TW201837056A - Ｂ７－ｈ３抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及B7-H3抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途。進一步地，本發明涉及包含B7-H3抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為藥物的用途。特別地，本發明涉及一種人B7-H3人抗體或其抗原結合片段在製備用於治療B7-H3相關的疾病或病症的藥物中的用途。

Description

B7-H3抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
本發明涉及B7-H3抗體或其抗原結合片段，進一步地，本發明涉及包含該B7-H3抗體CDR區的完全人源抗體，本發明還涉及包含該B7-H3抗體或其抗原結合片段的醫藥組成物，以及其作為B7-H3相關疾病診斷劑和治療藥物的用途。
T細胞介導的免疫反應在機體抗腫瘤過程中發揮著極其重要的作用，而T細胞的活化和增殖不僅需要TCR識別的抗原信號，還需要共刺激分子提供的第二信號。B7家族分子屬於共刺激分子免疫球蛋白超家族，越來越多的研究表明，該家族分子在機體正常免疫功能和病理狀態下均發揮了重要的調節作用。
B7-H3是B7家族的成員之一，屬於I型跨膜蛋白，包含胺基端的一個信號肽，一個細胞外的免疫球蛋白樣可變區(IgV)和恆定區(IgC)、一個跨膜區和一個含有45個胺基酸的胞質尾區(Tissue Antigens.2007 Aug；70(2)：96-104)。目前，B7-H3主要存在2種剪切體，B7-H3a和B7-H3b。 B7-H3a胞外段由IgV-IgC 2個免疫球蛋白結構域組成，又稱為2IgB7-H3，而B7-H3b胞外段由IgV-IgC-IgV-IgC 4個免疫球蛋白結構域組成，又稱為4IgB7-H3。
B7-H3蛋白質在正常組織、細胞中不表達或極低表達，卻高表達於多種腫瘤組織，並與腫瘤的進展、患者的生存及預後密切相關。臨床上已經報導，B7-H3在許多癌症類型中、特別是在非小細胞肺癌、腎癌、泌尿道上皮癌、結直腸癌、前列腺癌、多形性膠質母細胞瘤、卵巢癌和胰腺癌中過表達(Lung Cancer.2009 Nov；66(2)：245-249；Clin Cancer Res.2008 Aug 15；14(16)：5150-5157)。此外，也有文獻報導，在前列腺癌中，B7-H3的表達強度與臨床病理學惡性(諸如腫瘤體積、前列腺外侵襲或Gleason評分)正相關，且也與癌症進展相關(Cancer Res.2007 Aug 15；67(16)：7893-7900)。類似地，在多形性膠質母細胞瘤中，B7-H3的表達與無事件存活負相關，且在胰腺癌中，B7-H3的表達與淋巴結轉移和病理學進展相關。因此，B7-H3被認為是一種新的腫瘤標誌物和潛在的治療靶點
目前，已有針對B7-H3靶點的治療策略用於臨床前研究，如靶向小鼠B7-H3的抗體會增強瘤內的浸潤性的CD8陽性的T細胞和抑制腫瘤生長(Mod Pathol.2010 Aug；23(8)：1104-1112)。此外，WO 2008/066691專利顯示，識別B7-H3變體B7-H3a的抗體會對腺癌表現出體內抗腫瘤作用。在臨床研究中，一種鼠源的B7-H3抗體與放射性I131的偶聯藥物可顯著抑制患者成神經母細胞瘤的生長[J Neufooocol 97(3)：409-1 8(2010)]。但目前在研的B7H3抗體都是鼠源抗體經人源化改造的人源化抗體，而人源化抗體在免疫時存在的免疫原性比不含鼠源抗體成分的全人源抗體要高，在人體應用時是一個不利的因素。
噬菌體展示技術(phage display technology)是將外源蛋白質或多肽與噬菌體外殼蛋白融合表達，從而將外源蛋白表達在噬菌體的表面。噬菌體抗體庫是將噬菌體展示技術、PCR擴增技術、蛋白表達技術相結合的一項運用綜合技術手段所建立起來的抗體庫。
噬菌體抗體庫最大的優點是不經體內免疫，模擬體內抗體生成的三個過程而製備出完全人源抗體。除此之外，噬菌體抗體庫還具有以下優勢：①實現了基因型與表型的統一。此外，實驗方法簡單、快速，傳統的藉由融合瘤技術抗體產生方法需歷經數月，而抗體庫技術只需短短幾週的時間。②表達的是完全人源抗體，且分子量小，主要以活性片段Fab、scFV的形式表達，與完整抗體相比在組織穿透力方面都有明顯優勢。③篩選容量大，融合瘤技術是在上千個純株內篩選，抗體庫技術可以對百萬甚至億萬個分子選擇。篩選到的抗體種類更多。④用途廣泛，採用了原核表達系統，當大規模生產時優勢更加明顯(Curr Opin Biotechnol.2002 Dec；13(6)：598-602；Immunotechnology,2013,48(13)48(13)：63-73)。
目前，已有WO2008100934、WO2010096734、WO2012147713、WO2015181267、WO2016044383等專利 報導了B7-H3的抗體，絕大多數都是鼠源抗體或人源化抗體，但就國內外而言，大多數處於臨床I期和發現階段，還沒有靶向B7-H3的抗體藥物上市，因此，有必要進一步開發具有更高活性、高親和力和高穩定性的B7-H3全人源抗體，以進行相關疾病的治療研究和應用。
本發明的目的是提供與B7-H3的胞外區的胺基酸序列或三維結構結合的單株抗體或其抗原結合片段。此外，本發明的目的是藉由篩選與該單株抗體或其抗體片段競爭的高活性和高穩定性的抗人B7-H3全人源抗體。
此外，本發明將提供編碼該抗體的DNA，包含該DNA的載體，藉由轉化該載體而獲得的轉化體，使用該轉化體生產抗體或其抗體片段的方法，以及使用該抗體或其抗體片段作為活性成分的診斷劑或治療劑。
一方面，本發明提供一種B7-H3抗體或其抗原結合片段，其與人B7-H3結合，該B7-H3抗體或其抗原結合片段是選自下面(i)至(ii)中任一種單株抗體或其抗原結合片段：(i)單株抗體或其抗原結合片段，其包含1個或多個選自以下的CDR區序列或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列：抗體重鏈可變區HCDR區序列：如SEQ ID NO：10、11和12胺基酸序列所示；和抗體輕鏈可變區LCDR區序列：如SEQ ID NO：13、14和15胺基酸序列所示；(ii)單株抗體或其抗原結合片段，其包含1個或多個選 自以下的CDR區序列或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列：抗體重鏈可變區HCDR區序列：如SEQ ID NO：16、17和18胺基酸序列所示；和抗體輕鏈可變區LCDR區序列：如SEQ ID NO：19、20和21胺基酸序列所示。
在一種較佳的實施方式中，根據本發明所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體是重組抗體。
在一種較佳的實施方式中，根據本發明所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體是人源的重組抗體或其抗原結合片段。
在一種較佳的實施方式中，根據本發明所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中該人源的重組抗體的輕鏈和重鏈可變區上的輕鏈和重鏈FR區序列分別來源於人種系的輕鏈和重鏈序列或其突變序列。
在一種較佳的實施方式中，根據本發明所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中該人源的重組抗體含有SEQ ID NO：6或8所示的重鏈可變區或其變體；該變體是在SEQ ID NO：6或8所示的重鏈可變區序列上具有1-10個胺基酸替換。
在一種較佳的實施方式中，根據本發明所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中該人源的重組抗體含有SEQ ID NO：7或9所示的輕鏈可變區或其變體；該變體是在SEQ ID NO：7或9所示的輕鏈可變區序列上具有1-10個胺基酸替換。
在一種較佳的實施方式中，根據本發明所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中該B7-H3抗體進一步包括人抗體恒定區，較佳的該B7-H3抗體是分別由SEQ ID NO：22和23所示的重鏈和輕鏈序列組成的全長抗體，或分別由SEQ ID NO：22和26所示的重鏈和輕鏈序列組成的全長抗體，或分別由SEQ ID NO：24和25所示的重鏈和輕鏈序列組成的全長抗體。
在一種較佳的實施方式中，根據本發明所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段選自Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)和包含CDR的肽的抗原結合片段。
另一方面，本發明提供了一種分離的B7-H3抗體或其抗原結合片段，其特徵在於與前述B7-H3抗體或其抗原結合片段競爭結合人B7-H3。
