CN110914304B - Cd96抗体、其抗原结合片段及医药用途 - Google Patents

Cd96抗体、其抗原结合片段及医药用途 Download PDF

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Abstract

本公开提供CD96抗体、其抗原结合片段及医药用途。进一步地，本公开提供包含所述CD96抗体CDR区的鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，以及包含CD96抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为药物的用途。特别地，本公开提供一种人源化的CD96抗体在制备用于治疗CD96相关的疾病或病症的药物中的用途。

Description

CD96抗体、其抗原结合片段及医药用途
本申请要求申请日为2017年11月10日的中国专利申请CN201711107331.5的优先权。本申请引用上述中国专利申请的全文。
技术领域
本公开涉及CD96抗体以及其抗原结合片段，进一步地，本公开还涉及包含所述CD96抗体CDR区的嵌合抗体、人源化抗体，本公开还涉及包含所述CD96抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为CD96相关疾病诊断剂和治疗药物的用途。
背景技术
这里的陈述仅提供与本发明有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。
1992年，Wang及其同事发现并且克隆了一种新的细胞膜型分子，当时将其命名为Tactile(T cell activation increased late expression)。随后，在人类白细胞分化抗原协作组会议上将该分子命名为CD96。CD96分子表达于正常T细胞、T细胞克隆以及某些转化的T细胞上。外周血T细胞表达低水平的CD96分子，活化后其表达明显上调，并在刺激后第6～9天表达达到高峰值。在同种异体抗原刺激的条件下，NK细胞上CD96的表达也发生上调。CD96属于免疫球蛋白超家族，胞膜外区包含3个免疫球蛋白样结构域，共有15个N-连接糖基化位点，还有1个高度O-连接糖基化富含丝/苏/脯氨酸残基的茎状结构域，跨膜区有24个氨基酸残基，胞质区含44个氨基酸残基，并有一个富含碱性/脯氨酸的区域。自克隆CD96分子后的十多年间，由于不清楚其配体，该分子的研究无明显进展。CD96在造血和非造血细胞系中表达十分广泛。CD96也表达于正常人CD4+T细胞、CD8+T细胞、单核细胞和NK细胞。在PHA刺激后，CD4+T细胞、CD8+T细胞和NK细胞上CD96表达明显上调，证实CD96是一种活化表达增加的分子。但PHA对单核细胞CD96的表达上调作用不十分明显，提示不同细胞上CD96分子的表达调节具有不同特点。直到2004年，Fuchs及其同事发现NK细胞可通过CD96识别PVR(CD155)，促进NK细胞对表达CD155靶细胞的黏附，促进NK细胞的细胞杀伤活性并可介导靶细胞表面上CD155的内化。由于PVR(CD155)高表达于某些肿瘤细胞，这一受体系统可能在NK细胞对肿瘤的识别和杀伤中起重要作用。然而，迄今为止对CD96表达和功能的认识还十分有限。相信随着对该分子功能的不断认识，CD96必将会引起人们更多的关注。
CD96分子胞质区带有一个免疫受体酪氨酸抑制模体(ITIM)，其在种属间具有很高的保守性。一般认为ITIM参与抑制信号传递，近来研究发现某些分子可通过ITIM传递活化信号，包含ITIM模体的受体在活化信号传递中，SHP-2的募集起着关键性的作用，因此CD96可能会介导抑制NK细胞活性的作用。此外，CD96与CD226序列上有一定的同源性，根据目前的研究认为两者分别通过与CD155的结合来抑制或激活NK细胞，以达到调节NK细胞功能的作用。
截止目前，仅有如CN105636983，CN105636985等报道CD96抗体分子可在动物体内减缓免疫抑制，或EP2097535报道用CD96抗体分子清除CD96+的AMLSC细胞，尚未发现有具体的CD96抗体分子报道，也没有CD96抗体分子进入临床研究。因此，有必要开发具有高亲和力，针对特定表位的CD96抗体，以研究CD96及CD96抗体药物的作用。
发明内容
本公开提供与CD96的氨基酸序列或三维结构特异性结合的单克隆抗体或抗原结合片段(也可称CD96结合分子)。
一方面，本公开提供一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合人CD96，所述单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(i)重链可变区包含选自在分别如SEQ ID NO：16、17和18所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区基础上分别具有3，2，1或0个氨基酸突变的HCDR变体，轻链可变区包含选自在分别如SEQ ID NO：19、20和21所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区基础上分别具有3，2，1或0个氨基酸突变的LCDR变体；或
(ii)重链可变区包含选自在分别如SEQ ID NO：22、23和24所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区基础上分别具有3，2，1或0个氨基酸突变的HCDR变体，轻链可变区包含选自在分别如SEQ ID NO：25、26和27所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区基础上分别具有3，2，1或0个氨基酸突变的LCDR变体；或
(iii)重链可变区包含选自在分别如SEQ ID NO：28、29和30所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区基础上分别具有3，2，1或0个氨基酸突变的HCDR变体，轻链可变区包含选自在分别如SEQ ID NO：31、32和33所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区分别具有3，2，1或0个氨基酸突变的LCDR变体；或
(iv)重链可变区包含选自在分别如SEQ ID NO：34、35和36所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区分别具有3，2，1或0个氨基酸突变的HCDR变体，轻链可变区包含选自在分别如SEQID NO：37、38和39所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区分别具有3，2，1或0个氨基酸突变的LCDR变体；或
(v)重链可变区包含选自在分别如SEQ ID NO：40、41和42所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区分别具有3，2，1或0个氨基酸突变的HCDR变体，轻链可变区包含选自在分别如SEQID NO：43、44和45所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区分别具有3，2，1或0个氨基酸突变的LCDR变体。所述氨基酸突变优选氨基酸替代，更优选氨基酸的保守替代。
在一些实施方式中，所述单克隆抗体或抗原结合片段的CDR(包括3个重链CDR和3个轻链CDR)具有3，2或1个氨基酸突变的CDR变体是经亲和力成熟方法筛选获得的具有3，2或1个氨基酸突变的CDR变体。
在一些实施方式中，所述单克隆抗体或抗原结合片段与CD96的亲和力(KD)小于10-7M、小于10-8M、小于10-9M、小于10-10M或小于10-11M。
在一些实施方式中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合人CD96，所述单克隆抗体包含重链可变区和轻链可变区，其中：
(vi)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：16、17和18氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：52、20和21氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区，其中所述LCDR1优选如SEQ ID NO：19、108、109或110任一所示LCDR1；或
(vii)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：22、23和64氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：25、26和27氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区，其中所述HCDR3优选如SEQ ID NO：24、111、112、113、114、115和116任一所示HCDR3；或
(viii)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：28、29和30氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：31、32和33氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区；或
(ix)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：34、35和36氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：37、38和39氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区；或
(x)重链可变区包含分别如SEQ ID NO：40、119和42氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：43、44和45氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区，其中所述的HCDR2优选如SEQ ID NO：41、120和121所示。
在一些实施方式中，所述单克隆抗体或抗原结合片段是重组抗体，优选选自鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体。
在一些实施方式中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含选自如下轻链可变区、重链可变区或轻链可变区和重链可变区：
a.序列为SEQ ID NO：6、46、49、50和51任一所示的重链可变区或其变体和/或序列为SEQ ID NO：7、47、48、53、54、55、56、57和58任一所示的轻链可变区或其变体；或
b.序列为SEQ ID NO：8、59、62、63、65、66、67、68、69和70任一所示的重链可变区或其变体和/或序列为SEQ ID NO：9、60和61任一所示的轻链可变区或其变体；或
c.序列为SEQ ID NO：10所示的重链可变区或其变体和/或序列为SEQ ID NO：11所示的轻链可变区或其变体；
d.序列为SEQ ID NO：12、71、75、76和77任一所示的重链可变区或其变体和/或序列为SEQ ID NO：13、72、73和74任一所示的轻链可变区或其变体；或
e.序列为SEQ ID NO：14、78、82、83、84、122和123任一所示的重链可变区或其变体和/或序列为SEQ ID NO：15、79、80和81任一所示的轻链可变区或其变体；
其中a至e中所述变体是在所述轻链可变区或重链可变区的框架区序列上具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸突变。
在一些实施方式中，其中所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含选自如下重链链可变区：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：6、46、49、50和51任一所示的重链可变区或其变体；
(b)氨基酸序列如SEQ ID NO：8、59、62、63、65、66、67、68、69和70任一所示的重链可变区或其变体；
(c)氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示的重链可变区或其变体；
(d)氨基酸序列如SEQ ID NO：12、71、75、76和77任一所示的重链可变区或其变体；
(e)氨基酸序列如SEQ ID NO：14、78、82、83、84、122和123任一所示的重链可变区或其变体；
其中，a至e中所述变体是在所述轻链可变区或重链可变区的框架区序列上具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸突变。
在一些实施方式中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段包含选自如下轻链链可变区：
(a)氨基酸序列如SEQ ID NO：7、47、48、53、54、55、56、57和58任一所示的轻链可变区或其变体；
(b)氨基酸序列如SEQ ID NO：9、60和61任一所示的轻链可变区或其变体；
(c)氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示的轻链可变区或其变体；
(d)氨基酸序列如SEQ ID NO：13、72、73和74任一所示的轻链可变区或其变体；
(e)氨基酸序列如SEQ ID NO：15、79、80和81任一所示的轻链可变区或其变体；
其中，a至e中所述变体是在所述轻链可变区或重链可变区的框架区序列上具有1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个氨基酸突变，所述氨基酸突变优选框架区氨基酸的回复突变。
在一些实施方式中，其中所述抗体或抗原结合片段包含：
f.选自序列为SEQ ID NO：6、46、49、50和51任一所示的重链可变区和序列为SEQID NO：7、47、48、53、54、55、56、57和58任一所示的轻链可变区；或
g.选自序列为SEQ ID NO：8、59、62、63、65、66、67、68、69和70任一所示的重链可变区和序列为SEQ ID NO：9、60和61任一所示的轻链可变区；或
h.序列为SEQ ID NO：10所示的重链可变区和序列为SEQ ID NO：11所示的轻链可变区；
i.选自序列为SEQ ID NO：12、71、75、76和77任一所示的重链可变区和序列为SEQID NO：13、72、73和74任一所示的轻链可变区；或
j.选自序列为SEQ ID NO：14、78、82、83、84、122和123任一所示的重链可变区和序列为SEQ ID NO：15、79、80和81任一所示的轻链可变区。
在一些实施方式中，所述抗体为全长抗体，进一步包括人抗体恒定区，优选包含SEQ ID NO：117所示的人抗体重链恒定区和/或SEQ ID NO：118所示的人轻链恒定区。
在一些实施方式中，所述抗原结合片段是选自Fab、Fab′、F(ab′)2、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)和包含CDR的肽的抗原结合片段。
在一些实施方式中，所述抗体或抗原结合片段以如通过表面等离子共振(BIACORE)技术所测定的1×10-7M至1×10-12M的KD值的亲和力结合人CD96。
另一方面，本公开还提供一种分离的单克隆抗体或其抗原结合片段，其与前述(i)-(x)或a-j的单克隆抗体或其抗原结合片段竞争结合人CD96。
在一些实施方式中，所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，具有以下特征中的至少一种：
i.以如通过表面等离子共振(BIACORE)技术所测定的1×10-7M至1×10-12M的KD值的亲和力结合人CD96；
ii.与食蟹猴或恒河猴CD96交叉反应；
iii.阻断人CD96与人CD155的结合；
iv.增加NK细胞和/或T细胞的活化；
v.阻断由CD96与CD155结合所诱导的NK细胞活化抑制。
在一些实施方式中，所述单克隆抗体或其抗原结合片段结合人CD96胞外区(SEQID NO：3)中如IAVYHPQYGFYCAYGRPCES所示的区域。
在另一方面，本公开还提供一种多特异性抗体，其含有如上所述的抗CD96抗体或其抗原结合片段的轻链可变区和/或重链可变区。
在另一方面，本公开还提供一种单链抗体，其含有如上所述的抗CD96抗体或其抗原结合片段的轻链可变区和/或重链可变区。
在另一方面，本公开还提供一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据如上所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、所述的多特异性抗体或所述的单链抗体以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、缓冲剂或赋形剂，优选地，所述药物组合物单位计量中可含有0.01至99重量％的抗CD96抗体或其抗原结合片段或药物组合物单位剂量中含单克隆抗体或其抗原结合片段的量为0.1-2000mg，更优选为1-1000mg。
在另一方面，本公开还提供一种分离的核酸分子，其编码前述任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体或单链抗体。
在另一方面，本公开还提供一种重组载体，其包含上述的分离的核酸分子。
在另一方面，本公开还提供一种用上述的重组载体转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞，优选为真核细胞，更优选哺乳动物细胞。
在另一方面，本公开还提供用于生产前述任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括将前述的宿主细胞在培养基中进行培养以形成并积累前述任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体或单链抗体，以及从培养物回收所述单克隆抗体或其抗原结合片段。
在另一方面，本公开还提供用于体外检测或测定人CD96的方法，所述方法包括使用前述任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体或单链抗体。
在另一方面，本公开还提供前述任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体或单链抗体在制备用于检测或测定人CD96的试剂中的用途。
在另一方面，本公开还提供一种减少或缓解免疫抑制的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的前述任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体或单链抗体，或包含前述的药物组合物，或前述的分离的核酸分子。
在另一方面，本公开还提供一种增强NK细胞活性的方法，所述方法包括使用前述任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体或单链抗体，或包含前述的药物组合物，或前述的分离的核酸分子降低CD96活性的步骤。
在另一方面，本公开还提供一种利用前述任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体或单链抗体，或包含前述的药物组合物，或前述的分离的核酸分子制备增强NK细胞活性的药物的用途。
在另一方面，本公开还提供一种治疗与人CD96相关的疾病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的前述任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体或单链抗体，或包含前述的药物组合物，或前述的分离的核酸分子，以治疗人CD96相关的疾病，所述疾病优选肿瘤、癌症或感染性疾病。
在另一方面，本公开还提供如前述任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段、多特异性抗体或单链抗体，或包含前述的药物组合物，或前述的分离的核酸分子或其组合在制备治疗或预防疾病或病症的药物中的用途，其中所述疾病或病症是人CD96相关疾病，所述疾病或病症优选肿瘤、癌症或感染性疾病。
在另一方面，本公开还提供作为药物的如前述任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段、前述的多特异性抗体或前述的单链抗体，或如前所述的药物组合物，或如前所述的分离的核酸分子。
在另一方面，本公开还提供作为药物的如前述任一项的单克隆抗体或其抗原结合片段、前述的多特异性抗体或前述的单链抗体，或如前所述的药物组合物，或如前所述的分离的核酸分子，其中所述的药物用于人CD96相关的疾病的治疗，所述疾病优选肿瘤、癌症或感染性疾病。
适当地，癌症可以是任何对至少部分封闭CD96介导的免疫抑制、抑制或外周耐受应答的癌症。癌症癌症的例子包括但不限于癌瘤，淋巴瘤，胚细胞瘤(blastoma)，肉瘤，和白血病或淋巴样恶性。这种癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)、神经胶质瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞样白血病(CML)、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、髓样细胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓异常增生综合征(MDS)、胃肠(道)癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、黑素瘤、软骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子宫颈癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、肝细胞癌(HCC)、透明细胞肾细胞癌(RCC)、头和颈癌、肝胆癌(hepatobiliarycancer)、中枢神经系统癌、食管癌、恶性胸膜间皮瘤、全身性轻链淀粉样变性、淋巴浆细胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、骨髓异常增生综合征、骨髓增生性肿瘤、神经内分泌肿瘤、梅克尔细胞癌、睾丸癌和皮肤癌。在一些实施方案中，癌症是转移性癌症，其有能力迁移到机体内的另一位点、组织或器官，并且在该位点形成肿瘤。
典型地，对至少部分封闭CD96介导的免疫抑制、压制或外周耐受是应答的疾病或病症是提高或恢复免疫监视能够使患有疾病或病症的受试者受益的任何疾病或病症。该疾病和病症可能包括那些能够被细胞介导的免疫所控制或压制的持久性疾病或病症。非限制性的实施例包括肿瘤、癌症或感染性疾病。具体地，本公开所涉及癌症的例子包括但不限于癌瘤，淋巴瘤，胚细胞瘤(blastoma)，肉瘤，和白血病或淋巴样恶性。这种癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌、骨髓瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、头和颈鳞状细胞癌(HNSCC)、神经胶质瘤、何杰金淋巴瘤、非何杰金淋巴瘤、弥漫性大B-细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓细胞样白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性髓细胞样白血病(CML)、原发性纵隔大B-细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤(MCL)、小淋巴细胞性淋巴瘤(SLL)、富含T-细胞/组织细胞的大B-细胞淋巴瘤、多发性骨髓瘤、髓样细胞白血病-1蛋白(Mcl-1)、骨髓异常增生综合征(MDS)、胃肠(道)癌、肾癌、卵巢癌、肝癌、成淋巴细胞性白血病、淋巴细胞白血病、结肠直肠癌、子宫内膜癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌、黑素瘤、软骨肉瘤、神经母细胞瘤、胰腺癌、多形性成胶质细胞瘤、胃癌、骨癌、尤因氏肉瘤、子宫颈癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、肝细胞癌(HCC)、透明细胞肾细胞癌(RCC)、头和颈癌、肝胆癌(hepatobiliary cancer)、中枢神经系统癌、食管癌、恶性胸膜间皮瘤、全身性轻链淀粉样变性、淋巴浆细胞性淋巴瘤(lymphoplasmacyticlymphoma)、骨髓异常增生综合征、骨髓增生性肿瘤、神经内分泌肿瘤、梅克尔细胞癌、睾丸癌和皮肤癌。在一些实施方案中，癌症是转移性癌症，其有能力迁移到机体内的另一位点、组织或器官，并且在该位点形成肿瘤。
所涉及的感染性疾病指包括由病毒或病原菌感染引起的并且可通过呼吸器官、血液接触或皮肤接触感染的所有疾病。这些感染性疾病的非限制性的实例包括但不限于乙型肝炎、丙型肝炎、人乳头状瘤病毒(HPV)感染、巨细胞病毒感染、病毒性呼吸道疾病、流感、EB病毒(EBV)感染、单纯疱疹病毒(HSV包括HSV1和HSV2)感染、水痘带状疱疹病毒(VSV)感染以及巨细胞病毒(CMV)感染等。
本公开CD96单克隆抗体或抗原结合片段具有很高的特异性、与CD96的高亲和力，人源化抗体的免疫原性大大降低，同时完全保留了鼠源抗体的特异性，高亲和力和活性。
附图说明
图1：CD96人源化抗体阻断hCD96-CHOs细胞结合实验。
图2：CD96人源化抗体阻断hCD96抗原和hCD155-CHOs细胞结合实验。
图3：抗体竞争实验。图3A包被抗体(A抗体)是h1718-012；图3B包被抗体是h1719-014；图3C包被抗体是h1721-003；图3D包被抗体是ch1720；图3E包被抗体是h1722-010。
图4：CD96嵌合抗体/肽段复合物的CD96-CHOs细胞结合实验(FACS检测)，图4A为ch1718与3#肽段检测结果，图4B为ch1719与3#肽段检测结果，图4C为ch1720与不同肽段检测结果，图4D为ch1721与不同肽段检测结果。
图5：ch1718、ch1719、ch1720促进NK细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，E∶T＝1∶1。
发明详述
术语
为了更容易理解本公开，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本公开所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
