CN108779179B - Cd47抗体、其抗原结合片段及其医药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了CD47抗体、其抗原结合片段及其医药用途。进一步地，本发明公开了包含所述CD47抗体CDR区的嵌合抗体、人源化抗体，包含所述CD47抗体及其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为抗癌药物的用途。
Description
技术领域
本公开涉及生物学和医学领域；更具体而言，本公开涉及一种CD47抗体及其抗原结合片段、其嵌合抗体、人源化抗体，以及包含所述CD47抗体或其抗原结合片段的药物组合物，以及其作为抗癌药物的用途。
背景技术
随着人类对免疫系统和肿瘤发生机制上认识的深入，肿瘤免疫疗法已经日益成为人类对抗肿瘤的有力武器。
肿瘤靶向单克隆抗体是肿瘤免疫治疗领域的重要手段之一。巨噬细胞发挥吞噬效应需要两个信号同时起作用：一个是靶向细胞表面的“eat me”信号的激活，另一个是同一细胞表面“don′t eat me”信号的失活。任何一个信号的缺少都不足以引发吞噬效应的发生。越来越多的证据表明，CD47是一类“don′t eat me”信号，它通过与巨噬细胞表面的SIRP-α相互结合而抑制巨噬细胞的吞噬功能。
CD47是免疫球蛋白Ig超家族成员，其广泛表达于不同组织的细胞表面，比如红细胞、淋巴细胞、血小板、肝细胞。CD47在各种肿瘤细胞上有较高表达，有研究显示多种肿瘤细胞表面的CD47表达量高于正常细胞平均约3倍多。此外，癌细胞表达大量CD47的患者相比于CD47表达低水平的患者具有更短的生存期。目前研究已经发现，阻断性抗CD47单克隆抗体在肿瘤治疗方面有着非常良好的效果，但是这一过程的作用机制尚不清楚。
CD47作为癌症治疗的靶点具有以下不可比拟的优势：
1.它广泛地表达于各类癌细胞表面，因此可以用于治疗各种类型的癌症；
2.正常细胞由于缺乏“eat me”信号，因此单单阻断CD47并不能引发巨噬细胞对正常细胞的吞噬效应。因此，CD47阻断剂的副作用十分小。前期的很多基础实验数据已经支持了这一观点。研究者通过小鼠异体肿瘤移植模型说明了CD47阻断的有效性与安全性。
目前已有相关的CD47专利，如WO2016065329、WO2016109415、WO2014087248和WO2014093678。有效阻断CD47与SIRP-α之间的结合并促进体内巨噬细胞对于肿瘤细胞的吞噬，具有良好的临床前景。
发明内容
本公开的第一个方面提供一种CD47抗体或其抗原结合片段，其包含：抗体重链可变区的CDR区(以下称为HCDR)和/或抗体轻链可变区的CDR区(以下称为LCDR)。
在一些实施方案中，HCDR选自以下的任一个或多个CDR：SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16、以及与SEQ ID NO：8、SEQID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：16具有至少85％序列同一性的CDR。
在另一些实施方案中，LCDR选自以下的任一个或多个CDR：SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、以及与SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19具有至少85％序列同一性的CDR。
在本公开的上下文中，表述“至少85％序列同一性”是指至少85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％的序列同一性。
在本公开一个具体的实施方案中，提供了一种CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含抗体重链可变区；其中所述的抗体重链可变区包含SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，或与SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9或SEQ ID NO：10具有至少85％序列同一性的CDR。
在另一个具体的实施方案中，提供了一种CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含抗体重链可变区；其中所述的抗体重链可变区包含SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，或与SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15或SEQ IDNO：16具有至少85％序列同一性的CDR。
在本公开一个具体的实施方案中，提供了一种CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含抗体轻链可变区；其中所述的抗体轻链可变区包含SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或与SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12或SEQ IDNO：13具有至少85％序列同一性的CDR。
在另一个具体的实施方案中，提供了一种CD47的人源化抗体或其抗原结合片段，其包含抗体轻链可变区；其中所述的抗体轻链可变区包含SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18和SEQ ID NO：19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，或与SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：18或SEQ IDNO：19具有至少85％序列同一性的CDR。
在本公开一个具体的实施方案中，提供了一种CD47抗体或其抗原结合片段，其为鼠源抗体或其抗原结合片段。
在本公开一个具体的实施方案中，提供了一种CD47抗体或其抗原结合片段，所述抗体的轻链可变区包含鼠源轻链FR区或其突变序列；所述抗体的重链可变区包含鼠源重链FR区或其突变序列。
在本公开一个具体的实施方案中，提供了一种CD47抗体或其抗原结合片段，所述抗体包含SEQ ID NO：4所示的重链可变区和SEQ ID NO：5所示的轻链可变区。在另一个实施方案中，提供了一种CD47抗体或其抗原结合片段，所述CD47抗体包含SEQ ID NO：6所示的重链可变区和SEQ ID NO：7所示的轻链可变区。
在本公开一个具体的实施方案中，提供了一种CD47抗体或其抗原结合片段，其为嵌合抗体或其抗原结合片段。
在本公开一个具体的实施方案中，提供了一种CD47人源化抗体或其抗原结合片段，其重链可变区上重链FR区的序列选自人种系重链IGHV1-3*01和hjh6.1的组合及其突变序列，或选自人种系重链IGHV1-2*02和hjh6.1的组合及其突变序列。
本公开一个具体的实施方案中，提供了一种CD47人源化抗体或其抗原结合片段，其轻链可变区上轻链FR区的序列选自人种系轻链IGKV4-1*01和hjk2.1的组合及其突变序列，或选自人种系轻链IGKV1-39*01和hjk4.1的组合及其突变序列。
在本公开一个具体的实施方案中，提供了一种CD47人源化抗体或其抗原结合片段，所述人源化抗体或其抗原结合片段的可变区上FR区包含0至10个氨基酸的回复突变，包括但不限于0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸的回复突变。
在本公开一个具体的实施方案中，提供了一种CD47人源化抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ ID NO：20所示的重链可变区或其突变序列和SEQ ID NO：21所示的轻链可变区或其突变序列。
在本公开另一个具体的实施方案中，提供了一种CD47人源化抗体或其抗原结合片段，其包含SEQ ID NO：22所示的重链可变区或其突变序列和SEQ ID NO：23所示的轻链可变区或其突变序列。
在本公开一个具体的实施方案中，提供了一种CD47人源化抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区突变序列，所述轻链可变区突变序列是在SEQ ID NO：21所示的轻链可变区基础上，将第66位氨基酸残基D替换为E(以D66E表示，以下同)。
在本公开一个具体的实施方案中，提供了一种CD47人源化抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区突变序列，所述重链可变区突变序列是在SEQ ID NO：20所示的重链可变区基础上，包含选自以下的突变：R72A、M48I、E46D、V68A、I70L、R38K、R67K、A97S及其组合。在一个具体的实施方案中，所述重链可变区突变序列是在SEQ ID NO：20所示的重链可变区基础上包含选自以下的突变：R72A、M48I、E46D、V68A、I70L及其组合。
在本公开一个具体的实施方案中，提供了一种CD47人源化抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区突变序列，所述轻链可变区突变序列是在SEQ ID NO：23所示的轻链可变区基础上，包含选自以下的突变：V58I、I2V、M4I、Q38E、A43T、P44H及其组合。在一个具体的实施方案中，所述轻链可变区突变序列是在SEQ ID NO：23所示的轻链可变区基础上，包含选自以下的突变I2V、M4I及其组合。
在本公开一个具体的实施方案中，提供了一种CD47人源化抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区突变序列，所述重链可变区突变序列是在SEQ ID NO：22所示的重链可变区基础上，包含选自以下的突变：R72V、M48V、V68A、M70L、T74K、A40R、R38K、R67K及其组合。
在本公开一个具体的实施方案中，提供了一种CD47抗体或其抗原结合片段，其中：所述人源化抗体可变区包含：SEQ ID NO：26所示的重链可变区或其突变序列，和SEQ IDNO：27所示的轻链可变区或其突变序列；或
所述人源化抗体可变区包含：SEQ ID NO：28所示的重链可变区或其突变序列，和SEQ ID NO：29所示的轻链可变区或其突变序列。
在本公开一个具体的实施方案中，提供了一种CD47嵌合抗体或CD47人源化抗体，其重链包含：
·人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的重链恒定区或其突变序列；和
·人源κ链、λ链的轻链恒定区或其突变序列。
在本公开一个具体的实施方案中，提供了一种CD47嵌合抗体或CD47人源化抗体，其重链包含：
·人源IgG4的重链恒定区或其突变序列，和
·人源κ链的轻链恒定区或其突变序列。
在本公开一个具体的实施方案中，提供了一种CD47嵌合抗体或CD47人源化抗体，其重链包含：含有F234A和L235A突变的人源IgG4重链恒定区(如SEQ ID NO：30)。
本公开进一步提供一种药物组合物，其含有：
·治疗有效量的根据本公开的CD47抗体或其抗原结合片段，以及
