 서열; 및 서열번호 13, 14 및 15에 나타낸 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR 아미노산 서열;
(ii) 하기 서열로부터 선택되거나 하기에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열로부터 선택되는 하나 이상의 CDR 영역 서열을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
서열번호 16, 17 및 18에 나타낸 바와 같은 항체 중쇄 가변 영역 HCDR 서열; 및 서열번호 19, 20 및 21에 나타낸 바와 같은 항체 경쇄 가변 영역 LCDR 서열.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되며, 여기에서 모노클로날 항체는 재조합 항체이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되며, 여기에서 모노클로날 항체는 인간 재조합 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되며, 여기에서 인간 재조합 항체의 경쇄의 프레임워크(framework, FR) 서열 및 중쇄 가변 영역은 각각 인간 생식세포(germline) 경쇄 및 중쇄, 또는 이의 돌연변이체 서열로부터 유래한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되며, 여기에서 인간 재조합 항체는 서열번호 6 또는 8에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 또는 이의 변이체를 포함하며; 여기에서 변이체는 서열번호 6 또는 8에 나타낸 바와 같은 중쇄 가변 영역 서열에서 1 내지 10개의 아미노산 치환(들)을 갖는다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되며, 여기에서 인간 재조합 항체는 서열번호 7 또는 9에 나타낸 바와 같은 경쇄 가변 영역 또는 이의 변이체를 포함하며; 여기에서 변이체는 서열번호 7 또는 9의 경쇄 가변 영역 서열에서 1 내지 10개의 아미노산 치환(들)을 갖는다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되며, 여기에서 B7-H3 항체는 또한 인간 항체 불변 영역을 포함하고, 바람직하게는 B7-H3 항체는 각각 서열번호 22 및 23에 나타낸 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열로 이루어지는 전장(full-length) 항체; 또는 각각 서열번호 22 및 26에 나타낸 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열로 이루어지는 전장 항체; 또는 각각 서열번호 24 및 25에 나타낸 바와 같은 중쇄 및 경쇄 서열로 이루어지는 전장의 항체를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 본 발명에 따른 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편이 제공되며, 여기에서 항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 단일-사슬 항체(single-chain antibody, scFv), 이량체화 V 영역(dimerized V region)(디아바디(diabody)), 이황화-안정화 V 영역(disulfide-stabilized V region, dsFv) 및 CDR 함유 펩티드(CDR-containing peptide)로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
다른 양태에서, 본 발명은 분리된 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 제공하며, 이는 인간 B7-H3에 대한 결합에 대해 상기 기술된 바와 같은 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁하는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한 치료학적 유효량의 본 발명에 따른 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 본 발명에 기술된 바와 같은 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 기술된 바와 같은 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 기술된 바와 같은 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하며, 숙주 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포, 바람직하게는 진핵 세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포 또는 효모 세포로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
본 발명은 또한 본 발명에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 방법을 제공하며, 여기에서 방법은 상기 기술된 바와 같은 숙주 세포를 배양물에서 배양하여 본 발명에 따른 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 형성 및 축적시키는 단계 및 배양물로부터 축적된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 B7-H3을 면역학적으로 검출하거나 측정하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 방법은 본 발명에 기술된 바와 같은 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 이용하는 단계를 포함한다.
본 발명은 또한 인간 B7-H3를 검출하거나 측정하기 위한 시약을 제공하며, 여기에서 시약은 본 발명에 기술된 바와 같은 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
본 발명은 또한 B7-H3 양성 세포와 관련된 질환을 검출하기 위한 진단 시약을 제공하며, 진단 시약은 본 발명에 기술된 바와 같은 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함한다.
본 발명은 또한 B7-H3 양성 세포와 관련된 질환을 진단하기 위한 방법을 제공하며, 이러한 방법은 본 발명에 기술된 바와 같은 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용함으로써 B7-H3 또는 B7-H3 양성 세포를 검출하거나 결정하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 B7-H3 양성 세포와 관련된 질환에 대한 진단 시약의 제조를 위한, 본 발명에 기술된 바와 같은 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 용도를 제공한다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 B7-H3 양성 세포와 관련된 질환을 치료하기 위한 치료제를 제공하며, 치료제는 본 발명에 기술된 바와 같은 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하거나, 상기 기술된 바와 같은 약학 조성물, 또는 상기 기술된 바와 같은 핵산 분자를 포함한다.
본 발명은 또한 B7-H3 양성 세포와 관련된 질환을 치료하는 방법을 제공하며, 방법은 본 발명에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 상기 기술된 바와 같은 약학 조성물, 또는 상기 기술된 바와 같은 핵산 분자를 사용함으로써 B7-H3 양성 세포의 세포사(cell death)를 유도하는 단계를 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 또한 B7-H3 양성 세포와 관련된 질환을 치료하기 위한 치료제의 제조에 있어서, 본 발명에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 약학 조성물, 또는 핵산 분자의 용도를 제공한다.
1. 용어
본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위해, 특정 기술 및 과학 용어가 하기에 구체적으로 정의되어 있다. 본 문서의 다른 곳에 달리 구체적으로 지시되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 다른 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다.
본원에 사용된 바와 같은, 아미노산에 대한 3-문자 코드 및 1-문자 코드는 J. biol. chem, 243, p3558 (1968)에 기술된 바와 같다.
본원에 사용된 바와 같은, "항체"는 2개의 동일한 중쇄 및 2개의 동일한 경쇄 사이에서 이황화 결합에 의해 함께 연결되어 있는 4개의 펩타이드 사슬 구조인 면역글로불린을 지칭한다. 상이한 면역글로불린 중쇄 불변 영역은 상이한 아미노산 조성 및 순위 순서(rank order)를 나타내므로, 상이한 종류의 항원성(antigenicity)을 나타낸다. 따라서, 면역글로불린은 5개의 카테고리로 나뉠 수 있거나, 또는 각각 중쇄 μ, δ, γ, α 및 ε를 갖는 면역글로불린 아이소타입(isotype), 즉 IgM, IagD, IgG, IgA 및 IgE으로 불린다. 힌지 영역(hinge region)의 아미노산 조성 및 중쇄 이황화 결합의 수 및 위치에 따라, 동일한 유형의 Ig는 상이한 하위-카테고리로 나뉠 수 있으며, 예를 들어 IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 나뉠 수 있다.　경쇄는 상이한 불변 영역으로 인하여, κ 또는 λ 사슬로 나뉠 수 있다. 다섯 가지의 유형 중에서 각각의 IgG는 κ 또는 λ 사슬을 갖는다.
본 발명에서, 본원에 기술된 바와 같은 항체 경쇄는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함하며, 여기에서 경쇄 불변 영역은 인간 또는 쥣과 κ, λ 사슬 또는 이의 변이체를 포함한다.
본 발명에서, 본원에 기술된 바와 같은 항체 중쇄는 중쇄 불변 영역을 추가로 포함하며, 여기에서 중쇄 불변 영역은 인간 또는 쥣과 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 또는 이의 변이체를 포함한다.
항체 중쇄 및 경쇄의 N-말단에 인접한 약 110개 아미노산의 서열은 가변성이 높아 가변 영역(Fv 영역)으로 알려져 있고; C-말단에 인접한 나머지 아미노산의 서열은 상대적으로 안정하여 불변 영역으로 알려져 있다. 가변 영역은 3개의 초가변 영역(hypervariable region, HVR) 및 4개의 상대적으로 보존된 서열을 갖는 프레임워크 영역(framework region, FR)을 포함한다. 3개의 초가변 영역은 항체의 특이성을 결정하며, 상보성 결정 영역(complementarity determining region, CDR)으로도 알려져 있다. 각각의 경쇄 가변 영역(LCVR) 및 각각의 중쇄 가변 영역(HCVR)은 아미노 말단에서부터 카복실 말단으로 순차적으로 다음과 같은 3개의 CDR 영역 및 4개의 FR 영역으로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 및 FR4.　3개의 경쇄 CDR은 LCDR1, LCDR2 및 LCDR3을 지칭하고; 3개의 중쇄 CDR은 HCDR1, HCDR2 및 HCDR3을 지칭한다.　본원의 항체 또는 항원 결합 단편의 LCVR 및 HCVR 영역에 있는 CDR 아미노산 잔기의 번호 및 위치는 공지의 Kabat 번호매김 기준(Kabat numbering criteria)(LCDR1-3, HCDR2-3)에 따르거나, Kabat 및 Chothia 번호매김 기준(HCDR1)에 따른다.
용어 "인간 항체" 및 "인간 유래 항체"는 상호교환적으로 사용되며, 인간 면역글로불린 서열로부터 유래하는 하나 이상의 가변 및 불변 영역을 포함하는 항체를 지칭한다. 바람직한 방법 중 하나는 가변 및 불변 영역 모두가 인간 면역글로불린 서열, 즉 "완전 인간 유래 항체(fully human derived antibody)" 또는 "완전 인간 항체(fully human antibody)"로부터 유래하는 것이다. 이들 항체는 다양한 방식으로 수득될 수 있으며, 인간 PBMC, 비장, 림프절 조직으로부터 B 세포를 분리하고 천연의 단일-가닥 파아지 인간 항체 라이브러리를 구성하는 것을 포함하는 파아지 디스플레이 기술을 사용하거나, 인간 항체 경쇄 및 중쇄를 발현하는 형질전환(transgenic) 마우스를 면역화시키고 스크리닝함으로써 수득되는 항체를 포함한다.
본 발명에 사용된 용어 "쥣과 항체(murine antibody)"는 당해 분야의 지식과 기술에 따라 제조되는 인간 B7-H3에 대한 모노클로날 항체를 지칭한다. 제조 동안, 시험 대상체에게 B7-H3 항원을 주사한 후, 원하는 서열 또는 기능적 특성을 갖는 항체를 발현하는 하이브리도마를 분리하였다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 쥣과 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 쥣과 카파, 람다 사슬의 경쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 추가로 포함하거나, 또는 쥣과 IgG1, IgG2, IgG3의 중쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 추가로 포함한다.