本公开所述的“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。
在本公开中，本公开所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。
在本公开中，本公开所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区和4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本公开所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3，HCDR1-3)。
本公开的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，优选人源化抗体。
术语“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能制备的对人CD96的单克隆抗体。制备时用CD96抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本公开一个优选的实施方案中，所述的鼠源CD96抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其变体的重链恒定区。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入表达载体中，最后在真核系统或原核系统中表达嵌合抗体分子。在本公开一个具体的实施方案中，所述的CD96嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。所述的CD96嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区，或者包含氨基酸突变(如YTE突变或回复突变)的IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区变体。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase)中获得，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本公开的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体。在本公开一个优选的实施方案中，所述的CD96人源化抗体中鼠的CDR序列选自SEQ ID NO：16-21、22-27、28-33、34-39或40-45；人的抗体可变区框架经过设计选择，其中所述抗体重链可变区上的重链FR区序列，来源于人种系重链序列，和人种系轻链序列。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区可进行最少反向突变(回复突变，即将人抗体来源的FR区氨基酸残基突变成原始来源抗体对应位置的氨基酸残基)，以保持活性。
CDR的移植可由于与抗原接触的构架残基的变化而导致产生的CD96抗体或其抗原结合片段对抗原的亲和力减弱。此类相互作用可以是体细胞高度突变的结果。因此，可能仍然需要将此类供体构架氨基酸移植至人源化抗体的构架。来自非人CD96抗体或其抗原结合片段的参与抗原结合的氨基酸残基可通过检查鼠单克隆抗体可变区序列和结构来鉴定。CDR供体构架中与种系不同的的各残基可被认为是相关的。如果不能确定最接近的种系，那么可将序列与亚型共有序列或具有高相似性百分数的鼠序列的共有序列相比较。稀有构架残基被认为可能是体细胞高度突变的结果，从而在结合中起着重要作用。
在类似“分别具有3、2、1或0个氨基酸突变的，如SEQ ID NO：X、SEQ ID NO：Y和SEQID NO：Z所示的CDR1、CDR2和CDR3的CDR变体”的描述中，示例性的解释是对CDR的突变可以包含3个、2个、1个或0个氨基酸的突变，CDR1、CDR2和CDR3之间可以任选地选择相同或不同数目的氨基酸残基进行突变，例如在如SEQ ID NO：X、SEQ ID NO：Y和SEQ ID NO：Z所示的CDR1、CDR2和CDR3的基础上，对CDR1进行1个氨基酸的突变，对CDR2和CDR3进行0个氨基酸突变。当对某个CDR进行0个氨基酸突变时，则该具有0个氨基酸突变的CDR变体仍是该CDR本身。
术语抗体的“抗原结合片段”或“功能片段”是指抗体的保持特异性结合抗原(例如，CD96)的能力的一个或多个片段。已显示可利用全长抗体的片段来实现抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)2片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段；(v)单结构域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)可任选地通过合成的接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成的接头连接它们，从而使得其能够产生为其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此类单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功用性筛选片段。可通过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。
本公开的抗原结合片段包括Fab、F(ab′)2、Fab′、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)、包含CDR的肽等。
Fab是通过用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H链的224位的氨基酸残基)处理IgG抗体分子所获得的片段中的具有约50,000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段，其中H链N端侧的约一半和整个L链通过二硫键结合在一起。
本公开的Fab可以通过用木瓜蛋白酶处理本公开的特异性识别人CD96并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体来生产。此外，可以通过将编码所述抗体的Fab的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab来生产所述Fab。
F(ab′)2是通过用酶胃蛋白酶消化IgG铰链区中两个二硫键的下方部分而获得的分子量为约100,000并具有抗原结合活性并包含在铰链位置相连的两个Fab区的抗体片段。
本公开的F(ab′)2可以通过用胃蛋白酶处理本公开的特异性识别人CD96并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体来生产。此外，可以通过用硫醚键或二硫键连接下面描述的Fab′来生产所述F(ab′)2。
Fab′是通过切割上述F(ab′)2的铰链区的二硫键而获得的分子量为约50,000并具有抗原结合活性的抗体片段。本公开的Fab′可以通过用还原剂例如二硫苏糖醇处理本公开的特异性识别CD96并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的F(ab′)2来生产。
此外，可以通过将编码抗体的Fab′片段的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab′来生产所述Fab′。
术语“单链抗体”、“单链Fv”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域；VH)和抗体轻链可变结构域(或区域；VL)的分子。此类scFv分子可具有一般结构：NH2-VL-接头-VH-COOH或NH2-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成，例如使用1-4个重复的变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用于本公开的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immunol.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。
本公开的scFv可以通过以下步骤来生产：获得本公开的特异性识别人CD96并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码scFv的DNA，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达scFv。
双抗体是其中scFv被二聚体化的抗体片段，是具有二价抗原结合活性的抗体片段。在二价抗原结合活性中，两个抗原可以是相同或不同的。
本公开的双抗体可以通过以下步骤来生产：获得本公开的特异性识别人CD96并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码scFv的DNA以使肽接头的氨基酸序列长度为8个残基或更少，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达双抗体。
dsFv是通过将其中每个VH和VL中的一个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代的多肽经由半胱氨酸残基之间的二硫键相连而获得的。可以按照已知方法(ProteinEngineering，7，697(1994))基于抗体的三维结构预测来选择被半胱氨酸残基取代的氨基酸残基。
本公开的dsFv可以通过以下步骤来生产：获得本公开的特异性识别人CD96并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码dsFv的DNA，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达dsFv。
包含CDR的肽是通过包含VH或VL的CDR中的一个或多个区域而构成的。包含多个CDR的肽可以被直接相连或经由适合的肽接头相连。
本公开的包含CDR的肽可以通过以下步骤来生产：构建本公开的特异性识别人CD96并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的CDR的编码DNA，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达所述肽。也可以通过化学合成方法例如Fmoc方法或tBoc方法来生产所述包含CDR的肽。
本文中使用的术语“抗体框架”，是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。从本质上讲，其是不具有CDR的可变结构域。
术语“氨基酸突变”是指多肽与其变体之间，在多肽片段上某个或某些氨基酸位点之间的突变，其中变体可以由多肽上某个或某些位点经替代、插入或缺失氨基酸获得。
术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位(例如，CD96分子上的特定部位)。表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸。参见，例如，Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10-8M，例如大约小于10-9M、10- 10M、10-11M或更小的亲和力(KD)结合。
术语″KD″是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本公开的抗体以小于大约10-7M，例如小于大约10-8M、10-9M或10-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合CD96，例如，如使用表面等离子体共振(SPR)技术在BIACORE仪中测定的。
当术语“竞争”用于竞争相同表位的抗原结合蛋白(例如中和抗原结合蛋白或中和抗体或特异性结合的抗体)的情况中时，意指在抗原结合蛋白之间竞争，其通过以下测定法来测定：待检测的抗原结合蛋白(例如抗体或其免疫学功能片段)防止或抑制(例如降低)参考抗原结合蛋白(例如配体或参考抗体)与共同抗原(例如CD96抗原或其片段)的特异性结合。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一种竞争，这些测定例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)、固相直接或间接酶免疫测定(EIA)、夹心竞争测定(参见例如Stahli等，1983，Methodsin Enzymology 9：242-253)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Kirkland等，1986，J.Immunol.137：3614-3619)、固相直接标记测定、固相直接标记夹心测定(参见例如Harlow和Lane，1988，Antibodies，A Laboratory Manual(抗体，实验室手册)，Cold Spring Harbor Press)；用I-125标记物的固相直接标记RIA(参见例如Morel等，1988，Molec.Immunol.25：7-15)；固相直接生物素-亲和素EIA(参见例如Cheung，等，1990，Virology176：546-552)；和直接标记的RIA(Moldenhauer等，1990，Scand.J.Immunol.32：77-82)；或通过如本公开测试例7的方法进行测定。通常所述测定法涉及使用能与带有未标记的检测抗原结合蛋白及标记的参考抗原结合蛋白结合的纯化抗原(所述抗原在固态表面或细胞表面上)。在待测抗原结合蛋白存在下，测量结合于固态表面或细胞的标记的量，来测量竞争性抑制。或者如在本文测试例7中提供的关于用于测定竞争性结合的方法，通过固定抗原结合蛋白A，检测与抗原结合蛋白预先结合的标记过的抗原信号变化来测定竞争性抑制。通常，这种竞争性抑制测试会调换抗原结合蛋白A和抗原结合蛋白B的位置进行确认。由竞争性测定(竞争抗原结合蛋白)鉴定的抗原结合蛋白包括：与参考抗原结合蛋白相同的表位发生结合的抗原结合蛋白；以及，与充分接近参考抗原结合蛋白结合的表位所邻近的表位发生结合的抗原结合蛋白，所述两个表位在空间上互相妨碍结合的发生。通常当竞争的抗原结合蛋白过量存在时，部分竞争性抗原结合蛋白抑制(例如降低)至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％)参考抗原结合蛋白与共同抗原的特异性结合。在完全竞争情况下，参考抗原结合蛋白与抗原的结合被抑制至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少98％、至少99％或更多。抑制小于30％被认为是不竞争。在以测试例7提供的测试竞争性结合的方法中，无论竞争性抗原结合蛋白作为抗原结合蛋白A或作为抗原结合蛋白B能够抑制参考抗原结合蛋白上述程度的结合，都被认为是竞争或部分竞争。
“氨基酸保守修饰”或“氨基酸保守取代”或“氨基酸的保守替代”指蛋白质中的氨基酸被具有相似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其他氨基酸取代，从而使得在不改变蛋白质的生物活性或其他所需特性(例如抗原亲和力和/或特异性)的情况下，可以经常进行改变。本领域技术人员认识到，通常，多肽的非必需区域中的单个氨基酸取代基本上不改变生物活性(参见，例如，Watson等人，(1987)MolecularBiology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页(第4版))。此外，结构上或功能上相似的氨基酸的取代不太可能破环生物活性。示例性保守取代于下表“示例性氨基酸保守取代”中陈述。
示例性氨基酸保守取代
Figure GPA0000283798530000171
Figure GPA0000283798530000181
本文中使用的术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。
术语“载体”是指能够运输与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。在另一个实施方案中，载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。本文中公开的载体能够在已引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)或可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组一起复制(例如，非附加型哺乳动物载体)。
现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用人CD96或其片段免疫，所得到的抗体能被复性、纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http：//imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。
术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括微生物(例如细菌)、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)、HEK293和NS0细胞。
本公开工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端位点。通过表达与人CD96特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用pH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。
“缓解免疫抑制”表示以抑制或抑制一种或更多种通常表达CD96的细胞的免疫功能，至少部分消除、去除或克服CD96的正常活性或功能。典型地，一种或更多种通常表达CD96的细胞是T细胞，包括CD4+和CD8+T细胞、γδT细胞、NKT细胞、以及自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，缓解免疫抑制可能包括或涉及废除对外来病原体、显示外来病原体的宿主细胞(例如在自体MHC中显示外来病原体衍生的多肽)和/或宿主的癌细胞或组织的外周耐受。
术语“阻断”是指本公开的抗体或其抗原结合片段封闭、部分封闭、干扰、降低、抑制、减少靶蛋白或使其失活的能力，所述靶蛋白即CD96和/或其配体(如CD155)。因此，本领域的技术人员理解术语“阻断”可以涵盖所述配体或受体的全部和/或部分活性丧失。所述配体或受体的活性可以通过与配体/受体蛋白的活性位点结合的化合物，或通过其它方式，诸如使激活受抑制的第一蛋白的第二蛋白失活来阻抑或抑制。例如，CD96和CD155之间的相互作用的全部和/或部分抑制可以通过NK细胞活化增加来表示。
术语“肿瘤”指所有赘生性(neoplastic)细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。
术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。术语“癌症”，“癌性”，“细胞增殖性病症”，“增殖性病症”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。
“给予”、“施用”和“处理”当应用于动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”、“施用”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”、“施用”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，例如包含本公开的任一种抗体或其抗原结合片段的组合物或编码抗体或其抗原结合片段的核酸分子，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床有测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本公开的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
“有效量”包含足以改善或预防医学疾病的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：例如，待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
“外源性”指根据情况在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据情况在细胞、生物或人体内产生的物质。
“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源；如果两个序列中的100个位置有95个匹配或同源，那么两个序列为95％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。
本文使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美国专利号4,683,195中所述扩增的程序或技术。一般来说，需要获得来自目标区域末端或之外的序列信息，使得可以设计寡核苷酸引物；这些引物在序列方面与待扩增模板的对应链相同或相似。2个引物的5’末端核苷酸可以与待扩增材料的末端一致。PCR可用于扩增特定的RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列和由总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等。一般参见Mullis等(1987)Cold Spring HarborSymp.Ouant.Biol.51：263；Erlich编辑，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press，N.Y.)。本文使用的PCR被视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应法的一个实例，但不是唯一的实例，所述方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶，以扩增或产生核酸的特定部分。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
此外，本公开包括用于治疗与CD96相关的疾病的药剂，所述药剂包含本公开的单克隆抗体或其抗体片段作为活性成分。
对与CD96相关的疾病没有限制，只要它是与CD96相关的疾病即可，例如利用本公开的分子诱导的治疗反应可通过结合人类CD96然后阻断CD96与其配体CD155的结合，从而降低对NK细胞的抑制。因此，当处于适于治疗应用的制备物和制剂中时，本公开的分子对这样一些人是非常有用的，他们患有肿瘤、癌症或感染性疾病。
此外，本公开涉及用于免疫检测或测定CD96的方法、用于免疫检测或测定CD96的试剂、用于免疫检测或测定表达CD96的细胞的方法和用于诊断与CD96相关的疾病的诊断剂，其包含本公开的特异性识别人CD96并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体或抗体片段作为活性成分。
在本公开中，用于检测或测定CD96的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫检测或测定方法。
免疫检测或测定方法是使用标记的抗原或抗体检测或测定抗体量或抗原量的方法。免疫检测或测定方法的实例包括放射性物质标记的免疫抗体方法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法、蛋白质免疫印迹法、物理化学方法等。
上述与CD96相关的疾病可以通过用本公开的单克隆抗体或抗体片段检测或测定表达CD96的细胞来诊断。
为了检测表达多肽的细胞，可以使用已知的免疫检测方法，并优选使用免疫沉淀法、荧光细胞染色法、免疫组织染色法等。此外，可以使用利用FMAT8100HTS系统(AppliedBiosystem)的荧光抗体染色法等。
在本公开中，对用于检测或测定CD96的活体样品没有特别限制，只要它具有包含表达CD96的细胞的可能性即可，例如组织细胞、血液、血浆、血清、胰液、尿液、粪便、组织液或培养液。
根据所需的诊断方法，含有本公开的单克隆抗体或其抗体片段的诊断剂还可以含有用于执行抗原-抗体反应的试剂或用于检测反应的试剂。用于执行抗原-抗体反应的试剂包括缓冲剂、盐等。用于检测的试剂包括通常用于免疫检测或测定方法的试剂，例如识别所述单克隆抗体、其抗体片段或其结合物的标记的第二抗体和与所述标记对应的底物等。
具体实施方式
以下结合实施例进一步描述本公开，但这些实施例并非限制着本公开的范围。本公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1、CD96抗原蛋白设计及表达
以人CD96蛋白(Uniprot号：P40200-2)作为本公开CD96的模板，设计本公开涉及的抗原及检测用蛋白的氨基酸序列，可选的在CD96蛋白基础上融合不同的标签，分别克隆到pHr载体上(自产)或pXC-17.4载体上(LONZA)上，在293细胞瞬转表达或CHO细胞稳定表达纯化，获得编码本公开抗原及检测用蛋白。以下CD96抗原未特殊说明的均指人CD96。
带Flag标签的CD96胞外区(SEQ ID NO：1)：CD96-Flag，用于免疫小鼠
MEKKWKYCAVYYIIQIHFVKGVWEKTVNTEENVYATLGSDVNLTCQTQTVGFFVQMQWSKVTNKIDLIAVYHPQYGFYCAYGRPCESLVTFTETPENGSKWTLHLRNMSCSVSGRYECMLVLYPEGIQTKIYNLLIQTHVTADEWNSNHTIEIEINQTLEIPCFQNSSSKISSEFTYAWSVEDNGTQETLISQNHLISNSTLLKDRVKLGTDYRLHLSPVQIFDDGRKFSCHIRVGPNKILRSSTTVKVFAKPEIPVIVENNSTDVLVERRFTCLLKNVFPKANITWFIDGSFLHDEKEGIYITNEERKGKDGFLELKSVLTRVHSNKPAQSDNLTIWCMALSPVPGNKVWNISSEKITFLLGSEISSTDPPLSVTESTLDTQPSPASSVSPARYPATSSVTLVDVSALRPNTTPQPSNSSMTTRGFNYPWTSSGTDTKKSVSRIPSETYSSSPSGAGSTLHDNVFTSTARAFSEVPTTANGSTKTNHVHITGIVVNKPKDGMDYKDDDDK