本發明還提供一種醫藥組成物，其含有治療有效量的根據本發明該的B7-H3抗體或其抗原結合片段，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
本發明還提供一種核酸分子，其編碼本發明所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段。
本發明還提供一種重組載體，其包含上述的核酸分子。
本發明還提供一種根據上述重組載體轉化的宿主細胞，該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞，較佳為真核細 胞，更佳為哺乳動物細胞或酵母細胞。
本發明還提供一種根據用於生產本發明所述的抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包括將上述的宿主細胞在培養物中進行培養以形成並積累本發明所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段，以及從培養物中回收所積累的抗體或其抗原結合片段。
本發明還提供一種用於免疫檢測或測定B7-H3的方法，該方法包括使用本發明所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段。
本發明還提供一種用於檢測或測定B7-H3的試劑，該試劑包含本發明所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段。
本發明還提供一種與B7-H3陽性細胞相關的疾病的診斷劑，該診斷劑包含本發明所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段。
本發明還提供一種用於診斷與B7-H3陽性細胞相關的疾病的方法，該方法包括使用本發明所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段檢測或測定B7-H3或B7-H3陽性細胞。
另一方面，本發明還提供一種本發明所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段在製備與B7-H3陽性細胞相關的疾病的診斷劑中的用途。
在另一方面，本發明還提供一種與B7-H3陽性細胞相關的疾病的治療劑，該治療劑包含本發明所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段，或包含上述醫藥組成物，或包含上述核酸分子。
本發明還提供一種與B7-H3陽性細胞相關的疾病的治療方法，該方法包括使用本發明所述的抗體或其抗原結合片段，或包含上述醫藥組成物，或上述核酸分子誘導B7-H3陽性細胞的細胞死亡。
在另一方面，本發明還提供本發明所述的抗體或其抗原結合片段，或包含本發明所述的醫藥組成物，或本發明所述的核酸分子在製備與B7-H3陽性細胞相關的疾病的治療劑中的用途。
第1圖為不同抗體與人2Ig-B7-H3抗原的結合力圖；第2圖為不同抗體與人4Ig-B7-H3抗原的結合力圖；第3圖為不同抗體與鼠B7-H3抗原的交叉結合力圖；第4圖為不同抗體與U87MG細胞的結合力圖；第5圖為不同抗體在U87MG細胞上的內吞效果圖。
一.術語
為了更容易理解本發明，以下具體定義了某些技術和科學術語。除非在本文中另有明確定義，本文使用的所有其它技術和科學術語都具有本發明所屬領域的一般技術人員通常理解的含義。
本發明所用胺基酸三字母代碼和單字母代碼如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
本發明所述的“抗體”指免疫球蛋白，是由兩條相同的重鏈和兩條相同的輕鏈藉由鏈間二硫鍵連接而成的四肽鏈 結構。免疫球蛋白重鏈恒定區的胺基酸組成和排列順序不同，故其抗原性也不同。據此，可將免疫球蛋白分為五類，或稱為免疫球蛋白的同種型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相應的重鏈分別為μ鏈、δ鏈、γ鏈、α鏈、和ε鏈。同一類Ig根據其鉸鏈區胺基酸組成和重鏈二硫鍵的數目和位置的差別，又可分為不同的亞類，如IgG可分為IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。輕鏈藉由恒定區的不同分為κ鏈或λ鏈。五類Ig中每類Ig都可以有κ鏈或λ鏈。
在本發明中，本發明所述的抗體輕鏈可進一步包含輕鏈恒定區，該輕鏈恒定區包含人源或鼠源的κ、λ鏈或其變體。
在本發明中，本發明所述的抗體重鏈可進一步包含重鏈恒定區，該重鏈恒定區包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體。
抗體重鏈和輕鏈靠近N端的約110個胺基酸的序列變化很大，為可變區(Fv區)；靠近C端的其餘胺基酸序列相對穩定，為恒定區。可變區包括3個高變區(HVR)和4個序列相對保守的骨架區(FR)。3個高變區決定抗體的特異性，又稱為互補性決定區(CDR)。每條輕鏈可變區(LCVR)和重鏈可變區(HCVR)由3個CDR區4個FR區組成，從胺基端到羧基端依次排列的順序為：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。輕鏈的3個CDR區指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重鏈的3個CDR區指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本發明所述的抗體或抗原結合片段的LCVR區 和HCVR區的CDR胺基酸殘基在數量和位置符合已知的Kabat編號規則(LCDR1-3，HCDR2-3)，或者符合kabat和chothia的編號規則(HCDR1)。
術語“人抗體”與“人源抗體”可以互換使用，是指有一或多個可變區和恒定區來源於人免疫球蛋白序列。其中一個較佳的方式是所有的可變區和恒定區均來自於人免疫球蛋白序列，即“完全人源抗體”或“全人抗體”。這些抗體可以藉由多種方式製備獲得，包括藉由噬菌體展示技術，從人PBMC、脾臟、淋巴結組織分離B細胞，構建天然單鏈噬菌體人抗體庫，或者藉由免疫可表達人抗體輕重鏈的轉基因小鼠，篩選獲得的抗體。
術語“鼠源抗體”在本發明中為根據本領域知識和技能製備的對人B7-H3的單株抗體。製備時用B7-H3抗原注射試驗對象，然後分離表達具有所需序列或功能特性的抗體的融合瘤。在本發明一個較佳的實施方案中，該鼠源B7-H3抗體或其抗原結合片段，可進一步包含鼠源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恒定區，或進一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其變體的重鏈恒定區。
術語“嵌合抗體(chimeric antibody)”，是將鼠源性抗體的可變區與人抗體的恒定區融合而成的抗體，可以減輕鼠源性抗體誘發的免疫應答反應。建立嵌合抗體，要先建立分泌鼠源性特異性單抗的融合瘤，然後從鼠融合瘤細胞中選殖可變區基因，再根據需要選殖人抗體的恒定區基因，將鼠可變區基因與人恒定區基因連接成嵌合基因後插入表 達載體中，最後在真核系统或原核系统中表達嵌合抗體分子。在本發明一個較佳的實施方案中，該B7-H3嵌合抗體的抗體輕鏈進一步包含人源κ、λ鏈或其變體的輕鏈恒定區。該B7-H3嵌合抗體的抗體重鏈進一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其變體的重鏈恒定區，較佳包含人源IgG1、IgG2或IgG4重鏈恒定區，或者使用胺基酸突變(如YTE突變或回復突變)的IgG1、IgG2或IgG4變體。
術語“人源化抗體(humanized antibody)”，也稱為CDR移植抗體(CDR-grafted antibody)，是指將鼠的CDR序列移植到人的抗體可變區框架，即不同類型的人種系抗體框架序列中產生的抗體。可以克服嵌合抗體由於攜帶大量鼠蛋白成分，從而誘導的異源性反應。此類構架序列可以從包括種系抗體基因序列的公共DNA數據庫或公開的參考文獻獲得。如人重鏈和輕鏈可變區基因的種系DNA序列可以在“VBase”人種系序列數據庫(在因特網www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可獲得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。
CDR的移植可由於與抗原接觸的構架殘基而導致產生的B7-H3抗體或其抗原結合片段對抗原的親和力減弱。此類相互作用可以是體細胞高度突變的結果。因此，可能仍然需要將此類供體構架胺基酸移植至人源化抗體的構架。來自非人B7-H3抗體或其抗原結合片段的參與抗原結合的胺基酸殘基可藉由檢查鼠單株抗體可變區序列和結構 來鑒定。CDR供體構架中與種系不同的的各殘基可被認為是相關的。如果不能確定最接近的種系，那麼可將序列與亞型共有序列或具有高相似性百分數的鼠序列的共有序列相比較。稀有構架殘基被認為可能是體細胞高度突變的結果，從而在結合中發揮重要作用。