용어 "키메라 항체(chimeric antibody)"는 쥣과 항체-유도성 면역 반응을 완화시키도록 쥣과 항체의 가변 영역과 인간 항체의 불변 영역을 융합시켜 형성된 항체이다. 키메라 항체를 확립하기 위하여, 특이적인 쥣과 모노클로날 항체를 분비하는 하이브리도마를 확립하고, 가변 영역 유전자를 쥣과 하이브리도마 세포로부터 클로닝한 후, 인간 항체의 원하는 불변 영역 유전자를 클로닝하여, 쥣과 가변 영역 유전자와 연결시켜 키메라 유전자를 형성하고, 이어서 발현 벡터 내로 삽입시키고, 최종적으로 키메라 항체 분자를 진핵생물 또는 원핵생물 시스템에서 발현시켰다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, B7-H3 키메라 항체의 경쇄는 인간 카파, 람다 사슬 또는 이의 변이체로부터 유래하는 경쇄 불변 영역을 추가로 포함한다. B7-H3 키메라 항체의 중쇄는 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4로부터 유래하는 중쇄 불변 영역 또는 이의 변이체를 추가로 포함하고, 바람직하게는 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4로부터 유래하는 중쇄 불변 영역, 또는 아미노산 돌연변이(예컨대, YTE 돌연변이 또는 역 돌연변이)를 갖는 IgG1, IgG2 또는 IgG4의 변이체를 포함한다.
CDR-이식(CDR-grafted) 항체로도 알려진 용어 "인간화 항체(humanized antibody)"는 인간 항체(즉, 상이한 유형의 인간 생식세포 항체 프레임워크 서열 내에서 생산된 항체)의 가변 영역 프레임워크 내로 쥣과 CDR 서열을 이식함으로써 생성된 항체를 지칭한다. 인간화 항체는 다량의 쥣과 단백질 성분을 포함하는 키메라 항체에 의해 유도되는 이종(heterologous) 반응을 극복한다. 이러한 프레임워크 서열은 생식세포 항체 유전자 서열을 포함하는 공공의 DNA 데이터베이스 또는 공개된 참고문헌으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 인간의 중쇄 및 경쇄 가변 영역 유전자의 생식세포 DNA 서열은 예를 들어, "VBase" 인간 생식세포 서열 데이터베이스(웹 www.mrccpe.com.ac.uk/vbase에서 입수가능)뿐만 아니라, 문헌[Kabat, EA, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition]에서 찾을 수 있다.
CDR 이식은 항원과 접촉하는 프레임워크 잔기로 인하여, 항원에 대한 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 친화성(affinity)을 감소시킬 수 있다. 이러한 상호작용은 체세포 내 초-돌연변이(hyper-mutation)의 결과일 수 있다. 따라서, 이러한 공여체(donor)의 프레임워크 아미노산을 인간화 항체의 프레임워크에 이식하는 것이 여전히 필요할 수 있다. 항원 결합에 관여하는 비-인간 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로부터의 아미노산 잔기는 쥣과 모노클로날 항체 가변 영역 서열 및 구조를 조사함으로써 확인될 수 있다. 생식세포와 상이한 CDR 공여체 프레임워크에 있는 각각의 잔기는 관련성이 있는 것으로 간주될 수 있다. 가장 근접한 생식세포가 결정될 수 없는 경우, 서열은 하위 유형(subtype)의 공통 서열(common sequence) 또는 높은 유사성 백분율을 갖는 쥣과의 서열과 비교될 수 있다. 드믄 프레임워크 잔기는 체세포성 초-돌연변이의 결과인 것으로 생각되므로, 결합에서 중요한 역할을 한다.
항체 용어 "항원-결합 단편(antigen-binding fragment)" 또는 "기능성 단편(functional fragment)"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 하나 이상의 항체의 단편(예를 들어, B7-H3)을 지칭한다. 전장 항체의 단편이 항체의 항원 결합 기능에 사용될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 항체 용어 "항원-결합 단편"에 포함되는 결합 단편의 예는: (i) VL, VH, CL 및 CH1 도메인으로 이루어지는 1가(monomalent) 단편인 Fab 단편; (ii) 힌지 영역에서 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 2가(bivalent) 단편인, F(ab')2 단편, (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어지는 Fd 단편; (iv) 항체의 하나의 암(arm)의 VH 및 VL 도메인으로 이루어지는 Fv 단편; (v) VH 도메인으로 구성되는 단일 도메인 또는 dAb 단편(Ward et al. (1989) Nature 341: 544-546); 및 (vi) 별개의 상보성 결정 영역 (CDR); 또는 (vii) 합성 링커에 의해 선택적으로 연결된 2개 이상의 분리된 CDR의 조합을 포함한다. 또한, Fv 단편의 VL 도메인 및 VH 도메인은 분리된 유전자에 의해 암호화되지만, 이들은 VL 및 VH 도메인(단일-사슬 Fv(scFv)라 불림; 예를 들어, Bird et al. (1988) Science 242: 423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879-5883 참고)과 쌍을 이룸으로써 1가 분자를 갖는 단일 단백질 사슬을 생성할 수 있도록 재조합 방법을 사용하여 합성 링커에 의해 연결될 수 있다. 이러한 단일 사슬 항체는 또한 항체 용어 "항원-결합 단편"에 포함되는 것으로 의도된다. 이러한 항체 단편은 당해 분야에 공지된 기존의 기술을 사용하여 수득되며, 단편의 기능적 스크리닝은 온전한(intact) 항체와 동일한 방식으로 사용된다. 항원 결합 부위는 재조합 DNA 기술에 의해 또는 온전한 면역글로불린의 효소적 또는 화학적 파괴에 의해 생산될 수 있다. 항체는 상이한 표현형, 예를 들어 IgG(예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3 또는 IgG4 아형), IgA1, IgA2, IgD, IgE 또는 IgM 항체으로 존재할 수 있다.
본 발명의 항원-결합 단편은 Fab, F(ab')2, Fab', 단일-사슬 항체(scFv), 이량체화 V 영역(디아바디), 이황화-안정화된 V 영역(dsFv), CDR-함유 펩타이드 등을 포함한다.
Fab는 분자량이 약 50,000이며 항원-결합 활성을 갖는 항체 단편이고, 이러한 단편은 IgG 항체 분자를 프로테아제 파파인(H 사슬의 224번 위치에서 아미노산 잔기를 절단시킴)으로 처리함으로써 수득되며, 여기에서 H 사슬의 N-말단 측면의 약 1/2 및 전체 L 사슬은 이황화 결합에 의해 결합된다.
본 발명의 Fab는 인간 B7-H3을 특이적으로 인식하여 세포 외 영역 아미노산 서열 또는 이의 3-차원 구조에 결합하는 본 발명의 모노클로날 항체를 파파인으로 처리함으로써 생산될 수 있다. 또한, Fab는 항체의 Fab를 암호화하는 DNA를 원핵세포 발현 벡터 또는 진핵세포 발현 벡터 내로 삽입시키고, 벡터를 원핵세포 또는 진핵세포 내로 도입하여 Fab를 발현시킴으로써 생산될 수 있다.
F(ab')2는 IgG 힌지 영역내 2개의 이황화 결합의 하부 부분을 펩신으로 분해함으로써 수득되는 항체 단편이다. 이는 약 100,000의 분자량을 가지고, 항원-결합 활성을 가지며, 힌지 위치에 연결된 2개의 Fab 영역을 포함한다.
본 발명의 F(ab')2는 인간 B7-H3을 특이적으로 인식하여 세포 외 영역 아미노산 서열 또는 이의 3-차원 구조에 결합하는 본 발명의 모노클로날 항체를 펩신으로 처리함으로써 생산될 수 있다. 또한, F(ab')2는 후술된 Fab'를 티오에테르 결합 또는 이황화 결합과 연결시킴으로써 생산될 수 있다.
Fab'는 분자량이 약 50,000이고 항원-결합 활성을 가진 항체 단편이다. 이는 상술한 F(ab')2의 힌지 영역에서 이황화 결합을 절단시킴으로써 수득된다. 본 발명의 Fab'는 인간 B7-H3을 특이적으로 인식하여 세포 외 영역 아미노산 서열 또는 이의 3-차원 구조에 결합하는 본 발명의 F(ab')2를 환원제(예컨대, 디티오트레이톨(dithiothreitol))로 처리함으로써 생산될 수 있다.
또한, Fab'는 항체의 Fab' 단편을 암호화하는 DNA를 원핵세포 발현 벡터 또는 진핵세포 발현 벡터 내로 삽입하고, 벡터를 원핵세포 또는 진핵세포 내로 도입하여 Fab'를 발현시킴으로써 생산될 수 있다.
용어 "단일-사슬 항체(single-chain antibody)", "단일-사슬 Fv" 또는 "scFv"는 링커에 의해 연결되는 항체 중쇄 가변 도메인(또는 영역; VH) 및 항체 경쇄 가변 도메인(또는 영역; VL)을 포함하는 분자를 지칭한다. 이러한 scFv 분자는 일반적인 구조를 갖는다: NH2-VL-링커-VH-COOH 또는 NH2-VH-링커-VL-COOH. 선행 기술의 적합한 링커는 반복되는 GGGGS 아미노산 서열 또는 이의 변이체, 예를 들어 1 내지 4개의 반복체(repeat)를 가지는 변이체로 이루어진다(Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444 -6448). 본 발명에서 사용될 수 있는 다른 링커는 문헌[Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8: 725-731, Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31: 94-106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56: 3055-3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293: 41-56 및 Roovers et al. (2001), Cancer Immunol]에 기술되어 있다.