·一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
根据本公开的CD47抗体或其抗原结合片段可以作为药物组合物中唯一的药物活性成分而配制于组合物中，或者可以与其它活性组分组合配制在组合物中。
本文所用的“载体”包括当其以所用剂量和浓度与细胞或哺乳动物接触时没有毒性的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。药学上可接受的载体通常是指缓冲水溶液。药学上可接受的载体的例子包括但不限于缓冲液；抗氧化剂；多肽；蛋白质；亲水性聚合物；氨基酸；糖；螯合剂；糖醇；离子；表面活性剂。再比如，药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂还可以是脂质体的形式，包括以癌组织为靶标的脂质体也可以用作药物学上可接受的载体。这些都可以依据本领域技术人员已知的方法来制备。
“治疗有效量”可以通过在已知的体外和体内系统中测试本公开的CD47抗体或其抗原结合片段而确定，例如根据在动物体上所证实的有效量，然后由此推断出用于人的量。
为了全身性的、外部的或局部的给药，将本公开的CD47抗体或其抗原结合片段与合适的药物载体混合，从而形成药物组合物。组合物中CD47抗体或其抗原结合片段的浓度取决于抗体或其抗原结合片段的吸收、失活、代谢率、给药方案、给药量、剂型以及本领域技术人员已知的其它因素。
本公开的药物组合物可以通过本领域技术人员已知的任何途径来施用，例如但不限于口服、局部给药、脑内给药、眼内给药、心内给药、鞘内给药、静脉内给药、肌内给药、腹腔内给药、皮内给药、气管内给药及其组合。
最合适的给药途径将依据预期用途而变化。例如，对于各种癌症的治疗，例如乳腺癌、膀胱癌和肠胃癌的治疗，可以采用局部给药，包括施用至肿瘤生长的位点是优选的，因为优点在于本公开的CD47抗体或其抗原结合片段能够以较高的浓度被施用。
用于肠胃外、皮内、皮下的溶液或悬浮液，包括但不限于：无菌稀释剂；抗菌剂；抗氧化剂；缓冲液；以及用于调整渗透压的试剂。肠胃外给药的制剂可以装入玻璃、塑料或其他合适材料制成的安瓿、注射器或者单剂量或多次剂量的小瓶中。
本公开进一步提供一种双特异性抗体，其包含根据本公开的CD47抗体或其抗原结合片段。
本公开进一步提供一种分离的核酸，其编码根据本公开的CD47抗体或其抗原结合片段。
本公开进一步提供一种表达载体，其表达根据本公开的CD47抗体或其抗原结合片段。
本公开进一步提供一种表达载体，其包含根据本公开的分离的核酸。
本公开进一步提供一种宿主细胞，其转化有根据本公开的表达载体。
在具体的实施方案中，所述宿主细胞选自原核细胞或真核细胞。在具体的实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞。在具体的实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
本公开进一步提供一种用于制备CD47抗体及其抗原结合片段的方法，包括：
·在适合表达本公开的CD47抗体或其抗原结合片段的条件下，培养如上所述的宿主细胞，以及
·自该宿主细胞中分离本公开的CD47抗体或其抗原结合片段。
本公开进一步提供一种用于抑制受试者中的肿瘤细胞的生长的方法，包括：
向所述受试者施用本公开的CD47抗体或其抗原结合片段、或本公开的药物组合物。
本公开进一步提供了本公开的CD47抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗癌症的药物中的用途。根据另一方面，提供了本公开的药物组合物在制备用于治疗癌症的药物中的用途。根据又一方面，提供了本公开的双特异性抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途。
在一些实施方案中，本公开的CD47抗体或其抗原结合片段能够治疗癌症，所述癌症包括，但不限于：卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、肠癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、子宫癌、肝癌、膀胱癌、子宫颈癌、口腔癌、脑癌、睾丸癌、皮肤癌、甲状腺癌以及血液学恶性肿瘤。在一些实施方案中，血液学恶性肿瘤选自骨髓瘤、慢性白血病和急性白血病。
附图说明
图1为本公开CD47抗体在体外增强CCRF-CEM细胞的抗体依赖性细胞的吞噬作用(ADCP)。
表示hu055-5；
表示hu167-33；
表示5F9。
图2为本公开CD47抗体红细胞凝集实验。
图3为本公开CD47抗体红细胞裂解实验。
图4为本公开CD47抗体hu055-5大鼠体内药代动力学。
图5为本公开CD47抗体hu167-33大鼠体内药代动力学。
具体实施方式
术语
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本公开所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
CD47是一种广泛表达的细胞膜表面的免疫球蛋白，又称整合素相关蛋白。信号调节蛋白(singal regulatory protein，SIRP)是抑制性受体超家族的一个成员，属于免疫球蛋白超家族，主要表达于巨噬细胞、树突状细胞和神经细胞表面，通过细胞表面受配体接触调节细胞的迁移和吞噬活性、免疫自稳及神经元网络。CD47是人信号调节蛋白α(SIRPα)的胞外配体，通过与巨噬细胞表面SIRPα结合传导抑制性信号而降低吞噬活性，进而对固有免疫系统产生抑制作用，该信号被形象的描述为“don′t eat me(别吃我)”信号。
本公开所述的抗体指免疫球蛋白，是由两条相同的重链和两条相同的轻链通过链间二硫键连接而成的四肽链结构。免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，故其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白分为五类，或称为免疫球蛋白的同种型，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、6链、γ链、α链、ε链。同一类Ig根据其铰链区氨基酸组成和重链二硫键的数目和位置的差别，又可分为不同的亚类，如IgG可分为IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。轻链通过恒定区的不同分为κ链、λ链。五类Ig中每类Ig都可以有κ链、λ链。
在本公开中，所述的抗体轻链可进一步包含轻链恒定区，所述的轻链恒定区包含人源或鼠源的κ、λ链的恒定区或其突变序列。
在本公开中，所述的抗体重链可进一步包含重链恒定区，所述的重链恒定区包含人源或鼠源的IgG1，2，3，4的恒定区或其突变序列。
抗体重链和轻链靠近N端的约110个氨基酸的序列变化很大，为可变区(V区)；靠近C端的其余氨基酸序列相对稳定，为恒定区(C区)。可变区包括3个高变区(HVR)和4个序列相对保守的骨架区(FR)。3个高变区决定抗体的特异性，又称为互补性决定区(CDR)。每条轻链可变区(LCVR)和重链可变区(HCVR)由3个CDR区4个FR区组成，从氨基端到羧基端依次排列的顺序为：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链的3个CDR区指LCDR1、LCDR2、和LCDR3；重链的3个CDR区指HCDR1、HCDR2和HCDR3。
发明所述的抗体或其抗原结合片段的LCVR区和HCVR区的CDR氨基酸残基在数量和位置符合已知的Kabat编号规则(LCDR1-3、HCDR2-3)，或者符合kabat和chothia的编号规则(HCDR1)。
术语“鼠源抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能制备的对人CD47的单克隆抗体。制备时用CD47抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体。在本公开一个优选的实施方案中，所述的鼠源CD47抗体或其抗原结合片段，可进一步包含鼠源κ、λ链或其突变序列的轻链恒定区，或进一步包含鼠源IgG1、IgG2、IgG3或其突变序列的重链恒定区。
术语“嵌合抗体(chimeric antibody)”，是将鼠源性抗体的可变区与人抗体的恒定区融合而成的抗体，可以减轻鼠源性抗体诱发的免疫应答反应。建立嵌合抗体，要先建立分泌鼠源性特异性单抗的杂交瘤，然后从小鼠杂交瘤细胞中克隆可变区基因，再根据需要克隆人抗体的恒定区基因，将小鼠可变区基因与人恒定区基因连接成嵌合基因后插入载体中，最后在真核工业系统或原核工业系统中表达嵌合抗体分子。在本发明优选的实施方案中，所述的嵌合抗体的抗体轻链进一步包含人源κ、λ链或其突变序列的轻链恒定区。所述的嵌合抗体的抗体重链进一步包含人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或其突变序列的重链恒定区，优选包含人源IgG2或IgG4重链恒定区，或者使用氨基酸突变后显著降低ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用)毒性的IgG4恒定区。
术语“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-graftedantibody)，是指将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架(FR)中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的对人体的免疫副反应。人种系抗体可变区框架(FR)序列可以从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http：//imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。为避免免疫原性下降的同时，引起的活性下降，可对所述的人抗体可变区进行反向突变(回复突变)，以保持活性。
本公开中所述的“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段、F(ab’)2片段、以及与人CD47结合的Fv片段、scFv片段。Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体(single chain antibody)或单链Fv(scFv)。
本公开的术语“与CD47结合”，指能与人CD47相互作用。
本公开的术语“抗原结合位点”指抗原上不连续的，由本公开抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。
本公开中所述的“ADCC”，即antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用，是指表达Fc受体的细胞通过识别抗体的Fc段直接杀伤被抗体包被的靶细胞。
本公开中所述的融合蛋白是一种通过DNA重组，将得到的两个基因共表达的蛋白产物。重组CD47胞外区Fc融合蛋白通过DNA重组，把CD47胞外区和人抗体Fc片段共表达的融合蛋白。所述的CD47胞外区，是指CD47蛋白表达在细胞膜以外的部分，序列见SEQID NO：1。
