CN109983032B

CN109983032B - Tim-3抗体、其抗原结合片段及医药用途

Info

Publication number: CN109983032B
Application number: CN201880004331.9A
Authority: CN
Inventors: 曹卓晓; 付雅媛; 张婷; 陶维康
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co Ltd; Shanghai Hengrui Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2017-02-27
Filing date: 2018-02-26
Publication date: 2022-07-26
Anticipated expiration: 2038-02-26
Also published as: CN109983032A; US11345753B2; WO2018153366A1; TW201831512A; JP2020508658A; US20190375839A1; EP3587452A4; EP3587452A1

Abstract

本发明提供了TIM‑3抗体、其抗原结合片段及医药用途。进一步地，本发明提供了包含所述TIM‑3抗体CDR区的鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，以及包含TIM‑3抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为药物的用途。特别地，本发明提供了一种人源化的TIM‑3抗体在制备用于治疗TIM‑3相关的疾病或病症的药物中的用途。

Description

TIM-3抗体、其抗原结合片段及医药用途

技术领域

本发明涉及TIM-3抗体以及其抗原结合片段，进一步地，本发明还涉及包含所述TIM-3抗体CDR区的嵌合抗体、人源化抗体，本发明还涉及包含所述TIM-3抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为TIM-3相关疾病诊断剂和治疗药物的用途。

背景技术

T细胞免疫球蛋白黏蛋白分子3(T cell immunoglobulinand mucin-domain-containing molecule 3，TIM-3)，又称甲型肝炎病毒细胞受体2(hepatitis A viruscellular receptor 2，HAVCR-2)，是一种I型膜表面蛋白分子，属TIM家族成员。人类TIM-3分子由301个氨基酸组成，包含信号肽、Ig可变区(IgV区)、富含丝氨酸/苏氨酸的黏蛋白区、跨膜区和胞质区，人鼠之间的同源性63％。

TIM-3选择性地表达在分泌IFN-γ的T辅助细胞(Th1和Th17)、T调控细胞(Treg)、树突状细胞(DCs)、单核细胞、肥大细胞、NK细胞、肿瘤浸润性淋巴细胞(TILs)上(see，e.g.，Clayton et al.，J.Immunol.，192(2)：782-791(2014)；Jones et al.，J.Exp.Med.，205：2763-2779(2008))。目前已知的TIM-3的受体包括磷脂酰丝氨酸半乳糖凝集素9(Galectin-9，Gal-9)、高迁移率族蛋白1(HMGB1)和癌胚抗原细胞粘附分子1(CEACAM1)。

TIM-3可从多方面调节免疫系统的功能，在Th1细胞表面与配体Gal-9结合可下调Th1细胞应答，并能诱导Th1细胞凋亡，在自身和异体免疫性疾病(如系统性红斑狼疮、哮喘)以及免疫耐受中起着重要作用。在单核-巨噬细胞表达的TIM-3与磷脂酰丝氨酸相互作用，促进凋亡细胞的吞噬；在肿瘤浸润DC中，TIM-3则与HMGB1配体结合，抑制核酸正确转运，从而抑制核酸免疫反应，参与免疫逃逸。TIM-3不仅表达于免疫细胞，在卵巢癌、脑膜瘤、黑色素瘤等肿瘤细胞中也有过表达，并直接促进肿瘤的增长。下调TIM-3的表达可以明显抑制Hela细胞的侵袭和转移。TIM-3的过表达均与肺癌、胃癌、前列腺癌和宫颈癌的不良预后密切相关。在血液系统肿瘤中，TIM-3过表达于急性髓系白血病的白血病干细胞、MDS患者的造血干细胞上，且TIM-3+造血干细胞具有低分化、低凋亡及高增殖的恶性生物学特征。因此，通过抑制TIM-3的活性(如TIM-3抗体)以提高固有免疫系统的功能，有望成为治疗肿瘤的新方法(see，e.g.，Ngiow et al.，Cancer Res.，71(21)：1-5(2011)；Guo et al.，Journαl ofTranslationαl Medicine，11：215(2013)；and Ngiow et al.，Cancer Res.，71(21)：6567-6571(2011))。

抗体药物的稳定性是影响抗体成药性的关键因素之一，其中天冬酰胺(Asn)和谷氨酰胺(Gln)的非酶促脱酰胺作用，能够引起抗体的不稳定和异质性，是抗体分子常见化学降解途径之一。已有文献报道，多个IgGl亚型抗体因为其CDR区氨基酸的脱酰胺和异构化作用，而失去了其生物学活性。Huang等人发现，位于IgG1单克隆抗体重链可变区2(CDR2)的Asn55的脱酰胺作用，明显降低了其结合活性。因此，在抗体的研发过程中应尽量避免或者突变相应氨基酸以降低抗体脱酰胺情况的发生，以增加抗体的稳定性和生物利用率。

尽管目前已有专利报道了有关TIM-3的抗体，如WO2011159877、WO2013006490、WO2015117002、WO2016144803、WO2016161270、US20150218274，但就国内外而言，仅有两个TIM-3抗体处于临床研究阶段，其他抗体药物仍处于发现和研究阶段，尚没有TIM-3抗体进入临床应用。因此，有必要进一步开发具有更高活性、高亲和力和高稳定性的TIM-3的抗体，以进行TIM-3相关疾病的治疗研究和应用。

发明内容

本发明提供与TIM-3的胞外区的氨基酸序列或三维结构结合的单克隆抗体或抗原结合片段。此外，本发明通过筛选，获得与所述单克隆抗体或其抗体片段竞争的高活性和高稳定性的抗人TIM-3抗体。

此外，本发明将提供生产根据本发明的抗体的杂交瘤、编码所述抗体的DNA、包含所述DNA的载体、通过转化所述载体而获得的转化体、使用所述杂交瘤或转化体生产抗体或其抗体片段的方法、以及使用根据本发明的抗体或其抗体片段作为活性成分的诊断剂或治疗剂。

一方面，本发明提供一种TIM-3抗体或抗原结合片段，其与人TIM-3的胞外区结合，同时与选自下面(i)至(iv)中的一种单克隆抗体或抗原结合片段竞争，或是选自下面(i)至(iv)中的一种单克隆抗体或其抗原结合片段：

(i)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含1个或多个选自以下的CDR区序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列：

抗体重链可变区HCDR区序列：如SEQ ID NO：8、43和10氨基酸序列所示；和抗体轻链可变区LCDR区序列：如SEQ ID NO：11、12和13氨基酸序列所示；

(ii)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含1个或多个选自以下的CDR区序列或与其具有至少95％序列同一性的氨基酸序列：

抗体重链可变区HCDR区序列：如SEQ ID NO：14、15和16氨基酸序列所示；和抗体轻链可变区LCDR区序列：如SEQ ID NO：17、18和19氨基酸序列所示；

(iii)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、43和10所示的抗体重链可变区HCDR1-3区序列，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区LCDR1-3区序列；

(iv)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：14、15和16所示的抗体重链可变区HCDR1-3区序列，和分别如SEQ ID NO：17、18和19所示的抗体轻链可变区LCDR1-3区序列。

一方面，本发明提供一种TIM-3抗体或抗原结合片段，其与人TIM-3的胞外区结合，同时与选自下面(a)至(m)中的一种单克隆抗体或抗原结合片段竞争，或是选自下面(a)至(m)中的一种单克隆抗体或其抗原结合片段：

(a)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、9和10所示的抗体重链可变区HCDR1-3区序列，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区LCDR1-3区序列；

(b)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、62和10所示的抗体重链可变区HCDR1-3区序列，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区LCDR1-3区序列；

(c)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、63和10所示的抗体重链可变区HCDR1-3区序列，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区LCDR1-3区序列；

(d)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、64和10所示的抗体重链可变区HCDR1-3区序列，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区LCDR1-3区序列；

(e)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、65和10所示的抗体重链可变区HCDR1-3区序列，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区LCDR1-3区序列；

(f)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、66和10所示的抗体重链可变区HCDR1-3区序列，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区LCDR1-3区序列；

(g)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、67和10所示的抗体重链可变区HCDR1-3区序列，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区LCDR1-3区序列；

(h)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、68和10所示的抗体重链可变区HCDR1-3区序列，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区LCDR1-3区序列；

(i)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、69和10所示的抗体重链可变区HCDR1-3区序列，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区LCDR1-3区序列；

(g)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、70和10所示的抗体重链可变区HCDR1-3区序列，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区LCDR1-3区序列；

(k)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、71和10所示的抗体重链可变区HCDR1-3区序列，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区LCDR1-3区序列；

(l)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、72和10所示的抗体重链可变区HCDR1-3区序列，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区LCDR1-3区序列；