注释：划横线部分为信号肽，斜体部分为Flag-tag标签。
CD96胞外区和mIgG2a Fc的融合蛋白(SEQ ID NO：2)：CD96-mFc，用于免疫
MEFGLSWLFLVAILKGVQCVWEKTVNTEENVYATLGSDVNLTCQTQTVGFFVQMQWSKVTNKIDLIAVYHPQYGFYCAYGRPCESLVTFTETPENGSKWTLHLRNMSCSVSGRYECMLVLYPEGIQTKIYNLLIQTHVTADEWNSNHTIEIEINQTLEIPCFQNSSSKISSEFTYAWSVEDNGTQETLISQNHLISNSTLLKDRVKLGTDYRLHLSPVQIFDDGRKFSCHIRVGPNKILRSSTTVKVFAKPEIPVIVENNSTDVLVERRFTCLLKNVFPKANITWFIDGSFLHDEKEGIYITNEERKGKDGFLELKSVLTRVHSNKPAQSDNLTIWCMALSPVPGNKVWNISSEKITFLLGSEISSTDPPLSVTESTLDTQPSPASSVSPARYPATSSVTLVDVSALRPNTTPQPSNSSMTTRGFNYPWTSSGTDTKKSVSRIPSETYSSSPSGAGSTLHDNVFTSTARAFSEVPTTANGSTKTNHVHITGIVVNKPKDGMEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK
注释：划横线部分为信号肽，斜体部分为mFc。
全长CD96(SEQ ID NO：3)：用于构建CD96过表达细胞株，用于免疫和检测
MEKKWKYCAVYYIIQIHFVKGVWEKTVNTEENVYATLGSDVNLTCQTQTVGFFVQMQWSKVTNKIDLIAVYHPQYGFYCAYGRPCESLVTFTETPENGSKWTLHLRNMSCSVSGRYECMLVLYPEGIQTKIYNLLIQTHVTADEWNSNHTIEIEINQTLEIPCFQNSSSKISSEFTYAWSVEDNGTQETLISQNHLISNSTLLKDRVKLGTDYRLHLSPVQIFDDGRKFSCHIRVGPNKILRSSTTVKVFAKPEIPVIVENNSTDVLVERRFTCLLKNVFPKANITWFIDGSFLHDEKEGIYITNEERKGKDGFLELKSVLTRVHSNKPAQSDNLTIWCMALSPVPGNKVWNISSEKITFLLGSEISSTDPPLSVTESTLDTQPSPASSVSPARYPATSSVTLVDVSALRPNTTPQPSNSSMTTRGFNYPWTSSGTDTKKSVSRIPSETYSSSPSGAGSTLHDNVFTSTARAFSEVPTTANGSTKTNHVHITGIVVNKPKDGMSWPVIVAALLFCCMILFGLGVRKWCQYQKEIMERPPPFKPPPPPIKYTCIQEPNESDLPYHEMETL
注释：下划横线部分为信号肽，正体部分为胞外区，斜体部分为跨膜区和胞内区
带His标签的CD96胞外区(SEQ ID NO：4)：CD96-His，用于检测
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注释：划横线部分为信号肽，斜体部分为His tag。
CD96胞外区和hIgG1Fc的融合蛋白(SEQ ID NO：5)：CD96-Fc，用于检测
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注释：划横线部分为信号肽，斜体部分为Fc。
实施例2、CD96相关重组蛋白的纯化，以及杂交瘤抗体、重组抗体的纯化
1.带Flag标签的CD96-Flag重组蛋白的纯化步骤：
将样品高速离心去除杂质，并浓缩至适当体积。使用0.5×PBS平衡flag亲和柱，冲洗2-5倍柱体积。将除杂后的细胞表达上清样品上柱。用0.5×PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用含有0.3M NaCl的PBS冲洗柱子，冲洗杂蛋白，并收集。用0.1M乙酸(pH3-4)或者Flag肽溶液洗脱目的蛋白，并收集目的产物洗脱峰，调节pH至中性。
收集的洗脱产物浓缩后可示例性地使用凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，流动相为PBS，去除聚体及杂蛋白峰，收集目的产物洗脱峰。所得到的蛋白经电泳，肽图，LC-MS鉴定为正确后分装备用。
2.带His标签的CD96-His重组蛋白的纯化步骤：
将细胞表达上清样品高速离心去除杂质，并将缓冲液置换为PBS，加入咪唑至终浓度为5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡镍柱，冲洗2-5倍柱体积。将置换后的上清样品上柱结合，介质可以选择不同公司的镍柱。用含有5mM咪唑的PBS溶液冲洗柱子，至A280读数降至基线。后用PBS+10mM咪唑冲洗层析柱，除去非特异结合的杂蛋白，并收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脱目的蛋白，并收集洗脱峰。
收集的洗脱产物浓缩后可可示例性地用凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，流动相为PBS，去除聚体及杂蛋白峰，收集目的产物洗脱峰。所得到的蛋白经电泳，肽图，LC-MS鉴定为正确后分装备用。
3.杂交瘤上清分离纯化/ProteinG亲和层析：重组抗体，Fc融合蛋白的纯化
对于小鼠杂交瘤上清纯化首选ProteinG进行亲和层析，将培养所得杂交瘤离心取上清，根据上清体积加入10-15％体积的1M Tris-HCl(pH8.0-8.5)调节上清pH。ProteinG柱利用6M盐酸胍洗3-5倍柱体积，然后利用纯水清洗3-5倍柱体积；利用如1×PBS(pH7.4)缓冲体系作为平衡缓冲液对层析柱平衡3-5倍柱体积；细胞上清利用低流速上样结合，控制流速使保留时间约1min或更长时间；利用1×PBS(pH7.4)洗涤层析柱3-5倍柱体积至紫外吸收回落至基线；利用0.1M醋酸/醋酸钠(pH3.0)缓冲液进行样品洗脱，根据紫外检测收集洗脱峰，洗脱产物利用1M Tris-HCl(pH8.0)快速调节pH至5-6暂存。对于洗脱产物可以利用本领域技术人员熟知的方法进行溶液置换，如利用超滤管进行超滤浓缩及溶液置换至所需的缓冲体系，或者利用分子排阻如G-25脱盐替换成所需的缓冲体系，或者利用如Superdex 200等高分辨率分子排阻柱去除洗脱产物中的聚体成分以提高样品纯度。
4.Protein A亲和层析提取带Fc标签的融合蛋白或者抗体
首先将表达Fc融合蛋白或者抗体的细胞培养上清进行高速离心收取上清。ProteinA亲和柱利用6M盐酸胍洗3-5倍柱体积，然后利用纯水清洗3-5倍柱体积。利用如1×PBS(pH7.4)缓冲体系作为平衡缓冲液对层析柱平衡3-5倍柱体积。细胞上清利用低流速上样结合，控制流速使保留时间约1min或更长时间，结合完毕后利用1×PBS(pH7.4)洗涤层析柱3-5倍柱体积至紫外吸收回落至基线。利用0.1M醋酸/醋酸钠(pH3.0-3.5)缓冲液进行样品洗脱，根据紫外检测收集洗脱峰，洗脱产物利用1M Tris-HCl(pH8.0)快速调节pH至5-6暂存。对于洗脱产物可以利用本领域技术人员熟知的方法进行溶液置换，如利用超滤管进行超滤浓缩及溶液置换至所需的缓冲体系，或者利用分子排阻如G-25脱盐替换成所需的缓冲体系，或者利用如Superdex 200等高分辨率分子排阻柱去除洗脱产物中的聚体成分以提高样品纯度。
实施例3、抗人CD96杂交瘤单克隆抗体的制备
1.免疫
抗人CD96单克隆抗体通过免疫小鼠产生。实验用SJL白小鼠，雌性，6-8周龄(北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001)。饲养环境：SPF级。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，12/12小时光/暗周期调节，温度20-25℃；湿度40-60％。将已适应环境的小鼠按以下方案免疫。免疫抗原为带Flag标签或mFc的人CD96胞外区(SEQ ID NO：1或2)，以及过表达人CD96的CHO细胞株。
免疫方案A：用
Figure GPA0000283798530000261
Gold Adjuvant(Sigma Cat No.T2684)与Thermo
Figure GPA0000283798530000262
Alum(Thermo Cat No.77161)佐剂交叉免疫。抗原与佐剂(
Figure GPA0000283798530000263
Gold Adjuvant)比例为1∶1，抗原与佐剂(Thermo
Figure GPA0000283798530000271
Alum)比例为3∶1，50μg/只/次(首免)，25μg/只/次(加强免疫)。抗原乳化后进行接种，时间为第0、14、28、42、56天。第0天腹膜内(IP)注射50μg/只的乳化后抗原。第14天皮下(sc)多点(一般背部6-8点)注射25μg/只。第28，42天根据背部结块和腹部肿胀情况，选择背部或腹膜内注射抗原。于第21，35，49，63天取血，用ELISA方法确定小鼠血清中的抗体滴度。在4-5免以后，选择血清中抗体滴度高并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合。在进行脾细胞融合前3天加强免疫，腹膜内(IP)注射50μg/只的生理盐水配制的抗原溶液。
免疫方案B：用Quick Antibody-Mouse 5W(KX0210041)佐剂对小鼠进行免疫。抗原与佐剂比例为1∶1，25μg/只/次(首免/加强免疫)。抗原与佐剂迅速充分混匀后接种，时间为第0、21、35天。第0天小鼠后小腿肌肉(IM)注射25μg/只的抗原。第21，35天按同样方式注射25μg/只(根据滴度决定第3免是否进行)。于第28，42天取血，用ELISA方法确定小鼠血清中的抗体滴度。选择血清中抗体滴度高并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合。在进行脾细胞融合前3天加强免疫，腹膜内(IP)注射50μg/只的生理盐水配制的抗原溶液。
2.脾细胞融合
采用优化的PEG介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(
Figure GPA0000283798530000272
CRL-8287TM)进行融合得到杂交瘤细胞。融合好的杂交瘤细胞以0.5-1×10^6/ml的密度用完全培养基(含20％FBS、1×HAT、1×OPI的DMEM培养基)重悬，100μl/孔种于96孔板中，37℃，5％CO2孵育3-4天后，补充HAT完全培养基100μl/孔，继续培养3-4天至形成针尖般克隆。去除上清，加入200μl/well的HT完全培养基(含20％FBS、1×HT和1×OPI的RPMI-1640培养基)，37℃，5％CO2培养3天后进行ELISA检测。
3.杂交瘤细胞筛选
根据杂交瘤细胞生长密度，用结合ELISA方法进行杂交瘤培养上清检测。并将结合ELISA检测的阳性孔细胞上清进行细胞结合实验和细胞阻断实验。结合和阻断均为阳性的孔细胞及时进行扩增冻存保种和二到三次亚克隆直至获得单细胞克隆。
每次亚克隆细胞也均需进行CD96结合ELISA、细胞结合实验和细胞阻断实验检测。通过以上实验筛选得到杂交瘤克隆，用无血清细胞培养法进一步制备抗体，按纯化实例(实施例2第3项)纯化抗体，供在检测例中使用。
4.杂交瘤阳性克隆序列测定
从阳性杂交瘤中克隆序列过程如下。收集对数生长期杂交瘤细胞，用Trizol(Invitrogen，Cat No.15596-018)按照试剂盒说明书步骤提取RNA，用PrimeScriptTMReverse Transcriptase试剂盒反转录(Takara，Cat No.2680A)。将反转录得到的cDNA采用小鼠Ig-Primer试剂盒(Novagen，TB326 Rev.B 0503)进行PCR扩增后送测序公司测序。得到鼠源抗体m1718、m1719、m1720、m1721、m1722的重链和轻链可变区DNA序列对应的氨基酸序列(VH/VL中CDR的氨基酸残基由Kabat编号系统确定并注释，下划线标注的序列为CDR)：
m1718 VH(SEQ ID NO：6)
EFQLQQSGPELVKPGASVKISCKASAYSITDYNMNWVKQSNGKSLEWIGVINPSYGITDYNQNFKDKATLTVDQSSSTAYMQLNSLTSEDSAVYYCAIQLRLPGYFDVWGTGTTVIVSS
m1718VL(SEQ ID NO：7)
DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINNYLNWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLKYDEFPYTFGGGTKVEIK
m1719VH(SEQ ID NO：8)
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLISYGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGNTNYHSVLISRLSIRKDDSKSQVFLKLNSLQTDDTATYYCAKNNYYGSRYGYPMDYWGQGTSVTVSS
m1719VL(SEQ ID NO：9)
DIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITCKATQDVGTAVAWYQQKPGHSPKLLIYWASTRHTGVPERFTGSGSGTDFTLTIDNVQSEDLADYFCQQYGSSVLTFGAGTKVELR
m1720VH(SEQ ID NO：10)
EFQLQQSGPELVKPGASVKISCKASAYSLTDYNMNWVKQSNGKSLEWIGVINPSYGISSYNQKFKGKATLTVDQSSSTAYMHLNSLTSEDSAVYYCARQLRLPGYFDVWGTGTTVTVSS
m1720VL(SEQ ID NO：11)
DIKMTQSPSSKNASLGERVTITCKASQDINSYLNWFQQKPGKSPKTLIYRASRLVDGVPSRFSGSGSGQDYSLTISSLEYEDMGIYYCLKYDEFPYTFGGGTKLEIK
m1721VH(SEQ ID NO：12)
QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLISYGVNWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGSTNYHSALISRLSISKDDSKSQVFLNLNSLQTDDTATYYCAKNYFYGSRYGYAMDSWGQGISVTVSS
m1721VL(SEQ ID NO：13)
DIQMTQSPASLSAAVGETVTITCRASENIYSSLAWYQQKQGKSPQLLVYNAKTLIETVASRFSGSGSGTQYSLKINSLQPEDFGSFYCQHHYGTPYTFGGGTKLEIK
m1722VH(SEQ ID NO：14)
QVQLQQPGAELVKPGTSVKLSCKASGNTFIDYWMHWVKQRPGQGLEWIGMLHPNSGTTSFNEKFKIKTTLTIDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAIYYCASDYSGPFAYWGQGTLVTVSA
m1722VL(SEQ ID NO：15)
QIVLTQSPGIMSAFPGEKVTMTCSASSSVNYIHWYQQKSGTSPKRWIFDTSKLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWRSNPLTFGAGTKLELK
其中各抗体轻重链中CDR序列如表1所示。
表1各抗体重链及轻链CDR区序列
Figure GPA0000283798530000291
Figure GPA0000283798530000301
上述鼠源抗体的轻重链可变区分别与人源抗体的轻链恒定区(SEQ ID NO：117)和重链恒定区(SEQ ID NO：118)连接后形成嵌合抗体，m1718抗体对应的嵌合抗体命名为ch1718，其他抗体类推。
实施例4、鼠源抗CD96抗体的人源化
通过比对IMGT人类抗体重轻链可变区种系基因数据库和MOE软件，分别挑选与鼠源抗体同源性高的重链和轻链可变区种系基因作为模板，将鼠源抗体的CDR分别移植到相应的人源模板中，形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区序列。根据需要，将骨架序列中关键氨基酸回复突变为鼠源抗体对应的氨基酸，以保证原有的亲和力，即得到人源化抗CD96单克隆抗体。其中回复突变时氨基酸残基由自然编号确定并注释。
4.1杂交瘤克隆m1718的人源化
(1)m1718人源化构架选择
鼠源抗体m1718的人源化轻链模板为IGKV1-16*01和hjk4.1，人源化重链模板为IGHV1-3*01和hjh6.1，经CDR graft后得到人源化抗体h1718-001，人源化可变区序列如下：
h1718-001 VH-CDR graft
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMNWVRQAPGQRLEWMGVINPSYGITDYNQNFKDRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARQLRLPGYFDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：46
h1718-001 VL-CDR graft
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINNYLNWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLKYDEFPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：47
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列，下划线为CDR序列。
(2)h1718系列回复突变设计如下表：
表2.h1718抗体的回复突变
Figure GPA0000283798530000311
注：如S46T表示依照氨基酸序列自然顺序编号，将46位S突变回T。Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。
(3)h1718系列人源化抗体可变区序列组合如下表：
表3.h1718系列人源化抗体可变区序列组合
h1718-VH1 h1718-VH2 h1718-VH3 h1718-VH4
h1718-VL1 h1718-001 h1718-002 h1718-003 h1718-004
h1718-VL2 h1718-005 h1718-006 h1718-007 h1718-008
注：该表表示各种突变组合所得的序列。如h1718-006表示，在人源化的抗体h1718-006包含有轻链可变区h1718-VL2和重链可变区h1718-VH2。其它类推。
(4)h1718系列人源化抗体可变区具体序列如下：
＞h1718-VL1(同H1718-001VL-CDR graft)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINNYLNWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLKYDEFPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：47
＞h1718-VL2
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINNYLNWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLKYDEFPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：48
＞h1718-VH1(同H1718-001VH-CDR graft)
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMNWVRQAPGQRLEWMGVINPSYGITDYNQNFKDRVTITRDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARQLRLPGYFDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：46
＞h1718-VH2
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYNMNWVRQAPGQRLEWIGVINPSYGITDYNQNFKDRVTITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCARQLRLPGYFDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：49
＞h1718-VH3
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTITDYNMNWVRQAPGQRLEWIGVINPSYGITDYNQNFKDRVTITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIQLRLPGYFDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：50
＞h1718-VH4
EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTITDYNMNWVKQAPGQRLEWIGVINPSYGITDYNQNFKDKVTITVDTSASTAYMELSSLRSEDTAVYYCAIQLRLPGYFDVWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：51
(5)h1718-VL热点突变：
将h1718系列人源化VL的CDR1(即SEQ ID NO：19，KASQDINNYLN)中NN突变为NQ、NT、NL，以提高抗体的稳定性。h1718 VL CDR1序列通式为KASQDINX1YLN(SEQ ID NO：52)，其中X1选自：N、T、L和Q。具体的h1718VL CDR1突变体包括KASQDINQYLN(SEQ ID NO：108)，KASQDINTYLN(SEQ ID NO：109)，KASQDINLYLN(SEQ ID NO：110)。
h1718-VL1可变为以下轻链可变区序列：
＞h1718.VL1a(SEQ ID NO：53)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINQYLNWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLKYDEFPYTFGGGTKVEIK
＞h1718.VL1b(SEQ ID NO：54)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINTYLNWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLKYDEFPYTFGGGTKVEIK
＞h1718.VL1c(SEQ ID NO：55)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINLYLNWFQQKPGKAPKSLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCLKYDEFPYTFGGGTKVEIK
h1718-VL2可变为以下轻链可变区序列：
＞h1718.VL2a(SEQ ID NO：56)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINQYLNWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLKYDEFPYTFGGGTKVEIK
＞h1718.VL2b(SEQ ID NO：57)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINTYLNWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLKYDEFPYTFGGGTKVEIK
＞h1718.VL2c(SEQ ID NO：58)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCKASQDINLYLNWFQQKPGKAPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDYTLTISSLQPEDFATYYCLKYDEFPYTFGGGTKVEIK
h1718系列人源化抗体可变区序列组合如下表：
表4.h1718系列人源化抗体可变区序列组合
h1718-VH3 h1718-VH4 h1718-VH1 h1718-VH2
h1718-VL1a h1718-009 h1718-015 h1718-021 h1718-027
h1718-VL1b h1718-010 h1718-016 h1718-022 h1718-028
h1718-VL1c h1718-011 h1718-017 h1718-023 h1718-029
h1718-VL2a h1718-012 h1718-018 h1718-024 h1718-030
h1718-VL2b h1718-013 h1718-019 h1718-025 h1718-031
h1718-VL2c h1718-014 h1718-020 h1718-026 h1718-032
4.2杂交瘤克隆m1719的人源化
(1)m1719人源化构架选择
鼠源抗体m1719的人源化轻链模板为IGKV1-12*01和hjk4.1，人源化重链模板为IGHV2-26*01和hjh6.1，经CDR graft后得到人源化抗体h1719-001，人源化可变区序列如下：
h1719-001 VH-CDR graft
EVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSSYGVSWIRQPPGKALEWLAVIWGDGNTNYHSVLISRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARNNYYGSRYGYPMDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：59
h1719-001 VL-CDR graft