術語抗體的“抗原結合片段”或“功能片段”是指抗體的保持特異性結合抗原(例如，B7-H3)的能力的一個或多個片段。已显示可利用全長抗體的片段來進行抗體的抗原結合功能。術語抗體的“抗原結合片段”中包含的結合片段的實例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1結構域組成的單價片段；(ii)F(ab')2片段，包含藉由鉸鏈區上的二硫橋連接的兩個Fab片段的二價片段，(iii)由VH和CH1結構域組成的Fd片段；(iv)由抗體的單臂的VH和VL結構域組成的Fv片段；(v)單結構域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546)，其由VH結構域組成；和(vi)分離的互補决定區(CDR)或(vii)可視需要地藉由合成的接頭連接的兩個或更多個分離的CDR的組合。此外，雖然Fv片段的兩個結構域VL和VH由分開的基因編碼，但可使用重組方法，藉由合成的接頭連接它們，從而使得其能够產生為其中VL和VH區配對形成單價分子的單個蛋白質鏈(稱為單鏈Fv(scFv)；參見，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此類單鏈抗體也意欲包括在術語抗體的“抗原結合片段”中。使用本領 域技術人員已知的常规技術獲得此類抗體片段，並且以與對於完整抗體的方式相同的方式就功用性篩選片段。可藉由重組DNA技術或藉由酶促或化學斷裂完整免疫球蛋白來產生抗原結合部分。抗體可以是不同同種型的抗體，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亞型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗體。
本發明的抗原結合片段包括Fab、F(ab')2、Fab'、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)、包含CDR的肽等。
Fab是藉由用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H鏈的224位的胺基酸殘基)處理IgG抗體分子所獲得的片段中的具有約50,000的分子量並具有抗原結合活性的抗體片段，其中H鏈N端側的約一半和整個L鏈藉由二硫鍵結合在一起。
本發明的Fab可以藉由用木瓜蛋白酶處理本發明的特異性識別人B7-H3並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體來生產。此外，可以藉由將編碼該抗體的Fab的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab來生產該Fab。
F(ab')2是藉由用酶胃蛋白酶消化IgG鉸鏈區中兩個二硫鍵的下方部分而獲得的分子量為約100,000並具有抗原結合活性並包含在鉸鏈位置相連的兩個Fab區的抗體片段。
本發明的F(ab')2可以藉由用胃蛋白酶處理本發明的 特異性識別人B7-H3並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體來生產。此外，可以藉由用硫醚鍵或二硫鍵連接下面描述的Fab'來生產該F(ab')2。
Fab'是藉由切割上述F(ab')2的鉸鏈區的二硫鍵而獲得的分子量為約50,000並具有抗原結合活性的抗體片段。本發明的Fab'可以藉由用還原劑例如二硫蘇糖醇處理本發明的特異性識別B7-H3並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的F(ab')2來生產。
此外，可以藉由將編碼抗體的Fab'片段的DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中並將載體導入到原核生物或真核生物中以表達Fab'來生產該Fab'。
術語“單鏈抗體”、“單鏈Fv”或“scFv”意指包含藉由接頭連接的抗體重鏈可變結構域(或區域；VH)和抗體輕鏈可變結構域(或區域；VL)的分子。此類scFv分子可具有一般結構：NH2-VL-接頭-VH-COOH或NH2-VH-接頭-VL-COOH。合適的现有技術接頭由重複的GGGGS胺基酸序列或其變體組成，例如使用1-4個重複的變體(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用於本發明的其他接頭由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno 1.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
本發明的scFv可以藉由以下步驟來生產：獲得本發明 的特異性識別人B7-H3並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的編碼cDNA，構建編碼scFv的DNA，將該DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達scFv。
雙抗體是其中scFv被二聚體化的抗體片段，是具有二價抗原結合活性的抗體片段。在二價抗原結合活性中，兩個抗原可以是相同或不同的。
本發明的雙抗體可以藉由以下步驟來生產：獲得本發明的特異性識別人B7-H3並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的編碼cDNA，構建編碼scFv的DNA以使肽接頭的胺基酸序列長度為8個殘基或更少，將該DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達雙抗體。
dsFv是藉由將其中每個VH和VL中的一個胺基酸殘基被半胱胺酸殘基取代的多肽經由半胱胺酸殘基之間的二硫鍵相連而獲得的。可以按照已知方法(Protein Engineering,7,697(1994))基於抗體的三維結構預測來選擇被半胱胺酸殘基取代的胺基酸殘基。
本發明的dsFv可以藉由以下步驟來生產：獲得獲得本發明的特異性識別人B7-H3並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的編碼cDNA，構建編碼dsFv的DNA，將該DNA插入到原核生物表達載體 或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達dsFv。
包含CDR的肽是藉由包含VH或VL的CDR中的一個或多個區域而構成的。包含多個CDR的肽可以被直接相連或經由適合的肽接頭相連。
本發明的包含CDR的肽可以藉由以下步驟來生產：構建本發明的特異性識別人B7-H3並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體的VH和VL的CDR的編碼DNA，將該DNA插入到原核生物表達載體或真核生物表達載體中，然後將該表達載體導入到原核生物或真核生物中以表達該肽。也可以藉由化學合成方法例如Fmoc方法或tBoc方法來生產該包含CDR的肽。
術語“CDR”是指抗體的可變結構域內主要促成抗原結合的6個高變區之一。該6個CDR的最常用的定義之一由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins of immunological interest.NIH Publication91-3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat定義只應用於輕鏈可變結構域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR L1、CDR L2、CDR L3或L1、L2、L3)，以及重鏈可變結構域的CDR2和CDR3(CDR H2、CDR H3或H2、H3)。
本文中使用的術語“抗體框架”，是指可變結構域VL或VH的一部分，其用作該可變結構域的抗原結合環(CDR)的支架。從本質上講，其是不具有CDR的可變結構域。
術語“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或 抗體特異性結合的部位(例如，B7-H3分子上的特定部位)。表位通常以獨特的空間構象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15個連續或非連續的胺基酸。參見，例如，Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。
術語“特異性結合”、“選擇性結合”、“選擇性地結合”和“特異性地結合”是指抗體對預先確定的抗原上的表位的結合。通常，抗體以大约小於10-7M，例如大约小於10-8M、10-9M或10-10M或更小的親和力(KD)結合。
術語“KD”或“Kd”是指特定抗體-抗原相互作用的解離平衡常數。通常，本發明的抗體以小於大约10-7M，例如小於大约10-8M、10-9M或10-10M或更小的解離平衡常數(KD)結合B7-H3，例如，如使用表面等離子體共振(SPR)技術在BIACORE儀中测定的。