(m)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：14、15和16所示的抗体重链可变区HCDR1-3区序列，和分别如SEQ ID NO：17、18和19所示的抗体轻链可变区LCDR1-3区序列。

在一种优选的实施方式中，本发明所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述TIM-3抗体或其抗原结合片段与选自上面(i)至(iv)中的一种单克隆抗体结合相同的表位。

在一种优选的实施方式中，本发明所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体是重组抗体。

在一种优选的实施方式中，本发明所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体选自鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体的重组抗体或其抗原结合片段。

在一种优选的实施方式中，本发明所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体轻链和重链可变区上的轻链和重链FR区序列分别来源于人种系轻链和重链或其突变序列。

在一种优选的实施方式中，本发明所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体含有SEQ ID NO：44或31所示的重链可变区或其变体；所述变体是在SEQ IDNO：44或31所示的重链可变区上具有1-10个氨基酸变化的序列。

在一种优选的实施方式中，本发明所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述变体是在SEQ ID NO：44或31所示的重链可变区的FR区位置上具有1-10个氨基酸的回复突变；优选的，所述回复突变选自在SEQ ID NO：44所示的重链可变区上进行D89E，R98T，G49A，M48I，M70L，R38K和V68A的氨基酸回复突变或在SEQ ID NO：31所示的重链可变区上进行Q3K和R87K的氨基酸回复突变。

在一种优选的实施方式中，为消除抗体CDR区的乙酰化、脱酰胺化等化学修饰，本发明所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR区的易发生化学修饰的位点可以进行氨基酸的置换，优选CDR2中的NNG被置换；优选地，本发明所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含选自SEQ ID NO：45-50中任一个所示的重链可变区或包含选自SEQ ID NO：34-35中任一个所示的重链可变区。

在一种优选的实施方式中，本发明所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体含有SEQ ID NO：21或32所示的轻链可变区或其变体；所述变体是在SEQ IDNO：21或32所示的轻链可变区上具有1-10个氨基酸变化的序列。

在一种优选的实施方式中，本发明所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述变体是在SEQ ID NO：21或32所示的轻链可变区的FR区位置上具有1-10个氨基酸的回复突变；优选的，所述回复突变选自在SEQ ID NO：21所示的轻链可变区上进行A43S的氨基酸回复突变或在SEQ ID NO：32所示的重链可变区上进行Q3K和I48V、K45Q、A43S、T85S的氨基酸回复突变。

在一种优选的实施方式中，本发明所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含选自SEQ ID NO：30所示的轻链可变区或包含选自SEQ ID NO：37-40中任一个所示的轻链可变区。

在一种优选的实施方案中，为消除抗体CDR区的乙酰化、脱酰胺化等化学修饰，本发明所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR区易发生化学修饰的位点可以进行氨基酸的置换，优选CDR2中的NNG被置换，形成如SEQ ID NO：43所示的CDR2序列；优选地本发明所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含：选自SEQ ID NO：44-50所示的重链可变区序列和选自SEQ ID NO：29-30中任一个所示的轻链可变区序列，或选自SEQ ID NO：22-28中任一个所示的重链可变区序列和选自SEQ ID NO：29-30中任一个所示的轻链可变区序列，或选自SEQ ID NO：33-35中任一个所示的重链可变区序列和选自SEQID NO：36-40中任一个所示的轻链可变区序列，优选选自SEQ ID：24所示的重链可变区序列和选自SEQ ID NO：29所示的轻链可变区序列；或选自SEQ ID NO：33所示的重链可变区序列和选自SEQ ID NO：36所示的轻链可变区序列。

在一种优选的实施方案中，为消除抗体CDR区氨基酸位点的脱酰胺，本发明所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述CDR区的易脱酰胺化的位点可以进行氨基酸的置换，优选CDR2中的NNG被置换；一种优选的实施方式中，本发明所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含：选自SEQ ID NO：51-61中任一个所示的重链可变区序列和选自SEQ ID NO：29-30所示的轻链可变区序列，优选选自SEQ ID NO：51所示的重链可变区序列和选自SEQ ID NO：29所示的轻链可变区序列；或选自SEQ ID NO：52所示的重链可变区序列和选自SEQ ID NO：29所示的轻链可变区序列。

在一种优选的实施方式中，本发明所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为全长抗体，进一步包括人抗体恒定区，优选SEQ ID NO：41所示的人重链恒定区序列和优选SEQ ID NO：42所示的人轻链恒定区序列。

在一种优选的实施方式中，本发明所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段是选自Fab、Fab′、F(ab′)2、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)和包含CDR区的肽的抗原结合片段。

本发明进一步提供一种药物组合物，其含有治疗有效量的如上所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

本发明进一步提供一种核酸分子，其编码如上所述的抗体或其抗原结合片段。

本发明进一步提供一种重组载体，其包含如上述项所述的核酸分子。

本发明进一步提供一种用如上述项所述的重组载体转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞，优选为真核细胞，更优选哺乳动物细胞。

本发明进一步提供一种用于生产如上的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括将如前述项所述的宿主细胞在培养物中进行培养以形成并积累如上所述的抗体或其抗原结合片段，以及从培养物回收抗体或其抗原结合片段。

本发明进一步提供一种用于免疫检测或测定人TIM-3的方法，所述方法包括使用如上所述的抗体或其抗原结合片段。

本发明进一步提供一种用于检测或测定人TIM-3的试剂，所述试剂包含如上所述的抗体或其抗原结合片段。

本发明进一步提供一种与人TIM-3阳性细胞相关的疾病的诊断剂，所述诊断剂包含如上所述的抗体或其抗原结合片段。

本发明进一步提供一种用于诊断与人TIM-3阳性细胞相关的疾病的方法，所述方法包括使用如上所述的任一项的抗体或其抗原结合片段检测或测定人TIM-3或TIM-3阳性细胞。

本发明进一步提供一种如上所述的抗体或其抗原结合片段在制备与人TIM-3阳性细胞相关的疾病的诊断剂中的应用。

本发明进一步提供一种与人TIM-3阳性细胞相关的疾病的治疗剂，所述治疗剂包含如上所述的抗体或其抗原结合片段，或包含上述的药物组合物，或包含上述述的核酸分子。

本发明进一步提供一种与人TIM-3阳性细胞相关的疾病的治疗方法，所述方法包括使用如上所述的抗体或其抗原结合片段，或包含上述的药物组合物，或上述的核酸分子诱导人TIM-3阳性细胞的细胞死亡。

本发明进一步提供如上所述的抗体或其抗原结合片段，或包含上述的药物组合物，或上述的核酸分子在制备与人TIM-3阳性细胞相关的疾病的治疗剂中的应用。

附图说明

图1：候选TIM-3抗体的细胞结合实验曲线，数据显示候选抗体mAb-1701和mAb-1799对表达抗原的细胞均具有很强的结合活性；

图2A-图2C：在混合淋巴细胞反应实验中本发明的候选抗体和其抗原结合片段对IFNγ分泌的影响；图2A，h1701-009及其抗原结合片段对IFNγ分泌的影响；图2B，h1701-005及其抗原结合片段对IFNγ分泌的影响；图2C，h1701-009，h1799-005对IFNγ分泌的影响。结果显示h1701-009、h1799-005均能够有效刺激IFNγ的分泌；

图3A-图3D：PBMC被CD3/CD28抗体激活。h1701-009，h1799-005，AbTIM-3对活化后PBMC细胞内IFNγ表达的影响，均不同程度提高了细胞内IFNγ阳性细胞的百分比以及IFNγ的表达；

图4A-图4B：SEB刺激PBMC5天后，h1701-009，h1799-005以及AbTIM-3均有效升高了SEB诱导的IL12和IFNγ的分泌。

具体实施方式

一.术语

为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。

本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。

本发明所述的“抗体”指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链、和ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链或λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链或λ链。

在本发明中，本发明所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链或其变体。

在本发明中，本发明所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体。

抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(Fv区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。本发明所述的抗体或抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3，HCDR2-3)，或者符合kabat和chothia的编号规则(HCDR1)。

本发明的抗体包括鼠源抗体、嵌合抗体、人源化抗体，优选人源化抗体。

术语“鼠源抗体”在本发明中为根据本领域知识和技能制备的对人TIM-3的单克隆抗体。制备时用TIM-3抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。在本发明一个优选的实施方案中，所述的鼠源TIM-3抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其变体的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其变体的重链恒定区。

术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入表达载体中，最后在真核系统或原核系统中表达嵌合抗体分子。在本发明一个优选的实施方案中，所述的TIM-3嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其变体的轻链恒定区。所述的TIM-3嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其变体的重链恒定区，优选包含人源IgG1、IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变(如YTE突变或回复突变)的IgG1、IgG2或IgG4变体。