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKATQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYGSSVLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：60
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列，下划线为CDR序列。
(2)h1719-001回复突变设计如下表：
表5.h1719人源化抗体回复突变
Figure GPA0000283798530000341
注：如A43S表示依照氨基酸序列自然顺序编号，将43位A突变回S。Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。
(3)h1719系列人源化抗体可变区序列组合如下表：
表6.h1719系列人源化抗体可变区序列组合
Figure GPA0000283798530000342
Figure GPA0000283798530000351
注：该表表示各种突变组合所得的序列。如h1719-005表示，在人源化的抗体h1719-005上包含轻链可变区h1719-VL2和重链可变区h1719-VH2。其它类推。
(4)h1719系列人源化抗体可变区具体序列如下：
＞h1719-VL1(同h1719-001 VL-CDR graft)
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKATQDVGTAVAWYQQKPGKAPKLLIYWASTRHTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYGSSVLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：60
＞h1719-VL2
DIQMTQSPSSVSASVGDRVTITCKATQDVGTAVAWYQQKPGKSPKLLIYWASTRHTGVPERFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYFCQQYGSSVLTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：61
＞h 1719-VH1(同h1719-001 VH-CDR graft)
EVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSSYGVSWIRQPPGKALEWLAVIWGDGNTNYHSVLISRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARNNYYGSRYGYPMDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：59
＞h1719-VH2
EVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSSYGVSWVRQPPGKALEWLAVIWGDGNTNYHSVLISRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCAKNNYYGSRYGYPMDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：62
＞h1719-VH3
EVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSSYGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGNTNYHSVLISRLTISKDTSKSQVVLTLTNMDPVDTATYYCAKNNYYGSRYGYPMDYWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：63
(5)h1719-VH热点突变：
将h1719 VH CDR3(NNYYGSRYGYPMDY)中NN突变为QN、NY、NQ，M突变为L或I，以提高抗体的稳定性。h1719VH CDR3序列通式为X2X3YYGSRYGYPX4DY(SEQ ID NO：64)，其中X2选自：N和Q，X3选自：N、Y和Q，X4选自M、L和I。具体的h1719 VH CDR3突变体可以包括但不限于QNYYGSRYGYPLDY(SEQ ID NO：111)，NYYYGSRYGYPLDY(SEQ ID NO：112)，NQYYGSRYGYPLDY(SEQ ID NO：113)，QNYYGSRYGYPIDY(SEQ ID NO：114)，NYYYGSRYGYPIDY(SEQ ID NO：115)，NQYYGSRYGYPIDY(SEQ ID NO：116)。
h1719-VH3可变为以下重链可变区序列：
＞h1719.VH3a(SEQ ID NO：65)
EVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSSYGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGNTNYHSVLISRLTISKDTSKSQVVLTLTNMDPVDTATYYCAKQNYYGSRYGYPLDYWGQGTTVTVSS
＞h1719.VH3b(SEQ ID NO：66)
EVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSSYGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGNTNYHSVLISRLTISKDTSKSQVVLTLTNMDPVDTATYYCAKNYYYGSRYGYPLDYWGQGTTVTVSS
＞h1719.VH3c(SEQ ID NO：67)
EVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSSYGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGNTNYHSVLISRLTISKDTSKSQVVLTLTNMDPVDTATYYCAKNQYYGSRYGYPLDYWGQGTTVTVSS
＞h1719.VH3d(SEQ ID NO：68)
EVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSSYGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGNTNYHSVLISRLTISKDTSKSQVVLTLTNMDPVDTATYYCAKQNYYGSRYGYPIDYWGQGTTVTVSS
＞h1719.VH3e(SEQ ID NO：69)
EVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSSYGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGNTNYHSVLISRLTISKDTSKSQVVLTLTNMDPVDTATYYCAKNYYYGSRYGYPIDYWGQGTTVTVSS
＞h1719.VH3f(SEQ ID NO：70)
EVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSSYGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGNTNYHSVLISRLTISKDTSKSQVVLTLTNMDPVDTATYYCAKNQYYGSRYGYPIDYWGQGTTVTVSS
h1719系列人源化抗体可变区序列组合如下表：
表7.h1719系列人源化抗体可变区序列组合
Figure GPA0000283798530000371
4.3杂交瘤克隆m1721的人源化
(1)m1721人源化构架选择
鼠源抗体m1721的人源化轻链模板为IGKV1-39*01和hjk4.1，人源化重链模板为IGHV2-26*01和hjh6.1，经CDR graft后得到人源化抗体h1721-001，人源化可变区序列如下：
h1721-001VH-CDR graft
EVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSSYGVNWIRQPPGKALEWLAVIWGDGSTNYHSALISRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARNYFYGSRYGYAMDSWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：71
h1721-001 VL-CDR graft
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSSLAWYQQKPGKAPKLLIYNAKTLIEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：72
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列，下划线为CDR序列。
(2)h1721-001回复突变设计如下表：
表8.h1721人源化抗体回复突变
Figure GPA0000283798530000372
Figure GPA0000283798530000381
注：如A48S表示依照氨基酸序列自然顺序编号，将48位A突变回S。Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。
(3)h1721系列人源化抗体可变区序列组合如下表：
表9.h1721系列人源化抗体可变区序列组合
h1721-VH1 h1721-VH2 h1721-VH3 h1721-VH4
h1721-VL1 h1721-001 h1721-002 h1721-003 h1721-004
h1721-VL2 h1721-005 h1721-006 h1721-007 h1721-008
h1721-VL3 h1721-009 h1721-010 h1721-011 h1721-0012
注：该表表示各种突变组合所得的序列。如h1721-006表示，在人源化的抗体h1721-006包含轻链可变区h1721-VL2、重链可变区h1721-VH2。其它类推。
(4)h1721系列人源化抗体可变区具体序列如下：
＞h1721V-L1(同h1721-001 VL-CDR graft)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSSLAWYQQKPGKAPKLLIYNAKTLIEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：72
＞h1721-VL2
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSSLAWYQQKPGKAPKLLVYNAKTLIEGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：73
＞h1721-VL3
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSSLAWYQQKPGKSPKLLVYNAKTLIEGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPYTFGGGTKVEIK
SEQ ID NO：74
＞h1721-VH1(同h1721-001 VH-CDR graft)
EVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSSYGVNWIRQPPGKALEWLAVIWGDGSTNYHSALISRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCARNYFYGSRYGYAMDSWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：71
＞h1721-VH2
EVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSSYGVNWIRQPPGKALEWLGVIWGDGSTNYHSALISRLTISKDTSKSQVVLTMTNMDPVDTATYYCAKNYFYGSRYGYAMDSWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：75
＞h1721-VH3
EVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSSYGVNWIRQPPGKALEWLGVIWGDGSTNYHSALISRLTISKDTSKSQVVLTLTNMDPVDTATYYCAKNYFYGSRYGYAMDSWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：76
＞h1721-VH4
EVTLKESGPVLVKPTETLTLTCTVSGFSLSSYGVNWVRQPPGKGLEWLGVIWGDGSTNYHSALISRLTISKDTSKSQVVLTLTNMDPVDTATYYCAKNYFYGSRYGYAMDSWGQGTTVTVSS
SEQ ID NO：77
4.4杂交瘤克隆m1722的人源化
(1)m1722人源化构架选择
鼠源抗体m1722的人源化轻链模板为IGKV1-39*01和hjk2.1，人源化重链模板为IGHV1-69*02和hjh4.1，经CDR graft后得到人源化抗体h1722-001，人源化可变区序列如下：
h1722-001 VH-CDR graft
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYWMHWVRQAPGQGLEWMGMLHPNSGTTSFNEKFKIRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDYSGPFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：78
h1722-001 VL-CDR graft
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVNYIHWYQQKPGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWRSNPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO：79
注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列，下划线为CDR序列。
(2)h1722-001回复突变设计如下表：
表10.h1722人源化回复突变
Figure GPA0000283798530000401
注：如L45R表示依照氨基酸序列自然顺序编号，将45位L突变回R。Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。
(3)h1722系列人源化抗体可变区序列组合如下表：
表11.h1722系列人源化抗体可变区序列组合
h1722-VH1 h1722-VH2 h1722-VH3 h1722-VH4
h1722-VL1 h1722-001 h1722-002 h1722-003 h1722-004
h1722-VL2 h1722-005 h1722-006 h1722-007 h1722-008
h1722-VL3 h1722-009 h1722-010 h1722-011 h1722-012
注：该表表示各种突变组合所得的序列。如h1722-006表示，在人源化的抗体h1722-006包含轻链可变区h1722-VL2、重链可变区h1722-VH2。其它类推。
(4)h1722系列人源化抗体可变区具体序列如下：
＞h1722-VL1(同h1722-001 VL-CDR graft)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVNYIHWYQQKPGKAPKLLIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWRSNPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO：79
＞h1722-VL2
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVNYIHWYQQKPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQWRSNPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO：80
＞h1722-VL3
DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVNYIHWYQQKPGKAPKRWIFDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQWRSNPLTFGQGTKLEIK
SEQ ID NO：81
＞h1722-VH1(同h1722-001 VH-CDR graft)
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYWMHWVRQAPGQGLEWMGMLHPNSGTTSFNEKFKIRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDYSGPFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：78
＞h1722-VH2
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYWMHWVRQAPGQGLEWIGMLHPNSGTTSFNEKFKIRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASDYSGPFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：82
＞h1722-VH3
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYWMHWVKQAPGQGLEWIGMLHPNSGTTSFNEKFKIRVTITIDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASDYSGPFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：83
＞h1722-VH4
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGNTFSDYWMHWVKQAPGQGLEWIGMLHPNSGTTSFNEKFKIRTTITIDKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASDYSGPFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：84
(5)h1722-VH热点突变：
由于h1722-VH CDR2有一个乙酰化高风险位点NS，因此我们将NS突变为KS或QS，以提高抗体的化学稳定性。h1722-VH CDR2的序列通式为MLHPX5SGTTSFNEKFKI(SEQ ID NO：119)，其中X5选自N、K或Q。具体地，h1722-VH CDR2的突变体包括但不限于；MLHPKSGTTSFNEKFKI(SEQ ID NO：120)或MLHPQSGTTSFNEKFKI(SEQ ID NO：121)。
h1722-VH2可变为以下重链可变区序列：
＞h1722-VH2a(N54K)
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYWMHWVRQAPGQGLEWIGMLHPKSGTTSFNEKFKIRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASDYSGPFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：122
＞h1722-VH2b(N54Q)
EVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYWMHWVRQAPGQGLEWIGMLHPQSGTTSFNEKFKIRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCASDYSGPFAYWGQGTLVTVSS
SEQ ID NO：123
h1722系列人源化抗体可变区序列突变后的组合如下表：
表12.h1722系列人源化抗体可变区序列突变后组合
h1722-VH2a h1722-VH2b
h1722-VL1 h1722-013 h1722-014
h1722-VL2 h1722-015 h1722-016
h1722-VL3 h1722-017 h1722-018
以上各重链可变区与如SEQ ID NO：117所示的重链恒定区序列重组表达得到最终的完整重链序列。以上各轻链可变区与如SEQ ID NO：118所示的轻链恒定区序列重组表达得到最终的完整轻链序列。
ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：117
轻链恒定区：
RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SEQ ID NO：118
采用所属领域的常规技术手段，将以上轻链可变区、重链可变区还可与其他可选的人源化恒定区，及经过功能性修饰的人源化恒定区，重组并表达。
用于检测的猴CD96抗原：猴CD96-3×Flag(SEQ ID NO：95)
MEFGLSWLFLVAILKGVQCVWGKPFNTEENIYATLGSDVNLTCQTQAKGFLVQMQWSKVTDKADLIALYHPQYGFHCAYGSPCESLVTFTQTPENGSKWTLHLRNMSSSVSGRYECMLTLYPEGMQTKIYNLLIQTHVTPDEWKSNHTIEIEINQTLEIPCFQNSSSEISSEFTYAWLVEDNGTQQTLISQDHLISSSTLLKDRVKVGIDYRLHLSPVQIFDDGRKFSCHIRVGPDKILRSSTTIKVFAKPEIPMIVENNSTDVLVERTFTCLLKNVFPKANIIWFIDGSFLHDEKEGIYITNEERKGKDGFLELKSVLTRVHSDKPAQSDNLTIWCMALSPVPGNKVWNISSEKITFLLGSEMSTTDLPPSVTESTLDTQPSPASSVSPTRYPATSSVTLADVSALRPNTTPQSSSSSVTTQDFNYPWTSSGTDAKKSFSQIPSETYSSSPSGAGSTLHDNVFTSTTRALSEVPTTANGSTKTNHVHITGIVVSKPKDGMDYKDHDGDYKDHDIDYKDDDDK
下划线部分为信号肽，斜体部分为3×Flag-tag。制备方法见实施例2第1项。
以下用生化测试方法验证本公开性能及有益效果。
测试例1：CD96抗体结合人CD96蛋白的ELISA实验
抗CD96抗体的结合力通过抗体与人CD96蛋白的ELISA实验来检测。用带His标签的CD96融合蛋白包被在酶标板中，抗体加入后信号的强弱被用于判断抗体和CD96的结合活性，具体实验方法如下。
用pH7.4的PBS(上海源培生物科技有限公司，CatNo.B320)缓冲液将实施例1中序列如SEQ ID NO：4所示的CD96-His稀释至2μg/ml浓度，以50μl/孔的体积加入96孔酶标板(Corning，Cat No.CLS3590-100EA)中，于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(BD，232100)封闭液250μl/孔，37℃孵育箱孵育2.5小时或4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(pH7.4 PBS含0.05％tween-20)洗板4次后，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的不同浓度待测抗体(杂交瘤纯化抗体或人源化抗体)，放于37℃孵育箱孵育1小时。孵育结束后用PBST洗板4次，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)，37℃孵育1小时。用PBST洗板4次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，Cat No.52-00-03)，于室温孵育5-15min，加入50μl/孔1M H2SO4终止反应，用NOVOStar酶标仪在波长450nm处读取吸收值，计算CD96抗体对人CD96的结合EC50值(见表13)。
表13.CD96抗体与人CD96的亲和力ELISA测定
Figure GPA0000283798530000431
Figure GPA0000283798530000441
结果显示抗CD96的嵌合抗体和人源化抗体能够与人CD96特异性结合。
测试例2：CD96抗体结合食蟹猴CD96蛋白的ELISA实验
抗CD96抗体的与猴CD96的交叉反应结合力通过抗体与食蟹猴CD96蛋白的ELISA实验来检测。用带3×FLAG标签的食蟹猴CD96融合蛋白包被在酶标板中，抗体加入后信号的强弱被用于判断抗体和食蟹猴CD96的结合活性，具体实验方法如下。
用pH7.4的PBS(上海源培生物科技有限公司，Cat No.B320)缓冲液将上述实施例4制备得到的氨基酸序列为SEQ ID NO：95的cyno-CD96-3×FLAG稀释至2μg/ml浓度，以50μl/孔的体积加入96孔酶标板(Corning，Cat No.CLS3590-100EA)中，于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(BD，232100)封闭液250μl/孔，37℃孵育箱孵育2.5小时或4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(pH7.4 PBS含0.05％tween-20)洗板4次后，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的不同浓度待测抗体(杂交瘤纯化抗体或人源化抗体)，放于37℃孵育箱孵育1小时。孵育结束后用PBST洗板4次，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗(Jackson ImmunoResearch，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)，37℃孵育1小时。用PBST洗板4次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，Cat No.52-00-03)，于室温孵育5-15min，加入50μl/孔1M H2SO4终止反应，用NOVOStar酶标仪在波长450nm处读取吸收值，计算CD96抗体对猴CD96的结合EC50值(见表14)。