術語“競爭結合”是指與本發明的單株抗體識別人B7-H3的胞外區上的相同表位(也稱為抗原決定簇)或相同表位的一部分並與該表位結合的抗體。與本發明的單株抗體結合相同表位的抗體是指識別並結合於本發明的單株抗體所識別的人B7-H3的胺基酸序列的抗體。
本文中使用的術語“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，但較佳是雙鏈DNA。當將核酸與另一個核酸序列置於功能關係中時，核酸是“有效連接的”。例如，如果啟動子或增强子影響編碼序列的轉錄，那麼啟動子或增强子有效地連接至該編碼序 列。
術語“載體”是指能够運輸已與其連接的另一個核酸的核酸分子。在一個實施方案中，載體是“質粒”，其是指可將另外的DNA區段連接至其中的環狀雙鏈DNA環。在另一個實施方案中，載體是病毒載體，其中可將另外的DNA區段連接至病毒基因組中。本文中公開的載體能够在已引入它們的宿主細胞中自主複製(例如，具有細菌的複製起點的細菌載體和附加型哺乳動物載體)或可在引入宿主細胞後整合入宿主細胞的基因組，從而隨宿主基因組一起複製(例如，非附加型哺乳動物載體)。
現有技術中熟知生產和純化抗體和抗原結合片段的方法，如冷泉港的抗體實驗技術指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用人B7-H3或其片段免疫，所得到的抗體能被覆性、純化，並且可以用常規的方法進行胺基酸測序。抗原結合片段同樣可以用常規方法製備。發明該的抗體或抗原結合片段用基因工程方法在非人源的CDR區加上一個或多個人源FR區。人FR種系序列可以藉由比對IMGT人類抗體可變區種系基因資料庫和MOE軟體，從ImMunoGeneTics(IMGT)的網站http：//imgt.cines.fr得到，或者從免疫球蛋白雜誌，2001ISBN012441351上獲得。
術語“宿主細胞”是指已向其中引入了表達載體的細胞。宿主細胞可包括細菌、微生物、植物或動物細胞。易於轉化的細菌包括腸桿菌科(enterobacteriaceae)的成員，例如大腸桿菌(Escherichia coli)或沙門氏菌(Salmonella) 的菌株；芽孢桿菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；鏈球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。適當的微生物包括釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和畢赤酵母(Pichia pastoris)。適當的動物宿主細胞系包括CHO(中國倉鼠卵巢細胞系)和NS0細胞。
本發明工程化的抗體或抗原結合片段可用常規方法製備和純化。比如，編碼重鏈和輕鏈的cDNA序列，可以選殖並重組至GS表達載體。重組的免疫球蛋白表達載體可以穩定地轉染CHO細胞。作為一種更推薦的現有技術，哺乳動物類表達系統會導致抗體的糖基化，特別是在Fc區的高度保守N端位點。藉由表達與人B7-H3特異性結合的抗體得到穩定的純株。陽性的純株在生物反應器的無血清培養基中擴大培養以生產抗體。分泌了抗體的培養液可以用常規技術純化。比如，用含調整過的緩衝液的A或G Sepharose FF管柱進行純化。洗去非特異性結合的組分。再用pH梯度法洗脫結合的抗體，用SDS-PAGE檢測抗體片段，收集。抗體可用常規方法進行過濾濃縮。可溶的混合物和多聚體，也可以用常規方法去除，比如分子篩、離子交換。得到的產物需立即冷凍，如-70℃，或者凍乾。
“給予”和“處理”當應用於動物、人、實驗受試者、細胞、組織、器官或生物流體時，是指外源性藥物、治療劑、診斷劑或組合物與動物、人、受試者、細胞、組織、器官或生物流體的接觸。“給予”和“處理”可以指例如治療、藥 物代謝動力學、診斷、研究和實驗方法。細胞的處理包括試劑與細胞的接觸，以及試劑與流體的接觸，其中該流體與細胞接觸。“給予”和“處理”還意指藉由試劑、診斷、結合組合物或藉由另一種細胞體外和離體處理例如細胞。“處理”當應用於人、獸醫學或研究受試者時，是指治療處理、預防或預防性措施，研究和診斷應用。
“治療”意指給予患者內用或外用治療劑，例如包含本發明的任一種結合化合物的組合物，該患者具有一種或多種疾病症狀，而已知該治療劑對這些症狀具有治療作用。通常，在受治療患者或群體中以有效緩解一種或多種疾病症狀的量給予治療劑，以誘導這類症狀退化或抑制這類症狀發展到任何臨床右測量的程度。有效緩解任何具體疾病症狀的治療劑的量(也稱作“治療有效量”)可根據多種因素變化，例如患者的疾病狀態、年齡和體重，以及藥物在患者產生需要療效的能力。藉由醫生或其它專業衛生保健人士通常用於評價該症狀的嚴重性或進展狀況的任何臨床檢測方法，可評價疾病症狀是否已被減輕。儘管本發明的實施方案(例如治療方法或製品)在緩解每個目標疾病症狀方面可能無效，但是根據本領域已知的任何統計學檢驗方法如Student t檢驗、卡方檢驗、依據Mann和Whitney的U檢驗、Kruskal-Wallis檢驗(H檢驗)、Jonckheere-Terpstra核對總和Wilcoxon檢驗確定，其在統計學顯著數目的患者中應當減輕目標疾病症狀。
“保守修飾”或“保守置換或取代”是指具有類似特徵(例 如電荷、側鏈大小、疏水性/親水性、主鏈構象和剛性等)的其它胺基酸置換蛋白中的胺基酸，使得可頻繁進行改變而不改變蛋白的生物學活性。本領域技術人員知曉，一般而言，多肽的非必需區域中的單個胺基酸置換基本上不改變生物學活性(參見例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene,The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224頁，(第4版))。另外，結構或功能類似的胺基酸的置換不大可能破壞生物學活性。
“有效量”包含足以改善或預防醫學疾病的症狀或病症的量。有效量還意指足以允許或促進診斷的量。用於特定患者或獸醫學受試者的有效量可依據以下因素而變化：例如，待治療的病症、患者的總體健康情況、給藥的方法途徑和劑量以及副作用嚴重性。有效量可以是避免顯著副作用或毒性作用的最大劑量或給藥方案。
“外源性”指根據情況在生物、細胞或人體外產生的物質。“內源性”指根據情況在細胞、生物或人體內產生的物質。
“同一性”是指兩個多核苷酸序列之間或兩個多肽之間的序列相似性。當兩個比較序列中的位置均被相同鹼基或胺基酸單體亞基佔據時，例如如果兩個DNA分子的每一個位置都被腺嘌呤佔據時，那麼該分子在該位置是同源的。兩個序列之間的同一性百分率是兩個序列共有的匹配或同源位置數除以比較的位置數×100的函數。例如，在序列最佳比對時，如果兩個序列中的10個位置有6個匹配或 同源，那麼兩個序列為60%同源；如果兩個序列中的100個位置有95個匹配或同源，那麼兩個序列為95%同源。一般而言，當比對兩個序列而得到最大的同一性百分率時進行比較。
本文使用的表述“細胞”、“細胞系”和“細胞培養物”可互換使用，並且所有這類名稱都包括後代。因此，單詞“轉化體”和“轉化細胞”包括原代受試細胞和由其衍生的培養物，而不考慮轉移數目。還應當理解的是，由於故意或非有意的突變，所有後代在DNA含量方面不可能精確相同。包括具有與最初轉化細胞中篩選的相同的功能或生物學活性的突變後代。在意指不同名稱的情況下，其由上下文清楚可見。
本文使用的“聚合酶鏈式反應”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美國專利號4,683,195中所述擴增的程式或技術。一般來說，需要獲得來自目的地區域末端或之外的序列資訊，使得可以設計寡核苷酸引子；這些引子在序列方面與待擴增範本的對應鏈相同或相似。2個引子的5’末端核苷酸可以與待擴增材料的末端一致。PCR可用於擴增特定的RNA序列、來自總基因組DNA的特定DNA序列和由總細胞RNA轉錄的cDNA、噬菌體或質粒序列等。一般參見Mullis等(1987)Cold Spring Harbor Symp.Ouant.Biol.51：263；Erlich編輯，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press,N.Y.)。本文使用的PCR被視為用於擴增核酸測試樣品的核酸聚合 酶反應法的一個實例，但不是唯一的實例，該方法包括使用作為引子的已知核酸和核酸聚合酶，以擴增或產生核酸的特定部分。
“視需要”或“視需要地”意味著隨後所描述地事件或環境可以但不必發生，該說明包括該事件或環境發生或不發生的場合。例如，“視需要包含1-3個抗體重鏈可變區”意味著特定序列的抗體重鏈可變區可以但不必須存在。
“醫藥組成物”表示含有一種或多種本文所述化合物或其生理學上/可藥用的鹽或前體藥物與其他化學組分的混合物，該其他組分例如生理學/可藥用的載體和賦形劑。醫藥組成物的目的是促進對生物體的給藥，利於活性成分的吸收進而發揮生物活性。
此外，本發明涉及用於免疫檢測或測定B7-H3的方法、用於免疫檢測或測定B7-H3的試劑、用於免疫檢測或測定表達B7-H3的細胞的方法和用於診斷與B7-H3陽性細胞相關的疾病的診斷劑，其包含本發明的特異性識別人B7-H3並與胞外區的胺基酸序列或其三維結構結合的單株抗體或抗體片段作為活性成分。