术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体框架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量鼠蛋白成分，从而诱导的异源性反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991 Sequences ofProteins of Immunological Interest，第5版中找到。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区框架序列进行最少反向突变或回复突变，以保持活性。本发明的人源化抗体也包括进一步由噬菌体展示对CDR进行亲和力成熟后的人源化抗体。在本发明一个优选的实施方案中，所述的TIM-3人源化抗体中鼠的CDR序列选自SEQ IDNO：8-13或14-19；人的抗体可变区框架经过设计选择，其中所述抗体重链可变区上的重链FR区序列，来源于人种系重链IGHV1-18*01和hjh4.1的组合序列或IGHV3-7*01和hjh4.1的组合序列；其中所述抗体轻链可变区上的轻链FR区序列，来源于人种系轻链IGKV1-33*01和hjk4.1的组合序列或IGKV1-39*01和hjk2.1的组合序列。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区可进行最少反向突变，以保持活性。

CDR的移植可由于与抗原接触的构架残基而导致产生的TIM-3抗体或其抗原结合片段对抗原的亲和力减弱。此类相互作用可以是体细胞高度突变的结果。因此，可能仍然需要将此类供体构架氨基酸移植至人源化抗体的构架。来自非人TIM-3抗体或其抗原结合片段的参与抗原结合的氨基酸残基可通过检查鼠单克隆抗体可变区序列和结构来鉴定。CDR供体构架中与种系不同的的各残基可被认为是相关的。如果不能确定最接近的种系，那么可将序列与亚型共有序列或具有高相似性百分数的鼠序列的共有序列相比较。稀有构架残基被认为可能是体细胞高度突变的结果，从而在结合中起着重要作用。

术语抗体的“抗原结合片段”或“功能片段”是指抗体的保持特异性结合抗原(例如，TIM-3)的能力的一个或多个片段。已显示可利用全长抗体的片段来进行抗体的抗原结合功能。术语抗体的“抗原结合片段”中包含的结合片段的实例包括(i)Fab片段，由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab′)₂片段，包含通过铰链区上的二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段，(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体的单臂的VH和VL结构域组成的Fv片段；(v)单结构域或dAb片段(Ward等人，(1989)Nature341：544-546)，其由VH结构域组成；和(vi)分离的互补决定区(CDR)或(vii)可任选地通过合成的接头连接的两个或更多个分离的CDR的组合。此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH由分开的基因编码，但可使用重组方法，通过合成的接头连接它们，从而使得其能够产生为其中VL和VH区配对形成单价分子的单个蛋白质链(称为单链Fv(scFv)；参见，例如，Bird等人(1988)Science242：423-426；和Huston等人(1988)Proc.Natl.Acad.Sci USA85：5879-5883)。此类单链抗体也意欲包括在术语抗体的“抗原结合片段”中。使用本领域技术人员已知的常规技术获得此类抗体片段，并且以与对于完整抗体的方式相同的方式就功用性筛选片段。可通过重组DNA技术或通过酶促或化学断裂完整免疫球蛋白来产生抗原结合部分。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

本发明的抗原结合片段包括Fab、F(ab′)2、Fab′、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)、包含CDR的肽等。

Fab是通过用蛋白酶木瓜蛋白酶(切割H链的224位的氨基酸残基)处理IgG抗体分子所获得的片段中的具有约50,000的分子量并具有抗原结合活性的抗体片段，其中H链N端侧的约一半和整个L链通过二硫键结合在一起。

本发明的Fab可以通过用木瓜蛋白酶处理本发明的特异性识别人TIM-3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体来生产。此外，可以通过将编码所述抗体的Fab的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab来生产所述Fab。

F(ab′)2是通过用酶胃蛋白酶消化IgG铰链区中两个二硫键的下方部分而获得的分子量为约100,000并具有抗原结合活性并包含在铰链位置相连的两个Fab区的抗体片段。

本发明的F(ab′)2可以通过用胃蛋白酶处理本发明的特异性识别人TIM-3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体来生产。此外，可以通过用硫醚键或二硫键连接下面描述的Fab′来生产所述F(ab′)2。

Fab′是通过切割上述F(ab′)2的铰链区的二硫键而获得的分子量为约50,000并具有抗原结合活性的抗体片段。本发明的Fab′可以通过用还原剂例如二硫苏糖醇处理本发明的特异性识别TIM-3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的F(ab′)2来生产。

此外，可以通过将编码抗体的Fab′片段的DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中并将载体导入到原核生物或真核生物中以表达Fab′来生产所述Fab′。

术语“单链抗体”、“单链Fv”或“scFv”意指包含通过接头连接的抗体重链可变结构域(或区域；VH)和抗体轻链可变结构域(或区域；VL)的分子。此类scFv分子可具有一般结构：NH₂-VL-接头-VH-COOH或NH₂-VH-接头-VL-COOH。合适的现有技术接头由重复的GGGGS氨基酸序列或其变体组成，例如使用1-4个重复的变体(Holliger等人(1993)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448)。可用于本发明的其他接头由Alfthan等人(1995)，Protein Eng.8：725-731，Choi等人(2001)，Eur.J.Immuno 1.31：94-106，Hu等人(1996)，Cancer Res.56：3055-3061，Kipriyanov等人(1999)，J.Mol.Biol.293：41-56和Roovers等人(2001)，Cancer Immunol.描述。

本发明的scFv可以通过以下步骤来生产：获得本发明的特异性识别人TIM-3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码scFv的DNA，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达scFv。

双抗体是其中scFv被二聚体化的抗体片段，是具有二价抗原结合活性的抗体片段。在二价抗原结合活性中，两个抗原可以是相同或不同的。

本发明的双抗体可以通过以下步骤来生产：获得本发明的特异性识别人TIM-3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码scFv的DNA以使肽接头的氨基酸序列长度为8个残基或更少，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达双抗体。

dsFv是通过将其中每个VH和VL中的一个氨基酸残基被半胱氨酸残基取代的多肽经由半胱氨酸残基之间的二硫键相连而获得的。可以按照已知方法(ProteinEngineering，7，697(1994))基于抗体的三维结构预测来选择被半胱氨酸残基取代的氨基酸残基。

本发明的dsFv可以通过以下步骤来生产：获得获得本发明的特异性识别人TIM-3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的编码cDNA，构建编码dsFv的DNA，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达dsFv。

包含CDR的肽是通过包含VH或VL的CDR中的一个或多个区域而构成的。包含多个CDR的肽可以被直接相连或经由适合的肽接头相连。

本发明的包含CDR的肽可以通过以下步骤来生产：构建本发明的特异性识别人TIM-3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体的VH和VL的CDR的编码DNA，将所述DNA插入到原核生物表达载体或真核生物表达载体中，然后将所述表达载体导入到原核生物或真核生物中以表达所述肽。也可以通过化学合成方法例如Fmoc方法或tBoc方法来生产所述包含CDR的肽。

术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A.等人，(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication91-3242)提供。如本文中使用的，CDR的Kabat定义只应用于轻链可变结构域的CDR1、CDR2和CDR3(CDR L1、CDR L2、CDR L3或L1、L2、L3)，以及重链可变结构域的CDR2和CDR3(CDR H2、CDR H3或H2、H3)。

本文中使用的术语“抗体框架”，是指可变结构域VL或VH的一部分，其用作该可变结构域的抗原结合环(CDR)的支架。从本质上讲，其是不具有CDR的可变结构域。

术语“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上免疫球蛋白或抗体特异性结合的部位(例如，TIM-3分子上的特定部位)。表位通常以独特的空间构象包括至少3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个连续或非连续的氨基酸。参见，例如，Epitope Mapping Protocols inMethods in Molecular B iology，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996)。

术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常，抗体以大约小于10^-7M，例如大约小于10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的亲和力(KD)结合。

术语″KD″或“Kd”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。通常，本发明的抗体以小于大约10-7M，例如小于大约10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的解离平衡常数(KD)结合TIM-3，例如，如使用表面等离子体共振(SPR)技术在BIACORE仪中测定的。

术语“竞争结合”是指与本发明的单克隆抗体识别人TIM-3的胞外区上的相同表位(也称为抗原决定簇)或相同表位的一部分并与所述抗原结合的抗体。与本发明的单克隆抗体结合相同表位的抗体是指识别并结合于本发明的单克隆抗体所识别的人TIM-3的氨基酸序列的抗体。

本文中使用的术语“核酸分子”是指DNA分子和RNA分子。核酸分子可以是单链或双链的，但优选是双链DNA。当将核酸与另一个核酸序列置于功能关系中时，核酸是“有效连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，那么启动子或增强子有效地连接至所述编码序列。