生产和纯化抗体和抗原结合片段的方法在现有技术中熟知和能找到，如冷泉港的抗体实验技术指南，5-8章和15章。如，老鼠可以用人CD47或其片段免疫，所得到的抗体能被复性、纯化，并且可以用常规的方法进行氨基酸测序。抗原结合片段同样可以用常规方法制备。发明所述的抗体或抗原结合片段用基因工程方法在非人源的CDR区加上一个或多个人FR区。人FR种系序列可以从ImMunoGeneTics(IMGT)的网站http：//imgt.cines.fr得到，或者从免疫球蛋白杂志，2001ISBN012441351上获得。
本公开工程化的抗体或抗原结合片段可用常规方法制备和纯化。比如，编码重链CDR和轻链的cDNA序列，可以克隆并重组至GS表达载体。重组的免疫球蛋白表达载体可以稳定地转染CHO细胞。作为一种更推荐的技术，哺乳动物表达系统会导致抗体的糖基化，特别是在Fc区的高度保守N端。通过表达与人CD47特异性结合的抗体得到稳定的克隆。阳性的克隆在生物反应器的无血清培养基中扩大培养以生产抗体。分泌有抗体的培养液可以用常规技术纯化。比如，用含调整过的缓冲液的Protein A或G Sepharose FF柱进行过柱。洗去非特异性结合的组分。再用酸性缓冲液洗脱结合的抗体，用SDS-PAGE检测抗体片段，收集。抗体可用常规方法进行过滤浓缩。可溶的混合物和多聚体，也可以用常规方法去除，比如分子筛、离子交换。得到的产物需立即冷冻，如-80℃，或者冻干。
本公开的抗体指单克隆抗体。本公开所述的单克隆抗体或mAb，指由单一的克隆细胞株得到的抗体，所述的细胞株不限于真核的，原核的或噬菌体的克隆细胞株。单克隆抗体或抗原结合片段可以用如杂交瘤技术、重组技术、噬菌体展示技术，合成技术(如CDR-grafting)，或其它现有技术进行重组得到。
“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施、研究和诊断应用。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，诸如包含CD47抗体或其抗原结合片段的组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，无论是通过诱导这类症状退化还是抑制这类症状发展到任何临床可测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物对患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本公开的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解某个患者的目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
本公开中所述的“突变序列”中的“突变”包括但不限于“回复突变”、“保守修饰”或“保守置换或取代”。本公开中所述的“保守修饰”或“保守置换或取代”是指具有类似特征(例如电荷、侧链大小、疏水性/亲水性、主链构象和刚性等)的其它氨基酸置换蛋白中的氨基酸，使得可频繁进行改变而不改变蛋白的生物学活性。本领域技术人员知晓，一般而言，多肽的非必需区域中的单个氨基酸置换基本上不改变生物学活性(参见例如Watson等(1987)Molecular Biology of the Gene，The Benjamin/Cummings Pub.Co.，第224页，(第4版))。另外，结构或功能类似的氨基酸的置换不大可能破环生物学活性。
本发明所述的“突变序列”是指对本发明的核苷酸序列和氨基酸序列进行适当的替换、插入或缺失等突变修饰情况下，得到的与本发明的核苷酸序列和氨基酸序列具有不同百分比序列同一性程度的核苷酸序列和氨基酸序列。本发明中所述的序列同一性可以至少为85％、90％或95％，优选至少为95％。非限制性实施例包括85％，86％，87％，88％，89％，90％，91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％，100％。两个序列之间的序列比较和同一性百分比测定可以通过National Center For Biotechnology Institute网站上可得的BLASTN/BLASTP算法的默认设置来进行。
“有效量”包含足以改善或预防医学病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
“外源性”指根据背景在生物、细胞或人体外产生的物质。“内源性”指根据背景在细胞、生物或人体内产生的物质。
本文使用的表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这类名称都包括后代。因此，单词“转化体”和“转化细胞”包括原代受试细胞和由其衍生的培养物，而不考虑转移数目。还应当理解的是，由于故意或非有意的突变，所有后代在DNA含量方面不可能精确相同。包括具有与最初转化细胞中筛选的相同的功能或生物学活性的突变后代。
本文使用的“聚合酶链式反应”或“PCR”是指微量的特定部分的核酸、RNA和/或DNA如在例如美国专利号4,683,195中所述扩增的程序或技术。一般来说，需要获得来自目标区域末端或之外的序列信息，使得可以设计寡核苷酸引物；这些引物在序列方面与待扩增模板的对应链相同或相似。2个引物的5’末端核苷酸可以与待扩增材料的末端一致。PCR可用于扩增特定的RNA序列、来自总基因组DNA的特定DNA序列和由总细胞RNA转录的cDNA、噬菌体或质粒序列等。一般参见Mullis等(1987)Cold Spring Harbor Symp.Ouant.Biol.51：263；Erlich编辑，(1989)PCR TECHNOLOGY(Stockton Press，N.Y.)。本文使用的PCR被视为用于扩增核酸测试样品的核酸聚合酶反应法的一个实例，但不是唯一的实例，所述方法包括使用作为引物的已知核酸和核酸聚合酶，以扩增或产生核酸的特定部分。
“任选”或“任选地”意味着随后所描述地事件或环境可以但不必发生，该说明包括该事件或环境发生或不发生地场合。例如，“任选包含1-3个抗体重链可变区”意味着特定序列的抗体重链可变区可以但不必须存在。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述CD47抗体或其抗原结合片段与其他化学组分的混合物，以及其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
实施例
以下结合实施例进一步描述本公开，但这些实施例并非限制本公开的范围。本公开实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如冷泉港的抗体技术实验手册，分子克隆手册；或按照原料或商品制造厂商所建议的条件。未注明具体来源的试剂，为市场购买的常规试剂。
实施例1.CD47抗原及检测用蛋白的制备
以UniProt Leukocyte surface antigen CD47(人CD47蛋白，Uniprot号：Q08722)作为CD47的模板，设计本公开涉及的抗原及检测用蛋白的氨基酸序列，可选的在CD47蛋白基础上融合不同的标签如his标签或Fc等。
1.带His标签的CD47蛋白胞外域(CD47-ECD-His)：
QLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNEHHHHHH(SEQ ID NO：1)。注释：划线部分为6×his标签。
2.CD47胞外域与人IgG1Fc融合蛋白(CD47-ECD-Fc)作为免疫原及检测试剂：
QLLFNKTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNEEPKSSDKTHTCPPCPAPELLG GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPE NNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：2)。注释：划线部分为人IgG1-Fc部分。
3.人SIRPα与人IgG1Fc融合蛋白(SIRPα-Fc)作为结合及阻断检测试剂：
EEELQIIQPDKSVSVAAGESAILHCTITSLFPVGPIQWFRGAGPARVLIYNQRQGPFPRVTTVSETTKRENMDFSISISNITPADAGTYYCIKFRKGSPDTEFKSGAGTELSVRAKPSEPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVF LFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGK EYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：3)。注释：划线部分为huamn-IgG1-Fc部分。
实施例2.CD47、SIRPα相关重组蛋白的纯化
1.带His标签的重组蛋白的纯化步骤：
将细胞表达上清样品高速离心去除杂质，并将缓冲液置换为PBS，加入咪唑至终浓度为5mM。用含有5mM咪唑的PBS溶液平衡镍柱，冲洗2-5倍柱体积。将置换后的上清样品上IMAC柱。用含有5mM咪唑的PBS溶液冲洗柱子，至A280读数降至基线。后用PBS+10mM咪唑冲洗层析柱，除去非特异结合的杂蛋白，并收集流出液。再用含有300mM咪唑的PBS溶液洗脱目的蛋白，并收集洗脱峰。收集的洗脱液浓缩后用凝胶层析Superdex200(GE，28-9893-35)进一步纯化，流动相为PBS。去除聚体峰，收集洗脱峰。所得到的蛋白经电泳、肽图、LC-MS鉴定为正确后，分装备用。
得到带His标签的CD47-ECD-His(SEQ ID NO：1)用于本公开抗体的免疫原或检测试剂。CD47-ECD-His也可以通过体外化学法与KLH进行偶联反应后作为免疫原刺激小鼠免疫。
2.CD47-ECD-Fc及SIRPα-Fc融合蛋白的纯化步骤：
将细胞表达上清样品高速离心去除杂质，上清进行MabSelect Sure(GE，17-5438-01)亲和层析。MabSelect Sure层析柱先用0.1M NaOH再生，利用纯水冲洗后用PBS平衡柱子，将上清结合后，利用PBS进行洗涤至A280读数降至基线。用0.1M醋酸缓冲液在pH3.5条件下洗脱目的蛋白，用1MTris-HCl中和。洗脱样品适当浓缩后利用PBS平衡好的凝胶层析Superdex200(GE，28-9893-35)进一步纯化，合并收集目的蛋白所在接收管浓缩至适当浓度。
此方法用来纯化CD47-ECD-Fc(SEQ ID NO：2)及SIRPα-Fc(SEQ ID NO：3)融合蛋白，该方法也可以用来纯化本公开中涉及的人源化抗体蛋白。
实施例3.抗人CD47杂交瘤单克隆抗体的获得和制备
1.免疫
抗人CD47单克隆抗体通过免疫小鼠产生。实验用SJL白小鼠，雌性，6周龄(北京维通利华实验动物技术有限公司，动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001)。
饲养环境：SPF级。小鼠购进后，实验室环境饲养1周，12/12小时光/暗周期调节，温度20-25℃；湿度40-60％。将已适应环境的小鼠按不同方案免疫，每组6-10只。