在本發明中，用於檢測或測定B7-H3的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫檢測或測定方法。
免疫檢測或測定方法是使用標記的抗原或抗體檢測或測定抗體量或抗原量的方法。免疫檢測或測定方法的實例包括放射性物質標記的免疫抗體方法(RIA)、酶免疫測定法(EIA或ELISA)、螢光免疫測定法(FIA)、發光免疫測定 法、蛋白質免疫印跡法、物理化學方法等。
上述與B7-H3陽性細胞相關的疾病可以藉由用本發明的單株抗體或抗體片段檢測或測定表達B7-H3的細胞來診斷。
為了檢測表達多肽的細胞，可以使用已知的免疫檢測方法，並較佳使用免疫沉澱法、螢光細胞染色法、免疫組織染色法等。此外，可以使用利用FMAT8100HTS系統(Applied Biosystem)的螢光抗體染色法等。
在本發明中，對用於檢測或測定B7-H3的活體樣品沒有特別限制，只要它具有包含表達B7-H3的細胞的可能性即可，例如組織細胞、血液、血漿、血清、胰液、尿液、糞便、組織液或培養液。
根據所需的診斷方法，含有本發明的單株抗體或其抗體片段的診斷劑還可以含有用於執行抗原-抗體反應的試劑或用於檢測反應的試劑。用於執行抗原-抗體反應的試劑包括緩衝劑、鹽等。用於檢測的試劑包括通常用於免疫檢測或測定方法的試劑，例如識別該單株抗體、其抗體片段或其結合物的標記的第二抗體和與該標記對應的受質等。
本發明還涉及治療人B7-H3陽性細胞相關的疾病的方法，特別是在治療癌症和炎症中的用途。
二.實施例與測試例
以下結合實施例進一步描述本發明，但這些實施例並非限制著本發明的範圍。本發明實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，如冷泉港的抗體技術實 驗手冊，分子選殖手冊；或按照原料或商品製造廠商所建議的條件。未注明具體來源的試劑，為市場購買的常規試劑。
實施例1. B7-H3抗原及檢測用蛋白的製備 B7-H3抗原設計
以SEQ ID NO：1所示人B7-H3作為本發明B7-H3的模板，設計本發明涉及的抗原及檢測用蛋白的胺基酸序列。以下B7-H3抗原未特殊說明的均指人B7-H3。
人B7-H3全長蛋白：B7-H3(SEQ ID NO：1)： 注釋： 雙橫線部分為信號肽(Signal peptide：1-28)；劃橫線部分為B7-H3胞外區(Extracellular domain：29-466)，其中29-139為Ig-like V-type 1 Domain，145-238為Ig-like C2-type 1 Domain；243-357為Ig-like V-type 2 Domain，363-456為Ig-like C2-type 2 Domain；點劃線部分為跨膜區部分(Transmembrane domain：467-487)；斜體部分為胞內區(Cytoplasmic domain：488-534)。
鼠B7-H3全長胺基酸序列(SEQ ID NO：2) 注釋：雙橫線部分為信號肽(Signal peptide：1-28)；劃橫線部分為B7-H3胞外區(Extracellular domain：29-248)，其中29-139為Ig-like V-type Domain，145-238為Ig-like C2-type Domain；點劃線部分為跨膜區部分(Transmembrane domain：249-269)； 斜體部分為胞內區(Cytoplasmic domain：270-316)。
篩選及檢測用人B7-H3抗原(SEQ ID NO：3)為商業化產品(R&D cat# 1949-B3-050/CF，簡稱2Ig-B7-H3)，序列如下： 注釋：劃橫線部分為B7-H3胞外區；斜體部分為His-tag標記。
檢測用人B7-H3抗原(SEQ ID NO：4)為商業化產品(SinoBiological cat# 11188-H08H，簡稱4Ig-B7-H3)，序列如下： 注釋：劃橫線部分為B7-H3胞外區；斜體部分為His-tag標記。
篩選及檢測用鼠B7-H3抗原(SEQ ID NO：5)為商業化產品(R&D cat#1397-B3-050/CF)，序列如下： 注釋：劃橫線部分為B7-H3胞外區；斜體部分為His-tag標記。
實施例2. 特異性結合人B7-H3的陽性序列的篩選
利用人PBMC、脾臟、淋巴結組織分離B細胞，並提取RNA，構建天然單鏈噬菌體抗體庫(庫容3.2×1010)。將構建的天然單鏈噬菌體抗體庫經過包裝形成噬菌體顆粒後，採用液相法進行淘篩，噬菌體與生物素化的B7-H3液相結合，再採用鏈黴親和素磁珠分離。為了獲得與人B7-H3(R&D cat# 1949-B3-050/CF)結合的陽性序列，採用生物素化的人B7-H3進行淘篩，挑取500個單株菌落包裝成噬菌體單鏈抗體，用於噬菌體ELISA測試。分別測試單株噬菌體與人B7-H3(R&D cat# 1949-B3-050/CF)和鼠 B7-H3(R&D cat#1397-B3-050/CF)的結合活性：ELISA板上分別包被1μg/ml人B7-H3或鼠B7-H3以及1%BSA，加入1：1 blocking buffer稀釋的噬菌體上清，最後用anti-M13 HRP檢測；將ELISA測試到的OD450值大於0.5，以及結合人和鼠B7-H3的ELISA OD450值除以結合1%BSA的ELISA OD450值的兩個比值均大於2.0的純株進行測序，得到9個特異性序列。
實施例3. 完整單株抗體的構建
噬菌體庫篩選得到的9個特異性序列構建完整抗體後藉由ELISA結合實驗確定其中2個抗體結合力強，分別是h1702和h1703。對其完整單株抗體構建的過程如下：根據測序得到的單鏈抗體序列，設計引子PCR搭建各單鏈抗體序列的VH/VK/VL基因片段。獲得h1702和h1703的重輕鏈可變區。
>h1702重鏈可變區序列 SEQ ID NO：6
>h1702輕鏈可變區序列 SEQ ID NO：7
>h1703重鏈可變區序列 SEQ ID NO：8
>h1703輕鏈可變區序列 SEQ ID NO：9注：順序為FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜體為FR序列，底線為CDR序列。
其中各抗體輕重鏈中CDR序列如表1所示。
抗體可變區再與恒定區基因(CH1-FC/CL)片段進行同源重組，構建完整抗體VH-CH1-FC/VK-CL/VL-CL。
構建的完整抗體h1702-IgG1、h1703-IgG1序列如下：h1702-IgG1：h1702-IgG1重鏈胺基酸序列：(SEQ ID NO：22)
h1702輕鏈胺基酸序列：Lamada(SEQ ID NO：23)
h1703-IgG1：h1703-IgG1重鏈胺基酸序列：(SEQ ID NO：24)
h1703輕鏈胺基酸序列：Kappa(SEQ ID NO：25)
為進一步提高抗體的穩定性，對h1702的輕鏈序列進行胺基酸突變，具體突變為輕鏈N端第一個胺基酸殘基Q替代為D，缺失突變C端第一個胺基酸殘基S，以獲得更加穩定和均一的單株抗體。
突變修飾後的h1702-1的輕鏈胺基酸序列：(SEQ ID NO：26)
實施例4. 全人抗體的表達與純化
分別表達抗體輕重鏈的質粒以1.5：1的比例轉染 HEK293E細胞，6天後收集表達上清，高速離心去除雜質，用Protein A管柱進行純化。用PBS沖洗管柱，至A280讀數降至基線。用pH3.0-pH3.5的酸性洗脫液洗脫目的蛋白，用1M Tris-HCl,pH8.0-9.0中和。洗脫樣品適當濃縮後，利用PBS平衡好的凝膠層析Superdex200(GE)進一步純化，以去除聚體，收集單體峰，分裝備用。
以下用測試方法驗證本發明抗體性能及有益效果。
測試例1. ELISA結合實驗
為檢測篩選到的B7-H3抗體對於人不同形式B7-H3的體外結合能力，人2Ig-B7-H3(Cat.# 1949-B3-050/CF，R&D)和人4Ig-B7-H3(Cat.# 11188-H08H，Sino Biological)被用於進行體外結合檢測。
用pH7.4的PBS(Sigma，P4417-100TAB)緩衝液將人B7-H3蛋白(2Ig/4Ig)稀釋至1μg/ml濃度，以100μl/孔的體積加入96孔酶標板(Corning，CLS3590-100EA)中，於4℃放置過夜16-20小時。棄去液體後，加入用PBST緩衝液(PH7.4PBS含0.05% Tween-20)稀釋的5%脫脂牛奶(光明脫脂奶粉)封閉液120μl/孔，37℃孵育箱孵育2小時進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液洗板4次後，加入100μl/孔初始濃度為1μM的相應B7-H3抗體，用PBST緩衝液倍比稀釋8個梯度，置於37℃孵育箱孵育1小時。孵育結束後，棄去酶標板中的反應液，用PBST洗板4次，加入100μl/孔用PBST稀釋(1：4000)的HRP標記的羊抗人IgG(Goat Anti-Human IgG)Fcγ片段特異性的 二次抗體(Jackson Immuno Research,109-005-008)，37℃孵育1小時。用PBST洗板4次後，加入100μl/孔TMB顯色受質(KPL，52-00-03)，於室溫孵育3-5min，加入100μl/孔1M H2SO4終止反應，用NOVOStar酶標儀在450nm處讀取吸收值，計算抗體對抗原的結合EC50值，結果見表2和第1圖、第2圖。