术语“载体”是指能够运输已与其连接的另一个核酸的核酸分子。在一个实施方案中，载体是“质粒”，其是指可将另外的DNA区段连接至其中的环状双链DNA环。在另一个实施方案中，载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接至病毒基因组中。本文中公开的载体能够在已引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌的复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)或可在引入宿主细胞后整合入宿主细胞的基因组，从而随宿主基因组一起复制(例如，非附加型哺乳动物载体)。

现有技术中熟知生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。例如，鼠可以用人TIM-3或其片段免疫，所得到的抗体能被复性、纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人源FR区。人FR种系序列可以通过比对IMGT人类抗体可变区种系基因数据库和MOE软件，从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http：//imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。

术语“宿主细胞”是指已向其中引入了表达载体的细胞。宿主细胞可包括细菌、微生物、植物或动物细胞。易于转化的细菌包括肠杆菌科(enterobacteriaceae)的成员，例如大肠杆菌(Escherichia coli)或沙门氏菌(Salmonella)的菌株；芽孢杆菌科(Bacillaceae)例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)；肺炎球菌(Pneumococcus)；链球菌(Streptococcus)和流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)。适当的微生物包括酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和毕赤酵母(Pichia pastoris)。适当的动物宿主细胞系包括CHO(中国仓鼠卵巢细胞系)和NS0细胞。

本发明工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的现有技术，哺乳动物类表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端位点。通过表达与人TIM-3特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌了抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的A或G Sepharose FF柱进行纯化。洗去非特异性结合的组分。再用PH梯度法洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-70℃，或者冻干。

“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。

“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，例如包含本发明的任一种结合化合物的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本发明的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。

“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology ofthe Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。

“有效量”包含足以改善或预防医学疾病的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：例如，待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。

“外源性”指根据情况在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据情况在细胞、生物或人体内产生的物质。

“同源性”是指两个多核苷酸序列之间或两个多肽之间的序列相似性。当两个比较序列中的位置均被相同碱基或氨基酸单体亚基占据时，例如如果两个DNA分子的每一个位置都被腺嘌呤占据时，那么所述分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源性百分率是两个序列共有的匹配或同源位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，在序列最佳比对时，如果两个序列中的10个位置有6个匹配或同源，那么两个序列为60％同源；如果两个序列中的100个位置有95个匹配或同源，那么两个序列为95％同源。一般而言，当比对两个序列而得到最大的同源性百分率时进行比较。

本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。在意指不同名称的情况下，其由上下文清楚可见。

本文使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”是指其中微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美国专利号4,683,195中所述扩增的程序或技术。一般来说，需要获得来自目标区域末端或之外的序列信息，使得可以设计寡核苷酸引物；这些引物在序列方面与待扩增模板的对应链相同或相似。2个引物的5’末端核苷酸可以与待扩增材料的末端一致。PCR可用于扩增特定的RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列和由总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等。一般参见Mullis等(1987)Cold Spring HarborSymp.Ouant.Biol.51：263；Erlich编辑，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press，N.Y.)。本文使用的PCR被视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应法的一个实例，但不是唯一的实例，所述方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶，以扩增或产生核酸的特定部分。

“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生的场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。

“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。

此外，本发明包括用于治疗与TIM-3阳性细胞相关的疾病的药剂，所述药剂包含本发明的单克隆抗体或其抗体片段作为活性成分。

对与TIM-3阳性细胞相关的疾病没有限制，只要它是与表达TIM-3的细胞相关的疾病即可，例如癌症、自体免疫性疾病和过敏性疾病。

癌症包括血液癌、乳腺癌、子宫癌、结直肠癌、食道癌、胃癌、卵巢癌、肺癌、肾癌、直肠癌、甲状腺癌、宫颈癌、小肠癌、前列腺癌和胰腺癌。癌症的优选实例包括血液癌、食道癌、胃癌、结直肠癌、肝癌和前列腺癌。

血液癌的实例包括急性髓性白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、骨髓增生异常综合征(MDS)、多发性骨髓瘤、皮肤T细胞淋巴瘤(CTCL)、外周T细胞淋巴瘤(PTCL)、间变性大细胞淋巴瘤(ALCL)、急性淋巴细胞性白血病(ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、其他淋巴性白血病、NK细胞淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤例如Burkitt淋巴瘤等等。

自体免疫性疾病的具体实例包括类风湿关节炎、牛皮癣、克罗恩病、强硬性脊柱炎、多发性硬化症、I型糖尿病、肝炎、心肌炎、Sjogren综合征、移植排斥后的自体免疫性溶血性贫血、水疱性类天疱疮、格雷夫氏病、桥本甲状腺炎、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、天疱疮、恶性贫血等。

过敏性疾病的实例包括急性或慢性反应性气道疾病、支气管哮喘、特应性皮炎、过敏性鼻炎、荨麻疹、PIE综合征、食物过敏、花粉热、过敏性鼻、支气管哮喘、特应性皮炎、过敏性休克等。

此外，本发明涉及用于免疫检测或测定TIM-3的方法、用于免疫检测或测定TIM-3的试剂、用于免疫检测或测定表达TIM-3的细胞的方法和用于诊断与TIM-3阳性细胞相关的疾病的诊断剂，其包含本发明的特异性识别人TIM-3并与胞外区的氨基酸序列或其三维结构结合的单克隆抗体或抗体片段作为活性成分。

在本发明中，用于检测或测定TIM-3的量的方法可以是任何已知方法。例如，它包括免疫检测或测定方法。

免疫检测或测定方法是使用标记的抗原或抗体检测或测定抗体量或抗原量的方法。免疫检测或测定方法的实例包括放射性物质标记的免疫抗体方法(RIA)、酶免疫测定法(EIA或ELISA)、荧光免疫测定法(FIA)、发光免疫测定法、蛋白质免疫印迹法、物理化学方法等。

上述与TIM-3阳性细胞相关的疾病可以通过用本发明的单克隆抗体或抗体片段检测或测定表达TIM-3的细胞来诊断。

为了检测表达多肽的细胞，可以使用已知的免疫检测方法，并优选使用免疫沉淀法、荧光细胞染色法、免疫组织染色法等。此外，可以使用利用FMAT8100HTS系统(AppliedBiosystem)的荧光抗体染色法等。

在本发明中，对用于检测或测定TIM-3的活体样品没有特别限制，只要它具有包含表达TIM-3的细胞的可能性即可，例如组织细胞、血液、血浆、血清、胰液、尿液、粪便、组织液或培养液。

根据所需的诊断方法，含有本发明的单克隆抗体或其抗体片段的诊断剂还可以含有用于执行抗原-抗体反应的试剂或用于检测反应的试剂。用于执行抗原-抗体反应的试剂包括缓冲剂、盐等。用于检测的试剂包括通常用于免疫检测或测定方法的试剂，例如识别所述单克隆抗体、其抗体片段或其结合物的标记的第二抗体和与所述标记对应的底物等。

二.实施例与测试例

以下结合实施例进一步描述本发明，但这些实施例并非限制着本发明的范围。本发明实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。

实施例1、TIM-3抗原及检测用蛋白的制备

1.TIM-3抗原设计及表达

以UniProt Hepatitis A virus cellular receptor 2(人HAVCR2，人TIM-3，Uniprot号：Q8TDQ0)作为本发明TIM-3的模板，设计本发明涉及的抗原及检测用蛋白的氨基酸序列，可选的在TIM-3蛋白基础上融合不同的标签，分别克隆到pHr载体上(自产)或pTargeT载体上(promega，A1410)，在293细胞瞬转表达或CHO-S稳定表达纯化，获得编码本发明抗原及检测用蛋白。以下TIM-3抗原未特殊说明的均指人TIM-3。

TIM-3胞外区和hIgG1 Fc的融合蛋白：TIM-3-Fc(SEQ ID NO：1)，用于小鼠免疫

注释：划横线部分为信号肽，斜体部分为Fc。

带Flag标签和His标签的TIM-3胞外区：TIM-3-Flag-His(SEQ ID NO：2)，用于检测

TIM-3-flag-His

注释：划横线部分为信号肽，斜体部分为Flag-His标签。

全长TIM-3：用于构建TIM-3过表达细胞株

TIM-3-full length(SEQ ID NO：3)

注释：

2.TIM-3相关重组蛋白的纯化，以及杂交瘤抗体、重组抗体的纯化

2.1 TIM-3-Flag-His重组蛋白的纯化步骤：

将样品高速离心去除杂质，并浓缩至适当体积。利用PBS平衡NI-NTA亲和柱(QIAGEN，Cat No.30721)，冲洗2-5倍柱体积。将除杂后的细胞表达上清样品上柱。用PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用PBS冲洗柱子，冲洗杂蛋白，并收集。依次用洗涤缓冲液(咪唑20mM)和洗脱缓冲液(咪唑300mM)洗脱目的蛋白，并收集洗脱峰。