免疫抗原可以是CD47-ECD-Fc、CD47-ECD-His6、CD47-ECD-His6-KLH等，可以单独一种试剂配合不同的免疫佐剂或者不同类型免疫原交叉免疫。免疫部位可以是腹腔或者背部皮下，或者两种位置交替免疫。示例性免疫方法如用弗氏佐剂(sigma Lot Num：F5881/F5506)乳化：首免用弗氏完全佐剂(CFA)，其余加强免疫用弗氏不完全佐剂(IFA)。抗原与佐剂比例为1∶1，100μg/只(首免)，50μg/只(加强免疫)。第0天腹膜内(IP)注射100μg/只的乳化后抗原，首免后每两周一次，共6-8周。或用Titermax(sigma Lot Num：T2684)与Alum(Thremo Lot Num：77161)交叉免疫。抗原与佐剂(titermax)比例为1∶1，抗原与佐剂(Alum)比例为3∶1，10-20μg/只(首免)，5μg/只(加强免疫)。第0天腹膜内注射20/10μg/只的乳化后抗原，首免后每周一次，Titermax和Alum交替使用，共6至11周。免疫四周后，根据背部结块和腹部肿胀情况，选择背部或腹膜内注射抗原。
2.细胞融合
选择血清中抗体滴度高(见后面的测试例1，结合CD47的ELISA方法)并且滴度趋于平台的小鼠进行脾细胞融合，融合前72小时利用CD47-ECD-Fc腹腔注射冲刺免疫所选小鼠。采用优化的PEG介导的融合步骤将脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞Sp2/0细胞(
CRL-8287TM)进行融合得到杂交瘤细胞。融合好的杂交瘤细胞用HAT完全培养基(含20％FBS、1×HAT和1×OPI的RPMI-1640培养基)重悬，分装于96孔细胞培养板中(1×105/150μl/孔)，37℃，5％CO2孵育。融合后的第5天加入HAT完全培养基，50μl/孔，37℃，5％CO2孵育。融合后第7天至8天，根据细胞生长密度，全换液，培养基为HT完全培养基(含20％FBS、1×HT和1×OPI的RPMI-1640培养基)，200μl/孔，37℃，5％CO2孵育。
3.杂交瘤细胞筛选
融合后第7-9天，根据细胞生长密度，进行结合CD47的ELISA方法检测(见测试例1)。并将结合ELISA检测的阳性孔细胞进行CD47/SIRPα结合的阻断ELISA检测(见测试例2)，阳性孔换液，并根据细胞密度及时扩大至24孔板中。移入24孔板的细胞株经过复测后进行保种和第一次亚克隆。第一次亚克隆筛选(见测试例1)为阳性的进行保种，并进行第二次或第三次亚克隆，直至获得单细胞克隆。多次融合获得有阻断CD47和SIRPα结合效果(见测试例2)的杂交瘤细胞。
通过阻断实验和结合实验筛选得到杂交瘤克隆055和167，用无血清细胞培养法进一步制备抗体，按纯化实例纯化抗体，供在检测例中使用。
测得杂交瘤克隆055的鼠抗可变区序列如下：
克隆055的鼠源重链可变区序列：
克隆055的鼠源轻链可变区序列：
杂交瘤克隆167的鼠抗可变区序列如下：
克隆167的鼠源重链可变区序列：
克隆167的鼠源轻链可变区序列：
表1.各重链及轻链CDR区序列
实施例4.抗人CD47杂交瘤单克隆抗体的人源化
通过比对IMGT人类抗体重轻链可变区种系基因数据库和MOE软件，分别挑选与055和167同源性高的重轻链可变区种系基因作为模板，将这两个鼠源抗体的CDR分别移植到相应的人源模板中，形成次序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4的可变区序列。氨基酸残基由Kabat编号系统确定并注释。
1.杂交瘤克隆055人源化
1.1杂交瘤克隆055人源化构架选择
鼠源抗体055的人源化轻链模板为IGKV4-1*01和hjk2.1，人源化重链模板为IGHV1-3*01和hjh6.1，人源化可变区序列如下：
hu055VH-CDR嫁接：
hu055VL CDR嫁接：
1.2杂交瘤克隆055的人源化模板选择和回复突变设计。
表2.杂交瘤克隆055的人源化模板选择和回复突变设计
注：如D66E表示依照Kabat编号系统，将66位D突变回E。嫁接(Grafted)代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。
1.3杂交瘤克隆055的人源化
杂交瘤克隆055的人源化模板进行回复突变设计，不同的回复突变组合成不同的人源化抗体，具体见表3。
表3：鼠抗055人源化序列组合
| hu055_VL.1 | hu055_VL.1A | |
| hu055_VH.1 | hu055-1 | hu055-8 |
| hu055_VH.1A | hu055-2 | hu055-9 |
| hu055_VH.1B | hu055-3 | hu055-10 |
| hu055_VH.1C | hu055-4 | hu055-11 |
| hu055_VH.1D | hu055-5 | hu055-12 |
| hu055_VH.1E | hu055-6 | hu055-13 |
| hu055_VH.1F | hu055-7 | hu055-14 |
2.杂交瘤克隆167人源化
2.1鼠源抗体167的人源化轻链模板为IGKV1-39*01和hjk4.1，人源化重链模板为IGHV1-2*02和hjh6.1，人源化可变区序列如下：
Hu167VH-CDR嫁接
Hu167VL-CDR嫁接
2.2杂交瘤克隆167的人源化模板选择和回复突变设计，见下表4：
表4.鼠抗167人源化序列组合
注：如V58I表示依照Kabat编号系统，将58位V突变回I。嫁接代表鼠抗体CDR植入人种系FR区序列。
2.3杂交瘤克隆167的人源化
杂交瘤克隆167的人源化模板进行回复突变设计，不同的回复突变组合成不同的人源化抗体，具体见表5。
表5.鼠抗167人源化序列组合
| hu167_VL.1 | hu167_VL.1A | hu167_VL.1B | hu167_VL.1C | hu167_VL.1D | |
| hu167_VH.1 | hu167-1 | hu167-2 | hu167-3 | hu167-4 | hu167-5 |
| hu167_VH.1A | hu167-6 | hu167-7 | hu167-8 | hu167-9 | hu167-10 |
| hu167_VH.1B | hu167-11 | hu167-12 | hu167-13 | hu167-14 | hu167-15 |
| hu167_VH.1C | hu167-16 | hu167-17 | hu167-18 | hu167-19 | hu167-20 |
| hu167_VH.1D | hu167-21 | hu167-22 | hu167-23 | hu167-24 | hu167-25 |
| hu167_VH.1E | hu167-26 | hu167-27 | hu167-28 | hu167-29 | hu167-30 |
3.人源化抗体筛选
进行结合CD47的ELISA方法检测(见测试例1)，并将结合ELISA检测的阳性孔细胞进行CD47/SIRPα结合的阻断ELISA检测(见测试例2，结果见表6)，根据测试结果优选最大程度保留抗体结合能力及阻断能力的回复突变组合。
055人源化抗体的不同组合基本都保持了良好的体外阻断活性，通过Biacore进行不同人源化抗体的亲和力比较，部分数据如表8所示，结果显示人源化抗体组合均保持了对于CD47良好的结合能力，尤其是hu055-3、hu055-4、hu055-5、hu055-6、hu055-7亲和力和嵌合抗体ch-055相比基本接近。
同样对于167人源化抗体的不同组合进行结合CD47的ELISA方法检测(见测试例1)，并将结合ELISA检测的阳性孔细胞进行CD47/SIRPα结合的阻断ELISA检测(见测试例2)，根据测试结果优选最大程度保留抗体结合能力及阻断能力的回复突变组合。体外阻断实验结果显示大部分抗体均保持了良好的阻断能力，相互之间无明显差异，从中选择了部分进行Biacore亲合力比较，结果如表9所示，大部分都保持了很好的对于CD47的结合能力，尤其是hu167-4、hu167-6、hu-167-9、hu167-14。
根据亲和力及阻断活性比较不同人源化组合形式，发现回复突变中的V58I对于亲和力的维持影响很小，因此在原设计基础上增加三条轻链(分别为：hu167_VL.1E(I2V)、hu167_VL.1F(M4I)、hu167_VL.1G(I2V，M4I))和hu167_VH.1组合产生的hu167-31、hu167-32、hu167-33，体外Biacore检测及阻断活性显示三者均保持了相当的CD47结合能力及阻断活性。通过Biacore检测比较hu167-31、hu167-32、hu167-33及hu167-4的亲和力(KD)，结果显示相比hu167-4的KD比值分别为1.3、1.2、0.98，提示hu167-31、hu167-32、hu167-33很好的保持了抗体的结合能力。
实施例5.构建和表达CD47人源化抗体的IgG4-S228P及IgG4-AA形式
设计引物PCR搭建各人源化抗体VH/VK基因片段，再与表达载体pHr(带信号肽及恒定区基因(CH1-FC/CL)片段)进行同源重组，构建抗体全长表达载体VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr。IgG4-AA抗体形式可以通过IgG4抗体形式简单点突变获得，IgG4-AA代表F234A和L235A突变，结果显示其进一步降低IgG4-Fc与FcyR的结合能力，进一步降低ADCC/CDC。IgG4-S228P代表野生型IgG4铰链区第228位的氨基酸S突变成P，该位点突变能够避免天然IgG4抗体在体内发生Fab-交换(exchange)导致的错配。
IgG4-S228P的重链恒定区序列如下：
IgG4-AA代表上述序列下划线部分发生F234A和L235A突变所得的重链恒定区序列，具体本公开中IgG4-AA(包含S228P)的重链恒定区序列如下：
抗体的轻链(Kappa链)恒定区序列如下：
构建后的抗体序列列举如下：
hu167-33：抗体形式IgG4AA
hu167-33重链序列：
hu167-33轻链序列：
hu055-5：抗体形式IgG4AA
hu055-5重链序列：
hu055-5轻链序列：
测试例
测试例1.CD47抗体结合CD47蛋白的ELISA实验
抗CD47抗体的结合力通过抗体与固定在ELISA板上CD47的结合的量来检测。用PBS稀释CD47-ECD-His(SEQ ID NO：1)至1μg/ml包被在96孔ELISA板(Costar，CAT#3590)上，洗板封闭后，加入不同浓度稀释的抗CD47抗体样品，再洗板后加入辣根过氧化物酶-羊抗人(H+L)抗体(Jackson，CAT#109-035-088)，再洗板加入四甲基联苯胺溶液显色，最后加入终止液，在酶标仪上测量OD450并计算其EC50值。
测试例2.CD47抗体对SIRPα/CD47结合的阻断
抗CD47抗体对SIRPα和CD47结合的阻断能力，通过检测在抗体存在的条件下CD47与SIRPα结合的量来确定。用磷酸缓冲液稀释CD47-ECD-Fc(SEQ ID NO.2)至1μg/ml包被在96孔ELISA板(Costar，CAT#3590)上，洗板封闭后，加入生物素标记的SIRPα-Fc(SEQ ID NO：3)(用磷酸缓冲液稀释至终浓度0.5μg/ml)和抗体样品(用磷酸缓冲液稀释)的混合液100μl/孔，洗板后加入辣根过氧化物酶-链霉亲和素(sigma，CAT#S2438)，再洗板加入四甲基联苯胺溶液显色，最后加入终止液，在酶标仪上测量OD450并计算其IC50值，结果见表6。