본 발명의 scFv는 다음의 단계에 의해 생산될 수 있다: 인간 B7-H3를 특이적으로 인식하여 세포 외 영역 아미노산 서열 또는 이의 3-차원 구조에 결합하는 본 발명의 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하는 단계; scFv를 암호화하는 DNA를 제작하는 단계; DNA를 원핵세포 발현 벡터 또는 진핵세포 발현 벡터 내로 삽입하는 단계; 및 이후에 발현 벡터를 원핵세포 또는 진핵세포 내로 도입하여 상기 scFv를 발현시키는 단계.
디아바디는 scFv가 이량체화되어 있는 항체 단편이며, 2가 항원-결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 2가 항원 결합 활성에서, 2개의 항원은 동일하거나 상이할 수 있다.
본 발명의 디아바디는 다음의 단계에 의해 생산될 수 있다: 인간 B7-H3을 특이적으로 인식하여 세포 외 영역 아미노산 서열 또는 이의 3-차원 구조에 결합하는 본 발명의 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하는 단계; 링커 펩타이드의 길이가 8 이하의 아미노산 잔기가 되도록 scFv를 암호화하는 DNA를 제작하는 단계; DNA를 원핵세포 발현 벡터 또는 진핵세포 발현 벡터 내로 삽입하는 단계; 및 이후에 발현 벡터를 원핵세포 또는 진핵세포 내로 도입하여 디아바디를 발현시키는 단계.
dsFv는 VH 및 VL 각각의 하나의 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 후, 2개의 시스테인 잔기 사이의 이황화 결합을 통해 연결함으로써 수득된다. 시스테인 잔기로 치환될 아미노산 잔기는 공지된 방법에 따라 항체의 항체 3-차원 구조 예측에 기초하여 선택될 수 있다(Protein Engineering, 7, 697 (1994)).
본 발명의 dsFv는 다음의 단계에 의해 생산될 수 있다: 인간 B7-H3을 특이적으로 인식하여 세포 외 영역 아미노산 서열 또는 이의 3-차원 구조에 결합하는 본 발명의 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 암호화하는 cDNA를 수득하는 단계; dsFv-암호화 DNA를 제작하는 단계; DNA를 원핵세포 발현 벡터 또는 진핵세포 발현 벡터 내로 삽입하는 단계; 및 이후에 발현 벡터를 원핵세포 또는 진핵세포 내로 도입하여 상기 dsFv를 발현시키는 단계.
CDR-함유 펩타이드는 VH 또는 VL의 CDR의 하나 이상의 영역에 의해 제작된다. 여러 CDR을 포함하는 펩타이드는 직접 또는 적합한 펩타이드 링커를 통해 연결될 수 있다.
본 발명의 CDR-함유 펩타이드는 다음 단계에 의해 생산될 수 있다: 인간 B7-H3을 특이적으로 인식하여 세포 외 영역 아미노산 서열 또는 이의 3-차원 구조에 결합하는 본 발명의 모노클로날 항체의 VH 및 VL의 CDR을 암호화하는 DNA를 제작하는 단계; DNA를 원핵세포 발현 벡터 또는 진핵세포 발현 벡터 내로 삽입하는 단계; 및 이후에 발현 벡터를 원핵세포 또는 진핵세포 내로 도입하여 상기 펩타이드를 발현시키는 단계. CDR-함유 펩타이드는 또한 Fmoc 방법 또는 tBoc 방법과 같은 화학적 합성 방법에 의해 생산될 수 있다.
용어 "CDR"은 항원 결합에 주로 기여하는 항체의 가변 도메인 내 6개의 초가변 영역 중 하나를 지칭한다. 6개의 CDR에 대해 가장 일반적으로 사용되는 정의 중 하나는 Kabat E.A. et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest. NIH Publication 91-3242에 의해 제공된다. 본원에 사용된 바와 같이, CDR의 Kabat 정의는 경쇄 가변 도메인의 CDR1, CDR2 및 CDR3(CDR L1, CDR L2, CDR L3 또는 L1, L2, L3)뿐만 아니라, 중쇄 가변 도메인의 CDR2 및 CDR3(CDR H2, CDR H3 또는 H2, H3)에 적용된다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "항체 프레임워크(antibody framework)"는 가변 도메인 VL 또는 VH의 일부를 지칭하며, 이는 가변 도메인의 항원 결합 루프(CDR)에 대한 스캐폴드(scaffold)로서 제공된다. 본질적으로, 이는 CDR이 없는 가변 도메인이다.
용어 "에피토프(epitope)" 또는 "항원 결정인자(antigenic determinant)"는 이에 대해 면역글로불린 또는 항체가 특이적으로 결합하는 항원의 부위(예를 들어, B7-H3 분자의 특이적인 부위)를 지칭한다. 에피토프는 전형적으로 독특한 공간 구조에 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15개의 연속 또는 비-연속 아미노산을 포함한다. 예를 들어, 문헌[Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)]를 참조.
용어 "특이적인 결합(specific binding)", "선택적 결합(selective binding)", "선택적으로 결합하다(selectively bind)" 및 "특이적으로 결합하다(specifically bind)"는 미리 결정된 항원 상의 에피토프에 대한 항체의 결합을 지칭한다. 전형적으로, 항체는 약 10-7 M 미만, 예컨대 대략 약 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만의 친화성(KD)으로 결합한다.
용어 "KD" 또는 "Kd"는 특정 항체-항원 상호작용에 대한 해리 평형 상수(dissociation equilibrium constant)를 지칭한다. 전형적으로, 본 발명의 항체는 예를 들어, BIACORE 장치에서 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance: SPR) 기술을 사용하여 결정되는 것과 같이, 약 10-7 M 미만, 예컨대 약 10-8 M, 10-9 M 또는 10-10 M 미만의 해리 평형 상수(KD)로 B7-H3에 결합한다.
용어 "경쟁적 결합(competitive binding)"은 본 발명의 모노클로날 항체에 의해 인식되는 것과 같이, 항체가 인간 B7H3의 세포 외 도메인의 동일한 에피토프(또한 항원 결정인자로도 알려져 있음) 또는 이의 일부를 인식하여 이에 결합하는 것을 지칭한다. 본 발명의 모노클로날 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체는 본 발명의 모노클로날 항체에 의해 인식되는 인간 B7-H3의 아미노산 서열을 인식하여 이에 결합하는 항체를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "핵산 분자(nucleic acid)"는 DNA 분자 및 RNA 분자를 지칭한다. 핵산 분자는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있지만, 바람직하게는 이중 가닥 DNA이다. 핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계에 있을 때 "효과적으로 연결(effectively linked)"된다. 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서(enhancer)가 암호화 서열의 전사에 영향을 미치는 경우, 프로모터 또는 인핸서는 코딩 서열에 효과적으로 연결된다.
용어 "벡터(vector)"는 그것이 연결된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 일 구현예에서, 벡터는 추가의 DNA 세그먼트(segment)가 라이게이션될 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프(loop)를 지칭하는 "플라스미드(plasmid)"이다. 다른 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이며, 여기에서 추가의 DNA 세그먼트는 바이러스 게놈 내로 라이게이션될 수 있다. 본원에 개시된 벡터는 이들이 도입된 숙주 세포(예를 들어, 세균 복제 오리진(bacterial replication origin) 및 에피솜(episomal) 포유동물 벡터를 가지는 세균 벡터)에서 자가-복제(self-replicating)될 수 있거나, 또는 숙주 세포로 도입될 때 숙주 세포의 게놈 내로 통합되어 숙주 게놈(예를 들어, 비-에피솜 포유동물 벡터)과 함께 복제될 수 있다.
항체 및 항원-결합 단편을 생산하고 정제하는 방법은 당해 분야에 잘 알려진 방법, 예를 들어 Cold Spring Harbor Antibody Technical Guide, Chapters 5-8 및 15이다. 예를 들어, 마우스는 인간 B7-H3 또는 이의 단편으로 면역화될 수 있고, 수득된 항체는 당해 분야에 공지된 통상의 방법을 사용함으로써 재-천연화(re-natured)되고, 정제되고, 서열분석 될 수 있다. 항원-결합 단편은 또한 통상의 방법으로 제조될 수 있다. 본 발명의 항체 또는 항원-결합 단편은 유전적으로 조작하여 비-인간 CDR 영역에 하나 이상의 인간 FR 영역을 부가할 수 있다. 인간 FR 생식세포 서열(들)은 http://imgt.cines.fr에서 ImMunoGeneTics (IMGT) 웹사이트 또는 Journal of Immunoglobulins 2001ISBN012441351로부터 인간 항체 가변 생식세포 유전자 데이터베이스 및 MOE 소프트웨어를 정렬함으로써 수득될 수 있다.
용어 "숙주 세포(host cell)"는 발현 벡터가 도입되는 세포를 지칭한다. 숙주 세포는 세균, 미생물, 식물 또는 동물 세포를 포함할 수 있다. 형질전환되기 쉬운 세균은 엔테로박테리아세아에(Enterobacteriaceae) 패밀리, 예컨대 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 또는 살모넬라(Salmonella); 바실라세아에(Bacillaceae), 예컨대 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis); 뉴모코쿠스(Pneumococcus); 스트렙토코쿠스(Streptococcus) 및 해모필루스 인플루엔자에(Haemophilus influenzae)를 포함한다. 적합한 미생물은 사카로마이세스 세레비지아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)를 포함한다. 적합한 동물 숙주 세포주는 차이니즈 햄스터 난소 세포주(Chinese hamster ovary cell line, CHO) 및 NS0 세포를 포함한다.