收集的洗脱液用离子交换(Hiload 16/600 superdex 200柱)进一步纯化。用PBS平衡2个柱体积左右，保证pH7.4。将鉴定含目的蛋白的elution buffer浓缩后上样，收集样品，SDS-PAGE和LC-MS鉴定为正确后分装备用。

2.2杂交瘤，重组抗体，Fc融合蛋白的纯化

将细胞表达上清样品高速离心去除杂质，杂交瘤表达上清用Protein G柱，重组抗体、Fc融合蛋白表达上清用Protein A柱进行纯化。用PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用100mM乙酸pH3.0洗脱目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0中和。洗脱样品适当浓缩后利用PBS平衡好的凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，去聚体的峰收集好后分装备用。

实施例2、抗人TIM-3单克隆抗体的制备

1.动物免疫

抗人TIM-3单克隆抗体通过免疫小鼠产生。实验用SJL白小鼠，雌性，6-8周龄(北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001)。饲养环境：SPF级。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，12/12小时光/暗周期调节，温度20-25℃；湿度40-60％。将已适应环境的小鼠按以下方案免疫。免疫抗原为带Fc标签的人TIM-3胞外区(SEQID NO：1)。

免疫方案：用QuickAntibody-Mouse5W(KX0210041)对小鼠进行免疫。抗原与佐剂比例为1∶1，10μg/只/次(首免/加强免疫)。抗原与佐剂迅速充分混匀后接种，接种时间为第1和第2次免疫间隔21天，之后每次免疫间隔14天。于每次免疫后7天取血，用ELISA方法确定小鼠血清中的抗体滴度。选择血清中抗体滴度高并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合。在进行脾细胞融合前3天加强免疫，腹膜内(IP)注射20μg/只的生理盐水配制的抗原溶液。

2.脾细胞融合

采用优化的PEG介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(

CRL-8287^TM)进行融合得到杂交瘤细胞。融合好的杂交瘤细胞以4-5E5/ml的密度用完全培养基(含20％FBS、1×HAT、1×OPI的DMEM培养基)重悬，100μl/孔种于96孔板中，37℃，5％CO₂孵育3-4天后，补充HAT完全培养基100μl/孔，继续培养3-4天至形成针尖般克隆。去除上清，加入200μl/well的HT完全培养基(含20％FBS、1×HT和1×OPI的RPMI-1640培养基)，37℃，5％CO₂培养3天后进行ELISA检测。

3.杂交瘤细胞筛选

根据杂交瘤细胞生长密度，用结合ELISA方法进行杂交瘤培养上清检测(见实施例4测试例1)。并将结合ELISA检测的阳性孔细胞上清进行TIM-3过表达细胞结合实验(见实施例4测试例2)。蛋白结合和细胞结合均为阳性的孔细胞及时进行扩增冻存保种和二到三次亚克隆直至获得单细胞克隆。

每次亚克隆细胞均需进行TIM-3结合ELISA、细胞结合实验检测。通过以上实验筛选得到杂交瘤克隆，并获得其分泌的抗体mAb-1701和mAb-1799，用无血清细胞培养法进一步制备抗体，按纯化实例纯化抗体，供在检测例中使用。

4.杂交瘤阳性克隆序列测定

从阳性杂交瘤中克隆序列过程如下。收集对数生长期杂交瘤细胞，用Trizol(Invitrogen，Cat No.15596-018)按照试剂盒说明书步骤提取RNA，用PrimeScript^TMReverse Transcriptase试剂盒反转录(Takara，Cat No.2680A)。将反转录得到的cDNA采用mouse Ig-Primer Set(Novagen，TB326 Rev.B 0503)进行PCR扩增后送测序公司测序。得到mAb-1701和mAb-1799的重链和轻链可变区DNA序列对应的氨基酸序列：

mAb-1701重链可变区(SEQ ID NO：4)

mAb-1701轻链可变区(SEQ ID NO：5)

mAb-1799重链可变区(SEQ ID NO：6)

mAb-1799轻链可变区(SEQ ID NO：7)

其中各抗体轻重链中CDR序列如表1所示。

表1各重链及轻链CDR区序列

实施例3、抗人TIM-3鼠杂交瘤单克隆抗体的人源化

1.抗TIM-3抗体mAb-1701号的人源化

通过比对IMGT人类抗体重轻链可变区种系基因数据库和MOE软件，分别挑选与mAb-1701抗体同源性高的重链和轻链可变区种系基因作为模板，将鼠源抗体的CDR分别移植到相应的人源模板中，形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区序列。其中氨基酸残基由Kabat编号系统确定并注释。

1.1杂交瘤克隆mAb-1701号人源化构架选择

鼠源抗体mAb-1701号的人源化轻链模板为IGKV1-33*01和hjk4.1，人源化重链模板为IGHV1-18*01和hjh4.1，人源化可变区序列如下：

h1701VH-CDR graft(SEQ ID NO：20)

h1701VL-CDR graft(SEQ ID NO：21)

注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，序列中斜体为FR序列，下划线为CDR序列。

1.2 h1701号的模板选择和回复突变设计

具体突变设计见下表2：

表2 h1701的模板选择和回复突变设计

注：如A43S表示依照Kabat编号系统，将43位A突变回S。Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。

表3 h1701人源化抗体重轻链可变区相互组合表

	h1701_VL.1	h1701_VL.1A
			h1701_VH.1	h1701-005	h1701-006
h1701_VH.1A	h1701-007	h1701-008
			h1701_VH.1B	h1701-009	h1701-010
h1701_VH.1C	h1701-011	h1701-012
			h1701_VH.1D	h1701-013	h1701-014
h1701_VH.1E	h1701-015	h1701-016
			h1701_VH.1F	h1701-017	h1701-018

注：该表表示各种突变组合所得的序列。如h1701-007表示，在人源化的鼠抗体h1701-007上的有轻链h1701_VL.1A、重链h1701_VH.1A两种突变。其它类推。

1701号人源化具体序列如下：

＞h1701_VH.1(同h1701VH-CDR graft，SEQ ID NO：22)

＞h1701h1701_VH.1A(SEQ ID NO：23)

＞h1701_VH.1B(SEQ ID NO：24)

＞h1701_VH.1C(SEQ ID NO：25)

＞h1701_VH.1D(SEQ ID NO：26)

＞h1701_VH.1E(SEQ ID NO：27)

＞h1701_VH.1F(SEQ ID NO：28)

＞h1701_VL.1(同h1701VL-CDR graft，SEQ ID NO：29)

＞h1701_VL.1A(SEQ ID NO：30)

2.抗TIM-3抗体mAb-1799号的人源化

通过比对IMGT人类抗体重轻链可变区种系基因数据库和MOE软件，分别挑选与mAb-1799号抗体同源性高的重链和轻链可变区种系基因作为模板，将鼠源抗体的CDR分别移植到相应的人源模板中，形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区序列。其中氨基酸残基由Kabat编号系统确定并注释。

2.1杂交瘤克隆1799号人源化构架选择

鼠源抗体1799号的人源化轻链模板为IGKV1-39*01和hjk2.1，人源化重链模板为IGHV3-7*01和hjh4.1，人源化可变区序列如下：

h1799VH-CDR graft(SEQ ID NO：31)

h1799VL-CDR graft(SEQ ID NO：32)

2.2杂交瘤克隆1799号的模板选择和回复突变设计，见下表4：

表4 h1799的模板选择和回复突变设计

注：如I48V表示依照Kabat编号系统，将48位I突变回V。Grafted代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。

表5鼠抗1799号人源化抗体重轻链可变区序列组合

	h1799_VL.1	h1799_VL.1A	h1799_VL.1B	h1799_VL.1C	h1799_VL.1D
						h1799_VH.1	h1799-005	h1799-006	h1799-007	h1799-008	h1799-009
h1799_VH.1A	h1799-010	h1799-011	h1799-012	h1799-013	h1799-014
						h1799_VH.1B	h1799-015	h1799-016	h1799-017	h1799-018	h1799-019

注：该表表示各种突变组合所得的序列。如h1799-005表示，在人源化的鼠抗体h1799-005上的有轻链h1799_VL.1A、重链h1799_VH.1两种突变。其它类推。

1799号人源化具体序列如下：

＞h1799_VH.1(同h1799VH-CDR graft，SEQ ID NO：33)

＞h1799_VH.1A(SEQ ID NO：34)

＞h1799_VH.1B(SEQ ID NO：35)

＞h1799_VL.1(同h1799VL-CDR graft，SEQ ID NO：36)

＞h1799_VL.1A(SEQ ID NO：37)

＞h1799_VL.1B(SEQ ID NO：38)

＞h1799_VL.1C(SEQ ID NO：39)

＞h1799_VL.1D(SEQ ID NO：40)