表14 CD96抗体与食蟹猴CD96结合ELISA测定
Figure GPA0000283798530000442
结果显示CD96嵌合抗体和人源化抗体能够与猴CD96具有交叉反应。
测试例3：CD96抗体与人CD96过表达CHO-s细胞的结合实验
抗CD96抗体的结合力通过抗体与过表达人CD96蛋白的CHO-S细胞的结合实验来检测。通过电转染的方法将CD96全长质粒转染进CHO-S细胞中后加压筛选两周后，检测CD96的表达量。将过表达细胞固定于96孔板底后，抗体加入后信号的强弱被用于判断抗体和CD96过表达CHO-S细胞的结合活性，具体实验方法如下。
将细胞以9×104/100μL/well密度，接种于96孔板中过夜培养。吸掉上清，用PBS洗一遍后，加入100μl/孔免疫染色固定液(碧云天，P0098)室温固定一小时，PBS洗三遍。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(BD，232100)封闭液250μl/孔，37℃孵育箱孵育2.5小时进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(pH7.4 PBS含0.05％tween-20)洗板4次后，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的不同浓度待测抗体(杂交瘤纯化抗体或人源化抗体)，放于37℃孵育箱孵育2小时。孵育结束后用PBST洗板4次，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)，37℃孵育1小时。用PBST洗板4次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，Cat No.52-00-03)，于室温孵育10-25min，加入50μl/孔1M H2SO4终止反应，用NOVOStar酶标仪在波长450nm处读取吸收值，计算CD96抗体对CD96过表达CHO-S细胞的结合EC50值(见图1和表15)。
表15 CD96抗体与过表达人CD96-CHOs细胞的亲和力ELISA测定
候选抗体 EC50(nM) 候选抗体 EC50(nM)
ch1718 0.026 h1718-012 0.031
ch1719 0.012 h1719-003 0.028
ch1720 0.036 h1719-006 0.016
ch1721 0.036 h1719-014 0.02
ch1722 0.043 h1721-003 0.074
h1722-005 0.045 h1722-006 0.043
h1722-010 0.047 h1722-017 0.053
h1722-018 0.044
结果显示CD96嵌合抗体和人源化抗体能够结合CD96过表达CHO-S细胞。
测试例4：抗CD96抗体阻断CD96抗原和CD155-CHOs细胞结合实验
CD155-CHOs细胞(上海恒瑞构建)以9×104/100μL/well的数量接种于96孔培养板中过夜培养，吸掉上清，用PBS洗一遍后，加入100μl/孔免疫染色固定液(碧云天，P0098)室温固定一小时，PBS洗三遍。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(BD，232100)封闭液250μl/孔，37℃孵育箱孵育2.5小时进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(pH7.4 PBS含0.05％tween-20)洗板4次后，加入50μl/孔抗原-抗体预孵育液(梯度浓度的杂交瘤待测抗体与终浓度0.5μg/mL的CD96-Fc 37℃预混合30分钟，或者梯度浓度的人源化抗体样品与终浓度0.5μg/mL的Bio-CD96-His 37℃预混合30分钟)(生物素标记试剂盒，东仁化学，Cat No.LK03)，置37℃孵育箱孵育2小时。孵育结束后，弃去酶标板中的反应液，用PBST洗板4次后，加入50μl/孔用样品稀释液稀释HRP标记的羊抗人二抗(Jackson ImmunoResearch，Cat No.109-035-003)或者HRP标记的链霉亲和素(Sigma，Cat No.S2438)，37℃孵育1小时。用PBST洗板4次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，Cat No.52-00-03)，于室温孵育10-20min，加入50μl/孔1M H2SO4终止反应，用NOVOStar酶标仪在波长450nm处读取吸收值，计算CD96抗体对抗原与CD155-CHOs细胞结合的阻断作用(见图2和表16)。
表16 CD96抗体阻断CD96与表达人CD155-CHOs细胞的结合测定
候选抗体 IC50(nM) 候选抗体 IC50(nM)
ch1718 0.096 h1718-012 0.133
ch1719 0.137 h1719-003 0.096
ch1720 0.149 h1719-006 0.064
ch1721 0.214 h1719-014 0.046
ch1722 0.159 h1721-003 0.155
h1722-006 0.398 h1722-010 0.207
h1722-017 0.135 h1722-018 0.134
结果显示CD96嵌合抗体和人源化抗体能够阻断CD96和CD155-CHOs细胞的结合。
测试例5：BIAcore检测抗CD96抗体亲和力实验
1.人Fc抗体亲和力测定方法：
用Protein A生物传感芯片亲和捕获待测抗体，然后于芯片表面流经CD96抗原，用Biacore仪器实时检测反应信号获得结合和解离曲线。在每个实验循环解离完成后，用甘氨酸-盐酸再生溶液(pH 1.5)将生物传感芯片洗净再生。
2.鼠Fc抗体亲和力测定方法：
用偶联有抗鼠Fc抗体的CM5生物传感芯片亲和捕获待测抗体，然后于芯片表面流经CD96抗原，利用Biacore仪器实时检测反应信号获得结合和解离曲线。在每个实验循环解离完成后，用小鼠抗体捕获试剂盒里的再生溶液将生物芯片洗净再生。
流动相均为CD96-ECD-His。
表17候选抗体的亲和力BIACORE测定
Figure GPA0000283798530000461
Figure GPA0000283798530000471
*亲和力数值3.32E-9M是3.32×10-9M。
抗CD96嵌合抗体ch1718、ch1720、ch1721、ch1719、ch1722与人CD96均有很强的亲和力，示例性人源化抗体也与人CD96有很强的亲和力。
抗人CD96单克隆抗体的表位测定
测试例6：抗CD96抗体的竞争实验
将不同抗体与CD96蛋白结合的竞争实验用来进行抗体的结合表位分类。具体实验方法如下：
用pH7.4的PBS(上海源培，Cat No.B320)缓冲液将抗体A稀释至2μg/mL浓度，以50μL/孔的体积加入96孔酶标板(Corning，Cat No.CLS3590-100EA)中，于4℃包被过夜。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(BD skim milk，Cat No.232100)封闭液250μL/孔，37℃孵育箱孵育3小时。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(pH7.4 PBS含0.05％tween-20)洗板5次后，备用。1％BSA稀释抗体B至40μg/ml和8μg/ml，同时稀释BiotinylatedCD96抗原至4μg/mL，将抗体B和抗原按1∶1体积比混匀，37℃预孵育45分钟后，加入到已包被抗体A的酶标板中，放于37℃孵育箱孵育1.5小时。孵育结束后用PBST洗板5次，加入50μL/孔用样品稀释液稀释的HRP标记的链霉亲和素(Sigma，Cat No.S2438)，37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，Cat No.52-00-03)进行显色，加入50μl/孔1M H2SO4终止反应，用NOVOStar酶标仪在波长450nm处读取吸收值，根据OD值的大小确定A和B两种CD96抗体是否竞争。彼此竞争的抗体分为同一类的抗体，不能竞争的抗体则是不同类的抗体。检测结果见图3和表18。
表18不同组抗体间竞争关系检测
Figure GPA0000283798530000481
竞争实验结果表明h1721-003、h1719-014、h1718-012和ch1720抗体之间存在竞争关系，它们都与h1722-010抗体不竞争。
测试例7：抗CD96抗体结合CD96蛋白不同多肽片段的ELISA实验
抗CD96抗体所识别的抗原表位通过抗体与CD96蛋白不同多肽片段的结合实验来检测。用CD96抗原的不同肽段的多肽包被在酶标板中，抗体加入后信号的强弱被用于判断抗体和多肽的结合活性，具体实验方法如下：
用pH7.4的PBS(上海源培，Cat No.B320)缓冲液将多肽稀释至20μg/mL浓度，以50μL/孔的体积加入96孔酶标板(Corning，Cat No.CLS3590-100EA)中，于4℃包被过夜。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(BD skim milk，Cat No.232100)封闭液250μL/孔，37℃孵育箱孵育3小时。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(pH7.4 PBS含0.05％tween-20)洗板5次后，加入50μL/孔用样品稀释液稀释的不同浓度待测抗体(杂交瘤纯化抗体或嵌合抗体)，放于37℃孵育箱孵育2小时。孵育结束后用PBST洗板5次，加入50μL/孔用样品稀释液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.109-035-003)或者anti-Rat-IgGHRP(Jackson Immuno Research，Cat No.112-035-003)，37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入50μL/孔TMB显色底物(KPL，Cat No.52-00-03)，于室温孵育5-15min，加入50μL/孔1MH2SO4终止反应，用酶标仪(Thermo scientific MuLtiskan MK3)在波长450nm处读取吸收值，推测分析CD96抗体可能所识别的抗原表位。
表19抗原表位肽列表
Figure GPA0000283798530000482
Figure GPA0000283798530000491
注：“+”表示结合强度，“+”越多，表示结合力越强；“-”表示无结合。
根据上述结果，抗体ch1718、ch1720、ch1721、ch1719与3#抗原片段(SEQ ID NO：87)结合较强，3#抗原片段中含抗体ch1718、ch1720、ch1721、ch1719的表位。
测试例8：CD96抗体结合CD96不同肽段的FACS实验
为了验证抗体与CD96蛋白多肽片段的结合是特异的，我们设计了以下FACS实验进行验证。用多肽片段与抗体孵育结合后，抗体与CD96蛋白结合的表位即被占据，则抗体再与细胞表面的CD96蛋白结合的信号下降。具体实验方法如下：
1％BSA稀释抗体样品至1.2μg/mL，同时稀释多肽至40μg/mL，将多肽和抗体样品按1∶1体积比混匀，37℃预孵育90分钟；收集CD96-CHOs细胞，PBS洗涤一次，按0.5×106/test分配；用100μL的多肽-抗体混合液重悬细胞，4℃孵育60分钟，1％BSA洗涤3次；Alexa Fluor488 anti-human IgG Fc(thermofisher，A-11013)，或者PE goat anti-mouse IgG(Biolegend，405307)，或者PE goat anti-Rat IgG(Biolegend，405406)稀释液(1∶400，1∶40，1∶100)100μL重悬细胞，4℃孵育40分钟，1％BSA洗涤3次，以200μL的1％BSA重悬细胞，在流式细胞仪BD FACSCanto II上读取各样品MFI，GraphPad Prism 5分析数据做出柱状图，通过未与多肽孵育的和与多肽孵育的两者之间的MFI差值来判断CD96抗体可识别的抗原表位。检测结果见图4。
检测结果显示，嵌合抗体ch1721、ch1719、ch1718结合人CD96胞外区中SEQ ID NO：87所示的表位区段。
测试例9：NK细胞介导的细胞杀伤功能实验
为了研究CD96抗体对NK细胞杀伤功能的影响，收集和纯化人外周血单核细胞(PBMC)，提取自然杀伤细胞(NK)，与人大肠癌细胞WiDr(Cat No.ATCC-CCL-218)共培养4h，检测乳酸脱氢酶(LDH)的分泌水平。
实验过程简单描述如下：
人大肠癌细胞系WiDr于MEM培养基中培养，该培养基中添加10％(v/v)胎牛血清(FBS)，37℃、5％CO2条件下培养。新鲜血液利用Ficoll-Hypaque密度梯度离心(Stem CellTechnologies)得到PBMC，人原代NK细胞从新鲜分离的PBMC中提取(Miltenyi，CAT#130-092-657)，于RPMI 1640培养基中培养，该培养基中添加10％(v/v)FBS，37℃、5％CO2条件下培养。人原代NK细胞接种至6孔细胞培养板，细胞密度约为2×106/ml，加入100U/mL人IL-2(Peprotech，200-02-100)过夜培养后，利用无酚红RPMI1640培养基洗涤，重悬，并接种至96孔U底板中，细胞密度约为3×105/孔，同时加入梯度稀释的抗体样品(用PBS稀释)或等量的同型IgG作为空白对照，以只加入IL-2、NK细胞和癌细胞的孔作为空白对照(control)。37℃，5％CO2培养箱孵育1h后，靶标细胞WiDr以1∶1比例与人原代NK细胞共培养，37℃，5％CO2培养箱培养4h后，收集细胞培养上清。采用CytoTox
Figure GPA0000283798530000501
Non-Radioactive CytotoxicityAssay(Promega，CAT#G1780)方法检测细胞培养上清内LDH分泌水平。具体操作参考试剂说明书。特异性细胞溶解的百分比以下式决定：％溶解＝100×(ER-SR1-SR2)/(MR-SR1)，其中ER、SR(1&2)及MR分别代表实验、自发(1为靶标细胞，2为人原代NK细胞)及最大LDH释放。自发释放系由单独培养于培养基中的靶标细胞或人原代NK细胞所释放的LDH，最大释放系利用裂解液裂解所有靶标细胞时所测定的LDH。
实验结果见图5，结果表明CD96的抗体ch1718，ch1720，以及ch1719均能不同程度增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。因此，本发明的保护范围由所附权利要求书限定。
序列表
<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司、上海恒瑞医药有限公司
<120> CD96抗体、其抗原结合片段及医药用途
<130> P184016530C
<150> CN201711107331.5
<151> 2017-11-10
<160> 123
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 511
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 带Flag标签的CD96胞外区序列
<400> 1
Met Glu Lys Lys Trp Lys Tyr Cys Ala Val Tyr Tyr Ile Ile Gln Ile
1 5 10 15
His Phe Val Lys Gly Val Trp Glu Lys Thr Val Asn Thr Glu Glu Asn
20 25 30
Val Tyr Ala Thr Leu Gly Ser Asp Val Asn Leu Thr Cys Gln Thr Gln
35 40 45
Thr Val Gly Phe Phe Val Gln Met Gln Trp Ser Lys Val Thr Asn Lys
50 55 60
Ile Asp Leu Ile Ala Val Tyr His Pro Gln Tyr Gly Phe Tyr Cys Ala
65 70 75 80
Tyr Gly Arg Pro Cys Glu Ser Leu Val Thr Phe Thr Glu Thr Pro Glu
85 90 95
Asn Gly Ser Lys Trp Thr Leu His Leu Arg Asn Met Ser Cys Ser Val
100 105 110
Ser Gly Arg Tyr Glu Cys Met Leu Val Leu Tyr Pro Glu Gly Ile Gln
115 120 125
Thr Lys Ile Tyr Asn Leu Leu Ile Gln Thr His Val Thr Ala Asp Glu
130 135 140
Trp Asn Ser Asn His Thr Ile Glu Ile Glu Ile Asn Gln Thr Leu Glu
145 150 155 160
Ile Pro Cys Phe Gln Asn Ser Ser Ser Lys Ile Ser Ser Glu Phe Thr
165 170 175
Tyr Ala Trp Ser Val Glu Asp Asn Gly Thr Gln Glu Thr Leu Ile Ser
180 185 190
Gln Asn His Leu Ile Ser Asn Ser Thr Leu Leu Lys Asp Arg Val Lys
195 200 205
Leu Gly Thr Asp Tyr Arg Leu His Leu Ser Pro Val Gln Ile Phe Asp
210 215 220
Asp Gly Arg Lys Phe Ser Cys His Ile Arg Val Gly Pro Asn Lys Ile
225 230 235 240
Leu Arg Ser Ser Thr Thr Val Lys Val Phe Ala Lys Pro Glu Ile Pro
245 250 255
Val Ile Val Glu Asn Asn Ser Thr Asp Val Leu Val Glu Arg Arg Phe
260 265 270
Thr Cys Leu Leu Lys Asn Val Phe Pro Lys Ala Asn Ile Thr Trp Phe
275 280 285
Ile Asp Gly Ser Phe Leu His Asp Glu Lys Glu Gly Ile Tyr Ile Thr
290 295 300
Asn Glu Glu Arg Lys Gly Lys Asp Gly Phe Leu Glu Leu Lys Ser Val
305 310 315 320
Leu Thr Arg Val His Ser Asn Lys Pro Ala Gln Ser Asp Asn Leu Thr
325 330 335
Ile Trp Cys Met Ala Leu Ser Pro Val Pro Gly Asn Lys Val Trp Asn
340 345 350
Ile Ser Ser Glu Lys Ile Thr Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ile Ser Ser
355 360 365
Thr Asp Pro Pro Leu Ser Val Thr Glu Ser Thr Leu Asp Thr Gln Pro
370 375 380
Ser Pro Ala Ser Ser Val Ser Pro Ala Arg Tyr Pro Ala Thr Ser Ser
385 390 395 400
Val Thr Leu Val Asp Val Ser Ala Leu Arg Pro Asn Thr Thr Pro Gln
405 410 415
Pro Ser Asn Ser Ser Met Thr Thr Arg Gly Phe Asn Tyr Pro Trp Thr
420 425 430
Ser Ser Gly Thr Asp Thr Lys Lys Ser Val Ser Arg Ile Pro Ser Glu
435 440 445
Thr Tyr Ser Ser Ser Pro Ser Gly Ala Gly Ser Thr Leu His Asp Asn
450 455 460
Val Phe Thr Ser Thr Ala Arg Ala Phe Ser Glu Val Pro Thr Thr Ala
465 470 475 480
Asn Gly Ser Thr Lys Thr Asn His Val His Ile Thr Gly Ile Val Val
485 490 495
Asn Lys Pro Lys Asp Gly Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
500 505 510
<210> 2
<211> 734
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD96胞外区和mIgG2a Fc的融合蛋白序列
<400> 2
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Val Trp Glu Lys Thr Val Asn Thr Glu Glu Asn Val Tyr
20 25 30
Ala Thr Leu Gly Ser Asp Val Asn Leu Thr Cys Gln Thr Gln Thr Val
35 40 45
Gly Phe Phe Val Gln Met Gln Trp Ser Lys Val Thr Asn Lys Ile Asp
50 55 60
Leu Ile Ala Val Tyr His Pro Gln Tyr Gly Phe Tyr Cys Ala Tyr Gly
65 70 75 80
Arg Pro Cys Glu Ser Leu Val Thr Phe Thr Glu Thr Pro Glu Asn Gly
85 90 95
Ser Lys Trp Thr Leu His Leu Arg Asn Met Ser Cys Ser Val Ser Gly
100 105 110
Arg Tyr Glu Cys Met Leu Val Leu Tyr Pro Glu Gly Ile Gln Thr Lys
115 120 125
Ile Tyr Asn Leu Leu Ile Gln Thr His Val Thr Ala Asp Glu Trp Asn
130 135 140
Ser Asn His Thr Ile Glu Ile Glu Ile Asn Gln Thr Leu Glu Ile Pro
145 150 155 160
Cys Phe Gln Asn Ser Ser Ser Lys Ile Ser Ser Glu Phe Thr Tyr Ala
165 170 175
Trp Ser Val Glu Asp Asn Gly Thr Gln Glu Thr Leu Ile Ser Gln Asn
180 185 190
His Leu Ile Ser Asn Ser Thr Leu Leu Lys Asp Arg Val Lys Leu Gly
195 200 205
Thr Asp Tyr Arg Leu His Leu Ser Pro Val Gln Ile Phe Asp Asp Gly
210 215 220
Arg Lys Phe Ser Cys His Ile Arg Val Gly Pro Asn Lys Ile Leu Arg
225 230 235 240
Ser Ser Thr Thr Val Lys Val Phe Ala Lys Pro Glu Ile Pro Val Ile
245 250 255
Val Glu Asn Asn Ser Thr Asp Val Leu Val Glu Arg Arg Phe Thr Cys
260 265 270
Leu Leu Lys Asn Val Phe Pro Lys Ala Asn Ile Thr Trp Phe Ile Asp
275 280 285
Gly Ser Phe Leu His Asp Glu Lys Glu Gly Ile Tyr Ile Thr Asn Glu
290 295 300
Glu Arg Lys Gly Lys Asp Gly Phe Leu Glu Leu Lys Ser Val Leu Thr
305 310 315 320
Arg Val His Ser Asn Lys Pro Ala Gln Ser Asp Asn Leu Thr Ile Trp
325 330 335
Cys Met Ala Leu Ser Pro Val Pro Gly Asn Lys Val Trp Asn Ile Ser
340 345 350
Ser Glu Lys Ile Thr Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ile Ser Ser Thr Asp
355 360 365
Pro Pro Leu Ser Val Thr Glu Ser Thr Leu Asp Thr Gln Pro Ser Pro
370 375 380
Ala Ser Ser Val Ser Pro Ala Arg Tyr Pro Ala Thr Ser Ser Val Thr
385 390 395 400
Leu Val Asp Val Ser Ala Leu Arg Pro Asn Thr Thr Pro Gln Pro Ser
405 410 415
Asn Ser Ser Met Thr Thr Arg Gly Phe Asn Tyr Pro Trp Thr Ser Ser
420 425 430
Gly Thr Asp Thr Lys Lys Ser Val Ser Arg Ile Pro Ser Glu Thr Tyr
435 440 445
Ser Ser Ser Pro Ser Gly Ala Gly Ser Thr Leu His Asp Asn Val Phe
450 455 460
Thr Ser Thr Ala Arg Ala Phe Ser Glu Val Pro Thr Thr Ala Asn Gly
465 470 475 480
Ser Thr Lys Thr Asn His Val His Ile Thr Gly Ile Val Val Asn Lys