表6. 055人源化抗体阻断活性
测试例3.CD47抗体结合CCRF-CEM细胞的实验
CCRF-CEM细胞(ATCC，CAT#CRM-CCL-119)培养在RPMI培养基中(Hyclone，CAT#SH30809.01B)(含10％胎牛血清)，1×106细胞/ml CCRF-CEM细胞用5％BSA封闭后，加入CD47抗体样品至1μg/ml，洗两次后，再加入Alexa Fluor 488-羊抗人(H+L)抗体(Invitrogen，CAT#A11013)，洗两次后，流式细胞仪读取荧光信号值。
FACS检测结果显示，本公开涉及的人源化抗体对细胞表面的天然CD47具有很强的结合能力，明显优于对照抗体B6H12(US9017675B)的结合能力，结果见表7。
表7.本公开人源化抗体与细胞表面的天然CD47的结合能力测试
| 序号 | 样品名称 | 流式结合信号 |
| 1 | hu167-33 | 2.78E4 |
| 2 | hu055-5 | 3.41E4 |
| 3 | B6H12 | 2713 |
| 4 | IgG4-Fc对照 | 65.1 |
| 5 | 空白对照 | 30.0 |
测试例4.CD47抗体增强CCRF-CEM细胞体外抗体依赖的细胞介导的细胞吞噬作用(ADCP)的实验
单核细胞分离于人外周血单核细胞，培养在RPMI培养基中(Hyclone，CAT#SH30809.01B)(含10％胎牛血清)的六孔板中7天。1×106细胞/ml CCRF-CEM细胞加入CFSE(abcam，ab113853)至终浓度0.02μM，37℃孵育5-10分钟，洗两次后，加入含分化后单核细胞的六孔板，加入不同浓度稀释的抗CD47抗体样品，37℃孵育4小时，洗两次后，刮下分化后单核细胞，加入APC-抗人CD14抗体(BioLegend，CAT#325608)，4℃孵育0.5小时，洗两次后，流式细胞仪读取荧光信号值。
测试结果见图1，显示加入本公开的人源化抗体可以有效促进ADCP，且有一定的剂量效应。
测试例5.CD47抗体红细胞凝集实验
新鲜人血用磷酸缓冲液稀释1倍加入96孔板，加入不同浓度稀释的抗CD47抗体样品，震荡后37℃孵育4小时。吸去上清，观察96孔板上不同孔中的细胞沉淀情况，记录各孔中各抗体不同浓度引起红细胞(RBC)凝集的情况，以图2中所示的方式进行标记，并统计结果进行比较。
抗体引起红细胞发生凝集是CD47领域内抗体较为普遍的现象，比如专利抗体5F9(US9017675B，见专利中vh2，SEQ ID NO 37和vl2，SEQ ID NO 42)经检测能够在很大浓度范围内引起体外红细胞发生凝集现象，而同样条件下本公开的hu167-33在测试的不同浓度下均不会引起红细胞凝集，另外一个抗体分子hu055-5能够引起红细胞凝集，但其引起红细胞凝集的浓度范围明显小于5F9。结果见图2。提示本公开的抗体在安全性方面的潜在优势。
测试例6.CD47抗体红细胞裂解实验
新鲜人血用磷酸缓冲液稀释1倍加入96孔板，加入0.2mg/ml的抗CD47抗体样品或不同浓度稀释的Triton X-100，震荡后37℃孵育4小时，离心后吸取上清至另一块96孔板，在酶标仪上测量OD540。结果见图3，显示体外加入本公开所示的抗CD47抗体不会引起红细胞的裂解。
测试例7.BIAcore检测CD47抗体亲和力实验
用Biacore仪器测试本公开嵌合抗体及相应的人源化抗体对人CD47-his抗原的亲和力。
按照人Fab捕获试剂盒(Cat.#28-9583-25，GE)说明书中所述的方法，将人Fab捕获分子共价偶联于CM5生物传感芯片(Cat.#BR-1000-12，GE)上，从而亲和捕获待测抗体。然后于芯片表面流经人CD47-his(义翘神州，CAT#12283-HCCH-50)抗原，利用Biacore仪器实时检测反应信号，从而获得结合和解离曲线，通过拟合得到亲和力数值，见下表8、表9。在实验中每个循环解离完成后，用人Fab捕获试剂盒里配置的再生溶液将生物芯片洗净再生。
表8.本公开的hu055系列抗体对人CD47-his抗原的亲和力
| 配体 | ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) | KD的倍数差异 |
| ch-055 | 2.32E6 | 3.89E-4 | 1.67E-10 | 1 |
| hu055-1 | 1.67E6 | 9.76E-4 | 5.85E-10 | 3.5 |
| hu055-2 | 1.81E6 | 7.76E-4 | 4.29E-10 | 2.6 |
| hu055-3 | 1.98E6 | 7.32E-4 | 3.70E-10 | 2.2 |
| hu055-4 | 1.87E6 | 6.99E-4 | 3.73E-10 | 2.2 |
| hu055-5 | 2.10E6 | 3.82E-4 | 1.82E-10 | 1.1 |
| hu055-6 | 2.00E6 | 3.27E-4 | 1.64E-10 | 1.0 |
| hu055-7 | 2.11E6 | 4.33E-4 | 2.05E-10 | 1.2 |
| hu055-8 | 1.60E6 | 9.87E-4 | 6.17E-10 | 3.7 |
表9.本公开167系列抗体对人CD47-his抗原的亲和力
| 配体 | ka(1/Ms) | kd(1/s) | KD(M) | KD的倍数差异 |
| ch-167 | 1.72E6 | 5.58E-4 | 3.25E-10 | 1 |
| hu167-1 | 1.49E6 | 9.91E-4 | 6.64E-10 | 2.04 |
| hu167-2 | 1.50E6 | 9.85E-4 | 6.55E-10 | 2.01 |
| hu167-3 | 1.21E6 | 8.76E-4 | 7.22E-10 | 2.22 |
| hu167-4 | 1.60E6 | 7.01E-4 | 4.37E-10 | 1.34 |
| hu167-6 | 1.61E6 | 9.46E-4 | 5.89E-10 | 1.81 |
| hu167-9 | 1.38E6 | 6.10E-4 | 4.43E-10 | 1.36 |
| hu167-14 | 1.37E6 | 5.48E-4 | 4.00E-10 | 1.23 |
本公开抗体相应的人源化抗体经Biacore检测，发现其与抗原有较高的亲和力，并进一步筛选到具有高亲和力且回复突变少的优化人源化抗体。
测试例8.CD47抗体的体内药代动力学实验
动物在给药不同浓度抗CD47抗体样品后于不同时间点采取血清，根据测试例1抗CD47抗体结合CD47蛋白的ELISA实验中的方法作不同样品的标准曲线，血清样品1∶1000代替抗CD47抗体加入反应体系后根据OD450换算不同时间点抗CD47抗体于血清中的浓度，所得数据由Phoenix WinNonlin软件分析计算药代动力学相关参数。
在大鼠中测定了hu055-5在3mpk剂量下的药物代谢参数，结果显示hu055-5具有良好的大鼠体内药物代谢表现，平均药物半衰期t1/2约285小时，见图4，提示该抗体在大鼠体内稳定性良好。在小鼠体内对本公开抗体hu167-33，进行了药物代谢检测，在10mpk剂量下发现其药物半衰期t1/2约192小时，见图5，显示该抗体在小鼠体内稳定性良好。
序列表
<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司、上海恒瑞医药有限公司
<120> CD47抗体、其抗原结合片段及其医药用途
<130> 770089CPCN
<150> 201611063938.3
<151> 2016-11-28
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 带His标签的CD47蛋白胞外域
<400> 1
Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Cys Asn
1 5 10 15
Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn
20 25 30
Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr
35 40 45
Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp Phe Ser
50 55 60
Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu
65 70 75 80
Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys
85 90 95
Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys
100 105 110
Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu His His His His His
115 120 125
His
<210> 2
<211> 355
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> CD47胞外域与人IgG1Fc融合蛋白：CD47-ECD-Fc
<400> 2
Gln Leu Leu Phe Asn Lys Thr Lys Ser Val Glu Phe Thr Phe Cys Asn
1 5 10 15
Asp Thr Val Val Ile Pro Cys Phe Val Thr Asn Met Glu Ala Gln Asn
20 25 30
Thr Thr Glu Val Tyr Val Lys Trp Lys Phe Lys Gly Arg Asp Ile Tyr
35 40 45
Thr Phe Asp Gly Ala Leu Asn Lys Ser Thr Val Pro Thr Asp Phe Ser
50 55 60
Ser Ala Lys Ile Glu Val Ser Gln Leu Leu Lys Gly Asp Ala Ser Leu
65 70 75 80
Lys Met Asp Lys Ser Asp Ala Val Ser His Thr Gly Asn Tyr Thr Cys
85 90 95
Glu Val Thr Glu Leu Thr Arg Glu Gly Glu Thr Ile Ile Glu Leu Lys
100 105 110
Tyr Arg Val Val Ser Trp Phe Ser Pro Asn Glu Glu Pro Lys Ser Ser
115 120 125
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
130 135 140
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
145 150 155 160
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
165 170 175
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