본 발명의 조작된 항체 또는 항원-결합 단편은 통상의 방법으로 제조되고 정제될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 cDNA 서열(들)은 GS 발현 벡터로 클로닝되고 재조합될 수 있다. 재조합 면역글로불린 발현 벡터는 CHO 세포로 안정하게 형질감염될 수 있다. 보다 추천되는 선행기술로서, 포유동물 발현 시스템은 특히 Fc 영역의 고도로 보존된 N-말단 부위에서 항체를 글리코실화한다. 적합한 클론은 인간 B7-H3에 특이적으로 결합하는 항체를 발현시킴으로써 수득된다. 양성 클론은 생물반응기의 혈청을 포함하지 않는 배지에서 증식되어 항체를 생산한다. 분비된 항체를 함유하는 배양 배지는 통상의 기술에 의해 정제될 수 있다. 예를 들어, 정제는 상용성 완충액(compatible buffer)으로 평형화시킨 A 또는 G 세파로즈 FF 컬럼을 사용하여 수행된다. 비-특이적으로 결합된 성분은 세척에 의해 제거된다. 결합된 항체는 pH 구배 방법에 의해 용출되며, 항체 단편은 SDS-PAGE에 의해 검출되어 수집된다. 항체는 통상의 방식으로 여과되어 농축될 수 있다. 가용성 응집체(aggregate) 및 다량체(multimer)는 또한 통상의 방법, 예컨대 크기 배제(size exclusion) 또는 이온 교환에 의해 제거될 수 있다. 생성물은 즉시, 예컨대 -70℃에서 동결시키거나, 또는 동결건조시킬 필요가 있다.
동물, 인간, 실험 대상체, 세포, 조직, 장기 또는 생물학적 유체에 적용되는 경우, "투여(administration)" 및 "치료(treatment)"는 외인성(exobenous) 약학적, 치료적, 진단적 시약 또는 조성물을 동물, 인간, 대상체, 세포, 조직, 장기 또는 생물학적 유체와 접촉시키는 것을 포함한다. "투여" 및 "치료"는 예를 들어, 치료학적, 약동학적, 진단, 조사 및 실험 방법을 지칭할 수 있다. 세포의 처리는 시약을 세포와 접촉시킬 뿐만 아니라, 시약을 유체와 접촉시키는 것을 포함하며, 여기에서 유체는 세포와 접촉된다. "투여" 및 "치료"는 또한 시약, 진단제, 결합 조성물에 의한 또는 다른 세포에 의한, 예를 들어 세포의 시험관 내(in vitro) 및 생체 외(ex vivo) 처리를 의미한다. "치료"는 인간, 가축 또는 연구 대상체에게 적용되는 경우, 치료적 처치, 예방적 또는 방지적 조치(measure), 연구 및 진단 적용을 지칭한다.
"치료하다"는 하나 이상의 질환 증상을 가진 환자에게 그것에 대해 공지된 치료학적 활성을 가진 본 발명의 임의의 결합 화합물을 포함하는 조성물과 같은 치료제를 내부적으로 또는 외부적으로 투여하는 것을 의미한다. 전형적으로, 제제(agent)는 임의의 임상적으로 측정 가능한 정도까지 증상(들)의 퇴행(regression)을 유도하거나 이의 진행을 예방하기 위하여, 치료되는 환자 또는 집단에서 하나 이상의 질환 증상을 완화시키는데 효과적인 양으로 투여된다. 임의의 특정 질환 증상을 완화시키는데 효과적인 치료제의 양("치료학적 유효량"으로도 지칭됨)은 환자의 질환 상태, 연령 및 체중과 같은 인자 및 환자에게서 원하는 반응을 이끌어내는 제제의 능력에 따라 달라질 수 있다. 질환 증상이 완화되었는지 여부는 그 증상의 중증도 또는 진행 상태를 평가하기 위해 의사 또는 다른 숙련된의료 제공자에 의해 전형적으로 사용되는 임의의 임상적 측정에 의해 평가될 수 있다. 본 발명의 구현예(예를 들어, 치료방법 또는 제조 물품)가 모든 환자에서 표적 질환 증상(들)을 완화시키는데 효과적이지 않더라도, 이는 당해 분야에 공지된 임의의 통계적 테스트, 예컨대 스튜던츠 t-테스트(Student's t-test), 카이-자승 테스트(chi-square test), 만 앤드 휘트니(Mann and Whitney)에 따른 U-테스트, 크러스칼-왈리스 테스트(Kruskal-Wallis test: H-테스트), 존케르-텝스트라 테스트(Jonckheere-Terpstra test) 및 윌콕슨 테스트(Wilcoxon test)에 의해 결정되는 바와 같이 통계적으로 유의미한(statistically significant) 수의 환자에서 표적 질환 증상(들)을 완화시켜야 한다.
"보존적 변형(conservative modification)" 또는 "보존적 치환(replacement or substitution)"은 단백질에서 아미노산의 유사한 특성(예를 들어, 전하, 측쇄 크기, 소수성/친수성, 프레임워크 구조 및 강직성(rigidity) 등)을 가지는 다른 아미노산으로의 치환을 지칭하며, 그에 따라 단백질의 생물학적 활성을 변경하지 않고서도 변화가 빈번하게 이루어질 수 있다. 일반적으로, 폴리펩타이드의 비-필수 영역에서의 단일 아미노산 치환은 생물학적 활성을 실질적으로 변경시키지 않는다는 것이 당업자에게 이해될 것이다(예를 들어, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., Page 224, (4th edition) 참조)). 또한, 구조적으로 또는 기능적으로 유사한 아미노산으로의 치환은 생물학적 활성을 방해하지 않을 것이다.
"유효량(effective amount)"은 의학적 질환의 증상 또는 상태를 완화시키거나 예방하기에 충분한 양을 포함한다. 유효량은 또한 진단을 가능하게 하거나 용이하게 하기에 충분한 양을 의미한다. 특정 환자 또는 가축 대상체에 대한 유효량은 다음과 같은 인자에 따라 달라질 수 있다: 치료될 상태, 환자의 전반적인 건강 상태, 투여 경로와 투여 용량 및 부작용의 중증도. 유효량은 현저한 부작용 또는 독성 효과를 피하는 최대 용량 또는 투여 요법일 수 있다.
"외인성(exogenous)"은 상황에 따라 유기체, 세포 또는 인간의 외부에서 생성되는 물질을 지칭한다. "내인성(endogenous)"은 상태에 따라 세포, 유기체 또는 인간에서 생성되는 물질을 지칭한다.
"동일성(identity)"은 2개의 폴리뉴클레오타이드 서열 또는 2개의 폴리펩타이드 서열 사이의 서열 유사성(similarity)을 지칭한다. 비교될 2개의 서열에서의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 서브유닛에 의해 점유될 때, 예를 들어 2개의 DNA 분자의 각각의 위치가 둘 다 아데닌에 의해 점유되는 경우, 분자는 그 위치에서 상동성(homologous)인 것으로 간주된다. 두 서열 사이의 동일성 퍼센트는 비교될 위치의 수로 나눈 2개의 서열에 의해 공유되는 일치하거나 상동성인 위치의 수 × 100의 함수이다. 예를 들어, 서열(들)의 최적의 정렬에서, 2개의 서열 사이의 10개 위치 중에서 6개의 일치(match) 또는 상동성이 존재하는 경우, 2개의 서열은 60% 상동성인 것으로 간주되고; 2개의 서열 사이의 100개 위치 중에서 95개의 일치 또는 상동성이 존재하는 경우, 2개의 서열은 95% 상동성인 것으로 간주된다. 일반적으로, 비교는 두 서열을 정렬함으로써 최대 동일성 퍼센트가 얻어질 때 수행된다.
본원에 사용된 바와 같은, 표현 "세포(cell)", "세포주(cell line)" 및 "세포 배양물(cell culture)"은 상호교환적으로 사용되며, 모든 이러한 용어는 이의 자손(progeny)을 포함한다. 따라서, 단어 "형질전환체(transformant)" 및 "형질전환된 세포(transformed cell)"는 계대(passage) 수에 상관없이 1차 시험 세포 및 이로부터 유래하는 배양물을 포함한다. 모든 자손은 의도적(deliberate)이거나 의도하지 않은(inadvertent) 돌연변이로 인해 DNA 함량의 측면에서 정확하게 동일하지 않을 수도 있음을 또한 이해하여야 한다. 주로 형질전환된 세포에 대해 스크리닝된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손이 포함된다. 다른 명칭의 경우, 이는 문맥으로부터 명확하게 이해된다.
본원에 사용된 바와 같은, "폴리머라아제 연쇄 반응(polymerase chain reaction)" 또는 "PCR"은 예를 들어 미국 특허 제4,683,195호에 기술된 바와 같이, 소량의 핵산, RNA 및/또는 DNA의 특정 부분이 증폭되는 절차 또는 기술을 지칭한다. 일반적으로, 표적 영역 말단 또는 그 너머(beyond)로부터 서열 정보를 얻을 필요가 있으며, 이에 의해 올리고뉴클레오타이드 프라이머가 설계될 수 있다; 이들 프라이머는 증폭될 주형(template)의 반대 가닥과 동일하거나 유사하다. 2개의 프라이머의 5' 말단 뉴클레오타이드는 증폭될 물질의 말단과 동일할 수 있다. PCR은 특정 RNA 서열, 총 유전체 DNA(total genomic DNA)로부터의 특정 DNA 서열 및 총 세포질 RNA(total cellular RNA)로부터 전사된 cDNA, 파아지 또는 플라스미드 서열 등을 증폭하는데 사용될 수 있다. 일반적으로, 문헌[Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51:263; Erlich ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.)]를 참고. 본원에서 사용되는 PCR은 핵산 시험 샘플을 증폭시키기 위한 핵산 폴리머라아제 반응 방법의 예(그러나 유일한 것은 아님)로서 고려되며, 상기 방법은 프라이머로서 공지된 핵산 및 핵산 폴리머라아제를 사용하여 핵산의 특정 부위를 증폭시키거나 생산하는 것을 포함한다.
"선택적(optional)" 또는 "선택적으로(optionally)"는 이후에 설명되는 사건 또는 상황이 발생할 수 있지만(발생할 필요는 없음), 이는 이러한 사건 또는 상황이 발생하거나 발생하지 않는 경우를 포함한다. 예를 들어, "선택적으로 1 내지 3개의 항체 중쇄 가변 영역을 포함하는"은 특정 서열을 갖는 항체 중쇄 가변 영역이 존재할 수 있지만, 존재할 필요는 없음을 의미한다.