485 490 495
Pro Lys Asp Gly Met Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro
500 505 510
Pro Cys Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
515 520 525
Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro
530 535 540
Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val
545 550 555 560
Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr
565 570 575
Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala
580 585 590
Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys
595 600 605
Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser
610 615 620
Lys Pro Lys Gly Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro
625 630 635 640
Pro Glu Glu Glu Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val
645 650 655
Thr Asp Phe Met Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly
660 665 670
Lys Thr Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp
675 680 685
Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp
690 695 700
Val Glu Arg Asn Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His
705 710 715 720
Asn His His Thr Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys
725 730
<210> 3
<211> 569
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 全长CD96序列
<400> 3
Met Glu Lys Lys Trp Lys Tyr Cys Ala Val Tyr Tyr Ile Ile Gln Ile
1 5 10 15
His Phe Val Lys Gly Val Trp Glu Lys Thr Val Asn Thr Glu Glu Asn
20 25 30
Val Tyr Ala Thr Leu Gly Ser Asp Val Asn Leu Thr Cys Gln Thr Gln
35 40 45
Thr Val Gly Phe Phe Val Gln Met Gln Trp Ser Lys Val Thr Asn Lys
50 55 60
Ile Asp Leu Ile Ala Val Tyr His Pro Gln Tyr Gly Phe Tyr Cys Ala
65 70 75 80
Tyr Gly Arg Pro Cys Glu Ser Leu Val Thr Phe Thr Glu Thr Pro Glu
85 90 95
Asn Gly Ser Lys Trp Thr Leu His Leu Arg Asn Met Ser Cys Ser Val
100 105 110
Ser Gly Arg Tyr Glu Cys Met Leu Val Leu Tyr Pro Glu Gly Ile Gln
115 120 125
Thr Lys Ile Tyr Asn Leu Leu Ile Gln Thr His Val Thr Ala Asp Glu
130 135 140
Trp Asn Ser Asn His Thr Ile Glu Ile Glu Ile Asn Gln Thr Leu Glu
145 150 155 160
Ile Pro Cys Phe Gln Asn Ser Ser Ser Lys Ile Ser Ser Glu Phe Thr
165 170 175
Tyr Ala Trp Ser Val Glu Asp Asn Gly Thr Gln Glu Thr Leu Ile Ser
180 185 190
Gln Asn His Leu Ile Ser Asn Ser Thr Leu Leu Lys Asp Arg Val Lys
195 200 205
Leu Gly Thr Asp Tyr Arg Leu His Leu Ser Pro Val Gln Ile Phe Asp
210 215 220
Asp Gly Arg Lys Phe Ser Cys His Ile Arg Val Gly Pro Asn Lys Ile
225 230 235 240
Leu Arg Ser Ser Thr Thr Val Lys Val Phe Ala Lys Pro Glu Ile Pro
245 250 255
Val Ile Val Glu Asn Asn Ser Thr Asp Val Leu Val Glu Arg Arg Phe
260 265 270
Thr Cys Leu Leu Lys Asn Val Phe Pro Lys Ala Asn Ile Thr Trp Phe
275 280 285
Ile Asp Gly Ser Phe Leu His Asp Glu Lys Glu Gly Ile Tyr Ile Thr
290 295 300
Asn Glu Glu Arg Lys Gly Lys Asp Gly Phe Leu Glu Leu Lys Ser Val
305 310 315 320
Leu Thr Arg Val His Ser Asn Lys Pro Ala Gln Ser Asp Asn Leu Thr
325 330 335
Ile Trp Cys Met Ala Leu Ser Pro Val Pro Gly Asn Lys Val Trp Asn
340 345 350
Ile Ser Ser Glu Lys Ile Thr Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ile Ser Ser
355 360 365
Thr Asp Pro Pro Leu Ser Val Thr Glu Ser Thr Leu Asp Thr Gln Pro
370 375 380
Ser Pro Ala Ser Ser Val Ser Pro Ala Arg Tyr Pro Ala Thr Ser Ser
385 390 395 400
Val Thr Leu Val Asp Val Ser Ala Leu Arg Pro Asn Thr Thr Pro Gln
405 410 415
Pro Ser Asn Ser Ser Met Thr Thr Arg Gly Phe Asn Tyr Pro Trp Thr
420 425 430
Ser Ser Gly Thr Asp Thr Lys Lys Ser Val Ser Arg Ile Pro Ser Glu
435 440 445
Thr Tyr Ser Ser Ser Pro Ser Gly Ala Gly Ser Thr Leu His Asp Asn
450 455 460
Val Phe Thr Ser Thr Ala Arg Ala Phe Ser Glu Val Pro Thr Thr Ala
465 470 475 480
Asn Gly Ser Thr Lys Thr Asn His Val His Ile Thr Gly Ile Val Val
485 490 495
Asn Lys Pro Lys Asp Gly Met Ser Trp Pro Val Ile Val Ala Ala Leu
500 505 510
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515 520 525
Gln Tyr Gln Lys Glu Ile Met Glu Arg Pro Pro Pro Phe Lys Pro Pro
530 535 540
Pro Pro Pro Ile Lys Tyr Thr Cys Ile Gln Glu Pro Asn Glu Ser Asp
545 550 555 560
Leu Pro Tyr His Glu Met Glu Thr Leu
565
<210> 4
<211> 509
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 带His标签的CD96胞外区
<400> 4
Met Glu Lys Lys Trp Lys Tyr Cys Ala Val Tyr Tyr Ile Ile Gln Ile
1 5 10 15
His Phe Val Lys Gly Val Trp Glu Lys Thr Val Asn Thr Glu Glu Asn
20 25 30
Val Tyr Ala Thr Leu Gly Ser Asp Val Asn Leu Thr Cys Gln Thr Gln
35 40 45
Thr Val Gly Phe Phe Val Gln Met Gln Trp Ser Lys Val Thr Asn Lys
50 55 60
Ile Asp Leu Ile Ala Val Tyr His Pro Gln Tyr Gly Phe Tyr Cys Ala
65 70 75 80
Tyr Gly Arg Pro Cys Glu Ser Leu Val Thr Phe Thr Glu Thr Pro Glu
85 90 95
Asn Gly Ser Lys Trp Thr Leu His Leu Arg Asn Met Ser Cys Ser Val
100 105 110
Ser Gly Arg Tyr Glu Cys Met Leu Val Leu Tyr Pro Glu Gly Ile Gln
115 120 125
Thr Lys Ile Tyr Asn Leu Leu Ile Gln Thr His Val Thr Ala Asp Glu
130 135 140
Trp Asn Ser Asn His Thr Ile Glu Ile Glu Ile Asn Gln Thr Leu Glu
145 150 155 160
Ile Pro Cys Phe Gln Asn Ser Ser Ser Lys Ile Ser Ser Glu Phe Thr
165 170 175
Tyr Ala Trp Ser Val Glu Asp Asn Gly Thr Gln Glu Thr Leu Ile Ser
180 185 190
Gln Asn His Leu Ile Ser Asn Ser Thr Leu Leu Lys Asp Arg Val Lys
195 200 205
Leu Gly Thr Asp Tyr Arg Leu His Leu Ser Pro Val Gln Ile Phe Asp
210 215 220
Asp Gly Arg Lys Phe Ser Cys His Ile Arg Val Gly Pro Asn Lys Ile
225 230 235 240
Leu Arg Ser Ser Thr Thr Val Lys Val Phe Ala Lys Pro Glu Ile Pro
245 250 255
Val Ile Val Glu Asn Asn Ser Thr Asp Val Leu Val Glu Arg Arg Phe
260 265 270
Thr Cys Leu Leu Lys Asn Val Phe Pro Lys Ala Asn Ile Thr Trp Phe
275 280 285
Ile Asp Gly Ser Phe Leu His Asp Glu Lys Glu Gly Ile Tyr Ile Thr
290 295 300
Asn Glu Glu Arg Lys Gly Lys Asp Gly Phe Leu Glu Leu Lys Ser Val
305 310 315 320
Leu Thr Arg Val His Ser Asn Lys Pro Ala Gln Ser Asp Asn Leu Thr
325 330 335
Ile Trp Cys Met Ala Leu Ser Pro Val Pro Gly Asn Lys Val Trp Asn
340 345 350
Ile Ser Ser Glu Lys Ile Thr Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ile Ser Ser
355 360 365
Thr Asp Pro Pro Leu Ser Val Thr Glu Ser Thr Leu Asp Thr Gln Pro
370 375 380
Ser Pro Ala Ser Ser Val Ser Pro Ala Arg Tyr Pro Ala Thr Ser Ser
385 390 395 400
Val Thr Leu Val Asp Val Ser Ala Leu Arg Pro Asn Thr Thr Pro Gln
405 410 415
Pro Ser Asn Ser Ser Met Thr Thr Arg Gly Phe Asn Tyr Pro Trp Thr
420 425 430
Ser Ser Gly Thr Asp Thr Lys Lys Ser Val Ser Arg Ile Pro Ser Glu
435 440 445
Thr Tyr Ser Ser Ser Pro Ser Gly Ala Gly Ser Thr Leu His Asp Asn
450 455 460
Val Phe Thr Ser Thr Ala Arg Ala Phe Ser Glu Val Pro Thr Thr Ala
465 470 475 480
Asn Gly Ser Thr Lys Thr Asn His Val His Ile Thr Gly Ile Val Val
485 490 495
Asn Lys Pro Lys Asp Gly Met His His His His His His
500 505
<210> 5
<211> 733
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD96胞外区和hIgG1Fc的融合蛋白
<400> 5
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Val Trp Glu Lys Thr Val Asn Thr Glu Glu Asn Val Tyr
20 25 30
Ala Thr Leu Gly Ser Asp Val Asn Leu Thr Cys Gln Thr Gln Thr Val
35 40 45
Gly Phe Phe Val Gln Met Gln Trp Ser Lys Val Thr Asn Lys Ile Asp
50 55 60
Leu Ile Ala Val Tyr His Pro Gln Tyr Gly Phe Tyr Cys Ala Tyr Gly
65 70 75 80
Arg Pro Cys Glu Ser Leu Val Thr Phe Thr Glu Thr Pro Glu Asn Gly
85 90 95
Ser Lys Trp Thr Leu His Leu Arg Asn Met Ser Cys Ser Val Ser Gly
100 105 110
Arg Tyr Glu Cys Met Leu Val Leu Tyr Pro Glu Gly Ile Gln Thr Lys
115 120 125
Ile Tyr Asn Leu Leu Ile Gln Thr His Val Thr Ala Asp Glu Trp Asn
130 135 140
Ser Asn His Thr Ile Glu Ile Glu Ile Asn Gln Thr Leu Glu Ile Pro
145 150 155 160
Cys Phe Gln Asn Ser Ser Ser Lys Ile Ser Ser Glu Phe Thr Tyr Ala
165 170 175
Trp Ser Val Glu Asp Asn Gly Thr Gln Glu Thr Leu Ile Ser Gln Asn
180 185 190
His Leu Ile Ser Asn Ser Thr Leu Leu Lys Asp Arg Val Lys Leu Gly
195 200 205
Thr Asp Tyr Arg Leu His Leu Ser Pro Val Gln Ile Phe Asp Asp Gly
210 215 220
Arg Lys Phe Ser Cys His Ile Arg Val Gly Pro Asn Lys Ile Leu Arg
225 230 235 240
Ser Ser Thr Thr Val Lys Val Phe Ala Lys Pro Glu Ile Pro Val Ile
245 250 255
Val Glu Asn Asn Ser Thr Asp Val Leu Val Glu Arg Arg Phe Thr Cys
260 265 270
Leu Leu Lys Asn Val Phe Pro Lys Ala Asn Ile Thr Trp Phe Ile Asp
275 280 285
Gly Ser Phe Leu His Asp Glu Lys Glu Gly Ile Tyr Ile Thr Asn Glu
290 295 300
Glu Arg Lys Gly Lys Asp Gly Phe Leu Glu Leu Lys Ser Val Leu Thr
305 310 315 320
Arg Val His Ser Asn Lys Pro Ala Gln Ser Asp Asn Leu Thr Ile Trp
325 330 335
Cys Met Ala Leu Ser Pro Val Pro Gly Asn Lys Val Trp Asn Ile Ser
340 345 350
Ser Glu Lys Ile Thr Phe Leu Leu Gly Ser Glu Ile Ser Ser Thr Asp
355 360 365
Pro Pro Leu Ser Val Thr Glu Ser Thr Leu Asp Thr Gln Pro Ser Pro
370 375 380
Ala Ser Ser Val Ser Pro Ala Arg Tyr Pro Ala Thr Ser Ser Val Thr
385 390 395 400
Leu Val Asp Val Ser Ala Leu Arg Pro Asn Thr Thr Pro Gln Pro Ser
405 410 415
Asn Ser Ser Met Thr Thr Arg Gly Phe Asn Tyr Pro Trp Thr Ser Ser
420 425 430
Gly Thr Asp Thr Lys Lys Ser Val Ser Arg Ile Pro Ser Glu Thr Tyr
435 440 445
Ser Ser Ser Pro Ser Gly Ala Gly Ser Thr Leu His Asp Asn Val Phe
450 455 460
Thr Ser Thr Ala Arg Ala Phe Ser Glu Val Pro Thr Thr Ala Asn Gly
465 470 475 480
Ser Thr Lys Thr Asn His Val His Ile Thr Gly Ile Val Val Asn Lys
485 490 495
Pro Lys Asp Gly Met Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr Cys
500 505 510
Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu
515 520 525
Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu
530 535 540
Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys
545 550 555 560
Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys
565 570 575
Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu
580 585 590
Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys
595 600 605
Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys
610 615 620
Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser
625 630 635 640
Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys
645 650 655
Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln
660 665 670
Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly
675 680 685
Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln
690 695 700
Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn
705 710 715 720
His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
725 730
<210> 6
<211> 119
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1718 VH
<400> 6
Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Ala Tyr Ser Ile Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Ser Tyr Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Gln Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Gln Leu Arg Leu Pro Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly
100 105 110
Thr Thr Val Ile Val Ser Ser
115
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1718 VL
<400> 7
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Met Tyr Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
65 70 75 80
Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Lys Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 122
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1719VH
<400> 8
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr His Ser Val Leu Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Arg Lys Asp Asp Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Asn Asn Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Gly Tyr Pro Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
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<210> 9
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1719VL
<400> 9
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Thr Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly His Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Glu Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Val Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val Glu Leu Arg
100 105
<210> 10
<211> 119
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1720VH
<400> 10
Glu Phe Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Ala Tyr Ser Leu Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ser Asn Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Ser Tyr Gly Ile Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Gln Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