結果表明，h1702和h1703與人2Ig-B7-H3和4Ig-B7-H3都有明顯的結合，其中h1702的結合力更強。
測試例2. 與不同種屬B7-H3的交叉結合實驗
為檢測篩選到的B7-H3抗體對於不同種屬來源的B7-H3的體外結合能力，小鼠B7-H3(Cat.# 1397-B3-050/CF，R&D)被用於進行體外結合檢測。
用pH7.4的PBS(Sigma，P4417-100TAB)緩衝液將不同種屬B7-H3蛋白(mouse B7-H3)稀釋至1μg/ml濃度，以100μl/孔的體積加入96孔酶標板(Corning，CLS3590-100EA)中，於4℃放置過夜16-20小時。棄去液體後，加入用PBST緩衝液(PH7.4PBS含0.05% Tween-20)稀釋的5%脫脂牛奶(光明脫脂奶粉)封閉液120μl/孔，37℃孵育箱孵育2小時 進行封閉。封閉結束後，棄去封閉液，並用PBST緩衝液洗板4次後，加入100μl/孔初始濃度為1μM的相應B7-H3抗體，用PBST緩衝液倍比稀釋8個梯度，置於37℃孵育箱孵育1小時。孵育結束後，棄去酶標板中的反應液，用PBST洗板4次，加入100μl/孔用PBST稀釋(1：4000)的HRP標記的Goat Anti-Human IgG,Fcγ fragment specific的二次抗體(Jackson Immuno Research,109-005-008)，37℃孵育1小時。用PBST洗板4次後，加入100μl/孔TMB顯色受質(KPL,52-00-03)，於室溫孵育3-5min，加入100μl/孔1M H2SO4終止反應，用NOVOStar酶標儀在450nm處讀取吸收值，計算抗體對抗原的結合EC50值(結果見表3和第3圖)。
結果顯示，h1702和h1703與鼠B7-H3結合力相對較弱，顯示出兩個單株抗體特異性結合人B7-H3。
測試例3. Biacore抗體親和力實驗
用Biacore，GE儀器測定抗B7-H3抗體和人、鼠B7-H3的反應親和力。
用生物傳感晶片Protein A(Cat.# 29127556，GE)親和捕獲一定量的待測抗體，然後於晶片表面流經一系列濃度 梯度下的人2Ig-B7-H3抗原(Cat.# 1949-B3-050/CF，R&D)、人4Ig-B7-H3抗原(Cat.# 11188-H08H，Sino Biological)或鼠B7-H3抗原(Cat.# 1397-B3-050/CF，R&D)，利用Biacore儀器(Biacore T200，GE)即時檢測反應信號從而獲得結合和解離曲線。在每個循環解離完成後，用甘胺酸-鹽酸再生溶液(pH 1.5)(Cat.# BR-1003-54，GE)將生物晶片洗淨再生。實驗中用到的緩衝液為HBS-EP緩衝溶液(pH 7.4)(Cat.# BR-1001-88，GE)。
實驗得到的資料用BIAevaluation version 4.1，GE軟體以(1：1)Langmuir模型進行擬合，從而得出親和力數值。實驗結果見表4-6。
Biacore親和力測試結果表明，h1702與人4Ig-B7-H3 的親和力較強，達到nM水準，而與人2Ig-B7-H3和鼠B7-H3的親和力相對較弱，h1703與人4Ig-B7-H3，人2Ig-B7-H3，和鼠B7-H3的親和力都較弱。
測試例4. 體外細胞結合實驗
本實驗藉由檢測細胞表面抗體的螢光信號，根據螢光信號強弱來評價抗體的結合。將10μg一次抗體與2×105個U87MG細胞在冰上孵育30分鐘後洗掉多餘的抗體。將細胞與APC anti-human IgG Fc(Biolegend，409306)在室溫孵育30分鐘，洗掉多餘抗體後使用BD Verse讀取細胞表面的螢光信號(結果見第4圖)。結果表明h1702能與B7-H3過表達的腫瘤細胞系U87MG特異結合。
測試例5. 體外細胞內吞實驗
本實驗藉由檢測細胞內抗體的螢光信號，根據螢光信號強弱來評價抗體的內吞效果。將B7-H3抗體和APC anti-human IgG Fc(Biolegend，409306)以1：2的莫耳比例混合在冰上孵育15分鐘。將抗體混合物與2×105個U87MG細胞在冰上孵育30分鐘後洗掉多餘的抗體，然後將細胞轉入預溫37℃的培養基中，在37℃分別孵育0，15，30，60和120分鐘。離心細胞並將細胞重懸在抗體洗脫液中室溫孵育7分鐘，洗掉抗體洗脫液，使用BD Verse讀取細胞內螢光信號(結果見第5圖)。結果表明h1702和h1703與U87MG細胞系結合後，都能有效地被內吞入細胞。
測試例6. SD大鼠T1/2評價
SD大鼠4隻(購自傑思捷實驗動物有限公司)，雌雄各半，12/12小時光/暗調節，溫度24±3℃恆溫，濕度50-60%，自由進食飲水。實驗當天對SD大鼠分別尾靜脈注射受試藥物，給藥劑量為3mg/kg，注射體積5ml/kg。
取血時間點為：第1天給藥後5min、8h、24h(第2天)，第3天，第5天，第8天，第11天，第15天，於大鼠眼底靜脈取血，每次200μL(相當於取血清100μL)；收集的血樣在室溫下置放半小時至凝集，然後4℃下10000×g離心10分鐘。收集上清，立即放置-80℃貯存。用ELISA檢測血清中的B7-H3抗體濃度，進行PK分析，結果見表7。
結果表明，本發明在大鼠體內的半衰期約為185h(7.7天)。
測試例7. B7-H3抗體的物理穩定性
利用DSC檢測不同抗體的熱穩定性，比較了不同的緩衝體系不同pH條件下的熱穩定性情況，不同pH對應的示例性緩衝體系如10mM PB(pH7)，10mM Acetate(pH5.2)。將樣品置換到對應緩衝液中，控制樣品濃度在1mg/ml左右，利用MicroCal* VP-Capillary DSC(Malvern)進行檢測。 檢測前，將各個樣品及空白buffer用真空脫氣器脫氣1~2min。樣品板每個孔加入400μl樣品或空白緩衝液(儀器上樣量為300μl)。最後兩對孔板分別加入14% Decon 90和ddH2O，以備清洗用，樣品板加樣完畢後，套上塑膠軟蓋板。掃描溫度從25℃開始到100℃結束，掃描速率60℃/h。具體結果如表8所示，在幾個測試體系中h1702、h1703均表現了較好的熱穩定性。
藉由SEC-HPLC監測樣品純度考察一定濃度條件下穩定性，示例性的條件比如將樣品濃度控制在約40-50mg/ml，在PBS(pH7.4)體系及pH5.2醋酸/蔗糖體系中比較不同抗體在4℃、30℃、40℃保存一個月的穩定性情況。利用Xbridge protein BEH SEC 200A(Waters)HPLC管柱檢測抗體純度，藉由一個月的考察，h1702、h1703均表現了良好的穩定性，結果如表9所示。
結果顯示，h1702和h1703在醋酸和PBS緩衝液中均顯示出優異的穩定性。
測試例8. B7-H3抗體的化學穩定性
抗體製備後化學修飾是導致產品穩定性的常見問題之一，尤其是CDR區域的部分胺基酸高度脫醯胺、氧化或者異構化修飾一般選擇儘量避免或者突變降低。取500μg待測抗體溶於500μl pH 7.4的PBS中，40℃水浴；分別於0、10、20天取樣，用於酶解實驗。將100μg不同時間點取樣的樣品溶於100μl 0.2M His-HCl，8M Gua-HCl，pH 6.0溶液中，加3μl 0.1g/mL DTT，50℃水浴1小時，後用0.02M His-HCl，pH 6.0的溶液超濾兩次，加入3μL 0.25mg/mL的胰蛋白酶(trypsin)，37℃水浴酶解過夜。Agilent 6530 Q-TOF進行LC-MS檢測分析，對潛在的修飾位點進行質譜分析(結果見表10)，結果顯示本發明中涉及的h1702、h1703均無明顯的脫醯胺、氧化或者異構化加劇趨勢，提示分子優異的化學穩定性。
測試例9. h1702-1抗體的穩定性
由於抗體輕鏈為1ambda型時，在C端比kappa型輕鏈多出一個胺基酸S，其空間位阻可能是導致輕重鏈間二硫鍵不穩定的因素。可以藉由分子選殖的方法敲除末端S胺基酸，顯著提高鹼性條件該抗體的穩定性。
當裸抗輕鏈N端第一個胺基酸為Q時，在該抗體中也會存在部分環化的現象，部分環化導致樣品電荷異質性增加，對處方及產品的穩定性均會產生影響。藉由分子選殖的方法將N端第一個胺基酸Q突變為D，可消除環化不完全的情況，顯著提高抗體穩定性。而上述改造未顯著影響改造後的抗體與抗原的親和能力。
藉由SEC、非還原CE-SDS分析檢測方法(pH 9.0)和IEX分析檢測方法，對h1702和h1702-1進行穩定性檢測。
SEC檢測：使用Waters e2695色譜儀，Xbridge BEH 200A SEC色譜管柱，上樣50μg抗體，PBS流動相等度洗脫。
CE-SDS NR方法：
使用Beckman SDS-MW Analysis Kit試劑盒處理樣品。100μg蛋白中加入緩衝液，加熱變性。使用PA800毛細管電泳儀採集資料。
IEX方法：
使用Waters Acquity H-Class色譜儀，Thermo MAbPac SCX-10色譜管柱，CX-1 pH Gradient Buffer Kit作為流動相，上樣50μg抗體，線性梯度，採集280nm波長的紫外信號。