"약학 조성물(pharmaceutical composition)"은 생리학적/약제학적으로 허용 가능한 담체 및 부형제와 같은 다른 화학 성분과 함께, 본원에 기재된 하나 이상의 화합물 또는 이의 생리학적/약제학적으로 허용 가능한 염 또는 전구 약물(prodrug)을 포함하는 혼합물을 의미한다. 약학 조성물의 목적은 유기체로의 투여를 촉진하고, 활성 성분의 흡수를 용이하게 하여 생물학적 활성을 발휘하기 위한 것이다.
또한, 본 발명은 인간 B7-H3를 특이적으로 인식하여 세포 외 영역 아미노산 서열 또는 이의 3차원 구조에 결합하는 본 발명의 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 활성 성분으로서 포함하는, B7-H3를 면역학적으로 검출하거나 결정하는 방법, B7-H3를 면역학적으로 검출하거나 결정하기 위한 시약, B7-H3를 발현하는 세포를 면역학적으로 검출하거나 결정하기 위한 방법 및 B7-H3 양성 세포와 관련된 질환의 진단을 위한 진단 시약에 관한 것이다.
본 발명에서, B7-H3의 양을 검출하거나 결정하기 위한 방법은 임의의 공지된 방법일 수 있다. 예를 들어, 이는 면역검출 또는 검정을 포함한다.
면역검출 또는 검정은 표지된 항체 또는 항원을 사용함으로써 항체 또는 항원의 양을 검출하거나 결정하는 방법이다. 면역검출 또는 검정의 예로는 방사성 물질 표지된 면역학적 항체 방법(radioactive substance labeled immunological antibody method, RIA), 효소 면역검정(enzyme immunoassay, EIA 또는 ELISA), 형광성 면역검정(fluorescent immunoassay, FIA), 발광성 면역검정(luminescent immunoassay), 웨스턴 블롯팅 방법(western blotting method), 물리화학적 방법 등을 포함한다.
B7-H3 양성 세포와 관련된 상기 언급된 질환은 본 발명의 모노클로날 항체 또는 이의 항체 단편을 사용함으로써 B7-H3을 발현하는 세포를 검출하거나 결정함으로써 진단될 수 있다.
폴리펩타이드를 발현하는 세포를 검출하기 위하여, 공지의 면역검출법이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 면역침전, 형광성 세포 염색 또는 면역조직화학 염색 등이 사용될 수 있다. 또한, FMAT8100HTS 시스템(Applied Biosystem)을 사용하는 형광성 항체 염색 방법 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서, B7-H3를 검출하거나 결정하기 위한 살아있는 샘플은 조직 세포, 혈액, 혈장, 혈청, 췌장 유체, 소변, 대변, 조직 유체 또는 배양 유체와 같은 B7-H3을 발현하는 세포를 포함할 가능성을 가지는 한, 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 모노클로날 항체 또는 이의 항체 단편을 함유하는 진단 시약은 원하는 진단 방법에 따라, 항원-항체 반응을 수행하기 위한 시약 또는 반응을 검출하기 위한 시약을 추가로 함유할 수 있다. 항원-항체 반응을 수행하기 위한 시약은 완충제, 염 등을 포함한다. 검출용 시약은 면역검출 또는 측정에 통상적으로 사용되는 시약, 예컨대 모노클로날 항체, 항체 단편 또는 이의 접합체, 표지에 상응하는 기질 등을 인식하는 표지된 제2 항체를 포함한다.
본 발명은 또한 인간 B7-H3 양성 세포에 관련된 질환을 치료, 특히 암 및 염증을 치료하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 인간 2Ig-B7-H3 항원에 대한 상이한 항체의 결합 능력을 나타낸 것이다.
도 2는 인간 4Ig-B7-H3 항원에 대한 상이한 항체의 결합 능력을 나타낸 것이다.
도 3은 쥣과 B7-H3 항원에 대한 상이한 항체의 교차-결합 능력을 나타낸 것이다.
도 4는 U87MG 세포에 대한 상이한 항체의 결합 능력을 나타낸 것이다.
도 5는 U87MG 세포에서 상이한 항체의 식균작용 효과를 나타낸 것이다.
2. 실시예 및 시험 실시예
이하, 본 발명을 실시예와 함께 더 설명하지만, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다. 특정 조건이 기술되어 있지 않은 본 발명의 실시예에서, 실험은 일반적으로 문헌[Cold Spring Harbor Antibody Technology Laboratory Manual, Molecular Cloning Manual]에 기술된 바와 같은 통상적인 조건하에서, 또는 원료 또는 제품의 제조업자가 권장하는 조건하에서 수행된다. 시약의 공급원이 구체적으로 제공되어 있지 않은 경우, 시약은 상업적으로 이용 가능한 통상적인 시약이다.
실시예 1. 검출을 위한 B7-H3 항원 및 단백질의 제조
B7-H3 항원의 설계
서열번호 1에 나타낸 바와 같은 인간 B7-H3을 본 발명의 B7-H3에 대한 주형으로서 사용하여, 본 발명에 포함된 검출용 항원 및 단백질의 아미노산 서열을 설계하였다. 달리 명시하지 않는 한, 다음의 B7-H3 항원은 인간 B7-H3이다.
인간 B7-H3 전장 단백질: B7-H3(서열번호 1):
Figure pct00001
주석:
이중으로 밑줄 친 부분은 신호 펩타이드(신호 펩타이드: 1-28)이고;
밑줄 친 부분은 B7-H3 세포 외 도메인(세포 외 도메인: 29-466)이며, 여기에서 29-139는 Ig-유사 V-형 1 도메인이고, 145-238은 Ig-유사 C2-형 1 도메인이고; 243-357은 Ig-유사 V-형 2 도메인이고, 363-456은 Ig-유사 C2-형 2 도메인이고;
점선 부분은 막관통 도메인 부분(막관통 도메인: 467-487)이고;
이탤릭체 부분은 세포내 도메인(세포질성 도메인: 488-534)이다.
쥐 B7-H3 전장 아미노산 서열(서열번호 2)
Figure pct00002
주석:
이중으로 밑줄 친 부분은 신호 펩타이드(신호 펩타이드: 1-28)이고;
밑줄 친 부분은 B7-H3 세포 외 도메인(세포 외 도메인: 29-248)이며, 여기에서 29-139는 Ig-유사 V-형 도메인이고, 145-238은 Ig-유사 C2-형 도메인이고;
점선 부분은 막관통 도메인 부분(막관통 도메인: 249-269)이고;
이탤릭체 부분은 세포내 도메인(세포질성 도메인: 270-316)이다.
스크리닝 및 검출에 사용된 인간 B7-H3 항원(서열번호 3)은 시판 제품(R&D 제품 번호: 1949-B3-050/CF, 2Ig-B7-H3으로 약칭함)이며, 서열은 다음과 같다:
Figure pct00003
주석: 밑줄 친 부위는 B7-H3 세포 외 영역이고; 이탤릭체 부위는 His-tag 마커이다.
검출에 사용된 인간 B7-H3 항원(서열번호 4)은 시판 제품(SinoBiological 제품 번호 11188-H08H, 4Ig-B7-H3으로 약칭함)이며, 서열은 다음과 같다:
Figure pct00004
주석: 밑줄 친 부분은 B7-H3 세포 외 영역이고; 이탤릭체 부위는 His-tag 마커이다.
스크리닝 및 검출에 사용된 쥣과 B7-H3 항원(서열번호 5)은 시판 제품(R&D 제품 번호 1397-B3-050/CF)이며, 서열은 다음과 같다:
Figure pct00005
주석: 밑줄 친 부분은 B7-H3 세포 외 영역이고; 이탤릭체 부위는 His-tag 마커이다.
실시예 2. 인간 B7-H3에 대한 특이적인 결합을 위한 양성 서열(들)의 스크리닝
B 세포를 인간 PBMC, 비장 및 림프절 조직으로부터 분리하고, RNA를 추출하여 비감작(naive) scFv 파아지 항체 라이브러리(용량 3.2×1010)를 제작하였다. 제작된 비감작 scFv 파아지 항체 라이브러리를 패키징하여 파아지 입자를 형성시킨 후, 액체상(liquid phase) 방법으로 패닝(panning)시켰다. 파아지를 액체상의 바이오티닐화된 B7-H3에 결합시킨 후, 스트렙타비딘 자성 비드(magnetic bead)로 분리하였다. 인간 B7-H3(R&D 제품 번호 1949-B3-050/CF)에 결합하는 양성 서열(들)을 얻기 위하여, 바이오티닐화된 인간 B7-H3을 패닝을 위해 사용하고, 500개의 모노클로날 콜로니를 선택하여 파아지 ELISA 시험을 위한 파아지 scFv 항체 내로 패키징하였다. 인간 B7-H3(R&D 제품 번호 1949-B3-050/CF) 및 쥣과 B7-H3(R&D 제품 번호 1397-B3-050/CF)에 대한 모노클로날 파아지의 결합 활성을 별도로 시험하였다: 1 μg/ml 인간 B7-H3 또는 쥣과 B7-H3 및 1% BSA를 ELISA 플레이트 상에 코팅하고, 차단 완충액으로 1:1로 희석시킨 파아지 상청액을 첨가하고, 항-M13 HRP로 검출하고; ELISA OD450 값이 0.5보다 큰 클론 및 인간 또는 쥣과 B7-H3과의 결합에 대한 ELISA OD450 값 대 2.0보다 큰 1% BSA와의 결합에 대한 ELISA OD450 값의 비를 갖는 클론을 선택하여, 9개의 클론을 수득하였다.