实施例4.重组嵌合抗体以及人源化抗体的制备及效果测试

抗体选用人重链IgG4/轻链kappa的恒定区与各可变区组合，在Fc段做了S228P突变来增加IgG4抗体的稳定性，也可选用本领域其它已知的突变来增加其性能。

重链恒定区序列如SEQ ID NO：41所示：

轻链恒定区序列如SEQ ID NO：42所示：

1.重组嵌合抗体的分子克隆

杂交瘤筛选所获得的阳性抗体分子经过测序后，得到可变区编码基因序列。以测序所得序列设计首尾引物，以测序基因为模板，经过PCR搭建各抗体VH/VK基因片段，再与表达载体pHr(带信号肽及hIgG4/hkappa恒定区基因(CH1-FC/CL)片段)进行同源重组，构建重组嵌合抗体全长表达质粒VH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHr，形成Ch1701和Ch1799两个嵌合抗体。

2.人源化抗体的分子克隆

人源设计之后的抗体序列，经过密码子优化后产生人密码子偏好的编码基因序列，设计引物PCR搭建各抗体VH/VK基因片段，再与表达载体pHr(带信号肽及hIgG4/hkappa恒定区基因(CH1-FC/CL)片段)进行同源重组，构建人源化抗体全长表达质粒VH-CH1-FC-pHr/VL-CL-pHr。

3.重组嵌合抗体以及人源化抗体的表达与纯化

分别表达抗体轻重链的质粒以1∶1.2的比例转染HEK293E细胞，6天后收集表达上清，高速离心去除杂质，用Protein A柱进行纯化。用PBS冲洗柱子，至A280读数降至基线。用pH3.0-pH3.5的酸性洗脱液洗脱目的蛋白，用1M Tris-HCl，pH8.0-9.0中和。洗脱样品适当浓缩后，利用PBS平衡好的凝胶层析Superdex200(GE)进一步纯化，以去除聚体，收集单体峰，分装备用。

实施例5、h1701抗体的点突变

脱酰胺修饰是抗体中可能影响后期稳定性的一种常见的化学修饰，尤其是CDR区域的部分氨基酸高度脱酰胺、氧化或者异构化修饰一般选择尽量避免或者突变降低。根据加速稳定性实验和计算机模拟抗体结构和热点预测，h1701抗体重链CDR2中的NNG是易于发生脱酰胺化的位点，上述NNG分别位于h1701抗体重链可变区的第54-56位，根据氨基酸性质和计算机抗体结构模拟技术，上述位点的氨基酸可以进行任意的氨基酸取代，优选地，h1701的CDR2突变体为：DIIPX₁X₂X₃GSKYNQKFKD(SEQ ID NO：43)，其中X₁X₂X₃分别为h1701抗体重链可变区第54-56位氨基酸残基，X₁可选自Asn、Leu、Val、Met或Glu，X₂可选自Asn、Glu、Met、His、Lys、Leu、Ala或Val，X₃可选自Gly或Ala。

进一步地，含上述第54-56位突变的CDR2与含不同回复突变的FR区可形成如下的重链可变区：＞h1701_VH.1-CDR2突变体(SEQ ID NO：44)

＞h1701_VH.1A-CDR2突变体(SEQ ID NO：45)

＞h1701_VH.1B-CDR2突变体(SEQ ID NO：46)

＞h1701_VH.1C-CDR2突变体(SEQ ID NO：47)

＞h1701_VH.1D-CDR2突变体(SEQ ID NO：48)

＞h1701_VH.1E-CDR2突变体(SEQ ID NO：49)

＞h1701_VH.1F-CDR2突变体(SEQ ID NO：50)

h1701的HCDR2突变体相关的示例性序列，及包含相应CDR2突变体的人源化序列h1701_VH.1B-CDR2突变体(SEQ ID NO：46)见以下突变体及表6。

示例性地，把h1701-009的HCDR2中的NNG设计突变为NLG、NVG、NNA、NMA、NEA、NHA、NMG、NEG、NKG、NAG、NHG(上述重链可变区的CDR2氨基酸突变体的序列分别如SEQ ID NO：51-61所示)，通过分子克隆的方法进行表达质粒构建和293E表达，纯化后进一步检测突变体抗体的亲和力和稳定性。

其中示例性变体的亲和力检测结果分别见测试例1、3。

对h1701-009进行系列氨基酸突变具体相关序列包括但不限于表6所述，具体化学稳定性检测结果见测试例9：

表6 h1701-009防脱酰胺化修饰突变体重链可变区序列

重链可变区	VH序列代号	对应的HCDR2序列
			h1701-009	SEQ ID NO：24	DIIPNNGGSKYNQKFKD(SEQ ID NO：9)
h1701-009NLG	SEQ ID NO：51	DIIPNLGGSKYNQKFKD(SEQ ID NO：62)
			h1701-009NVG	SEQ ID NO：52	DIIPNVGGSKYNQKFKD(SEQ ID NO：63)
h1701-009NNA	SEQ ID NO：53	DIIPNNAGSKYNQKFKD(SEQ ID NO：64)
			h1701-009NMA	SEQ ID NO：54	DIIPNMAGSKYNQKFKD(SEQ ID NO：65)
h1701-009NEA	SEQ ID NO：55	DIIPNEAGSKYNQKFKD(SEQ ID NO：66)
			h1701-009NHA	SEQ ID NO：56	DIIPNHAGSKYNQKFKD(SEQ ID NO：67)
h1701-009NMG	SEQ ID NO：57	DIIPNMGGSKYNQKFKD(SEQ ID NO：68)
			h1701-009NEG	SEQ ID NO：58	DIIPNEGGSKYNQKFKD(SEQ ID NO：69)
h1701-009NKG	SEQ ID NO：59	DIIPNKGGSKYNQKFKD(SEQ ID NO：70)
			h1701-009NAG	SEQ ID NO：60	DIIPNAGGSKYNQKFKD(SEQ ID NO：71)
h1701-009NHG	SEQ ID NO：61	DIIPNHGGSKYNQKFKD(SEQ ID NO：72)

以下用测试方法验证本发明抗体性能及有益效果。

测试例1：抗TIM-3抗体与人TIM-3过表达CHO-s细胞的结合实验

抗TIM-3抗体的结合力通过抗体与过表达TIM-3蛋白的CHO-S细胞的结合实验来检测。通过电转染的方法将TIM-3全长质粒(内部生产，SEQ ID NO：3)转染进CHO-S细胞中后加压筛选两周后，检测TIM-3的表达量。将过表达细胞固定于96孔板底后，抗体加入后信号的强弱被用于判断抗体和Tim-3过表达CHO-S细胞的结合活性，具体实验方法如下。所使用的阳性对照抗体为AbTim-3，序列来源自US20150218274A1表2，为我公司自行制备。

将细胞以4E5/ml密度，100μl/孔接种于96孔板中过夜培养。弃上清，用PBS洗三遍后，加入100μl/孔4％PFA室温固定半小时，PBS洗三遍。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(光明脱脂奶粉)封闭液200μl/孔，37℃孵育箱孵育2.5小时进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(PH7.4 PBS含0.05％tweeen-20)洗板5次后，加入50μl/孔用样品稀释液稀释的不同浓度待测抗体(杂交瘤纯化抗体或人源化抗体)，放于37℃孵育箱孵育1小时。孵育结束后用PBST洗板5次，加入100μl/孔用样品稀释液稀释的HRP标记的羊抗鼠二抗(Jackson Immuno Research，Cat No.115-035-003)或羊抗人二抗(Jackson ImmunoResearch，Cat No.109-035-003)，37℃孵育1小时。用PBST洗板6次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，Cat No.52-00-03)，于室温孵育5-15min，加入50μl/孔1M H₂SO₄终止反应，用NOVOStar酶标仪在波长450nm处读取吸收值，计算TIM-3抗体对Tim-3过表达CHO-S细胞的结合EC50值。