雖然為了清楚的理解，已經借助於圖式和實例詳細描述了上述發明，但是描述和實例不應當解釋為限制本發明的範圍。本文中引用的所有專利和科學文獻的公開內容藉由引用完整地清楚結合。
<110> 江蘇恆瑞醫藥股份有限公司、上海恆瑞醫藥有限公司
<120> B7-H3抗體、其抗原結合片段及其醫藥用途
<130> 780019CPCT
<160> 26
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 534
<212> PRT
<213>智人
<220>
<221>肽
<223>人B7H3全長胺基酸序列
<400>1
<210> 2
<211> 316
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> 肽
<223> 鼠B7H3全長胺基酸序列
<400> 2
<210> 3
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<223> 人B7H3抗原：2Ig-B7H3
<400> 3
<210> 4
<211> 439
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<223> 人B7H3抗原：4Ig-B7H3
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<210> 5
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 肽
<223> 鼠B7H3抗原
<400> 5
<210> 6
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> h1702重鏈可變區
<400> 6
<210> 7
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> h1702輕鏈可變區
<400> 7
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<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> h1703重鏈可變區
<400> 8
<210> 9
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> h1703輕鏈可變區
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<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
<223> h1702 HCDR1
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> 結構域
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> 結構域
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> 結構域
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<212> PRT
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<221> 結構域
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> 結構域
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<221> 結構域
<223> h1702-1輕鏈
<400> 26

Claims (23)

  1. 一種B7-H3抗體或其抗原結合片段，其與人B7-H3結合，該B7-H3抗體或其抗原結合片段是選自下面(i)至(ii)中任一種單株抗體或其抗原結合片段：(i)單株抗體或其抗原結合片段，其包含1個或多個選自以下的CDR區序列或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列：抗體重鏈可變區HCDR區序列：如SEQ ID NO：10、11和12胺基酸序列所示；和抗體輕鏈可變區LCDR區序列：如SEQ ID NO：13、14和15胺基酸序列所示；(ii)單株抗體或其抗原結合片段，其包含1個或多個選自以下的CDR區序列或與其具有至少95%序列同一性的胺基酸序列：抗體重鏈可變區HCDR區序列：如SEQ ID NO：16、17和18胺基酸序列所示；和抗體輕鏈可變區LCDR區序列：如SEQ ID NO：19、20和21胺基酸序列所示。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體是重組抗體。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中該單株抗體是人源的重組抗體或其抗原結合片段。
  4. 如申請專利範圍第3項所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中該人源的重組抗體的輕鏈和重鏈可變區上的輕鏈和重鏈FR區序列分別來源於人種系的輕鏈和重 鏈序列或其突變序列。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中該人源的重組抗體含有SEQ ID NO：6或8所示的重鏈可變區或其變體；該變體是在SEQ ID NO：6或8所示的重鏈可變區序列上具有1至10個胺基酸的缺失、替換或添加。
  6. 如申請專利範圍第4項所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中該人源的重組抗體含有SEQ ID NO：7或9所示的輕鏈可變區或其變體；該變體是在SEQ ID NO：7或9所示的輕鏈可變區序列上具有1至10個胺基酸的缺失、替換或添加。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中該B7-H3抗體進一步包括人抗體恆定區。
  8. 如申請專利範圍第7項所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中該B7-H3抗體是分別由SEQ ID NO：22和23所示的重鏈和輕鏈序列組成的全長抗體，或分別由SEQ ID NO：22和26所示的重鏈和輕鏈序列組成的全長抗體，或分別由SEQ ID NO：24和25所示的重鏈和輕鏈序列組成的全長抗體。
  9. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段，其中該抗原結合片段選自Fab、Fab'、F(ab')2、單鏈抗體(scFv)、二聚化的V區(雙抗體)、二硫鍵穩定化的V區(dsFv)和包含CDR的肽的抗 原結合片段。
  10. 一種分離的B7-H3抗體或其抗原結合片段，其特徵在於與申請專利範圍第1至9項中任一項所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段競爭結合人B7-H3。
  11. 一種醫藥組成物，其含有治療有效量的根據申請專利範圍第1至10項中任一項所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段，以及一種或多種藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑。
  12. 一種核酸分子，其編碼申請專利範圍第1至10項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段。
  13. 一種重組載體，其包含申請專利範圍第12項所述的核酸分子。
  14. 一種使用如申請專利範圍第13項所述的重組載體轉化的宿主細胞，該宿主細胞選自原核細胞和真核細胞。
  15. 如申請專利範圍第14項所述的宿主細胞，其中該宿主細胞為真核細胞。
  16. 如申請專利範圍第15項所述的宿主細胞，其中該宿主細胞為哺乳動物細胞或酵母細胞。
  17. 一種用於生產申請專利範圍第1至10項中任一項所述的抗體或其抗原結合片段的方法，該方法包括將申請專利範圍第14項所述的宿主細胞在培養物中進行培養以形成並積累申請專利範圍第1至10項中任一項所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段，以及從培養物中回收所積累的抗體或其抗原結合片段。
  18. 一種用於免疫檢測或測定B7-H3的方法，該方法包括使用申請專利範圍第1至10項中任一項所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段檢測B7-H3的步驟。
  19. 一種用於檢測或測定人B7-H3的試劑，該試劑包含申請專利範圍第1至10項中任一項所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段。