실시예 3. 전장 모노클로날 항체의 제작
파아지 라이브러리 스크리닝에 의해 수득된 이들 9개의 클론에 대해 전장 항체를 제작한 후, 2개의 항체(각각 h1702 및 h1703)는 ELISA 결합 검정에 의해 강한 친화성을 가지는 것으로 확인되었다. 전장 모노클로날 항체를 제작하는 과정은 다음과 같다:
파아지 스크리닝에 의해 수득된 scFv 항체 서열(들)에 기초하여, 프라이머를 설계하여 PCR에 의한 각각의 단일-사슬 항체 서열의 VH/VK/VL 유전자 단편을 제작하였다. h1702 및 h1703의 중쇄 및 경쇄 가변 영역을 수득하였다.
>h1702 중쇄 가변 영역 서열
Figure pct00006
>h1702 경쇄 가변 영역 서열
Figure pct00007
>h1703 중쇄 가변 영역 서열
Figure pct00008
>h1703 경쇄 가변 영역 서열
Figure pct00009
주석: 순서는 FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4이고, 서열에서 이탤릭체는 FR 서열이고, CDR 서열은 밑줄 친 것이다.
각각의 항체의 경쇄 및 중쇄에서의 CDR 서열을 표 1에 나타내었다.
[표 1]
각각의 중쇄 및 경쇄의 CDR 영역
Figure pct00010
이어서, 항체 가변 영역을 불변 영역 유전자(CH1-FC/CL) 단편과 상동 재조합하여 완전 항체 VH-CH1-FC/VK-CL/VL-CL을 제작하였다.
제작된 완전 항체 h1702-IgG1, h1703-IgG1의 서열은 다음과 같다:
h1702-IgG1:
h1702-IgG1 중쇄 아미노산 서열: (서열번호 22)
Figure pct00011
h1702 경쇄 아미노산 서열: Lambda(서열번호 23)
Figure pct00012
h1703-IgG1:
h1703-IgG1 중쇄 아미노산 서열: (서열번호 24)
Figure pct00013
h1703 경쇄 아미노산 서열: 카파(서열번호 25)
Figure pct00014
항체의 안전성을 추가로 향상시키기 위하여, h1702 경쇄 서열의 아미노산을 돌연변이시켰으며, 여기에서 보다 안정하고 균일한 모노클로날 항체를 수득하기 위하여 특정 돌연변이는 경쇄의 N-말단에서 처음 아미노산 잔기 Q를 D로 치환하고, C-말단에서 처음 아미노산 잔기 S를 결실시켰다.
돌연변이 변형을 갖는 h1702-1 경쇄 아미노산 서열: (서열번호 26)
Figure pct00015
실시예 4. 완전 인간 항체의 발현 및 정제
항체의 경쇄 및 중쇄를 발현하는 플라스미드 각각을 1.5:1의 비로 HEK293E 세포 내로 형질감염시키고, 세포 배양물 상청액을 6일 후 수집하고, 세포 찌거기를 고속 원심분리로 제거하고, 단백질 A 컬럼으로 정제를 수행하였다. 컬럼을 A280 판독 값이 기준선으로 떨어질 때까지 PBS로 세척하였다. 표적 단백질을 pH 3.0 - pH 3.5의 산성 용출액으로 용출시키고, 1 M 트리스-HCl, pH 8.0 - 9.0으로 중화시켰다. 용출된 샘플을 적절히 농축시키고, PBS로 평형화시켜 응집체를 제거한 겔 크로마토그래피 Superdex 200(GE)으로 추가로 정제하였다. 단량체 피크를 수집하고, 사용하기 위해 분취하였다.
본 발명의 항체의 성능 및 유익한 효과를 다음의 시험 방법으로 시험하였다:
시험예 1. ELISA 결합 검정
시험관 내에서 상이한 형태의 인간 B7-H3에 대해 스크리닝 된 B7-H3 항체의 결합 능력을 시험하기 위하여, 인간 2Ig-B7-H3(제품 번호 1949-B3-050/CF, R&D) 및 인간 4Ig-B7-H3(제품 번호 11188-H08H, Sino Biological)을 시험관 내 결합 검정에 사용하였다.
인간 B7-H3 단백질(2Ig/4Ig)을 PBS 완충액, pH 7.4(Sigma, P4417-100TAB)을 사용하여 1 μg/ml의 농도로 희석하고, 96-웰 엘라이자 플레이트(Elisa plate)에 100 μl/웰(Corning, CLS3590-100 EA)의 부피로 첨가하고, 4℃에서 밤새 16 내지 20시간 동안 두었다. 액체를 버린 후, 5% 스킴 밀크(GuangMing 스킴 밀크 분말) 차단 용액을 PBST 완충액(0.05% 트윈-20을 함유하는 pH 7.4 PBS)으로 희석하고, 120 μl/웰로 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 항온처리하여 차단시켰다. 차단 말기에, 차단 용액을 버리고, 플레이트를 PBST 완충액으로 4회 세척하였다. 이후에, 연속 희석된 상응하는 B7-H3 항체 100 μl/웰을 첨가하였다. 초기 농도는 1 μM이었으며, 이후 PBST 완충액을 사용하여 8구배로 희석시키고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리기에서 항온처리하였다. 항온처리 후, 플레이트의 반응 용액을 버리고, 플레이트를 PBST로 4회 세척하였다. PBST(1:4000)로 희석시킨 HRP-표지된 염소 항-인간 IgG Fcγ 단편 특이적인 제2 항체(Jackson Immuno Research, 109-005-008)를 100μl/웰로 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 플레이트를 PBST로 4회 세척한 후, TMB 발색 기질(chromogenic substrate)(KPL, 52-00-03)을 100 μl/웰로 첨가하고, 3 내지 5분 동안 실온에서 항온처리하고, 1 M H2SO4를 100 μl/웰로 첨가하여 반응을 정지시켰다. 흡광도 값을 NOVOStar 미세플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 판독하고, 항체와 항원 사이의 결합에 대한 EC50 값을 계산하였다. 결과는 표 2, 도 1 및 도 2에 나타내었다.
[표 2]
인간 2Ig-B7-H3 및 4Ig-B7-H3 항원에 대한 상이한 항체의 결합 능력
Figure pct00016
결과는 h1702 및 h1703이 인간 2Ig-B7-H3 및 4Ig-B7-H3 둘 다에 대해 상당한 결합 능력을 가지며, h1702가 더 강한 결합 능력을 가짐을 보여준다.
시험예 2. 상이한 종으로부터 유래한 B7- H3에 대한 교차 -결합 검정
시험관 내에서 상이한 종으로부터 유래한 B7-H3에 대해 스크리닝된 B7-H3 항체의 능력을 시험하기 위하여, 쥣과 B7-H3(제품 번호 1397-B3-050/CF, R&D)을 시험관 내 결합 검정을 위해 사용하였다.
상이한 종(마우스 B7-H3)으로부터 유래한 B7-H3 단백질을 PBS 완충액, pH 7.4(Sigma, P4417-100TAB)을 사용하여 1 μg/ml의 농도로 희석하고, 96-웰 미세역가 플레이트에 100 μl/웰(Corning, CLS3590-100 EA)의 부피로 첨가하고, 4℃에서 밤새 16 내지 20시간 동안 두었다. 액체를 버린 후, PBST 완충액(0.05% 트윈-20을 함유하는 pH 7.4 PBS)으로 희석시킨 5% 스킴 밀크(GuangMing 스킴 밀크 분말) 차단 용액을 120 μl/웰로 첨가하고, 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 항온처리하여 차단시켰다. 차단 말기에, 차단 용액을 버리고, 플레이트를 PBST 완충액으로 4회 세척하였다. 이후에, 1 μM의 초기 농도로 100 μl/웰의 상응하는 B7-H3 항체를 첨가하고, PBST 완충액을 사용하여 8구배로 희석시키고, 37℃에서 1시간 동안 항온처리기에서 항온처리하였다. 항온처리 후, 플레이트의 반응 용액을 버리고, 플레이트를 PBST로 4회 세척하고, PBST(1:4000)로 희석시킨 HRP-표지된 염소 항-인간 IgG Fcγ 단편 특이적인 제2 항체(Jackson Immuno Research, 109-005-008)를 100 μl/웰로 첨가하고, 1시간 동안 37℃에서 항온처리하였다. 플레이트를 PBST로 4회 세척한 후, TMB 발색 기질(KPL, 52-00-03)을 100 μl/웰로 첨가하고, 실온에서 3 내지 5분 동안 항온처리하고, 1 M H2SO4를 100 μl/웰로 첨가하여 반응을 중지시키고, 흡광도 값을 NOVOStar 미세플레이트 판독기를 사용하여 450 nm에서 판독하고, 항체와 항원 사이의 결합에 대한 EC50 값을 계산하였다(결과는 표 3 및 도 3에 나타내었음).
[표 3]
쥣과 B7-H3 항원에 대한 상이한 항체의 결합 능력
Figure pct00017
결과는 쥣과 B7-H3에 대한 h1702 및 h1703의 결합 능력이 약한 것으로 나타났으며, 이는 2개의 모노클로날 항체가 인간 B7-H3에 특이적으로 결합함을 나타낸다.
시험예 3. 항체 친화성에 대한 비아코어 시험( Biacore test)
인간 및 쥣과 B7-H3에 대한 항-B7-H3 항체의 반응 친화성을 Biacore, GE 장치를 이용하여 측정하였다.
바이오센서 칩(biosensor chip) 단백질 A (제품 번호 29127556, GE)를 사용하여 시험될 특정 양의 항체를 친화성 포획하였다. 연속 희석된 인간 2Ig-B7-H3 항원(제품 번호 1949- B3-050/CF, R&D), 인간 4Ig-B7-H3 항원(제품 번호 11188-H08H, Sino Biological) 또는 쥣과 B7-H3 항원(제품 번호 1397-B3-050/CF, R&D)을 칩(chip)의 표면을 통해 흐르게 하였다. 결합 및 해리 곡선을 얻기 위하여, 실시간 반응 신호를 Biacore 장치(Biacore T200, GE)를 사용하여 검출하였다. 각각의 해리 사이클이 완료된 후, 바이오칩을 세척하고 글리신-염산 재생 용액(pH 1.5)(제품 번호 BR-1003-54, GE)으로 재생시켰다. 실험시 사용된 완충액은 HBS-EP 완충액 용액(pH 7.4)(제품 번호 BR-1001-88, GE)이었다.