表7候选抗体在细胞结合实验中的EC50的测定

结果表明，TIM-3抗体1701号和1799号及其人源化抗体与过表达人TIM-3全长蛋白的CHO-s细胞均有很好的结合活性。

对h1701-009抗体的HCDR2点突变抗体进行的人TIM-3过表达细胞结合活性检测，结果见表8。

表8候选抗体在细胞结合实验中的EC50的测定

结果显示，h1701-009抗体的HCDR2点突变抗体对过表达人TIM-3的CHO-s细胞仍显示出很强的结合活性。

测试例2：抗TIM-3抗体分组竞争实验

用pH7.4的PBS(Sigma，Cat No.P4417-100TAB)缓冲液将抗体A稀释至2μg/ml浓度，以50μl/孔的体积加入96孔酶标板(Corning，Cat No.CLS3590-100EA)中，于37℃孵育箱中放置2小时。弃去液体后，加入用PBS稀释的5％脱脂牛奶(光明脱脂奶粉)封闭液200μl/孔，37℃孵育箱孵育2.5小时或4℃放置过夜(16-18小时)进行封闭。封闭结束后，弃去封闭液，并用PBST缓冲液(PH7.4 PBS含0.05％tweeen-20)洗板5次后，加入50μl/孔用样品稀释液(PH7.4PBS含1％BSA)稀释至20μg/ml和4μg/ml的抗体B及终浓度为0.4μg/ml的生物素标记的TIM-3-Fc蛋白(内部生产，SEQ ID NO：1)的预混液，置37℃孵育箱孵育1小时。孵育结束后，弃去酶标板中的反应液，用PBST洗板5次后，加入100μl/孔用样品稀释液稀释的HRP标记的streptavidin(Sigma，Cat No.S2438)，37℃孵育1小时。用PBST洗板5次后，加入50μl/孔TMB显色底物(KPL，Cat No.52-00-03)，于室温孵育5-10min，加入50μl/孔1M H₂SO₄终止反应，用NOVOStar酶标仪在波长450nm处读取吸收值，计算不同抗体对Tim-3结合的竞争作用。

表9 mAb-1701和mAb-1799与TIM-3结合的竞争试验

结果表明，在结合TIM-3时，mAb-1701与mAb-1799两者之间没有竞争关系。

测试例3：BIAcore检测抗TIM-3抗体亲和力实验

1、鼠源抗体BIAcore亲和力检测

按照鼠抗捕获试剂盒(Cat.#BR-1008-38，GE)说明书中所述的方法将鼠抗捕获抗体共价偶联于CM5生物传感芯片(Cat.#BR-1000-12，GE)上，从而亲和捕获待测抗体，然后于芯片表面流经TIM-3-His(Sino.Biol，Cat.10390-H03H)抗原，利用Biacore仪器实时检测反应信号从而获得结合和解离曲线，通过拟合得到亲和力数值。在实验中每个循环解离完成后，用鼠抗捕获试剂盒里配置的再生溶液将生物芯片洗净再生，结果如表10所示。

表10候选抗体的亲和力测定

结果表明，TIM-3抗体mAb-1701号和mAb-1799号对人TIM-3蛋白有较强的结合活性和亲和力。

2、嵌合抗体和人源化抗体BIAcore亲和力检测

按照人抗捕获试剂盒(Cat.#BR-1008-39，GE)说明书中所述的方法将人抗捕获抗体共价偶联于CM5生物传感芯片(Cat.#BR-1000-12，GE)上，从而亲和捕获待测抗体，然后于芯片表面流经TIM-3-Flag-His(内部生产，SEQ ID NO：2)抗原，利用Biacore仪器实时检测反应信号从而获得结合和解离曲线，通过拟合得到亲和力数值，见下表11。在实验中每个循环解离完成后，用人抗捕获试剂盒里配置的再生溶液将生物芯片洗净再生。

表11抗TIM-3抗体的亲和力

结果表明，本发明筛选得到的人源化抗体对人TIM-3蛋白有较强的结合活性和亲和力(结果未全部示出)。

对h1701-009抗体的HCDR2点突变抗体进行的BIAcore亲和力检测，结果见表12。

表12抗TIM-3抗体的亲和力

结果显示，上述h1701-009突变体仍具有很强的TIM-3亲和力。在NNG位点的突变并不影响抗体与抗原的亲和力。

测试例4：体外免疫细胞功能实验

为研究抗TIM-3抗体对T淋巴细胞激活效果，我们建立了3个体外功能实验：混合淋巴细胞反应实验(MLR assay)，PBMC活化实验以及超抗原金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)刺激实验。

1.混合淋巴细胞反应实验

实验过程简单描述如下：

1)收集和纯化人外周血单核细胞(PBMC)；

2)将PBMC以2E6 cell/ml密度种于6孔NUNC板中培养2小时；

3)去除非贴壁细胞，使用GM-CSF(100ng/ml)和IL-4(100ng/ml)刺激贴壁细胞5天，然后再和TNFα(100ng/ml)孵育2天诱导DC细胞成熟；

4)将成熟的DC细胞和不同献血者的PBMC以1∶5的比例混合培养在预先包被10ng/ml CD3抗体的96孔板中，同时加入不同浓度的h1701-009，h1799-005，AbTIM-3以及阴性对照Fc-IgG；

5)5天后使用ELISA的方法检测上清中的IFNγ浓度(结果如图2A至图2C所示)。

结果显示，h1701-009，h1799-005以及AbTIM-3均有效刺激了IFNγ的分泌，h1701-009，h1799-005则显示出更强的刺激作用。

2.PBMC活化实验

实验过程简单描述如下：

1)收集和纯化人外周血单核细胞(PBMC)，并用CD3和CD28抗体包被96孔板，浓度均为10ng/ml；

2)将PBMC以1E5cell/孔的密度种于包被好的96孔板中。同时加入不同浓度的TIM-3抗体以及阴性对照Fc-IgG；

3)6天后收集细胞进行细胞内IFNγ和TIM-3染色，利用FACS分析IFNγ阳性细胞比例(IFNγ+％)，在所有细胞上IFNγGeo mean值，IFNγ和TIM-3双阳性细胞比例(TIM-3+IFNγ+％)，在TIM-3+细胞上IFNγGeo mean值(图3A至图3D)。

结果显示，h1701-009，h1799-005以及AbTIM-3不同程度提高了细胞内IFNγ阳性细胞的百分比以及IFNγ的表达，h1701-009，h1799-005的作用更强。

3.SEB刺激实验

实验过程简单描述如下：

1)收集和纯化人外周血单核细胞(PBMC)；

2)将PBMC以1E5cell/孔的密度种于96孔板中。同时加入1ng/ml SEB和不同浓度的TIM-3抗体以及阴性对照Fc-IgG；

3)5天后收集上清用ELISA检测IL12和IFNγ(分别见图4A和图4B)；

结果显示，h1701-009，h1799-005以及AbTIM-3均有效升高了SEB诱导的IL12和IFNγ的分泌，h1701-009，h1799-005在低剂量时显示出更高的优势。

测试例5：抗TIM-3人源化抗体，h1701-009，h1799-005的大鼠PK测定

SD大鼠12只，体重180-240g，购自西普尔-必凯实验动物有限公司。饲养期间自由摄取饲料和水，实验室环境适应性饲养不小于3天，12/12小时光/暗周期调节，温度16-26℃，相对湿度40-70％。实验开始前一天，对SD大鼠进行编号，随机分组，每组3只(2雄1雌)。实验当天，两组大鼠分别静脉注射受试药物h1701-009，给药剂量为3mg/kg和10mg/kg；两组大鼠分别静脉注射受试药物h1799-005，给药剂量为3mg/kg和10mg/kg。静脉注射体积为5ml/kg。

于给药前及给药后5min，8h，1d，2d，4d，7d，10d，14d，21d，28d各时间点采血。每只动物取全血0.2ml，不加抗凝剂，取血后在4℃放置30min，1000g离心15min，取上清置于EP管中，80℃保存。

采用ELISA方法检测血清中的抗体浓度，采用Winnolin软件计算受试药物的药动学参数。所得主要药动学参数见表13。

表13 h1799-005，h1701-009在大鼠体内的半衰期

SD大鼠静脉注射给予10mg/kg抗TIM-3抗体h1701-009，h1799-005后，在大鼠体内的暴露量相近；抗体h1799-005在3，10mg/kg剂量下的暴露量增长与剂量增长基本呈线性关系，抗体h1701-009在3，10mg/kg剂量下的暴露量增长略高于剂量增长倍数；抗体h1701-009，h1799-005的消除半衰期相近。

测试例6：利用DSC检测h1701-009，h1799-005抗体的热稳定性

比较了不同的缓冲体系不同pH条件下的热稳定性情况，不同pH对应的示例性缓冲体系如10mM PB(pH7)，15mM His(pH6.0)，10mM Acetate(pH5.2)。将样品置换到对应缓冲液中，控制样品浓度在1mg/ml左右，利用MicroCal*VP-Capillary DSC(Malvern)进行检测。检测前，将各个样品及空白buffer用真空脱气器脱气1～2min。样品板每个孔加入400μl样品或空白buffer(仪器上样量为300μl)。最后两对孔板分别加入14％Decon 90和ddH2O，以备清洗用，样品板加样完毕后，套上塑料软盖板。扫描温度从25℃开始到100℃结束，扫描速率60℃/h。具体结果如表14所示，在几个测试体系中h1701-009、h1799-005均表现了较好的热稳定性。