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Ala Arg Gln Leu Arg Leu Pro Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Thr Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 11
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1720VL
<400> 11
Asp Ile Lys Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Lys Asn Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Ser Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Tyr
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Glu Asp Met Gly Ile Tyr Tyr Cys Leu Lys Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
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<211> 122
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1721VH
<400> 12
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
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Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ile Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asp Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Asn Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Asn Tyr Phe Tyr Gly Ser Arg Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Ser Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Ile Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 13
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
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35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ile Glu Thr Val Ala Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
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65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Ser Phe Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 14
<211> 117
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
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<400> 14
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asn Thr Phe Ile Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
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<211> 106
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1722VL
<400> 15
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Ile Met Ser Ala Phe Pro Gly
1 5 10 15
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20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Phe
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 16
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1718 HCDR1
<400> 16
Asp Tyr Asn Met Asn
1 5
<210> 17
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1718 HCDR2
<400> 17
Val Ile Asn Pro Ser Tyr Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 18
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1718 HCDR3
<400> 18
Gln Leu Arg Leu Pro Gly Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1718 LCDR1
<400> 19
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 20
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1718 LCDR2
<400> 20
Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp
1 5
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1718 LCDR3
<400> 21
Leu Lys Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr Phe
1 5 10
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1719 HCDR1
<400> 22
Ser Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 23
<211> 16
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1719 HCDR2
<400> 23
Val Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr His Ser Val Leu Ile Ser
1 5 10 15
<210> 24
<211> 14
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1719 HCDR3
<400> 24
Asn Asn Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Gly Tyr Pro Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 25
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1719 LCDR1
<400> 25
Lys Ala Thr Gln Asp Val Gly Thr Ala Val Ala
1 5 10
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1719 LCDR2
<400> 26
Trp Ala Ser Thr Arg His Thr
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1719 LCDR3
<400> 27
Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Val Leu Thr
1 5
<210> 28
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1720 HCDR1
<400> 28
Asp Tyr Asn Met Asn
1 5
<210> 29
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1720 HCDR2
<400> 29
Val Ile Asn Pro Ser Tyr Gly Ile Ser Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 30
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1720 HCDR3
<400> 30
Gln Leu Arg Leu Pro Gly Tyr Phe Asp Val
1 5 10
<210> 31
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1720 LCDR1
<400> 31
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ser Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1720 LCDR2
<400> 32
Arg Ala Ser Arg Leu Val Asp
1 5
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1720 LCDR3
<400> 33
Leu Lys Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr Thr Phe
1 5 10
<210> 34
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1721 HCDR1
<400> 34
Ser Tyr Gly Val Asn
1 5
<210> 35
<211> 16
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1721 HCDR2
<400> 35
Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile Ser
1 5 10 15
<210> 36
<211> 14
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1721 HCDR3
<400> 36
Asn Tyr Phe Tyr Gly Ser Arg Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Ser
1 5 10
<210> 37
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1721 LCDR1
<400> 37
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Ser Leu Ala
1 5 10
<210> 38
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1721 LCDR2
<400> 38
Asn Ala Lys Thr Leu Ile Glu
1 5
<210> 39
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1721 LCDR3
<400> 39
Gln His His Tyr Gly Thr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1722 HCDR1
<400> 40
Asp Tyr Trp Met His
1 5
<210> 41
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1722 HCDR2
<400> 41
Met Leu His Pro Asn Ser Gly Thr Thr Ser Phe Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ile
<210> 42
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1722 HCDR3
<400> 42
Asp Tyr Ser Gly Pro Phe Ala Tyr
1 5
<210> 43
<211> 10
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1722 LCDR1
<400> 43
Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Ile His
1 5 10
<210> 44
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1722 LCDR2
<400> 44
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser
1 5
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> m1722 LCDR3
<400> 45
Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Leu Thr
1 5
<210> 46
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1718-001VH-CDR graft
<400> 46
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Ser Tyr Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Leu Arg Leu Pro Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 47
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1718-001VL-CDR graft
<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Lys Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 48
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1718-VL2
<400> 48
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Lys Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 49
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1718-VH2
<400> 49
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Ser Tyr Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gln Leu Arg Leu Pro Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 50
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1718-VH3
<400> 50
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Ser Tyr Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Gln Leu Arg Leu Pro Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 51
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1718-VH4
<400> 51
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Ile Thr Asp Tyr
20 25 30
Asn Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asn Pro Ser Tyr Gly Ile Thr Asp Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Val Thr Ile Thr Val Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ile Gln Leu Arg Leu Pro Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 52
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1718-VL CDR1序列通式
<220>
<221> UNSURE
<222> (8)..(8)
<223> The 'Xaa' at location 8 stands for Asn, Thr, Leu or Gln.
<400> 52
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Xaa Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 53
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1718.VL1a
<400> 53
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Gln Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Lys Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 54
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1718.VL1b
<400> 54
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Lys Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 55
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1718.VL1c
<400> 55
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Leu Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Ser Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Lys Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 56
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1718.VL2a
<400> 56
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Gln Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Lys Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 57
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1718.VL2b
<400> 57
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Lys Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1718.VL2c
<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Leu Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Thr Leu Ile
35 40 45
Tyr Arg Ala Asn Arg Leu Val Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Gln Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Lys Tyr Asp Glu Phe Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 59
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> HRP00721VH-CDR graft
<400> 59
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Ala Val Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr His Ser Val Leu Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Asn Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Gly Tyr Pro Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 60
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> HRP00721VL-CDR graft
<400> 60
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Thr Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Val Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 61
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1719-VL2
<400> 61
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Thr Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Glu Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Val Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 62
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1719-VH2
<400> 62
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Ala Val Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr His Ser Val Leu Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Asn Asn Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Gly Tyr Pro Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 63
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1719-VH3
<400> 63
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr His Ser Val Leu Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Leu Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Asn Asn Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Gly Tyr Pro Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 64
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1719-VH CDR3通式
<220>
<221> UNSURE
<222> (1)..(1)
<223> The 'Xaa' at location 1 stands for Gln or Asn.
<220>
<221> UNSURE
<222> (2)..(2)
<223> The 'Xaa' at location 2 stands for Gln, Asn, or Tyr.
<220>
<221> UNSURE
<222> (12)..(12)
<223> The 'Xaa' at location 12 stands for Met, Leu, or Ile.