실험 데이터를 BIA 평가 버젼 4.1 GE 소프트웨어(1:1) 랭뮈어 모델(Langmuir model)에 피팅하여 친화성 값을 얻었다. 실험 결과는 표 4 내지 6에 나타내었다.
[표 4]
인간 2Ig-B7-H3 항원에 대한 상이한 항체의 반응 친화성
Figure pct00018
[표 5]
인간 4Ig-B7-H3 항원에 대한 상이한 항체의 반응 친화성
Figure pct00019
[표 6]
쥣과 B7-H3 항원에 대한 상이한 항체의 반응 친화성
Figure pct00020
비아코어 시험의 친화성 결과는 h1702가 인간 4Ig-B7-H3에 대해 nM의 수준에 이르는 강한 친화성을 가지는 반면, 인간 2Ig-B7-H3 또는 쥣과 B7-H3에 대한 친화성은 상대적으로 약하며; h1703은 인간 4Ig-B7-H3, 인간 2Ig-B7-H3 및 쥣과 B7-H3에 대해 더 약한 친화성을 가짐을 보여준다.
시험예 4. 시험관 내 세포 결합 검정
본 실험에서, 항체의 결합은 세포 표면에 결합된 항체의 형광 신호의 강도에 기초하여 평가하였다. 10 μg의 제1 항체와 2×105 U87MG 세포를 얼음 위에서 30분 동안 항온처리한 후, 과량의 항체를 세척으로 제거하였다. 세포를 APC 항-인간 IgG Fc(Biolegend, 409306)와 함께 30분 동안 실온에서 항온처리하고, 과량의 항체를 제거한 후, 세포 표면의 형광성 신호를 BD 버즈(Verse)를 사용하여 판독하였다(결과는 도 4에 나타냄). 결과는 h1702가 B7-H3를 과발현하는 종양 세포 U87MG에 특이적으로 결합함을 보여준다.
시험예 5. 시험관 내 엔도시토시스( endocytosis ) 시험
본 실험에서, 항체의 엔도시토시스 효과를 내재화된(internalized) 항체에 의해 결정된 형광 신호의 강도에 기초하여 평가하였다. B7-H3 항체 및 APC 항-인간 IgG Fc(Biolegend, 409306)를 1:2의 몰 비로 혼합하고, 15분 동안 얼음 위에서 항온처리하였다. 항체 혼합물을 2×105 U87MG 세포와 함께 얼음 위에서 30분 동안 항온처리한 후, 과량의 항체를 세척에 의해 제거한 후, 세포를 37℃의 미리 가온시킨 배지로 이동시키고, 37℃에서 각각 0, 15, 30, 60 및 120분 동안 항온처리하였다. 세포를 원심분리하고, 항체 용출 완충액에 재현탁시켜 항체를 제거하였다. 실온에서 7분 동안 항온처리한 후, 항체 용출 완충액을 세척에 의해 제거하고, 세포 내 형광 신호를 BD 버즈를 사용하여 판독하였다(결과는 도 5에 나타냄). 결과는 h1702 및 h1703 둘 다 U87MG 세포에 대해 결합한 후 세포 내로 효율적으로 세포내 이입(endocytosed)되었음을 보여준다.
시험예 6. SD 랫트에서의 T 1/2 평가
2마리의 수컷과 2마리의 암컷으로 4마리의 SD 랫트(JSJ Experimental Animal Co., Ltd.에서 구입함)를 12/12 시간으로 조절된 명/암 주기에서, 24±3℃의 일정 온도, 50 내지 60%의 습도로, 사료 및 물에 자유로이 접근하도록 하면서 유지시켰다. 실험 당일에, SD 랫트에게 시험 제제를 꼬리 정맥에 3 mg/kg의 용량 및 5 ml/kg의 주사 부피로 주사하였다.
혈액 수집을 위한 시간: 투여 첫날에, 투여 후 5분, 8시간, 24시간, 2일, 3일, 5일, 8일, 및 15일째에 안저 정맥(ocular fundus vein)로부터 혈액을 매회 200 μL(100 μL의 혈청과 동일)로 취하고; 수집된 혈액 샘플을 실온에서 30분 동안 응고될 때까지 둔 후, 10,000 ×g에서 10분 동안 4℃에서 원심분리하였다. 상청액을 수집하고, -80℃에 즉시 저장하였다. 혈청 속의 B7-H3 항체 농도를 ELISA로 측정하고, PK 분석을 수행하였다. 결과는 표 7에 나타내었다.
[표 7]
SD 랫트에서 B7-H3 항체의 T1/2
Figure pct00021
결과는 랫트에서 본 발명의 항체의 반감기는 대략 185 h(7.7일)이었음을 보여준다.
시험예 7. B7-H3 항체의 물리적 안전성
DSC를 사용하여 상이한 항체의 열 안전성을 검출하고, 상이한 pH 조건 하 상이한 완충액 시스템에서 열 안전성을 비교하였다. 상이한 pH에 상응하는 예시적인 완충액 시스템은 10 mM PB(pH 7) 및 10 mM 아세테이트(pH 5.2)였다. 샘플을 상응하는 완충액에 용해하고, 샘플 농도를 약 1 mg/ml로 조절하였다. MicroCal* VP-Capillary DSC (Malvern)를 사용하여 검출을 수행하였다. 검출 전에, 각각의 샘플 및 블랭크 완충액을 진공 탈기기(vacuum degasser)로 1 내지 2분 동안 탈기시켰다. 400 μl의 샘플 또는 블랭크 완충액을 샘플 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다(장치의 로딩은 300 μl임). 웰-플레이트의 마지막 2개의 쌍에 각각 세척을 위해 14% 데콘(Decon) 90 및 ddH2O를 첨가하였다. 샘플 플레이트를 로딩한 후에, 플라스틱 연질 커버를 덮었다. 스캐닝 온도는 25℃로부터 시작하여 100℃에서 끝났다. 스캐닝 속도는 60℃/h였다. 결과는 표 8에 나타내었다. 여러 시험 시스템에서, h1702 및 h1703 둘 다는 우수한 열 안전성을 나타내었다.
[표 8]
상이한 항체의 DSC 결과
Figure pct00022
샘플의 순도를 SEC-HPLC로 모니터링하여 특정의 농도 조건하에서 안전성을 조사하였다. 조건의 예로서, 샘플 농도를 약 40 내지 50 mg/ml로 조절하였다. 상이한 항체의 안전성을 PBS(pH 7.4) 시스템 및 pH 5.2 아세트산/수크로오스 시스템에서 4℃, 30℃, 40℃에서 1개월 저장 동안 비교하였다. 항체의 순도를 Xbridge 단백질 BEH SEC 200A(Waters) HPLC 컬럼을 사용하여 실험하였다. 1개월 시험 후, h1702 및 h1703 둘 다는 우수한 안전성을 나타내었다. 결과는 표 9에 나타내었다.
[표 9]
상이한 항체에 대한 안전성 결과
Figure pct00023
결과는 h1702 및 h1703 둘 다 아세트산 및 PBS 완충액에서 우수한 안전성을 나타냄을 보여준다.
시험예 8. B7-H3 항체의 화학 안전성
항체 제조 후의 화학적 변형은 생성물 안전성 문제, 특히 CDR 영역의 일부 아미노산에서 고도의 탈아미노화(deamination), 산화(oxidation) 또는 이성질체화(isomerization) 변형을 야기하는 일반적인 이유 중 하나이다. 이러한 변형은 회피되거나 감소되어야 한다. 시험될 500 μg의 항체를 500 μl의 PBS pH 7.4에 용해하고, 수조에서 40℃로 처리하고; 효소 가수분해 실험을 위해 샘플을 각각 0, 10, 및 20일에 취하였다. 100 μg의 샘플을 상이한 시점에서 취하여 0.2 M His-HCl, 8 M Gua-HCl, pH 6.0의 용액에 용해시키고; 3 μl의 0.1 g/mL DTT를 첨가하고, 수조에서 50℃에서 1시간 동안 처리하고; 이후에, 샘플을 0.02 M His-HCl, pH 6.0의 용액으로 2회 한외 여과하고, 3 μL의 0.25 mg/mL 트립신을 첨가하였다. 혼합물을 수조에서 37℃에서 밤새 가수분해하였다. 잠재적 변형 부위를 Agilent 6530 Q-TOF를 사용하는 질량 분광법으로 분석하였다(결과는 표 10에 나타냄). 결과는 본 발명에 기술된 h1702 및 h1703이 탈아미노화, 산화 또는 이질성(heterogeneity)에 대한 경향이 유의미하게 증가되지 않았으며, 이는 분자가 우수한 화학적 안전성을 가짐을 보여준다.
[표 10]
상이한 항체의 화학적 안전성
Figure pct00024
시험예 9. h1702-1 항체의 안전성
람다형은 카파형 경쇄보다 C-말단에 하나 이상의 아미노산 S를 가지며, S의 입체 장해(steric hindrance)는 경쇄와 중쇄 사이의 사슬 간 이황화 결합의 불안전성을 유발하는 인자일 수 있다. 말단 아미노산 S는 분자 클로닝에 의해 녹아웃(knock out)될 수 있으며, 알칼리 조건하에서 항체의 안전성은 현저하게 향상될 수 있다.
네이키드 항체(naked antibody)의 경쇄의 N-말단에서 첫 번째 아미노산이 Q인 경우, 항체에서 부분 고리화(partial cyclization)가 또한 발생할 수 있으며, 이는 샘플의 전하 이질성을 증가시켜 제형 및 생성물의 안전성에 영향을 미친다. N-말단에서 첫 번째 아미노산 Q를 분자 클로닝에 의해 D로 돌연변이시켜 불완전한 고리화를 제거하고, 항체 안전성을 현저하게 개선하였다. 상기 변형은 조작된 항체의 항원에 대한 친화력에 크게 영향을 미치지 않았다.
h1702 및 h1702-1의 안전성을 SEC, 비-환원 CE-SDS 분석법(pH 9.0) 및 IEX 분석법으로 시험하였다.