180 185 190
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
195 200 205
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
210 215 220
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
225 230 235 240
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
245 250 255
Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
260 265 270
Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
275 280 285
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
290 295 300
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
305 310 315 320
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
325 330 335
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
340 345 350
Pro Gly Lys
355
<210> 3
<211> 350
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> PEPTIDE
<223> 人SIRPα与人IgG1Fc融合蛋白：SIRPα-Fc
<400> 3
Glu Glu Glu Leu Gln Ile Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Phe Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Val Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Arg Gln Gly Pro Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Glu Thr Thr Lys Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Ile Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Thr Glu Phe Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser
100 105 110
Val Arg Ala Lys Pro Ser Glu Pro Lys Ser Ser Asp Lys Thr His Thr
115 120 125
Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe
130 135 140
Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro
145 150 155 160
Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val
165 170 175
Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr
180 185 190
Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val
195 200 205
Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys
210 215 220
Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser
225 230 235 240
Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro
245 250 255
Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val
260 265 270
Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly
275 280 285
Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp
290 295 300
Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp
305 310 315 320
Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His
325 330 335
Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
340 345 350
<210> 4
<211> 117
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 克隆055的鼠源重链可变区序列
<400> 4
Gln Val Leu Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Gln Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Arg Gly Asp Val Phe Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 5
<211> 113
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 克隆055的鼠源轻链可变区序列
<400> 5
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Thr Val Thr Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Thr Ser
20 25 30
Gly Lys Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Glu Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
100 105 110
Asn
<210> 6
<211> 120
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 克隆167的鼠源重链可变区序列
<400> 6
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Ile Gln Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Gly Tyr Leu Gly Arg Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 7
<211> 107
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 克隆167的鼠源轻链可变区序列
<400> 7
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Tyr Leu Ala Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Thr Ile Thr Ile Asn Cys Arg Thr Ser Lys Ser Ile Ser Lys Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Glu Lys Pro Gly Lys Thr His Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 克隆055的HCDR1
<400> 8
Ser Ser Tyr Leu His
1 5
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 克隆055的HCDR2
<400> 9
Trp Ile Tyr Pro Glu Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 10
<211> 8
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 克隆055的HCDR3
<400> 10
Arg Gly Asp Val Phe Phe Ala Tyr
1 5
<210> 11
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 克隆055的LCDR1
<400> 11
Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Thr Ser Gly Lys Gln Lys Asn Tyr Leu
1 5 10 15
Thr
<210> 12
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 克隆055的LCDR2
<400> 12
Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 克隆055的LCDR3
<400> 13
Gln Asn Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 克隆167的HCDR1
<400> 14
Ser Tyr Trp Met His
1 5
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 克隆167的HCDR2
<400> 15
Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 克隆167的HCDR3
<400> 16
Trp Gly Tyr Leu Gly Arg Ser Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 17
<211> 11
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 克隆167的LCDR1
<400> 17
Arg Thr Ser Lys Ser Ile Ser Lys Phe Leu Ala
1 5 10
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 克隆167的LCDR2
<400> 18
Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser
1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 小鼠(Mus musculus)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 克隆167的LCDR3
<400> 19
Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp Thr
1 5
<210> 20
<211> 117
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 鼠源抗体055的人源化重链可变区
<400> 20
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Asp Val Phe Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 21
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 鼠源抗体055的人源化轻链可变区
<400> 21
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Thr Ser
20 25 30
Gly Lys Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 22
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 鼠源抗体167的人源化重链可变区
<400> 22
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Gly Tyr Leu Gly Arg Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 23
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 鼠源抗体167的人源化轻链可变区
<400> 23
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Lys Ser Ile Ser Lys Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 24
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> IgG4-S228P的重链恒定区序列
<400> 24
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
<210> 25
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> 抗体的轻链（Kappa链）恒定区序列
<400> 25
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105
<210> 26
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu167-33重链序列
<400> 26
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Asn Ile Asp Pro Ser Asp Ser Glu Thr His Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Trp Gly Tyr Leu Gly Arg Ser Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val
225 230 235 240
Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr
245 250 255
Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu
260 265 270
Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys
275 280 285
Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser
290 295 300
Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys
305 310 315 320
Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile
325 330 335
Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro
340 345 350
Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu
355 360 365
Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn
370 375 380
Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser
385 390 395 400
Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg
405 410 415
Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu
420 425 430
His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440 445
<210> 27
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu167-33轻链序列
<400> 27
Asp Val Gln Ile Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Thr Ser Lys Ser Ile Ser Lys Phe
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Trp
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 28
<211> 444
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu055-5重链序列
<400> 28
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Ser
20 25 30
Tyr Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Arg Leu Asp Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Tyr Pro Glu Ser Gly Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Arg Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Arg Gly Asp Val Phe Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu
115 120 125
Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys
130 135 140
Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser
145 150 155 160
Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser
165 170 175
Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser
180 185 190
Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn
195 200 205
Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro
210 215 220
Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe
225 230 235 240
Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val
245 250 255
Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe
260 265 270
Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro
275 280 285
Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr
290 295 300
Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val
305 310 315 320
Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala
325 330 335
Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln
340 345 350
Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly
355 360 365
Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro
370 375 380
Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser
385 390 395 400
Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu
405 410 415
Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His
420 425 430
Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
435 440
<210> 29
<211> 220
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> hu055-5轻链序列
<400> 29
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Thr Ser
20 25 30
Gly Lys Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn
85 90 95