<400> 64
Xaa Xaa Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Gly Tyr Pro Xaa Asp Tyr
1 5 10
<210> 65
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1719.VH3a
<400> 65
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr His Ser Val Leu Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Leu Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gln Asn Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Gly Tyr Pro Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 66
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1719.VH3b
<400> 66
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr His Ser Val Leu Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Leu Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Asn Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Gly Tyr Pro Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 67
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1719.VH3c
<400> 67
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr His Ser Val Leu Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Leu Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Asn Gln Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Gly Tyr Pro Leu Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 68
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1719.VH3d
<400> 68
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr His Ser Val Leu Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Leu Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Gln Asn Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Gly Tyr Pro Ile Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 69
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1719.VH3e
<400> 69
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr His Ser Val Leu Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Leu Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Asn Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Gly Tyr Pro Ile Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 70
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1719.VH3f
<400> 70
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr His Ser Val Leu Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Leu Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Asn Gln Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Gly Tyr Pro Ile Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 71
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1721-001 VH-CDR graft
<400> 71
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Ala Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Asn Tyr Phe Tyr Gly Ser Arg Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Ser Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 72
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1721-001 VL-CDR graft
<400> 72
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ile Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 73
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1721-VL2
<400> 73
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ile Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 74
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1721-VL3
<400> 74
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Ser
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ile Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 75
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1721-VH2
<400> 75
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Asn Tyr Phe Tyr Gly Ser Arg Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Ser Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 76
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1721-VH3
<400> 76
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Leu Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Asn Tyr Phe Tyr Gly Ser Arg Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Ser Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 77
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1721-VH4
<400> 77
Glu Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu
1 5 10 15
Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu
65 70 75 80
Thr Leu Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Asn Tyr Phe Tyr Gly Ser Arg Tyr Gly Tyr Ala Met Asp Ser Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 78
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1722-001 VH-CDR graft
<400> 78
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Met Leu His Pro Asn Ser Gly Thr Thr Ser Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ile Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Asp Tyr Ser Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 79
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1722-001 VL-CDR graft
<400> 79
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 80
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1722-VL2
<400> 80
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 81
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1722-VL3
<400> 81
Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Asn Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Phe
35 40 45
Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu
65 70 75 80
Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Arg Ser Asn Pro Leu Thr
85 90 95
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 82
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1722-VH2
<400> 82
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Leu His Pro Asn Ser Gly Thr Thr Ser Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ile Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Asp Tyr Ser Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 83
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1722-VH3
<400> 83
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Leu His Pro Asn Ser Gly Thr Thr Ser Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ile Arg Val Thr Ile Thr Ile Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Asp Tyr Ser Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 84
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1722-VH4
<400> 84
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asn Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Leu His Pro Asn Ser Gly Thr Thr Ser Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ile Arg Thr Thr Ile Thr Ile Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Asp Tyr Ser Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 85
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD96 胞外区17-36位多肽序列
<400> 85
Gly Ser Asp Val Asn Leu Thr Cys Gln Thr Gln Thr Val Gly Phe Phe
1 5 10 15
Val Gln Met Gln
20
<210> 86
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD96 胞外区32-51位多肽序列
<400> 86
Phe Val Gln Met Gln Trp Ser Lys Val Thr Asn Lys Ile Asp Leu Ile
1 5 10 15
Ala Val Tyr His
20
<210> 87
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD96 胞外区47-66位多肽序列
<400> 87
Ile Ala Val Tyr His Pro Gln Tyr Gly Phe Tyr Cys Ala Tyr Gly Arg
1 5 10 15
Pro Cys Glu Ser
20
<210> 88
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD96 胞外区62-81位多肽序列
<400> 88
Arg Pro Cys Glu Ser Leu Val Thr Phe Thr Glu Thr Pro Glu Asn Gly
1 5 10 15
Ser Lys Trp Thr
20
<210> 89
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD96 胞外区77-86位多肽序列
<400> 89
Gly Ser Lys Trp Thr Leu His Leu Arg Asn Met Ser Cys Ser Val Ser
1 5 10 15
Gly Arg Tyr Glu
20
<210> 90
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD96 胞外区92-111位多肽序列
<400> 90
Ser Gly Arg Tyr Glu Cys Met Leu Val Leu Tyr Pro Glu Gly Ile Gln
1 5 10 15
Thr Lys Ile Tyr
20
<210> 91
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD96 胞外区107-126位多肽序列
<400> 91
Gln Thr Lys Ile Tyr Asn Leu Leu Ile Gln Thr His Val Thr Ala Asp
1 5 10 15
Glu Trp Asn Ser
20
<210> 92
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD96 胞外区122-141位多肽序列
<400> 92
Asp Glu Trp Asn Ser Asn His Thr Ile Glu Ile Glu Ile Asn Gln Thr
1 5 10 15
Leu Glu Ile Pro
20
<210> 93
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD96 胞外区137-156位多肽序列
<400> 93
Thr Leu Glu Ile Pro Cys Phe Gln Asn Ser Ser Ser Lys Ile Ser Ser
1 5 10 15
Glu Phe Thr Tyr
20
<210> 94
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD96 胞外区149-170位多肽序列
<400> 94
Lys Ile Ser Ser Glu Phe Thr Tyr Ala Trp Ser Val Glu Asp Asn Gly
1 5 10 15
Thr Gln Glu Thr Leu Ile
20
<210> 95
<211> 523
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<400> 95
Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Leu Phe Leu Val Ala Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Val Trp Gly Lys Pro Phe Asn Thr Glu Glu Asn Ile Tyr
20 25 30
Ala Thr Leu Gly Ser Asp Val Asn Leu Thr Cys Gln Thr Gln Ala Lys
35 40 45
Gly Phe Leu Val Gln Met Gln Trp Ser Lys Val Thr Asp Lys Ala Asp
50 55 60
Leu Ile Ala Leu Tyr His Pro Gln Tyr Gly Phe His Cys Ala Tyr Gly
65 70 75 80
Ser Pro Cys Glu Ser Leu Val Thr Phe Thr Gln Thr Pro Glu Asn Gly
85 90 95
Ser Lys Trp Thr Leu His Leu Arg Asn Met Ser Ser Ser Val Ser Gly
100 105 110
Arg Tyr Glu Cys Met Leu Thr Leu Tyr Pro Glu Gly Met Gln Thr Lys
115 120 125
Ile Tyr Asn Leu Leu Ile Gln Thr His Val Thr Pro Asp Glu Trp Lys
130 135 140
Ser Asn His Thr Ile Glu Ile Glu Ile Asn Gln Thr Leu Glu Ile Pro
145 150 155 160
Cys Phe Gln Asn Ser Ser Ser Glu Ile Ser Ser Glu Phe Thr Tyr Ala
165 170 175
Trp Leu Val Glu Asp Asn Gly Thr Gln Gln Thr Leu Ile Ser Gln Asp
180 185 190
His Leu Ile Ser Ser Ser Thr Leu Leu Lys Asp Arg Val Lys Val Gly
195 200 205
Ile Asp Tyr Arg Leu His Leu Ser Pro Val Gln Ile Phe Asp Asp Gly
210 215 220
Arg Lys Phe Ser Cys His Ile Arg Val Gly Pro Asp Lys Ile Leu Arg
225 230 235 240
Ser Ser Thr Thr Ile Lys Val Phe Ala Lys Pro Glu Ile Pro Met Ile
245 250 255
Val Glu Asn Asn Ser Thr Asp Val Leu Val Glu Arg Thr Phe Thr Cys
260 265 270
Leu Leu Lys Asn Val Phe Pro Lys Ala Asn Ile Ile Trp Phe Ile Asp
275 280 285
Gly Ser Phe Leu His Asp Glu Lys Glu Gly Ile Tyr Ile Thr Asn Glu
290 295 300
Glu Arg Lys Gly Lys Asp Gly Phe Leu Glu Leu Lys Ser Val Leu Thr
305 310 315 320
Arg Val His Ser Asp Lys Pro Ala Gln Ser Asp Asn Leu Thr Ile Trp
325 330 335
Cys Met Ala Leu Ser Pro Val Pro Gly Asn Lys Val Trp Asn Ile Ser
340 345 350
Ser Glu Lys Ile Thr Phe Leu Leu Gly Ser Glu Met Ser Thr Thr Asp
355 360 365
Leu Pro Pro Ser Val Thr Glu Ser Thr Leu Asp Thr Gln Pro Ser Pro
370 375 380
Ala Ser Ser Val Ser Pro Thr Arg Tyr Pro Ala Thr Ser Ser Val Thr
385 390 395 400
Leu Ala Asp Val Ser Ala Leu Arg Pro Asn Thr Thr Pro Gln Ser Ser
405 410 415
Ser Ser Ser Val Thr Thr Gln Asp Phe Asn Tyr Pro Trp Thr Ser Ser
420 425 430
Gly Thr Asp Ala Lys Lys Ser Phe Ser Gln Ile Pro Ser Glu Thr Tyr
435 440 445
Ser Ser Ser Pro Ser Gly Ala Gly Ser Thr Leu His Asp Asn Val Phe
450 455 460
Thr Ser Thr Thr Arg Ala Leu Ser Glu Val Pro Thr Thr Ala Asn Gly
465 470 475 480
Ser Thr Lys Thr Asn His Val His Ile Thr Gly Ile Val Val Ser Lys
485 490 495
Pro Lys Asp Gly Met Asp Tyr Lys Asp His Asp Gly Asp Tyr Lys Asp
500 505 510
His Asp Ile Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
515 520
<210> 96
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD96 胞外区166-185位多肽序列
<400> 96
Gln Glu Thr Leu Ile Ser Gln Asn His Leu Ile Ser Asn Ser Thr Leu
1 5 10 15
Leu Lys Asp Arg
20
<210> 97
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD96 胞外区181-200位多肽序列
<400> 97
Leu Leu Lys Asp Arg Val Lys Leu Gly Thr Asp Tyr Arg Leu His Leu
1 5 10 15
Ser Pro Val Gln
20
<210> 98
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD96 胞外区196-215位多肽序列
<400> 98
Leu Ser Pro Val Gln Ile Phe Asp Asp Gly Arg Lys Phe Ser Cys His
1 5 10 15
Ile Arg Val Gly
20
<210> 99
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD96 胞外区211-230位多肽序列
<400> 99
His Ile Arg Val Gly Pro Asn Lys Ile Leu Arg Ser Ser Thr Thr Val
1 5 10 15
Lys Val Phe Ala
20
<210> 100
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD96 胞外区220-239位多肽序列
<400> 100
Leu Arg Ser Ser Thr Thr Val Lys Val Phe Ala Lys Pro Glu Ile Pro
1 5 10 15
Val Ile Val Glu
20
<210> 101
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD96 胞外区235-254位多肽序列
<400> 101
Pro Val Ile Val Glu Asn Asn Ser Thr Asp Val Leu Val Glu Arg Arg
1 5 10 15
Phe Thr Cys Leu
20
<210> 102
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD96 胞外区250-269位多肽序列
<400> 102
Arg Phe Thr Cys Leu Leu Lys Asn Val Phe Pro Lys Ala Asn Ile Thr
1 5 10 15
Trp Phe Ile Asp
20
<210> 103
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD96 胞外区265-284位多肽序列
<400> 103
Thr Trp Phe Ile Asp Gly Ser Phe Leu His Asp Glu Lys Glu Gly Ile
1 5 10 15
Tyr Ile Thr Asn
20
<210> 104
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD96 胞外区280-299位多肽序列
<400> 104
Ile Tyr Ile Thr Asn Glu Glu Arg Lys Gly Lys Asp Gly Phe Leu Glu
1 5 10 15
Leu Lys Ser Val
20
<210> 105
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD96 胞外区295-314位多肽序列
<400> 105
Glu Leu Lys Ser Val Leu Thr Arg Val His Ser Asn Lys Pro Ala Gln
1 5 10 15
Ser Asp Asn Leu
20
<210> 106
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD96 胞外区310-329位多肽序列
<400> 106
Gln Ser Asp Asn Leu Thr Ile Trp Cys Met Ala Leu Ser Pro Val Pro
1 5 10 15
Gly Asn Lys Val
20
<210> 107
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD96 胞外区325-344位多肽序列
<400> 107
Pro Gly Asn Lys Val Trp Asn Ile Ser Ser Glu Lys Ile Thr Phe Leu
1 5 10 15
Leu Gly Ser Glu
20
<210> 108
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1718-VL CDR1 突变体
<400> 108
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Gln Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 109
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1718-VL CDR1 突变体
<400> 109
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Thr Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 110
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1718-VL CDR1 突变体
<400> 110
Lys Ala Ser Gln Asp Ile Asn Leu Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 111
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1719-VH CDR3突变体
<400> 111
Gln Asn Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Gly Tyr Pro Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 112
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1719-VH CDR3突变体
<400> 112
Asn Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Gly Tyr Pro Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 113
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1719-VH CDR3突变体
<400> 113
Asn Gln Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Gly Tyr Pro Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 114
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1719-VH CDR3突变体
<400> 114
Gln Asn Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Gly Tyr Pro Ile Asp Tyr
1 5 10
<210> 115
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1719-VH CDR3突变体
<400> 115
Asn Tyr Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Gly Tyr Pro Ile Asp Tyr
1 5 10
<210> 116
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1719-VH CDR3突变体
<400> 116
Asn Gln Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Gly Tyr Pro Ile Asp Tyr
1 5 10
<210> 117
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 重链恒定区
<400> 117
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 118
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 轻链恒定区
<400> 118
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 119
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1722-VH CDR2的序列通式
<220>
<221> DOMAIN
<222> (5)..(5)
<223> Xaa选自Asn,Lys or Gln.
<400> 119
Met Leu His Pro Xaa Ser Gly Thr Thr Ser Phe Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ile
<210> 120
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1722-VH CDR2的突变体
<400> 120
Met Leu His Pro Lys Ser Gly Thr Thr Ser Phe Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ile
<210> 121
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1722-VH CDR2的突变体
<400> 121
Met Leu His Pro Gln Ser Gly Thr Thr Ser Phe Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Ile
<210> 122
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1722-VH2a (N54K)
<400> 122
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Leu His Pro Lys Ser Gly Thr Thr Ser Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ile Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Asp Tyr Ser Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 123
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> h1722-VH2b (N54Q)
<400> 123
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Met Leu His Pro Gln Ser Gly Thr Thr Ser Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Ile Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Ser Asp Tyr Ser Gly Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115

Claims (27)

1.一种单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段特异性结合人CD96，且包含重链可变区和轻链可变区，其中：
所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：16、17和18所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区；
所述轻链可变区包含如SEQ ID NO：20所示的LCDR2，如SEQ ID NO：21所示的LCDR3区，和如SEQ ID NO：108、109、110或19所示的LCDR1区。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中：
所述重链可变区包含分别如SEQ ID NO：16、17和18氨基酸序列所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3区，且所述轻链可变区包含分别如SEQ ID NO：108、20和21氨基酸序列所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3区。
3.如权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段是重组抗体或其抗原结合片段。
4.如权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体为鼠源抗体、嵌合抗体或人源化抗体。
5.如权利要求3所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含：
如SEQ ID NO:50所示的重链可变区和如SEQ ID NO：56所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:50所示的重链可变区和如SEQ ID NO：47所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:50所示的重链可变区和如SEQ ID NO：48所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:50所示的重链可变区和如SEQ ID NO：53所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:50所示的重链可变区和如SEQ ID NO：54所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:50所示的重链可变区和如SEQ ID NO：55所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:50所示的重链可变区和如SEQ ID NO：57所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:50所示的重链可变区和如SEQ ID NO：58所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:46所示的重链可变区和如SEQ ID NO：56所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:46所示的重链可变区和如SEQ ID NO：47所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:46所示的重链可变区和如SEQ ID NO：48所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:46所示的重链可变区和如SEQ ID NO：53所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:46所示的重链可变区和如SEQ ID NO：54所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:46所示的重链可变区和如SEQ ID NO：55所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:46所示的重链可变区和如SEQ ID NO：57所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:46所示的重链可变区和如SEQ ID NO：58所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:49所示的重链可变区和如SEQ ID NO：56所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:49所示的重链可变区和如SEQ ID NO：47所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:49所示的重链可变区和如SEQ ID NO：48所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:49所示的重链可变区和如SEQ ID NO：53所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:49所示的重链可变区和如SEQ ID NO：54所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:49所示的重链可变区和如SEQ ID NO：55所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:49所示的重链可变区和如SEQ ID NO：57所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:49所示的重链可变区和如SEQ ID NO：58所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:51所示的重链可变区和如SEQ ID NO：56所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:51所示的重链可变区和如SEQ ID NO：47所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:51所示的重链可变区和如SEQ ID NO：48所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:51所示的重链可变区和如SEQ ID NO：53所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:51所示的重链可变区和如SEQ ID NO：54所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:51所示的重链可变区和如SEQ ID NO：55所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:51所示的重链可变区和如SEQ ID NO：57所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:51所示的重链可变区和如SEQ ID NO：58所示的轻链可变区；或
如SEQ ID NO:6所示的重链可变区和如SEQ ID NO：7所示的轻链可变区。
6.如权利要求5所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:50所示的重链可变区和如SEQ ID NO：56所示的轻链可变区。
7.如权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为全长抗体，其包括人抗体恒定区。
8.如权利要求7所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:117所示的重链恒定区和如SEQ ID NO:118所示的轻链恒定区。
9.如权利要求7所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含：如SEQ IDNO:50所示的重链可变区和如SEQ ID NO：56所示的轻链可变区，以及如SEQ ID NO:117所示的重链恒定区和如SEQ ID NO:118所示的轻链恒定区。
10.如权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、scFv、双抗体和dsFv。
11.如权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段以通过表面等离子共振(BIACORE)技术所测定的1×10-7M至1×10-12M的KD值的亲和力结合人CD96。
12.如权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其具有以下特征中的至少一种：
i.以如通过表面等离子共振(BIACORE)技术所测定的1×10-7M至1×10-12M的KD值的亲和力结合人CD96；
ii.与食蟹猴或恒河猴CD96交叉反应；
iii.阻断人CD96与人CD155的结合；
iv.增加NK细胞和/或T细胞的活化；
v.阻断由CD96与CD155结合所诱导的NK细胞的活化抑制。
13.如权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体或其抗原结合片段结合人CD96胞外区中如IAVYHPQYGFYCAYGRPCES所示的区域。
14.一种多特异性抗体，其含有如权利要求1至13任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
15.一种单链抗体，其含有如权利要求1至13任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段。
16.一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求1至13任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求14所述的多特异性抗体或权利要求15所述的单链抗体，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或缓冲剂。
17.一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求1至13任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求14所述的多特异性抗体或权利要求15所述的单链抗体，以及一种或多种药学上可接受的赋形剂。
18.一种分离的核酸分子，其编码权利要求1至13任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求14所述的多特异性抗体或权利要求15所述的单链抗体。
19.一种重组载体，其包含权利要求18所述的分离的核酸分子。
20.一种用如权利要求19所述的重组载体转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞。
21.如权利要求20所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为哺乳动物细胞。
22.用于生产如权利要求1至13任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求14所述的多特异性抗体或权利要求15所述的单链抗体的方法，所述方法包括将权利要求20或21所述的宿主细胞在培养基中进行培养以形成并积累权利要求1至13任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求14所述的多特异性抗体或权利要求15所述的单链抗体，以及从培养物回收所述单克隆抗体或其抗原结合片段、所述多特异性抗体或所述单链抗体。
23.如权利要求1至13任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求14所述的多特异性抗体或权利要求15所述的单链抗体在制备用于体外检测或测定人CD96的药物中的应用。
24.如权利要求1至13任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求14所述的多特异性抗体或权利要求15所述的单链抗体在制备用于检测或测定人CD96的试剂中的用途。
25.如权利要求1至13任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求14所述的多特异性抗体或权利要求15所述的单链抗体、权利要求16或17所述的药物组合物、或权利要求18所述的分离的核酸分子在制备减少或缓解免疫抑制的药物中的用途。
26.权利要求1至13任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求14所述的多特异性抗体或权利要求15所述的单链抗体、权利要求16或17所述的药物组合物、或权利要求18所述的分离的核酸分子在制备增强NK细胞活性的药物中的用途。
27.如权利要求1至13任一项所述的单克隆抗体或其抗原结合片段、权利要求14所述的多特异性抗体或权利要求15所述的单链抗体，或权利要求16或17所述的药物组合物，或权利要求18所述的分离的核酸分子或其组合在制备治疗肿瘤或感染性疾病的药物中的用途。
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