  20. 一種與人B7-H3陽性細胞相關的疾病的診斷劑，該診斷劑包含申請專利範圍第1至10項中任一項所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段。
  21. 一種用於診斷與人B7-H3陽性細胞相關的疾病的方法，該方法包括使用申請專利範圍第1至10項中任一項所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段檢測或測定B7-H3或B7-H3陽性細胞的步驟。
  22. 一種與B7-H3陽性細胞相關的疾病的治療劑，該治療劑包含申請專利範圍第1至10項中任一項所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段，或包含申請專利範圍第11項所述的醫藥組成物，或包含申請專利範圍第12項所述的核酸分子。
  23. 一種與B7-H3陽性細胞相關的疾病的治療方法，該方法包括使用申請專利範圍第1至10項中任一項所述的B7-H3抗體或其抗原結合片段，或包含申請專利範圍第11項所述的醫藥組成物，或申請專利範圍第12項所述的核酸分子，誘導B7-H3陽性細胞的死亡。
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UA (1) UA125593C2 (zh)
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7158403B2 (ja) 2017-03-31 2022-10-21 ジエンス ヘンルイ メデイシンカンパニー リミテッド Ｂ７－ｈ３抗体、その抗原結合フラグメント、及びそれらの医学的使用
CN109963591B (zh) * 2017-08-04 2023-04-04 江苏恒瑞医药股份有限公司 B7h3抗体-药物偶联物及其医药用途
US11403813B2 (en) 2019-11-26 2022-08-02 Sdc U.S. Smilepay Spv Systems and methods for constructing a three-dimensional model from two-dimensional images
US10916053B1 (en) 2019-11-26 2021-02-09 Sdc U.S. Smilepay Spv Systems and methods for constructing a three-dimensional model from two-dimensional images
US11270523B2 (en) 2017-11-29 2022-03-08 Sdc U.S. Smilepay Spv Systems and methods for constructing a three-dimensional model from two-dimensional images
WO2020018964A1 (en) 2018-07-20 2020-01-23 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for controlled expression of antigen-specific receptors
WO2020114479A1 (zh) * 2018-12-07 2020-06-11 江苏恒瑞医药股份有限公司 多特异性蛋白分子
US11030801B2 (en) 2019-05-17 2021-06-08 Standard Cyborg, Inc. Three-dimensional modeling toolkit
KR20210006637A (ko) * 2019-07-09 2021-01-19 주식회사 와이바이오로직스 B7-h3(cd276)에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
US20220332829A1 (en) * 2019-09-16 2022-10-20 Nanjing Sanhome Pharmaceutical Co., Ltd. Anti-b7-h3 antibody and application thereof
BR112022026401A2 (pt) * 2020-06-26 2023-03-14 Intocell Inc Conjugados anticorpo-fármaco compreendendo anticorpos anti-b7-h3
KR20230145038A (ko) * 2021-02-09 2023-10-17 메디링크 테라퓨틱스 (쑤저우) 컴퍼니, 리미티드 생물활성 물질 접합체, 이의 제조방법 및 이의 용도
WO2022203414A1 (ko) * 2021-03-26 2022-09-29 세라노틱스(주) B7-h3 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 이의 용도
CN116178553B (zh) * 2022-02-25 2023-11-17 南京蓬勃生物科技有限公司 针对人b7-h3的抗体及其变体
TW202402808A (zh) * 2022-05-18 2024-01-16 中國大陸商上海藥明生物技術有限公司 抗-b7h3抗體及其用途
WO2023221975A1 (zh) * 2022-05-18 2023-11-23 苏州宜联生物医药有限公司 包含蛋白降解剂类生物活性化合物的抗体药物偶联物及其制备方法和用途

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US20050002935A1 (en) * 2003-04-17 2005-01-06 Vincent Ling Use of B7-H3 as an immunoregulatory agent
CN101104639A (zh) * 2006-07-10 2008-01-16 苏州大学 抗人b7-h3单克隆抗体的制备及其应用
JP5601836B2 (ja) 2006-11-08 2014-10-08 マクロジェニックス ウエスト， インコーポレイテッド Ｔｅｓ７およびｔｅｓ７に結合する抗体
US20100203035A1 (en) 2007-02-14 2010-08-12 Kwon Eugene D B7-h3 in cancer
AU2010215838A1 (en) 2009-02-20 2010-08-26 John Wayne Cancer Institute B7-H3 antibody coupled bead assay for detection of circulating tumor cells
US8802091B2 (en) * 2010-03-04 2014-08-12 Macrogenics, Inc. Antibodies reactive with B7-H3 and uses thereof
ME03447B (me) * 2010-03-04 2020-01-20 Macrogenics Inc Anтitela reakтivna sa b7-нз, njihovi imunološki akтivni fragmenтi i upotreba
RS57279B1 (sr) * 2011-04-25 2018-08-31 Daiichi Sankyo Co Ltd Anti-b7-h3 antitelo
US9790282B2 (en) * 2013-03-25 2017-10-17 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Anti-CD276 polypeptides, proteins, and chimeric antigen receptors
CA2947660C (en) * 2014-05-29 2021-06-29 Spring Bioscience Corporation Anti-b7-h3 antibodies and diagnostic uses thereof
AU2015306621B2 (en) 2014-08-27 2021-05-06 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Antibodies, compositions, and uses
ES2875057T3 (es) 2014-09-17 2021-11-08 Us Health Anticuerpos anti-CD276 (B7H3)
JP7158403B2 (ja) 2017-03-31 2022-10-21 ジエンス ヘンルイ メデイシンカンパニー リミテッド Ｂ７－ｈ３抗体、その抗原結合フラグメント、及びそれらの医学的使用

Also Published As

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