Asp Tyr Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile
100 105 110
Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp
115 120 125
Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn
130 135 140
Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu
145 150 155 160
Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp
165 170 175
Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr
180 185 190
Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser
195 200 205
Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215 220
<210> 30
<211> 327
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> DOMAIN
<223> IgG4-AA（包含S228P）的重链恒定区序列
<400> 30
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg
1 5 10 15
Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr
65 70 75 80
Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro
100 105 110
Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys
115 120 125
Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val
130 135 140
Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp
145 150 155 160
Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe
165 170 175
Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp
180 185 190
Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu
195 200 205
Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg
210 215 220
Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys
225 230 235 240
Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp
245 250 255
Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys
260 265 270
Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser
275 280 285
Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser
290 295 300
Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser
305 310 315 320
Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys
325
Claims (21)
1.一种CD47抗体或其抗原结合片段，其包含抗体重链可变区和抗体轻链可变区，其中：
所述的抗体重链可变区包含SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO: 10所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和所述的抗体轻链可变区包含SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12和SEQID NO: 13所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或者
所述的抗体重链可变区包含SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO: 15和SEQ ID NO: 16所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3，和所述的抗体轻链可变区包含SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18和SEQID NO: 19所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。
2.根据权利要求1所述的CD47抗体或其抗原结合片段，所述CD47抗体或其抗原结合片段选自鼠源抗体或其抗原结合片段，嵌合抗体或其抗原结合片段，和人源化抗体或抗原结合其片段。
3.根据权利要求2所述的CD47抗体或其抗原结合片段，其中所述鼠源抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含鼠源的轻链FR区；所述鼠源抗体或其抗原结合片段的重链可变区包含鼠源的重链FR区。
4.根据权利要求3所述的CD47抗体或其抗原结合片段，其中：
所述CD47抗体包含SEQ ID NO: 4所示的重链可变区和SEQ ID NO: 5所示的轻链可变区，或
所述CD47抗体包含SEQ ID NO: 6所示的重链可变区和SEQ ID NO: 7所示的轻链可变区。
5.根据权利要求2所述的CD47抗体或其抗原结合片段，其中：
所述人源化抗体的重链可变区上的重链FR区序列为人种系重链IGHV1-3*01和hjh6.1的组合，或为人种系重链IGHV1-2*02和hjh6.1的组合序列；
所述人源化抗体的轻链可变区上的轻链FR区序列为人种系轻链IGKV4-1*01和hjk2.1的组合，或为人种系轻链IGKV1-39*01和hjk4.1的组合序列。
6.根据权利要求2所述的CD47抗体或其抗原结合片段，其中，
（I）所述人源化抗体可变区为：SEQ ID NO:20所示的重链可变区或其突变序列，所述突变为选自以下的突变：R72A、M48I、E46D、V68A、I70L、R38K、R67K、A97S及其组合；和SEQ IDNO: 21所示的轻链可变区或其突变序列，所述突变为D66E突变；或
（II）所述人源化抗体可变区为：SEQ ID NO:22所示的重链可变区或其突变序列，所述突变为选自以下的突变：R72V、M48V、V68A、M70L、T74K、A40R、R38K、R67K及其组合；和SEQ IDNO: 23所示的轻链可变区或其突变序列，所述突变为选自以下的突变：V58I、I2V、M4I、Q38E、A43T、P44H及其组合。
7.根据权利要求6所述的CD47抗体或其抗原结合片段，其中，
（I）所述人源化抗体可变区为：SEQ ID NO:20所示的重链可变区或其突变序列，所述突变为选自以下的突变：R72A、M48I、E46D、V68A、I70L及其组合；和SEQ ID NO: 21所示的轻链可变区或其突变序列，所述突变为D66E突变；或
（II）所述人源化抗体可变区为：SEQ ID NO:22所示的重链可变区或其突变序列，所述突变为选自以下的突变：R72V、M48V、V68A、M70L、T74K、A40R、R38K、R67K及其组合；和SEQ IDNO: 23所示的轻链可变区或其突变序列，所述突变为选自以下的突变：I2V、M4I及其组合。
8.根据权利要求7所述的CD47抗体或其抗原结合片段，其中：
所述人源化抗体可变区为：SEQ ID NO:26所示的重链的重链可变区，和SEQ ID NO: 27所示的轻链的轻链可变区；或
所述人源化抗体可变区为：SEQ ID NO:28所示的重链的重链可变区，和SEQ ID NO: 29所示的轻链的轻链可变区。
9.根据权利要求8所述的CD47抗体或其抗原结合片段，其中：
所述人源化抗体的重链和轻链为：SEQ ID NO:26所示的重链，和SEQ ID NO: 27所示的轻链；或
所述人源化抗体的重链和轻链为：SEQ ID NO:28所示的重链，和SEQ ID NO: 29所示的轻链。
10.根据权利要求2所述的CD47抗体或其抗原结合片段，所述嵌合抗体或人源化抗体的重链包含：人源IgG1、IgG2、IgG3或 IgG4的重链恒定区，和人源κ、λ链的轻链恒定区。
11.根据权利要求10所述的CD47抗体或其抗原结合片段，所述嵌合抗体或人源化抗体的重链包含：人源IgG4的重链恒定区，和人源κ链轻链恒定区。
12.根据权利要求10所述的CD47抗体或其抗原结合片段，所述嵌合抗体或人源化抗体的重链包含：含有F234A突变和L235A突变的人源IgG4重链恒定区如SEQ ID NO:30所示。
13.一种药物组合物，其含有：
治疗有效量的权利要求1至12任一项所述的CD47抗体或其抗原结合片段，以及一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。
14.一种双特异性抗体，其包含：
权利要求1至12任一项所述的CD47抗体或其抗原结合片段。
15.一种分离的核酸，其编码权利要求1至12任一项所述的CD47抗体或其抗原结合片段。
16.一种表达载体，其含有根据权利要求15所述的分离的核酸。
17.一种宿主细胞，其转化有权利要求16所述的表达载体，所述宿主细胞选自原核细胞和真核细胞，所述真核细胞为哺乳动物细胞。
18.一种用于制备权利要求1至12任一项所述CD47抗体或其抗原结合片段的方法，包括步骤：
在权利要求17所述的宿主细胞中表达抗体，以及从该宿主细胞中分离所述抗体。
19.权利要求1至12任一项所述的CD47抗体或其抗原结合片段、或权利要求13所述的药物组合物在制备抑制肿瘤细胞生长的药物中的用途。
20.选自以下的任一项在制备用于治疗癌症的药物中的用途：权利要求1至12任一项所述的CD47抗体或其抗原结合片段、权利要求13所述的药物组合物以及权利要求14所述的双特异性抗体，
所述癌症选自卵巢癌、黑色素瘤、前列腺癌、肠癌、胃癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、肾癌、胰腺癌、子宫癌、肝癌、膀胱癌、子宫颈癌、口腔癌、脑癌、睾丸癌、皮肤癌、甲状腺癌以及血液学恶性肿瘤。
21.根据权利要求20所述的用途：其中所述血液学恶性肿瘤选自骨髓瘤、慢性白血病和急性白血病。
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