表14 h1701-009和h1799-005抗体不同pH热稳定性监测表

测试例7：通过SEC-HPLC监测样品纯度考察一定浓度条件下周期性稳定性

示例性的条件比如将样品浓度控制在约50mg/ml，在PBS(pH7.4)体系中比较不同抗体在比如-80℃反复冻融5次及4℃和40℃保存一个月的稳定性情况。利用Xbridgeprotein BEH SEC 200A(Waters)HPLC柱子检测抗体纯度，通过一个月的考察，h1701-009、h1799-005均表现了良好的稳定性，一个月40℃加速SEC纯度无明显变化。

测试例8：抗体的化学稳定性

对h1701-009、h1799-005以及SEQ ID NO：51-55所示的h1701-009突变体进行化学稳定性检测。

取500μg待测抗体溶于500μl pH 7.4的PBS中，40℃水浴；分别于0、14、28天取样，用于酶解实验。将100μg不同时间点取样的样品溶于100μl 0.2M His-HCl，8M Gua-HCl，pH6.0溶液中，加3μl 0.1g/mL DTT，50℃水浴1小时，后用0.02M His-HCl，pH 6.0的溶液超滤两次，加入3μL 0.25mg/mL的trypsin，37℃水浴酶解过夜。Agilent 6530 Q-TOF进行LC-MS检测分析，结果显示h1799-005在40度条件加速一个月均未发现明显的异构化、氧化及脱酰胺修饰，提示分子良好的化学稳定性。h1701-009检测中发现无明显的氧化及异构化修饰，但存在N54N55G56位点的强脱酰胺修饰，尝试对其进行系列氨基酸突变。其中示例性突变如NLG、NVG、NMA、NEA、NNA等，体外活性验证这些突变均不影响其生物活性，加速实验后进行LC-MS分析显示这些突变体均能够有效降低脱酰胺修饰，表中所示为加速后不同突变体脱酰胺修饰比例。

表15 h1701-009抗体CDR2突变体化学稳定性监测表

	0天	一周	两周
				h1701-009	11.16％	17.55％	34.62％
h1701-009NLG	0	0	0
				h1701-009NVG	0	0	0
h1701-009NMA	0	0	0
				h1701-009NEA	0	0	0
h1701-009NNA	0	0	13.58％

虽然为了清楚的理解，已经借助于附图和实例详细描述了上述发明，但是描述和实例不应当解释为限制本发明的范围。本文中引用的所有专利和科学文献的公开内容通过引用完整地清楚结合。

Claims

1.TIM-3抗体或其抗原结合片段，其与人TIM-3的胞外区结合，其选自下面(a)至(m)中的任一种单克隆抗体或其抗原结合片段：

(a)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、9和10所示的抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(b)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、62和10所示的抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(c)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、63和10所示的抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(d)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、64和10所示的抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(e)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、65和10所示的抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(f)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、66和10所示的抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(g)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、67和10所示的抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(h)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、68和10所示的抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(i)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、69和10所示的抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(g)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、70和10所示的抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(k)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、71和10所示的抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(l)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：8、72和10所示的抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和分别如SEQ ID NO：11、12和13所示的抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3；

(m)单克隆抗体或其抗原结合片段，其包含分别如SEQ ID NO：14、15和16所示的抗体重链可变区的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和分别如SEQ ID NO：17、18和19所示的抗体轻链可变区的LCDR1、LCDR2和LCDR3。

2.如权利要求1所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体是重组抗体。

3.如权利要求2所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述单克隆抗体选自鼠源抗体、嵌合抗体和人源化抗体。

4.如权利要求3所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体轻链和重链可变区上的轻链和重链FR区序列分别来源于人种系轻链和重链或其突变序列。

5.如权利要求4所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体含有SEQID NO:44或31所示的重链可变区或其变体；所述变体是在SEQ ID NO:44或31所示的重链可变区序列上具有1-10个氨基酸变化。

6.如权利要求5所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述变体是在SEQ ID NO:44或31所示的重链可变区的FR区位置上具有1-10个氨基酸的回复突变。

7.如权利要求6所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述回复突变选自在SEQ IDNO:44所示的重链可变区上具有选自D89E,R98T,G49A,M48I,M70L,R38K和V68A中的氨基酸回复突变或在SEQ ID NO:31所示的重链可变区上具有选自Q3K和R87K中的氨基酸回复突变。

8.如权利要求7所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含选自SEQ ID NO:45-50中任一个所示的重链可变区或包含选自SEQ ID NO:34-35中任一个所示的重链可变区。

9.如权利要求4所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述的人源化抗体含有SEQID NO:21或32所示的轻链可变区或其变体；所述变体是在SEQ ID NO:21或32所示的轻链可变区上具有1-10个氨基酸变化的序列。

10.如权利要求9所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述变体是在SEQ ID NO:21或32所示的轻链可变区的FR区位置上具有1-10个氨基酸的回复突变。

11.如权利要求10所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述回复突变选自在SEQID NO:21所示的轻链可变区上具有A43S的氨基酸回复突变或在SEQ ID NO:32所示的轻链可变区上具有选自Q3K、I48V、K45Q、A43S和T85S中的氨基酸回复突变。

12.如权利要求11所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含选自SEQ ID NO:30所示的轻链可变区或包含选自SEQ ID NO:37-40中任一个所示的轻链可变区。

13.如权利要求4所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含：

选自SEQ ID NO:44-50中任一个所示的重链可变区序列和选自SEQ ID NO:29-30中任一个所示的轻链可变区序列，或

选自SEQ ID NO:22-28中任一个所示的重链可变区序列和选自SEQ ID NO:29-30中任一个所示的轻链可变区序列，或

选自SEQ ID NO:33-35中任一个所示的重链可变区序列和选自SEQ ID NO:36-40中任一个所示的轻链可变区序列。

14.如权利要求13所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含如SEQ ID:24所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:29所示的轻链可变区序列；或

包含如SEQ ID NO:33所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:36所示的轻链可变区序列。

15.如权利要求4所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含：选自SEQ ID NO:51-61中任一个所示的重链可变区序列和选自SEQ ID NO:29-30中任一个所示的轻链可变区序列。

16.如权利要求15所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述人源化抗体包含：如SEQ ID NO:51所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:29所示的轻链可变区序列；或如SEQID NO:52所示的重链可变区序列和如SEQ ID NO:29所示的轻链可变区序列。

17.如权利要求1至16中任一项所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体为全长抗体，进一步包括人抗体恒定区。

18.如权利要求17所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体包含如SEQ IDNO:41所示的人重链恒定区序列和如SEQ ID NO:42所示的人轻链恒定区序列。

19.如权利要求1至18中任一项所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，其中所述抗原结合片段选自Fab、Fab'、F(ab')2、单链抗体(scFv)、二聚化的V区(双抗体)、二硫键稳定化的V区(dsFv)和包含CDR的肽的抗原结合片段。

20.一种药物组合物，其含有治疗有效量的根据权利要求1至19中任一项所述的TIM-3抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

21.一种核酸分子，其编码权利要求1至19中任一项的抗体或其抗原结合片段。

22.一种重组载体，其包含根据权利要求21所述的核酸分子。

23.一种用根据权利要求22所述的重组载体转化的宿主细胞，所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞。

24.如权利要求23所述宿主细胞，所述宿主细胞为真核细胞。

25.如权利要求23所述宿主细胞，所述宿主细胞为哺乳动物细胞。

26.用于生产权利要求1至19中任一项的抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括将权利要求23至25中任一项所述的宿主细胞在培养物中进行培养以形成并积累权利要求1至19中任一项的抗体或其抗原结合片段，以及从培养物回收所述抗体或其抗原结合片段。

27.权利要求1至19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备用于免疫检测或测定人TIM-3的试剂中的用途。

28.用于检测或测定人TIM-3的试剂，所述试剂包含权利要求1至19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

29.用于与人TIM-3阳性细胞相关的疾病的诊断剂，所述诊断剂包含根据权利要求1至19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

30.权利要求1至19中任一项的抗体或其抗原结合片段在制备用于检测或测定人TIM-3或TIM-3阳性细胞的试剂中的用途。

31.权利要求1至19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段在制备与人TIM-3阳性细胞相关的疾病的诊断剂中的应用。

32.用于与人TIM-3阳性细胞相关的疾病的治疗剂，所述治疗剂包含权利要求1至19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或包含权利要求20所述的药物组合物，或包含权利要求21所述的核酸分子。

33.权利要求1至19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或包含权利要求20所述的药物组合物，或权利要求21所述的核酸分子在制备诱导人TIM-3阳性细胞的细胞死亡的药物中的应用。

34.权利要求1至19中任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或包含权利要求20所述的药物组合物，或权利要求21所述的核酸分子在制备与人TIM-3阳性细胞相关的疾病的治疗剂中的应用。