SEC 검출: Waters e2695 크로마토그래프 및 Xbridge BEH 200A SEC 컬럼을 사용하였다. 50 μg 항체를 로딩하고, 고정 구배로 PBS 이동 상을 이용하여 용출을 수행하였다.
CE-SDS NR 방법:
샘플을 Beckman SDS-MW 분석 키트(Analysis Kit)를 사용하여 처리하였다. 완충액 용액을 100 μg의 시험된 항체에 첨가하고, 유인 프로토콜(manned protocol)에 기술된 바와 같이 샘플 완충액에서 가열함으로써 변성시켰다. 데이터를 PA800 모세관 전기영동 장치를 사용하여 수집하였다.
IEX 방법:
Waters Acquity H-클래스 크로마토그래프 및 Thermo MAbPac SCX-10 컬럼을 사용하였다. 50 μg의 시험된 항체를 로딩하고, 이동 상으로서 CX-1 pH 구배 완충액 키트(Gradient Buffer Kit)를 사용하여 선형 구배를 적용시키고; 280 nm의 파장에서 자외선 신호를 수집하였다.
[표 11]
h1702 및 h1702-1의 안전성의 비교
Figure pct00025
본 발명은 명확한 이해를 위해 도면 및 특정 구현예로 상세하게 설명되었지만, 설명 및 구현예는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 인용된 문헌 및 특허의 모든 공개 내용은 그 전문이 명백히 참조로 포함된다.
<110> JIANGSU HENGRUI MEDICINE CO.,LTD SHANGHAI HENGRUI PHARMACEUTICAL CO.,LTD <120> B7-H3 ANTIBODY, ANTIGEN-BINDING FRAGMENT THEREOF AND MEDICAL USE THEREOF <130> P19-083-INP-GC <150> CN 201710206261.2 <151> 2017-03-31 <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 534 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Arg Arg Arg Gly Ser Pro Gly Met Gly Val His Val Gly Ala 1 5 10 15 Ala Leu Gly Ala Leu Trp Phe Cys Leu Thr Gly Ala Leu Glu Val Gln 20 25 30 Val Pro Glu Asp Pro Val Val Ala Leu Val Gly Thr Asp Ala Thr Leu 35 40 45 Cys Cys Ser Phe Ser Pro Glu Pro Gly Phe Ser Leu Ala Gln Leu Asn 50 55 60 Leu Ile Trp Gln Leu Thr Asp Thr Lys Gln Leu Val His Ser Phe Ala 65 70 75 80 Glu Gly Gln Asp Gln Gly Ser Ala Tyr Ala Asn Arg Thr Ala Leu Phe 85 90 95 Pro Asp Leu Leu Ala Gln Gly Asn Ala Ser Leu Arg Leu Gln Arg Val 100 105 110 Arg Val Ala Asp Glu Gly Ser Phe Thr Cys Phe Val Ser Ile Arg Asp 115 120 125 Phe Gly Ser Ala Ala Val Ser Leu Gln Val Ala Ala Pro Tyr Ser Lys 130 135 140 Pro Ser Met Thr Leu Glu 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Pro Tyr Ser Lys Pro Ser Met Thr Leu Glu 355 360 365 Pro Asn Lys Asp Leu Arg Pro Gly Asp Thr Val Thr Ile Thr Cys Ser 370 375 380 Ser Tyr Arg Gly Tyr Pro Glu Ala Glu Val Phe Trp Gln Asp Gly Gln 385 390 395 400 Gly Val Pro Leu Thr Gly Asn Val Thr Thr Ser Gln Met Ala Asn Glu 405 410 415 Gln Gly Leu Phe Asp Val His Ser Val Leu Arg Val Val Leu Gly Ala 420 425 430 Asn Gly Thr Tyr Ser Cys Leu Val Arg Asn Pro Val Leu Gln Gln Asp 435 440 445 Ala His Gly Ser Val Thr Ile Thr Gly Gln Pro Met Thr Phe Pro Pro 450 455 460 Glu Ala Leu Trp Val Thr Val Gly Leu Ser Val Cys Leu Ile Ala Leu 465 470 475 480 Leu Val Ala Leu Ala Phe Val Cys Trp Arg Lys Ile Lys Gln Ser Cys 485 490 495 Glu Glu Glu Asn Ala Gly Ala Glu Asp Gln Asp Gly Glu Gly Glu Gly 500 505 510 Ser Lys Thr Ala Leu Gln Pro Leu Lys His Ser Asp Ser Lys Glu Asp 515 520 525 Asp Gly Gln Glu Ile Ala 530 <210> 2 <211> 316 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Met Leu Arg Gly Trp Gly Gly Pro Ser Val Gly Val Cys Val Arg Thr 1 5 10 15 Ala Leu Gly Val Leu Cys 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Claims (20)

  1. 인간 B7-H3에 결합하는 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편으로서,
    여기에서 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편은 다음 (i) 및 (ii)의 모노클로날 항체 또는 이의 항원 결합 단편 중 어느 하나로부터 선택되는 것인 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    (i) 하기 서열로부터 선택되거나 하기 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열로부터 선택되는 하나 이상의 CDR 영역 서열을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    서열번호 10, 11 및 12에 나타낸 항체 중쇄 가변 영역 HCDR 서열; 및 서열번호 13, 14 및 15에 나타낸 항체 경쇄 가변 영역 LCDR 서열;
    (ii) 하기 서열로부터 선택되거나 하기 서열에 대해 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열로부터 선택되는 하나 이상의 CDR 영역 서열을 포함하는, 모노클로날 항체 또는 이의 항원-결합 단편:
    서열번호 16, 17 및 18에 나타낸 항체 중쇄 가변 영역 HCDR 서열; 및 서열번호 19, 20 및 21에 나타낸 항체 경쇄 가변 영역 LCDR 서열.
  2. 제1항에 있어서,
    모노클로날 항체는 재조합 항체인 것인, B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  3. 제2항에 있어서,
    모노클로날 항체는 인간 재조합 항체 또는 이의 항원-결합 단편인 것인, B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  4. 제3항에 있어서,
    인간 재조합 항체의 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 프레임워크(framework, FR) 서열은 각각 인간 생식세포 경쇄 및 중쇄, 또는 이의 돌연변이체 서열로부터 유래되는 것인, B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  5. 제4항에 있어서,
    인간 재조합 항체는 서열번호 6 또는 8에 나타낸 중쇄 가변 영역 또는 이의 변이체를 포함하며; 여기에서 변이체는 서열번호 6 또는 8의 중쇄 가변 영역에 1 내지 10개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 것인, B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  6. 제4항에 있어서,
    인간 재조합 항체는 서열번호 7 또는 9에 나타낸 경쇄 가변 영역 또는 이의 변이체를 포함하며; 여기에서 변이체는 서열번호 7 또는 9의 경쇄 가변 영역에 1 내지 10개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가를 갖는 것인, B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    B7-H3 항체는 인간 항체 불변 영역을 추가로 포함하며, 바람직하게는 B7-H3 항체는 각각 서열번호 22 및 23에 나타낸 중쇄 및 경쇄 서열로 이루어지는 전장 항체, 또는 각각 서열번호 22 및 26에 나타낸 중쇄 및 경쇄로 이루어지는 전장 항체, 또는 각각 서열번호 24 및 25에 나타낸 중쇄 및 경쇄로 이루어지는 전장 항체인 것인, B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    항원-결합 단편은 Fab, Fab', F(ab')2, 단일-사슬 항체(scFv), 이량체화 V 영역(디아바디), 이황화-안정화된 V 영역(dsFv) 및 CDR-함유 펩타이드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것인, B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  9. 인간 B7-H3에 결합하기 위해 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편과 경쟁하는 것을 특징으로 하는, 분리된 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편.
  10. 치료학적 유효량의 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 약학 조성물.
  11. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 암호화하는 핵산 분자.
  12. 제11항에 따른 핵산 분자를 포함하는 재조합 벡터.
  13. 제12항에 따른 재조합 벡터로 형질전환된 숙주 세포로서,
    여기에서 숙주 세포는 원핵 세포 및 진핵 세포, 바람직하게는 진핵 세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포 또는 효모 세포로 이루어지는 군으로부터 선택되는 숙주 세포.
  14. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은
    제13항에 따른 숙주 세포를 배양물에서 배양하여 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 형성하고 축적시키는 단계, 및 배양물로부터 축적된 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  15. B7-H3을 면역학적으로 검출하거나 측정하는 방법으로서, 상기 방법은
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 이용함으로써 B7-H3을 검출하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 인간 B7-H3의 검출 또는 측정을 위한 시약으로서,
    여기에서 시약은 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 시약.
  17. 인간 B7-H3 양성 세포와 관련된 질환을 검출하기 위한 진단 시약으로서,
    여기에서 진단 시약이 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 포함하는 진단 시약.
  18. 인간 B7-H3 양성 세포와 관련된 질환을 진단하기 위한 방법으로서, 상기 방법은
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편을 사용함으로써 B7-H3 또는 B7-H3 양성 세포를 검출하거나 결정하는 단계를 포함하는 방법.
  19. B7-H3 양성 세포와 관련된 질환을 치료하기 위한 치료제로서,
    치료제는 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제10항에 따른 약학 조성물, 또는 제11항에 따른 핵산 분자를 포함하는 치료제.
  20. B7-H3 양성 세포와 관련된 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은
    제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 B7-H3 항체 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 제10항에 따른 약학 조성물, 또는 제11항에 따른 핵산 분자를 이용함으로써 B7-H3 양성 세포의 사멸을 유도하는 단계를 포함하는 방법.
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